Medicinska Biologija - Citologija -

MEDICINSKA BIOLOGIJA -Citologija( skripta za ponavljanje )

Skinuto sa:

www.perpetuum-lab.com.hr

I.

PREGLEDNO O STANICAMA I ISTRAŽIVAŽNJU STANICA

PODRIJETLO I EVOLUCIJA Stanice smo podijelili u prokariote i eukariote. Prokarioti nemaju pravu jezgru, manje i jednostavnije su, te im genetički materijal nije organiziran u kromosome. Eukarioti imaju pravu jezgru i organele. Život je nastao prije 3.8 milijardi godina tj. 750 milijuna godina nakon nastanka zemlje. U primitivnoj zemljinoj atmosferi gotovo da uopće nije bilo kisika, ali zato je sadržavala CO2, N2 i CO. Takva atmosfera je bila reducirajuća. Uz pomoć električnog pražnjenja ili sunčeve svjetlost mogle su se stvoriti organske molekule. Stanley Miller je uspio dobiti organske molekule iz H2, CH2, NH3 i vode uz električne iskre. Slijedeći korak je stvaranje makromolekula iz monomera, koji mogu spontano polimerizirati u pretpostavljenim prebiotičkim uvjetima. Zagrijavanjem suhe smjese aminokiselina rezultira njihovim spajanjem u polipeptide. Takve makromolekule su morale za daljnji razvoj upravljati vlastitom replikacijom, a za to su jedino nukleinske kiseline sposobne. Otkriveno je da je RNA sposobna katalizirati određen broj reakcija, uključujući i polimerizaciju nukleotida i stvaranja novog lanca RNA. Prema tome je RNA molekula u tzv. RNA-svijetu mogla biti inicijalni genetički sustav, Raznim interakcijama između RNA i aminokiselina dovelo je vjerojatno do stvaranja i DNA. Takva replicirajuća RNA se našla okružena u membrani od fosfolipida, koji su karakteristične zbog svoje amfipatičnost. Imaju ugljikohidratni rep, koji je hidrofoban, i fosfatnu glavu, koja je hidrofilna. Kada se oni urone u vodu onda spontanu stvaraju dvosloj, tako da im je rep okrenut u unutrašnjost, a glava prema van u vodenu sredinu. Moguće da je u to vrijeme već postojala RNA koja je bila okružena membranom i stvarala vlastite proteine. Stanice su bile sposobne uzimati hranu i energiju izravno iz okoliša, ali pošto je takvo stanje ograničavajuće, pa su stanice trebale razviti vlastite mehanizme. Sve stanice koriste adenozin – 5'trifosfat ( ATP ) za svoj stanični metabolizam i druge aktivnosti ( pokretanje ). Smatra se da su se ti mehanizmi za proizvodnju energije razvili u tri stupnja ( glikoliza, fotosinteza i oksidativni metabolizam). Prva je nastala Glikoliza pomoću koje se u anaerobnim uvjetima razgradnjom glukoze u mliječnu kiselinu dobivaju 2 molekule ATP-a. Slijedeći korak je bio razvoj fotosinteze, koji je stanici omogućio korištenje sunčeve svjetlosti i da postane neovisna o već oblikovanim organskim molekulama u kojima je pohranjena energija ( glukoza ). Vjerojatno su te primitivne stanice koristile H2S da CO2 pretvore u organske molekule. Korištenje H2O kao donora elektrona i vodika za pretvorbu CO2 u organske molekule se razvio tek kasnije. Nusprodukt takve reakcije je O2. Oslobađanje O2 je dovelo do stvaranje oksidirajuće

atmosfere i do razvoja oksidativnog metabolizma. Potpunom razgradnjom glukoze u aerobnim uvjetima nastaje oko 36-38 ATP-a. Današnje prokariote smo podijelili u arhebakterije i eubakterije. Ovi prvi žive u ekstremnim uvjetima, koji su vjerojatno takvi bili i u primitivnoj atmosferi ( sumporna vrelišta od oko 80°c, Ph = 2), a u eubakterije spadaju današnje bakterije. Bakterije su većinom okruglaste, štapićaste ili spiralne, promjera od 1-10цm, mogu kodirati i do 5.000 različitih proteina, a najsloženije su cijanobakterije. E.coli je štapićasta, ima nukleoid, ispod stanične stjenke ima staničnu membranu ( osigurava funkcionalnost ), unutar citoplazme oko 30.000 ribosoma.

Podrijetlo eukariota Organeli eukariota nastali su endosimbiozom. To je pojava kada jedna stanica živi unutar druge. Pretpostavlja se da su prokariotske stanice ušle u eukariotske. Mitohondriji i kloroplasti potječu od eubakterija. Veličinom su slični njima,a također se dijele diobom. Sadrže vlastiti DNA, koji se replicira svaki put kada se oni dijele. Oni imaju vlastiti genetički sustav, koji se razlikuje od onog u jezgri. Ribosomi i rRNA su srodniji onim bakterijskim. Mitohondriji su se razvili od aerobnih bakterija, a kloroplasti od fotosintetskih bakterija ( cijanobakterije ). Neki eukariotski geni potječu od arhebakterija, a neki od eubakterija. Geni koji su uključeni u informacijske procese ( replikacija, transkripcija i sinteza ) potječu od arhebakterija, a oni uključeni u opće stanične procese ( glikoliza i biosinteza lipida ) od eubakterija. Novija hipoteza govori o fuziji gena eubakterija u arhebakterija. Endosiombiotska asocijacija između eubakterije i arhebakterije bila je popraćena fuzijom dvaju prokariotskih genoma čime je onda nastao ancestralni eukariotski genom sastavljen od dijelova genoma eubakterija i arhebakterija. Najsloženiji jednostanični eukariotski organizam je kvasac. Oni su mnogo složeniji od bakterija, a ujedno i puno jednostavniji od stanica životinja i biljaka. Najviše istraživan kvasac je Saccharomices cerevisiae. Ostali složeniji jednostanični eukarioti: -

E.coli Amoeba proteus ( pseudopodiji ) zelene alge ( imaju kloroplaste )

Višestanični organizmi nastali su iz jednostaničnih prije bilijun godina. Prijelazni oblik smatramo agregate jednostaničnih organizama ( alga volvox - kolonije) u kojim je došlo do ˝podjele rade˝među stanicama.

II.

Jezgra

Jezgra je glavna karakteristika eukariota u kojoj se odvija replikacija DNA, transkripcija i doradba RNA, dok se translacija događa u citosolu.

Ovojnica i promet Jezgra je obavijena dvostrukom membranom koja ju odvaja od citoplazma i održava drugačiji sastav. Jedina komunikacija su kompleksi jezgrinih pora, koji imaju i ulogu u regulaciji ekspresije gena eukariota. Razlikujemo unutarnju i vanjsku jezgrinu membranu. Vanjska na sebi nosi proteine i ona se nastavlja na ER, a lumen između jezgrinih membrana se također nastavlja u lumen ER. Proteini na vanjskoj jezgrinoj membranu vežu se za citoskelet, dok oni na njenoj unutarnjoj na jezgrinu laminu. Kao i sve ostale membrane i jezgrina se sastoji od dvosloja fosfolipida kroz kojeg mogu prolaziti male nepolarne molekule. Vanjska i unutarnja membrana se spajaju na mjestima gdje se nalaze kompleksi jezgrinih pora, koji omogućuju prolazak malim polarnim molekulama. Na unutarnju membranu priliježe lamina, koja je građena od vlaknastih proteina (60 – 80 kilodaltona), a nazivaju se lamini. U organizmu sisavca su pronađena tri gena ( A, B i C ), koji kodiraju barem sedam različitih proteina. Stvaranje lamine započinje udruživanjem dvaju lamina ( vlaknasti proteini ), koji stvaraju dimere čije se α-uzvojnice isprepliću. Tako nastala struktura se naziva pletenica. Dimeri se međusobno spajaju i tako nastaju intermedijarni filamenti. Povezivanje lamina sa unutrašnjom membranom olakšano je posttranslacijskim dodavanjem lipida – prenilacijom c-terminalnog cisteinskog ostatka. Lamini se vežu na specifične proteine na unutarnjoj membrani ( emerin ) i na receptore lamina B. Lamini su još povezani i sa kromatinom preko H2A i H2B histona, a protežu se u obliku labave mrežu i u unutrašnjost jezgre. Kompleks jezgrinih pora su velike strukture ( 30 puta veće od ribosoma ), koje se sastoje od oko 30 različitih proteina prisutnih u više kopija. Kroz te pore prolaze male nabijene molekule, ioni i makromolekule ( proteini i RNA ). RNA tim putem napušta jezgru, kao što proteini bitni za samu jezgru ulaze tim putem. Postoje dva mehanizma transporta kroz pore. Male nabijene molekule i manji proteini ( 20 – 30 kd ) prolaze slobodno u oba pravca bez utroška energije. Većina proteina i RNA ( veće molekule ) prolaze kroz centralnu poru u kompleksu uz utrošak energije ( oni bivaju prepoznati i prebačeni na suprotnu stranu ). Kompleks jezgrinih pora je struktura sa oktogonalnom simetrijom organiziranom oko središnjeg kanala. Sadrži 8 prečki koje su povezani prstenima na citoplazmatskoj i jezgrinoj strani, a svi skupa učvršćeni na mjestu gdje se vanjska i unutarnja membrana sastaju. Na obe strane još strše i proteinski filamenti. Proteini namijenjeni za jezgru imaju jezgrin lokalizacijski slijed ( Histoni, DNA/RNA – polimeraza, transkripcijski faktori, faktori prekrajanje ) kojeg prepoznaju jezgrini transportni receptori i usmjeruju kroz pore.

Sljedovi za jezgru su kratki odsječci bazičnih aminokiselina ( lizin i arginin ). Oni mogu biti smješteni jedan do drugog, pa su slični T-antigenu*. Sljedovi mogu biti i odvojeni ( između njih se nalaze aminokiseline nebitne za signalizaciju ), pa ih nazivamo bipartit. *Istraživači su proučavali T-antigen majmunskog virusa, koji pokreće replikaciju virusne DNA. Taj signal je odgovoran za lokalizaciju T-antigena u jezgri, pa je preko njega otkriven jezgrin lokalizacijski slijed – Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val

Jezgrine lokalizacijske signale prepoznaju importini. Kretanje makromolekule regulirano je proteinom Ran, koji veže GTP. Ostali primjeri proteina koji vežu GTP su Ras,, Arf i Rab, Rac, Rho i cdc42. Enzimi koji stimuliraju hidrolizu GTP-a u GDP smješteni su na vanjskoj membrani, a enzimi, koji su odgovorni za obrnut proces, na unutarnjoj membrani jezgre. Ulazak proteina u jezgru započinje vezanjem importina na signalni slijed, a tako nastali kompleks se dalje usmjeruje prema filamentnima. Pomoću proteina nukleoporina, koji sadrži sljedovi Phe-Gly ( FG-proteini ) i obrubljuju centralni kanal, kompleks ulazi u jezgru. Na jezgrinoj strani se taj kompleks veže na Ran/GDP kompleks i dolazi do otpuštanja importina od proteina. Ran/GTP napušta jezgru gdje se ponovno hidrolizira u ran/GDP ( oslobađa importin ) i pomoću vlastitog receptora ( NTF 2 ) ponovno ulazi u jezgru. Proteini namijenjeni za izlazak iz jezgre imaju ne sebi jezgrin izlazni slijed, kojeg prepoznaju eksportini ( iz porodice karioferina ). Eksportini se moraju isto vezati za Ran/GTP kompleks, napuštaju jezgru, dolazi do disocijacije u GDP i eksportin napušta svoj teret i reciklira se ( ulazi ponovno u jezgru za novi ciklus ). Transkripcijski faktori mogu regulirati ulazak nekih proteina u jezgru. Oni se vežu u citoplazmi sa određenim proteinom i maskiraju njegov signal za prijenos do jezgrinih pora. Primjer takvog transkripcijskog faktora je NF – ҡB, koji se aktivira na odgovore izvanstaničnih signala. U nestimuliranim stanicama on postoji kao inaktivan kompleks s inhibicijskim proteinom IҡB., a u stimuliranim stanicama je IҡB fosforiliran i razgrađen. Ostali transkripcijski faktori se ne udružuju sa inhibicijskim proteinima, nego su oni regulirani samo fosforilicaijom. Iz jezgre u citoplazmu izlaze mRNA, rRNA, tRNA i mikroRNA ( miRNA ) uz utrošak energije. Messenger RNA izlazi pomoću mRNA eksportera, kao što je to NTF2 ( nalikuje Ran/GTP transporteru ). Molekula RNA izlazi u obliku ribonukleoproteinskog kompleksa ( RNP ). Ribosomske RNA se povezuju sa ribosomskim proteinima, a onda i sa specifičnim proteinima za doradbu RNA u jezgrici. Tako nastale podjedinice 60S i 40S ribosomske podjedinice ( sadrže i jezgrin izlazni signal ) odvojeno napuštaju citoplazmu mehanizmom koji uključuje karioferin Crm1. Transportna RNA i miRNA izlaze pomoću eksportina - t i eksportina – 5, koji se vezuje direktno na RNA. Molekule snRNA i snoRNA funkcioniraju unutar jezgre kao komponente sustava za doradbu RNA. Molekula snRNa napušta jezgru i ponovno se vrača u nju nakon što se vezala sa proteinima i tako formirala funkcionalni snRNA. Crm 1 i ostali transportni proteinski receptori se vežu na 5´7-metilgvanozinske kape snRNA, a snRNa se vrača u jezgru vlastitim slijedom.

Unutarnja organizacija jezgre U jezgri se nalazi kromatin ( koji je organiziran u petlje DNA, a specifične regije tih petlji su vezane za matriks lamina ) i molekule RNA. Unutar jezgre razlikujemo heterokromatin i eukromatin. Prvi ostaje kondenziran u interfazi i ne prepisuje se, a eukromatin se dekondenzira i raspoređuje po jezgri. Heterokromatin je podijeljen u konstutivni, koji se nikad ne prepisuje ( satelitni sljedovi ), i fakultativni, koji se ne prepisuje u proučavanoj stanici, ali u drugoj dolazi do prepisivanja. Kromatin nije nasumično raspoređen unutar jezgre, nego je podijeljen u diskretno funkcionalne domene i čvrsto su vezani za jezgrinu ovojnicu na više mjesta. Geni koji se aktivno prepisuju smješteni su na periferiju uz kanale koji odvajaju pojedine kromosome. Nakon sinteze RNA se one otpuštaju u te kanale gdje se odvija i njihova doradba. Heterokromatin se isto nalazi na periferiji jer se neki njegovi dijelovi povezani sa laminom. Zbog različitih tipova stanica su i različiti dijelovi fakultativnog kromatina vezani za matriks lamine. Kromatin je u interfaznoj jezgri organiziran u petlje ( 50 – 100 kb DNA ). Kod Oocita vodozemaca se dobro vide izvučene petlje, dijelovi koji se aktivno prepisuju. Replikacija DNA se odvija u velikim strukturama koje sadržavaju veliki broj replikacijskih kompleksa organiziranih u zasebna funkcionalna tjelešca, a koje se nazivaju replikacijskim tvornicama. Geni koji se aktivno prepisuju raspoređeni su u jezgrinim pjegama. Ostala tjelešca: -

PML – tjelešca – mjesta lokalizacije regulacijskih proteina u bolesnika sa akutnom promijelocitnom leukemijom Cajalova tjelešca – sadrže karakteristične protein koilin i bogata su malim RNP, a funkcioniraju kao mjesta uspostave i obrade RNP

Jezgrica i doradba rRNA U jezgrici ( nukleolus ) dolazi do sinteze rRNA, njihove doradbe i sklapanja ribosomskih podjedinica. Ribosomi viših eukariota imaju četiri tipa rRNA, a to su 5S, 5,8S, 18S i 28S. Svi osim prvog se prepisuju kao jedna molekula unutar jezgre pomoću RNA-polimeraze I, što daje 45S prekursor ribosomske RNA. Taj prekursor obrađuje se sve do 18S rRNA koji nalazimo u maloj ribosomskoj podjedinici ( 40S ), te do 5,8S i 28S koji su dijelovi velike podjedinice ( 60S ). Transkripcija 5S rRNA se događa u izvan jezgre pomoću RNA-polimeraze III. Geni za 5,8S, 18S i 28S rRNA grupirani su u područjima uzastopnih ponavljanja na pet različitim ljudskim kromosomima ( 13,14,15,21,22 ),a geni za 5S u jednom području prvog kromosoma. Jezgrica je podijeljena u tri dijela: -

fibrilarni centar gusta fibrilarna komponenta granularna komponenta

Dijelovi kromosoma, koji sadržavaju gene za 5,8S, 18S i 28S rRNA, nazivaju se nukleolarnim organizacijskim regijama. Oni imaju skupinu uzastopno ponovljenih gena za rRNA odvojenom neprepisujućom DNA-razmaknicom. Ta područja vrlo aktivno prepisuje DNA-polimeraza I i vidljiva su kao područja nalik božićnom drvcu. Uočljivi su rastući, gusto pakirani lanci RNA, a tu gustoću održava RNA-polimeraza I ( jedna polimeraza na stotinu parova baza kalupa DNA lanca ). Male jezgrine RNA ( snoRNA ) sudjeluju u doradbi pre-rRNA. Udružuju se sa proteinima i formiraju snoRNP. Odgovorne su za kidanje pre-rRNA u 18S, 5,8S i 28S molekulama. Najčešća sno RNA je U3 i ona kida pre-rRNA unutar razmaknica koje se prepisuju na 5'kraju. U8 kida na 5,8S i 28S, a U22 na 18S rRNA.

