Marco Teorico Practica Floculacion Inmuno

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIAPAS FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS CAMPUS IV, TAPACHULA LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA

PRACTICA “FLOCULACION”

CATEDRATICO: DRA. MARISOL ESPINOZA RUIZ

ALUMNO: ANZUETO GARCIA MARGARITA ELIZABET BARCENAS BALCAZAR VERONICA ESTHER RODAS HERRERA MIGUEL ANGEL

SEMESTRE: 6°

GRUPO: “A”

TAPACHULA CHIAPAS A 19 DE ABRIL DEL 2010

MARCO TEORICO

Inmunización y preparación del antígeno El proceso de inmunización es aquel en el que se inyecta al animal el antígeno

en

condiciones

adecuadas

de

cantidad,

sustancias

acompañantes, y número de veces, que sean necesarias para conseguir  una buena respuesta inmune. En general se divide en dos fases: inmunización primaria, en la cual se administra una determinada cantidad de antígeno en presencia de adyuvante, e inmunización de recuerdo ('booster'), en la que el antígeno es administrado en forma soluble o bien con adyuvante. Existen numerosos protocolos de inmunización, con una duración variable. Cuando se inmuniza un animal con un antígeno y se provoca una respuesta inmune aumenta notablemente en el suero del animal la cantidad de Ig específicas del antígeno empleado. Esto es la consecuencia de la selección clonal de los limfocitos B que producen anticuerpos contra el antígeno. Como hemos visto un antígeno puede presentar diferentes epítopes, y cada uno de ellos ser reconocido por un clon de linfocitos B que producirá moléculas Ig con una secuencia característica. Por ello en el suero de un animal inmunizado se acumulan un número desconocido, posiblemente elevado, de diferentes moléculas de Ig específicas en mayor o menor medida de nuestro antígeno. Se trata de un suero producido por la acción de síntesis de numerosos clones de linfocitos B y por ello se ha denominado policlonal. Los anticuerpos son las moléculas de la inmunidad humoral específica y una de sus principales funciones fisiológicas es la defensa contra los microorganismos extracelulares y las toxinas producidas por los distintos agentes microbianos. Aunque los blancos de los anticuerpos son comúnmente bacterias extracelulares, hongos y parásitos extracelulares, estas moléculas tienen también un papel muy importante en el control de los

procesos

infecciosos

producidos por

los

microorganismos

intracelulares obligados, tales como los virus, debido a que pueden reconocerlos antes que ellos infecten las células o cuando son liberados como viriones desde las células infectadas. Sin embargo, a pesar de su alta especificidad por microorganismos y toxinas microbianas, los anticuerpos requieren de otros mecanismos efectores, tales como el

complemento, las células fagocíticas y las células citotóxicas para eliminar los antígenos.

Los anticuerpos son producidos por los linfocitos B una vez reconocen el antígeno y reciben señales accesorias por parte de los linfocitos T. Este reconocimiento y activación de los linfocitos B ocurre en los órganos linfoides secundarios, hasta donde llegan los antígenos sea en forma libre o transportados por las células fagocíticas mononucleares. Una vez ocurre la activación, los linfocitos B proliferan y un porcentaje de estas células se convierte en células plasmáticas, las cuales son la principal fuente de anticuerpos durante una respuesta inmune. Luego de ser  secretados, los anticuerpos entran al torrente circulatorio, difunden hacia los tejidos extravasculares o pasan a las secreciones mucosas para interactuar con los antígenos. Por lo tanto, aunque el reconocimiento inicial de los antígenos ocurre en sitios precisos, la fase efectora de la inmunidad humoral es sistémica. Algunas de las células B que reconocieron el antígeno y fueron activadas, migran a través del organismo para ubicarse en distintos órganos linfoides, particularmente la médula ósea y el bazo. Dentro de esta población de células, una parte importante continúa produciendo

