MARKERI TUMORALI. RECOMANDARI PRIVIND UTILIZAREA LOR IN PRACTICA CLINICA Lector Dr. Chim. ADINA STANCIU Formator Acreditat de Ministerul Sanatatii
[email protected]
Ce îşi propune cursul ! 1.
Notiuni generale despre markerii tumorali
2.
Clasificare markeri tumorali. Semnificatia clinica a markerilor: CEA 、 AFP, CA 19-9, CA 72-4, CA 125, PSA / fPSA, CA 15-3, TPA, CYFRA 21-1, SCC, NSE, TK, TG, B2M, S-100, TA-90, Feritina, HCG, Calcitonina etc.
3.
Determinarea markerilor tumorali
4.
Recomandari privind utilizarea markerilor tumorali de prima linie in diverse neoplazii
5.
Evaluarea clinica a markerilor tumorali
ANTIGENE TUMORALE ¾
TSA-Tissue Specific Ag - Antigene care aparţin doar celulelor tumorale
¾
TAA-Tissue Associated Ag - Antigene care aparţin şi celulelor normale z
z
Antigenele retrogenetice: sunt exprimate numai pe suprafaţa celulelor embrionare: antigene oncofetale (α-fetoproteina - AFP şi antigenul carcinoembrionar – CEA) Antigenele de diferenţiere: apar numai într-o fază determinată a maturaţiei unor serii celulare (elementele imature din leucemii).
ANTIGENE TUMORALE IDENTIFICATE PÂNĂ ACUM ANTIGENE TUMORALE Antigene virale: HPV E6 şi E7 EBNA-1 Antigene de hepatită B şi C HTLA-1
Antigene proteice nemutate: MAGE-1, -3* BAGE GAGE RAGE LAGE-1 Tirozinază* TRP-1/gp75 (tyrosinase related protein), TRP-2, gp100*, MELAN-A / MART-1 GAG-3 / NY-ESO-1 CEA PAP, PSA, PSMA HER-2 / neu SCP-1 (synaptonemal complex protein) / HOM-TES-14
NEOPLAZIA Col uterin Limfom Hodgkin/Burkitt Hepatom Leucemie/limfom T
Melanom, cancer pulmonar, mamar, cap şi gât Melanom, cancer vezical Melanom, cc. pulmonar, mamar, cap şi gât, sarcom Cancer renal şi alte cancere Melanom Melanom Melanom Cancer esofagian, vezical, pulmonar etc Cancere gastro-intestinale, pulmonare, mamare Cancer de prostată Cancer mamar, ovarian etc Cancer testicular, mamar, ovarian, gliom etc
ANTIGENE TUMORALE IDENTIFICATE PÂNĂ ACUM ANTIGENE TUMORALE Autoantigene mutate: MUM-1 (melanoma-ubiquitous mutated) β-catenina ESO-1 TPI* (triosephosfate isomerase) CDC 27* (MHC II) CDK4 (Cyclin-dependent kinase) CASP-8 (caspase-8) p21 ras p53
Proteine anormal glicozilate: MUC-1 M-TAA U-TAA
Proteine de fuziune: Bcr-abl (p120) Pax3-fkhr Ews-fli-1 LDFP (Low density-lipid receptor fusion protein)*
Glicolipide: De grup sangvin (T, Tn, siali-Tn) Ganglioside (GM2, GD2, GD3)
NEOPLAZIA Melanom Melanom, cancer de colon Cancere de cap şi gât, tumori scuamoase Melanom Melanom, adenocarcinoame Tumori scuamoase Adenocarcinoame Adenocarcinoame
Cancere de pancreas, mamare Melanom Melanom
Leucemie cronică mieloidă Rabdomiosarcom alveolar Sarcom Ewing Melanom
Carcinoame Melanom, sarcom, neuroblastom, gliobalstom
1. NOŢIUNI GENERALE DESPRE MARKERII TUMORALI markerii tumorali apar ca urmare a alterării metabolismului celular; z markerii tumorali sunt substanţe, care reflectă sinteza, creşterea şi răspunsul la terapie a tumorilor maligne, fiind produşi fie de celulele tumorale, fie de celulele gazdă stimulate de tumora; z markerii tumorali sunt produşi asociaţi tumorilor (factori genetici, oncogene, proteine, etc.). z
MARKERI TUMORALI - ISTORIC a)
1846 - proteina Bence Jones a fost descrisă ca marker pentru mielomul multiplu
b)
1930 - gonadotropina chorionică (hCG) a devenit un test standard, iniţial în diagnosticul şi apoi în monitorizarea choriocarcinomului
c)
1963 - AFP a fost identificată ca marker pentru carcinomul hepatoceluar (Tatarinov)
d)
1965 - CEA a fost identificat ca antigen oncofetal şi exploatat clinic (Gold şi Freedman).
e)
din 1975 – tehnica anticorpilor monoclonali este folosită pentru a descoperi noi markeri tumorali (Kohler si Milstein)
CARACTERISTICILE MARKERULUI TUMORAL IDEAL ¾
¾
¾
specificitate cât mai apropiată de 100 % (să nu fie detectabil în tumori benigne sau în alte afecţiuni organice); specificitate de organ foarte mare (să fie secretat de o singură entitate tumorală); sensibilitate cât mai apropiată de 100 % (să poată fi detectat la o cantitate foarte mică de celule tumorale).
2. CLASIFICARE MARKERI TUMORALI După localizarea lor: ¾ Markeri tumorali celulari: sunt detectati în ţesutul tumoral (p53, receptori hormonali etc.) ¾
Markeri tumorali umorali: sunt detectaţi în lichidele biologice (ser, plasmă, LCR, urină, salivă, lichid de ascită, lavaj bronhoalveolar etc.)