Sastavljanje ribosoma Formiranje ribosoma uključuje spajanje preteča Ribosomske RNA s ribosomskim proteinima i 5S rRNA. Geni koji kodiraju ribosomske proteine prepisuju se izvan jezgrice uz pomoć RNA-polimeraze II. Oni zatim ulaze u jezgricu gdje se spajaju sa rRNA i formiraju preribosomske čestice. 5S rRNA se također uz RNA-polimerazu III spaja u jezgrici. Udruživanje ribosomskih proteina počinje još dok sinteza pre-rRNA traje, te se na nju još vežu proteini prije njezina kidanja.

III. RAZVRSTAVANJE I PRIJENOS PROTEINA Za razliku od prokariotske stanice, eukariotske sadrži organele pomoću kojih se razvrstavaju proteini, koji nastaju u ribosomima na membrani endoplazmatskog retikuluma. Polipeptidni lanac ulazi u ER gdje se dorađuje i usmjeruje do Golgijevog aparata vezikulama, od kojeg se dalje šalju u lizosome, endosome, staničnu membranu ili izvan stanice. GA, ER, endosomi i lizosomi se razlikuju od ostalih organela jer su uključeni u prijenos proteina pomoću vezikula.

Endoplazmatski Retikulum Sastoji se od sustava cjevčica i vrećica koje su okružene membranom. Čini ga jedna neprekinuta membrana koja se nastavlja od jezgre i može činiti i do 50% ukupnih membrana stanice, a njegov lumen i do 10% ukupnog volumena stanice. Sastoji se od tri različita dijela, a to su hrapavi ( sadrži ribosome na površini ), prijelazni ( izlaze vezikule prema Golgijevom aparatu ) i glatki ER ( sudjeluje u proizvodnji lipida ) George Palade je proučavajući serozne acinuse gušterače otkrio da proteini nastaju u hrapavom endoplazmatskom retikulumu, koji se premještaju u Golgijev aparat, a iz njega pomoću sekretotnih vezikula odlazi na staničnu membranu s kojom se stapa. Tako je otkriven sekrecijski put kojim se koriste i proteini namijenjeni drugim odjeljcima. Proteini koji su namijenjeni za membranu ER-a, GA, lizosome ili staničnu membranu, odmah su usmjereni u ER ( u stanicama sisavaca, proteini ulaze u ER dok translacija mRNA još traje ), a oni koji su namijenjeni za jezgru, mitohondrije, kloroplaste ili peroksisome, sintetiziraju se na slobodnim ribosomima u citosolu ( nakon translacije ). KOTRANSLACIJSKA TRANSLOKACIJA – premještanje proteina u ER dok translacija još traje ( SRP ) -

ER, GA, lizosomi, stanična membrana

POSTTRANSLACIJSKA TRANSLOKACIJA – premještanje proteina nakon translacije ( BiP ) -

citosol, jezgra, mitohondriji, kloroplasti, peroksisom

Slobodni ribosomi u citosolu i oni na membrani ER se ne razlikuju. Sinteza svakog proteina započinje na slobodnim u citosolu, koji se nakon toga usmjeruju prema ER-u pomoću aminokiselinskog slijeda na polieptidu. Taj kratki signalni slijed se sastoji od hidrofobnih aminokiselina, koji se nakon ulaska u ER odcijepi. Kada se stanica razori, ER se raspada na mikrosome koji nastaju od hrapavog ER-a, a posjeduju ribosome na vanjskoj strani. Hrapavi mikrosomi su gušći od glatkih, te se mogu centrifugiranjem izolirati u gradijentu gustoće. Pokusi su potvrdili da ako se mRNA koja kodira sekrecijski protein prevodi na slobodnim ribosomima in vitro, nastaje protein nešto duži od odgovarajućeg izlučenog proteina. Ako se u sustav dodaju i mikrosomi, sekrecijski protein se usmjeruje u mikrosom ( ekvivalent hrapavom ER-u) i cijepa se pomoću mikrosomske proteaze do prave veličine.

Čim započne sinteza proteina na slobodnom ribosomu u citosolu, SRP čestica ( signal recognittion particle ) prepozna signalni slijed i veže se za nastali polipeptid i ribosom, zaustavlja translaciju, te ga usmjeruje prema ER-u. SRP čestica se sastoji od 6 polipeptida i od SRP RNA, koja ima dvije regije fleksibilne poput šake. Na membrani ER se nalazi SRP receptor ( integralni membranski protein izložen na citosolnoj strani ER-a ) na koji se veže SPR čestica, ribosom i polipeptid. Kada su tako vezani za SRP receptor, pridružuje se GTP molekula koja disocira u GDP i otpušta SRP česticu od receptora i rRNA kompleksa. Ribosom se potom veže za translokacijski kompleks i signalni slijed uvuče u membranski kanal ili translokon. Translokon je izgrađen od triju transmembranskih proteina nazvanih Sec61. Signalna sekvenca dolazi u interakciju sa kratkim hidrofobnim lancima u vratu translokona, što otvara ˝čep˝ u membranskom kanalu. Signalna peptidaza cijepa signalnu sekvencu sa polipeptida i on ulazi u lumen ER-a. Proteini koji se usmjeruju u ER nakon translacije ( posttranslacijska translokacija ) drugačije ulaze u lumen ER. Umjesto SRP čestica i SRP receptora, njihove signalne sljedove prepoznaju receptorski proteini Sec62/63, a posebni citosolni Hsp70 šaperoni održavaju lanac raspetljanim. Peptidni lanac kroz membranski kanal uvlači posebni Hsp70 šaperon, koji se nalazi unutar ER i nazvan je BiP. Proteini koji su namijenjeni staničnoj membrani ili membranama ER, GA i ostalih već navedenim organelima, ne ulaze u lumen ER, nego putuju kroz membranu do svog odredišta kao u sekrecijskom putu. Integralni membranski proteini uklopljeni su u staničnu membranu pomoću hidrofobnih sljedova. Sastoje se od 20-25 hidrofobnih aminokiselina koje tvore α-uzvojnicu, te se tako maksimalizira broj vodikovih veza između peptidnih veza, a bočni ogranci aminokiselina stupaju u interakciju sa repovima masnih kiselina fosfolipida. Integralni proteini se razlikuju po načinu uranjanja u membranu. Neki ju premošćuju samo jednom, dok ostali višestruko. Također im je u citosolnu stranu membrane okrenut ili amino – kraj ili karboksilni kraj. Ovakva orijentacija proteina na membranama ER-a, GA-a, lizosoma i staničnih membrana tijekom translokacije rastućeg polipeptidnog lanca. Pošto je lumen ER ekvivalentan vanjskoj strani membrane, domene proteina koji se nalazi na membrani sa vanjske strane stanične membrane odgovaraju regijama polipeptidnih lanaca koji se translociraju u lumen ER-a. Ugradnja proteina u membranu odvija se sintezom transmembranskih proteina čiji karboksilni kraj okrenut u citosol, a na svom amino kraju imaju normalni signalni slijed, koji ih ˝dovuče˝ do ER. Oni se sidre u membranu pomoću druge α-uzvojnice, nazvanom zaustavni slijed, koja se nalazi u sredini lanca. Kada translokon prepozna zaustavni slijed, dolazi do konformacijske promjene. Daljnji prijenos se zaustavi, karboksilni kraj lanca ostaje u citosolu, podjedinice kanala se razdvoje i transmembransko područje ( α-uzvojnica ) proteina uđe u lipidni dvosloj. Neki proteini imaju signalni slijed za ugradnju u membranu kojeg signalna peptidaza ne može ukloniti. Takve sljedove prepozna SRP i donose ih do ER. Pošto ti sljedovi ne bivaju uklonjeni, oni djeluju kao α-uzvojnice i sidre se u membranu. Unutarnji sljedovi mogu biti orijentirati tako da u citosol strši amino-kraj ili karboksilni kraj. U membranu se mogu ugraditi i proteini koji ju više puta premošćuju, a to se postiže naizmjeničnim signalnim i zaustavnim sljedovima u lancu. Svakim signalni slijedom lanac raste, a svakim zaustavnim se ugrađuje u lipidni dvosloj.

U ER-u dolazi do doradbe proteina, smatanja, udruživanja podjedinica, stvaranje disulfidnih veza. Također se odvijaju početni stupnjevi glikolize, dodavanje glikolipidnih sidara. Proteini ulaze u ER razmotani, te se uz pomoć BiP i Hsp70, koji se vežu na lanac, smotaju. Tako smotani proteini otpuštaju šaperone i odlaze prema GA-u, a oni loše smotani razrađuju. U ER-u nastaju disulfidne veze ( S-S ) iz cisteinskih ostataka zbog oksidirajućeg okruženja, dok u citosolu ne nastaju zbog reducirajućeg okruženja ( -SH ). U nastajanju tih veza pomaže protein-disulfid-izomeraza. Još dok se protein nalazi u ER-u dolazi do njegove glikolizacije. Oligosaharidi ( od 14 šećernih ostataka) se sintetiziraju na membrani ( dolikol ) koji se pomoću oligosaharil-transferaze prenose na asparaginske ostatke konsenzus-sljeda Asn-X-Ser/Thr na rastući protein koji ulazi u ER. Tri glukozna ostatka i jedna manoza se uklanjaju još dok je protein u ER-u. Neki proteini su vezani glikolipidima za membranu, a nazvani su glikozilfosfatidil-inozitolna ( GPI ) sidra. U ER-u dolazi i do provjere kvalitete proteina, tj. dolazi do prepoznavanja dobro smotanih, loše smotanih i jako loše smotanih proteina. Taj proces je složen i uključuje BiP, šaperone, proteindisulfid-izomerazu i mnoge pomoćne proteine. Jedan od putova prepoznavanje ide preko glikoproteina kalretikulina, koji prepozna djelomično dorađene oligosaharide na novonastalim proteinima, te im pomaže u pravilnom smatanju. Odvajanje terminalnog glukoznog ostatak sa glikoproteina ga oslobađa od kalretikulina. Oni dobro smotani odlaze u tranzicijski ER, oni loše smotane se upućuju ponovno u ciklus sa kalretikulinom tako da im se ponovno doda glukozni ostatak na oligosaharid, a oni koji su ozbiljno poremećeni se upućuju na retro-translokaciju, put degradacije gdje bivaju u citosolu obilježeni ubikvitinom. BiP igra važnu ulogu u signalizaciji. Ako se u stanici nakupi previše ne smotanih proteina dolazi preko BiP-a do ˝reakcije na ne-smotane proteine˝. BiP ima dovoljno u stanici da se uvijek omoguće svi procesi vezani uz njega, no kada dođe do prevelikog broje ne smotanih proteina, oni se počinju natjecati za slobodne BiP-ove. Dolazi do oslobađanja signalnih molekula koje signaliziraju odgovor na ne smotane proteine, dolazi do inhibicije proteinske sintaze i povećanja ekspresije šaperona. Ako ništa od toga ne pomogne nastupa stanična smrt ili apoptoza.

Glatki ER i sinteza lipida Pošto su lipidi izrazito hidrofobni, oni ne nastaju u citosolu, nego u ER. Od ER-a se prenose do ostalih membrana, ili preko glatkog ER do trans golgijeve mreže, preko vezikula ili proteinskih nosača. Membrane eukariotskih stanica sastoje se od fosfolipida, glikolipida i kolesterola. Većina fosfolipida sintetizira se na citosolnoj strane ER-a iz u vodi topljivih preteča. Masne kiseline se najprije prebace sa koenzima A na glicerol – 3 – fosfat, te tako nastali spoj ugradi u membranu. Enzimi na citosolnoj strani membrane mijenjanju fosfatidnu kiselinu u diacilglicerol i kataliziraju dodavanjem raznih polarnih skupina glave lipida, te tako nastaju fosfatidilkolin, fosfatidilserin, fosfatidiletanolamin i fosfatidilinozitol. Ti fosfolipidi omogućuju hidrofobnim lancima masnih kiselina da ostanu uronjeni u membrani dok enzimi na citosolnoj strani kataliziraju njihove reakcije u citosolu sa pretečama koje su topljive u vodi ( npr. CFP-kolin ). Proteini pod imenom Flipaze omogućuju prebacivanje fosfolipida na drugu stranu membrane radi očuvanja stabilnosti membrane ( osiguranje ujednačenog rasta obiju strana ).

U ER-u se također sintetizira i kolesterol i ceramid, koji se u GA-u može pretvoriti u glikolipide ili u sfingomijelin. ER-a ima općenito mnogo u stanicama koje aktivno sintetiziraju lipide ( jajnici i testisi ). Jetra sadrži enzime za pretvorbu različitih sastojaka topljivih u lipidima, igra važnu ulogu u detoksikaciji od lijekova. Proteini i lipidi se prenose sa prijelaznog ER tako da pupaju kao vezikule koje se prenose do GA. Od GA se mogu dalje prenositi do endosoma, lizosoma ili do stanične membrane, a njihova orijentacija se putem ne mijenja. Oni imaju na svojoj citosolnoj strani signale za izvoz iz ER. Proteini koji djeluju u ER-u imaju ciljni slijed KDEL ( Lys-Asp-Glu-Leu ), koji ih vraća u ER,a ako se taj slijed ukloni, oni će biti izbačeni iz stanice. Neki transmembranski proteini iz ER-a na sličan način su obilježeni kratkim završnim C-sljedovima koji sadržavaju lizina ( sljedovi KKXXX ). Proteini koji imaju ove sljedove se pakiraju u reciklažne vezikule i vraćaju u ER.

