Metode PCR (Polymerase Chain Reaction)-1

Metode PCR (Polymerase chain reaction) dalam mendekteksi isolat klinis Mycobacterium tuberculosis pa  pada da Anak Anak dr. Putu Ayunda Trisna dr. Ni Putu Wirantari dr. Putu Diah Pratiwi

PENDAHULUAN

PENDAHULUAN

PENDAHULUAN • Baku emas dalam penegakan diagnosis adalah adanya mikobakterium pada biakan sampel cairan tubuh atau  jaringan PERLU WAKTU • pengecatan bakteri tahan asam akan tetapi cara ini kurang sensitif dibandingkan kultur

aat ini mulai berkembang pemeriksaan molekular dimana sensitifitas lebih baik dibandingkan pengecatan bakteri tahan asam dengan hasil lebih cepat dibanding pemeriksaan kultur

Tuberkulosis Penyakit akibat infeksi kuman Mycobacterium tuberkulosis sistemis sehingga dapat mengenai hampir semua organ tubuh! dengan lokasi terbanyak di paru yang biasanya merupakan lokasi infeksi primer

Patogenesis TBC1

+koring Tuberkulosis Parameter Kontak T#$

0 tidak "elas

Uji Tuberkulin

Negati&e

##%keadaan gi&i

'emam tanpa sebab  yang jelas

-

 laporan keluarga BTA#$% atau tidak tahu

" BTA #'%

Positif ( )* mm! atau ( + mm pada keadaan imunosupresi BB,TB - */ atau BB,0 -1*/

2linis gi3i buruk atau BB,TB - 4*/ atau BB,0 -5*/

( 6 minggu

#atuk  Pembesaran kelenjar lim(e koli) aksila) inguinal

( 7 minggu ( ) cm! "umlah ( )! tidak nyeri

Pembengkakan tulang%sendi panggul) lutut) (alang

Ada pembengkakan

*oto rontgen toraks

-

! ka&itas #'% BTA tidak  "elas

Normal,tid 8nfiltrate! pembesaran ak "elas kelen"ar! konsolidasi segmental,lobar

2lasifikasi'infiltra te! pembesaran kelen"ar ' infiltrate

Petunuk diagnosis TBC menurut !H" 'icurigai tuberkulosis 9  Anak sakit dengan riwayat kontak penderita tuberkulosis dengan diagnosis pasti #BTA Positif% 9 terdapat reaksi kemerahan cepat setelah penyuntikan B:; #dalam 7$4 hari%! 9  terdapat ge"ala umum TB: ,ungkin tuberkulosis • Anak dicurigai tuberkulosis dengan tambahan < 9 0"i tuberkulin positif #)* mm, lebih% 9 =oto rontgen paru sugestif tuberkulosis 9 Pemeriksaan histologis biopsi sugestif tuberkulosis 9 >espon yang baik pada pengobatan ?AT Pasti tuberkulosis •Ditemukan basil tuberkulosis pada pemeriksaan langsung atau  biakan. 8dentifikasi Mycobacterium tuberculosa pada karakteristik  biakan.

Pemeriksaan Penunang • • • • • •

0"i Tuberkulin ;ambaran radiologis Bakteriologis erodiagnosis< @8A Teknik biomolekular Patologi anatomik 

Diagnosis biomolekular pada Tuberkulosis endeteksi asam nukleat #DNA maupun >NA% suatu patogen - Ekstrasi Asam Nukleat : Proses ekstrasi harus dilakukan di - Amplifikasi : Asam Nukleat pada sampel ataupun kultur di amplfikasi. PCR ( Polymerase Chain Reaction) merupakan salah satu metode amplifikasi. - Deteksi : Metode yang digunakan untuk mendeteksi asam nukleat yang telah di amplifikasi dapat dengan cara elektroporesis line probe assay atau real time detection

 Alur sampel pada pemeriksaan molekuler tuberkulosis

#agan prookol pemeriksaan biomolekular pada pasien Tuberkulosis

Mengidentifikasi M.tuberkulosis menggunakan PCR • Prinsip prosedur P:> adalah denaturasi thermal DNA sampel! diikuti hibridisasi primer oligonukleotida #annealing% ke utas DNA  • Pada proses P:> khususnya dalam mendeteksi . Tuberkulosis diperlukan beberapa komponen yang memegang peranan penting ). DNA cetakan 2. Primer 7. Proses amplifikasi DNA  C. Analisis DNA hasil amplifikasi

DNA Cetakan • Perlu diperhatikan kemurnian dan "umlah DNA sasaran  menurunkan efesiensi P:>  • Dalam hal mendeteksi kumat Tuberkulosis ekstrasi nya dengan cara! bakteri yang sudah tumbuh! dibuat suspensi dengan menambahkan larutan Na:l *!/ #b,&% ke dalam kultur tersebut • uspensi kemudian dipanaskan! disentrifugasi! dan dicuci sebanyak 6 kali • Pelet bakteri kemudian dilarutkan dengan larutan penyangga T@,Tris$@DTA p 1!*. • @kstraksi DNA dilakukan sesuai dengan prosedur

Primer •  Primer adalah oligonukleotida dengan pan"ang 6* E 7*  basa yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi peman"angan rantai atau polimerisasi DNA. •  Primer merupakan basa komplemen dari masing$ masing u"ung +F fragmen DNA yang akan diperbanyak. • P:> diperlukan sepasang primer. •  Primer pertama sebagai upstream primer dan primer kedua sebagai downstream primer

Proses ampli#ikasi DNA •  Amplifikasi DNA dilakukan dengan metode P:> menggunakan primer oligonukleotida Pt1 #+G$;T;:;;AT;;T:;:;A;AT$7G% dan Pt #+G$:T;;AT;:: :T: A:; ;TT:A$7G% • larutan penyangga #)*m Tris$:l p 1!7 ' +* m 2:l%! 6!* m g:l6! *!*)/ #b,&% gelatin! dNTP #dATP! d:TP! d;TP! dTTP% • Proses P:> dilakukan dalam DNA thermocycler #Perkin$@lmer% dengan tahap denaturasi )!+ menit pada suhu C o:! annealing pada suhu 5+o:! 6 menit! tahap extension 7 menit pada suhu 46o:! dan extended extension pada suhu 46o: selama 4 menit! untuk tiap siklus. • Humlah siklus yang diperlukan C* siklus.

Analisis DNA $asil ampli#ikasi • Teknik elektroforesis gel agarosa digunakan untuk menganalisis DNA hasil amplifikasi dengan konsentrasi agarosa )!+/ #b,&% • Pewarnaan DNA hasil elektroforesis dilakukan dengan menggunakan larutan etidium bromida • ;el kemudian di&isualisasi melalui ultraviolet transilluminator • enentukan ukuran fragmen DNA! digunakan penanda berat molekul ae888∅I)4C yang dinyatakan dengan pasangan basa #basepair J bp%.

Analisis DNA $asil ampli#ikasi • Batas deteksi u"i P:>! yaitu "umlah DNA minimum yang memberikan hasil positi( dengan metode P:> dan elektroforesis gel agarosa! ditun"ukkan dengan adanya pita DNA pada gel dari isolat M. tuberkulosis • ensiti&itas u"i P:> yang ditun"ukkan dengan batas deteksi tersebut untuk 5 isolat yang digunakan dalam penelitian ini ber&ariasi. Pada umumnya makin tinggi tingkat kemurnian '-A) sensiti.itas uji P$R makin meningkat

Tahap Reaksi P$R