CLASIFICARE MARKERI TUMORALI 2.1 Peptide non-hormonale: CEA, AFP, CA19-9, CA 72-4, CA125, CA15-3, PSA, TPA, BTA etc.
2.2 Enzime şi izoenzime: Enolaza Neuron Specifica
(NSE),Timidin Kinaza (TK), Fosfataza Acida etc.
2.3 Proteine serice speciale: Tiroglobulina (TG), Beta-2-
microglobulina (B2M), Proteina S-100, Proteina TA-90, Feritina etc.
2.4. Produşi hormonali ai sistemului endocrin difuz - hormoni eutopici (paratiroide – PTH, cancer tiroidian medular – calcitonina, gastrinom – gastrina, feocromocitom – catecolaminele, insulinom – insulina, choriocarcinom – HCG etc.).
2.5 Produşi hormonali ai tumorilor non-endocrine – hormoni ectopici (APUD-oame: cancer bronsic cu celule mici - ACTH, carcinoid - LPH etc. si Non APUD-oame: cancer mamar - HCG, PTH, ACTH etc.)
2.1 PEPTIDE NON-HORMONALE 2.1.1 Antigenul carcino-embrionar (CEA) ¾Este
o glicoproteină cu o greutate moleculară de 180 kD. 45-60% din moleculă este alcătuită din carbohidraţi, iar partea proteică este un lanţ polipeptidic. Au fost descrişi cel puţin 6 epitopi. ¾În timpul dezvoltării embrionului se formează în pancreas şi în tractul gastrointestinal ca un antigen de suprafaţă celulară. Chiar şi la adult, sinteza nu încetează complet Timpul de înjumătăţire: 1-2 săptămâni Interval de referinţă: 0-5 ng/mL (Fumători < 10 ng/mL)
In urină, concentraţii de peste 35 ng/mL (dacă infecţia
urinară este exclusă) poate indica un carcinom al vezicii urinare !!! S-a observat că tumorile colonului, prostatei şi rinichilor sunt însoţite de valori crescute ale CEA numai după invadarea tractului urinar !!! Valori crescute ale CEA în LCR apar în primul rând în metastaze cerebrale !!!
Sensibilitatea CEA în tumorile primare Tumori primare
Sensibilitate [%]
Carcinom colorectal pre-operator
10-50
Carcinom colorectal post-operator
75-85
Cancer mamar pre-operator
10-40
Cancer mamar post-operator
75-85
Carcinom pulmonar cu celule mici
20-60
Carcinom pulmonar altul decât cel cu celule mici
70-80
Cancer cap, gât
60-70
Carcinom pancreatic
30-40
Carcinom ovarian
20-30
Limite si interferente ¾
CEA nu poate fi folosit in scop de screening.
¾
Cresteri usoare sau moderate (rar peste 10 ng/mL) sunt intalnite la fumatori si in unele afectiuni benigne ale intestinului (colita ulceroasa, boala Crohn, polipoze), pancreasului (pancreatite), ficatului (ciroza hepatica, hepatita cronica), rinichilor (insuficienta renala), plamanilor (emfizem pulmonar) si glandelor mamare.
Pot exista interferente cu unele componente ale kit-ului: - tratamentul cu biotina in doze mari (>5 mg/zi); se recomanda ca recoltarea de sange sa se faca dupa minimum 8 ore de la ultima administrare; - titrurile foarte crescute de anticorpi anti-streptavidina si anti-ruteniu; - anticorpii monoclonali proveniti de la soarece administrati la unii pacienti in scop diagnostic sau terapeutic. ¾
2.1.2 Alfa-fetoproteina (AFP) Este o glicoproteină cu masa moleculară 70 kD, sinteza ei fiind suprimată la adult. ¾ În cursul vieţii intrauterine se formează în sacul vitelin, iar mai târziu în ficat. În ficatul fătului sinteza maximă are loc în săptămânile 14-20. ¾ În serul mamei concentraţia maximă este atinsă în săptămânile 35-38 de sarcină. ¾
- Screening-ul prenatal pentru depistarea afectiunilor de tip anencefalie, spina bifida, boala Langdon Down, trisomie 21, trisomie 18 etc. presupune recoltarea serului matern intre saptamanile 16-18 de sarcina. Daca se obtine o valoare crescuta pentru AFP, determinarea se va repeta dupa 1 saptamana.
ser fetal : lichid amniotic : ser matern = 10.000 : 100 : 1 ¾
Postnatal sinteza de AFP este minimă.
Interval de referinţă: < 5 ng/mL (ELISA) < 7 ng/mL (ECLIA) < 6 ng/mL (CLIA) Limita de detectie – 0.2 U/mL (0.24 ng/mL) Factor de conversie: U/mL x 1.21 = ng/mL; ng/mL x 0.83 =U/mL Timpul de înjumătăţire: 5 zile Stabilitate ser: - 7 zile la 2-8°C; - timp indelungat la -20°C sau la -70°C. AFP este un marker de masă tumorală, nivelul seric crescând cu mărimea tumorii.
2.1.3 Antigenul gastro-intestinal
(CA 19-9)
¾
CA 19-9 este un gangliozid (glicolipid). IMPORTANT! Apare numai la persoanele cu antigenele de grup sanguin Lewis prezente
¾
Persoanele cu grup sanguin relativ rar negativ pentru antigenele Lewis (3-5% din populaţie) nu dispun de enzima sialyl-transferaza necesară pentru sinteza CA 19-9. La aceste persoane CA 19-9 rămâne la valori foarte scăzute, chiar dacă este prezentă o neoplazie.
¾
Pentru astfel de persoane markerul tumoral indicat: CA 50 sau CA 242.