GOLGIJEV APARAT Djeluje kao tvornice jer se u njemu dorađuju proteini pridošli uz ER-a, te dalje šalju u lizosome, endosome, staničnu membranu ili izlučuju iz stanice. Također je bitan zbog sinteza sfingomijelina i glikolipida. Građen je izrazito polarno i razlikuje se njegova cis-strana koja je okrenuta prema jezgri i njegova trans-strana. Možemo ga podijeliti u četiri dijela i to na cis-golgijevu mrežu, golgijev stog ( sastoji od medijalnog i trans pododjeljka )i na trans-golgijevu mrežu. Proteini iz ER-a odlaze u ER-Golgijev pododjeljak, zatim ulaze na njegovu cis-stranu, prolaze medijalni i trans pododjeljak i na kraju dolaze u trans-mrežu, koja ima ulogu završnog razvrstavanja i slanja vezikula u daljnja odredišta. U GA-u dolazi do dorade N-vezanih oligosaharida, koji su bili dodani u ER-u, točno određenim nizom reakcija. 123456-

Uklanjanje triju manoznih ostataka Dodavanje N-acetilglukozamina Uklanjanje još dviju manoza Dodavanje Fukoze i još dva N-acetilglukozamina Dodavanje triju galaktoza Dodavanje triju sijalinskih kiselina

U GA-u ne dolazi do obrade svih proteina podjednako. Sve ovisi o vrsti proteina, enzima prisutnih u GA-u i o vrsti stanice. Šećerne ostatke dodaju enzimi glikozil-transferaze, a odstranjuju glikozidaze. Proteini namijenjeni za lizosome, prije nego što dođe do uklanjanja početne manoze, najprije dolazi do fosforillacije manoze: 1- N-acetilglukozamin-fosfat dodaje se na ostatke manoze dok je protein još u cis-mreži 2- Uklanja se N-acetilglukozamin, te ostaje manoza-6-fosfatni ostatak

U trans-mreži receptori za manozu-6-fosfat taj protein šalju preko endosoma u lizosom. Odrednica prepoznavanja koja dovodi do fosforilacije manoze i konačnog slanja u lizosome, ovisi o trodimenzionalnoj konformaciji smotanog proteina. Ta se odrednica naziva signalnim plohama. Fosfogliceridi, kolesterol i ceramid se sintetiziraju u ER, a iz ceramida u GA-u nastaje sfingomijelin i glikolipidi. Sfingomijelin se sintetizira prijenosom fosfotilkolinske skupina sa fosfatidilkolina na ceramid. Sfingomijelin nastaje na luminarnoj strani GA, a dodavanje glukoze se vrši na citosolnoj strani, te se on ( glukozilceramid ) mora preseliti na drugu stranu zbog dodavanja i Glikolipida. U biljnim stanicama se također stvaraju još i polisaharidi za staničnu stjenku U trans-mreži GA dolazi do razvrstavanja proteina u vezikule, koji se zatim šalju dalje u staničnu membranu, izvan stanice ili u lizosome i endosome. Proteini koji se trebaju zadržati u GA-u imaju u svom transmembranskom dijelu signal, te oni nisu otopljeni u lumenu, nego se nalazi u membrani GA-a. Proteini se mogu izlučivati iz GA-a na tri načina. Najjednostavniji način je transportom od trans-mreže do stanične membrane ( ugradnja u nju )ili izvan stanice. Mogu se prenositi putem prijelaznih reciklažnih endosoma ( jedan od triju tipova u životinjskoj stanici ). Proteini se mogu otpuštati i reguliranim putem signalom iz vana ( hormoni, neurotransmiteri, otpuštanje probavnih enzima ), koje je posredovano teretnim receptorima. Oni prepoznaju signalne plohe, koje su zajedničke za mnoge proteini koji se izlučuju ovim putem iz trans-mreže. Ovi kompleksi tereta i receptora selektivno se agregiraju u cisternama trans-mreže i oslobađaju se pupanjem nezrelih sekrecijskih vezikula, koje su veće od transportnih. Oni se stapaju sa drugim nezrelim vezikulama i stvaraju zrele sekrecijske vezikule, koje se izlučuju tek kada dođe odgovarajući signal iz vana ( prisutnost hrane u želudcu i tankom crijevu uzrokuje lučenje enzima u gušterači ). Epitelne stanice su polarizirane kada se stapaju u tkivo, te na njima razlikujemo apikalno i bazolateralno područje, a oni imaju različite proteine. U crijevnim resicama, apikalan strana je okrenuta lumenu i specijalizirana je za apsorpciju hrane, a bazolateralna prekriva ostatak membrane. Zbog toga se proteini u tim stanicama moraju usmjeriti ili prema apikalnoj ili prema bazolateralnoj strani. U kvasaca i biljaka ne postoje lizosomi. Njih zamjenjuje vakuola, a proteini se u nju šalju kratkim signalnim slijedom, a ne ugljikohidratnim sljedovima.

Mehanizam Vezikularno transporta Transportne vezikule imaju važnu ulogu u prijenosu tvari među odjeljcima okruženih membranom. Pri tome je bitna i selektivnost takvog transporta. Lizosomski enzimi se moraju slati od GA-a do lizosoma, a ne do stanične membrane ili ER-a. Transportne vezikule su obložene citosolnim oblažućim proteinima, pa se zovu obložene vezikule. Njihovo nastajanje reguliraju mali proteini koji vežu GTP u srodstvu sa proteinima Ras i Ran. Dvije obitelji proteina koji vežu GTP imaju ulogu u pupanju transportnih vezikula: 1. porodica faktora ADP-ribolizacije - ARF1-3 - Sar1 2. velika porodica proteina Rab Oni se grutiraju i reguliraju proteine adaptere koji su u izravnoj interakciji s oblažućim proteinom vezikule. Udruživanjem proteina za GTP i proteina adaptera nastaje platforma za određene procese, kao što su stvaranje transportnih vezikula. Postoje tri vrste obloženih vezikula: 1.) COPI - pupaju sa ERGIC-a* i imaju ulogu vračanja proteina u prijašnje odjeljke – reciklažni put 2.) COPII - pupaju iz prijelaznog ER-a, prenose proteina u ERGIC, te u GA. 3.) Klatrinom obložene vezikule - Pupaju iz trans-mreže i vode proteine u endosome, lizosome i do stanične membrane potreban klatrin, protein ARF1 koji veže GTP, te barem dvije vrste proteinskih adaptera *ERGIC – međuodjeljak između ER-a i GA-a

Nastajanje takvih vezikula odvija se ovako: 1.) kompleks ARF/GDP veže se za proteine GA membrane 2.) Faktor izmjene ARF-gvaninskog nukleotida počinje izmjenu GDP s GTP 3.) ARF/GTP počinje pupanje privlačenjem proteinskih adaptera, koji potom služe kao vezna mjesta i za transmembranske receptore i za klatrin Klatrin ima strukturnu ulogu, jer njegove molekule sastavljaju rešetku oblika košare, koja uvija membranu i time započinje pupanje vezikule 4.) ARF/GDP kompleks otpušta se s membrane i reciklira Stapanje vezikula započinje tako da vezikula mora najprije prepoznati svoje odredište, a nakon toga stopit se s njim i predati svoj sadržaj. Stapanje vezikula posredovano je interakcijama između parova specifičnih transmembranskih proteina nazvanim SNARE. Mogu se nalaziti na vezikuli ( v-SNARE ) i na ciljnoj membrani ( t-SNARE ), te stvaranjem kompleksa između njih dovodi do stapanja vezikula ( oslobađa se energija potrebna za približavanje dvaju lipidnih dvosloja ). Rab-proteini također sudjeluju u ovome procesu ( neki od njih su npr. Rab1, Rab1b…Rab6,Rab7,Rab21…). Njihov smještaj

na pravoj membrani je kao ključ za uspostavljanje specifičnosti vezikularnog transporta. Svi SNARE proteini imaju spiralno namotanu središnju domenu.

LIZOSOMI Lizosomi su organeli okruženi membranom koji služe za probavu ( razgradnju ) tvari donošenih u stanicu i za dijelove unutar stanice. Sadrže više od 50 različitih hidrolitičkih enzima za razgradnju proteina, DNA, RNA, polisaharida i lipida. Mutacijom gena koji kodiraju ove enzime nastaju lizosomske bolesti odlaganja. Većina lizosomskih enzima su kisele hidrolaze, koje su jedino aktivne u Ph području 5. Kada lizosom pukne, njegovi enzimi ne će biti aktivni u citosolu ( Ph 7,2 ). Lizosomi održavaju svoj kiseli medij pomoću protonskih crpki, koje ubacuju
 , a za to je potreban ATP. Jedna od glavnih uloga lizosoma jest probava unesenog materijala izvana endocitozom. Lizosomi nastaju stapanjem transportnih vezikula koje pupaju iz trans-mreže i spajaju se sa kasnim Endosomima, koji sadrže molekule unesene endocitozom sa stanične membrane Endosomi predstavljaju raskrižje sekrecijskog puta i endocitoznog puta. Životinjska stanica ima tri tipa endosoma. Rani endosomi se nalaze blizu stanične membrane i oni primaju sadržaj kojeg razvrstavaju. Tvari koje se trebaju vratiti u staničnu membranu se pomoću reciklažnih endosoma šalju nazad u membranu ( membranski receptori ), a oni koji su namijenjeni razgradnji se šalju kasnim endosomima za stapanje sa lizosomskim enzimima. Dozrijevanje ranih u kasne endosome obilježeno je snižavanjem Ph do oko 5,5. Daljnje uloge lizosoma: 1. Fagocitoza – specijalizirane stanice poput makrofaga i neutrofila unose i razgrađuju velike čestice ( bakterije, stanilni otpad i dotrajale stanice ). Te se čestice unose u fagosome, koji se potom stapaju sa lizosomima ( fagolizosomi ). 2. Autofagija – razgradnja vlastitih staničnih dijelova i ovaj mehanizam funkcionira u svim stanicama. Proces započinje ograničenjem malog područja citoplazme i organela citosolnom membranom, a nastala vezikula ( autofagosom ) se stapa sa lizosomom.

IV.

Citoskelet i stanično kretanje

Citoskelet se sastoji od aktinskih vlakana, intermedijarnih i mikrotubula, koji su međusobno povezani putem različitih proteina. Također su vezani i sa organelima i sa staničnom membranom.

Struktura i organizacija aktinskih vlakana Glavni element citoskeleta je aktin, koji polimerizacijom daje aktinska vlakna ( mikrofilamenti ). Takva vlakna tvore snopove i trodimenzionalne mreže čije stvaranje reguliraju različiti proteini. Najgušća mreža je ispod same membrane jer daje čvrstoću i oblik stanici. Aktin je u većim količinama prisutan u mišići. Kvasci imaju samo jedan gen koji kodira aktin, dok viši eukarioti ( sisavci ) imaju i do 6 gena za aktin. Aminokiselinski slijed aktina u kvasca je gotovo identičan onome u višim euakriotima ( 90% ). Monomeri aktina su globularni proteini sa oko 375 aminokiselina ( globularni G aktin ), a na njima razlikujemo vezna mjesta za glavu i rep drugog monomera. Polarni su, te razlikujemo na svakome točkasti i kukasti kraj. Oni se udružuju dimere, trimere i konačno u vlaknasti F aktin, koji ima oblik dvolančane uzvojnice u kojoj je svaki monomer rotiran za 166°. U otopinama niske ionske jakosti aktin depolimerizira. Povećanjem ionske jakosti do fiziološke vrijednosti dovodi do njihove spontane polimerizacije. Prvi korak je stvaranje male nakupine od tri monomera aktina ( nukleacija ). Aktinska vlakna onda rastu reverzibilno na kukastom i na točkastom kraju ( na kukastom pet do šest puta brže ), a vezanje ATP-a i njegovom hidrolizacijom u ADP ubrzava proces, ali nije nužan. Brzina dodavanja monomera je proporcionalna njihovoj koncentraciji, pa prema tome postoji trenutak kada je u ravnoteži brzina dodavanja i odvajanja (dinamička ravnoteža ). Kada je u ravnoteži neto-dodavanje monomera sa oduzimanje monomera na plus i minus kraju, dolazi do fenomena hoda u mjestu. -

Citohalazin – veže se na kukasti kraj i sprječava vezanje monomera Posljedica je primjena oblika stanice i inhibicija nekih staničnih pokreta Faloidin – Veže se čvrsto na aktinska vlakna i ne dopušta njihov raspad

U mnogim stanicama dinamika aktina nije u ravnoteži Proteini koji reguliraju stvaranje aktinskih vlakana mogu na više načina djelovati: 1. 2. 3. 4.

Povezuju se na aktinska vlakna čitavom njegovom dužinom i tako ga stabiliziraju Povezuju se na krajeve vlakna i tako sprječavaju oduzimanje i dodavanje Neki razgrađuju aktinska vlakna Neki se vežu na monomere aktina i kontroliraju njihovo združivanje regulirajući izmjenu ATP/ADP

Početni stadij stvaranja aktinskog vlakna je nukleacija u kojoj sudjeluje formin i Arp2/3. Formin pripada obitelji velikih proteina, a sliče na tračnice s kukastim krajem. Oni se pomiču usporedno sa rastom vlakna i na kukasti kraj dodaju monomere. Oni formiraju nerazgranata vlakna , koja čine stres

vlakna, kontraktilni obruč, filopodije i tanka vlakna mišićnih stanica. Takva vlakna su stabilna jer ih stabiliziraju proteini ( tropomiozin ). Arp2/3 se veže u blizinu kukastog kraja i stvara ogranak na aktinskom vlaknu. Sastoji se od sedam proteina ( dva slična aktinu ) i aktiviraju ga drugi proteini koji se vežu na njega. ADR/kofilin veže se na minus kraj vlakna i ubrzava odvajanje aktin/ADP monomera. Može također raskinuti vlakna stvarajući više plus krajeva. On ostaje vezan za aktin/ADP monomer da bi spriječio ponovno udruživanje otkinutih lanaca. Profilin može poništiti djelovanje kofilina i potaknuti zamjenu ADP u ATP. Tako nastaje aktin/ATP koji se otpušta od kofilina i može sudjelovati u procesu polimerizacije. Arp4-8 je povezan sa aktinom i sudjeluje u remodeliranju kromatina u biljaka i u životinja, te može sudjelovati i u stvaranju jezgre nakon diobe.

Organizacija aktinskih vlakana Pojedina aktinska vlakna se mogu udruživati u snopove ili mreže. U snopovima su oni poprječno povezani u stisnute paralelne redove, a u mrežama su snopovi gotovo okomiti jedan na drugog i imaju svojstvo polučvrstih gelova. Proteini koji organiziraju snopove su mali i krute, te prisiljavaju vlakna da se približe jedni drugima. Proteini koji organiziraju mreže su veliki i savitljivi. Oni sadrže najmanje dvije domene da bi mogli vezani s obe strane aktinska vlakna tj. povezivati ih. Postoje dvije vrste snopova: -

-

Prvi tip sadržava tijesno zbijena paralelna vlakna aktina koja podupiru izbočine membrane citoplazme ( mikrovili ), a protein koji sudjeluje u stvaranju tih snopova je fimbrin ( ima dvije domene, a na vlakna se veže kao monomer ). Ti snopovi su polarni sa plus krajem okrenutim staničnoj membrani. U stvaranju drugog tipa snopova sudjeluje α-aktinin, koji se veže na vlakna kao dimer, ostavljajući tako više mjesta između aktinskih vlakana. Takvi snopovi se nazivaju kontraktilni snopovi. U njima motorički protein miozin dolazi u interakciju sa aktinom.

Aktinska vlakna u mreže veže filamin. On ima oblik slova ˝V˝ ili škarica. Na vrhu su povezani dva filamina u dimere, a sa svojim parnim krajevima oni se vežu za aktin. Prema tome razlikujemo domenu za dimerizaciju i domene za vezanje s aktinom.