anticuerpos aun años después de que el antígeno es eliminado, pues recibe los estímulos derivados de otras respuestas inmunes contra diversos antígenos a los que se expone el individuo. Otra porción de células B queda como células de memoria con una menor capacidad para producir anticuerpos. De esta manera, si un antígeno o microorganismo ingresa de nuevo al individuo, las células que permanecen produciendo anticuerpos dan los niveles suficientes para tener una protección inmediata contra la infección, mientras que por su lado las células B de memoria se activan un poco más tardíamente para proveer una respuesta mucho mayor de anticuerpos que proteja durante un tiempo más prolongado. La molécula básica de un anticuerpo está constituida por dos cadenas pesadas idénticas entre sí y por dos cadenas livianas, también idénticas entre sí; cada una de estas cadenas posee una región variable y una región constante. De esta manera, cada molécula de anticuerpo tiene dos regiones variables o de unión al antígeno, cada una de ellas formada por la interacción entre la porción variable de las cadenas pesadas y liviana. Por lo tanto, decimos que una molécula básica de anticuerpo tiene una valencia de 2. Sin embargo, existen moléculas multiméricas de anticuerpos; por ejemplo, la IgM circulante está constituida por 5 moléculas de inmunoglobulinas (pentámero) y por lo tanto tiene una valencia de 10, mientras que la IgA secretora tiene una valencia de 4, debido a que está conformada por dos moléculas de IgA. Las porciones variables, tanto de las cadenas pesadas como livianas, se forman gracias a fenómenos de recombinación genética entre los varios cientos de fragmentos genéticos que los codifican, proceso que ocurre durante el desarrollo de cada célula individual que se generó a partir de las células precursoras (ontogenia de los linfocitos B). Este mecanismo genético asegura dos aspectos fundamentales para la respuesta inmune:

• Primero, que exista en cada individuo toda la gama posible de anticuerpos que pueden reconocer a todos los antígenos con los cuales se puede encontrar en el transcurso de su vida. • Segundo, que una vez el linfocito B se ha diferenciado y madurado ya tiene la capacidad de responder de manera específica contra un antígeno determinado.Esto implica que al nacimiento, los seres vertebrados poseen células B con posibilidad de responder contra cualquier antígeno. Una vez el antígeno se une a las regiones variables de los anticuerpos se producen una serie de cambios conformacionales en toda la molécula que en última instancia también afectan a las regiones constantes; esto permite que las regiones constantes de aquellos anticuerpos que están unidos a los antígenos, puedan interactuar con otras moléculas como receptores Fc o fracciones del complemento, y de esta manera desencadenar los mecanismos efectores. Esto asegura que dichos mecanismos efectores sólo se pongan en marcha cuando el anticuerpo encuentra y se une específicamente a un antígeno. Existen varios tipos de regiones constantes en las cadenas pesadas de los anticuerpos, lo cual ha permitido definir los isotipos de inmunoglobulinas (IgG, IgM, IgA, IgE e IgD) y las subclases de algunas de ellas (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2). Debido a las diferencias existentes entre estas regiones constantes, los distintos isotipos de inmunoglobulinas cumplen con funciones efectoras distintas. Por ejemplo, algunas subclases de IgG tienen la capacidad de unirse a receptores Fc y promueven la fagocitosis de partículas recubiertas con anticuerpos; la IgM y algunas subclases de IgG pueden activar el complemento; por su parte, la IgE se une a receptores Fc específicos presentes en los mastocitos y eosinófilos y desencadena la activación de estas células. De lo anterior podemos concluir que dependiendo del tipo de inmunoglobulina que se produzca durante una respuesta inmune se podrán desencadenar distintos mecanismos efectores en respuesta a un antígeno determinado. Por lo tanto, deben existir mecanismos que