¾
CA 19-9 este prezent în celule epiteliale şi mucoase din: pancreas, căi biliare, colon, stomac, ficat etc.
¾
Deşi, a fost descoperit ca marker pentru cancerul colorectal, CA 19-9 este markerul de primă linie în carcinomul pancreatic
¾
Indicatii absolute: diagnosticul si monitorizarea adenocarcinomului pancreatic, gastric si a tumorilor hepatobiliare;
¾
Indicatii relative: diagnosticul si monitorizarea cancerului colorectal (al doilea marker dupa CEA) si ovarian (al doilea marker dupa CA 125).
¾
CA 19-9 nu poate fi utilizat pentru screening-ul carcinomului pancreatic.
Interval de referinţă: < 37 U/mL (ELISA) < 27 U/mL (ECLIA) Interval de graniţă: 30 – 65 U/mL Valori > 65 U/mL (probabilitatea ca boala să fie de natură malignă este de 95%) - CA 19-9 se poate pozitiva si in afectiuni benigne (37-65 U/mL), in special boli inflamatorii ale intestinului, ciroza, dar si in boli autoimune: poliartrita reumatoida (33%), lupus eritematos sistemic (32%) si sclerodermie (33%). Timp de înjumătăţire: 4 – 6 zile Stabilitate proba - serul separat este stabil: 30 zile la 2-8°C; trei luni la -20°C sau la -70°C;
2.1.4 Antigenul gastric (CA 72-4) CA 72-4 este un marker, care a fost identificat cu doi anticorpi monoclonali (CC49, B72.3). Este o glicoproteină cu masa moleculară de 400 kD. Este considerat a fi o molecula asemanatoare mucinei. ¾ Este prezent în: stomac, ovare, celule epiteliale pulmonare. ¾ Deşi, CA 72-4 a fost destinat monitorizării cancerului ovarian, se pare că rezultatele au fost mai bune pentru cancere ale tractului digestiv, în special pentru cel de stomac. ¾
Indicatii absolute: marker de prima linie in monitorizarea tratamentului si evolutiei bolii in cancerul pancreatic, gastric (sensibilitate = 85%) si a tumorilor hepatobiliare (in asociere cu CEA sau CA 19-9 ca markeri secundari). Indicatii relative: - in tumorile ovariene mucinoase: sensibilitate de 82%, - in cancerele pulmonare (altele decat cele cu celule mici) sensibilitatea este de 75%.
¾ ¾
Există o foarte bună corelaţie între CA 72-4 şi stadiul bolii. CA 72-4 poate fi folosit pentru monitorizarea carcinomului gastric postoperator pentru că indică recidiva bolii.
Interval de referinţă:
< 8 U/mL (ELISA) < 6.9 U/mL (ECLIA)
Timp de înjumătăţire: 4 – 6 zile Limita de detectie – 0.2 U/mL ¾
CA 72-4 se poate pozitiva in afectiuni benigne mamare sau hepatice si in sarcina.
Stabilitate ser: - 30 zile la 2-8°C; - timp indelungat la -20°C sau la -70°C
2.1.5 Antigenul ovarian (CA 125) CA 125 este o glicoproteină cu masa moleculară de 220 kD. CA 125 a fost identificat cu un anticorp monoclonal. CA 125 II de a doua generaţie a fost identificat cu un alt anticorp (M II), care a crescut semnificativ specificitatea acestui marker (specificitate 95%). ¾ Este prezent în epiteliul următoarelor organe: ovar, pancreas, vezică biliară, stomac, rinichi, colon etc. ¾ CA 125 se găseşte în cantităţi mari în lichidul amniotic, laptele şi serul femeilor însărcinate. ¾
Interval de referinţă:
< 37U/mL (ELISA) < 35 U/mL (ECLIA)
Interval de graniţă: 35 – 65 U/mL (fibroame uterine, endometrite etc.) Cresteri usoare ale CA 125 se pot intalni in timpul menstruatiei, primul trimestru de sarcina, diferite afectiuni benigne ale sferei genitale (endometrioza, fibromatoza, boli inflamatorii pelvine), dar si in alte afectiuni benigne non-ginecologice (pancreatita acuta sau cronica, hepatita, ciroza, insuficienta renala, boli autoimune etc.)
Timpul de înjumătăţire: 2 – 6 zile Limita de detectie – 0.6 U/mL Stabilitate ser: - 5 zile la 2-8°C; - 3 luni la -20°C. Indicatii absolute: - monitorizarea carcinoamelor ovariene epiteliale seroase şi nediferenţiate (cel mai comun tip de cancer ovarian). z Sensibilitatea în stadiile I şi II = 65%; z Sensibilitatea în stadiile III şi IV = 85%. z În cazul tumorilor mucinoase, care reprezintă 10% din carcinoamele ovariene, sensibilitatea este mai mică. Indicatii relative: - suspiciune de adencarcinom pancreatic ¾
CA 125 nu poate fi utilizat pentru screening-ul cancerului ovarian in populatia generala, datorita lipsei sale de sensibilitate pentru stadiul precoce al bolii.
2.1.6 Antigenul mamar (CA 15-3) CA 15-3 este o glicoproteină de tip mucinos cu masa moleculară de 300 - 400 kD. CA 15-3 de ultimă generaţie a fost identificat cu 2 anticorpi monoclonali diferiţi: 115D8 şi DF3. Anticorpul 115D8 a fost obţinut prin imunizare cu lipide din laptele uman, iar anticorpul DF3 prin imunizare cu membrana celulelor de carcinom mamar. ¾ CA 15-3 este o glicoproteina transmembranara a carei sinteza este codificata de gena MUC1. ¾ Principala utilitate a determinarii acestui marker este monitorizarea tratamentului si a evolutiei bolii in cancerul mamar. ¾ CA 15-3 este prezent în celulele epiteliale secretorii şi în secreţii. ¾
Interval de referinţă:
25mg /24 ore (atenţie la recoltarea Urinei: paracetamol, banane, alune - 5 HO-Indol).