Udruživanje aktinskih vlakana sa staničnom membranom Aktinska vlakna na periferiji stanice ( ispod stanične membrane ) oblikuju mrežu, koju nazivamo stanična kora. U eritrocita spektrin veže aktin, a član je porodice kalponina. Spektrin je tetramer sačinjen od α i β polipeptidnog lanca. β-lanac ima domenu koja na svom amino kraju veže aktin. Oba lanca se udružuju pobočno da bi oblikovali dimere. Zatim se spajaju u tetramere ( ˝glavica na glavicu˝ ) sa dvije domene koje vežu aktin. Krajevi spektrinskih tetramera se udružuju sa kratkim aktinskim vlaknima stvarajući spektrin-aktin mrežu. Glavna spona između spektrina i aktina je ankirin. Proteini srodni spektrinu: -

protein 4.1 ( ERM-proteini ) povezuju aktinska vlakna sa staničnom membranom, a filamin tvori glavnu sponu Distrofin proizvodi gen odgovoran za dvije vrste mišićne distrofije. Ima jednu domenu koja veže na svom amino-kraju aktin i membransku veznu domenu na karboksi-kraju, te on također stvara dimere.

Neke stanične membrane na svojim površinama imaju specijalizirana mjesta za dodir sa susjednim stanicama, matriksom i ostalim tvorevinama. Ta mjesta su posebno bitna za fibroblaste. Oni izlučuju proteine izvanstaničnog matriksa, koji se lijepe za površinu posude u kulturi stanica. Oni se vežu za posudu transmembranskim proteinom ( integrini ). Mjesta vezanja nazivaju se žarišne adhezije, a to služi i za pričvršćivanje velikih snopova aktinskih vlakana zvanih tlačna ( stresna ) vlakna. Tlačna vlakna su kontraktilni snopovi međusobno povezani sa α-aktinom. Oni se na mjestima žarišne adhezije vežu na integrin. Talin i vinkulin također sudjeluju u povezivanju. U područjima staničnih dodira usidren je aktinski citoskelet ( prianjajući ili adhezivni spojevi ). Oko stanica se oblikuje adhezivni neprekinuti pojas. Kaldherin oblikuje složene tvorbe s citoplazmatskim proteinima kateninima, a oni se združuju s aktinskim vlaknima.

Izbočenja stanične površine Najviše proučena izbočenja su mikrovili na apikalnoj strani stanica specijaliziranih za apsorpciju. Oni tvore četkastu membranu. Stereocilije su slični mikrovilima, ali imaju ulogu slušnih dlačica. U mikrovilima crijeva su djelomično aktinska vlakna povezana fimbrinom, ali glavni protein je vilin. Uzduž cijelog mikrovila aktinska vlakna su sa staničnom membranom ˝bočnim rukama˝ što se sastoje od proteina koji veže kalcija i kalmodulina združenog s miozinom I. Vrste izbočenja: -

Pseudopodiji su izbočenja promjenjive dužine odgovorna za fagocitozu i kretanje amebe Lamelipodiji su široka, plahtolika izbočenja na vodećem rubu fibroblasta filopodiji su tanka izbočenja poduprta aktinskim snopovima

Mišići i mišićna kontrakcija Mišići su izgrađeni od puno vlakana i podjedinica koji se pružaju kroz čitavi mišić i u 98 % slučaja su inervirani jednim živčanim završetkom. Oni imaju sarkolemu koja je posebna vrsta membrane građena od stanične membrane koju još zovemo i plazmatska membrana i od polisaharidne ovojnice koja sadrži mnogo kolagenih vlakana. Ta kolagena vlakna čine na krajevima mišića tetive koje ih spajaju za kosti. Mišići su građeni od mnogo miofibrila koje imaju 1500 miozinskih i 3000 aktinskih niti. To su velike polimelizirane bjelančevine koje omogućuju kontrakciju. Miozinske niti su debele i zovu se još i A-pruge jer su anizotropne za polarizacijsko svjetlo mikroskopa, a aktinske su tanje i zovu se I-pruge jer su izotropne za polarizacijsko svjetlo. Miozinske i aktinske niti djelomično ulaze jedna u drugu, pa se vide svijetle ( samo aktinske niti ) i tamne ( miozinske niti i krajeve aktinskih niti ) pruge. Miozinske niti sadrže i male izdanke koji se zovu poprečni mostovi. Aktinske niti su pričvršćene za Zploču koja je također građena od nitastih bjelančevina. Z-ploča prolazi kroz pojedinu miofribrilu i povezuje susjedne miofribrile. Prostor između dvije Z-ploče zove se sarkomera ( 2 mikrometra ), a srednji dio sarkomere u kojoj se nalaze samo miozinske niti je H-zona. Miozinske i aktinske niti na okupu drži titin. To je nitasta bjelančevinska molekula relativne mase 3 000 000. Titin je vrlo elastičan i on drži miozinske i aktinske niti u povoljnom položaju za kontrakciju. Da bi se mišić podražio najprije impuls putuje živcem gdje se u aksonu oslobađa acetil-kolin. Zatim se na membrani mišića stvara akcijski potencijal koji iz sarkoplazme oslobađa Ca ione koji uzrokuju kontrakciju ( kliženje miozinskih i aktinskih niti ). Na kraju Ca crpka izbacuje ione van. Miozinska nit je građena od molekula miozina koja je građena od 6 polipeptidnih lanaca. Dva teška lanca su zavijena u heliks i čine rep miozina. Završeci svakog pojedinog lanca tvore glavicu. 4 laka lanca ( 2 u svakoj glavici ) pomažu ori kontrakciji. Glavice molekula strše van i tvore poprečne mostove. Imamo ukupno dva mjesta na kojima je moguće savijane, a zovemo ih zglobovi ( miozinručica i ručica-miozin ) Na središnjem dijelu miozina nema poprečnim mostova i svaka glavica je od slijedeće udaljena za 120 stupnjeva. Glavice djeluju kao ATPaze jer mogu razgradit ATP koji je potreban za kontrakciju. Aktinske niti se sastoje od dva lanca F-aktina koji se sastoji od G-aktina. Dva lanca su savijena u heliks kao i kod miozinske niti. Na F-aktin je nepravilno u nakupinama vezan ADP koji čini aktivna mjesta. Tropomiozinske molekule su savijene sa F-aktinom i one u mirovanju prekrivaju aktivna mjesta. Na tropomiozin je u pravilnim razmacima pričvršćen i troponin koji se sastoji od 3 labavo vezana bjelančevinska kompleksa. Troponin I ima veliki afinitet prema aktinu, troponin T prema tropomiozinu i troponin C prema Ca ionima. Troponin C može na sebe vezati i do 4 Ca iona što uzrokuje njegovu konformacijsku promjenu i otkrivanje aktivnih mjesta na F-aktinu za koje se automatski vežu glavice miozina. Kada se glavice vežu promjeni se molekularna sila na ručicama pa dolazi do uspravljanja glavice što ujedno i povlači aktinsku nit i tako dolazi do kontrakcije. Što je veći mišićni rad to je i veća potrošnja ATP-a ( Fennov učinak ). Kada je glavica vezana za aktivno mjesto njoj je potreban ATP da se otkine od aktinske niti. Njegovom razgradnjom glavica se otkine, ali na njoj ostane vezan ADP. Glavica se naginje prema aktinskoj niti i ponovno veže za aktivno mjesto što uzrokuje promjene u molekularnim silama glavice u ručice. Dolazi do uspravljanja glavice i

povlačenja akinske niti, zatim razgradnje ATP-a i tako se cijeli proces ponavlja. Naginjanje glavice zove se zamah. Najveća napetost mišića je pri duljini sarkomere od 2 mikrometra. Osim što se ATP troši za miozinske glavice,potreban je i za prebacivanje Ca iona iz sarkoplazme u sarkoplazmatsku mrežicu i za izbacivanje Na i K kroz membranu. Mišići svoj ATP dobivaju na tri načina. Prvo iz fosfokreatina kojeg ima vrlo malo. Drugo glikolizom glikogena koji se razgrađuje na mliječnu i pirogrožđanu kiselinu. Prednost glikolize je ta što nije potreban kisik, a nedostatak što se brzo u mišiću nakupljaju štetne tvari. Treći način je oksidacijski metabolizam ( ugljikohidrati, bjelančevine i masti ). Ovim se putem dobiva 95 % potrebne energije za rad mišića. Korisnost kontrakcije mišića u najpovoljnijim uvjetima iznosi samo 25 %. Pri izometričnoj kontrakciji se mišić ne skraćuje, a pri izotoničnoj se skraćuje, ali napetost ostaje ista. Najmanji mišić u srednjem uhu je m. stapedius, a najveći m. kvadriceps. Brza vlakna su deblja, jače se kontrahiraju, imaju manju opskrbu kisikom jer im nije potreban, imaju puno glikolitičkih enzima za razgradnju glikogena i imaju manje mitohondrija. Spora vlakna su tanja, inerviraju ih tanji živci, imaju dobro razvijen sustav kapilara, sadrže velike količine mioglobina koji je sličan hemoglobinu. On veže na sebe kisik, pa se ta vlakna zovu crveni mišići, a spora bijeli mišići.

Aktin i miozin u nemišićnim stanicama Primjeri za to su tlačna vlakna i adhezijski pojasi. Kontrakcijom tlačnih vlakana stvara se napetost u stanici i omogućuje joj da se kreće po supstratu, a adhezijski pojas mijenja oblik ploča epitelnih stanica. U citokinezi se stvara kontrakcijski prsten građen od aktinskih vlakana i miozina II, a u biljaka dolazi do združivanja aktina ( fragmoplast ). U bakterija protein MreB sudjeluje u diobi. Aktin-miozinska kontrakcija je regulirana fosforilacijom jednog od lakih miozinskih lanaca ( regulacijski lanac ). enzim koji katalizira tu reakciju nazvan je kinaza miozinskog lakog lanca, a njegova regulacija povezana je s proteinom koji veže kalcijeve ione – kalmodulin.

Nekonvencionalni miozini Oni za razliku od miozina II nemaju glavice i ne sudjeluju u kontrakciji. Miozin I ima globularni skupinu glavice, manje su molekule, nemaju dugačak rep i ne stvaraju dimere. Njihovi repovi se mogu vezati na druge molekule i organele. Funkcije: -

oblikovanje bočnih ručica pomicanje stanične membrane duž aktinskih snopova prema vrhu mikrovila transport vezikula i organela duž aktinskog vlakna kretanje stanične membrane tijekom fagocitoze produljivanje pseudopodija

Otkriveno je da postoje još miozina ( miozin III – XIV ): -

V,VI – transport tereta i kretnje molekula III – osjetne funkcije za vid VI, VII – osjetne funkcije za sluh

Oblikovanje izbočenja i kretnje stanica Kretnje stanice ili produljivanje dugačkih nastavaka stanice uključuje koordinirani ciklus kretnji, koji se može promatrati u više faza. 1. razvoj inicijalne polarnosti 2. izbočenja ( pseudopodiji ) moraju se protegnuti da bi nastao vodeći rub stanice i moraju se pričvrstiti na podlogu Ova faza uključuje grananje i polimerizaciju filamenata aktina

3. Stražnji rub stanice mora se odvojiti od podloge i uvući u tijelo stanice WASP/Scar – aktivator kompleksa Arp2/3, koji inicira grananje vlakana aktina u blizini kukastog kraja, koji mogu gurati membranu stanice. Kako kukasti krajevi rastu, točkasti se razgrađuju pomoću ADF/kofilina. ADP-aktinski monomeri se prenose do kukastog kraja pomoću tvinfilina.

Intermedijarna vlakna Usporedba veličina: -

Mikrotubuli – 25 nm Intermedijarna vlakna – 8 do 11 nm Aktinska vlakna – 7 nm

Ne sudjeluju u staničnim pokretima, nego daju čvrstoću i strukturu. Građeni su od 65 različitih proteina, svrstanih u 6 skupina: I. II. III.

IV.

Keratin tipa I ( kiseli ) Keratin tipa II ( neutralni/lužnati ) kopolimeriziraju čvrsti keratini izgrađuju kosti, nokte rogove mekani keratini prisutni u citoplazmi epitelnih stanica Vimentin ( proteini intermedijarnih vlakana ) – fibroblasti, glatki mišići, bijele krvne stanice, Dezmin – mišićnim stanicama, povezuje Z-ploče kolagen tipa II prisutan u glija stanicama Proteini neurofilamenata ( NF ) – NF-L ( light ), NF-M ( medium ), NF-H ( heavy )

-

Prisutni u aksonima motoričkih neurona protein tipa IV ( α – interneksin ) eksprimiran je u ranijim stadijima razvitka neurona, i prije izražaja proteina neurofilamenta. V. Lamini jezgrine ovojnice VI. Nestini – Prisutni u embrionalnom razvoju nekoliko stanica ( matične stanice ).

Svi proteini intermedijarnih vlakana imaju središnju α-uzvojnicu od približno 310 aminokiselina.

Izgradnja intermedijarnih vlakana Prvo se stvaraju dimeri, zatim se povezuju antiparalelno i s pravilnim pomakom, te nastaju tetrameri. Oni se mogu međusobno združiti i tako nastaju protofilamenti. Završni oblik je 8 protofilamenata omotanih jedan oko drugog u strukturu nalik užetu. Intermedijarna vlakna su apolarna tj. oba su kraja ista. Intermedijarna vlakna su puno stabilnija od aktinskih i njihovi proteini se često mijenjaju fosforilacijom, koja može upravljati njihovom razgradnjom. Intermedijarna vlakna čine potporanj, koji integrira citoskelet i različite dijelove stanice. Keratinska vlakna epitelnih stanica čvrsto su usidrena na staničnu membranu na dva područja specijaliziranih staničnih dodira, dezmosomima i hemidezmosomima.

Dezmosomi su spojevi među susjednim stanicama posredovani transmembranskim proteinima srodnim kadherinima. Na citoplazmatskoj strani su povezani gustim pločama unutarstaničnih proteina na koje su vezana keratinska vlakna. Te su veze posredovane dezmoplakinom iz porodice plakina. Oni vežu Intermedijarna vlakna i povezuju ih s ostalim strukturama. Hemidezmosomi su pomoću plektinske porodice vezani na integrine. Dezmosomi = stanica + stanica Hemidezmosomi = stanica + podloga Dezmini –u mišićima povezuju aktin-miozin nakupine međusobno i sa staničnom membranom. Neurofilamenti – prisutni uglavnom u motoričkim aksonima, gdje su usidreni u aktinska vlakna i mikrotubule.

Mikrotubuli Dinamična struktura koja podliježe združivanju i razilaženju unutar stanice.

Struktura i organizacija Građen je od dimera tubulina ( α i β tubulin ), 13 linearnih protofilamenata združenih oko središnje cijevi. γ-tubulin je smješten u centrosomu. Evolucijski je sličan prokariotskom FtsZ-u. Protofilamenti se poslaguju paralelno, a sastoje se od redova tubulinskh dimera usmjerenih od glavice prema repu. Mikrotubuli su polarne građe sa brzorastućim plus krajem i minus krajem. Dimeri tubulina mogu polimerizirati i depolimerizirati. Obe vrste tubulina vežu GTP ( analogno ATP-u u aktinu ). GTP vezan na β-tubulin biva hidroliziran u GDP. Ta hidroliza oslabljuje afinitet tubulina za vezanjem za susjedne molekule, te se tako favorizira depolimerizacija. GDP otkinut sa minus kraja se kao GTP veže na plus kraj i tako se uspostavlja dinamička ravnoteža - ˝hod u mjestu˝. U dinamičkoj nestabilnosti se izmjenjuju ciklusi rasta i skraćivanja.    >   =  ! " #  $č&!& ' ()* −  ,    <   = ' !

