Metabolismo Aeróbico

VICERRE VICE RRECT CTOR OR A AC ACAD AD MI MICA CA INSTITUTO DE CIENCIAS NATURALES CURSO DE BIOQUIMICA

Guía N°5 Laboratorio de Bioquímica CQU 310

METABOLISMO AERÓBICO

2013 (Revisión 2015)

VICERRECTOR A ACAD MICA INSTITUTO DE CIENCIAS NATURALES CURSO DE BIOQUIMICA

METABOLISMO AERÓBICO OBJETIVOS -

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Identificar la actividad de enzimas que participan en el metabolismo aeróbico, como son la Succinato Deshidrogenasa y Citocromo Oxidasa, a partir de un extracto enzimático de tejido animal. Identificar el efecto de sustancias inhibitorias sobre la actividad enzimática.

INTRODUCCIÓN Las dos grandes vías del Metabolismo celular, catabolismo y anabolismo, están necesariamente conectadas a través de moléculas con funciones muy definidas. Por un lado las vías se conectarán a través de moléculas transportadoras de energía (ciclo del ATP); pero además, existe una clara conexión con moléculas encargadas de la transferencia de electrones. En las dos vías metabólicas se producen reacciones de oxido-reducción: en las vías catabólicas, donde se realizan reacciones de oxidación, los electrones se irán reduciendo; y en las vías anabólicas, las moléculas irán captando los electrones de estas moléculas reducidas. La principal molécula transportadora de energía es el ATP, y las moléculas trasportadoras de electrones serán nucleótidos como el NADH y el NADPH. Todas las reacciones del metabolismo están estrechamente relacionadas e interconectadas de tal manera que la separación es más que nada, formal. Para facilitar el estudio y la comprensión de las rutas metabólicas, el metabolismo se divide clásicamente en varias etapas: tres para el catabolismo y tres para el anabolismo. En particular las etapas del catabolismo son: ETAPA I:  Comprende la digestión de las grandes macromoléculas o biopolímeros a sus moléculas precursoras o monómeros. ETAPA II  Los monómeros se convierten en un reducido número de especies metabólicas intermediarias más sencillas. Así, productos como monosacáridos, glicerol y algunos aminoácidos se degradan hasta dar piruvato, molécula intermediaria de tres carbonos, que posteriormente, rendirá una especie de dos carbonos: el grupo acetilo del acetil CoA. En esta etapa se pueden destacar varias rutas metabólicas: por un lado, la glucólisis, ruta por la cual la glucosa y otras hexosas se degradan a piruvato, y posteriormente a acetil CoA a través de la descarboxilación oxidativa del piruvato, por otro lado, cabría destacar el proceso de degradación de los ácidos grasos comúnmente denominado beta-oxidación, que también acaba rindiendo acetil CoA en las mitocondrias. ETAPA III en esta última etapa, tanto el grupo acetilo del acetil CoA como los demás productos de la etapa anterior se canalizan hacía una ruta catabólica final común, en la que, en último término, pueden ser oxidados, dando dióxido de carbono y agua. En esta etapa se encuentra el Ciclo de Krebs o Ciclo de los Ácidos Tricarboxilicos, así como la cadena transportadora de electrones (C.T.E).

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La C.T.E sirve para producir grandes cantidades de energía en forma de ATP, gracias a la oxidación de las coenzimas NADH y FADH 2, que se originan en las rutas del catabolismo, especialmente en la glucólisis, -oxidación y ciclo de Krebs. (Bioquímica conceptos esenciales, Feduchi, 2011)

VISIÓN GENERAL DEL METABOLISMO AERÓBICO ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL

and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)

La glucólisis y el ciclo de Krebs generan por sí una cantidad relativamente baja de energía en forma de ATP. Sin embargo seis pasos de deshidrogenación (uno en la glicólisis, otro en la reacción de la piruvato deshidrogenasa y cuatro más en el ciclo de Krebs) reducen en total 10 moles de NAD+ a NADH y 2 moles de FAD a FADH 2 por mol de glucosa. La re-oxidación de estos transportadores electrónicos reducidos genera la mayor parte de la energía necesaria para la síntesis de ATP. Las células y tejidos aerobios transfieren los electrones en un proceso escalonado, desde los transportadores reducidos hasta el oxígeno molecular y agua.  En este proceso, una serie de protones se transfieren desde la matriz mitocondrial, de modo que forma un gradiente de protones (gradiente electroquímico). Este gradiente resultante sirve para impulsar la síntesis de ATP, a partir de ADP y Pi, a través de la llamada Fosforilación Oxidativa (F.O). Cadena Transportadora de Electrones y Fosforilación Oxidativa. En la siguiente figura se muestra la cadena transportadora de electrones y la fosforilación oxidativa.

