Martínez-romero, Aurora. Ortega, José Luis. Cervantes, Maribel. Técnicas de Identificación en Química Forense. Editorial Académica Española, 2013
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Tecnicas de Identificacion en Quimica Forense
QoQ editorial acad~mica espanola
Tecnicas de Identificaci6n en Quimica Forense, es una obra de texto que contiene tecnicas utiles e indispensables para estudiantes e investigadores en ciencias forenses con la responsabi lidad de resolver situaciones medico-legales. Una breve introducci6n sabre qui mica, medicina legal y ciencias relacionadas con la misma. Se da a conocer el perfil de un peri to legal y aspectos relevantes de jurisprudencia en relaci6n a la profesi6n del qufmico legista. La presente obra pretende apoyar en 10 posible a la identificaci6n certera y oportuna con
resu ltados eficaces, considerando la importancia en la concatenaci6n en toma de muestra, etiquetado, conservacion, envio y anal isis. Se busca lograr la preparacion de recursos humanos con las habilidades y destrezas requeridas para una investigacion apl icada efectiva en el area
etico riguroso. Las tecnicas de identificacion proporcionadas facilitarim
qui mica legal bajo la aplicaci6n de ju sticia dentro de un marco
informacion s61 ida sabre evidencias en cualquier escenario quimico, medico legal, como el analisis de productos biol6gicos, mane has, intoxicaciones, adulteraciones en bebidas y alimentos, procedimientos de identificaci6n, etc.
Aurora Marti nez-Romero
Tiene Maestria Desarroll o y Procesamiento de Alimentos, Maestrfa Bioquimica Cllnica, UJED. Doctorado Ciencias Agropecuarias, UAAAN.Dr. Jose Lui s Ortega Sanchez, Maestria Salud Publica, UJED y candidato a Doctor Ciencias Agropecuarias, UAAAN .DC Maribel Cerva ntes Flores, Maestrfa y Doctorado en Inmunologfa, Escuela Nacional de Ciencias Biomedicas,IPN
Aurora Martinez-Romero ' Jose Luis Ortega ' Maribel Cervantes
Tecnicas de Identificaci6n en Quimica Forense La Quimica Forense, importante linea de aplicacion e investigacion en el sector medico y quimico social
editorial academica espanola 978-3-659-04850-0
ISBN-13:978-3-659-04850-0ISBN-10:365904850XEAN:9783659048500
Técnicas de Identificación en Química Forense, es una obra de texto que contiene técnicas útiles e indispensables para estudiantes e investigadores en ciencias forenses con la responsabilidad de resolver situaciones médico-legales. Una breve introducción sobre química, medicina legal y ciencias relacionadas con la misma. Se da a conocer el perfil de un perito legal y aspectos relevantes de jurisprudencia en relación a la profesión del químico legista. La presente obra pretende apoyar en lo posible a la identificación certera y oportuna con resultados eficaces, considerando la importancia en la concatenación en toma de muestra, etiquetado, conservación, envío y análisis. Se busca lograr la preparación de recursos humanos con las habilidades y destrezas requeridas para una investigación aplicada efectiva en el área química legal bajo la aplicación de justicia dentro de un marco ético riguroso. Las técnicas de identificación proporcionadas facilitarán información sólida sobre evidencias en cualquier escenario químico, médico legal, como el análisis de productos biológicos, manchas, intoxicaciones, adulteraciones en bebidas y alimentos, procedimientos de identificación, etc.
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(afección
inflamatoria, aguda o crónica en la piel) etc.@ Tratamiento ante intoxicaciones: Forma aguda: debe tratarse como un proceso producido por un veneno irritante. Forma crónica: aplicar durante tres semanas 50-500 mg de sulfato sódico, aunque no siempre este tratamiento es efectivo. MATERIAL: Animal infectado con cobre (cloruro de cobre, oxido de cobre, carbonato de cobre, etc.) HCl al 20% Na2S Glicerinado (1:1) KI al 0.6 M (recién preparado) Agua amoniacal (1:1) Papel filtro. Cronómetro o reloj de tiempo. Pipetas de 1, 2, 5 y 10 mL. TÉCNICAS: Se pueden realizar los siguientes métodos para la determinación de Cobre: A) Hidróxido de amonio (agua amoniacal), B) Sulfuro de sodio glicerado, C) Ioduro de potasio. A) HIDROXIDO DE AMONIO (AGUA AMONIACAL) Fundamento teórico: Al adicionar cuidadosamente una solución diluida de hidróxido amónico a una muestra donde haya presencia de 85
una sal cúprica, se obtiene un precipitado verde de la sal básica, que se disuelve fácilmente en exceso de reactivo originando un intenso color azul celeste del complejo tetraaminocobre II. TECNICA: Se toman 20 g de contenido estomacal y se le añaden 20 ml de ácido clorhídrico al 20%, se mezcla y se deja en reposo por período de 10 minutos. Posteriormente filtramos. Tomar 2 ml del filtrado, añadir agua amoniacal gota a gota hasta ver la formación de un precipitado verde pálido. Posteriormente continuar añadiendo el agua amoniacal hasta que el precipitado se disuelva. La aparición de un color azul indica la presencia de iones cobre. B) SULFURO DE SODIO GLICERADO Fundamento teórico: El ácido sulfhídrico y los sulfuros alcalinos forman con el cobre un precipitado negro de sulfuro cúprico insoluble en sulfuros alcalinos y fácilmente solubles en ácido nítrico diluido y caliente con precipitación de azufre. TECNICA: Tomar 2 ml del filtrado, añadir 0.5 ml de sulfuro de sodio glicerado. La aparición de un precipitado negro indica la presencia de iones cobre. C) IODURO DE POTASIO: Fundamento teórico: En presencia de iones cobre origina un precipitado de ioduro cuproso, blanco, el mismo tiempo que deja yodo libre. Este yodo es retenido por el precipitado, que adquiere un tinte del color rosa al amarillo rojizo. TECNICA: Tomar 2 ml del filtrado. Añadirle 0.5 ml de KI al 0.6 M (recientemente preparada). La aparición de un precipitado de un color rosa a pardo rojizo indica la presencia de iones cobre. CUESTIONARIO PREVIO: 86
1. Investigue todo lo referente a todas las sustancias mencionadas en esta práctica, así como las fórmulas de cada una. 2. Investigue otro método para determinación de cobre. 3. ¿Cuáles son las reacciones que se llevan a cabo en los tres métodos utilizados para determinación de cobre? 4. ¿Fisiológicamente para que es necesario el cobre en nuestro organismo? 5. ¿En que alimentos se encuentra en cobre naturalmente? 6. ¿Cuál es la sintomatología presentada durante el curso agudo en una intoxicación por cobre? 7. Investigue la DL 50 en ovejas y bovinos de cobre. 8. ¿En cuáles otros compuestos puede llegar el cobre a los organismos animales?
PRACTICA NO. 8 DETERMINACIÓN DE PLOMO OBJETIVOS: Que los estudiantes adquieran la habilidad necesaria para determinar la presencia de plomo en animales intoxicados con este elemento. INTRODUCCION: Dentro de los metales pesados, el plomo ocupa el primer lugar como causa de intoxicación de los animales domésticos, especialmente en los bovinos. Dentro de las causas de intoxicación presentan gran importancia las pinturas, que se dejan alcance de los individuos y animales, así como los pesticidas que contienen plomo en el caso del arseniato de plomo, alimentos que contienen sales de plomo. Generalmente el plomo llega por vía oral y muy pocas veces por vías respiratorias, una gran parte se excreta por heces fecales, la absorción en intestino se realiza en su mayor parte en forma de complejos de plomo relativamente insolubles que se forman con las 87
proteínas y otros cuerpos presentes en el tracto intestinal, la tasa de absorción depende de la velocidad de solubilidad del compuesto ingerido en el tracto digestivo. La mayor parte del plomo ingerido pasa al hígado a través de la vena porta donde se deposita y se va eliminando lentamente por la bilis, parte por la orina y la otra por circulación general, también puede excretarse por leche. En los procesos agudos la distribución de plomo en el organismo en orden decreciente generalmente es la siguiente: huesos, hígado, riñones, corazón, pulmones, músculo y cerebro. En procesos crónicos el índice en huesos es menor y mayor en corteza renal y en hígado. La dosis tóxica es de 50 mg - 25 g según el producto y la especie animal. Los síntomas en fase aguda son: ruidos por la boca (mugido) y salida de espuma, movimientos giratorios de los ojos, convulsiones, espasmos musculares y tetania
(contracción tónica
dolorosa de los músculos de las extremidades especialmente) que aumenta hasta que aparece la muerte. En fases crónicas es diferente en cada especie, puede observarse pérdida de peso, la respiración se acorta, ronquidos por parálisis de los músculos laríngeos, banda azul en la encía y anemia. En una intoxicación durante la autopsia al abrir se observa un olor característico, musculatura puede tener color gris, inflamación del abomaso (en rumiantes es el cuarto estómago) e intestino, lesiones renales con hemorragias en superficie, principalmente. MATERIAL: Infectar al animal con pesticida con arseniato de plomo u orina, alimentos que contengan sales de plomo (acetato de plomo). Acetato de amonio NH 3 concentrado HNO 3 al 8% CH3COOH concentrado. 88
Cromato de potasio saturado H2SO4 concentrado Pipetas 1, 1, 5 y 10 mL. Equipo para evaporar (mechero, vaso de precipitados 250 ml, tripie, tela de asbesto, pinza tres dedos). TECNICAS: Preparación de las muestras: Las muestras se mineralizan tomándose para ello 5 - 10 ml de sangre. Si se toma orina 50 ml, pienso (alimento seco que se le da al ganado) ó porción de alimento a analizar 50 g, y si es contenido estomacal 50 ml o 50 g. Esta mineralización se hace por vía húmeda y al terminarse esta se le añade acetato de plomo para solubilizar el plomo existente. Si se utiliza orina puede usarse sin la mineralización preparándose de la siguiente forma: Se toman los 50 ml de orina y se alcaliniza con 10 ml de amoniaco concentrado y se deja reposar por período de 30 minutos para que se forme el fosfato de plomo, se filtra y se desecha el filtrado recogiéndose el precipitado, para ello se toma con solución caliente de ácido nítrico al 8% (30 ml) y se recoge el filtrado del ácido nítrico y se vuelve a tomar con dicha solución tantas veces como sea necesario para que se solubilice todo el precipitado. Este filtrado se evapora hasta que queden aproximadamente 5 ml. Con esta orina procesada o con la muestra mineralizada se pueden realizar los diferentes métodos que veremos a continuación: METODO A: CROMATO POTÁSICO Fundamento teórico: En presencia del plomo se forma un precipitado amarillo de cromato de potasio insoluble en ácido acético (es por esto que se añade ácido acético en exceso). TECNICA: 89
Se toman 5 ml de la orina procesada o 10 ml de la muestra mineralizada y se alcaliniza con amoníaco, luego se acidifica con ácido acético concentrado. Posteriormente añadir 1 ml más de ácido acético concentrado y se adiciona 5 gotas de solución de cromato de potasio saturado, si hay presencia de plomo se produce precipitado amarillo cuya intensidad esta en relación directa con la concentración de plomo en la muestra. Si se requiere determinar el plomo semicuantitativamente se realizan varios pasos son concentraciones conocidas y por comparación calculamos la cantidad de plomo en la muestra (esta técnica tiene una sensibilidad de 50 μg en 50 g de muestra). METODO B: ÁCIDO SULFÚRICO Fundamento teórico: El ácido sulfúrico y los sulfatos solubles precipitan a sulfato de plomo, blanco, pulvurulento o cristalino, muy poco soluble en agua e insoluble en medio alcohólico. TECNICA: Se toman 0.5 ml de la orina procesada o 10 ml de la muestra mineralizada y se le añaden 0.5 ml de ácido sulfúrico concentrado, más 5 ml de alcohol al 96.5% Si hay presencia de plomo aparecerá un precipitado color blanco en un período entre 1 - 30 minutos. CUESTIONARIO PREVIO 1. Investigue
todo
lo
referente
a
todas
las
sustancias
mencionadas en esta práctica, así como las fórmulas de cada una. 2. Investigue cuales son las reacciones que se llevan a cabo en los dos métodos utilizados para la determinación de plomo. 3. ¿Porque las pinturas son importantes en la intoxicación por plomo? 4. Describa que es saturnismo 90
5. ¿Que enzimas en sangre humana pueden servir como índice biológico de exposición al plomo? 6. ¿Cuales son las principales fuentes de contaminación
por
plomo en alimentos? 7. ¿Cómo se elimina el plomo en el organismo? 8. ¿Entre la vía oral y la respiratoria, cual tiene una repercusión inmediata en la intoxicación por plomo? 9. ¿Cuales son los órganos afectados en una intoxicación por plomo?
PRACTICA NO. 9 DETERMINACIÓN DE PLOMO EN SANGRE INTRODUCCIÓN El plomo se encuentra en la naturaleza en forma de minerales y es absorbido por las plantas junto con otros elementos nutritivos. Las fuentes industriales son: fábricas de acumuladores, de alambre, de pinturas, imprentas, etc. Los adultos poseen en promedio una cantidad total de 5 a 80 microgramos por 100 g de sangre y de 5 a 80 microgramos por 100 g de orina. Como medidas preventivas para proteger a los obreros están: 1. ventilación adecuada para no sobrepasar el límite de seguridad que es de 1.5 mg/10m3 de aire. 2. realizar análisis periódicos del ambiente y trabajadores. Si los obreros presentan síntomas de intoxicación y la cantidad de plomo está arriba de 59 Pg de plomo en 100 g de sangre, separarlo del lugar de exposición. 3. evitar comer, fumar, o mascar chicle en los sitios de trabajo. 4. evitar la contaminación del aire exterior mediante instalaciones de precipitadores electrostáticos en el tiro de las chimeneas. 91
La
intoxicación
por
plomo
se
hace
crónica,
existe
un
acostumbramiento a las molestias producidas. MATERIAL Y REACTIVOS Material necesario para toma de muestra (venopunción) Matraces Erlenmeyer de 250 ml 0.5 ml de ácido sulfúrico concentrado 25 ml de ácido nítrico Perlas de ebullición Ácidos nítrico y perclórico (25:5) 5 ml de ácido perclórico Mechero, tripie, tela de asbesto 8 ml de ácido nítrico 0.2 N Embudo de separación 25 ml de una mezcla de citrato de amonio, cianuro de potasio y clorhidrato de hidroxilamina Indicador rojo de fenol Amoniaco 5 ml de solución de ditizona Cloroformo Agitador 7 gotas de anaranjado de metilo 20 ml de mezcla amonio ±cianurada Espectrofotómetro DESARROLLO EXPERIMENTAL 1) Obtener una muestra de sangre de aproximadamente 10 ml 2) Colocar la sangre en matraces Erlenmeyer de 250 ml 3) Adicionar 0.5 ml de ácido sulfúrico concentrado y 25 ml de ácido nítrico. Colocar perlas de ebullición. 92
4) Colocar la muestra con los ácidos en una plancha térmica, aumentando la temperatura gradualmente hasta que se disuelva el coágulo de sangre. Entonces adicionar Se continúa calentando hasta que se dejen de emitir vapores nitrosos y la muestra tenga un color amarillo claro. 5) Si las muestras presentan un color mas oscuro, es necesario sacarlas, dejarlas enfriar y adicionar la misma proporción de ácidos nítrico y perclórico (25:5) 6) Llevar a sequedad. La digestión 5 ml de ácido perclórico.de la muestra se realiza durante varias horas. DETERMINACIÓN A) A las muestras digeridas adicionar 8 ml de ácido nítrico 0.2 N y calentar hasta ebullición. Dejar enfriar. B) En un embudo de separación colocar 25 ml de una mezcla de citrato de amonio, cianuro de potasio y clorhidrato de hidroxilamina. C) Vaciar las muestras en el embudo de separación. D) Checar con indicador rojo de fenol para tener un pH de 8.5; SI es necesario alcalinizar con amoniaco. E) Agregar 5 ml de solución de ditizona en cloroformo y agitar. F) Tomar nota del cambio de color. Realizar cuantas extracciones sean necesarias hasta que la ditizona no varié su color (verde original). G) Juntar los extractos clorofórmicos y desechar la fase acuosa. MUCHO CUIDADO DE NO DEJAR PASAR AGUA A LA FASE CLOROFORMICA. H) Colocar los extractos clorofórmicos en un embudo de separación y adicionar 50 ml de solución reguladora de pH 3.4 y agitar. La ditizona recupera su color original. Se desecha la fase clorofórmica y a la solución reguladora se le adicionan 5 ml de 93
cloroformo
para
retirar
la
ditizona
que
haya
quedado
emulsionada. I)
A la solución reguladora se le agregan 7 gotas de anaranjado de metilo, debe dar un color naranja. Si da rojo se alcaliniza con dos gotas de amoniaco.
