Manuel Micro 2012

http://mysite.science.uottawa.ca/jbasso/microlabo/accueil.htm Labo de Microbiologie-2012

1

Labo de Microbiologie-2012

Horaire ............................................................................................................................................ 5 BARÈME ........................................................................................................................................ 6 LABO NO 1 ..................................................................................................................................... 7 DILUTIONS ET CONCENTRATIONS ........................................................................................ 7 POURCENTAGE ..................................................................................................................... 7 POURCENTAGE PAR POIDS/VOLUME ............................................................................. 8 MOLARITÉ.............................................................................................................................. 9 POIDS/VOLUME .................................................................................................................... 9 LES DILUTIONS EN SÉRIE: PRÉPARATION POUR LE LABO No2 .............................. 12 PRÉPARATION DE MILIEUX: LES CONCENTRATIONS .............................................. 12 LABO NO 2 ................................................................................................................................... 14 INTRODUCTION AU TRAVAIL DANS LE LABO DE MICROBIOLOGIE .......................... 14 MILIEUX MICROBIOLOGIQUES ...................................................................................... 14 LA TECHNIQUE ASEPTIQUE ............................................................................................ 15 INOCULATION DES MILIEUX SOLIDES : STRIES (Individuellement) ......................... 15 INOCULATION DES MILIEUX SOLIDES: STRIES POUR COLONIES SIMPLES ....... 17 TECHNIQUES MICROBIOLOGIQUES DE BASE POUR ÉCHANTILLONNER L’ENVIRONNEMENT .......................................................................................................... 19 LES BACTERIES PRESENTES DANS UNE VOIE NAVIGABLE ................................... 19 METTRE DES BACTÉRIES SUR GÉLOSE : ÉTALEMENT ............................................. 19 ASSEMBLAGE DES CONDITIONS DE BIOREMÉDIATION .......................................... 21 VISUALISATION MACROSCOPIQUE- MORPHOLOGIES COLONIALE ..................... 22 DÉNOMBRER LES BACTÉRIES ........................................................................................ 23 VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATIONS SIMPLES (Groupes de 2) ...... 23 MORPHOLOGIES CELLULAIRES ..................................................................................... 25 LABO NO 3 ................................................................................................................................... 26 DÉNOMBRER LES BACTÉRIES .............................................................................................. 26 COMPTES VIABLES ............................................................................................................ 26 LES COMPTES LES PLUS PROBABLES ........................................................................... 27 COMPTES DIRECTS ............................................................................................................ 28 COMPTE LES PLUS PROBABLES ..................................................................................... 30 VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATION DE GRAM ............................... 34 VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATION ACIDO-RÉSISTANTE............ 36 VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATION DES SPORES .......................... 37 LABO NO 4 ................................................................................................................................... 39 LES MILIEUX DE CROISSANCE ET LES BACTÉRIES DU SOL ......................................... 39 BACTÉRIES DU SOL ........................................................................................................... 40 LES BACTÉRIES DANS DU COMPOST ............................................................................ 41 COMPTE DE BACTÉRIES AÉROBIES HÉTÉROTROPHES ............................................ 41 COMPTE DE BACTÉRIES ANAÉROBIES HÉTÉROTROPHES ...................................... 41 COMPTE DE BACTÉRIES GRAM NÉGATIVES ET POSITIVES .................................... 42 CYCLE DE L'AZOTE............................................................................................................ 43 BACTÉRIES QUI FIXENT L'AZOTE .................................................................................. 44 BACTÉRIES NITRIFIANTES .............................................................................................. 44 L'ASSIMILATION DU CARBONE ...................................................................................... 45 2