2.4.1Human Chorionic Gonadotropin - hCG •
Este un hormon GP heterodimeric (cu două subunităţi: a şi ß) produs în mod normal de către trofoblaştii placentari; este detectabil după aprox 1 săptămână de la nidare şi creşte exponenţial (dublându-şi concentraţia la 1,5-2,5 zile). •
•
Determinarea hCG este utilizată de obicei pentru confirmarea sarcinii şi evaluarea tumorilor trofoblastice.
A fost introdus în screening-ul matern (Triplu test: HCG + AFP + E3 neconjugat) – valori crescute - risc crescut de sindrom Down, Eduards
z
z
z
z
Valori normale: • la bărbaţi • la femei • la femei în menopauză
< 1 U/L < 5 U/L < 10 U/L.
Valori crescute: Identificarea în afara sarcinii este caracteristică tumorilor trofoblastice, în particular choriocarcinomului şi tumorilor cu celule germinale ale testiculului (seminoame) şi ovarului, rareori în carcinoame mamare, pulmonare, adenocarcinomul gastric şi pancreatic (uneori însoţite de ginecomastie). Există o corelaţie destul de bună între nivelul acestui marker şi masa tumorală, determinarea putând fi utilizată pentru a monitoriza răspunsul la tratament şi eventualele recăderi. Determinarea este utilă şi pentru screening-ul femeilor cu molă hidatiformă, în sensul depistării transformării acesteia în choriocarcinom.
2.4.2 CALCITONINA z
Calcitonina este secretată de celulele parafoliculare C ale tiroidei. Efectul principal este de scădere a calciului seric, prin inhibarea resorbţiei osoase şi stimularea eliminării urinare a calciului.
¾
Creşterea concentraţiei serice a calcitoninei apare în sindroamele mieloproliferative.
¾
Una dintre cele mai importante proliferări maligne însoţite de sinteza exagerată de calcitonină este carcinomul medular tiroidian. CALCITONINA = markerul de prima linie in screeningul Carcinomului Medular
MARKERI GENETICI ONCOGENELE sunt gene care atunci când sunt exprimate anormal de intens sau când suferă mutaţii, contribuie la transformarea unei celule normale într-o celulă canceroasă (angajată în mitoză necontrolata) GENE SUPRESOARE TUMORALE - inhibă sau frânează creşterea celulară şi ciclul celular, prevenind dezvoltarea tumorilor
ROLUL MARKERILOR TUMORALI IN ONCOLOGIE ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾
screening stabilirea diagnosticului valoare prognostică monitorizarea tratamentului valoare predictivă indice de supraveghere
PROBLEMA!! ¾
Markerii tumorali nu au valoare absoluta!
3. DETERMINAREA MARKERILOR TUMORALI 3.1 Recoltarea si Stocarea Recoltarea şi stocarea corectă a materialelor biologice este esenţială pentru ca rezultatele analizelor să fie corecte. Se poate lucra pe ser, plasma, lichid cefalorahidian (LCR), urină, salivă etc. a. Ser ¾ Recoltarea se face dimineaţa pe nemâncate ¾ Sângele se recoltează ca atare, fără aditivi ¾ Se recoltează 10 ml de sânge din venele cubitale. Trebuie evitată aplicarea prelungită a garoului înainte de recoltarea sângelui ¾ Sângele poate fi stocat înainte de centrifugare la temperatura camerei 1-2 ore, dacă este vorba despre markeri tumorali utilizaţi ca analize curente. Pentru teste mai speciale sângele va fi centrifugat la 30 minute după recoltare ¾ Sângele coagulat trebuie centrifugat la 1000 x g timp de 15 minute ¾ Serul trebuie transferat în 2-3 criotuburi, care obligatoriu vor avea dop. În ser nu trebuie să rămână hematii ¾ Serul poate fi păstrat la frigider (4◦C) timp de 4-5 zile (pentru analize curente) sau la temperaturi ≤ -20◦C, timp nelimitat
b. Plasmă ¾ Recoltarea se face dimineaţa pe nemâncate ¾ Sângele se recoltează folosind un anticoagulant ca citrat, EDTA sau heparină ¾ Se recoltează 10 ml de sânge din venele cubitale ¾ Sângele trebuie centrifugat la 1000 x g timp de 15 minute ¾ Plasma trebuie transferată în 2-3 criotuburi ¾ Plasma poate fi păstrată la frigider (4◦C) timp de 4-5 zile sau la temperaturi ≤ -20◦C c. Urina ¾ Recoltarea se face dimineaţa într-un vas steril respectându-se condiţiile de la urocultură. ¾ Se efectuează, în prealabil, o toaletare a organelor genitale exterioare cu apă şi săpun. Prelevarea se efectuează din jetul mijlociu, direct într-un vas steril cu gâtul larg (volumul necesar unei examinări uzuale este de 10-15 ml). ¾ Dozarea biomarkerilor se va efectua numai din urină sterilă pentru a înlătura eventualele interferenţe care ar putea apărea (prezenţa germenilor patogeni în urină influenţează calitatea dozării markerilor tumorali, conducând la valori fals pozitive) ¾ Urina, astfel recoltată, trebuie centrifugată la 1000 x g timp de 15 minute ¾ Urina poate fi păstrat la frigider (4◦C) timp de 7 zile (?) sau la temperaturi ≤ -20◦C timp nelimitat. Pentru determinarea markerilor tumorali, probele de ser, plasmă, urină etc. sunt decongelate la temperate camerei (1-2 h – mai puţin la urină) şi omogenizate. Proba odată decongelată nu mai poate fi recongelată. De aceea, este necesară fracţionarea probei în 2-3 eşantioane, care vor fi congelate. După decongelare, proba poate fi stocată 4-5 zile la frigider (4◦C). Important! Analizele nu pot fi efectuate din probe biologice cu hemoliză şi/sau lipemie