J)
Se adicionan 20 ml de mezcla amonio ±cianurada (NO CONFUNDIR CON LA QUE SE UTILIZO INICIALMENTE) y debe obtenerse un pH
de 11; se realizan extracciones con
solución de ditizona de 5 ml cada vez. Cuando la ditizona ya no varié de color (verde) ha finalizado la extracción y esta porción ya no se colecta. K) Juntar los extractos y leer en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 510 nm. CUESTIONARIO PREVIO 1. ¿Investigue que es el plomo? 2. ¿Cual es la sintomatología presentada por intoxicación de plomo? 3. ¿Como se lleva a cabo la absorción y distribución de plomo en el organismo? 4. ¿En base a que es la variación del grado de toxicidad de los compuestos del plomo? 5. ¿Cuales son las etapas que se presentan durante la absorción del plomo? 6. ¿Como se le conoce a la enfermedad causada por la intoxicación por plomo? 7. Investigue algún otro método para determinación de plomo. 8. ¿Que repercusiones ecológicas, sociales y económicas trae como resultado la contaminación por plomo, proponga alternativas de solución?
94
PRACTICA NO. 10 DETERMINACIÓN DE NITRATOS, NITRITOS Y CLORATOS OBJETIVOS: El alumno aprenderá la técnica para la realización del análisis fundamental en la determinación de nitratos, nitritos y cloratos, así como su interpretación. INTRODUCCIÓN: La intoxicación por nitratos y nitritos puede tener su origen en abonos artificiales, herbicidas y agua contaminada que contengan nitratos de sodio, potasio y amonio, ingestión de plantas. La importancia de nitratos como causa de intoxicación es su transformación a nitritos, ya que éste produce alteraciones en la hemoglobina, formándose la metahemoglobina, la cual es incapaz de transportar oxígeno, cuando se produce esta conversión en más de un 30%, comienzan a aparecer los síntomas tóxicos del caso, puede llegar a morir por anoxia (estado de oxidación insuficiente) tisular. La dosis mínima letal en bovino de nitrato de sodio es 0.65 - 0.75 g por kg de peso. Para otra especie es de 0.15 - 0.17 g por kg de peso. Los nitratos y nitritos se aíslan de sangre con anticoagulante, contenido estomacal, agua, pasto, forraje, pienso y alimento contaminado. MATERIAL: Forrajes, pasto, sangre, etc., contaminada con Nitrato de sodio. Matraz Erlenmeyer de 250 ml con tapa esmerilada Matraz aforado de 250 ml y otro de 500 ml. Papel filtro Mg ó Zn en polvo Agua destilada Cápsula de porcelana 95
Difenilamina Reactivo de Griess (Acido sulphanílico y alfanaftilamina 1:1) CH3COOH Pipeta (1, 2 y 5 ml) Preparación de la muestra: SANGRE: Se toman 2 ml de sangre con anticoagulante y se añade ácido tricloro acético al 50% gota a gota hasta lograr una precipitación total de las proteínas, luego se filtra o se centrifuga para obtener la parte acuosa de la solución. CONTENIDO ESTOMACAL: Se toma 1 ml centrifugado y se trata con una pizca de carbón activado, agregar 4 ml de solución saturada de sulfato de amonio, agitar ligeramente y centrifugar a 2000 rpm el sobrenadante se filtra húmedo y el residuo se lava con 2 ml de sulfato de amonio, aforar el filtrado con agua destilada en un matraz de 250 ml. PASTO, FORRAJES, PIENSO Y ALIMENTOS: Pesar 10 g, se desmenusa
bien,
cubriendo
con
agua
destilada,
agitando
periódicamente, después de 5 minutos la extracción acuosa se filtra y el residuo se cubre de nuevo con agua destilada. Si la extracción acuosa posee coloración se trata con carbón activado y se agita en un Erlenmeyer con tapa esmerilada, filtrar. El filtrado se afora con agua destilada en un matraz aforado de 500 ml. MÉTODO: Fundamento teórico:
La difenilamina se oxida fácilmente a
compuestos azules tanto por nitritos como nitratos, por lo que es poco
selectiva,
entonces
se
hace
necesario
determinar
posteriormente cual de los dos aniones esta presente usando el reactivo de Griess, si con este reactivo nos da positivo estamos frente a nitritos, si da negativo tenemos que discriminar entre nitratos 96
y cloratos por reducción con Mg o Zn en polvo a nitritos y la posterior identificación de este por el mismo reactivo de Griess, el cual es específico para determinar nitritos. Se lleva a cabo una reacción de diazotación (se forman sales de diazonio a partir de una amina primaria con ácido nitroso con HCl). Se emplean dos aminas: el ácido sulfanílico y la alfa-naftilamina. En una primera etapa de diazota el ácido sulfanílico. Después esta sal de diazonio se copula con la alfa-naftilamina, dando un colorante azoico rojo y eliminación de HCl. TECNICA: En un matraz de 250 ml se le añade 50 g de la muestra y agregar 50 ml de agua destilada, reposar por horas, agitarlo ocasionalmente, filtrar. Añadir en una cápsula de porcelana bien limpia 0.5 ml de difenilamina, posteriormente se deja correr por las paredes de la cápsula unas gotas (3) del filtrado. Si se produce una coloración azul en el punto de contacto de los líquidos indica la presencia de nitratos, nitritos y cloratos. Por lo que es necesario realizar las siguientes pruebas para determinar cual es el que esta presente: En una cápsula de porcelana colocar 5 ml de la muestra (filtrado) y añadir 3 ml de reactivo de Griess, si se produce un color rojo indica la presencia de nitritos, de lo contrario hay nitratos o cloratos. En una cápsula de porcelana añadir 5 ml de filtrado. Agregarle una pizca de Mg o Zn en polvo y gotas de ácido acético (para reducir nitratos a nitritos) y se añaden 3 ml del Reactivo de Griess, si aparece un color rojo nos demuestra la presencia de nitratos y de no aparecer estamos frente a una intoxicación por cloratos. DETERMINACION DE NITRITOS (PRUEBA DE GRIESS) Colocar la muestra en una placa o cápsula de porcelana. Agregar alfa-naftilamina (0.5% en metanol) más ácido sulfanílico (0.5% en 97
agua) más ácido acético al 25%. En un resultado positivo se observa una coloración rojo pardo. DETERMINACION DE NITRATOS (PRUEBA DE LUNGE) REACTIVO: En un tubo o probeta colocar la difenilamina con poco agua y ácido sulfúrico, aproximadamente 5 gotas Prueba: Colocar la muestra en cápsula o placa más una o dos gotas del reactivo. Se observa una coloración azul cuando la prueba es positiva. METODO PARA IDENTIFICACION DE NITRATOS EN SANGRE 1)
Sangre fresca (5ml) diluir 1:100 0.05 de sangre con 4.95 de SS Agregar KCN, el cambio a color chocolate a un rojo (+)
2)
Valorar una solución de nitrato de plata en presencia de cromato de potasio al 10% como indicador. EXPLOSIVOS DETERMINACION DE CLORATOS a) En tubo de ensayo se coloca la muestra en solución acuosa. Se agrega HCl (gotas) más unos gránulos de KI. En un resultado positivo se debe observar una coloración amarillenta. b) Se coloca la muestra en una placa, se agrega H2SO4 (una o dos gotas). En un resultado positivo se detectará un olor picante característico por el desprendimiento de HCl
CUESTIONARIO PREVIO: 1. Investigue todo lo referente a todas las sustancias mencionadas en esta práctica, así como las fórmulas de cada una con su nombre. 2. Investigue otro método para determinación de NITRATOS. 3. Investigue otro método para determinación de NITRITOS. 4. Investigue otro método para determinación de CLORATOS.
98
5. ¿Cuál es la reacción que se lleva a cabo en el método utilizado para determinación de NITRATOS, NITRITOS Y CLORATOS? 6. ¿Por que son peligrosos los nitratos y nitritos? 7. ¿Cual es la acción farmacológica de los nitritos? 8. ¿Cuáles son los síntomas que se manifiestan por intoxicación por nitritos?
PRÁCTICA NO.
11
TECNICAS DE ORIENTACIÓN PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE SANGRE I.
TECNICA DE LA BENCIDINA O DE ADLER
FUNDAMENTO
QUÍMICO:
Las
peroxidasas
sanguíneas
son
catalasas, que como su nombre lo indica poseen actividad catalítica (enzimática) en las reacciones de oxidación, ya que tienen la propiedad de descomponer el peróxido de hidrógeno u otros peróxidos orgánicos, produciendo liberación de radicales oxhidrilo. El grupo hem de la hemoglobina posee esa actividad enzimática, que puede catalizar la ruptura del peróxido de hidrógeno. Mientras no estén presentes otras sustancias orgánicas oxidantes, esta actividad de la hemoglobina, descompone el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno, que al reaccionar con la bencidina la oxidarán formando un compuesto intensamente azul. La oxidación de la bencidina es utilizada como prueba presuntiva para la identificación de sangre. INTERPRETACIÓN Un resultado negativo excluye la presencia de sangre, si la reacción es positiva requiere del empleo de reacciones de confirmación ya que se pueden obtener falsas reacciones positivas con otras sustancias que tengan actividad semejante a la de las peroxidasas o bien con otros materiales oxidantes. Manchas problema de sangre 99
Solución de bencidina: 0.25 g bencidina 175 ml de etanol 5-10 gotas de ácido acético glacial Vaso de precipitados de 250 ml Agitador H2O2 al 3% en frasco gotero ámbar Hisopo Piseta PREPARACION DEL REACTIVO A) SOLUCIÓN DE BENCIDINA: 0.25 g de bencidina se disuelven en 175 ml de etanol y se añaden 510 gotas de ácido acético glacial. Se guarda en un frasco gotero ámbar, en refrigeración en tanto no se usa. B) H2O2 al 3%; también en frasco gotero ámbar. PROCEDIMIENTO Humedecer un hisopo con agua destilada y frotarlo sobre la mancha problema. Añadir al hisopo 1-2 gotas de solución de bencidina, después de unos momentos de observar que no de coloración con ésta, poner la misma cantidad de agua oxigenada sobre el hisopo. En caso positivo aparecerá rápidamente una coloración azul. 2. TECNICA DE LA FENOLFATELEINA O DE KASTLE - MAYER FUNDAMENTO QUÍMICO: Esencialmente la rige el mismo principio que se señaló para la reacción de Adler. La diferencia estriba en que: a)
la fenolftaleína debe ser reducida previamente a fenolftaleína incolora y este reactivo por su labilidad debe ser guardado en refrigeración en frascos ámbar. 100
b)
Se trabaja en medio alcalino en vez de medio ácido.
c)
Se efectuará un calentamiento previo a 100°C durante un minuto.
Solución de fenolftaleína: 2 g fenolftaleína 20 g de NaOH 20 g polvo de zinc Equipo para reflujo Frasco ámbar Tubo de ensayo Pipeta 5 ml Mechero, tripié, tela de asbesto PREPARACIÓN DEL REACTIVO A) SOLUCIÓN DE FENOLFTALEÍNA Fenolftaleína
2g
Hidróxido de potasio
20 g
Agua destilada
100 ml
Polvo de zinc
20 g
Disolver estas sustancias y colocarlas a reflujo con el polvo de zinc hasta completa decoloración. Esta solución madre deberá guardarse en un frasco ámbar en refrigeración y deberá añadírsele polvo de zinc. B) SOLUCIÓN DE TRABAJO: Diluir la solución madre en etanol en la proporción 1:5, la que también deberá refrigerarse en tanto no se use. B) SOLUCIÓN DE AGUA OXIGENADA AL 3% PROCEDIMIENTO: Humedecer un hisopo con solución salina, frotar la muestra problema y pasarlo a un tubo de ensayo con 2 ml de la misma solución,
101
calentar un minuto a 100°C, añadir unas gotas de reactivo, esperar unos segundos y agregar agua oxigenada. INTERPRETACIÓN En caso positivo se obtendrá una coloración rosa brillante. 3. TECNICA DE LA LEUCO MALAQUITA VERDE FUNDAMENTO QUÍMICO: Se basa, al igual que las anteriores en una reacción de oxidación-reducción. Reactivo leuco malaquita verde: 0.32 g de perborato de sodio 0.10 g malaquita verde Frasco ámbar ml de ácido acético glacial PREPARACIÓN DEL REACTIVO: a) Se prepara una mezcla sólida que contenga 0.32 g de perborato de sodio y 0.10 g de malaquita verde; se mezclan perfectamente y se guardan en frasco ámbar. Esta mezcla dura un año sin perder estabilidad. b) El solvente se prepara diluyendo 6.6 ml de ácido acético glacial en 3.3 ml de agua destilada. c) Preparar el reactivo de trabajo, inmediatamente antes de usarlo, disolviendo la mezcla sólida a)
en la solución
b).
Si en el
reactivo recién preparado llegara a observarse la más leve coloración verde, no deberá ser usado. PROCEDIMIENTO La mancha sospechosa se levanta con un hisopo humedecido con agua destilada y se ele agregan unas gotas de reactivo recientemente preparado. INTERPRETACIÓN: En caso positivo se observará una coloración verde. 4. TECNICAS DE CONFIRMACIÓN 102
I.