Labo de Microbiologie-2012 BACTÉRIES QUI DÉGRADENT L'AMIDON .................................................................... 45 BACTÉRIES QUI DÉGRADENT LA GÉLATINE .............................................................. 46 ISOLATION DE BACILLES INCONNUS GRAM POSITIFS ............................................ 49 LABO No 5 ................................................................................................................................... 51 DIAGNOSTIC BACTÉRIEN – BACTÉRIES GRAM POSITIVES ........................................... 51 IDENTIFICATION DE BACILLES GRAM POSITIFS ....................................................... 51 MORPHOLOGIE COLONIALE ........................................................................................... 51 COLORATION DE GRAM ................................................................................................... 51 MÉTABOLISME DE SOURCES DE CARBONE SIMPLES .............................................. 52 FERMENTATION DU GLUCOSE: PRODUCTION D'ACIDES MIXTES OU D'ACÉTOINE ......................................................................................................................... 53 URÉASE ................................................................................................................................. 53 L'UTILISATION DU CITRATE COMME SOURCE DE CARBONE ................................ 54 UTILISATION DE SOURCES DE CARBONE COMPLEXES: ENZYMES EXOCELLULAIRES ............................................................................................................. 54 RÉDUCTION DU NITRATE ET DU NITRITE ................................................................... 54 TOLÉRANCE À DES CONCENTRATIONS ÉLEVÉES DE SELS .................................... 55 CYTOCHROME OXYDASE ................................................................................................ 56 LA MOTILITÉ BACTÉRIENNE .......................................................................................... 56 CATALASE ........................................................................................................................... 57 IDENTIFICATION DES COCCI GRAM POSITIFS; FAMILLES DES MICROCOCCACEAE ET DES STREPTOCOCCACEAE .................................................. 58 Les Micrococcaceae ............................................................................................................... 58 Les Streptococcaceae ............................................................................................................. 58 DIAGNOSTIC DE COCCI GRAM POSITIF CATALASE NÉGATIF ................................ 59 HÉMOLYSE SANGUINE ..................................................................................................... 59 BILE-ESCULINE ................................................................................................................... 60 SENSIBILITÉ À LA BACITRACINE ET À L’OPTOCHINE ............................................. 60 DIAGNOSTIC DES MICROCOCCACEAE .......................................................................... 61 GÉLOSES DE MANNITOL + SELS .................................................................................... 61 AGAR DE TELLURITE OU AGAR DE BAIRD PARKER ................................................ 61 SENSIBILITÉ À LA NOVOBIOCINE ................................................................................. 61 COAGULASE ........................................................................................................................ 67 TEST DE COAGULASE SUR LAME .................................................................................. 67 LABO NO6 .................................................................................................................................... 69 CONTRÔLE DE LA CROISSANCE MICROBIENNE .............................................................. 69 COMPOSÉS ANTIBACTÉRIENS - ANTIBIOTIQUES ...................................................... 69 ESSAI DE DIFFUSION DE KIRBY-BAUER ...................................................................... 69 DÉTERMINATION DE LA DOSE THÉRAPEUTIQUE ..................................................... 70 DÉSINFECTANTS & ANTISEPTIQUES ............................................................................ 72 L'EFFICACITÉ DES SAVONS À MAINS ........................................................................... 72 DÉTERMINATION DE LA DOSE THÉRAPEUTIQUE ..................................................... 75 L'EFFICACITÉ DES SAVONS À MAINS ........................................................................... 76 CINÉTIQUE DE MORTALITÉ ............................................................................................ 76 LABO NO 7 ................................................................................................................................... 78 MICROBIOLOGIE DE L’EAU ET DES ALIMENTS................................................................ 78 3

Labo de Microbiologie-2012 QUALITÉ MICROBIOLOGIQUE DE L’EAU ..................................................................... 78 MICROORGANISMES INDICATEURS D’UNE CONTAMINATION FÉCALE ............. 78 ANALYSE QUALITATIVE STANDARD DES EAUX POUR DES COLIFORMES ........ 79 TEST DE COLIFORME PRÉSOMPTIF ............................................................................... 79 ANALYSE QUANTITATIVE STANDARD DE L’EAU POUR DES COLIFORMES ...... 81 ANALYSE QUALITATIVE STANDARD DE L'EAU POUR STREPTOCOQUES FECAUX ................................................................................................................................ 81 TEST DES ENTÉROCOQUES ............................................................................................. 82 QUALITÉ MICROBIOLOGIQUE DES ALIMENTS .......................................................... 83 SALMONELLOSE ................................................................................................................ 83 BACTÉRIES GRAM NÉGATIVES ET LES INFECTIONS ALIMENTAIRES ................. 85 TEST DE COLIFORME CONFIRMÉ................................................................................... 87 STANDARDS DE QUALITÉ MICROBIOLOGIQUE DE L’EAU EN ONTARIO ............ 87 ESSAI DE SALMONELLA CONFIRMÉ ............................................................................. 88 STANDARDS DE QUALITÉ MICROBIOLOGIQUE DU POULET CRU ........................ 88 COLORATIONS DE GRAM ET ISOLATION D’INCONNUS GRAM NÉGATIFS ......... 89 LABO NO8 .................................................................................................................................... 91 DIAGNOSTIC BACTÉRIEN – BACTÉRIES GRAM NÉGATIVES ........................................ 91 Les Enterobacteriaceae .......................................................................................................... 91 Les Pseudomonaceae ............................................................................................................. 91 Les Nesseriaceae .................................................................................................................... 91 DIAGNOSTIQUE D’INCONNUS GRAM NÉGATIFS ....................................................... 92 COLORATION DE GRAM ................................................................................................... 92 OXYDASE ............................................................................................................................. 92 CROISSANCE SUR MILIEU MACCONKEY ..................................................................... 92 L'UTILISATION DU CITRATE EN TANT QUE SOURCE DE CARBONE ..................... 92 URÉASE ................................................................................................................................. 92 CROISSANCE EN MILIEU TSI (TROIS SUCRES ET FER) ............................................. 93 SIM: PRODUCTION DE SULFIDE D’HYDROGÈNE, D’INDOLE ET LA MOTILITÉ .. 94 PRODUCTION DE H2S ......................................................................................................... 94 MOTILITÉ ............................................................................................................................. 94 PRODUCTION D'INDOLE SUITE À LA DÉGRADATION DU TRYPTOPHANE .......... 94 LES DÉCARBOXYLASES D’ORNITHINE ET DE LYSINE ............................................. 94 API 20E SYSTÈME ENTEROBACTERIACEAE ................................................................ 95 LABO NO 9 ................................................................................................................................. 104 HÉMATOLOGIE/ SÉROLOGIE ............................................................................................... 104 SÉROLOGIE MICROBIENNE ........................................................................................... 104 ELISA ................................................................................................................................... 104 L'HÉMATOLOGIE .............................................................................................................. 108 COMPTE DE GLOBULES ROUGES ................................................................................. 108 L'HÉMATOCRITE .............................................................................................................. 110 VOLUME CELLULAIRE MOYEN (VCM) ....................................................................... 111 LES LEUCOCYTES ............................................................................................................ 112