permitan a los linfocitos B producir anticuerpos de una clase particular  cuando éstos sean más efectivos. Cuando un linfocito B termina su proceso de maduración en la médula ósea tiene la capacidad de secretar IgM y expresa IgM e IgD en la membrana plasmática. Una vez el linfocito B es activado por el encuentro con el antígeno, recibe señales adicionales que le permiten cambiar el isótopo de inmunoglobulina que puede producir. Estas señales son provistas esencialmente por los linfocitos T y dependen de la interacción física entre ambas células y de la producción de citoquinas por dichos linfocitos T. La principal señal provista por la interacción entre las células es la unión de la molécula CD40 presente en la membrana del linfocito B con el ligando para CD40 (CD154) presente en los linfocitos T; una vez estas moléculas interactúan se transmiten señales hasta el núcleo de la célula B que inducen un cambio en el isotipo de inmunoglobulina, de manera que ya puede sintetizar isótopos distintos a la IgM. Por su parte, las citoquinas derivadas de los linfocitos T favorecen la especialización

en

la

síntesis

de

determinados

isotipos

de

inmunoglobulinas. Puesto que los linfocitos T ayudadores sufren un proceso de diferenciación dependiendo de sí el antígeno es intra o extracelular, ellos pueden producir citoquinas con actividades distintas, lo cual las diferencia en células TH1 o TH2, las que a su vez inducen efectos distintos en las células efectoras, incluyendo los linfocitos B. Por  ejemplo, los virus y las bacterias inducen la producción de isotipos de IgG dependientes de células TH1, anticuerpos que pueden unirse a los fagocitos y las células asesinas naturales (NK) y/o activar el complemento; por su parte, parásitos tipo helmintos estimulan la síntesis de IgE que depende de células TH2, la cual se une y activa los eosinófilos, los que a su vez tienen una potente actividad helminticida. INMUNIZACIÓN DE ANIMALES INSTRUCCIONES GENERALES PARA INOCULAR ANIMALES:

Equipamiento:

Hay que utilizar una aguja o lanceta esterilizada para pinchar la piel y el vaso sanguíneo subyacente. No es recomendable utilizar una hoja de escalpelo (bisturí) ya que su uso es impreciso y puede ocasionar una mutilación accidental del animal o de la persona, si el animal no está adecuadamente sujeto. Lugar:

Para familiarizarse con la ubicación de una vena, se recomienda encarecidamente estudiar primero la anatomía correspondiente en los animales muertos, para evitar tener que realizar repetidas entradas fallidas a la hora de encontrar un vaso sanguíneo. Un lugar habitual para practicar la punción venosa en un animal pequeño es la vena coccígea o de la cola. En pequeños roedores, la extremidad de la cola puede ser amputada y en el caso de los ratones- a diferencia de las ratas- no parece implicar la eliminación de ninguna vértebra coccígea. El corte de la cola tiene que realizarse una sola vez o dos como máximo. (En ratas topo desnudas se puede hacer pequeñas extirpaciones al final de la cola, que vuelve a crecer en 4-6 semanas y entonces puede realizarse de nuevo.) En pequeños animales sin cola, como los cobayas y hámsteres, se puede utilizar la vena yugular o la de la oreja, pero requiere gran habilidad; en estos mamíferos, la punción cardiaca con anestesia general puede ser el método más adecuado. En animales grandes es más probable que una pequeña muestra se tome directamente de una vena superficial. En las aves, puede practicarse la punción en las barbas, crestas y moco, en el caso del pavo. La utilización de las almohadillas plantares para la obtención de sangre no es aceptable debido a la sensibilidad de la zona y el riesgo de infección,

ya que los Animales de Laboratorio habitualmente se guardan cerca, o en lechos contaminados por orina y heces. La infección puede causar  cojera y sufrimiento innecesario. Preparación Del Lugar 