Kolhicin i Kolcemid – inhibiraju polimerizaciju mikrotubula i blokiraju mitozu Vinkristin i Vinblastin – koriste u kemoterapiji jer selektivno inhibiraju stanice koje se brzi dijele Taksol – stabilizira mikrotubule, sprječava podjelu stanice, kemoterapija

Centrosom je središnje mjesto usidravanja mikrotubula prema kojemu su okrenuti minus krajevi. Oni rastu prema van, od centrosoma. γ-tubulin je povezan s osam ili više drugih proteina u strukturu

nazvanu kompleks prstena γ-tubulina, a on ubrzava rast mikrotubula. Stvaranje mikrotubula može započeti i bez centrosoma uz pomoć γ-tubulina. Centrosomi se sastoji od centriola orijentiranih okomito jedan prema drugom, okruženih amorfnom pericentriolarnom tvari. Cilindrične su strukture načinjene od devet tripleta mikrotubula. Izrazito su polarne strukture i jedan im je kraj nalik na kotač sa brojnim izdancima u citoplazmu. Ekstenzivnom i posttranslacijskom modifikacijom tubulina i interakcijom mikrotubula s proteinima povezanim s mikrotubulima ( MAP ).

Međustanične veze 1. 2. 3. -

Nepropusni spojevi čvrsti spojevi, membrane stanica su sljubljene, slaba propusnost ( zonula occludentes ) Pričvrsni spojevi adhezijski, zonula adherentes, membrane su manje sljubljene ( crijeva i bubrezi ) Dezmosomi i Hemideznosomi ( opisano gore ). Komunikacijski spojevi tijesni spoj – bjelančevine, ionski kanali, neksusi Kemijske sinapse

V.

STANIČNA MEMBRANA

Prokariotske i eukariotske stanice okružene su staničnom membranom ( plazma – membrana ), koja je selektivno propusna.

Struktura stanične membrane Sve membrane su građene od lipida i proteina tj. od dvosloja fosfolipida u kojeg su uronjeni proteini. Saznanja od membrana se temelje uglavnom na vanjskoj membrani stanice. Većina istraživanja su se vršila na eritrocitima jer oni nemaju jezgru niti druge membrane unutar stanice. Tako se došlo do zaključka da je ekstrahirana membrana dvostruko duža od površine stanice – dvosloj fosfolipida. Membrane animalnih stanica sastoje se od fosfatidilkolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina i sfingomijelina. Vanjski sloj membrane sastoji se od fosfatidilkolina i sfingomijelina, a unutrašnji sloj od fosfatidiletanolamina i fosfatidilserina. Tu se još nalazi i fosfatidilinozitol, koji je minorna komponenta, ali je važan za endocitozu, u staničnim vezama i signalizaciji. Fosfolipidi unutarnjeg sloja imaju polarne glave okrenute u unutrašnjost.

Fosfatidilkolin + sfingomijelin ( + glikolipidi ) Fosfatidiletanolamin + fosfatidilserin + fosfatidilinozitol Hidrofobnost

Membrane animalnih stanica čine još i glikolipidi i kolesterol. Prvi se nalaze na vanjskoj površini sa ugljikohidratnim dijelom okrenutim stanici ( udio 2% ), dok je kolesterol glavna komponenta životinjske stanice i zauzima prostor gotovo isti kao i lipidi. Unutrašnjost dvosloja je hidrofobna, pa prema tome ne mogu prolaziti kroz membranu tvari topljive u vodi. Fosfolipidi su u viskoznom stanju, njihove masne kiseline imaju jednu ili dvije dvostruke veze, koje unose pregibe u lance, te se oni mogu kretati lateralnom difuzijom kroz membranu. Kolesterol se u membrani nalazi između fosfolipida. Njegova polarna hidroksilna glava je okrenuta u blizinu polarnih skupina fosfolipida. Pri visokim temperaturama kolesterol ograničava okretanje membrane, a pri visokim temperaturama on poboljšava kretanje tj. štiti membranu od smrzavanja i održava njihovu fluidnost. Kolesterol i sfingolipidi ( sfingomijelin i glikolipidi ) imaju drugačiju točku taljenja od fosfolipida, te oni stvaraju lipidne splavi. To su domene u staničnoj membrani koje su visoko uređene u odnosu na ostatak. Oni su obogaćeni s GPI-sidrom i proteinima bitnim za staničnu signalizaciju i endocitozu. Lipidi su temeljni strukturni elementi, a proteini su odgovorni za specifične funkcije. Težinski omjer je 50:50, ali su proteini mnogo veći od lipida ( na jedan protein ide 50-100 molekula lipida ). Udio ugljikohidratnog dijela glikolipida i glikoproteina je 5 – 10 %.

Singer i Nicolson su predložili model tekućeg mozaika, u kojemu je membrana prikazana kao lipidni dvosloj. Oni razlikuju periferne i integralne proteini. Periferni disociraju od membrane pod djelovanjem polarnih reagensa ( otopine s visokim Ph ili visokim udjelom soli ). Oni se drže na membrani vezom protein-protein ( ionske veze ) i nisu uronjeni u hidrofobni lipidni dvosloj. Integralni su uronjeni u dvosloj fosfolipidi i jedan njihov dio strši i izvan membrane. Oni se mogu osloboditi jedino ako se i dvosloj razbije( tvari koje remete hidrofobna međudjelovanja ). Koriste se detergenti, male amfipatske molekule, koje imaju hidrofilni i hidrofobni kraj. Integralni proteini mogu biti i transmembranski, koji strše na objema strana membrane. Onaj dio koji premošćuje dvosloj naziva se α-uzvojnica ( 20-25 hidrofobnih aminokiselina ) i sintetizira se u ER-u (ugrađuje u membranu ), zatim prenosi do GA i preko vezikula do membrane. U ER-u i GA-u uzvojnica dobiva i ugljikohidratne skupina, pa su prema tome transmembranski proteini glikoproteini sa oligosaharidnim krajem okrenutim vanjskoj strani. Na humanim eritrocitima utvrđeno je gel-elektroforezom desetak glavnih proteina membrane. Većina su periferni i ujedno dijelovi kortikalnog citoskeleta, koji je smješten ispod membrane. Najzastupljeniji je spektrin ( glavni protein citoskeleta ),zatim aktin, ankirin, glikoforin i vrpca 4.1. Ankirin povezuje citoskelet sa integralnim membranskim proteinom vrpca 3 ( veza spektrin–vrpca 3 ). Aktin povezuje sa spektrinom vrpca 4.1. Glikoforin je mali glikoprotein, koji se sastoji od 131 aminokiseline, molekularnom težinom od 30.000, od čega je jedna polovica proteinska, a druga polovica ugljikohidratna. Oni prolaze kroz membranu α-uzvojnicom od 23 aminokiselina, a glikolizirani kraj im je okrenut površini stanice. Vrpca 3 je anionski izmjenjivač odgovoran za prolaženje hidrogenkarbonatnih i kloridnih iona kroz membranu. Sastoji se od 929 aminokiselina i 14 transmembranskih uzvojnica. Vrpca 3 djeluje kao globularni protein. Porini su primjeri transmembranskih proteina koji se ne sastoji od klasične α-uzvojnice. Oni oblikuju vodene kanale kroz lipidni dvosloj. Sastoje se od β-nabrane ploče, gdje 8-22 takvih ploča čine bačvastu struktura, koja okružuje kanal. Polarni bočni ogranci aminokiselina okružuju poru, dok se bočni lanci hidrofobnih skupina okreću u unutrašnjost. Neki proteini su usidreni kovalentnom vezom na lipide i glikolipide i zovu se usidreni proteini. Jedan vrsta se drži za vanjsku stranu membrane preko glikozilfosfatidilinozitolnog ( GPI ) sidra. Neki su proteini usidreni na unutarnjoj membrani i oni se sintetiziraju na slobodnim ribosomima u citosolu i dodaju im se lipidi: -

miristilna kiselina ( masna kiselina s 14 C-atoma ) na amino-kraj polipeptida palmitinska kiselina ( 16 C-atoma ) na bočne ostatke cisteina prenilnih skupina ( 15 – 20 C-atoma ) na karboksilni kraj peptida

Ponekad se usmjeruju prema staničnoj membrani pomoću nabijene domene u lancu, koja može i stvarati dodatne polarne veze sa negativno nabijenim polarnim glavama fosfatidilserina na citosolnoj strani. Proteini se mogu kroz membranu kretati lateralnom difuzijom. Nekima je pokretljivost smanjena jer su povezani sa citoskeletom, a nekima jer su povezani s drugim proteinima na površini susjedne stanice ili vezama s proteinima međustaničnog matriksa.

Epitelne stanice se polariziraju tijekom organizacije tkiva, kada različiti dijelovi postaju odgovorni za izvršavanje: -

-

APIKALNE DOMENE Stanice crijeva koje gledaju u lumen, prekrivena mikrovilima, koje povećavaju površinu i specijalizirane su za apsorpciju BAZOLATERALNE DOMENE Priliježu na vezivno tkivo i krvne žile, posreduju u transportu apsorbiranih tvari

Izvanstanični kraj proteina stanične membrane je uglavnom glikoliziran. Isto tako je ugljikohidratni dio glikolipida izložen vanjskoj strani. Zbog toga je vanjska strana obložena ugljikohidratnim pokrovom i naziva se glikokaliks, a čine ga oligosaharidi glikolipida i transmembranski glikoproteini. Glikokaliks štiti stanicu od ionskog i mehaničkog stresa, te od prodiranja mikroorganizama. Također sudjeluju u nekim međustaničnim interakcijama, kao što je adhezija bijelih krvnih stanica na endotelne stanice stjenci krvnih žila. U početnoj fazi tog procesa sudjeluje transmembranski protein iz porodice selektina, koji prepoznaje točno određene ugljikohidrate na staničnoj površini ( E – selektin, P – selektin i L- selektin ).

Transport malih molekula Unutarnji sastav stanice održava se pomoću selektivne propusnosti membrane.

PASIVNA DIFUZIJA Molekula se otopi u lipidnom dvosloju i ide kroz njega, niz koncentracijski gradijent bez pomoćnih proteina. Ovo je neselektivan proces i svaka molekula koja se može otopiti u dvosloju ide pasivnom difuzijom. Samo manje hidrofobne molekule difundiraju značajnijom brzinom: -

CO2 i O2 hidrofobne molekule ( benzen ) male polarne i nenabijene molekule ( etanol, H2O )

OLAKŠANA DIFUZIJA Odvija se također niz koncentracijski gradijent, molekule se ne otapaju u dvosloju i pomoću proteinskih nosača ne dolaze uopće u dodir sa hidrofobnim dijelovima fosfolipida. Ovim putem putuju kroz membranu ugljikohidrati, aminokiseline, nukleotidi, ioni i ostale polarne i nabijene molekule. Razlikujemo dvije vrste transportnih proteina, a to su proteini nosači i kanalni proteini. Prvi vežu molekulu na jednoj strani i pomoću svoje konformacijske promjene prebacuju molekulu na drugu stranu, a drugi oblikuju pore kroz membranu. Proteini nosači odgovorni su za olakšanu difuziju šećera, aminokiselina i nukleozida. Bitni su zbog prijenosa glukoze, a identificirani su kao 55-kd proteini ljudskih crvenih krvnih stanica, u kojima čine oko 5% ukupnih membranskih proteina. Transporter glukoze ima 12 α-uzvojnica. Sastoje se od hidrofobnih aminokiselina, ali u nekima su i polarni aminokiselinski ostatci za koje se misli da oblikuju vezno mjesto za glukozu u unutrašnjosti proteina. Transporter glukoze najprije ima jednu konformacijsku promjenu u kojoj vezno mjesto za glukozu gleda u vanjsku stranu. Nakon vezanja glukoze dolazi do konformacijske promjene i vezno mjesto zatim gleda u citosol ( proces je

reverzibilan ). Kada glukoza uđe u stanicu, ona se brzo metabolizira i koncentracija ostane niska unutar stanice.

IONSKI KANALI Ionski kanali su kanalni proteini koji posreduju prolazu iona kroz membranu. Najbolje su proučene u živčanim stanicama gdje su bitni za provođenje impulsa. Opisujemo tri karakteristike 1. transport je izuzetno brz 2. transport je selektivan – prolaze molekule samo određene veličine ( ioni Na, Ca, Cl, K ) 3. transportni kanal nije stalno otvoren – regulirano ˝vratnicama˝ Kanali receptori – otvaraju se na podražaj nekog neurotransmitera Naponski kanali – otvaraju se kao odgovor na promjenu električnog okruženja

Protok iona kroz membranu ovisi o uspostavljanju ionskoga gradijenta kroz staničnu membranu. Gotovo sve stanice posjeduju ionske crpke, koje koriste ATP i održavaju ionski sastav unutar stanice različitim onome izvan.

Istraživanja na aksonu lignje -

U mirovanju potencijal je 60 mV, a u unutrašnjosti stanice vlada negativan naboj Na ioni se crpe iz stanice, a K ioni u stanicu U mirovanju je membrana više propusna za K ione ( daje najveći udio u oblikovanju potencijala u mirovanju )

Protok iona kroz membranu oblikuje se uslijed dvojakog utjecaja: 1. koncentracije 2. naponske sastavnice elektrokemijskog gradijenta Kvantitativno je odnos između koncentracije iona i membranskog potencijala dan Nernstovom jednadžbom : .=

/) 12 & 0 13

V – ravnotežni potencijal, R – plinska konstanta, T – apsolutna temperatura,, z – naboj iona, F – Faradayeva konstanta, C – konc. iona izvan ( 0 ) i unutar stanice ( 1 )

Živčani impuls ( akcijski potencijal ) putuje duž aksona, a membrana se depolarizira. Potencijal se mijenja sa – 60 mV na +30 mV i ponovno vrača na početne vrijednosti. Do promjena dolazi zbog otvaranja i zatvaranja Natrijevih i kalijevih kanala. Male početne promjene potencijala na do -40 mV dovode do otvaranja Na – kanala. Natrijevi ioni ulaze u stanicu i mijenjaju potencijal na +30 mV, približavajući se ravnotežnom potencijalu za Na ( +50 mV ). U tom se trenutku zatvaraju Na – kanali i

otvaraju K – kanali, koji započinju sa izbacivanjem K iona iz stanice. To dovodi do nagle promjene potencijala na -75 mV ( zatvaraju se K-kanali ), koji se kasnije smanji na -60 mV. Na krajevima aksona se iz mjehurića oslobađaju neurotransmiteri, poput acetilkolina. Najbolje proučen je nikotinski receptor za acetilkolin u mišićnim stanicama. Vezanjem acetilkolina otvara se kanal za Na i K ione. Također akcijski potencijal omogućuje otvaranje naponskih Ca- kanala.