4

Labo de Microbiologie-2012

Horaire Labo 1 Labo 2 Labo 3 Labo 4 Labo 5 Labo 6 Labo 7 Labo 8 Labo 9

Dilutions et concentrations Introduction au travail dans le labo de microbiologie Compter les bactéries Les milieux de croissance et les bactéries du sol EXAMEN DE MI-SESSION Diagnostic bactérien – Bactéries Gram positives SEMAINE D’ÉTUDE Contrôle de la croissance microbienne Microbiologie de l’eau et des aliments Diagnostic bactérien – Bactéries Gram négatives Hématologie/Sérologie EXAMEN PRATIQUE EXAMEN FINAL

5

11 et 13 sept. 18 et 20 sept. 25 et 27 sept. 2 et 4 oct. 11 oct. 16 et 18 oct. 21 au 27 oct. 30 oct. et 1 nov. 6 et 8 nov. 13 et 15 nov. 20 et 22 nov. 29 nov. 1 dec.

Labo de Microbiologie-2012

BARÈME Quiz Devoirs Examen de mi-session Examen pratique Examen final

5 20 30 15 30

6

Labo de Microbiologie-2012 LABO NO 1 DILUTIONS ET CONCENTRATIONS

Jour 1 Une propriété très importante au sujet des solutions qui doit être adressée c’est la concentration. En général, la concentration indique la quantité d’un soluté dans une quantité donnée d’une solution. Pour travailler avec des concentrations, vous devez comprendre la distinction entre le soluté, le solvant et la solution. Puisque différentes quantités de solutés peuvent être dissoutes dans une solution, la concentration est une propriété variable. Nous avons donc besoin d’une façon numérique pour indiquer comment concentrée est une solution. Une variété de différentes façons existent pour calculer et exprimer les concentrations des solutions. Ceci peut être fait par pourcentage en utilisant des mesures du poids (masse) ou le volume ou les deux. Alternativement, on peut aussi utiliser des mesures qui sont propres à la façon que les composés chimiques réagissent entre eux (moles). Dans les pages qui suivent, plusieurs types de concentrations seront présentés. Elles incluent le pourcentage par volume, le pourcentage par poids, le pourcentage du poids/volume, la molarité (l’utilisation principale des concentrations chimiques) et poids/volume. Vous obtiendrez de l’expérience avec plusieurs des façons d’établir la concentration d’une solution. Vous pouvez préparer une solution à partir des matières brutes et mesurer chacune des composantes qui doivent être présentes dans la solution. Vous pouvez préparer une solution en diluant une solution préexistante. POURCENTAGE L’utilisation des pourcentages est une façon commune d’exprimer la concentration d’une solution. C’est une approche simple qui indique la quantité d’un composé par 100. Les pourcentages peuvent être calculés en utilisant les volumes ainsi que les poids, ou les deux. Une façon, que vous connaissez, sans doute, d’exprimer les concentrations est le pourcentage par volume. Une autre façon est le pourcentage par poids. Enfin, une autre façon est un hybride appelé le pourcentage par poids/volume. Le pourcentage par volume est habituellement utilisé quand la solution est préparée en mélangeant deux liquides.

Par exemple, l’alcool à friction est habituellement 70% par volume d’alcool isopropyl. Ceci veut dire que 100 ml de solution contient 70 mL d’alcool isopropyl. Ceci veut aussi dire qu’un litre (ou 1000 ml) de cette solution contient 700 mL d’alcool isopropyl et assez d’eau pour compléter le volume à un total de 1 litre ou 1000 ml.

Pourcentage par volume =

volume du soluté volume de solution 7

x 100

Labo de Microbiologie-2012 Le pourcentage par poids est une façon d’exprimer la concentration d’une solution comme le poids du soluté/poids de la solution. Pourcentage par poids =

Poids du Poids de la solution

soluté

x 100

À titre d’exemple, considérons une solution 12 g NaCl 12 % NaCl solution = de 12% NaCl par poids. Une telle solution 100 g solution aurait 12 grammes de NaCl pour chaque 100 grammes de solution. Pour préparer une telle solution, vous pourriez peser 12 grammes de NaCl, et ensuite ajouter 88 grammes d’eau, 12 g NaCl afin que la masse totale de la solution soit de = 12% NaCl solution (12 g NaCl + 88 g eau) 100 grammes. Puisque les masses sont conservées, les masses des composantes de la solution s’additionneront à la masse totale de la solution. Afin de calculer le pourcentage par poids ou le pourcentage par masse d’une solution, vous devez diviser la masse du soluté par la masse de la solution (la somme combinée de la masse du soluté et du solvant) et ensuite multipliée par 100 pour la changer en pourcentage. POURCENTAGE PAR POIDS/VOLUME Une autre variante des concentrations par pourcentage est le pourcentage poids/volume ou le pourcentage masse/volume. Cette variante mesure la quantité de soluté en grammes, mais mesure la quantité de la solution en millilitres. Un exemple serait une solution de 5% NaCl (m/v). Elle contient 5 g de NaCl pour chaque 100 ml de solution. Pourcentage par volume =

Poids du soluté (en g) Volume de solution (en mL)

x 100

Cette façon est la manière la plus couramment utilisée dans ce cours pour exprimer les solutions en pourcentages.