3.2 Metode de Analiza Pentru determinarea markerilor tumorali sunt folosite metode radioimunochimice, imunochimice şi cromatografice. Metodele de analiza a markerilor tumorali trebuie sa indeplineasca urmatoarele conditii: ¾ specificitate; ¾ sensibilitate; ¾ reproductibilitate; ¾ variatia in timpul determinarii: < 5%; ¾ variatia intre determinari: < 10%. Principiul acestor metode - reacţia antigen-anticorp (Ag-Ac). Cantitatea de complexe imune poate fi determinata daca Ac sau Ag din complex este marcat cu o substanta care emite un semnal, ce urmeaza a fi masurat. Substanta folosita pentru marcare trebuie sa indeplineasca conditiile: ¾ sa emita un semnal stabil, usor de masurat; ¾ sa lege atat molecule mari, cat si mici; ¾ sa nu modifice in nici un fel legatura Ag-Ac In prezent, metodele radioimunochimice (RIA) folosesc pentru marcare izotopii radioactivi 125I, iar metodele imunochimice folosesc enzime (EIA), substante fluorescente (FIA), substante luminescente (LIA)
Metoda
Marker
Avantaje
Dezavantaje
RIA: competitie intre Ag ce se dozeaza si Ag marcat, pentru legare la acelasi anticorp specific.
Izotopi radioactivi:
Sensibilitate: mare Specificitate: mare Pret/kit: mic Sistem: deschis
Timp de viata: scurt Produs: radioactiv Deseuri: radioactive Costuri analizor (gammacounter): mari Conditii de lucru: speciale (autorizatie CNCAN)
IRMA: in general metoda in faza solida tip “sandwich”; primul anticorp este fixat pe o faza solida (bila, tub,etc.), dupa incubarea cu proba de dozat, se adauga un exces de anticorp marcat.
Izotopi radioactivi:
Sensibilitate: mare Specificitate: mare Pret/kit: mic Sistem: deschis
Timp de viata: scurt Produs: radioactiv Deseuri: radioactive Costuri analizor (gammacounter): mari Conditii de lucru: speciale( autorizatie CNCAN)
125 I, 131 I, 3 H
125 I, 131 I, 3 H
RIA
Metoda
Marker
Avantaje
Dezavantaje
ENZIMATICA EIA : competitie intre Ag ce se dozeaza si Ag marcat enzimatic pentru legare pe acelasi anticorp specific
Enzima: (cromogen) : Fosfataza alkalina Peroxidaza Glucoza oxidaza Substrat: PNPP, H2 O2
Timp de viata: lung Produs: neradioactiv Deseuri: neradioactive Costuri pt.analizor ( fotometru): mici Conditii de lucru: obisnuite Sistem: deschis/inchis Pret/test: mic/mediu
Sensibilitate: medie Specificitate: medie Pret/kit: mediu/mare
IEMA: metoda in faza solida tip “sandwich”; primul anticorp este fixat pe o faza solida (bila, tub,godeu), dupa incubarea cu proba de dozat, se adauga un exces de anticorp marcat
Enzima: (cromogen) : Fosfataza alkalina Peroxidaza Glucoza oxidaza Substrat: PNPP, H2 O2,
Timp de viata: lung Produs: neradioactiv Deseuri: neradioactive Costuri pt.analizor ( fotometru): mici Conditii de lucru: obisnuite Sistem: deschis/inchis Pret/test: mic/mediu
Sensibilitate: medie Specificitate: medie Pret/kit: mediu/mare
Imbracare placi
ELISA Ag
Ac ELISA competitiva
ELISA directa
ELISA indirecta
Proba
Ac sec. - E
Proba
Ac sec. - E
Substrat
Detectie si Analiza
Proba+Ag
Ac sec. - E
Metoda
Marker
Avantaje
Dezavantaje
LUMINISCENTE Isotiocianat de Timp de viata: lung Produs: neradioactiv Fluorescente (FIA) fluoresceina Fosforescente (PhIA) (492nm/520 nm) Deseuri: neradioactive Conditii de lucru: Isotiocianat de obisnuite in orice laborator clinic rhodamina (550nm/585nm) Sensibilitate: medie
Costuri pt.cititor probe (fluorimetru) si accesorii: mari Pret/kit: mediu/mare Sistem: inchis
CHEMILUNISCENTE
luminol, isoluminol
Timp de viata: lung Produs: neradioactiv Deseuri: neradioactive Conditii de lucru: obisnuite in orice laborator clinic Sensibilitate: mare Specificitate:mare
Costuri pt.cititor probe (luminometru) si accesorii: mari Pret/kit: mediu/mare Sistem: inchis
BIOLUMINISCENTA
luciferinluciferaza
Timp de viata: lung Produs: neradioactiv Deseuri: neradioactive Conditii de lucru: obisnuite in orice laborator clinic Sensibilitate: mare Specificitate:mare
Costuri pt.cititor probe (luminometru) si accesorii: mari Pret/kit: mediu/mare Sistem: inchis
3.3 ASIGURAREA CALITATII - organizare - personal - infrastructura Implementarea măsurilor AC conduce la: - un management optim al laboratorului; - îmbunătaţirea eficienţei activităţilor; - minimizarea erorilor; - stimularea şi motivarea personalului; - creşterea cotatiei laboratorului.