CRISTALES DE HEMINA O DE TEICHMANN
FUNDAMENTO QUIMICO: La hemoglobina cuando es tratada con ácido acético se separa inmediatamente de las proteínas y del grupo prostético. Durante la hidrólisis la globulina se desnaturaliza.. la oxidación del hierro del grupo hem se efectúa más rápidamente en medio ácido que en medio alcalino. Si se presenta un halógeno inorgánico como el cloro se formarán cristales insolubles de cloruro de ferriprotoporfirina o hemina. Reactivo de Teichmann: 0.1
g de cloruro de sodio
0.1
g de bromuro de potasio
0.1
g de yoduro de potasio
100 ml de ácido acético Portaobjetos Cubreobjetos Microscopio PREPARACION DEL REACTIVO: Cloruro de sodio
0.1 g
Bromuro de potasio
0.1 g
Ioduro de potasio
0.1 g
Ácido acético
100 ml
PROCEDIMIENTO: 1. Colocar la muestra problema en el centro de una laminilla de vidrio y poner encima de ella un cubreobjetos. 2. Deslizar entre lámina y laminilla, por capilaridad unas gotas de reactivo de Teichmann. 3. Centrar lentamente y a baja temperatura laminilla hasta evaporación. 4. Dejar enfriar y observar al microscopio. INTERPRETACIÓN 103
En caso positivo se observarán cristales romboidales de color café oscuro. CUESTIONARIO PREVIO 1. Investigue que es la bencidina 2. ¿Porque el grupo hem de la hemoglobina posee actividad enzimática? 3. ¿Que otras sustancias poseen actividad semejante a la de las peroxidasas? 4. ¿Que es el agua oxigenada? 5. ¿Que es la fenolftaleína e indique para que se utiliza y cuál es su estado oxidado y reducido? 6. ¿Que es la leuco malaquita verde e indique para que se utiliza y cuál es su estado oxidado y reducido?
PRACTICA NO.
12
TECNICAS DE ORIENTACIÓN (LIQUIDO
ESPERMÁTICO) 1. FLUORESCENCIA A LA LUZ ULTRAVIOLETA El líquido espermático contiene flavinas de alta concentración y son las responsables de impartir fluorescencia blanco verdosa al semen cuando las manchas de este son observadas a la luz UV, por lo tanto este procedimiento es de gran utilidad para la localización topográfica de posibles huellas espermáticas, tanto en el lugar de los hechos como en las prendas de vestir. Recientemente también se utiliza el rayo laser para este fin. 2. TECNICA DE LA FOSFATASA ACIDA FUNDAMENTO QUÍMICO: La fosfatasa ácida está presente en los géneros animal y vegetal, tiene la propiedad de hidrolizar los ésteres alifáticos y aromáticos del ácido ortofosfórico. Por lo que se refiere a los fluidos corporales humanos se ha demostrado que en el líquido 104
seminal se encuentra en concentraciones de 20 a 400 veces más que en otros fluidos, por lo tanto la presencia de semen en manchas sospechosas se puede detectar por el hallazgo de elevadas cantidades de fosfatasa ácida. Su detección se basa en la reacción cromática de la enzima fosfatasa ácida, muy abundante en la secreción genital masculina. La enzima reacciona con el reactivo 1-naftilfosfato de calcio y queda libre alfa naftol, este reacciona con sulfato de dianisiltetrazonioi y forma un colorante azoico violeta intenso. PREPARACION DEL REACTIVO SOLUCIÓN 1 (BUFFER) Cloruro de sodio
23.0 g
Acetato de sodio 3 H2 0 Acido acético glacial Agua destilada SOLUCIÓN 2 1-naftil fosfato de calcio
50 mg
Sulfato de dianisil tetrasonio
30 mg
Solución acuosa al 10% de lauril sulfato de sodio
1.0 ml
PROCEDIMIENTO La mancha problema o el hisopo con el cual se tomó la muestra, se colocan entre 2 hojas de papel filtro, lo mismo se hace con el material no manchado (blanco) y con otro que este manchado con semen (positivo). Se colocan sobre una lámina de vidrio en la que previamente se habrá anotado testigo negativo, muestra problema y testigo
positivo,
inmediatamente
después
se
agregan
aproximadamente 10 mg del reactivo a cada una de las muestras con una pileta Pasteur. 105
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS La aparición de una coloración violeta intensa en la muestra problema, dentro de un tiempo no mayor a 5 minutos, indicará la presencia de fosfatasa ácida en cantidades mayores a 20 UKA y por lo tanto la presencia de semen. OBSERVACION MICROSCOPICA DEL SEMEN CUESTIONARIO PREVIO 1. Investigue la enzima fosfatasa ácida. 2. Cual es el fundamento de las técnicas de fluorescencia. 3. De algunos ejemplos de especímenes que contengan fosfatasa ácida. 4. Investigue como se realiza en un laboratorio un examen de semen, para que se utiliza, diga como se observa al microscopio en fresco, como prepararía un frotis y una tinción para observarlo al microscopio permanentemente.
PRACTICA NO. 13
EXTRACCIÓN DE CAFEÍNA DE ALGUNAS
MEZCLAS INTRODUCCIÓN La cafeína es un alcaloide que se encuentra en forma natural en el café, té, cacao, nueces del árbol de cola y el mate. Los refrescos de cola contienen cafeína. Los alcaloides con compuestos que contienen nitrógeno y presentan propiedades ácido ± básicas semejantes a las de las aminas. Una taza de café instantáneo contiene aproximadamente 74 mg de cafeína (39 ± 168 mg). Una taza de café percolado posee 83 mg (64-124 mg). El té se reporta con una concentración de 27 mg de cafeína, una barra de 30 g de chocolate 20 mg, 300 ml de bebida de cola 31.7 mg de cafeína. La cafeína es un polvo blanco, con sabor amargo, soluble en agua, con 106
hidrofobicidad suficiente para atravesar membranas biológicas. Estas
características facilitan su absorción rápida en el tracto
gastrointestinal, se distribuye en todo el organismo, principalmente en cerebro, testículos y tejidos fetales. OBJETIVO Aplicar la técnica de extracción con disolventes para el aislamiento de la cafeína de diferentes bebidas. MATERIAL Y REACTIVOS Triangulo de porcelana, Mechero, tripie, tela de asbesto Capsula de porcelana Baño María Embudo de separación 2 Vasos de pp de 250 ml y de 1000 ml Probeta 100 ml Agitador Lupa EROVDVGHWHQHJUR³/DJJV´ EROVDVGHFDIpQHJUR³/DJJV´ 100 ml de coca ± cola 4 cucharadas de café instantáneo 4 cucharadas de café descafeinado Piseta Agitador H2O2 al 6% (gotas) HCl concentrado (gotas) Hidróxido de amonio (gotas) DESARROLLO EXPERIMENTAL
107
A) Hervir 2 bolsitas de té negro en 100 ml de agua durante 5 minutos a fuego lento (evitar la sequedad, retirando el mechero). B) Sacar las bolsitas de té y dejar enfriar la mezcla. C) En el embudo de separación colocar la mezcla y agregar 10 ml de cloroformo. D) Extraer cuidadosamente, agitando y abriendo la llave, para que salgan los gases formados. E) Colocar el embudo en un tripie con triángulo de porcelana. Dejar reposar. F) Separar la fase orgánica abriendo la llave y recibirla directamente en una cápsula de porcelana. G) Evaporar el cloroformo a baño maría, montando la cápsula sobre el triángulo de porcelana. H) Cuando se haya evaporado el cloroformo se saca la cápsula y se observan los cristales con ayuda de una lupa. OBSERVACIÓN: Cristales en forma de aguja. REACCION DE MUREXIDA: I)
Adicionar a la cápsula 5 gotas de H2O2 al 6% y 2 gotas de HCl concentrado mezclando con agitador.
J)
Volver a prender el mechero, colocar nuevamente la cápsula y evaporar a sequedad completa en el baño maría.
K) Agregar una gota de hidróxido de amonio, un color rojo púrpura indica la presencia de cafeína. L)
Aplicar el mismo método de extracción a 100 ml de coca ± cola desgasificada, pero haciendo dos extractos con 5 ml de cloroformo cada uno. Evaporar el cloroformo y observar cristales. 108
REACCION DE MUREXIDA: a) Agregar 3 gotas de H2O2 al 6% y 1 gota de HCl concentrado (mezclar) b) Evaporar a sequedad c) Agregar una gota de hidróxido de amonio. Observar. M) A las muestras de café darles el mismo tratamiento que a las bolsas de té negro. CUESTIONARIO PREVIO: 1)
Investigar el concepto de extracción, polaridad, cristalización, densidad del agua, cloroformo.
2)
Investigue los derivados de la xantina (estructura).
3)
¿Cual es la acción farmacológica de las xantinas?
4)
¿Cual es el mecanismo de acción de las xantinas?
5)
Investigue el origen, propiedades y contenido de cafeína de: café, té, cacao, kola y guaraná.
PRACTICA NO. 14 DETERMINACIÓN DE ALCOHOLES OBJETIVO: - Adquirir los hábitos y habilidades para determinar los niveles de alcohol (etanol) en alimentos, orina, sangre, contenido estomacal e intestinal; en caso de intoxicaciones por esta sustancia. INTRODUCCIÓN: Las intoxicaciones por alcohol etílico tienen mayor importancia en nuestro país debido a que es accesible su administración en dosis muy tóxicas. El administrar mieles finales provenientes de centrales azucareros
a
la
producción
pecuaria,
trae
como
resultado
intoxicaciones por administrar mieles en proceso de fermentación. El 109
administrar a los animales residuos de cervecerias o destilerias. La dosis tóxica de alcohol puro es 8 ml/kg de peso. El cuadro clínico que se presenta es: excitación muy marcada, colapso, coma, depresión, muerte por parálisis respiratoria. El metanol es altamente tóxico, el organismo lo oxida transformándose en formaldehído y ácido fórmico, produciéndose atrofia del nervio óptico, ceguera permanente y depresión de la musculatura cardíaca y voluntaria que lo lleva a la muerte. Y graves lesiones a nivel celular (hígado y riñones). MATERIAL: Orina, sangre, contenido estomacal que contenga alcohol etílico. Equipo para destilación por arrastre de vapor Acido sulfúrico concentrado Tubos de ensaye de 25 mL Agua destilada CS2 (cantidad suficiente para un gotero). KOH Molibdato de amonio al 10% Pipetas 5 mL Goteros Equipo necesario para Baño María. TECNICA: Fundamento teórico: Los alcoholes se oxidan a aldehídos por la presencia de algún agente oxidante fuerte. El permanganato y dicromato potásico con agentes oxidantes poderosos que reducen el alcohol a aldehído. El permanganato cuando oxida al alcohol, se reduce hasta óxido mangánico (oxido de manganeso IV) que tiene un color pardo rojizo. El dicromato de potasio se reduce hasta ión cromato, el cual presenta una coloración verdosa en las sales. Si a 110
estos oxidantes se les añade ácido sulfúrico concentrado, la oxidación se produce más rápidamente de alcohol a aldehído detectándose el color a fruta madura que lo caracteriza. TECNICA: El etanol se extrae de orina, sangre, contenido estomacal, miel, etc. La determinación se realiza en el destilado acuoso ácido de estas muestras con la técnica siguiente: En una cápsula de porcelana añadir 3 ml de destilado
y se agregan 3 gotas de bisulfuro de
carbono y una pizca de hidróxido de potasio (en polvo) calentar a Baño María hasta que se haya evaporado alrededor del 80 - 90% del bisulfuro. Posteriormente agregar 4 - 5 gotas de solución de molibdato de amonio y se agita, acidificar con 1 - 2 gotas de ácido sulfúrico concentrado, y si la muestra es positiva aparecerá una coloración roja a púrpura. CUESTIONARIO PREVIO: 1. Investigue las sustancias mencionadas, así como las fórmulas de cada una. 2. Investigue otro método para determinación de ETANOL. 3. Cuál es la reacción que se lleva a cabo en el fundamento teórico?
PRACTICA NO. 15 DETERMINACIÓN DE UREA OBJETIVO: Que el alumno aprenda la técnica para determinar la presencia de urea en muestras específicas en caso de intoxicaciones. INTRODUCCIÓN: La urea a pesar de ser introducida en la dieta de los animales como suplemento de necesidad en proteína, se han dado casos de intoxicación por descuido y proporcionar exceso de urea. Este
111
suplemento no debe pasar de 2% en la dieta, la intoxicación se produce por una producción excesiva de amoniaco. Los síntomas son: cólicos graves, estremecimiento, respiración forzada y rápida, muerte. Predomina el edema por el aumento de la permeabilidad en los capilares pulmonares. Si el amoníaco sanguíneo es superior a 2 mg/% se presenta ataxia y a los 5 mg/% se presenta la muerte. Para el tratamiento se aplica un álcali fuerte, ácido acético al 5% (vinagre), ácido tartárico, ácido cítrico. MATERIAL: Harina de soya (ureasa) H2SO4 2N Tungstato de sodio al 10% Reactivo de Nessler listo para usar Tubos de ensaye para centrífuga. Fotocolorímetro con filtro verde o violeta 420 ± 440 contra patrón de reactivo. TÉCNICA: En un tubo de ensaye se coloca una pizca de soya (harina), añadir 1 ml de alimento a analizar (pienso), preparado de la siguiente manera: 2 g de pienso en 100 cc de agua destilada, tomar una parte de esta solución y añadir 30 partes de agua destilada, después tomar de esta última solución 1 ml. Se mezcla y se tapa bien, incubar a 37°C durante 30 minutos. Agregar 1 ml de ácido sulfúrico 2 - 3 N. Agregar 1 ml de tungstato de sodio al 10%, añadir a esto 7 ml de agua destilada. Mezclar fuertemente y centrifugar por 10 minutos. Tomar 2 ml del sobrenadante añadir 7 ml de agua destilada y agregar 1 ml de reactivo de Nessler. Esperar 5 minutos en reposo. Leer en filtro verde 112
o violeta a 420 o 440 contra patrón. Durante el período de incubación se debe preparar lo siguiente: SE PREPARA UNA MATRIZ DE NITRÓGENO: Sulfato de amonio 4.714 g, diluidos en 1000 ml con ácido sulfúrico 0.1 N. Esto contiene 1 mg de nitrógeno por ml. PATRON DE AMONIO PARA UREA: En un matraz aforado de un litro agregar 15 ml de la solución matriz de nitrógeno y 185 ml de la solución N/5 de ácido sulfúrico. Esta mezcla se diluye a 1 litro con agua destilada. La solución es estable y contiene 0.015 mg de nitrógeno por cc. NOTA: N/5 de ácido sulfúrico es igual a 13.5 ml de ácido sulfúrico concentrado en 1 litro de agua destilada. Una vez preparado el patrón de urea se procede a: Tomar 2 ml de patrón. Tomar 7 ml de agua destilada. Tomar 1 ml de reactivo de Nessler Leer en fotocolorímetro con filtro verde o violeta a 420 -440. Después de realizar ambas lecturas, se anotan los valores de la densidad óptica, teniendo que aplicar la siguiente fórmula: DO muestra DO patrón Es igual a la concentración de la muestra que no debe nunca ser mayor de 2 g/% para el caso de la urea. DETERMINACION DE AMONIO (REACTIVO DE NESSLER) REACTIVO Disolver 3.5 g de KI más 1.25 g de HgCl2 en 80 mL de agua (solución 1). Preparar una solución saturada de HgCl2 en 10 mL de agua (solución 2).
113
Adicionar la solución 2en la solución 1 hasta formarse un precipitado naranja (sol. 3). A la solución 3 adicionarle 12 g de NaOH, se agita, decolorándose el sobrenadante y formándose un precipitado (solución 4). Se deja reposar y se prueba con un testigo positivo. En un tubo de ensayo se coloca la muestra adicionándole la solución 4. Si se forma un precipitado color café es prueba positiva para AMONIO. CUESTIONARIO PREVIO: 1. Investigue todo lo referente a todas las sustancias mencionadas en esta práctica, así como las fórmulas de cada una. 2. Investigue otro método para determinación de UREA. 3. Investigue los trastornos que ocasiona la intoxicación por UREA. 4. Comercialmente cual es el preparado farmacológico de UREA 5. ¿Cuál es la absorción, destino y excreción de la urea en el organismo?