8

Labo de Microbiologie-2012 MOLARITÉ Une autre façon d’exprimer une concentration s’appelle la molarité. La molarité c’est le nombre de moles de soluté moles de soluté dissout dans un litre de solution. Les Molarité = litre de solution unités sont donc moles par litre, plus précisément, c’est les moles de soluté par litre de solution. Plutôt d’écrire moles par litre, l’abréviation ―M‖ est utilisée pour ces unités. Alors, quand vous voyez la lettre M cela signifie molarité et représente moles par litre (pas seulement moles). Vous devez faire très attention de distinguer entre moles et molarité. "Moles" est une mesure de la quantité que vous avez d’une composante; "molarité" mesure la concentration de la composante. Alors quand un problème vous est donné, qui stipule que la concentration d’une solution est 0.1 M, ceci veut dire qu’elle possède 0.1 mole pour chaque litre de solution; cela ne veut pas dire que c’est 0.1 mole. POIDS/VOLUME Cette façon d’exprimer une concentration est très semblable à celle des pourcentages et représente une des façons les plus populaires utilisées par les biologistes moléculaires. Contrairement au pourcentage, la concentration est exprimée par quelconque volume l’utilisateur désire utiliser. Plus communément, ces concentrations sont exprimées par une unité de mesure. Par exemple, par 1 ml ou 1 µL ou 1L, etc. Essentiellement, ces expressions représentent la masse d’un soluté dans une quantité donnée de la solution. Par exemple, une solution qui est à une concentration de 1mg/ml contient 1mg de soluté dans 1 ml de solution. La formulation des dilutions est essentielle dans tous les domaines des sciences ainsi que dans la vie de tous les jours. Les dilutions servent à réduire de façon précise la concentration d'éléments, soit chimiques ou vivants, se retrouvant en solution. Par exemple, si vous désirez réduire la concentration de matières grasses dans du lait de 3.5% à 0.35%, vous devrez effectuer une dilution de facteur 10. La compréhension de la formulation des dilutions comporte trois concepts. La concentration, le facteur de dilution, et la dilution. La concentration se définit comme la quantité d'un composé pour un volume total de solution. Puisqu'une quantité peut être exprimée de plusieurs façons, les concentrations sont exprimées comme l'unité de mesure de la quantité du composé/volume total et final. Ex. Gram/Litre Molécules/Litre Moles/Litre Nombre d'organismes/Litre Etc.

9

Labo de Microbiologie-2012 Le facteur de dilution représente la multiple arithmétique par laquelle une concentration initiale doit être divisée afin d'obtenir la concentration finale. Par exemple, si une solution contient 30 grammes de caféine par 1L de solution et que vous désirez réduire la concentration de caféine à 0.3 Gramme/Litre vous devrez diviser la concentration initiale par 100, le facteur de dilution. Vous pouvez utiliser la formule suivante afin de déterminer un facteur de dilution. Le facteur de dilution = Concentration initiale Concentration finale La dilution représente la fraction du composé étant examiné. Par exemple, dans le problème précédent, une dilution de 1/100 a été effectuée. La dilution est exprimée comme une fraction de 1 sur le facteur de dilution. Afin de correctement préparer des dilutions, vous devez apprendre à utiliser les pipettes de façon appropriée. Voici quelques directives générales : Choisir la pipette dont la capacité se rapproche le plus du volume désirez. Par exemple, pour faire la mesure de 0.1ml il est préférable d’utiliser une pipette de 1.0 ml plutôt qu’une de 10ml. Minimiser le nombre de pipetages afin de minimiser les chances de faire des erreurs. Par exemple, si vous désirez distribuer 1 ml dans dix éprouvettes il est préférable de pipetter 10ml une fois et de distribuer 1 ml dix fois plutôt que de pipetter 1 ml dix fois et de distribuer 10 fois. Changer de pipette pour chaque solution différente. Faire des transferts en série : quand vous faites des transferts en série telle que pour les dilutions en série, il n’est pas nécessaire d’utiliser plusieurs pipettes. Utiliser les directives suivantes afin de minimiser le nombre de pipettes utilisées :

Source

Passer d’une concentration plus élevée à une solution de concentration plus faible : Pipeter le volume désiré de la source puis livrer à la nouvelle éprouvette (« A » dans l’image ci-dessous). Rincer la pipette de haut en bas plusieurs fois (dans « A » dans l’image ci-dessous). Pipetter le volume désiré de cette éprouvette (« A ») puis livré dans la prochaine éprouvette (« B »). Répéter cette procédure de « A » à « B » avec la même pipette.

A

B

C

10 Livrer puis rincer la pipette dans cette éprouvette avant de faire la prise du volume désiré de cette nouvelle solution.

