Metode Elisa

ked I mmun oass oassay  Metode Elisa (En zym L in ked ) Dalam metode ELISA digunakan dua macam antibodi yang berbeda dalam jumlah  berlebih. Dimana antibodi tersebut dapat mendeteksi dan terikat dengan antigen (toksin) pada dua sisi yang berbeda. Antigen akan terikat dengan antibodi pertama yang biasanya diikat dengan support padat. Antibodi kedua terikat terikat dengan suatu enzim dan akan mencari zat yang yang telah terikat (Winarno 2007). Aktifitas enzim merupakan hasil pengukuran absorbansi hasil reaksi antara enzim dengan substrat kromogenik.

Enzim yang umum digunakan dalam metode elisa elisa adalah beta

galaktosidase, alkalin

fosfatasei dan peroksidase.

Kurva kalibrasi dapat dibuat yang

menunjukkan hubungan antara absorbansi, kemudian absorbansi yang diperoleh dari contoh diinterpolasikan pada kurva tersebut (Winarno 2007) Setiap kali sebelum penambahan antibodi dilakukan pencucian untuk menghilangkan antibiotik yang tidak terikat, oleh karena itu metode ELISA tidak langsung memerlukan tahap analisis yang lebih lama (Winarno 2007)

Macam-macam metode pengujian : 

L iqui d Chromatography Chromatography –  Tan dem M ass Spectr Spectr oscopy  oscopy   (LC  (LC - MS/MS)

Kromatografi cair-spektrometri massa (LC-MS, HPLC atau alternatif-MS) adalah suatu teknik kimia analitik yang menggabungkan kemampuan pemisahan fisik kromatografi cair (HPLC) dengan kemampuan analisis massa spektrometri massa. LC-MS adalah teknik yang kuat digunakan untuk banyak aplikasi yang memiliki sensitivitas sangat tinggi dan selektivitas. Umumnya aplikasi berorientasi terhadap deteksi dan identifikasi yang spesifik potensi bahan kimia dalam kehadiran bahan kimia lainnya (Anonim 2010)



H igh Perf ormance L iqui d Chromatograph (HPLC)

Kromatografi cair berperforma tinggi (high performance liquid chromatography / HPLC) merupakan salah satu teknik  kromatografi untuk   zat cair yang biasanya disertai dengan  tekanan tinggi. Seperti teknik kromatografi pada umumnya, HPLC berupaya untuk memisahkan molekul  berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat  padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fase cair dan zat padatnya merupakan fase diam (stasioner). Teknik ini sangat  berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa mempunyai aktivitas selektif antara fase diam dan fase gerak tertentu. Dengan bantuan detektor serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram. Kromatorgram memuat waktu lambat serta tinggi puncak suatu senyawa (Anonim 2011) HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Hal ini membuatnya lebih cepat (Anonim 2010)

Mekanisme ELISA :

Metode elisa dilakukan dengan membandingkan dengan konsentrasi standar

yang

diketahui. Apabila sinyal yang diberikan contoh lebih kuat daripada standar maka disebut  positif, apabila lemah disebut negatif.

Selain itu dapat juga ditentukan konsentrasi

antibodi/antigen dalam contoh (Corner 1995 dalam Maratua 2008). Beberapa jenis elisa sebagai berikut : 1. Inderect ELISA Secara umum indirect elisa digunakan untuk penetapan konsentrasi antibodi dalam darah. Darah diinkubasikan pada well, setelah itu ikatan antibodi yang lemah dicuci. Antibodi