CONTROLUL CALITATII (CC):
“un set complet de proceduri aplicate in cadrul laboratorului pentru monitorizarea continuă a operaţiilor şi rezultatelor, în vederea stabilirii dacă rezultatele sunt suficient de sigure pentru a fi luate în considerare” CC se desfăşoară pe trei nivele: 1. primul nivel de control (control intern) realizat de analist 2. al doilea nivel de control (control intern) realizat de Responsabilul cu calitatea / Şeful de laborator 3. al treilea nivel de control (control extern) scheme de comparare interlaboratoare
CONCEPTUL DE MANAGEMENT AL CALITĂŢII ORGANIZARE ORGANIZARE
VERIFICĂRI VERIFICĂRI INTERNE INTERNE
AC INFRASTRUCTURĂ INFRASTRUCTURĂ
CC TESTEDE DE TESTE PERFORMANŢĂ PERFORMANŢĂ
TESTE TESTE INTERINTERLABORATOARE LABORATOARE PERSONAL PERSONAL
Fiecare laborator trebuie sa aiba propriul MANUAL al CALITATII: Proceduri specifice de analiza - curbe de etalonare - verificari interne (controale interne de calitate) - scheme de control interlaboratore (controale externe de calitate) etc.
CAUZE ALE ERORILOR FAZA PRE-ANALITICA (68% din erori) Factori legati de proba de analizat Colectarea, transportul, prelucrarea primara si inregistrarea probelor Recoltarea şi stocarea corectă a materialelor biologice este esenţială pentru ca rezultatele analizelor să fie corecte. Se poate lucra pe ser, plasma, lichid cefalorahidian (LCR), lichid amniotic, fluid pleural, urină, salivă etc. ¾ ¾ ¾ ¾
Timpul de la recoltarea probei – proba trebuie prelucrata in cel mult 1-2 ore Hemoliza - gradul de hemoliza va fi specificat in raportul de analiza Lipemia - pentru serurile lactescente determinarile se efectueaza utilizand uneori dilutia cu diluentul din trusa (1:10) prelucrarea primara a probelor – efectuarea corecta a dilutiilor A nu se uita de calibrarea periodica a micropipetelor!!! Probele intens hemolizate - NU se lucreaza!!!
CAUZE ALE ERORILOR FAZA PRE-ANALITICA (68% din erori) Factori legati de proba de analizat - INTERFERENTE
1. Factori care pot cauza rezultate fals pozitive: ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾
boli benigne, in primul rand boli inflamatorii degenerative; boli virale (virus herpetic) – (Timidin – Kinaza etc.) boli hepatice (AFP, CEA, CA 19-9, TPA, TPS etc.) boli renale (β2-mg, calcitonina, CEA, PSA, BTA etc.) tratamente (chimio-terapie, radio-terapie, necroza tumorala, interventii chirurgicale etc.); sarcina (AFP, CA 125, HCG etc.); menstruatia (CA 125 etc.); starea gripala; medicamente (calcitonina, catecolamine, TSH, T4, anticorpi monoclonali proveniti de la soarece, biotina > 5mg/zi etc.)
CAUZE ALE ERORILOR FAZA PRE-ANALITICA (68% din erori) Factori legati de proba de analizat - INTERFERENTE
2.Factori care pot cauza rezultate fals negative: viteza crescuta de metabolizare. se formeaza complexe imune cu anticorpi circulanti; numar scazut de celule maligne; markerul tumoral ramane in celula sau pe suprafata celulei (tumora incapsulata); ¾ sinteza de biomarker este blocata; ¾ vascularizarea slaba a tesutului tumoral – markerul tumoral nu ajunge in circulatia sanguina; ¾ CA 19-9 apare numai la persoanele cu antigenele de grup sanguin Lewis prezente - persoanele cu antigen Lewis negativ, nu dispun de enzima sialyl-transferaza necesară pentru sinteza de CA 199 (se recomandă CA 50 sau CA 242) etc. ¾ ¾ ¾ ¾
CAUZE ALE ERORILOR FAZA PRE-ANALITICA (68% din erori) Factori legati de reactivi receptia si evidenta corecta a reactivilor (reactivii expirati se indeparteaza conform procedurii privind managementul deseurilor) ¾ respectarea conditiilor impuse de producator privind conditiile de depozitare (temperatura, lumina, umiditate) pentru a nu afecta stabilitatea si proprietatile chimice ¾ reconstituirea si portionarea (cand este cazul) a standardelor si a controalelor, conform indicatiilor din interiorul kit-ului ¾
ATENTIE! Esantioanele de IQC reconstituite se utilizeaza o singura data dupa decongelare si NU se recongeleaza
CAUZE ALE ERORILOR FAZA ANALITICA (13% din erori) Factori legati de materialele de referinta ¾
¾
rularea controalelor pe minimum 2 nivele: normal si patologic frecventa rularii controalelor interne: interserie (la inceputul fiecarei serii analitice) sau intraserie (evitarea erorilor aleatorii)
CAUZE ALE ERORILOR FAZA ANALITICA (13% din erori) Calibrarea se efectueaza : ¾ la introducerea unei metode noi de determinare a unui analit ¾ la schimbarea lotului de reactivi ¾ dupa interventia service-ului la echipament ¾ cand rezultatele IQC incalca regulile Westgard ¾ dupa inlocuirea alicotelor din materialele de control
CAUZE ALE ERORILOR FAZA ANALITICA (13% din erori) ¾ ¾
¾
verificarea functionarii la parametrii ceruti a sistemului automat de analiza respectarea conditiilor de incubare, agitare si spalare in timpul procedurii de lucru (verificarea temperaturii, a capilarelor spalatorului, a vitezei de rotatie) – in cazul sistemelor semiautomate de analiza evitarea contaminarii reactivilor
IMPORTANT! La sfarsitul zilei de lucru este esentiala efectuarea operatiunilor de intretinere a echipamentului (spalare ace, tubulatura, cuve) in scopul evitarii contaminarii si interferentelor.