PRACTICA NO. 16 DETERMINACIÓN DE SULFAMIDAS OBJETIVOS: 1. Adquirir el conocimiento necesario para la determinación de sulfamidas. 2. Conocer la interpretación del análisis experimental realizado, comparando esto con los niveles posibles tóxicos para los animales domésticos. INTRODUCCIÓN: Las
sulfamidas
son
quimioterapéuticos
derivados
de
las
sulfanilamidas, las cuales actúan de forma bacteriostática contra infecciones en animales domésticos y humanos. Se absorben por el sistema digestivo con rapidez y se difunden por todo el organismo,
114
se excretan por riñones y otras vías de excreción. Si excede límites de saturación se depositan cristales en los riñones (cristaluria). MATERIAL: Riñones de animal infectado con sulfamidas (sulfatiazol, sulfas, etc.) HCl 20% NH4SO4 NH4SO4 en solución saturada Nitrito de sodio al 0.1% Agitador Balanza analítica o granataria Papel filtro Matraz aforado de 250 mL Tubos de Nessler Baño María Termómetro 2 Matraz Erlenmeyer de 50 mL Colorímetro Sulfamidas Sulfamato de amonio al 0.5% Clorhidrato de N-1 naftiletilendiamina Etanol al 95% TÉCNICA Fundamento teórico: Las amidas sulfónicas tienen un grupo amino que puede estar acetilado por reacción con ácido acético o derivados como anhídrido acético, la hidrólisis en medio ácido libera la amina. Este grupo amino es el más importante para la determinación, ya que se basa en la conversión en sal de diazonio mediante la acción del ácido nitroso. Esta reacción es común a las aminas primarias. Al añadir
al
producto
de
la
reacción 115
clorhidrato
de
N-1
naftiletilendiamina se produce una copulación en el catión diazonio, originándose un diazoamino compuesto coloreado o colorante azoico, reacción de ataque de las sales de diazonio sobre el anillo bencénico. Cuando esta fuertemente activado por un grupo amino o hidroxilo, usar el clorhidrato en lugar de la amina favorece la velocidad de reacción por estar solubilizada la amina, pero el medio debe ser ligeramente alcalino para liberar la misma de la sal. Las reacciones deben producirse a baja temperatura para evitar descomposición de la sal y del ácido nitroso. TECNICA: Se toma una cantidad mayor de 10 g de riñón se homogeniza en el mortero, se toma 1 alícuota de 10 g y añadir 20 ml de HCl al 20%, agitando durante 30 minutos, adicionar 16 g de sulfato de amonio y filtrar (debe lavarse el filtro con 10 ml de solución de sulfato de amonio saturado). Este filtrado se pasa a un matraz aforado de 250 ml y se afora con agua destilada (preparado 1). Depositar en un tubo de Nessler 2.5 ml del preparado 1 y se somete en 100°C en baño María durante 1 hora, enfriar y completar a 25 ml de agua destilada (esto se hace para que se produzca la hidrólisis de las sulfamidas acetiladas). En dos Erlenmeyer de 50 ml preparar 2 muestras de 1 y 3 ml respectivamente del preparado 1 y en otro Erlenmeyer de 50 agregar 0.5 ml del hidrolizado y completar cada uno con ácido clorhídrico al 20% a un volumen de 5 ml. Preparar una muestra patrón de referencia con sulfamidas (100 mg de sulfamidas depositadas en 100 ml de agua destilada).
116
Proporción de 1 mg/ml: De esta solución preparada tomar 2 ml y completar o aforar hasta 1000 ml con agua destilada y ya tenemos la muestra patrón de referencia necesitada (2 mcg/1 ml). Observación Colorimétrica: A cada muestra completa a 5 ml con HCl al 20% se le debe añadir 0.5 ml de nitrito de sodio al 0.1%, mezclar y dejar en reposo por 3 minutos. Añadir 0.5 ml de sulfamato de amonio al 0.5%, se mezcla bien y se deja en reposo durante 2 minutos. Agregar 25 ml de la solución reactivo y dejar en reposo por 15 minutos, leer a 550 nm (filtro verde). Primero la lectura se realiza con el patrón preparado después leer el investigado de 1 y 3 ml y la del hidrolizado. De todas las muestras tomar dentro de las de 1 y 3 ml la que más se asemeje y acerque a la DO del patrón obtenida previamente. Leer el resultado de la lectura del hidrolizado. Una vez seleccionado el investigado, se realiza el cálculo del seleccionado y del hidrolizado: Aplicamos la siguiente fórmula: 20 X DO i X es igual a
DO p por Vol.
X= cantidad de mg de sulfamida por 100 g de riñón. DO i = densidad óptica del investigado. DO p= densidad óptica del patrón. Vol. = Mililitros tomados de los investigados y del hidrolizado. Preparación de la solución reactivo: Diluir 100 mg de N-1 naftil etilendiamina clorhidrato en 100 ml de alcohol etílico al 95%. CUESTIONARIO PREVIO: 1. Investigue todo lo referente a todas las sustancias mencionadas en esta práctica, así como las fórmulas de cada una. 2. Investigue otro método para determinación de sulfamidas.
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3. Realice las reacciones que se llevan a cabo en el fundamento teórico.
PRACTICA NO. 17 DETERMINACIÓN DE FOSFURO DE ZINC OBJETIVOS: Que los estudiantes conozcan la metodología para la determinación de fosfuro de zinc. INTRODUCCIÓN: El fosfuro de zinc es un rodenticida. Las intoxicaciones se presentan en todas las especies, la más afectada son las aves, por ingerirla accidentalmente cuando se colocan para roedores. Su toxicidad se debe a la liberación del gas fosfamina en el tracto digestivo siendo su toxicidad en dependencia de su dosis a las diferentes especies. En bovinos, ovinos, cerdos, cabras, perros y gatos es de 20 - 40 mg/kg de peso; en aves de 20 - 30 mg/kg de peso. Los síntomas son inapetencia, dolor abdominal, letargo (sueño profundo y continuado con anestesia y exaltación de reflejos), coma y muerte. MATERIAL: Infectar al animal (roedor) con rodenticida (fosfuro de zinc). HCl ó H2SO4 al 10% Zinc Algodón Matraz Erlenmeyer 250 mL Acetato de plomo Papel filtro Solución saturada de AgNO3. Goteros. Cronómetro. Cápsula de porcelana. 118
CuSO4 al 11% CH3COOH concentrado TECNICA: Fundamento teórico: Los fósforos alcalinos y alcalinotérreos desprenden con agua fosfamina, acompañada de vapores de hidrógeno fosforado que se inflaman espontáneamente. ENSAYO: En un Erlenmeyer pequeño de boca ancha añadir 5 ml de contenido estomacal, agregar 5 ml de HCl (1:1 en agua). El HCl se puede sustituir por ácido sulfúrico al 10%. Agregar gránulos de Zn preparado x, colocar en el cuello del matraz un algodón humedecido con una solución de acetato de plomo, encima de este algodón colocar una capa delgada (1 cm) de algodón seco y se cubre con un pedazo de papel filtro que se fija con cinta. Dejar caer en el centro del papel filtro 1 - 2 gotas de solución saturada de bromuro de mercurio. Esperar 20 minutos y observar la superficie del papel. La formación de un precipitado de color amarillo claro sobre la mancha que dejó el nitrato de plata, se considera positivo. Se puede añadir sobre la mancha amarilla una gota de agua destilada y se tornará oscura. x Preparación de los gránulos de Zn: El Zn debe estar libre de arsénico antes de ser utilizado y se debe hacer lo siguiente: se toman de 5 a 8 gránulos de Zn y se llevan a una cápsula de porcelana donde se le añade un poco de agua destilada y una gotas de solución de sulfato de cobre al 1% Luego se deja en contacto hasta que la superficie se cubra con una capa negra. Se decanta el líquido de la cápsula y se utilizan los gránulos inmediatamente. PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE ACETATO DE PLOMO: 119
Pesar 2.5 g de acetato de plomo, añadir 20 ml de ácido acético concentrado y se diluye posteriormente con 150 ml de agua destilada. CUESTIONARIO PREVIO: 1. Investigue todo lo referente a todas las sustancias mencionadas en esta práctica, así como las fórmulas de cada una. 2. Investigue otro método para determinación de FOSFURO DE ZINC. 3. ¿Que preparados de las sales de este metal pesado (Zinc) se utilizan como medicamentos de uso terapéutico?
PRACTICA NO. 18 DETERMINACION DE DROGAS: CANNABIS 1. EXÁMEN MICROSCÓPICO a) Observación de los pelos característicos de las hojas de la planta Cannabis. Además de los cristales del Carbonato de calcio. INTERPRETACION Se considera positiva por la observación de tricomas o fragmentos de tricomas, acompañados de tricomas largos o "uñas de gato". Se adiciona una gota de ácido clorhídrico al 16% de la preparación de Cannabis observándose una ligera efervescencia producida por los cristales de carbonato de calcio presentes en la base de los pelos. El examen de los pelos nunca debe utilizarse como único criterio para su identificación. 2. REACCIONES COLORIMÉTRICAS: a) DUQUENOIS-LEVINE: REACTIVOS: Prueba de Duquenois-Levine
:
Reactivo 6 A: Disolver 2 g de Vainillina en 100 ml de Etanol al 95% y añadir seguidamente 2.5 ml de acetaldehído. Reactivo 6 B: Ácido clorhídrico concentrado 120
Reactivo 6 C: Cloroformo PROCEDIMIENTO Colocar una pequeña cantidad de muestra en el fondo de un tubo de ensaye, al que se le agrega 2 ml del reactivo 6 A, se agita durante un minuto para extraer los cannabinoides y se adicionan 2 ml de 6 B, volver a agitar durante unos segundos y dejarlo reposar unos minutos, si al cabo de 2-3 minutos aparece un color, añadir 2 ml del reactivo 6 C y agitar suavemente la mezcla. INTERPRETACION El color violeta en la capa inferior (cloroformo) indica la posible presencia de Cannabis. ORTODIANISIDINA (SAL DE AZUL SÓLIDO B O AZUL DE FAST) Reactivo 5 A: Mezclar con cuidado 2.5 g de sal de azul sólido B (Reactivo de Ortodianisidina) con 100 g de sulfato sódico anhidro Reactivo 5 B: Cloroformo Reactivo 5 C: Disolver 0.4 g de hidróxido de sodio en 100 ml de agua (Solución 0.1 N de hidróxido de sodio). PROCEDIMIENTO Colocar unos mg de muestra en el fondo del tubo de ensaye, añadir una pequeña cantidad de reactivo 5 A y agitar vigorosamente unos minutos para extraer la cannabinoide. Añadir 25 gotas de reactivo 5 B y agitar durante un minuto, añadir 25 gotas del reactivo 5 C y agitar el tubo durante dos minutos. La aparición de una capa inferior (cloroformo) de color rojo brillante (morado rojizo) unos segundos después indicara que la reacción es positiva a Cannabis. b) AZUL DE FAST MODIFICADO PROCEDIMIENTO Se preparan 2 papel filtro Watman no. 1 en forma de embudo y se superpone, en el primero se coloca una pequeña cantidad de la muestra y se agregan 2 gotas de éter de petróleo o procurando que 121
esta solución pase al segundo papel y se deje secar. Una vez secos se retira el residuo de la muestra y se adiciona un poco de azul rápido B diluido 1:100 con sulfato de sodio anhidro se agregan 2 o 3 gotas de agua destilada, procurando que esto pase al segundo papel. Si aparece una coloración roja púrpura la reacción es positiva. c) EN
LOS EXAMENES CONFORMATORIOS SE PUEDEN
UTILIZAR
CROMATOGRAFIAS
EN
CAPA
ESPECTROFOTOMETRÍA
DELGADA, INFRARROJA,
ESPECTROFOTOMETRÍA ULTRAVIOLETA. CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA Se utiliza en placas de silica gel GF 254, solventes: cloroformo, revelador: azul rápido B ALCALINO, saturación total. Tiempo de desarrollo: 45 minutos INTERPRETACIÓN Una coloración naranja para cannabidiol, violeta para cannabinol y roja para tetrahidrocannabinol. CUESTIONARIO PREVIO 1. Investigue que es el Cannabis sativa. 2. Cual es la composición de Cannabis? 3. Investigue otra técnica para identificar Cannabis.