Aktivni transport uz ATP U aktivnom transportu koji ide suprotnim smjerom od koncentracijskog gradijenta potrebno je putem hidrolize ATP-a dobiti energiju. Primjeri za takav prijenos su 45 /7 89:;< ili još nazvane 45 /7 ATPaze. Oni koriste energiju iz ATP-a za prijenos Na i K iona nasuprot koncentracijskom gradijentu. Crpka sadrži tri vezna mjesta za Na ione i dva vezna mjesta za K ione: 1. 3 Na iona se vežu na mjesto izloženo unutar stanice 2. Vezanjem Na stimulira ATP ovisnu fosforilaciju crpke 3. Dolazi do konformacijske promjene, Na vezna mjesta bivaju izložena vanjskoj površini, dolazi do smanjenja afiniteta za Na i on se otpušta 4. 2 K iona se vežu na vezna mjesta visokog afiniteta za te iona, koji se nalazi na strani izloženoj prema van 5. stimulira se defosforilacija crpke i dolazi do konformacijske promjene. 6. K ioni se otpuštaju u stanicu Citoplazma sadržava i visoku koncentraciju organskih molekula, uključujući makromolekula, aminokiselina, šećere i nukleotide. Kad ne bi bilo kontrateže došlo bi do osmoze, stanica bi nabubrila i pukla. Nužna kontrateža uspostavlja se ionskim gradijentom. =5> -crpka istim principom izbacuje kalcijeve ione iz stanice ( ili u lumen ER-a ), te tako održava njegovu koncentraciju unutar stanice niskom. Najveća obitelj membranskih transportera su ABC-transporteri. Sastoje se od visokokonzerviranih domena koje vežu ATP. U eukariota transportiraju toksične tvari iz stanice, a kod bakterija razne nutriente.

Aktivni transport tjeran ionskim gradijentom U ovoj vrsti transporta se molekule prenose ne koristeći ATP, nego se vežu uz transport drugih molekula, koje se prenose u za njih energetski povoljnom smjeru. Primjer za ovaj transport nalazimo u epitelu crijeva, koji na svojoj apikalnoj strani uz Na ione prenosi i glukozu. Za preuzimanje glukoze iz lumena odgovoran je aktivni transport Na iona. Vežu se dva iona Na i jedna molekula glukoze, te se oboje transportiraju aktivno u unutrašnjost stanice.

Vrste transporta: -

Simport – dvije molekule u isti smjer Uniport – olakšana difuzija glukoze, transport samo jedne molekule Antiport – dvije molekule prenose u suprotnome smjeru npr. Ca ioni se izbacuju iz stanice, a Na ioni u stanicu. npr. Na ioni ulaze u stanicu, a H protoni se izbacuju.

Još malo o osmozi Osmoza je difuzija vode ( otapala ) kroz polupropusnu membranu. Kroz membranu može proći samo otapalo, dok otopljena tvar ( npr. NaCl ) ne može. Da bi se uspostavila ravnoteža treba doći do izjednačenja koncentracija sa obiju strana. Vode ce sa mjesta gdje ima manje otopljenih tvari difundirati kroz polupropusnu membranu u područje gdje je viša koncentracija otopljenih čestica. Na taj način se ˝oduzimanjem˝ vode u području gdje je manje čestica koncentracija zapravo poveća, a u području gdje je bila veća koncentracija čestica ˝dodavanjem˝ vode njihova koncentracija smanji.

U tjelesnim stanicama najviše difundira voda. Difuzija vode u eritrocitima u oba smjera je oko 1000 puta veća od volumena samog eritrocita. Difuzija vode u stanicu i iz stanice je uravnoteženo, pa je volumen vode u stanicama stalan, Neto-kretanje vode je nula. Kada dođe do razlike u koncentracijama vode s jedne I s druge strane, onda se pojavi neto-tok vode kroz staničnu membranu koja je selektivno propusna. Tada dolazi ili do bubrenja ili do skvrčavanja stanice. Dakle neto-gibanje vode nastalo zbog razlike u koncentracijama kroz polupropusnu membranu naziva se ozmoza. Kroz polupropusnu membranu lako prolazi voda, a otopljene tvari kao što je NaCl teško prolaze kroz nju. Tlak koji je dovoljno velik da se suprotstavi djelovanju osmose zove se osmotski tlak otopine Natrijevog klorida. Osmotski tlak je određen koncentracijom otopine izraženoj brojem čestica. Dakle nije bitna masa čestice, već broj čestica po jedinici volumena tekučine.Da bismo koncentraciju otopine izrazili pomoču broja čestica upotrijebljavamo jedinicu koja se zove osmol, a ne grame ili nešto slično. Jedan osmol osmotski aktivne tvari ekvivalentan je jednome molu te iste tvari koja ne disocira. Ako tvar disocira na dvije molekule (NaCl ) onda masa molekule u jednom molu daje zapravo 2 osmola, jer je

tad broj osmotski aktivnih tvari duplo više.Prema tome za otopinu koja ima 1 osmol aktivnih tvari otopljenih u 1kg otopine kažemo da ima osmolalnost 1 osmol/kg . Normalna osmolalnost izvanstanične I stanične tekučine iznosi oko 300 miliosmola po 1 kilogramu.Pri normalnoj tjelesnoj temperaturi I osmolalnosti od 1 osmol/kg nastaje osmotski tlak od 2573 kPa, Budući da je vodu u otopini teško mjeriti u kilogramima upotrijebljava se osmolarnost koja je iskazana u osmolu po litri, a ne kao osmolalnost u osmolu po kilogramu.

Ostali oblici transporta kroz membranu su egzocitoza i endocitoza. Oblici Endocitoze su: -

Pinocitoza: unos tekućeg sadržaja uz pomoć vezikula Fagocitoza: Unos većih molekula ( bakterija ) i njihova razgradnja pomoću lizosoma. Endocitoza posredovana receptorom: Stanice imaju receptora pomoću kojih mogu lagano unijeti sadržaj iz vanstaničnog prostora

VI.

STANIČNA SMRT I OBNOVA

Stanična smrt i proliferacija su u normalnom odraslom organizmu u ravnoteži. Stanice fiziološki umiru i bivaju zamijenjene matičnim stanicama. Bitna je i za embrionalni razvoj pomoću koje se uklanjaju neželjene stanice.

Programirana stanična smrt Stanice koje su potencijalno štetne se programiranom staničnom smrču uklanjaju za dobrobit cijelog organizma. Tako se npr. crvene krvne stanice uklanjaju kako bi se stvorila ravnoteža sa novonastalim krvnim stanicama. Tijekom embrionalnog razvoja uklanja se npr. koža između prstiju noge i ruke, tkivo ličinke tijekom metamorfoze. Također se uklanjaju neuroni u suvišku ( 50% ),a pošteđeni ostanu samo odabrani, koji su ostvarili vezu sa svojim ciljnim stanicama. Za razliku od stanične smrti uzrokovane nekom akutnom ozljedom ( nekroza ), programirana stanična smrt je aktivni proces, koji se zbiva kao niz staničnih promjena poznatih kao apoptoza. U tom procesu je kromosomska DNA fragmentirana jer pucaju veze između nukleosoma, kromatin kondenziran, a jezgra se raspada. Sama stanica se isto raspadne u komadiće obavijene membranom, koje nazivamo apoptotičkim tjelešcima. Oni zajedno sa ostalim fragmentima bivaju fagocitirani pomoću makrofaga i susjednih stanica. Stanice u nekrozi najprije zadebljaju, liziraju i ispuštaju svoj sadržaj u izvanstaničnu tekućinu, što uzrokuje upalu. Apoptotičke stanice imaju na sebi ˝pojedi me˝signal, koji uključuje fosfatidilserin i kojeg prepoznaju fagociti. Istraživanjem stanične smrti C.elegans otkrivena su tri gena bitna za apoptozu. Prva dva su bitna za razvojne stanice jer bez njih nakon mutageneze ne nastupa stanična smrt, a to su ced-3 i ced-4. Treći gen je ced-9, koji ima ulogu negativnog regulatora apoptoze. Izostankom tog gena stanice koje bi inače preživjele će umrijeti. Ced-4 potiče ced-3, a ced-9 innhibira ced-4. Ced-3 kodira proteazu tj. njegova porodica sadrži više od desetak proteaza, koje nazivana kaspaze. One na svom kraju imaju cisteinske ostatke ( Cys ) na svojim aktivnim mjestima i kidaju proteinski supstrat aspartata ( Asp ). Kaspaze su konačni efektori, koji kidaju više od stotinu proteina u stanici. Također uzrokuju inhibiciju Dnaze, kidaju proteini citoskeleta, Golgijevog aparata, jezgrine lamine, te su odgovorni za translokaciju fosfatidilserina na vanjski dio membrane. Kaspaze se najprije sintetiziraju u inaktivnom obliku, koje proteolitičkim cijepanjem kataliziranim drugim kasapzama, prelaze u aktivni oblik. Ced-4 i njegov homolog ( Apaf-1 ) vežu se na kaspazu i dovode do njezine aktivacije. Inicijatorska kaspaza ( kaspaza – 9 ) se aktivira vezanjem na Apaf-1 u kompleks, koji se sastoji od više podjedinica, a naziva se apoptosom. Da bi nastao kompleks potreban je citokrom c, kojeg otpušta mitohondrij. Bcl- 2 je u sisavaca blisko srodan genu ced – 9, koji je identificiran kao onkogen ( uzrokuje limfom – B stanica tj. rak b- limdocita ). On uzrokuje inhibiciju apoptoze, za razliku od ostalih onkogena, koji potiču staničnu proliferaciju ( Ras ).

Sisavci nose upute za sintezu cijele porodice Bcl – 2 od približno 20 proteina, koji se dijele u tri funkcionalne skupine. 1. Antiapoptički – inhibitori apoptoze i programirane stanične smrti ( Bcl – 2 ) ( Inhibiraju Bax i Bak ), IAP-proteini 2. Proapoptički – induciraju aktivaciju kaspaze i potiču staničnu smrt - Višedomenski – BH1, BH2, BH3 Bax i Bak su nizvodni efektori, koji izravno induciraju apoptozu - Jednodomenski – BH3 proteini, oni su jedini uzvodni članovi regulirani su signalima, koji induciraju staničnu smrt ( samo-BH3 proteini, PUMA i Nox ) U aktivnom obliku samo BH3 proteini sprječavaju djelovanje članova antiapoptičke porodice Bcl-2, aktivirajući višedomenske proapoptičke proteine i pomičući ravnotežu prema aktivaciji kaspaza i staničnoj smrti. Bcl-2 djeluju mitohondrijima, koji imaju središnju ulogu u nadzoru stanične smrti. Bax i Bak stvaraju oligomere na vanjskoj strani membrane mitohondrija, što dovodi do otpuštanja citokroma c ( i inhibitora IAP proteina ) iz međumembranskog prostora istog organela. U citosolu se nalazi Apaf-1 i kasapza-9, koji zajedno sa otpuštenim citokromom c stvaraju apoptosom. Kaspaze su također regulirane i IAP proteinima, koji inhibiraju aktivnost kaspaze, ili ju obilježavaju za ubikvitinaciju. Signalne putove koji reguliraju apoptozu smo podijelili u intrinzičke ( otpuštanje citokroma c tijekom staničnog stresa ) i ekstrinzičke. Oštećenje DNA je najopasnija vrsta staničnog stresa, koji može dovesti i do nastanka karcinoma. Transkripcijski faktor p53 je glavni signalni put kao odgovor na oštećenu DNA. Oštećena Dna aktivira protein kinaze ATM i Chk2, koji potom stabiliziraju p53. To dovodi do transkripcijske translacije ciljnih gena, uključujući Cdk inhibitor p21, koji inhibira komplekse Cdk2/ciklin E i tako zaustavlja napredovanje kroz stanični ciklus u G1- fazi. Aktivacija p53 može dovesti i do apoptoze, koja je djelomično posljedica transkripcijske aktivacije gena koji nose upute za sintezu proteina PUMA i Noxa, koje ubrajamo u proapoptičke samo-BH3 proteine, članove porodice Bcl-2. Povećana ekspredija samo-BH3 proteina dovodi do aktivacije Bax i Bak. Nedostatak faktora rasta još je jedna vrsta staničnog stresa, koja dovodi do aktivacije intrinzičkih putova apoptoze. Tijekom embrionalnog razvoja uklanja se npr. koža između prstiju noge i ruke, tkivo ličinke tijekom metamorfoze. Također se uklanjaju neuroni u suvišku,a pošteđeni ostanu samo odabrani, koji su ostvarili vezu sa svojim ciljnim stanicama. Ti signali opstanka su polipeptidni faktori rasta, koji su srodni faktoru rasta neurona ( NGF ), a potiče preživljavanje neurona i njihovu diferencijaciju putem aktivacije receptorskih protein-tirozin-kinaza. Unutrašnji signalni put odgovoran za poticanje staničnog preživljavanja započinje enzimom PI 3kinaza, kojeg aktiviraju ili protein-tirozin-kinaze ili receptori povezani s G-proteinima.

fosforilira membranski protein PIP2

PI 3-kinaza

fosforilira Bad, član

aktivira proteinserin/treonin-kinazu

PIP2

Bcl-2( samo BH-3 )

Akt

Vezno mjesto

Vezno mjesto je namijenjeno za šaperone 14-3-3, koji uklanjaju inaktivni oblik Bad. pa tako fosforilacijom Bad kinaza Akt inhibira apoptozu i potiče stanično preživljavanje. Akt djeluje i na FOXO, čijom fosforilacijom također nastane vezno mjesto za šaperone 14-3-3. U ekstrinzičnom putu neki izlučeni polipeptid aktivira receptore, koji potiču staničnu smrt , tako što izravno aktiviraju određenu inicijatorsku kaspazu ( kaspaza-8 ). Ovakvi polipeptidi pripadaju porodici faktora tumorske nekroze ( TNF, sastoji od tri polipeptidna lanca čije vezanje potiče trimerizacija receptora ). Oni se vežu na TNF-receptore, koji potiču apoptozu u najrazličitijim vrstama stanica. Najbolje opisan Fas, koji ima važnu ulogu u regulaciji stanične smrti u imunološkim reakcijama. Citoplazmatski dio TNF-a veže adaptorske molekule, koje potom vežu kaspazu-8 uzvodno. Kasapza se kida i aktivira nizvodne efektorske kaspaze. Alternativni put stanične smrti je autofagia. Bez kaspaza, u stanici dolazi do nakupljanja lizosoma. Autofagija se događa kada je spriječena apoptoza ( npr. nedostatkom Bak i Bax ). U alternativne putove spada također i nekroza ( pretjerana liza ).

VII. STANIČNA ENERGETIKA ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------Ovaj dio gradivo općenito nije pretjerano zastupljen na ispitima ( eventualno 1-2 pitanja ), a pogotovo ne na usmenom dijelu ispita. Preporučujem ovaj dio jednostavno preskočiti i ne trošiti vrijeme. Jedino treba zapamtiti gdje se odvija koji ciklus. ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Tok energije i kemijsko recikliranje u ekosustavima Organizmi koriste organske molekule u svojoj hrani: - kao izvor energije - građevni materijal za rast i obnovu Disanje koristi energiju pohranjenu u organskim molekulama (kemijsko skladište) za stvaranje ATPa, koji postaje izvor energije za većinu staničnog rada, ostatak je raspršen kao toplina. Otpadne produkte disanja, ugljični dioksid i vodu, kloroplasti koriste kao sirovi materijal u fotosintezi. - kemijski elementi bitni za život se recikliraju. - energija se ne reciklira: ona ulazi u ekosustav kao sunčevo svjetlo, a vraća se kao toplina. Mitohondriji koriste kisik i organske produkte fotosinteze kao gorivo za stanično disanje. Mitohondriji i kloroplasti pretvaraju energiju u oblike (ionski gradijent i ATP) koji se koriste za izvođenje brojnih staničnih reakcija: -

pokretanje, aktivni transport biosinteza

Najizrazitija morfološka značajka mitohondrija i kloroplasta je obilnost unutarnjih membrana koje igraju dvije ključne uloge u funkciji ovih "energetskih organela": •

pružaju okosnicu procesima prijenosa elektrona koji pretvaraju energiju oksidacijskih reakcija u korisnije forme - ionski gradijent i ATP.