Es importante mantener una antisepsia completa a lo largo del muestreo, de forma que todo pelo o resto de piel superficial de encima de la vena, sea retirado. El método para eliminar el pelo dependerá de la localización de la vena y de la especie animal. El pelo se puede eliminar a tirones, con tijeras curvas o con esquiladora. Retirar el pelo a tirones puede realizarse fácilmente en los gatos y conejos sin causar sufrimiento al animal. Las cremas depilatorias químicas pueden aplicarse en zonas difíciles pero generalmente no se recomiendan ya que pueden provocar reacciones en la piel y contaminar  las muestras. Algunos animales tales como los gatos, pueden incomodarse con el ruido producido por las esquiladoras eléctricas. Hay que tener en cuenta también, que las pieles de algunos animales, por  ejemplo la de los conejos, son finas y sensibles. No es recomendable afeitar con cuchilla, jabón y agua ya que causa más daño a la piel que el esquilar. Las excepciones dependerán de la experiencia del operador, de la soltura a la hora de esquilar y el efecto que pueda causar en los animales y de la calidad de la muestra requerida. La zona rasurada o de la que se ha retirado el pelo a tirones deberá ser  limpiada con agua templada, a la que se le puede añadir un detergente o desinfectante

como

la

cetrimida.

Estos

agentes

deberán

ser 

posteriormente retirados con agua para evitar la contaminación de la muestra. El alcohol (etanol 70% en agua) desengrasará efectivamente la piel de aquellas especies en las cuales la secreción de glándulas sebáceas sea pronunciada (por ejemplo en las ovejas), pero puede contaminar una muestra de sangre si no se le deja evaporar. Es casi imposible producir una superficie estéril y una Limpieza excesiva trastornaría el ecosistema bacteriano natural de defensa de la piel. La preparación puede tener entonces el efecto posterior de causar irritación, deshidratación de la piel e incomodidad del animal. Para disminuir toda molestia asociada a la punción venosa, algunos científicos han investigado recientemente el uso de cremas de anestesia local aplicadas sobre la piel unos 30-60 minutos antes de tomar la muestra. Parecen ser beneficiosas en la reducción de las molestias en especies como conejos, perros y gatos pero no son tan efectivas en ratas. La Toma De Muestra:

El animal debe estar suavemente sujeto por un manipulador experimentado que, siempre que sea posible, deberá ser conocido por los animales. No hay tampoco que sobre valorar el papel clave desempeñado por la persona que sujeta al animal y evidencia la vena. La vena debe localizarse claramente (si se tienen dudas, es mejor no hacerlo y buscar ayuda) y la punción llevada a cabo decididamente mejor que con vacilaciones. Puede que el animal muestre signos de incomodidad (¡como nosotros!) por ejemplo, puede chillar, pero se le debe tranquilizar, tratándole con suavidad y hablándole. Puede que se necesite alguna presión próxima al lugar de oclusión del retorno venoso con el fin de obtener suficiente volumen de sangre.

La gota de sangre formada puede retirarse con un tubo capilar o con una micropipeta con punta de plástico. Después de haber sacado la sangre, se debe mantener una presión suave pero firme sobre el lugar durante unos 30 segundos, lo que detendrá rápidamente cualquier sangrado. También hay varios preparados hemostáticos de alginato de calcio, fibrillas de colágeno y esponja gelatinosa que pueden servir de ayuda si persiste el sangrado.

CONEJO: 1. Los conejos no muerden con frecuencia pero pueden causar heridas con las uñas de sus patas. Sujételo de forma tal que las patas traseras estén lejos del cuerpo del operario. Sujetándolo por la piel sobre los hombros con la cabeza en dirección al operario es el mejor método de sujeción para un conejo. Cuando esté colgado, se debe sujetar la parte bajo del cuerpo con la otra mano. Ver figura 5.

Figura 5.- Métodos para la sujeción y transportación de conejos y su  colocación y ajuste en la jaula de restricción para tomas de sangre e inyecciones

2. Los conejos nunca deben ser levantados por las orejas. Si el conejo comienza a moverse violentamente y en rotación, debe colocarse rápidamente sobre una superficie plana y esperar a que se tranquilice. Este movimiento violento y en forma circular puede traer como consecuencia la fractura de una o más vértebras lumbares y daño fatal en la espina dorsal. 3. Los conejos pueden ser llevados a un estado de hipnosis cuando se les acaricia sobre su espalda y el abdomen. Durante la sujeción los conejos pueden intentar escapar de forma violenta y pueden dañarse con la aguja o cualquier otro instrumento pudiendo causar daños en el animal o el operario. Por lo tanto la sujeción firme debe realizarse antes de iniciar  el procedimiento experimental.