PRACTICA NO. 19 ESTRICNINA OBJETIVOS: Que los alumnos aprendan a determinar la estricnina en muestras contaminadas. INTRODUCCIÓN: La estricnina desde un punto de vista farmacológico está clasificada dentro del grupo de los estimulantes medulares. Es un alcaloide que se encuentra en las semillas del Strychnosnux vómica. Es un tóxico 122
muy peligroso. Se absorbe fácilmente a través de las vías respiratorias y digestivas y ocasionalmente en piel intacta. La dosis letal varía de acuerdo a la especie: perro y gatos 0.75 mg/kg de peso; aves 2.0 mg/kg de peso; equinos y bovinos 200 - 400 mg/kg de peso y cerdos de 10 - 50 mg/kg de peso. Las lesiones observadas son: sangre oscura y fluida, cianosis, petequias, etc. MATERIAL: Orina de animal infectado con estricnina. NaOH al 1N CHCl3 Embudo de separación Agua destilada Pipetas Tubos de ensaye Matraz Erlenmeyer Agitadores H 2SO4 al 80% NH3 Cromato de potasio pulverizado. Na2SO4 anhidro Goteros Indicador de pH. Papel filtro MÉTODO: Tomar 25 ml de la muestra (orina o filtrado de contenido gástrico), añadir NaOH al 1N hasta un pH de 9 - 10, llevarlo a un embudo de separación, añadir 50 ml de cloroformo mezclando por agitación. Separación de la fase clorofórmica. Tomar 25 ml de destilado, añadir 123
ácido sulfúrico al 80% hasta alcanzar un pH de 2 - 3; luego unir en el embudo de separación con la fase clorofórmica y agitar ambas fases. Separar la fase acuosa. Alcalinizar con amoníaco. Uniéndose de nuevo a la fase clorofórmica. Filtrar con sulfato de sodio anhidro ya tratado
(con
calcinación
anterior
a
su
uso);
evaporando
posteriormente el cloroformo. Al residuo seco se le agrega una pizca de cromato potásico (pulverizado) y una gota de ácido sulfúrico al 80%. La aparición de un color violeta indica la presencia de estricnina. CUESTIONARIO PREVIO: 1. Investigue todo lo referente a todas las sustancias mencionadas en esta práctica, así como las fórmulas de cada una. 2. Investigue otro método para determinación de ESTRICNINA. 3. ¿Cuál es la sintomatología presentada en caso de intoxicación con estricnina? 4. ¿Cuál es el tratamiento recomendable cuando se presenta intoxicación con estricnina? PRACTICA NO. 20 Determinación de cocaína Presentación Pasta de coca, en forma sólida blanda, con agregados y raras veces finamente dividida y colores mate, pajizo e incluso marrón. Con olor característico y aspecto grumoso y húmedo. Su pureza oscila entre 60-80% Por cada 115 kg de hoja de coca prensada se obtiene 1 kg de pasta de coca. Polvo blanco esponjoso y sin olor, de apariencia similar a la nieve. A veces se presenta en forma de grandes cristales incoloros por lo que se le denomina cocaína de roca. Raramente adulterado. 124
ENSAYO DE OLOR Los ésteres alquilbenzoicos inferiores son conocidos por: Su olor característico. Separando la función benzoica de la cocaína con sosa o potasa en metanol, se obtiene el benzoato de metilo cuyo olor es fácilmente reconocible. ENSAYOS CROMATICOS PRUEBA DEL TIOCIANATO DE COBALTO Reactivo 7 A: Solución acuosa del ácido clorhídrico al 16% Reactivo 7 B: Disolver 2.5 g de tiocianato de cobalto (II) en 100 ml de agua 1. Colocar una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa en un tubo de ensayo. 2. Añadir una gota del reactivo 7 A y agitar durante 10 segundos. 3. Añadir una gota del reactivo 7 B y agitar de nuevo durante 10 segundos. INTERPRETACION El color azul indica la posible presencia de cocaína, incluidos los SUHSDUDGRVLOtFLWRVGHFRFDtQDEDVHFRPRHO³FUDFN´ PRUEBA DEL TIOCIANATO DE COBALTO MODIFICADA (PRUEBA DE SCOTT) Se emplean tres reactivos y se añaden en forma secuencial para observar las distintas coloraciones en cada fase del ensayo: Reactivo 8 A: Disolver 1 g de tiocianato de cobalto (II) en 50 ml de ácido acético al 10% (vol/vol) y añadir seguidamente 50 ml de glicerina de 96% Reactivo 8 B: ácido clorhídrico concentrado Reactivo 8 C: cloroformo El método se desarrolla en tres fases:
125
1. A una pequeña cantidad de muestra en un tubo de ensayo, añadir 5 gotas del reactivo 8 A y agitar durante 10 segundos, si tiene cocaína debe observarse inmediatamente un color azul. De no aparecer el color azul, añadir una cantidad de sustancia sospechosa igual a la utilizada en primer lugar. Si sigue sin aparecer el color azul, la sustancia sospechosa no contiene cocaína. 2. Si la solución se torna azul, añadir una gota del reactivo 8 B y agitar durante unos segundos. En presencia de cocaína, el color azul debe virar a rosa. Si el cambio cromático es incompleto, añadir otra gota del reactivo 8 B. 3. Si la solución en el punto 2 vira totalmente al rosa, añadir 5 gotas del reactivo 8 C y agitar para mezclar el líquido. El color azul debe aparecer de nuevo en la capa inferior (cloroformo) para indicar la presencia de cocaína. CUESTIONARIO PREVIO: 1) Investigue todo lo relativo a la cocaína 2) Investigue otro método para detección de cocaína 3) Que
efectos
primarios
y
secundarios
ocasiona
la
administración de cocaína PRUEBA DEL BENZOATO DE METILO Reactivo 9: Disolver 5 g de hidróxido de potasio en 100 ml de metanol absoluto 1. Colocar una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa en un tubo de ensayo. 2. Añadir 10 gotas del reactivo 9 3. Agitar durante 10 segundos. 4. Comparar el olor con el de una muestra de benzoato de metilo tomada como referencia. INTERPRETACION 126
Si el olor de la muestra es igual al de la muestra de benzoato de metilo tomada como referencia, ello indica la posible presencia de cocaína. PRUEBA DE WAGNER Reactivo 10: Mezclar 1.27 g de yodo y 2 g de yoduro de potasio y disolver la mezcla en 100 ml de agua. 1. Colocar una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa en un tubo de ensayo. 2. Añadir 5 gotas de agua y agitar el tubo durante unos pocos segundos 3. Añadir 2 gotas del reactivo 10 INTERPRETACION Un precipitado marrón indica la posible presencia de clorhidrato de cocaína. La cocaína base no da precipitado con este reactivo. PRUEBA DE TANRED Reactivo 11: Disolver 3.3 g de KI en 10 mL de agua destilada (solución 1); posteriormente, preparar la solución 2 disolviendo 1.3 g de HgCl2 (II) en 50 mL de agua destilada en ebullición y se deja enfriar; al terminar se añade la solución 2 a la solución 1 y se adicionan 20 mL de ácido acético glacial y se afora a 100 mL con agua destilada. Esta reacción se fundamenta en la interpretación entre el yodo y los grupos N+ de los alcaloides o bien de otras sustancias que contengan este grupo. El reactivo utilizado es el reactivo de Tanred. El procedimiento se lleva a cabo de la siguiente manera: 1. Suspender unos mg de la muestra problema en un tubo de ensaye con agua destilada. 2. Agregar unas gotas del reactivo de Tanred, la aparición de un precipitado amarillo lechoso denota la presencia de alcaloides, 127
la sensibilidad de esta prueba es del 100% a los alcaloides en general. Sin embargo, su especificidad es del 10% (pertinente a ensayos para detección preliminar de cocaína). PRUEBA DE SÁNCHEZ (Prueba de coloración para mezclas de cocaína con otras sustancias) Reactivo 12: En un frasco color ámbar se colocan 100 mL
de
solución acuosa de furfural a la que se le agregan de 2 a 3 mL de ácido acético. El fundamento de este análisis es que las aminas primarias cíclicas producen una coloración fucsia característica, cuando se ponen en contacto con el reactivo de Sánchez. 1. El análisis se lleva a cabo colocando sobre una placa de prueba una porción pequeña de la muestra a analizar y después se agregar 3 gotas del
reactivo de Sánchez, la
cocaína no produce ninguna coloración. La sensibilidad de esta prueba es mínima ya que no da coloración a la cocaína. Sin embargo, solo aparece coloración a la procaína y a la benzocaína produciendo una coloración rojo-violeta.
PRUEBA MICROCRISTALOGRÁFICA Cuando una sustancia reacciona
con un reactivo apropiado
(usualmente una sal de un metal pesado), precipita para formar cristales de color y forma característica, las cuales pueden ser observadas bajo el microscopio. El mecanismo de cristalización es muy complejo ya que involucra los fenómenos de difusión, formación de núcleos y crecimiento de cristales. Para que se produzca la cristalización se requiere sobresaturación, esto es, que la solución contenga al menos momentáneamente más soluto que el valor de
128
saturación para las condiciones dadas de temperatura, presión y composición. La sobresaturación puede producirse de tres maneras: - Variando la temperatura de modo que disminuya la solubilidad. - Eliminando el solvente por evaporación. - Cambiando la naturaleza de la solución por adición de una sustancia que por reacción produce una sustancia insoluble en el disolvente. La cocaína presenta una cristalografía diferente con cada reactivo a la cual es expuesta, se lleva a cabo en presencia de cloruro de oro (obteniendo cristales tipo roseta), cloruro de platino, ácido pícrico (obteniendo cristales tipo placa) y permanganato (obteniendo cristales tipo abanico). DETECCIÓN DE COCAÍNA POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (CCF) La cromatografía se realiza permitiendo que la mezcla de moléculas que se desea separar (muestra) interaccione con un medio o matriz de soporte que se denomina fase estacionaria; un segundo medio (fase móvil) que es inmiscible con la fase estacionaria se hace fluir a WUDYpVGHHVWDSDUD³ODYDU´ODVPROpFXODVGHODPXHVWUD'HELGRD que las distintas moléculas que en la muestra presentan diferente coeficiente de reparto, la fase móvil elude a los distintos componentes con eficiencia diferente, de modo que aquellos que prefieren disolverse en la fase móvil serán eludidos más rápido que los que sean preferentemente solubles en la fase estacionaria. En la cromatografía de capa fina, la fase estacionaria, generalmente, consiste de una capa delgada (0.1 a 0.5 mm de espesor para capa fina analítica y 0.5 a 2.0 mm de espesor para capa preparativa) compuesta de un sólido con partículas muy pequeñas con una gran 129
área superficial que se encuentra fija en una base o soporte siendo generalmente, una placa de vidrio, un foil de aluminio o una hoja de plástico, esta fase debe contar con ciertas características y estándares de calidad que estén de acuerdo a las necesidades de separación, por ello, se han desarrollado gran variedad de adsorbentes, sílica gel, tierra silícea, fluorosil, óxidos de aluminio, celulosa, poliamidas, resinas de intercambio iónico y dextrano, pudiendo presentar algunas propiedades específicas. La fase móvil (eluyente) actúa como medio de transporte y solvente para la muestra cromatográfica, debe ser elegido de acuerdo a su polaridad para proveer la mejor separación posible en combinación con la fase estacionaria, la fase móvil puede estar compuesta de un solo solvente o una combinación de diferentes solventes para poder obtener una fase móvil de polaridad intermedia; el poder de elución depende de la naturaleza de la fase estacionaria y de la sustancia a ser identificada, de tal forma que existen diferentes series eleutrópicas. Desarrollo Después de que la muestra ha sido aplicada y la zona de aplicación se ha secado, el cromatograma se forma por capilaridad, la fase estacionaria provoca que la fase móvil junto con la muestra suba a la altura deseada, momento en el cual el desarrollo cromatográfico ha finalizado, precediéndose a sacar la placa y a remover la fase móvil lo antes posible; el cromatograma puede desarrollarse por cualquiera de las siguientes formas: lineales, ascendente lineal y horizontal lineal (unidimensional, bidimensional, multidimensional), circular y anticircular. Revelado Para llevar a cabo la evaluación de un cromatograma es necesario primero detectar las sustancias separadas, pudiéndose realizar 130
dependiendo de las características de absorción de luz, pudiendo ser: sustancias coloridas, las cuales absorben una longitud de onda (O) entre 400 y 800 nm y pueden ser detectadas a simple vista; sustancias incoloras, que absorben luz fuera del espectro visible a una O de 200 a 400 nm y para las cuales se requiere utilizar una lámpara de luz ultravioleta (UV) que emita O de 254 o 366 nm; sustancias fluorescentes las cuales son detectables bajo radiación fluorescente y que debido a su estructura química son solo detectables bajo este tipo de luz; sustancias que no están coloreadas o que no absorben o emiten luz UV, las cuales se derivan por la reacción con un reactivo apropiado y formar así grupos cromóforos que permitan su fácil detección. Valoración de una cromatografía de capa fina (CCF) Tras finalizar una CCF deben evaluarse los resultados. Existe una variedad de métodos adecuados a cada problema y necesidad del analista. Una característica muy importante de todo sistema cromatográfico, es que la separación de cada uno de los elementos de una mezcla es constante, mientras que la temperatura, presión, humedad relativa y espesor de la capa se mantengan constantes. La primera información que proporciona un cromatograma es el comportamiento de elución de las sustancias separadas, el cual se expresa mediante el parámetro Rf (Relate Front); en donde se mide la distancia entre el punto de partida y el centro de la marcha del compuesto separado y se divide entre la distancia del punto de partida y el frente del solvente. En la cromatografía de adsorción, el Rf esta definido por la constante de adsorción por lo que, mientras mayor sea la atracción del adsorbente por el compuesto, mayor será la concentración en el adsorbente y este no será eludido tan fácilmente, el coeficiente de adsorción será mayor y el valor de Rf será menor y, si por el 131
contrario, el grado de atracción electrostática que posee el adsorbente sobre un compuesto es bajo, éste será fácilmente eludido y su concentración en el disolvente será mayor que en el sorbente. Evaluación cualitativa Los cromatogramas de capa fina se realizan para identificar sustancias de una mezcla, pero también para comprobar purezas o separar mezclas, sirven especialmente para control de síntesis o del transcurso de una reacción. El Rf indica la posición en que se encuentra una sustancia en el cromatograma. Con fines de identificación es necesario relacionar los Rf de los componentes analizados con los de las sustancias patrón, si coinciden es muy probable que se trate de las mismas sustancias. Evaluación semicuantitativa Se utiliza cuando hay que determinar si se está claramente por encima o por debajo de los valores limite, o cuando bastan indicaciones aproximadas; en cualquier caso, se cromatografían junto a la muestra varias concentraciones de las sustancias de interés. La evaluación se realiza por comparación visual o por medición del diámetro o de la superficie de las manchas, la exactitud máxima se sitúa alrededor de + 10%. Evaluación cuantitativa indirecta Una posibilidad de evaluación, poco importante actualmente, es la indirecta que consiste en raspar la región de la capa en que se encuentra la sustancia de interés, disolver la sustancia y, a continuación,
analizarla
mediante
un
procedimiento
analítico
adecuado, hay que tener en cuenta que la extracción diluye la muestra y que generalmente se tiene que concentrar de nuevo, lo que ocasiona errores en el análisis. Detección de cocaína por medio de CCF tipo I
132
Para extraer el analito, se puede realizar por el método del cloruro de bario, la muestra mas concentrada se toma con un capilar y se deposita en la fase estacionaria. Se debe tener cuidado al depositar la muestra en la fase estacionaria que en este caso es de sílica gel HF254, la fase móvil utilizada será: metanol e hidróxido de amonio en proporciones 99:1.5, respectivamente, después, se revela con reactivo en spray de Dragendorff, los patrones para este sistema cromatográfico
son:
cocaína,
heroína,
morfina,
lidocaína,
benzocaína, procaína y amidopirina. Detección de cocaína por medio de CCF tipo II La muestra se prepara con la metodología anterior, posteriormente, se deposita en la fase estacionaria en este caso la de sílica gel HF254. Se le agrega a la cámara la fase móvil: metanol, butanol, ácido clorhídrico,
éter
etílico
en
proporciones
60:40:1.5:10,
respectivamente. Después se revela con reactivo Dragendorff. Los patrones para este sistema son: cocaína, heroína, morfina, lidocaína, procaína y tetracaína. Detección de cocaína por medio de CCF tipo III La extracción de la muestra se prepara como ya se mencionó y se dispone sobre la placa de sílica gel HF254, que actúa como fase estacionaria, la fase móvil en este sistema es: cloroformo, acetona, hidróxido de amonio en proporciones 80:50:1.5, respectivamente. Después se revela con reactivo en spray de Wagner, los patrones para este sistema cromatográfico son: cocaína, heroína, morfina, lidocaína y tetracaína. Detección de cocaína por medio de CCF tipo IV Se extrae la muestra y a continuación se deposita en la fase estacionaria de sílica gel HF254. La fase móvil que se utiliza es: cloroformo y metanol en proporciones 90:10, respectivamente.