Labo de Microbiologie-2012 Passer d’une concentration moindre à une solution de concentration plus élevée : dans ce cas-ci le pipetage et plus facile. Utiliser tout simplement la même pipette pour le transfert du volume voulu d’une solution de concentration moindre à une solution de concentration plus élevée. Aucun équilibrage ou de rinçage n’est requis dans ce cas-ci. Calcul des dilutions en série Les dilutions sont essentiellement des fractions et suivent donc les mêmes principes arithmétiques. Ceci étant dit, la dilution (ou la fraction) indique quelle fraction du total est représentée par le composé étant dilué. Ex. Vous désirez diluer une solution par un facteur de 4. Pour ce faire, la fraction est donc 1/4; c.à-d. qu’un quart du volume total doit être représenté par la chose étant dilué. Donc, deux fractions qui sont égales, par exemple 2/4 et 4/8 représentent les mêmes dilutions et facteurs de dilutions. Préparation des dilutions : Les choses que vous devez déterminer avant de préparer une dilution sont quel est le volume total final que je désire, quel est le facteur de dilution désiré et quelle est la concentration finale que je désire (si celle-ci est connue). Par exemple, je désire avoir un volume final de 50 ml et un facteur de dilution de 4X. La fraction désirez est donc 1/4 où le dénominateur représente le total. Puisque je désire un volume final de 50ml, 1/4 du 50 doit être le composé étant dilué; donc 12.5. Ce que ceci signifie est que 1/4 = 12.5/50. Donc pour préparez cette dilution vous ajouteriez 12.5 ml de la solution à être dilué dans (50 ml -12.5 ml = 37.5 ml) de solvant. Si vous connaissez la concentration finale que vous désirez, vous pouvez utiliser la formule suivante pour déterminer quel volume de la solution mère de diluer : Concentration que vous voulez Concentration que vous avez

X

Le volume final désiré

=

Le volume de la solution mère à ajouter au mélange

Les dilutions en séries sont toutes simplement des dilutions séquentielles où la solution mère utilisée pour chaque dilution représente la dilution précédente. La dilution finale pour la série est le produit de chacune des dilutions individuelles. Dil. finale = Dil.1 X Dil. 2 X Dil. 3 etc.

11

Labo de Microbiologie-2012 LES DILUTIONS EN SÉRIE: PRÉPARATION POUR LE LABO No2 La semaine prochaine, vous diluerez des échantillons d'eau pour déterminer le nombre de bactéries. Votre matériel initial sera de l'eau d'un cours d'eau navigable que vous devrez diluer par 105X. Celles-ci doivent représenter des dilutions de 10X. Rédiger une méthode sur la façon dont celles-ci doivent être préparées. Utilisez des schémas et des instructions détaillées qui pourront être suivis par tout étudiant. Matériaux Éprouvettes stériles Eau stérile Échantillon d’eau PRÉPARATION DE MILIEUX: LES CONCENTRATIONS Pour vous familiariser avec la formulation de divers milieux de croissance, vous devrez préparer différents milieux de croissance qui seront utilisez pour certaines expériences au labo no4. RECETTES Milieu d’ammonium Ammonium sulfate 2.0g MgSO4 4mM NaCl 0.002g/ml K2HPO4 7mM CaCO3 0.5% (m/v) Microéléments 1X Eau 1L

Milieu d’essai de fixation d’azote Glucose 1% (m/v) CaCl2 5mg/ml K2HPO4 7mM MgSO4 4mM Microéléments 1X Eau 1L

Compléter et soumettre le tableau suivant Milieu d’ammonium Ingrédient Conc. stock Ammonium Sulfate MgSO4 20% (m/v) NaCl 20% (m/v) K2HPO4 0.5M CaCO3* Eau * Ajouter après la stérilisation

Conc. Finale 2g/L 4mM 2.0mg/ml 7mM 0.5% (m/v)* -

Quantité

Compléter à 200 ml

Milieu de fixation d’azote Ingrédient Conc. stock Conc. Finale Quantité Glucose 1% (m/v) CaCl2 10% (m/v) 5mg/ml K2HPO4 10% (m/v) 7mM MgSO4 1M 4mM Microéléments* 100X 1X Eau Compléter à 200 ml *Microéléments: 100 X (0.1% FeSO4 + 0.05% Na2MoO4); Ajouter après la stérilisation 12

Labo de Microbiologie-2012

Jour 2 Compléter et soumettre pour la fin de cette période de laboratoire la partie I du premier devoir.