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http://web.usal.es/~jmcsil/biblioteca/biofisica/unizar/FO.htm

La cadena trasportadora de electrones funciona gracias a cuatro complejos proteicos, los cuales van trasportando electrones desde el NADH o FADH 2 hasta el O2. El Complejo I recibe electrones del NADH, los cuales se transfieren a la Coenzima Q (Q) llegando al Complejo III, y desde aquí hacia el complejo por una proteína móvil llamada Citocromo C, el cual se encuentra en entre la membrana interna el espacio intermembrana. El citocromo C transfiere los electrones hacía el Complejo IV, quien finalmente se los entrega al Oxigeno Molecular  produciendo agua. El Complejo II es la succinato deshidrogenasa única enzima del ciclo de Krebs, que cataliza la conversión del Fumarato en Malato y se encuentra en la membrana interna de la mitocondria, y tiene unido, covalentemente, el FAD, quien al recibir los electrones de una molécula intermediaria del ciclo de Krebs, el succinato,   se reduce pasando a FADH 2, estos electrones también son trasferidos a la coenzima Q siguiendo la misma ruta que se sigue anteriormente hasta llegar al Oxigeno Molecular. La Teoria Quimiosmotica se basa en el siguiente mecanismo: -

Los complejos transportadores de electrones logran pasar protones al espacio intermembrana en contra de una gradiente, creando así n gradiente eléctrico y un gradiente de protones a través de la membrana interna. A este gradiente electroquímico generado por el transporte de electrones por los diversos complejos mitocondriales se le denomina fuerza protón-motriz.

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El potencial electroquímico de este gradiente o fuerza protón motriz lo aprovecha la  ATP sintasa para sintetizar ATP. La ATP sintasa trasporta los protones a la matriz mitocondrial a favor de gradiente y acopla este proceso a la síntesis de ATP.

En este práctico revisaremos el funcionamiento de la Su c c i n a t o D e s h i d r o g e n a s a ,  la cual es capaz de reducir al Azul de metileno (indicador), y del Co m p l e j o IV   (Citocromo Oxidasa) que es capaz de oxidar al p-fenilendeamina (sustrato). Generando cambios cualitativos que pueden ser observado a simple vista.

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Para este laboratorio debes investigar. -

Como es la estructura de la mitocondria. Que efecto tiene el Malonato en el metabolismo aeróbico. Que efecto tiene el Cianuro en el metabolismo aeróbico.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL. 1. Seguimiento de la reacción catalizada por el Complejo IV o Citocromo Oxidasa: Prepare una batería de tubos debidamente marcados según la siguiente tabla:

- Mezcle bien el contenido de cada tubo e incube a 37ºC hasta cuando aparezca el complejo coloreado. - Anote y comente los resultados obtenidos en cada tubo. 2. Seguimiento de la reacción catalizada por la Succinato Deshidrogenasa: Prepare una batería de tubos debidamente marcados según la siguiente tabla: Reactivo Buffer fosfato pH7.4 (ml) Succinato de sodio 1% (ml)  Azul de metileno (gotas) Malonato de sodio 1% (ml)

B 3,0 2 Incubar 1,0 1,0

Extracto enzimático (ml)  Aceite mineral (ml)

1 2,5 1,0 2 a 37°C 0,5 1,0

2 2,0 1,0 2 -

3 1,5 1,0 2 -

4 1,0 1,0 2 1,0

1,5 1,0

1,0 1,0

10 min.

1,0 1,0

- Antes de agregar el extracto enzimático, deje los tubos incubando a 37ºC durante 10 minutos, y sin retirarlos del baño termorregulado, agregue el extracto enzimático , inmediatamente agite bien y coloque el aceite mineral. - Espere a que los tubos se decoloren.

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Comente los resultados obtenidos en cada tubo.

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BIBLIOGRAFIA (1).- Harper, Bioquímica Ilustrada, 28 a Edición, McGraw Hill, 2010 (2).- Mathews, Bioquímica, 3 a Edición, Addison Wesley, 2002 (3).- Feduchi, Bioquímica Conceptos esenciales, 2011

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