133
Después se revela con reactivo Dragendorff. Los patrones para éste sistema son: cocaína, heroína, morfina y lidocaína. El límite de detección es de 1 μg, la sensibilidad es del 100%, su especificidad es 47%. Las manchas pueden visualizarse a la luz UV, antes del revelado, este tipo de análisis es poco útil cuando se analiza orina, ya que su sensibilidad es baja, requiriendo como mínimo la presencia de 1000 ng/ml de benzoil ecgonina, metabolitos correspondientes a cocaína. DETECCIÓN DE COCAÍNA POR CROMATOGRAFÍA DE GAS Al igual que otras cromatografías, se considera un método de separación de uno o varios componentes, el equipo puede ser simple o complejo pero el principio es el mismo y análogo a otras formas de cromatografía. La separación se lleva a cabo en una columna que contiene una fase estacionaria, sólida o líquida, ésta se mantiene a una temperatura constante mediante un horno y circulación de un gas (fase móvil) a una velocidad determinada. Cuando una sustancia se inyecta, cada componente migra hacia el detector generándose un equilibrio dinámico entre la fase móvil y la fase estacionaria. Las moléculas que tienen mayor afinidad por la fase estacionaria permanecen mas tiempo en ella y por lo tanto, tardan más tiempo para ser captadas SRUHOGHWHFWRUHVWHWLHPSRVHGHQRPLQD³WLHPSRGHUHWHQFLyQ´\VH define como el tiempo en min desde el momento de la inyección hasta el pico máximo del detector. DETECCIÓN DE COCAÍNA POR SISTEMA CROMATOGRÁFICO PE-8420 Si el analito se encuentra en estado sólido solo basta con una pequeña cantidad, aproximadamente, 10 mg y si por el contrario, si 134
se encuentra en estado líquido, deberá ser en solución no acuosa, por ejemplo, gasolina o un solvente orgánico, que contenga cocaína en solución. Lo primero es proceder a pesar 10 mg de clorhidrato de cocaína y llevarlo a 10 ml aforando con metanol 1:100, si se está trabajando con sangre es necesario mezclar ésta con fluoruro de sodio para inhibir la hidrólisis de la cocaína. Antes de llevar la solución al sistema cromatográfico, se deben poner en consideración la temperatura del inyector la cual debe estar a 220°C, la de la columna a 200°C durante 5 min, 30°C por un min hasta 260°C por 5 min, 30°C hasta 280°C durante 13 min, la temperatura del detector debe ser de 320°C , el tiempo del proceso será de 25 min. La sensibilidad de esta prueba es del 100% y su especificidad es del 80%, un error en el ajuste de la temperatura puede afectar en gran medida los resultados del análisis. DETECCIÓN DE COCAÍNA POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN Esta técnica, conocida mundialmente con la sigla HPLC, es una técnica de separación con detectores altamente sensibles, alta velocidad de separación y alta eficiencia. La separación se realiza básicamente por equilibrios dinámicos entre la fase móvil y la fase estacionaria, tiene la ventaja sobre otras cromatografías, de que los compuestos no volátiles o térmicamente inestables pueden ser analizados sin descomposición. La fase estacionaria se encuentra en una columna de acero inoxidable rellena de material de soporte que consiste en pequeñas partículas (10 μ o menos de diámetro) tiene un centro sólido y una superficie porosa, esta fase también puede ser un liquido, un polímero o un sólido recubierto con una película fina que reduce la
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resistencia a la transferencia de masas, para así establecer más rápido el equilibrio entre la fase móvil y la estacionaria. La fase móvil está constituida por un líquido o una mezcla de solventes con una polaridad determinada, dependiente de la polaridad de la columna y de los componentes de la mezcla que se va a separar. Los otros componentes del equipo son: detector de alta sensibilidad, bomba de alta presión, inyector para introducir la muestra y sistema de integración de datos. DETECCIÓN DE COCAÍNA POR ESPECTROFOTOMETRÍA INFRARROJA (IR) En esta técnica se hace pasar la luz por un prisma que va cambiando de posición y en consecuencia varia su longitud de onda (O), luego pasa por la muestra en donde se producen fenómenos de absorción y emisión de luz y por último, se determinan los cambios en un aparato
de
registro
automático
que
produce
el
espectro
característico. La absorbancia de energía a determinada O, se debe a las vibraciones que presentan los enlaces, que son de dos tipos: de tensión, en las cuales los enlaces se encogen y se alargan y, de deformación, en las que se produce la deformación del plano que forman los núcleos del enlace y, por lo tanto, se presenten dos vibraciones diferentes. Al aplicar energía a los enlaces en la región de luz IR, estos aumentan su amplitud de la vibración, al regresar la molécula de su estado excitado al estado normal emite el exceso de energía en forma de calor y así lo registran los termopares que posee el espectrómetro. Cada tipo de enlace, cada función, cada anillo y, en general, cada estructura, producen un tipo de bandas de absorción determinadas en O mas o menos fijas y así es posible la identificación dentro de una molécula.
136
Por otro lado, la existencia y la ubicación de estas bandas se pueden predecir desde el punto de vista teórico mediante consideraciones de simetría y cálculos a partir de ecuaciones cuánticas de las moléculas. DETECCIÓN DE COCAÍNA POR EL MÉTODO DE DISCO DE HALURO Al realizar esta técnica, se debe pulverizar finamente la muestra en caso de presentarse en forma de roca; posteriormente, se toman aproximadamente 2 mg los cuales se mezclan con 200 mg de bromuro de potasio, se tritura finamente en un mortero y por compresión se obtiene una pastilla delgada, casi transparente. La WpFQLFDVH GHQRPLQD ³PpWRGR GHO GLVFR GH EURPXUR GHSRWDVLR´VLQ embargo, se puede utilizar el cloruro de potasio el cual es superior al bromuro de potasio ya que es menos higroscópico, el haluro empleado debe ser reactivo para IR, secado a 105°C durante una h, mínimo y almacenado en un desecador, si se procede con cuidado la pastilla puede guardarse indefinidamente y la sustancia puede recuperarse de la tableta para futuros ensayos. DETECCIÓN DE COCAÍNA POR EL MÉTODO DEL CLORURO DE BARIO Se toma un mg de muestra y se deposita en un tubo de ensaye al cual se le adiciona 1 o 2 ml de agua destilada, mezclando perfectamente, después se le añade unas gotas de hidróxido de amonio. Mezclando con cuidado, a esta solución se le agregan de 2 a 3 ml de cloroformo. Al presentarse la separación en dos capas, con una pipeta Pasteur se toma la capa del fondo del tubo, esta se deposita en otro tubo, el cual se expondrá a mayor temperatura, para evaporar el cloroformo. Los valores de referencia de la O de los principales picos de la cocaína son: 1710, 1738, 1275, 1110, 712, 1037. La sensibilidad de esta prueba es del 100% y su especificidad es del 100%. Una 137
extracción mal realizada puede provocar ruido en el espectro IR lo que conlleva a la formación de picos ajenos a la cocaína, uno de los más comunes es la presencia de agua, comúnmente llamadas ³SDQ]DVGHDJXD´ DETECCIÓN DE COCAÍNA POR ESPECTROMETRÍA DE MASAS Actualmente, es la técnica analítica instrumental más extraordinaria y completa, entre las características que ofrece están: poder identificar cualitativamente de forma inequívoca casi cualquier tipo de sustancia desde
átomos
o
compuestos
sencillos,
hasta
moléculas
extremadamente complejas y lábiles, no solo es capaz de identificar ODVXVWDQFLDDQDOL]DGDSURSRUFLRQDQGRXQHVSHFWURTXHHVOD³KXHOOD GDFWLODU GH OD PROpFXOD´ VLQR WDPELpQ SXHGH FXDQWLILFDU \ PHGLU OD concentración de la misma. Esta técnica ofrece gran sensibilidad ya que detecta cualquier sustancia en concentración del orden de pg, capaz de separar una sustancia concreta en presencia de una matriz compleja, además de proporcionar información estructural de la molécula analizada: energía de los enlaces, información cinética y fisicoquímica, entre otras. Cuando una solución que contenga el analito a analizar se inyecta en espectrómetro de masa, se ioniza. El sistema de ionización mas usado es el de impacto electrónico que bombardea la molécula con cierta energía capaz de provocar la emisión estimulada de un electrón de la molécula y así analizarla. Además de moléculas ionizadas o iones moleculares (M+), también se forman fragmentos iónicos debido a la descomposición de esos iones con exceso de energía, el tipo y proporción relativa de cada uno de estos fragmentos es característico de la molécula analizada y de las condiciones del proceso de ionización y se denomina patrón de fragmentación. 138
Una vez que las moléculas de la muestra se han ionizado, se aceleran mediante campos eléctricos que comunican una misma energía cinética a todos los iones formados, los iones seguirán una trayectoria de la cual serán desviados mediante campos eléctricos o magnéticos, la desviación será mayor o menor dependiendo de la masa y velocidad del ión. La detección consecutiva de los iones formados a partir de las moléculas de la muestra produce el espectro de masas de una sustancia que es diferente para cada compuesto químico y que constituye una identificación inequívoca de la sustancia analizada. DETECCIÓN DE COCAÍNA POR ANÁLISIS RADIOINMUNOLÓGICOS En personas adictas, los metabolitos benzoil ecgonina se pueden detectar de 10 a 22 d después del uso de cocaína. Implica el muestreo de pelo en el que se puede estimar la duración y la intensidad de uso de la cocaína; asumiendo un crecimiento medio del pelo de 0.5 pulgada en 30 d. Se toma una muestra de cabello desde la raíz, se prepara con algún solvente orgánico y se procesa. Se puede distinguir el uso de la cocaína, de la contaminación del cabello; sin embargo, el análisis no proporciona una medida exacta de la cantidad de cocaína usada, solo da un patrón temporal de su uso.
PRACTICA NO. 21 OPIO (Prueba de Marquis) Reactivo I A: Añadir de 8 a 10 gotas (aprox. 0.25 ml) de una solución de formaldehído al 37% a 10 ml de ácido acético glacial. Reactivo I B: Ácido sulfúrico concentrado 1. Colocar una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa en una placa de gotas. 139
2. Añadir tres gotas de agua. Frotar la muestra contra la placa con una varilla de vidrio o una espátula. 3. Transferir una gota de este líquido a otra cavidad de la placa de gotas. 4. Añadir una gota del reactivo I A. 5. Añadir tres gotas del reactivo I B. INTERPRETACION El color morado a violeta indica la posible presencia de opio. OPIO (Prueba del Sulfato Férrico) Reactivo 2: Disolver 5 g de sulfato férrico en 100 ml de agua. 1. Colocar una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa en una placa de gotas. 2. Añadir tres gotas de agua. Frotar la muestra contra la placa con una varilla de vidrio o una espátula. 3. Transferir una gota de este líquido a otra cavidad de la placa de gotas. 4. Añadir una gota del reactivo 2. INTERPRETACION El color marrón morado indica la posible presencia de opio. CUESTIONARIO PREVIO: 1. Investigue todo lo relativo al opio 2. Investigue otro método para detección de opio 3. ¿Que
efectos
primarios
y
secundarios
ocasiona
la
administración de opio?
PRACTICA NO. 22 MORFINA, CODEINA, HEROINA (Prueba de Marquis) Reactivo I A: Añadir de 8 a 10 gotas (aprox. 0.25 ml) de una solución de formaldehído al 37% a 10 ml de ácido acético glacial. 140
Reactivo I B: Ácido sulfúrico concentrado 1. Colocar una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa en una placa de gotas. 2. Añadir una gota del reactivo I A. 3. Añadir tres gotas del reactivo I B. INTERPRETACION El color violeta a morado rojizo indica la posible presencia de morfina, codeína o heroína. MORFINA, CODEINA, HEROINA (Prueba de Mecke) Reactivo 3: Disolver 1 g de ácido selenioso en 100 ml de ácido sulfúrico concentrado. 1. Colocar una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa en una placa de gotas. 2. Añadir una gota del reactivo 3. INTERPRETACION El color azul a verde indica la posible presencia de morfina, codeína o heroína. MORFINA, CODEINA, HEROINA (Prueba del ácido nítrico) Reactivo 4: ácido nítrico concentrado. 1. Colocar una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa en una placa de gotas. 2. Añadir una gota del reactivo 4. INTERPRETACION El color amarillo que vira lentamente a verde claro indica la posible presencia de heroína. El color naranja que vira rápidamente a rojo y luego lentamente a amarillo indica la posible presencia de morfina. El color naranja que vira lentamente a amarillo claro indica la posible presencia de codeína. MORFINA, CODEINA, HEROINA (Prueba del Sulfato férrico) 141
Reactivo I A: Añadir de 8 a 10 gotas (aprox. 0.25 ml) de una solución de formaldehído al 37% a 10 ml de ácido acético glacial. Reactivo I B: Ácido sulfúrico concentrado 1. Colocar una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa en una placa de gotas. 2. Añadir una gota del reactivo 2. INTERPRETACION El color rojo indica la posible presencia de morfina. CUESTIONARIO PREVIO: 1. Investigue todo lo relativo a la morfina, codeína y heroína 2. Investigue otro método para detección de morfina, codeína y heroína 3. Que efectos primarios y secundarios ocasiona la administración de morfina, codeína y heroína
PRACTICA NO. 23 ANFETAMINA/METANFETAMINA Y OTROS DERIVADOS ANFETAMINICOS (PRUEBA DE MARQUIS) 1. Colocar una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa en una placa de gotas. 2. Añadir una gota del reactivo I A 3. Añadir dos gotas del reactivo I B INTERPRETACION El color naranja que vira a marrón indica la posible presencia de anfetamina o metanfetamina. El color amarillo a marrón amarillento indica la posible presencia de 2, 5-dimetoxi-4-etilanfetamina (DOET) o de STP/DOM. El color verde amarillento a verde indica la posible presencia de 2, 5 dimetoxianfetamina (DMA) o brolanfetamina (DOB).
142
El color negro indica la posible presencia de tenanfetamina (MDA), de 3, 4-metilenedioxianfetamina (MDMA), de N-etilenanfetamina o de N-hidroxitenanfetamina (N-OH MDA). ANFETAMINA/METANFETAMINA
(PRUEBA
DEL
ACIDO
SULFURICO) Reactivo 11: Ácido sulfúrico concentrado 1. Colocar una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa en una placa de gotas 2. Añadir dos gotas del reactivo 11. INTERPRETACION No debe aparecer ningún color en presencia de anfetamina y metanfetamina. METANFETAMINA (PRUEBA DE SIMON) Reactivo 12 A: Disolver 0.9 g de nitroprusiato de sodio en 90 ml de agua y añadir seguidamente 10 ml de acetaldehído Reactivo 12 B: Disolver 2 g de carbonato de sodio en 100 ml de agua. 1. Colocar una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa en una placa de gotas 2. Añadir una gota del reactivo 12 A. 3. Añadir dos gotas del reactivo 12 B. INTERPRETACION El color azul indica la posible presencia de metanfetamina ANFETAMINA (PRUEBA DE SIMON con ACETONA) Reactivo 13 A: Disolver 0.9 g de nitroprusiato de sodio en 100 ml de acetona acuosa al 5% v/v. Reactivo 13 B: Disolver 2 g de carbonato de sodio en 100 ml de agua. 1. Colocar una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa en una placa de gotas 143
2. Añadir una gota del reactivo 13 A. 3. Añadir una gota del reactivo 13 B. INTERPRETACION El color morado indica la posible presencia de anfetamina DERIVADOS ANFETAMINICOS (PRUEBA DEL ACIDO GALICO) Reactivo 14: Disolver 0.5 g de ácido gálico en 100 ml de ácido sulfúrico concentrado. 1. Colocar una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa en una placa de gotas 2. Añadir una gota del reactivo 14 INTERPRETACION El color verde brillante a oscuro indica la posible presencia de tenanfetamina (MDA), 3, 4- metilenedioximetanfetamina (MDMA), Netilenanfetamina (MDE), N-hidroxitenanfetamina (N-OH MDA) o de 5metoxi-3, 4-metilenedioxianfetamina (MDMA). CUESTIONARIO PREVIO: 1. Investigue todo lo relativo a la anfetamina/metanfetamina y otros derivados anfetaminicos 2. Investigue
otro
método
para
detección
de
anfetamina/metanfetamina y otros derivados anfetaminicos 3. Que efectos primarios y secundarios ocasiona la administración de anfetamina/metanfetamina y otros derivados anfetaminicos
PRACTICA NO. 24 PEMOLINA (PRUEBA DE ZIMMERMANN) Reactivo 15 A: Disolver 1 g de 1, 3-dinitrobenceno en 100 ml de metanol Reactivo 15 B: Disolver 15 g de hidróxido de potasio en 100 ml de agua.