•

stvaraju veliki unutarnji pododjeljak, gdje se nalaze posebni enzimi, koji kataliziraju važne stanične reakcije

– ciklus limunske kiseline i fiksacija ugljika. Iako mitohondriji pretvaraju energiju dobivenu iz hrane, a kloroplasti pretvaraju sunčevu energiju, oba tipa organela slično su organizirana, oba stvaraju velike količine ATPa istim mehanizmom ⇒ kemiosmotičkim spajanjem

Metabolizam: osnovni pojmovi i svojstva Živim organizmima potreban je stalan dotok slobodne energije za tri osnovna procesa: - mehanički rad, stezanje mišića i druge pokrete - aktivni prijenos molekula i iona - sintezu makromolekula i drugih biomolekula iz jednostavnih preteča Kemotrofna bića dobivaju tu energiju oksidacijom hrane. Fototrofna bića dobivaju tu energiju hvatanjem svjetlosne energije Slobodna energija dobivena oksidacijom hrane i od svjetla, prije nego što se iskoristi za pokretanje, aktivni prijenos i biosintezu, djelomično se transformira u posebnog prijenosnika slobodne energije ⇒ adenozintrifosfat (ATP) ATP-ADP ciklus osnovni je način izmjene energije u biološkim sustavima. Cijena većine staničnog rada je pretvorba ATPa u ADP i anorganski fosfat, produkte koji pohranjuju manje energije od ATPa. Za rad, stanica mora obnavljati svoju zalihu ATPa iz ADPa i anorganskog fosfata, a to se postiže fotosintezom u kloroplastima i oksidacijom hrane (stanično disanje) u mitohondrijima. Rep ATPa je kemijska veza bogata energijom: tri negativno nabijene blisko pakirane fosfatne skupine su energetski nestabilno uređeno skladište. Stanica otpušta taj izvor energije koristeći enzime (ATP hidrolaze → ATPaze) koji prenose fosfatne skupine s ATPa na druge spojeve, za koje se onda kaže da su fosforilirani. Fosforilacija potiče molekulu da se podvrgne nekoj vrsti promjene koja izvodi rad, a molekula u tom procesu gubi fosfat. Primjer: Na-K crpka

KEMIOSMOTIČKO SPAJANJE Procesi prijenosa (“osmoza”) e- velike energije povezani su s kemijskim procesima (“kemi”) pretvorbe te energije u energetski bogatu vezu (ATP) ⇒ kemiosmotičko spajanje → zajednički je put kojim mitohondriji, kloroplasti pa čak i bakterije pretvaraju energiju u biološke svrhe.

Prijenos elektrona na unutarnjoj membrani mitohondrija i tilakoidnoj membrani kloroplasta koristi se prvo za stvaranje transmembranskog elektrokemijskog gradijenta protona (H+) koji se onda koristi za pokretanje različitih reakcija. Energija dobivena oksidacijom hrane ili od sunčeve svjetlosti koristi se za pokretanje membranskih protonskih crpki (H+ crpke) koje prenose H+ s jedne strane membrane na drugu. Takve crpke stvaraju elektrokemijski gradijent protona kroz membranu ⇒ povratni tok protona niz gradijent koristi se za sintezu ATPa. e- se otpuštaju iz molekula hrane u postupku njezine razgradnje do CO2, i prenose se kružnim tokom do O2 za stvaranje H2O. Slobodna energija oslobođena u struji elektrona od visokoenergetskog stanja do niskoenergetskog stanja koristi se za pokretanje H+ crpki koje se nalaze na unutarnjoj membrani mitohondrija. U biološkim sustavima elektroni se prenose s jednog mjesta na drugo pomoću molekula koje prihvaćaju elektrone na jednom mjestu i dopremaju ih na drugo - nosači elektrona e- se s molekula goriva i produkata njihove razgradnje prenose na O2 pomoću posebnih nosača e- kao što su piridinnukleotidi i flavini. NAD+ + H+ + 2e-

↔

NADH

NAD+ - koenzim nikotinamid-adenindinukleotid NADH – reducirani oblik NAD+ Ključne komponente membrane kloroplasta su fotosustav I i II, gdje se hvata energija svjetla i koristi za prijenos e-. Tok e- proizveden pomoću fotosustava kloroplasta pokreće prijenos e- smjerom obrnutim od onog u mitohondriju: e- se uzimaju od H2O za proizvodnju O2 i dovode (preko NADPH) do CO2 za sintezu ugljikohidrata. Kloroplasti stvaraju O2 i ugljikohidrate, dok ih mitohondriji troše.

MITOHONDRIJ Mitohondriji zauzimaju znatan dio citoplazme svih eukariotskih stanica, i bili su neophodni za evoluciju životinja. ∅ 0.5 do 1µm → podsjećaju na bakterije. Mitohondrij sadrži vanjsku membranu i unutarnju membranu koja stvara dva unutarnja odjeljka: prostor matriksa i mnogo uži međumembranski prostor. Kriste - povećavaju površinu unutarnje membrane, tako da njezina ukupna površina sačinjava 1/3 svih membrana u stanicama jetre. Svaki pododjeljak sadrži jedinstvenu kolekciju proteina: Vanjska membrana sadrži: - veliki protein koji stvara kanal (nazvan porin), propusna je za sve molekule od 5000 daltona i manje. - enzime koji su uključeni u mitohondrijsku sintezu lipida Međumembranski prostor sadrži: - nekoliko enzima koji koriste ATP za fosforilaciju drugih nukleotida Matriks sadrži: - enzime za oksidaciju piruvata i masnih kiselina - enzime ciklusa limunske kiseline - nekoliko istovjetnih kopija mitohondrijskog DNA genoma, posebne mitohondrijske ribosome (70s), tRNA i različite enzime potrebne za ekspresiju mitohondrijskih gena Unutarnja membrana ⇒ složena je u brojne kriste koje jako povećavaju njezinu ukupnu površinu, sadrži: - enzime respiratornog lanca (lanac prijenosa elektrona) ⇒ neophodni za proces oksidativne fosforilacije - enzimski kompleks nazvan ATP sintaza, koji stvara ATP u matriksu - specifične transportne proteine koji reguliraju prolaz metabolita u i iz matriksa - kardiolipin, fosfolipid koji povećava nepropusnost unutarnje membrane za ione jer sadrži četiri masne kiseline Genetički sustav Genom mitohondrija izrazito je sličan genomu bakterija roda Rikecijia (unutrašnji paraziti, razmnožavaju se samo unutar eukariotske stanice). Kod čovjeka, genom mitohondrija kodira 13 proteina uključenih u transportni lanac i oksidativnu fosforilaciju. Mutacije nastale u DNA mitohondrija prenose se u slijedeću generaciju samo po majčinoj liniji . [ Leberova hereditarna op\čka neuropatija

Mitohondriji se kreću po citoplazmi i za to koriste mikrotubule citoskeleta. Mitohondriji nekih stanica stvaraju duga pokretna vlakna ili lance, dok su u drugim staničnim tipovima smješteni u blizini mjesta gdje se izuzetno puno troši ATP: npr. oni su pakirani između mišićnih vlakana srčanog mišića ili čvrsto omotani oko biča spermija.

PREGLED STANIČNOG DISANJA Stanično disanje je kumulativna funkcija triju metaboličkih procesa: Glikoliza se događa u citosolu, započinje razgradnju cijepanjem glukoze na dvije molekule piruvata. Krebsov ciklus odvija se u mitohondrijskom matriksu, → završava razgradnjom derivata, nastalih iz piruvata, do ugljičnog dioksida. Lanac prijenosa elektrona, prihvaća elektrone iz razradnih produkata prva dva stadija (preko NADH). Na kraju lanca, elektroni se vežu s vodikovim ionima i molekulskim kisikom da bi nastala voda. Oslobođena energija pohranjuje se u obliku protonskog gradijenta, koji mitohondrij koristi za stvaranje ATPa. Ovaj način sinteze ATPa zove se oksidativna fosforilacija, jer se opskrbljuje energijom pomoću prijenosa elektrona iz hrane do kisika. Mjesto prijenosa elektrona i oksidativne fosforilacije je unutarnja membrana mitohondrija. Na oksidativnu fosforilaciju otpada skoro 90% ATPa stvorenog disanjem. NAD+ = koenzim nikotinamid - adenin-dinukleotid NADH = reducirani oblik NAD+ NAD+ + 2e- + H+ ↔ NADH U nekim reakcijama glikolize i Krebsovog ciklusa manja količina ATPa nastaje direktno mehanizmom nazvanim fosforilacija na razini substrata. Ovaj način sinteze ATPa događa se kada enzim prenosi fosfatnu skupinu sa supstrata na ADP. PEP = fosfoenol piruvat, donor fosfata Glukoza se procesom glikolize u citosolu razgrađuje na dvije molekule piruvata, koji još uvijek sadrži većinu ukupne energije koja se može dobiti oksidacijom glukoze. Piruvat prolazi dvostruku membranu mitohondrija i ulazi u matriks, gdje se Krebsovim ciklusom razgrađuje do ugljičnog dioksida. NADH prenosi elektrone nastale glikolizom i Krebsovim ciklusom do lanaca prijenosa elektrona, koji su ugrađeni u membranama krista. Lanac prijenosa elektrona pretvara kemijsku energiju u protonski gradijent koji se može koristiti za izvođenje oksidativne fosforilacije, na koju otpada većina ATPa stvorenog staničnim disanjem ⇒ 32 molekule ATPa. Manja količina ATPa nastaje direktno tijekom glikolize i Krebsovog ciklusa pomoću fosforilacije na razini supstrata ⇒ 4 molekule ATPa. Piruvat i masne kiseline selektivno se prenose iz citosola u mitohondrijski matriks. Piruvat dehidrogenaza, enzimatski kompleks veći od ribosoma, brzo pretvara piruvat u acetil koenzim A (acetil CoA), središnji međuprodukt proizveden u mitohondriju tijekom razgradnje hrane. piruvat + CoA + NAD+ → acetil CoA + CO2 + NADH

Acetil CoA zajedno s acetil CoA proizvedenim iz masnih kiselina, ulaze u ciklus limunske kiseline gdje se dalje razgrađuju. Proces završava prolazom visokoenergetskih elektrona kroz respiratorni lanac ⇒ oksidativna fosforilacije. Da bi se osigurala stalna zaliha goriva za oksidacijski metabolizam, masne kiseline i piruvat pohranjeni su u životinjskim stanicama; masne kiseline u obliku masti, a glukoza kao glikogen. Kvantitativno, masti su važniji oblik uskladištenja od glikogena, djelomično i zbog toga što se oksidacijom masti oslobađa šest puta veća energija nego oksidacijom iste mase glikogena. Molekula masti je sastavljena iz tri molekule masnih kiselina koje su esterskom vezom vezane za glicerol. Takvi trigliceroli (trigliceridi) su bez naboja i netopljivi u vodi, pa se u citosolu spajaju u kapljice. Jedna jedina velika kapljica masti zauzima skoro cijeli volumen stanice adipocita, velike stanice specijalizirane za pohranjivanje masti u masnom tkivu. U matriksu mitohondrija svaka molekula masne kiseline potpuno se razgrađuje nizom cikličkih reakcija. Svaki ciklus skraćuje lanac masne kiseline za dva ugljika i stvara jednu molekulu acetil CoA i po jednu molekulu NADH i FADH2. U 19 st., istraživači su opazili da u odsutnosti kisika, stanice razgrađujući glukozu, proizvode mliječnu kiselinu (ili alkohol), dok u njegovoj prisutnosti stvaraju CO2 i H2O. 1937. otkriven ciklus limunske kiseline, poznat i kao ciklus trikarbonskih kiselina ili Krebsov ciklus. Ciklus limunske kiseline oksidira acetilnu grupu acetil CoA dobivenu oksidacijom masnih kiselina i glukoze i stvara NADH i FADH2 koji prenose elektrone na respiratorni lanac. U većini stanica, na ciklus limunske kiseline otpadaju 2/3 ukupne oksidacije ugljikovih spojeva. Krajnji produkti su: CO2, NADH i FADH2. NADH i FADH2 hrane svojim elektronima respiratorni lanac, na kraju kojeg se ti elektroni koriste za redukciju O2 u H2O. Energija pohranjena u elektrokemijskom protonskom gradijentu kroz unutarnju membranu kristi se za: •

proizvodnju ATP

•

prijenos metabolita u prostor matriksa

Univerzalna pojava ATP sintaze u mitohondrijima, kloroplastima i bakterijama potvrđuje središnju važnost kemiosmotičkih mehanizama u svim stanicama. Prolaskom elektrona velike energije duž serije nosača elektrona (citokromi), dio oslobođene energije koristi se za vođenje tri enzimatska respiratorna kompleksa (protonske crpke) koji crpe H+ iz prostora matriksa u međumembranski prostor. Kompleksi respiratornih enzima uklopljeni su u unutarnju membranu s određenom orijentacijom, tako da se svi protoni crpe iz matriksa u međumembranski prostor. Nastali elektrokemijski gradijent protona prebacuje H+ natrag kroz unutarnju membranu mitohondrija pomoću ATP sintaze, transmembranskog proteinskog kompleksa koji koristi energiju toka H+ za sintezu ATP iz ADP i Pi u matriksu. ATP sintaza je reverzibilna, ona obično pretvara struju protona u matriksu u energiju vezanu za fosfat ATPa, ali ona također može hidrolizirati ATP za crpljenje protona u međumembranski prostor. Unutrašnja membrana mitohondrija sadrži neobično velik udio proteina, i to u težinskim postotcima 70% proteina i 30% lipida. Mnogi proteini pripadaju lancu prijenosa elektrona, koji uspostavlja elektrokemijski protonski gradijent. Druga glavna komponenta je enzim koji katalizira sintezu ATP. Taj enzim, ATP sintaza, je veliki proteinski kompleks kroz koji protoni teku natrag niz elektrokemijski gradijent u matriks.

Osim što pokreće sintezu ATPa, potencijalna energija pohranjena u elektrokemijskom gradijentu pokreće transport metabolita u mitohondrije i iz mitohondrija: ATP u citosol, ADP i Pi te piruvat i masne kiseline u matriks mitohondrija. Kemiosmotička hipoteza, predložena 1960. god., sastoji se od četiri neovisna postulata. S obzirom na funkcije mitohondrija oni su sljedeći: -Respiratorni lanac (lanac prijenosa elektrona) na unutarnjoj membrani mitohondrija premješta protone; on crpi H+ iz prostora matriksa u međumembranski prostor, dok se elektroni prenose duž lanca. -Mitohondrijska ATP sintaza također premješta protone kroz unutrašnju membranu. Ona je reverzibilna, može koristiti energiju hidrolize ATPa da crpi H+ kroz membranu, međutim ako je već prisutan dovoljno veliki elektrokemijski protonski gradijent, protoni će teći obrnutim smjerom kroz kompleks pri čemu se oslobađa energija za sintezu ATPa. -Unutarnja membrana mitohondrija opremljena je skupinom proteina nosača (transportni proteini) koji posreduju pri ulazu i izlazu bitnih metabolita i anorganskih iona. - Unutarnja membrana mitohondrija inače je nepropusna za H+ i OH-, te općenito za anione I katione.

KRATKI SAŽETAK Piruvat i masne kiseline ulaze u mitohondrij, razgrađuju se do acetil CoA, a onda ulaze u ciklus limunske kiseline koji proizvodi NADH i FADH2. Kada se elektroni visoke energije prenose s vodika na NADH i FADH2 niz lanac prijenosa elektrona na unutrašnjoj membrani mitohondrija (respiratorni lanac), energija koja se oslobađa njihovim prijelazom od jedne molekule nosača na sljedeću koristi se za crpljenje protona kroz unutarnju membranu iz matriksa mitohondrija u međumembranski prostor. To stvara elektrokemijski protonski gradijent kroz unutarnju membranu mitohondrija, a povratnu struju protona niz taj gradijent koristi enzimatski kompleks ATP sintaza, vezan za membranu, koji katalizira pretvorbu ADP + Pi u ATP, čime se završava proces oksidativne fosforilacije. NADH nastao glikolizom također prenosi elektrone do respiratornog lanca.