CAUZE ALE ERORILOR FAZA POST-ANALITICA (18% din erori) Procedura de raportare a rezultatelor Raportul de analiză trebuie să indice: -
Aspectul probei, de ex. hemolitic, icteric, lipemic (turbid, opalescent)
-
Dacă proba a fost determinata in dilutie, trebuie specificata dilutia
-
Dacă interferenţa nu s-a putut elimina şi analiza nu s-a efectuat, în locul rezultatului se notează: “nu s-a efectuat datorită...”
CAUZE ALE ERORILOR FAZA POST-ANALITICA (18% din erori) Se impune repetarea determinarilor pentru: ¾
rezultate care nu se coreleaza intre ele si cu diagnosticul (ex. T4, T4 liber, TSH etc.)
¾
rezultate neastepatate in cazul monitorizarii tratamentului
¾
repetarea determinarii analitului se va efectua intotdeauna pe un alt esantion provenit din acelasi specimen!
¾
Se pot efectua determinari aditionale,cu anuntarea clinicianului, daca se obtin valori patologice pentru anumiti analiti (ex. metastaze hepatice – cauza necunoscuta – clinicianul indica CEA si AFP)
3.4 Criterii de selectie şi validare ¾
Sensibilitatea unei metode reprezintă proprietatea acesteia de a detecta o cantitate cât mai mică din substanţa de analizat (de a nu da rezultate fals negative - FN)
¾
Specificitatea unei metode reprezintă proprietatea acesteia de a detecta numai substanţa de analizat dintr-un sistem (de a nu da rezultate fals pozitive – FP sau de a da un rezultat real negativ – RN – dacă substanţa nu se găseşte în sistemul de analizat) Parametrii metodei de analiză a markerilor tumorali Tumora Rezultatele metodei de analiză a markerilor tumorali
Prezentă
Absentă
Total
Pozitiv
RP (Real pozitiv)
FP (Fals pozitiv)
RP+FP
Negativ
FN (Fals negativ)
RN (Real negativ)
FN+RN
Total
RP + FN
FP + RN
Criterii de selectie a markerilor tumorali: ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾
Sensibilitate cat mai mare – capacitatea de a identifica neoplazia in stadiu precoce Specificitate cat mai mare – capacitatea de a distinge intre indivizii sanatosi si cei cu neoplazii Specificitate de organ – capacitatea de a localiza tumora Corelatie intre concentratia markerului si stadiul tumorii Capacitate de a indica modificarile induse de tratament Valoare prognostica in functie de concentratie
3.5 Determinarea Multimarker PROBLEMA!! ¾
Nu exista marker tumoral ideal!
¾
Markerii tumorali nu au valoare absoluta!
SOLUTIA ¾
SE LUCREAZA CU ASOCIERI DE MARKERI:
-
un marker "de primă alegere" (cu cea mai mare specificitate ptr. celula tumorală cercetată); unul sau doi markeri, "de a doua sau a treia alegere", care îmbunătăţesc considerabil sensibilitatea primului.
-
EXEMPLU: un marker de masa tumorala; unul sau doi markeri de activitate tumorala.
4. RECOMANDARI PRIVIND UTILIZAREA MARKERILOR TUMORALI DE PRIMA LINIE IN DIVERSE NEOPLAZII
4.1 CANCER PULMONAR (NSE, CEA, CYFRA 21-1, SCC) Sensibilitatea a markerilor NSE – CEA în cancerul pulmonar TIPUL BOLII
N
NSE (>13 ng/mL) CEA (>5 ng/mL)
Carcinom cu celule mici
81
74%
47%
Alte carcinoame
108
15%
46%
Boli pulmonare benigne
79
5.1%
13.9%
Persoane sanatoase
92
0% ( 7.1 +/- 2.0) 0% ( 1.8 +/- 0.8)
CYFRA 21-1 – fragmente solubile de Citokeratina 19 (în NSCLC) •Valori normale: < 3,3 ng/mL •Valori crescute: carcinom bronşic non-parvicelular – specificitate 95%.