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1. Colocar una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa en una placa de gotas 2. Añadir una gota del reactivo 15 A. 4. Añadir una gota del reactivo 15 B. INTERPRETACION El color rojo intenso indica la posible presencia de pemolina PEMOLINA (PRUEBA DE DINITROBENCENO) a) Prueba del 1, 2 dinitrobenceno: Reactivo 16 A: Disolver 1 g de 1, 2-dinitrobenceno en 100 ml de polietilenglicol Reactivo 16 B: Disolver 10 g de hidróxido de litio en 100 ml de agua. Reactivo 16 C: Disolver 1 g de 1, 3-dinitrobenceno en 100 ml de polietilenglicol Reactivo 16 D: Disolver 1 g de 1, 4-dinitrobenceno en 100 ml de polietilenglicol 1. Colocar dos gotas del reactivo 16 A en una placa de gotas 2. Añadir una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa. 3. Añadir dos gotas del reactivo 16 B. INTERPRETACION El color morado moderado indica la posible presencia de pemolina b) Prueba del 1, 3 dinitrobenceno: 1. Colocar dos gotas del reactivo 16 C en una placa de gotas 2. Añadir una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa. 3. Añadir dos gotas del reactivo 16 B. INTERPRETACION El color rojo intenso indica la posible presencia de pemolina c) Prueba del 1, 4 dinitrobenceno: 1. Colocar dos gotas del reactivo 16 D en una placa de gotas 2. Añadir una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa. 3. Añadir dos gotas del reactivo 16 B. 145
INTERPRETACION El color amarillo intenso indica la posible presencia de remolina CUESTIONARIO PREVIO: 1. Investigue todo lo relativo a la pemolina 2. Investigue otro método para detección de pemolina 3. Que efectos primarios y secundarios ocasiona el uso de pemolina
PRACTICA NO. 25 BARBITURICOS (PRUEBA DE Dille-Koppanyi) Reactivo 17 A: Disolver 0.1 g de acetato de cobalto (II) en 100 ml de metanol absoluto y añadir en seguida 0.2 ml de ácido acético glacial Reactivo 17 B: Mezclar 5 ml de isopropilamina con 95 ml de metanol absoluto 1. Colocar una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa en una placa de gotas 2. Añadir tres gotas del reactivo 17 A. 3. Añadir tres gotas del reactivo 17 B. INTERPRETACION El color morado rojizo indica la posible presencia de barbitúricos CUESTIONARIO PREVIO: 1. Investigue todo lo relativo a barbitúricos 2. Investigue otro método para detección de barbitúricos 3. Que efectos primarios y secundarios ocasiona el uso de barbitúricos
146
PRACTICA NO. 26 DIAZEPAM Y OTROS DERIVADOS DE LA BENZODIACEPINA (Prueba de Zimmermann) 1. Colocar una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa en una placa de gotas 2. Añadir una gota del reactivo 15 A. 3. Añadir una gota del reactivo 15 B. INTERPRETACION El color morado rojizo o rosado indica la posible presencia de diazepam o algún derivado de la benzodiacepina afín. DIAZEPAM Y OTROS DERIVADOS DE LA BENZODIACEPINA (Prueba del Acido Clorhídrico) Reactivo 18: Acido clorhídrico 2 N (aprox. Al 7.3 %) 1. Colocar una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa en una placa de gotas 2. Añadir una gota del reactivo 18. INTERPRETACION El color amarillo indica la posible presencia de diazepam o algún derivado de la benzodiacepina afín. DIAZEPAM Y OTROS DERIVADOS DE LA BENZODIACEPINA (Prueba de Vitali-Morin) Reactivo 19 A: Ácido Nítrico concentrado Reactivo 19 B: Acetona Reactivo 19 C: Disolver 0.56 g de hidróxido de potasio en 100 ml de etanol (solución 0.1 N de hidróxido potásico etanólico) 1. Colocar una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa en una cápsula de porcelana 2. Añadir 0.5 ml del reactivo 19 A y calentar al baño María hasta que se seque 3. Añadir 5 ml del reactivo 19 B. 147
4. Añadir 1 ml del reactivo 19 C. INTERPRETACION El color naranja amarillo indica la posible presencia de diazepam o algún derivado de la benzodiacepina afín. CUESTIONARIO PREVIO: 1. Investigue todo lo relativo al diazepam y otros derivados de la benzodiacepina 2. Investigue otro método para detección de diazepam y otros derivados de la benzodiacepina 3. Que efectos primarios y secundarios ocasiona la administración de al diazepam y otros derivados de la benzodiacepina
PRACTICA NO. 27 METACUALONA (Prueba del Tiocianato de cobalto) 1. Colocar una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa en un tubo de ensayo. 2. Añadir una gota del reactivo 7 A y agitar durante 10 segundos. 3. Añadir una gota del reactivo 7 B y agitar de nuevo durante 10 segundos. INTERPRETACION El color azul indica la posible presencia de metacualona. CUESTIONARIO PREVIO: 1. Investigue todo lo relativo a la metacualona 2. Investigue otro método para detección de metacualona 3. Que efectos primarios y secundarios ocasiona el uso de metacualona
148
PRACTICA NO. 28 LISERGIDA (LSD) Prueba de Ehrlich Reactivo 20: Disolver 1 g de 4-dimetilamina benzaldehído en 100 ml de metanol y añadir con cuidado 10 ml de ácido orto-fosfórico concentrado. 1. Colocar una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa en una placa de gotas 2. Añadir dos gotas del reactivo 20. INTERPRETACION El color violeta que aparece en pocos minutos indica la posible presencia de LSD. CUESTIONARIO PREVIO: 1. Investigue todo lo relativo a LSD 2. Investigue otro método para detección de LSD 3. Que efectos primarios y secundarios ocasiona el uso de LSD
PRACTICA NO. 29 MESCALINA (Prueba de Marquis) 1. Colocar una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa en una placa de gotas. 2. Añadir una gota del reactivo I A. 3. Añadir dos gotas del reactivo I B. INTERPRETACION El color naranja indica la posible presencia de mescalina. MESCALINA (Prueba de Liebermann) Reactivo 21: Disolver 1 g de nitrito sódico en 10 ml de ácido sulfúrico concentrado. 1. Colocar una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa en una placa de gotas. 2. Añadir una gota del reactivo 21. INTERPRETACION 149
El color negro indica la posible presencia de mescalina. CUESTIONARIO PREVIO: 1. Investigue todo lo relativo a mescalina. 2. Investigue otro método para detección de mescalina. 3. Que efectos primarios y secundarios ocasiona el uso de mescalina.
PRACTICA NO. 30 PSILOCIBINA (Prueba de Marquis) 1. Colocar una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa en una placa de gotas. 2. Añadir una gota del reactivo I A. 3. Añadir dos gotas del reactivo I B. INTERPRETACION El color naranja indica la posible presencia de psilocibina PSILOCIBINA (Prueba de Ehrlich) 1. Colocar una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa en una placa de gotas. 2. Añadir dos gotas del reactivo 20. INTERPRETACION El color violeta indica la posible presencia de psilocibina CUESTIONARIO PREVIO: 1. Investigue todo lo relativo a psilocibina 2. Investigue otro método para detección de psilocibina 3. Que efectos primarios y secundarios ocasiona el uso de psilocibina
150
PRACTICA NO. 31 FENCICLIDINA (PCP)-Prueba del Tiocianato de cobalto 1. Colocar una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa en un tubo de ensayo. 2. Añadir una gota del reactivo 7 A y agitar durante 10 segundos. 3. Añadir una gota del reactivo 7 B y agitar de nuevo durante 10 segundos. INTERPRETACION El color azul indica la posible presencia de fenciclidina. FENCICLIDINA (PCP)-Prueba de Mecke 1. Colocar una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa en una placa de gotas. 2. Añadir una gota del reactivo 3 INTERPRETACION El color rosado indica la posible presencia de fenciclidina. CUESTIONARIO PREVIO: 1. Investigue todo lo relativo a fenciclidina. 2. Investigue otro método para detección de fenciclidina. 3. Que efectos primarios y secundarios ocasiona el uso de fenciclidina.
PRACTICA NO. 32 FENTANIL/alfa-METILFENTANIL (Prueba de Marquis) 1. Colocar una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa en una placa de gotas. 2. Añadir una gota del reactivo I A. 3. Añadir tres gotas del reactivo I B. INTERPRETACION
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El color naranja indica la posible presencia de fentanil/alfametilfentanil CUESTIONARIO PREVIO: 1. Investigue todo lo relativo a fentanil/alfa-metilfentanil 2. Investigue otro método para detección de fentanil/alfametilfentanil 3. Que efectos primarios y secundarios ocasiona el uso de fentanil/alfa-metilfentanil.
PRACTICA NO. 33 METADONA (Prueba de Marquis) 1. Colocar una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa en una placa de gotas. 2. Añadir una gota del reactivo I A. 3. Añadir tres gotas del reactivo I B. INTERPRETACION El color rosa que va apareciendo lentamente y vira a violeta indica la posible presencia de metadona.
METADONA (Prueba del ácido nítrico y el ácido sulfúrico) Reactivo 22: Añadir 10 gotas (aprox. 0.3 ml) del ácido nítrico concentrado a 10 ml de ácido sulfúrico. 1. Colocar una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa en una placa de gotas. 2. Añadir dos gotas del reactivo 22. INTERPRETACION El color naranja que va apareciendo lentamente y vira a rojo indica la posible presencia de metadona. CUESTIONARIO PREVIO: 152
1. Investigue todo lo relativo a metadona. 2. Investigue otro método para detección de metadona. 3. Que efectos primarios y secundarios ocasiona el uso de metadona.
PRACTICA NO. 34 PETIDINA (Prueba de Marquis) 1. Colocar una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa en una placa de gotas. 2. Añadir una gota del reactivo I A. 3. Añadir tres gotas del reactivo I B. INTERPRETACION El color naranja indica la posible presencia de petidina. PETIDINA (Prueba de Marquis) 1. Colocar una pequeña cantidad de la sustancia sospechosa en una placa de gotas. 2. Añadir una gota del reactivo 21. INTERPRETACION El color naranja rojo indica la posible presencia de petidina CUESTIONARIO PREVIO: 1. Investigue todo lo relativo a petidina. 2. Investigue otro método para detección de petidina. 3. Que efectos primarios y secundarios ocasiona el uso de petidina.
PRACTICA NO. 35 DETERMINACION DE AZUFRE ELEMENTAL Colocar la muestra en un tubo de ensayo y agregar unos mL de NaOH 1N (0.5 g en 25 mL de agua). Calentar para disolver (donde se realizará la formación de sulfuros). 153
Agregar H2SO4 1N (1.4 en 25 mL de agua), gota a gota. Para un resultado positivo se detecta un olor desagradable característico del H2S (huevo podrido). DETERMINACION DE SULFUROS En un tubo colocar la muestra en solución acuosa. Agregar Pb2+ (PbCl2), solución concentrada. Para un resultado positivo se formará un precipitado negro (PbS). DETERMINACION DE SULFITOS (SO3) Se coloca la muestra en placa o cápsula de porcelana. Se agregan dos gotas de la solución verde de malaquita. Para resultados positivos se decolora el pigmento (no ocurre con sulfatos, ni tiosulfatos). En lugar del verde de malaquita, se puede utilizar yodo el cual es decolorado por los sulfitos así como los tiosulfatos. DETERMINACION DE SULFATOS (SO4) a) Colocar en un tubo de ensaye la muestra en solución acuosa. Agregar BaCl2 en solución. Para resultados positivos se formará un precipitado blanco insoluble en HCl y HNO3. b) En un tubo de ensayo colocar la mezcla en solución. Agregar solución de acetato de plomo (gotas). Para un resultado positivo se formará un precipitado blanco, soluble en acetato de amonio. DETERMINACION DE AZUCAR (BOMBAS MOLOTOV) A la muestra agregar alfa-naftilamina más H2SO4. Para obtener resultados positivos se debe de presentar una coloración violeta. DETERMINACION DE CARBONATOS a) Colocar la muestra en una placa. Agregar HCl. Para obtener resultados positivos se observará efervescencia.
154
b) A la muestra en solución agregar solución de fenolftaleína (1 a 100 en alcohol). Para resultados positivos se observará una coloración roja. DETERMINACION DE MERCURIO (SALES MERCURICAS) a) En un tubo de ensayo colocar la muestra en solución acuosa. Adicionar solución de NaOH 1 N. Para obtener resultados positivos se formará un precipitado amarillo. b) Colocar la muestra en solución en un tubo de ensayo. Con la adición de una solución de KI, se formará un precipitado escarlata. DETERMINACION DE ALUMINIO a) PRUEBA CON UNA BASE FUERTE: Al combinarse con NaOH produce liberación de H2, que se demuestra con una pequeña explosión en la boca del tubo donde se realizará la reacción, al destaparse súbitamente. b) Prueba de TENARD: Impregnar un trozo de papel filtro con la solución problema más una solución de Co+2 (Nitrato de cobalto protoxido) diluido. Calcinarlo a la flama. Para que la prueba sea positiva se debe observar un tenue color azul que indica la presencia de Al+3; rojo para Mn+2; verde para Zn+2 c) Prueba del ALUMINON (Para pequeñas cantidades). Preparar una solución acuosa de aluminon (color más o menos anaranjado). Preparar una solución de HCl 1N y NH4OH concentrado. Colocar la muestra en un tubo de ensayo con aproximadamente 10 ml de agua (si es aluminio metálico disolver con NaOH 6N para formar el Al(OH)3 y agregar HCl 1N). Agregar una gota de ácido 1 N Agregar de 8 a 10 gotas de NH4OH conc. Agregar de 3 a 5 gotas de HCl 1N 155
Agregar de 3 a 5 gotas de solución de aluminon Para obtener resultados positivos se formará un precipitado color rojo.
PRACTICA
NO.