13

Labo de Microbiologie-2012 LABO NO 2 INTRODUCTION AU TRAVAIL DANS LE LABO DE MICROBIOLOGIE

Jour 1 Plusieurs faits doivent être considérés avant de se lancer dans l’étude des microorganismes. Premièrement, les microorganismes sont très petits. Ainsi, à moins qu'un très grand nombre de cellules (de l'ordre de plusieurs millions) ne soient présentes dans un petit secteur, les microorganismes ne peuvent pas être observés à l’œil nu. Dans leurs milieux naturels, non seulement le nombre de microorganismes est-il relativement bas, mais en outre plusieurs espèces cohabitent habituellement au même endroit. Par exemple, le bout de vos doigts est probablement recouvert d’au moins dix différentes espèces microbiennes à des niveaux relativement bas (de l'ordre de quelques centaines à quelques milliers). De plus, les conditions optimales requises pour la croissance d'une espèce microbienne donnée (par exemple les exigences d'alimentation, de température, de pH, etc.) sont extrêmement diverses. En tenant compte de ces caractéristiques, les microbiologistes ont développé plusieurs stratégies aptes à permettre l'étude des microorganismes. MILIEUX MICROBIOLOGIQUES Il est habituellement peu pratique d'étudier un microorganisme dans son environnement naturel. Par exemple, il serait impensable d’examiner l'effet d'un antibiotique nouvellement développé sur la croissance d'un pathogène bactérien chez l’être humain. En outre, l'effet sur l’espèce bactérienne visée serait difficile à interpréter compte tenu de l'hétérogénéité des populations bactériennes présentes. Par conséquent, des méthodes ont été établies pour croitre les bactéries en laboratoire en utilisant une variété de milieux de croissances, synthétiques ou non. Les milieux de croissances sont disponibles sous forme liquide, semi-solide ou solide. Des milieux de culture semi-solides et solides sont obtenus en ajoutant au milieu de croissances liquides des agents de solidification. L'agent de solidification le plus commun est l’Agar, un polysaccharide dérivé d’une algue. L’Agar possède plusieurs propriétés avantageuses : 1) il est facilement liquéfiable par un chauffage à 100°C dans une solution aqueuse, 2) sa forme liquide est maintenue à des températures aussi basses que 45°C, 3) il se solidifie à des températures en dessous de 45°C et enfin, 4) la plupart des bactéries ne le digèrent pas. Un autre agent de solidification est la gélatine. Son utilisation est moins commune puisque plusieurs espèces bactériennes la digèrent. Les milieux de culture liquides sont souvent appelés "bouillons de culture". Les milieux solides peuvent être soit sous la forme de géloses ou de pentes. Tous les milieux de culture doivent inclure les substances nutritives nécessaires pour la croissance et la survie bactérienne. D'autres conditions, comme la température et la présence ou l'absence d'oxygène, sont contrôlées par des équipements spéciaux, comme un incubateur à température contrôlée. L'utilisation de conditions appropriées permet au microbiologiste de croitre et de maintenir les espèces bactériennes à l'étude.

14

Labo de Microbiologie-2012 LA TECHNIQUE ASEPTIQUE Dans le domaine de la microbiologie, la technique aseptique est une des procédures utilisées par les microbiologistes afin de prévenir la contamination de soi-même, ce qui pourrait mener à une infection, la contamination de l’environnement dans lequel ils travaillent et la contamination des matériaux ou des spécimens avec lesquels ils travaillent. Elle est utilisée dans tous les cas où un transfert de cultures ou de milieu microbiologique est impliqué. L’utilisation de la flamme d’un bruleur Bunsen est centrale à l’exécution de cette technique. Vous utiliserez cette technique tout au cours de la session et il est donc important pour vous de la maitriser. La technique aseptique vous sera démontrée pour l’utilisation de la boucle d’inoculation, des pipettes et de l’étaleur de verre. INOCULATION DES MILIEUX SOLIDES : STRIES (Individuellement) Les stries peuvent être faites à partir de milieu solide ou liquide, contrairement aux étalements qui sont toujours faits à partir d’un milieu liquide. L’instrument utilisé dans ce cas-ci est la boucle d’inoculation, qui est essentiellement un fil de fer utilisé pour faire la prise de bactéries. Ne pas confondre cet instrument avec l’aiguille d’inoculation qui possède une extrémité droite plutôt qu’une boucle.

Matériaux Gélose d’E.coli Une gélose TSA Une pente TSA Méthode 1. Avant d’utiliser la boucle, elle doit être stérilisée. Pour ce faire, placer la boucle dans la flamme du bruleur Bunsen jusqu’a ce quelle devienne rouge. Permettre à la boucle de refroidir pour une minute avant de l’utiliser. NE PAS LA DÉPOSER SUR LA TABLE.

2. Une fois refroidie, ramassé des bactéries de la culture sur gélose fournie. Attention de ne pas en ramasser trop. 3. Maintenant, strier la surface d’une nouvelle gélose telle qu’illustrée 4. Répéter pour inoculer la pente telle qu’illustrée. 15

Labo de Microbiologie-2012 5. Placer vos échantillons à l’endroit désigné pour qu’ils soient incubés à 37oC jusqu'à la prochaine période de labo.