kedua ditambahakan untuk mendeteksi ikatan antibodi. Enzim ini dapat merubah substrat menjadi berwarna. Setelah reaksi selesai dilakukan penetapan dengan elisa plate reader (Corner 1995 dalam Maratua 2008). 2. Sandwich ELISA Sandwich elisa terdiri dari: 1. Plate yang dilapisi penangkap antibodi 2. Contoh yang ditambahkan dan sejumlah antigen yang terkandung terikat pada penangkap antibodi 3. Pendeteksi antibodi ditambahkan dan mengikat antigen, enzim yang mengikat antibodi yang lain ditambahkan dan mengikat pendeteksi antibodi 4. Substrat ditambahkan dan diubah oleh enzim menjadi bentuk yang dapat dideteksi (produk  berwana) 5. Untuk penetapan secara kuantitatif produk warna diukur absorbansinya. Keuntungan dari penggunaan sandwich elisa yaitu dapat digunakan untuk campuran atau contoh yang tidak murni dan tetap selektif mengikat tiap antigen dalam contoh. Konjugat antibodi universal dapat digunakan sebagai antbodi kedua meskipun berlawanan dengan antibodi  primer. Metode ini lebih sensitif daripada metode tidak langsung dan metode competitive (Corner 1995 dalam Maratua 2008). 3. Competitive ELISA Tahapan dalam penetapan competitive elisa yaitu : 1. Antibodi tidak berlabel (contoh) yang mengandung antigen diinkubasi 2. Ikatan kompleks antibodi terjadi saat ditambahkan pada antigen pada well

3. Plate dicuci untuk membuang antibodi tak berikatan (antigen dalam contoh) dan antibodi akan bersaing untuk terikat pada antigen pada well 4. Antibodi kedua yang spesifik terhadap antibodi pertama ditambahkan. Antibodi kedua akan  berpasangan dengan enzim 5. Substrat ditambahkan yang dapat menghasilkan produk warna sebagai sinyal.

Prinsip / Cara Kerja ELISA :

ELISA adalah suatu teknik deteksi dengan metode serologis yang berdasarkan atas reaksi spesifik antara antigen dan antibodi, mempunyai sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi dengan menggunakan enzim sebagai indikator (Corner 1995 dalam Maratua 2008) Prinsip dasar ELISA adalah analisis interaksi antara antigen dan antibodi yang teradsorpsi secara pasif pada permukaan fase padat dengan menggunakan konjugat antibodi atau antigen yang dilabel enzim. Enzim ini akan bereaksi dengan substrat dan menghasilkan warna (Corner 1995 dalam Maratua 2008) Warna yang timbul dapat ditentukan secara kualitatif dengan pandangan mata atau kuantitatif dengan pembacaan nilai absorbansi (OD) pada ELISA plate reader   (Burgess 1995 dalam Maratua 2008).

Prosedur Elisa

1. Larutan standar secara berurut 1-6 CAP dipipet ke dalam well 100 µl dan 100 µl contoh, tambahkan juga ke dalam well 50 µl CAP-HRP Konjugate dan Enzym Konjugate pada sampel.

2. Dihomogenkan selama 1 menit, kemudian diinkubasikan selama 1 jam dalam temperature ruangan. 3. Dibilas 3 kali dengan 250 µl Wash Solution (larutan pencuci), dikeringkan piringannya dengan cara menghentakkan pada tissue kering. 4. Ditambahkan 100 µl TMB substrat ke dalam well dan dihomogenkan selama 1 menit, kemudian diinkubasikan selama 20 menit pada temperatur ruangan. 5. Ditambahkan 100 µl stop buffer ke dalam well, kemudian well dibaca pada Elisa Reader.

DAPUS : a

Anonim. 2010 .  Antibiotik . http://id.wikipedia.org/wiki/Antibiotika [Diakses pada 1 Desember 2014]  b

Anonim. 2010 . Uji -skripsi-anilisis residu antibiotik   - 06613079 - Fachmi Hidayati6969840634  –  abstract [Diakses pada 1 Desember 2014] Maratua. 2008.  Analisis Residu Tetrasiklin Pada Udang Windu Untuk Ekspor Menggunakan  Enzyme Linked Immunosorbent Assay  ( ELISA) http///provokasi-1985:November 2008  arsif antibiotik.htm [Diakses pada 1 Desember 2014] Winarno, FG. 2007.  Analisis Laboratorium  (Gastroentroenteritis dan Keracunan Pangan), MBRO PRESS, Cetakan 1.