4.2 CANCER MAMAR (CA 15-3, CEA, CA 27-29, RE/RP, HER2/neu, EGFR, Ki-67) ¾ ¾
CA 15-3 nu se utilizează ca marker de screening Determinarea receptorilor pentru Estrogen / Progesteron este recomandată pentru a aprecia raspunsul la terapie hormonală
¾
Determinarea CA 15-3 şi CA 27-29 sunt utile pentru detecţia precoce a recurenţei la pacientele clinic asimptomatice, după tratament în std II şi III
¾
Determinarea CA 27-29 este utilizat doar in monitorizarea pacientelor aflate în fază avansată de boală Recomandari ESMO: Receptori RE/RP, status HER2/neu, indicele de proliferare Ki-67, factorul de crestere EGFR
¾ ¾
4.3 CANCER DE PROSTATA (PSA total, PSA liber) INCIDENTA ¾ ¾ ¾ ¾ ¾
1 caz la 100.000 de barbati în Asia, America de Sud, Africa Este frecvent în America de Nord şi în Nord-Estul Europei 100 de cazuri la 100.000 de barbati în rândul persoanelor de culoare din Statele Unite În România, sunt diagnosticate anual 177 de cazuri noi de cancer de prostată şi aproximativ 7,3% din bărbati mor anual din această cauză Cancerul de prostată reprezintă a doua cauză de deces prin cancer după cancerul pulmonar FACTORI DE RISC
¾ ¾ ¾
¾
Barbati cu varsta peste 65 de ani Rasa afro-americana: bărbaţii de culoare suferă de cancer de prostată cu 37% mai frecvent decât albii Prezenta genei HPC 1 (Hereditary Prostate Cancer 1), predispune bărbaţii la cancer de prostată atunci când suferă mutaţii Prezenta moleculei B7-H3 pe suprafata celulelor canceroase prostatice
PSA ¾
¾
¾
¾
¾
Antigenul specific prostatic (PSA) este un component esential al plasmei seminale. Este sintetizat in celulele acinare si in epiteliul ductal al prostatei. In mod obisnuit, PSA este prezent in ser in concentratii reduse. In cazurile in care se produce alterarea structurii microscopice a prostatei (cancer, hipertrofie prostatica benigna, prostatita acuta, biopsie prostatica) PSA va difuza in stroma, de unde va ajunge in circulatia generala, pe calea sistemului limfatic si capilar. Antigenul specific prostatic (PSA) circula in sange sub diferite forme moleculare datorita complexelor pe care le formeaza cu inhibitori de proteaze: - PSA complexat cu alfa1-antichimotripsina (PSA-ACT) este principala forma imunoreactiva din ser (60 - 90 %) - PSA complexat cu alfa2- macroglobulina (PSA-AMG) - aceasta forma nu este detectabila (< 0,1 %) - PSA liber este o forma enzimatic inactiva - nu se asociaza cu inhibitori (10 - 40 %) Formarea complexelor cu ACT duce la expunerea unui numar limitat de epitopi ai PSA, pe cand complexele cu AMG incapsuleza practic toti epitopii, din acest motiv fiind imposibil de detectat. Proporţiile relative de PSA - ACT şi PSA liber diferă la pacienţii cu cancer de prostată, comparativ cu cei cu BPH
CONCLUZII 1. Determinarea prezenţei, în ţesutul tumoral, a PSA total într-o anumită concentraţie, mai mare sau mai mică, prezintă o importanţă majoră pentru: ¾
alegerea liniei de tratament (în scopul identificării pacienţilor care să beneficieze de radioterapie, chimioterapie sau hormonoterapie);
¾
îmbunătăţirea metodologiilor de tratament, atunci când determinările de PSA total se efectuează postprostatectomie, urmărindu-se evoluţia bolii canceroase sub influenţa terapiei;
¾
monitorizarea tratamentului (indică recrudescenţa şi instalarea rezistenţei organismului la medicamentul administrat).
MARKERI TUMORALI MASA TUMORALA ¾
Bladder Tumor Antigen (BTA Trak) – a fost identificat ca fiind o proteină din familia Factorului H al Complementului Uman (hCFHrp), similar ca structură, compoziţie şi formă, dar nu identic cu hCFH
¾
NMP 22 – Proteine de Matrice Nucleară (NMPs) – fac parte din structura internă a nucleului sau, mai exact, alcătuiesc matricea structurală internă a nucleului celular şi se asociază cu funcţiile de replicare a ADN, sinteza ARN şi formarea de hormoni
ACTIVITATE TUMORALA ¾
Urinary Bladder Cancer Antigen (UBC) – permite măsurarea reactivităţii epitopilor din fragmentele solubile ale citokeratinei 8 şi 18, folosind anticorpii monoclonali 6D7 şi 3F3.
¾
Cyfra 21-1 – marker determinat cu ajutorul a 2 anticorpi monoclonali îndreptaţi împotriva unui fragment de citokeratină 19.
¾
Tissue Polypeptide Specific Antigen (TPS) – permite măsurarea reactivităţii epitopului M3 din fragmentele solubile ale citokeratinei 18, folosind anticorpi policlonali anti-citokeratină.
4.5 TUMORI TESTICULARE (HCG, AFP) Clasificarea histopatologică a tumorilor germ celulare testiculare şi rolul markerilor tumorali hCG şi AFP DIAGNOSTIC
HCG
AFP
SEMINOM
+
-
CARCINOM EMBRIONAL (NON-SEMINOM)
+
+
CHORIOCARCINOM (NON-SEMINOM)
+
-
TERATOM (NON-SEMINOM)
-
-
TUMORA SAC YOLK (NON-SEMINOM)
-
+
5. EVALUAREA CLINICA A MARKERILOR TUMORALI Rolul markerilor tumorali in oncologie: ¾ screening ¾ stabilirea
diagnosticului ¾ monitorizarea tratamentului ¾ valoare prognostică ¾ valoare predictivă ¾ indice de supraveghere
Bibliografie ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾
¾
Hamdan, M., “Cancer Biomarkers – Analytical Techniques for Discovery”, John Wiley & Sons Inc., 2007 Dobreanu, M., “Biochimie clinica – Implicatii practice”, University Press, 2006 Klapdor, R., “Tumour Markers in Clinical Oncology”, Sorin Biomedica, 1994 Belgun, M., Purice, M., Goldstein, A., “Istoricul si evolutia utilizarii radioizotopilor in endocrinologie”, 2003 Lothar Thomas.Tumor Markers. In Clinical Laboratory Diagnostics. 1998, 66-970. The National Academy of Clinical Biochemistry. Practice Guidelines and Recommendations for Use of Tumor Markers in the Clinic (Laboratory Medicine Practice Guidelines), 2002. The National Academy of Clinical Biochemistry. Laboratory Medicine Practice Guidelines. Use of Tumor Markers in Liver, Bladder, Cervical and Gastric Cancers, 2010.