Gélos e Pente

16

Labo de Microbiologie-2012 INOCULATION DES MILIEUX SOLIDES: STRIES POUR COLONIES SIMPLES (Individuellement) Faire des stries pour colonies simples est une méthode plus élaborée de stries utilisée pour générer des cultures pures où seulement qu’un organisme est présent. Il existe plusieurs méthodes différentes pour générer des cultures pures. Ces méthodes reposent généralement sur le principe de dilutions pour isoler l'organisme désiré de tous les autres. Prenons par exemple une population de millions d'individus à partir de laquelle vous ne voudriez en choisir qu'un seul. Si vous pouviez diviser la population de telle façon à ce qu'il y ait dans un secteur que quelques individus, il vous serait plus facile de choisir et d’isoler l'individu qui vous intéresse. Comme mentionnée ci-dessus, la dilution d’une culture hétérogène de départ génère habituellement des cultures pures. Les stries pour colonies simples permettent d’accomplir cela. La procédure est essentiellement comme suit : initialement, des bactéries sont ramassées d’un bouillon ou d’un milieu solide avec la boucle d’inoculation. Les bactéries sont ensuite striées sur une région de la gélose, ainsi là diluant. La boucle et ensuite stériliser encore une fois puis utilisée pour strier une nouvelle région de la gélose en ramassant des bactéries de la strie originale, la diluant donc encore plus. (Voir la figure ci-dessous). Notez : vous devez stériliser la boucle entre chaque série de stries et vous ne devez pas retourner à la source.

Faires des tries de gauche à droite pour recouvrir approximativement ¼ de la gélose. Restériliser la boucle d’ensemencement et la refroidir en touchant une partie libre de la gélose.

Tourner la gélose de 90o. Faire des stries de ¼ de la gélose en commençant par des stries qui traverse les stries originales au moins deux fois. Stériliser la boucle d’ensemencement encore une fois.

17 Répéter une troisième fois.

Labo de Microbiologie-2012 Matériaux Bouillon de culture mixte Gélose d’E.coli 2 géloses TSA (Jour 1) Méthode 1. Telle que précédemment, à l’aide de la boucle d’inoculation stérile ramasser un peu de bactéries de la culture sur gélose fournit et strier la gélose TSA comme illustrée dans le premier panneau de la figure sur la page précédente. SÉRILISER VOTRE BOUCLE après cette série de stries initiale. 2. Faire une deuxième série de stries avec la boucle stérile telle qu’illustrée. 3. Répéter autant de fois que possible en vous assurant de stériliser la boucle entre chaque série de stries pour isoler des colonies simples. 4. Sur une nouvelle gélose, répéter la procédure pour l’isolation de colonies simples à partir de bouillon de culture mixte. 5. Placer les deux isolations pour colonies simples à l’endroit désigné pour quelles soit incubées 37oC jusqu'à la prochaine période de labo.

18

Labo de Microbiologie-2012 TECHNIQUES MICROBIOLOGIQUES DE BASE POUR ÉCHANTILLONNER L’ENVIRONNEMENT Dans l'exercice suivant, vous initierez un projet à long terme concernant la biorémédiation. Chaque année, environ 100 millions de gallons de pétrole sont déversés dans l'environnement. Heureusement, en plus de l'intervention humaine, l'environnement contient des milliards de microorganismes qui travaillent à débarrasser l'eau de cette huile. Ces organismes microscopiques sont appelés bactéries oléophiles ou microbes qui consomment l'huile (OEM). Ce sont des bactéries qui utilisent normalement des huiles dans l'environnement comme source de nourriture. L’assainissement est défini comme un processus utilisé pour rendre l'environnement sécuritaire par l’absorption, la destruction, la neutralisation ou la fabrication de contaminants inoffensifs. Le processus d'utilisation de microbes pour décomposer les substances dangereuses (telles que le pétrole) en leurs éléments fondamentaux non toxiques est un exemple de biorémédiation. Dans les prochaines semaines, nous allons tenter d'enrichir pour, d'isoler, et partiellement identifier certains de ces OEM. LES BACTERIES PRESENTES DANS UNE VOIE NAVIGABLE (Groupes de 2) Des techniques microbiologiques de base seront utilisées pour poser des questions sur les bactéries présentes dans un cours d'eau et de déterminer si les résultats obtenus sont les mêmes sur différents milieux. Matériaux Échantillon d'eau d'un cours d'eau navigable (emplacement indiqué) Eau stérile Tubes stériles PRÉPARATION DE VOS DILUTIONS Méthode (voir la méthode élaborée la semaine dernière) 1. Utiliser un maximum de 0,5 ml de votre échantillon d'eau pour préparer une série de dilutions de facteurs 10 jusqu'à un facteur de dilution finale de 105 X. METTRE DES BACTÉRIES SUR GÉLOSE : ÉTALEMENT Contrairement aux stries, l’étalement est seulement utilisé avec des liquides. Il permet de répandre les bactéries de façon égale sur la surface d’une gélose. Par contre, contrairement aux stries, cette méthode ne permet pas à des dilutions d’être faites sur la gélose elle-même. Donc, si des dilutions sont requises, celles-ci doivent être faites au préalable. L’instrument utilisé est un étaleur de verre communément appelé « bâton de hockey ». Tout comme avec la boucle, l’étaleur doit être stérilisé préalablement à chaque utilisation.

Bâton de hockey

19

Labo de Microbiologie-2012 o STÉRILISATION DE L’ÉTALEUR Afin de stériliser l’étaleur, ce dernier est trempé dans l’éthanol, allumé, puis on laisse bruler l’éthanol. Ne pas garder l’étaleur dans la flamme, car il deviendra trop chaud! On permet ensuite à l’étaleur de refroidir, puis il est utilisé pour étaler l’échantillon de bactéries sur la surface de la gélose.