FLOCULACION La floculación es otro mecanismo que sirve para evidenciar reacción antígeno-anticuerpo in vitro y es considerada de interaccion secundaria porque no necesita ningún reactivo o sustancia biológica adicional para hacer visible la reacción. Este tipo de interacion se distingue en 2 etapas: la reacción primaria, no visualizable y la reacción secundaria, que sigue a la anterior, caracterizada por la aparición de un fenómeno visible, como es la floculación en este caso particular. La característica lipidica del antígeno es la condición que la hace ser una reacción de floculación. Los complejos antígeno-anticuerpo formados se agregan y sedimentan en un rango muy estrecho de su relación; y en la zona de exceso de antígeno y anticuerpo, solo se forman complejos solubles. La prueba de VDRL sirve para determinar los anticuerpos conocidos como reaginas. Estos son hetrerofilos, es decir, anticuerpos no específicos contra el treponem, quereacciona con antígenos lipidicos y que están presentes en personas infectadas por el, y los cuales tienen la capacidad de flocular frente al antígeno constituido por cardiolipina, lecitina y colesterol. Estos acnticuerpos se encuentran en el suero de personas que presentan variadas entidades clínicas como sífilis, paludismo, TBC, enfermedades del colágeno, y, además en sujetos normales, en condiciones de embarazo y en pacientes de edad avanzada o recientemente vacunados.

OBJETIVOS Aprender el proceso de inmunización, como también la técnica para la realización de antígenos. Manipular correctamente al conejo, inmunizarlo por via intravenosa, extraerle sangre (oreja, arteria central). Lograr crear anticuerpos contra el antígeno Salmonella, en el conejo mediante diferentes inmunizaciones. Conocer y aplicar el método de floculación Observar la formación del floculo en la dilución de antígeno con suero problema.

METODOLOGIA 1.- Se toma al conejo, de manera que permita la extracción de suero negativo, se toma la oreja con cuidado, se limpia con alcohol la parte de la vena marginal , se introduce el bisel y se extrae la sangre. 2.- Esto se coloca en hielo, Se deja que se forme el coagulo, una vez formado, se centrifuga a 2000 rpm durante 5 minutos, se extrae el suero y se mete a refrigeración. 3.-Se prosigue ala preparación del antígeno. se toma con ayuda de una asa , una colonia de la cepa de salmonella sp se coloca en un tubo de ensaye que contiene un volumen de 16 ml. De solución salina estéril. Se disuelve hasta obtener una turbidez del tubo número 2 de mc farland. Una vez obtenida la turbidez se esteriliza 15 min. A 15 libras. Se coloca 2ml de antígeno en cada uno de los viales, se etiquetan y se guardan a -20 °C hasta su posterior uso. •

4.-Se prosigue al protocolo de inmunización el cual se realiza de la siguiente manera: INYECCION N° TIEMPO (DIA) DOSIS (ml) VIA 1 0 0.5 IV 2 4 1.0 IV 3 8 2.0 IV 4 12 3.0 IV SANGRADO 18 5.- Ya terminada la inmunización se prosigue a extraer el suero con anticuerpos, se extrae de la siguiente manera, se toma la oreja del animal, se limpia con una torunda, se introduce el bisel y se extrae la sangre. Esto se realiza en hielo, Se prosigue a que se forme el coagulo se centrifuga a 2000 rpm durante cinco minutos, se obtiene el suero , se coloca en un tubo y se refrigera.

FLOCULACIÓN

COLOCAR 1 GOTA(FLOCULACIÓN) DE ANTÍGENO + 1 PROCEDIMIENTO GOTA DE SUERO PROBLEMA

AGITAR Y OBSERVAR EN EL MICROSCOPIO

✔

a si mismo se realizo la combinación de tífico “o” y tífico “h” con el suero, despositando 1 gota de cada uno de ellos.