ENERGETIKA BILJNE STANICE Plastidi su organeli karakteristični isključivo za biljnu stanicu. Kod gljiva i nekih visoko specijaliziranih biljnih stanica nema plastida. Proplastidi se nasljeđuju sa citoplazmom biljne jajne stanice. Kako se nezrele biljne stanice diferenciraju, proplastidi se razvijaju u skladu s potrebama specijalizirane stanice: oni se mogu razviti u kloroplaste (u zelenim listovima), ili skladišne plastide, leukoplaste koji akumuliraju škrob (u gomolju krumpira), ili kromoplaste koji sadrže pigmente (u laticama cvijeta). Različiti tipovi plastida mogu se reverzibilno transformirati iz jednog oblika u drugi.

Koji će tip plastida biti zastupljen u stanici ovisi o: •

razvojnom stadiju stanice

•

njenom smještaju unutar biljke

•

fiziološkim uvjetima, pri čemu je svjetlost odlučujući faktor

U jednoj biljnoj stanici javlja se uvijek samo jedan tip plastida, dok u čitavoj biljci nalazimo različite tipove. → semiautonomni organeli sa značajnom autonomijom, jer sadrže vlastitu nasljednu poruku u plastidnoj DNA (ptDNA). Ona međutim, nije dovoljna za samostalan život plastida izvan stanice. Proplastidi su slabo diferencirani, bezbojni plastidi meristemskih stanica. Sadrže malo unutarnjih struktura, dijele se, a iz njih će se razviti određeni tip plastida ovisno o smjeru diferencijacije stanice u kojoj se nalaze. Etioplasti su plastidi koje nalazimo u stanicama biljaka koje rastu u mraku. Neke reakcije u izgradnji fotosintetskog aparata i tilakoida ovisne su o svjetlosti. Protoklorofil reduktaza primjer je enzima ovisnog o svjetlosti. Etioplasti sadrže parakristaličnu strukturu tzv. prolamelarno tijelo i malo membrana - protilakoida. Prilikom osvjetljavanja prolamelarno tijelo se razgrađuje i formiraju se funkcionalni tilakoidi. Kromoplasti su žuto ili crveno obojani plastidi cvjetova i plodova, sadrže karotene i vrlo mnogo lipida u obliku lipidnih globula. Osim globularnog tipa kromoplasta, poznati su kromoplasti s membranama u obliku tubula, kao i s karotenskim kristalima. Leukoplasti su bezbojni plastidi u stanicama koje nisu fotosintetski aktivne. Često imaju pričuvnu funkciju i sadrže škrobna zrnca (amiloplasti), rezervne proteine (proteinoplasti) ili lipide (elaioplasti). Škrobna zrnca mogu biti prisutna u svim tipovima plastida. Gerontoplasti su plastidi požutjelih listova u kojima je klorofil razgrađen, a karoteni su sačuvani. Kloroplasti su fotosintetski aktivni plastidi. U tilakoidnoj membrani kloroplasta prisutan je klorofil, karotenoidi i ostale komponente fotosintetskog aparata, dok se enzimi za fiksaciju ugljičnog dioksida, nalaze u stromi kloroplasta. Pojedinačne tilakoide nazivamo stroma-tilakoidi dok višeslojne naslage tilakoida zovemo grana-tilakoidi. Iako je najznačajnija funkcija kloroplasta fotosinteza, u kloroplastima se odvija i sinteza lipida, masnih kiselina i škroba. Plastidi su obavijeni dvijema membranama koje čine ovojnicu. Vanjska i unutarnja membrana plastida znatno se razlikuju, pri čemu unutarnja membrana predstavlja pravu barijeru prema citoplazmi. Prostor između membrana odgovara necitoplazmatskoj fazi, dok unutarnja membrana obavija stromu u kojoj se nalaze škrobna zrnca, plastoglobuli, ribosomi i sustav membrana nazvan tilakoidi. Vanjska membrana, vrlo je propusna za male molekule i ione. Unutarnja membrana, slabo je propusna, •

sadrži posebne transportne proteine za prijenos ATP i dikarboksilnih kiselina.

•

predstavlja mjesto interakcije kloroplasta s preostalim dijelom stanice.

Tilakoidna mambrana, nepropusna je za ione; sadrži sve sustave kloroplasta koji stvaraju energiju: •

fotosintetski sustav apsorpcije svjetla (molekule klorofila)

•

lanac prijenosa elektrona

•

ATP sintazu

Stroma je veliki središnji prostor okružen unutarnjom membranom, sadrži: •

topljive enzime Calvinovog ciklusa i

•

uređaje za sintezu RNA i DNA (ribosome, DNA, RNA).

Tilakoidni prostor, lumeni tilakoida međusobno su povezani i određuju treći unutarnji pododjeljak tilakoidni prostor. Odvojen je od strome tilakoidnom membranom. Kako se kloroplasti razvijaju, uvrnuća specijalnih dijelova unutarnje membrane proplastida se otkidaju i formiraju tilakoidne vezikule, koje se zatim razvijaju u zreli tilakoid. Tilakoidna membrana formira odvojeni odjeljak, tilakoidni prostor, koji je strukturno i funkcionalno različit od ostatka kloroplasta. Tilakoidi mogu rasti i dijeliti se autonomno kako kloroplasti proliferiraju.

FUNKCIJA KLOROPLASTA •

proizvodnja ATP

•

pretvorba CO2 u ugljikohidrate u procesu fotosinteze

•

sinteza aminokiselina

•

sinteza masnih kiselina

•

redukcija nitrita (NO2-) do amonijaka (NH3), ključni korak u ugradnji dušika u organske spojeve.

Voda se razlaže, a kisik se oslobađa u reakcijama fotosintetskog prijenosa elektrona, dok se ugljični dioksid asimilira (fiksira) u proizvodnji ugljikohidrata u reakcijama fiksacije ugljika. Mnoge reakcije koje se odvijaju tijekom fotosinteze u biljkama, mogu se svrstati u dvije skupine: •

fotosintetske reakcije prijenosa elektrona ⇒ proizvodnja ATP i NADPH, odvijanje ovisi o svjetlosnoj energiji

•

reakcije fiksacije ugljika ⇒ pretvorba CO2 u ugljikohidrate

Fotosustav se sastoji od dvije usko povezane komponente: •

kompleks antena je važan za hvatanje svjetlosti, sastoji od molekula pigmenta koje hvataju svjetlosnu energiju i prenose je do reakcijskog središta.

•

fotokemijsko reakcijsko središte je transmembranski proteinsko-pigmentni kompleks koji leži u srcu fotosinteze. Misli se da se je razvio prije 3 milijarde godina u primitivnim fotosintetskim bakterijama.

→ sastoji se od proteinskih kompleksa i molekula klorofila koji omogućuju da energija svjetla bude pretvorena u kemijsku energiju.

Proces pretvorbe energije započinje kada su molekule klorofila pobuđene fotonom (kvant svjetlosti), elektron je pomaknut iz jedne molekulske orbite u drugu više energije. Pobuđena molekula je nestabilna i nastoji se povratiti u svoje početno, nepobuđeno stanje na jedan od ova tri načina: 1. pretvarajući višak energije u toplinu (molekularna kretanja) ili kombinacijom topline i svjetla duže valne duljine (fluorescencija), što se događa kad je energija svjetlosti apsorbirana od izolirane molekule klorofila u otopini 2. prenošenjem energije, ali ne direktno preko elektrona, na susjednu molekulu klorofila procesom nazvanim rezonantni prijenos energije; događa se u kompleksu antena 3. prenošenjem elektrona visokog potencijala do druge susjedne molekule (akceptora elektrona) i vraćanjem na početno stanje uzimanjem elektrona niskog energetskog potencijala od neke druge molekule (donor elektrona); događa se u reakcijskom središtu. Kada je molekula klorofila pobuđena u kompleksu antena, energija se brzo prenosi od jedne molekule do druge rezonantnim prijenosom energije dok ne stigne do posebnog para molekula klorofila u fotokemijskom reakcijskom središtu. Posebni par molekula klorofila u reakcijskom središtu, djeluje kao ireverzibilna zamka za pobuđeni kvant, jer se njegov pobuđeni elektron odmah prosljeđuje preko akceptora elektrona do lanca prijenosa elektrona, koji su precizno smješteni kao susjedi u istom proteinskom kompleksu. Membranski proteini često funkcioniraju kao veliki enzimatski kompleksi. Bakterijsko fotosintetičko reakcijsko središte (FRC) je transmembranski protein s najkompleksnijom strukturom proučavanom kristalografski pomoću X zraka. Struktura je određena difrakcijskom analizom X zraka (rendgenskom srtukturnom analizom) kristala tog transmembranskog proteinskog kompleksa. FCR sadrži: -

4 proteinske podjedinice L, M, H i citokroma 4 molekule bakterioklorofila 2 molekule bakteriofeofitina kinon slobodno željezo (Fe)

Prijenos elektrona i sinteza ATPa tijekom fotosinteze NECIKLIČKI TOK Pet proteinskih kompleksa u tilakoidnoj membrani djeluje u prijenosu elektrona i sintezi ATP i NADPH. Fotone apsorbiraju molekule klorofila udružene s fotosustavima I i II (PS I I PS II). U fotosustavu II, energija dobivena apsorpcijom fotona koristi se za cijepanje molekula H2O u tilakoidnom prostoru. Elektroni se zatim prenose pomoću plastokinona (PQ) do citokrom bf kompleksa, gdje se prenose na niže energetsko stanje, a H+ se crpe u tilakoidni prostor. Elektroni se zatim prenose do fotosustava I pomoću plastocijanina (PC). U fotosustavu I, energija dobivena apsorpcijom svijetla ponovo stvara visokoenergetske elektrone, koje proteinski kompleks, reduktaza NADP, koristi za redukciju NADP+ u stromi kloroplasta. Proteinski kompleks, ATP sintaza, zatim koristi

energiju pohranjenu u protonskom gradijentu za pretvorbu ADPa u ATP. Produkti necikličkog toka elektrona su ATP, NADPH i O2. CIKLIČKI TOK Umjesto da se prenesu na NADP+, elektroni visoke energije iz fotosustava I vraćaju se natrag do citokrom bf kompleksa. Prijenos elektrona kroz citokrom bf kompleks povezan je, kao i u fotosustavu II, sa stvaranjem protonskog gradijenta kroz tilakoidnu membranu. Plastocijanin zatim vraća te elektrone u fotosustav I, na nižu energetsku razinu, završavajući ciklus prijenosa elektrona u kojem se energija svjetla skupljena u fotosustavu I koristi za crpljenje protona u citokrom bf kompleksu. Prijenos elektrona od fotosustava I može stoga stvarati ili ATP ili NADPH, ovisno o metaboličkim potrebama stanice.

FOTOSINTEZA Početna reakcija u fiksaciji ugljika Ova reakcija u kojoj je ugljični dioksid pretvoren u organski ugljik, katalizirana je u stromi kloroplasta enzimom ribuloza 1,5 bisfosfat karboksilazom ⇒ rubisco, kojeg ima u jako velikim količinama. Taj enzim često predstavlja 50% svih proteina kloroplasta i smatra se jednim od najobilnijih enzima na Zemlji. CO2 iz atmosfere veže se s ribuloza 1,5-bisfosfatom (spojem koji sadrži pet ugljika) i vodom dajući dvije molekule 3-fosfoglicerata (spoj koji sadrži tri ugljika). rubisco CO2 + 1,5 ribuloza bisfosfat ----------------→ 1/6 C6H12O6 ATP, NADPH U ciklusu fiksacije ugljika potroše se tri molekule ATPa i dvije molekule NADPH za svaku molekulu CO2, koja se fiksira i pretvori u ugljikohidrat rubisco CO2 + 3 ATP + 2 NADPH + voda

3-fosfoglicerat

U reakcijama fiksacije ugljika tri molekule CO2 ugrađene su enzimom ribuloza bisfosfat karboksilaza da bi se proizvelo 6 molekula 3-fosfoglicerata rubisco 3 CO2 + 9 ATP + 6 NADPH + voda

6 3-fosfoglicerat

Čisti prinos ove reakcije je jedna molekula gliceraldehid 3-fosfata (3 atoma ugljika).

6 3-fosfoglicerat

gliceraldehid 3-fosfata + 8 Pi + 9 ADP + 6 NADP+

Energija fosfatne veze (ATP) i reducirajuća snaga (NADPH) potrebne su za stvaranje organskih molekula iz CO2 i H2O. Glavnina gliceraldehid 3-fosfata ostaje u stromi kloroplasta u obliku škroba (polimer glukoze i služi kao rezervni ugljikohidrat). Kemiosmoza povezuje protonski gradijent sa sintezom ATPa. Prolaskom elektrona između molekula nosača u lancu prijenosa elektrona, koji povezuje fotosustav I i II, H+ ioni aktivno se prenose u tilakoidni prostor. Energija protonskog gradijenta, održavana na taj način, koristi se za fosforilaciju ADPa u ATP. Protoni prolaze kroz membranu niz svoj koncentracijski gradijent, a oslobođenu energiju ATP sintaza koristi za sintezu ATPa. Crpljenje protona (a) i sinteza ATPa (b) događaju se na svjetlu, istovremeno i stalno. Fotosinteza je proces pomoću kojeg zelene biljke vežu svjetlosnu energiju sunčeva zračenja i pohranjuju je u kemijskim vezama ugljikohidrata i drugih organskih molekula. Dva su osnovna uvjeta koja se moraju ispuniti da bi došlo do fotosinteze: 1. mora postojati izvor energije; svjetlosnu energiju apsorbiraju molekule klorofila u kloroplastima, a dio te energije, tijekom fotosinteze, pohranjuje se u molekulama ATPa. 2. mora postojati izvor vodika koji će reducirati ugljični dioksid do visoko reduciranog i energetski bogatog šećera, glukoze. → energija svjetlosti omogućuje razlaganje vode na vodik i kisik. Tako se oslobađaju potrebne količine vodika za redukciju CO2, a kisik koji se oslobađa u atmosferu omogućuje disanje. Definicija: Fotosinteza je u osnovi proces razlaganja vode posredstvom svjetlosne energije (fotolitičko razlaganje vode) i postepeni prijenos elektrona iz vodika na sve više energetske razine, sve do njegovog privremenog vezivanja u sklop koenzima: reduciranog oblika NADPH (reduciranog nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfata). Fotosinteza je proces kojim se energija sunčevog svjetla pretvara u korisni oblik potencijalne kemijske energije, a koja predstavlja konačni izvor metaboličke energije za sve biološke sustave. Tijekom fotosinteze, energija sunčevog svijetla skuplja se i koristi za sintezu glukoze iz CO2 i H2O. Fotosinteza se odvija u dva odvojena stadija: U reakcijama na svjetlu, energija sunčeve svjetlosti koristi se za sintezu ATPa i NADPH, a pri tom iz H2O nastaje O2. Svjetlosne reakcije pretvaraju, dakle, energiju svjetla u kemijsku energiju ATPa i NADPH. Pigmenti i proteinske molekule (dva fotosustava i lanac prijenosa e-), koji izvode svjetlosne reakcije nalaze se u tilakoidnoj membrani kloroplasta. Svjetlosne reakcije cijepaju H2O i oslobađaju O2 u Zemljinu atmosferu. U reakcijama u tami, nazvane tako jer ne zahtijevaju sunčevu svjetlost, ATP i NADPH proizvedeni reakcijama na svjetlu koriste se za sintezu glukoze.