Metode de Analiza Ale Secventelor ADN Si ARN

Metode de analiza ale secventelor ADN si ARN

Electroforeza pe gel de agaroza





Structura acizilor nucleici poate fi studiata in prezent utilizand diverse metode Scopul analizarii secventelor acizilor nucleici este complex: in vederea studierii, sintetizarii si multiplicarii genelor, dar si pentru detectarea mutatiilor







Ingineria genetica reprezinta un ansamblu de tehnici de laborator folosite pentru modificarea ADN-ului organismelor vii ADN-ul poate fi extras din sange total, dar si din diferite celule sau tesuturi Pentru extragerea ADN-ului se folosesc diverse metode chimice





Izolarea ADN-ului constituie si ea o etapa importanta in cadrul inginerie genetice Clonarea ADN-ului semnifica amplificarea unei molecule sau a unei catene; o clona reprezentand un numar mare de molecule sau celule identice, provenind dintr-o celula sau molecula initiala





Clonarea unui fragment de ADN se realizeaza fie prin insertia acestuia intr-un vector care se va multiplica intr-o celula gazda, fie prin metoda PCR Vectorii frecvent utilizati sunt: plasmidele, cosmidele si bacteriofagii







Metoda PCR are ca finalitate obtinerea intr-un timp scurt a unui numar foarte mare de copii ale unei gene sau a unui anumit fragment de ADN Aceasta se realizeaza printro amplificare enzimatica, ce are loc in mod exponential PCR cuprinde 30-40 de cicluri realizate cu un aparat automat





In vederea detectarii mutatiilor se utilizeaza metode diferite Pentru a detecta mutatiile cunoscute se folosesc urmatoarele metode: PCR si separarea pe baza marimii fragmentului de ADN; PCR si digestia cu enzime de restrictie sau metoda amplificarii cu alele specifice.



Pentru detectarea mutatiilor necunoscute se folosesc metode precum: metoda FISH, electroforeza in camp pulsatil sau, in cazul mutatiilor punctiforme, metoda clivarii cu ribonucleaze, metoda proteinelor functionale ori analiza polimorfismelor conformationale monocatenare.



Secventializarea ADNului uman permite: finalizarea secventei complete a genomului uman(PGU), clonarea genelelor localizate, precum si punerea la dispozitia publicului a intregii secvente de ADN in mod gratuit

Secventializarea ADN 



Secventializarea ADN reprezinta identificarea tipului, felului si succesiunii nucleotidelor dintr-un fragment ADN de analizat In momentul de fata s-au dezvoltat tehnici de secventiere automate: fie chimic prin metoda MaxamGilbert, fie enzimatic prin metoda Sanger





Metoda chimica presupune marcarea ADN-ului supus secventializarii la unul din capetele sale, denaturarea, urmata de de separarea prin electroforeza in gel a celor doua catene Are loc apoi taierea ADNului monocatenar cu obtinerea unor fragmente de ADN cu lungime varibila ce pot fi separate electroforetic pe geluri de poliacrilamida



Metoda enzimatica Sanger consta din replicarea ADNului monocatenar incepand de la un punct precis de initiere, replicarea fiind apoi intrerupta in functie de baza existenta in secventa de analizatde catre dideoxinucleotide

Metode de separare ale acizilor nucleici 



In functie de scopul urmarit, pentru separarea acizilor nucleici se pot utiliza: centrifugarea, cromatografia sau electroforeza Metoda centrifugarii ofera posibilitatea obtinerii de ARN in cantitati considerabile si de inalta puritate





Din cadrul metodelor cromatografice, pentru separarea acizilor nucleici se utilizeaza cromatografia de gel filtrare, cromatografia de schimb ionic si metoda dHPLC Cromatografia de gel filtrare se foloseste pentru purificarea produsilor PCR



Cromatografia de schimb ionic se utilizeaza pentru extractia rapida de ADN si ARN din diverse probe biologice, in cantitati suficiente



dHPLC este o metoda de screening a mutatiilor punctiforme

Electroforeza fragmentelor ADN si ARN 





Electroforeza fragmentelor de ADN este o metoda analitica folosita pentru separarea acestor fragmente in functie de marimea lor In solutie libera, la pH neutru sau alcalin, acizii nucleici nu pot fi separati Pentru separarea lor se se folosesc matrici de gel de agaroza sau poliacrilamida



 

Gelurile de agaroza sunt folosite pentru separarea acizilor nucleici cu mase mari, in timp ce diferentierea moleculelor de acizi nucleici cu mase moleculare mici se face in geluri de poliacrilamida Un camp electric determina migrarea lor prin gel Datorita numarului mare de resturi fosfat, acizii nucleici au o puternica incarcatura negativa, migrand in campul electric spre anod





Fragmentele se separa sub forma unor benzi electroforetice Mobilitatea unui fragment de ADN este invers proportionala cu masa moleculara, fiind de asemenea influentata de o serie de factori





In conditii ideale, viteza de migrare a fragmentelor este direct proportionala cu tensiunea aplicata Vascozitatea gelului se poate reduce in momentul cresterii temperaturii ceea ce produce distorsiuni ale procesului de migrare





Tampoanele de electroforeza au rolul de a mentine un pH si o putere ionica constante, la valori optime pentru separare Agentii denaturanti(ureea, formamida, formaldehida) indeplinesc functia de combatere a fenomenelor de agregare si adsorbtie a moleculelor de acizi nucleici pe matricea de gel, dar si functia de inlaturare a diferentelor conformationale





Dupa ce separatia este completa, fragmentele ADN avand lungimi diferite sunt adesea vizualizate prin utilizarea unui colorant fluorescent precum bromura de etidiu Marimea fragmentelor este exprimata in:”nucleotide”, perechi de baze” sau “kb”pentru o mie de perechi de baze



Determinarea marimii fragmentelor se face uzual prin compararea cu “DNA-ladders” ce contin fragmente liniare de ADN, de lungimi cunoscute





Electroforeza acizilor nucleici este o etapa obligatorie in orice protocol de analiza a acizilor nucleici Prin ea se realizeaza: separarea fragmentelor ADN rezultate in urma digestiei cu enzime de restrictie; verficarea amplificarii PCR; identificarea si/sau determinarea semicantitativa a fragmentelor ADN rezultate in urma amplificarii PCR; detectia si determinarea semicantitativa a ADN-ului genomic obtinut in urma extractiei din tesuturi





  

Analizele ADN si ARN au asadar roluri cruciale in detectarea mutatiilor, in diagnosticarea bolilor genetice, a cancerelor, in diagnosticul microbiologic Dar si in cadrul testelor de paternitate si de identificare a persoanelor In determinarea profilului genetic al bolilor In teste de filogenie Toate aceste analize cuprind in mod obligatoriu si etapa de electroforeza



De aici sesizam cu usurinta importanta functie a utilizarii tehnologiei ADN in prognosticare, diagnosticare, monitorizare si terapie



Tehnologia ADN dispune de un larg spectru de aplicabilitate, in cele mai diverse si complexe domenii ale medicinii, atat in cercetarea fundamentala ce ne ofera permanent noi date si informatii, cat si in cercetarea aplicativa ce ofera noi solutii terapeutice