OBSERVACIONES

Durante todo el proceso de la práctica se observo lo siguiente: 



     

H”

Al realizar el sangrado para obtener el suero negativo, fue dificultoso obtenerlo ya que el conejo movía mucho la oreja, por lo cual se obtuvo 1 ml. De sangre. Para inmunizar al conejo, en lo que fue la primera inmunización fue dificultoso ya que como no teníamos práctica se nos complico inmunizar al conejo. ´para lo que fue nuestro antígeno particulados, se tuvieron algunos contratiempos con las cepas, pero esto fue resuelto. Durante el protocolo de inmunización se observo lo siguiente. Primer inyección: se le inyecto 0.5 ml al conejo después de esto, el conejo presento fiebre, diarrea, además de que se puso triste. Segunda, tercera y cuarta inyección el animal se encontró bien. Para la obtención de suero final, también bien fue dificultoso extraer sangre del conejo, únicamente se extrajeron 0.5 de suero. Al momento de realizar la reacción suero antígeno se observo la formación floculos.

sin reactivo

Tífico “ O ”

RESULTADOS

Tífico “

Durante la realización de la práctica, se obtuvo 0.2 aproximadamente de suero control. En la realización del antígeno, se obtuvieron 8 viales cada uno con 2 ml. De antígenos (salmonella sp). El suero negativo y los viales se guardaron el un refrigerador a -20°C, para su conservación. El día de la práctica se realizo en una placa de vidrio la reacción antígeno anticuerpo para valorar si en sistema inmunológico del conejo produjo anticuerpos para el antígeno (salmonella sp). Al momento de colocar una gota de antígeno y un a de anticuerpo, se observo la formación de floculos. Después se observo al microscopio con el objetivo de 10 y se observo la aglutinación demostrándonos que si hubo producción de anticuerpos. Después se realizo la reacción del reactivo tífico “ O ” y tífico “H”, con una gota de anticuerpos, dándonos más afinidad hacia el tífico “ O ”.

DISCUSION ✔

De acuerdo a lo consultado en la literatura esta nos indica que ante la presencia de un antígeno en el organismo nuestro sistema inmune desencadena una serie de respuestas inmunes, provocando una producción de anticuerpos de distinto isotipo. Esto se corroboro mediante la inmunización de un antígeno ( salmonela sp.) en el conejo, obteniendo un suero final el cual contenía anticuerpos específicos para el antígeno inmunizado mediante reacción de floculación.

✔

Asi como también la bibliografía nos indica que los antígenos particulados tienen la capacidad de formar flocuos al estar en contacto con un anticuerpo especifico para él. Hubo formación de floculo debido a la formación de complejos inmunes (antígeno-anticuerpo).

CONCLUSIONES

Terminada esta practica podemos decir fue un éxito, pues se obtuvieron los resultados esperados. Además: Aprendimos a inmunizar al conejo mediante vía intravenosa (oreja), y a crear antígenos. Con ayuda de la escala de Mc Farland Aprendimos a manipular de la forma mas adecuada a nuestro conejo, le extrajimos sangre (oreja, arteria central). En dos ocasiones. Cabe mencionar que este ultimo proceso si se nos dificulto un poco, pues que el conejo presentaba mucha resistencia y brincaba, provocando así que no lo sangráramos bien. Se logró crear anticuerpos contra el antígeno Salmonella, puesto que si observamos el floculo en el microoscopio mediante la disolución del antígeno con el suero problema, es decir si se realizo de manera correcta la inmunización. Conocimos y aplicamos el método de floculación.

BIBLIOGRAFÍA •

http://www.secal:

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http://meusite.com.br/COBEA

Peter J. Delves, Ivan M. Roitt. The immune system (First of two parts). N Engl J Med. 343(1): 37-49, 2000. Peter J. Delves, Ivan M. Roitt. The immune system (Second of two parts). N Engl J Med. 343(2): 108-117, 2000. Mark J. Walport. Complement (First of two parts). N Engl J Med. 344(14): 1058-1066, 2001. Mark J. Walport. Complement (Second of two parts). N Engl J Med. 344(15): 1140-1144, 2001. •