36
DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS
ORGANOFOSFORADOS POR EL MÉTODO DE CROMATOGRAFÍA EN PLACA (dos sesiones)
OBJETIVOS: Que los alumnos adquieran los conocimientos, hábitos y habilidades en la determinación de compuestos organofosforados por el método de cromatografía en placa. INTRODUCCIÓN: La cromatografía es una forma fisicoquímica de separar sustancias componentes de una mezcla. Consiste en distribuir las sustancias en dos fases (estacionaria - absorbente sólido o película de liquido que constituye una fase portadora
y móvil - disolvente en cuyas
moléculas se encuentra disuelta la sustancia), esta dependerá de la naturaleza de cada componente de la mezcla, se obtendrá una separación de las mismas. El método fue creado por el ruso Tswet para separar colorantes de las hojas (clorofilas y xantofilas) y de ahí el nombre de cromatografía. MATERIAL: Hígado contaminado con garrapaticida (organofosforados). Equipo para montaje de cromatografía tanque con sus placas y tapa. Sílica gel. Agua destilada. Micropipetas (0.5, 3, 5, 10, 100 PL) o capilares. 156
Atomizadores. Sustancia reveladora (acetato de alfa-naftilo). Disolvente (hexano, ciclohexano o acetona). Centrifuga. Incubadora. Lámpara UV. Pipetas 5, 10 mL. Alcohol etílico puro. Estufa (100 ± 170 °C). Lápiz de punta fina. Regla o escuadra graduada. Yodo metálico en cápsula de porcelana o cristal. Colorante (azul) Mortero MÉTODO: Fundamento teórico: El yodo metálico hace que se oxide el compuesto organofosforado sustituyendo en el radical fosfato su enlace con el azufre por el oxígeno. Esto hace que se permita la inactivación de la enzima y es por ello que las manchas no se colorean. PROCEDIMIENTO: Se toma la placa de vidrio, lavar, secar, eliminando trazas de grasa con acetona o alcohol. Una vez elegido el adsorbente (silica - gel realizándose una suspensión 30 g silicagel en 60 ml de agua destilada), se extiende sobre la placa de vidrio con la mano, dejándose reposar hasta que seque (puede usarse la proporción 35:50 de este adsorbente). Se ponen las placas en una estufa para 157
activarlas a una temperatura de 100 - 170 °C por período de 30 minutos a una hora. Además con esto se elimina la humedad. Se pueden conservar las placas en una campana, si son extraídas y no son utilizadas. Después de marcar la placa (sin romperla), debiendo existir 10 - 15 cm desde el punto de partida hasta la línea del frente. Estos puntos se marcan a partir de 1.5 cm del borde de la línea de arrancada y un cm entre punto y punto y de los extremos. Después se aplica la muestra (1 - 10 μg) aproximadamente es una gota en la micropipeta, al dejar caer cada gota debe mantenerse el espacio requerido entre muestra y muestra, para no alterar los resultados. Se sopla inmediatamente después del punteo para que seque rápido el área de tirada de la muestra. Luego se satura la cámara cromatográfica con los vapores de disolvente y pegarlo en las paredes de la cámara (parte interna) dejando siempre un espacio para observar el cromatograma. El tanque debe estar bien tapado, teniendo además un nivel de 0.5 a 1.5 cm en el fondo de disolvente para que pueda producirse la corrida. Emplearemos hexano o ciclohexano con acetona en proporción 80:30 (fase móvil). Una vez preparada la cámara se colocan las placas con las muestras de forma vertical, tapándose muy bien. Esperamos que la corrida alcance la línea del frente. Posteriormente extraemos la placa y se deja secar algunos minutos hasta que evapore en el medio ambiente. Después introducirnos la placa cromatográfica en la cámara (esta cámara debe estar preparada 24 horas antes de colocar la placa con la muestra), con cierre hermético para evitar la salida de los vapores. Debe estar en la cámara que contiene el yodo metálico (en cápsula de porcelana o cristal), durante 20 MINUTOS. Posteriormente se retira y se dejan al medio ambiente para la salida de los vapores del yodo metálico de la placa.
158
El yodo metálico hace que se oxide el compuesto organofosforado sustituyendo en el radical fosfato su enlace con el azufre por el oxígeno. Esto hace que se permita la inactivación de la enzima y es por ello que las manchas no se colorean, determinando de esta manera la presencia de compuestos organofosforados. x Si se atomiza con la enzima obtenida de bovino o conejo se observaran las manchas de color violeta.
A continuación
atomizamos con la enzima obtenida del hígado de bovino o conejo batido o triturado y homogeneizado con agua destilada. Preparación de la enzima: Tomamos 1 g de hígado en 9 ml de agua destilada y se pasa a un mortero, se centrifuga y se toma el sobrenadante, diluir en 3 ó 4 partes de agua destilada (de esta forma puede conservarse a temperatura de - 20°C). Una vez atomizada la muestra se deja secar llevándose a incubadora a 37°C DURANTE UNA HORA. Pasando este tiempo, la extraemos y atomizamos con la sustancia reveladora que está en la proporción de 125 mg de acetato de alfanaftilo en 100 ml de alcohol etílico puro. Tomamos 4 ml de esta solución y la mezclamos con 16 ml de agua destilada, a la cual previamente se le añadió 10 mg de azul sólido (en forma reciente). Se atomiza la muestra tornándose la placa con la muestra de color violeta. Después del revelado, se fijan inmediatamente los límites de las manchas incoloras y se mide la distancia entre la línea de arrancada y el punto central de la mancha incolora y se anota y también la distancia entre la línea de arrancada y la línea del frente y se aplica la fórmula matemática para obtener los resultados del Rf de la muestra.
159
Si se tiene una muestra patrón se procesa todo de la misma manera que para la muestra problema y se analizan los resultados comparando las dos muestras. CUESTIONARIO PREVIO: 1. Investiga los fundamentos, técnicas, ventajas y desventajas de la cromatografía en columna, en papel, de gases y en placa. 2. Investigue todo lo referente a todas las sustancias mencionadas en esta práctica, así como las fórmulas de cada una. 3. Investigue otro método para determinación de COMPUESTOS ORGANOFOSFORADOS. 4. En
que
productos
industriales
encontramos
compuestos
organofosforados? 5. Menciona algunos derivados de organofosforados. 6. Investiga
el
mecanismo
de
acción
de
los
compuestos
organofosforados.
PRACTICA NO. 37 PRUEBA DE RODIZONATO DE SODIO (EXAMEN RELACIONADO CON DISPAROS DE ARMA DE FUEGO)
La prueba de la Parafina quedo descartada en forma definitiva para XWLOL]DUVH OD GHO ³5RGL]RQDWR GH 6RGLR´ SDUD DVt GHWHUPLQDU VL XQD persona ha realizado disparos con arma de fuego por ser esta ultima amas efectiva para detectar residuos de bario y plomo proveniente de las armas metálicas del fulminante y de bala de un proyectil de arma de fuego. Cuando se dispara un arma de fuego, la mano de quien lo hace puede resultar maculada por gases
y derivados nitrados
provenientes de la deflagelación de la pólvora, plomo y bario. Con base en este hecho, la prueba del Rodizonato de Sodio tiene como 160
finalidad identificar el bario y el plomo que pudieron haber resultado en la mano de quien dispara. Tal identificación es posible en virtud de la coloración que resulta de la reacción química en todas las sustancias de referencia y los elementos señalados, que son partes integrales de los cartuchos a saber: plomo del proyectil y bario del fulminante. Técnica de la prueba y material utilizado 1. Goteros 2. Laminillas portaobjetos 3. Acido Clorhídrico al 1% 4. Acido Rodizónico al 0.2% (sal de Rodizonato de Sodio) 5. Solución buffer a un pH de 2.79 6. Microscopio 7. Tela blanca de algodón y libre de apresto 8. Preparación de soluciones HCl al 1%: -
99 cc de agua destilada
-
1 cc de ácido clorhídrico
Rodizonato de Sodio: -
20 mg de ácido rodizonico
-
10 cc de agua destilada
Solución BUFFER 2.79 -
1.9 g de Bitartrato de sodio
-
1.5 g de ácido tartárico
-
100 cc de agua destilada
METODO a)
Recortar la tela en cuadros de 2 por 2 cm y humedecerla con dos gotas de solución de HCl al 1% 161
b)
Limpiar con fragmentos de tela diferentes las regiones palmar y dorsal, de ambas manos, fundamentalmente las zonas anatómicas mas frecuentes de maculación.
c)
Colocar los fragmentos de tela en laminillas porta-objetos
d)
poner dos gotas de Buffer en ala parte de cada fragmento de tela que se utilizo para hacer la limpieza.
e)
Poner dos gotas de Rodizonato de Sodio al 0.2% en cada una de las partes de tela tratadas químicamente con anterioridad.
f)
Observar micro y macroscópicamente los fragmentos de tela
Se deberá recoger lógicamente 4 fragmentos de tela, o sea los correspondientes de las regiones palmar y dorsal de ambas manos. Interpretación de Resultados: Coloración Rosa Marrón Coloración Rojo Escarlata
Bario Plomo
Prueba
positiva Presencia ambos colores
Plomo y Bario
La coloración de la solución de Rodizonato de Sodio desaparece al cabo de unos minutos. Esta prueba puede dar falsas positivas en personas que mantengan contacto con sustancias que contengan plomo como: Gasolineras Plomeros Torneros Mecánicos que utilizan soldadura Hojalateros Las reacciones químicas y el fundamento de la prueba es el siguiente:
162
2 Pb + HCl PbCl2 + NaRd Ba + HCl BaCl2 + NaRd
PbCl2 PbRd
Color rojo escarlata
BaCl2 BaRd
Color Rosa marrón
En una serie de pruebas se obtuvieron resultados positivos en todos los casos en que se habían utilizado revólveres y en unos cuantos casos cuando se utilizaron pistolas semiautomáticas dependiendo en este último caso de los resultados positivos de las fugas en cada arma en particular.
PRACTICA NO. 38 DETERMINACIÓN DE FLUOR OBJETIVOS: El alumno creará los hábitos y habilidades necesarios en la detección de Flúor y puedan realizar una correcta profilaxis y terapia en las intoxicaciones por esta halógeno una vez determinado el mismo. INTRODUCCIÓN: El flúor se haya presente en todos los tejidos animales, encontrándose en las concentraciones más altas en los huesos y dientes. La ingestión prolongada de pequeñas cantidades producen signos característicos de envenenamiento crónico, se puede presentar en cantidades anormales en suelo, pastos o en agua, sobre todo en aquellos que vivan cerca de industrias que emitan gases o polvos que contengas fluoruros y es probable se de una fluorosis crónica endémica.
163
Otra forma de intoxicación es por la ingestión de grandes cantidades de compuestos de flúor solubles o ingestión accidental de fluoracetato. MATERIAL: Agua contaminada con Fluoruro de sodio. Reactivo de Laca alizarin-zirconio o lacazirconalizarina (Preparación: diluir 150 mg de oxicloruro de zirconio en 25 mL de solución de HCl al 5% (solución A). Se diluyen 60 mg de alizarina roja en 25 mL de solución de HCl al 5% (solución B). Estas soluciones se guardan separadamente
y al momento se
usarse se toma una parte de cada solución y 2 partes de HCl al 5% (Ej. 25 mL de sol. A; 25 mL de sol. B y 50 mL de HCl al 5%). Esta mezcla debe tomar una coloración Violeta-rojo, la cual no es resistente (estable) por lo que es necesaria su preparación inmediatamente antes de su uso. Oxicloruro de zirconio HCl al 5% Alizarina sulfonato ácido de sodio (alizarina roja). Varillas de cristal (agitadores) Papel filtro Carbón activado Tubos de ensaye Pipetas (2, 5 y 10 mL) Probeta 100 mL Vaso de precipitados 250 mL. Matraz Erlenmeyer 250 mL Goteros Mortero Ca (OH)2 164
NH4NO3 Agua destilada Crisol de platino o porcelana H2SO4 Parafina Cristal pequeño (10 x 10 cm, aprox.) Alcohol Eter TÉCNICAS: Preparación de la muestra: Se toman 10 g de la muestra, se cubren con 20 ml de solución de HCl al 5% se mezcla con agitador durante 30 minutos, se filtra (filtrado incoloro, de lo contrario se debe purificar con carbón activado a razón de 200 - 300 g de carbón por cada 4 ó 5 ml del filtrado, el cual se agita por períodos de 2 - 3 minutos y se filtra nuevamente), esto es válido para contenido estomacal, intestinal y sangre. Alimentos concentrados: Tomar 10 - 15 g de alimento, se le agregan 10 ml de solución de HCl al 5%, se mezclan y se realiza el resto de las operaciones anteriormente explicadas. Sustancias minerales: Tomar 1 - 2 g del precipitado mineral y añadir 10 ml de HCl 5%, el resto del experimento es el mismo explicado anteriormente. En agua: Se toman 20 ml de agua y agregar 20 ml de HCl 5% se mezclan y se realiza el resto de las operaciones. METODO A: Fundamento teórico: El ion flúor forma complejos incoloros muy estables con determinados cationes como hierro, titanio, zirconio, etc., esto le permite destruir otros complejos coloreados menos 165
estables de esos cationes. En el caso del complejo Zr - alizarina de color rojo violeta es decolorado por el ion Flúor al formarse el anión complejo F6Zr2- (hexafluor zirconato IV) y desprenderse alizarina libre, de color amarillo. La reacción más sensible es la decoloración de la laca alizarin zirconio. TECNICA: Se toman 2 -3 ml del filtrado incoloro en un tubo de ensayo limpio y se
añaden
de
3-6
gotas
del
reactivo
laca
zirconalizarina,
posteriormente se realiza la lectura durante los primeros 5 minutos. Cuando cambia el color violeta rojo del reactivo a un color amarillo (de pálido hasta brillante). METODO B: Fundamento teórico: Al tratar un fluoruro con ácido sulfúrico concentrado se forma el ácido fluorhídrico volátil, que corroe el vidrio por el tetrafluoruro de silicio. TECNICA: Se toman 50 g del material patológico bien triturado y se alcaliniza con exceso de hidróxido de calcio, se moja con solución de nitrato de amonio, se seca y se calcina hasta la quema total, la ceniza se remoja con agua destilada, se seca y se investiga: Una parte de la ceniza se coloca en un crisol de platino o porcelana y se le añaden de 3 - 5 ml de ácido sulfúrico concentrado, se cubre rápidamente con un cristal revestido de parafina con una inscripción hecha sobre este. Dentro de 24 horas se quita el cristal, se elimina la parafina con agua caliente y después se limpia con alcohol y éter. En casos positivos se quedará la inscripción sobre el cristal. CUESTIONARIO PREVIO: 1. Investigue todo lo referente a todas las sustancias mencionadas en esta práctica, así como las fórmulas de cada una con su nombre. 166
2. Investigue otro método para determinación de FLÚOR. 3. ¿Cuál es la reacción que se lleva a cabo en el método B utilizado para determinación de FLÚOR? 4. ¿En que productos industriales se encuentra el Flúor? 5. ¿En una autopsia que alteraciones se observan en el tracto digestivo? 6. ¿En donde se encuentra presente el fluoracetato? 7. ¿En medicina para que medicamentos y para que tratamientos se pueden usar las sustancias con flúor?
PRACTICA NO.
39
INVESTIGACION OSEA (PRUEBA DE
BURGER) Consiste en introducir el hueso en una solución de sulfato de cobre. Si el hueso contiene ácidos grasos al cabo de cierto tiempo toma color
verde
característico.
Esta
reacción
se
basa
en
la
descomposición cadavérica de la grasa en glicerina y ácidos grasos, generalmente resulta positiva. INVESTIGACION OSEA (PRUEBA DE ácido ósmico) Un hueso se introduce en éter durante varias horas y se trata después este éter con unas gotas de ácido ósmico al 1%, el agua de la solución de ácido ósmico que va al fondo del tubo de ensayo, se oscurece hasta volverse más o menos negra según la cantidad de grasa que del hueso haya disuelto el éter (entre mayor cantidad de grasa el hueso está más cerca de la fecha de muerte).
167
Bibliografía Ballantayne, B., M. Timothy, et al. (2000). General and Applied Toxicology. UK, Macmillan. Batana, L. M. (2000). Seafood and Freshwater Toxins. Pharmacology, Physiology, and Detection. USA, Marcel Dekker. Concon, J. M. (1988). Food Toxicology. USA, Marcel Dekker. Harris, J. (2000). Chemical Pesticide Markets, Health Risk and Residues. USA, CABI. Snell, K. and B. Mullock (1987). Biochemical Toxicology: A Practical Approach. UK, IRL. Valle, V. P. (1991). Toxicología de Alimentos. Metepec, Estado de México, México, Centro Panamericano de Ecología Humana y Salud. Programa de Salud Ambiental. Organización Panamericana de la Salud. Organización Mundial de la Salud.
168
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