Éthanol Tremper l’étaleur dans l’éthanol

Allumer l’éthanol

Permettre à l’éthanol de bruler

Étaler les bactéries

Matériaux Dilutions d’eau préparées précédemment 6 Géloses TSA (Groupes pairs) 6 Géloses TSA + 0.1% glycérol (Groupes impairs) Méthode 1. Étiqueter de façon appropriée 6 géloses TSA. 2. Transférer et étaler 0.1ml de chacune de vos dilutions, incluant l’échantillon non dilué, aux géloses correspondantes. 3. Amener toutes vos géloses à l’endroit désigné pour qu’elles soient incubées à 28oC jusqu'à la prochaine période de labo. Incuber vos géloses dans l’orientation inversée.

20

Labo de Microbiologie-2012 ASSEMBLAGE DES CONDITIONS DE BIOREMÉDIATION Matériaux Échantillon d’eau d’une voie navigable Engrais pour plantes Huile de Canola (Gr. 1-4), huile de maïs (Gr. 5-8), huile d’arachides (Gr. 9-12), et huile diesel (Gr.13-16) Flacon de 250ml 1% (m/v) Solution de chlorure de triphenyltetrazolium (TTC) Méthode 1. Ajouter 50 ml de l’échantillon d’eau d’une voie navigable au flacon de 250ml. 2. Ajouter de l’engrais de plantes pour obtenir une concentration finale de 0.1% (m/v). 3. Ajouter du TTC pour obtenir une concentration finale de 0.01% (m/v). 4. Ajouter approximativement 10ml de l’huile assignée au flacon. La quantité exacte n’est pas importante, mais vous désirez avoir une quantité qui est suffisante afin d’obtenir une fine couche d’huile qui recouvre la surface. 5. Étiqueter de façon appropriée votre flacon avec votre numéro de groupe, votre section et le type d’huile. 6. Faire et enregistrer vos observations quant à l’apparence du mélange. Soyez aussi détaillé que possible. 7. Amener le flacon à l’endroit désigné pour qu’il puisse être incubé avec agitation à la température de la pièce (groupes pairs) ou à 40C (groupes impairs). 8. Faire les taches suivantes d’après cet horaire dans les semaines suivantes. Labo 3

25 & 27 sept.

Labo 4

2 & 4 oct.

Labo 5 Labo 6

16 & 18 oct. 30 oct. & 1 mai

Labo 7

6 & 8 nov.

Labo 8

13 & 15 nov.

Labo 9

20 & 22 nov.

Retirer 1ml et faire un entreposage à long terme Retirer 1ml et faire un entreposage à long terme. Inoculer nouveau milieu avec échantillon de 10ml Retirer 1ml et faire un entreposage à long terme Retirer 1ml et faire un entreposage à long terme faire des comptes viables sur tous les échantillons incluant celui prélevé cette semaine Choisir et strier pour colonies simples le type de colonie prédominant obtenu lors du dernier prélèvement Faire une coloration de Gram sur le type de colonie prédominant obtenu lors du dernier prélèvement Soumettre une proposition des tests a faire pour l’identification du genre Faire une deuxième coloration de Gram sur l’isolation de colonies simples Faire un deuxième striage pour colonies simples Préparer des cultures en bouillon à partir du deuxième striage pour colonies simples Faire les tests proposés pour l’identification du genre 21

Labo de Microbiologie-2012

Jour 2 STRIES POUR COLONIES SIMPLES 1. Obtenir et examiner vos géloses sur lesquelles vous avez fait vos stries pour colonies simples. Avez-vous obtenu des colonies isolées? 2. Demander à un aide enseignant d’évaluer vos stries pour colonies simples. 3. Comparer vos stries pour colonies simples aux stries régulières et vos pentes. VISUALISATION MACROSCOPIQUE- MORPHOLOGIES COLONIALE L’identification préliminaire des microorganismes peut être fondée sur la morphologie coloniale. Chaque colonie simple représente une population de cellules bactériennes originaire d'une seule et unique cellule qui, après de multiples cycles de division cellulaire, a généré une colonie de cellules s’empilant les unes sur les autres selon une forme caractéristique au type bactérien (tout comme un amas de bananes a une apparence différente d’un amas de pommes de terre). La morphologie d'une colonie bactérienne est une fonction de plusieurs facteurs tels que la forme de la cellule, sa taille et sa physiologie. Il est aussi important de noter que les colonies d'un type bactérien donné ont souvent des couleurs, des textures et des odeurs distinctes. Après une période d'incubation appropriée de vos comptes viables, vous devriez pouvoir voir des colonies typiques de bactéries. Remarquez la grande variété de couleurs, de formes et de textures qu'assument les colonies de différentes espèces. Référez-vous à la figure ci-dessous pour distinguer les morphologies des colonies observées. Ceci vous permettra d'obtenir une estimation préliminaire du nombre d'espèces qui se retrouvaient dans vos échantillons.

Forme

Circulaire

Irrégulière

Filamenteuse

Rhizoïde

Élévation Convexe

Bombé

Élevée

22

Bossue

Cratère

Labo de Microbiologie-2012 DÉNOMBRER LES BACTÉRIES Le but de cet exercice était d'utiliser des techniques microbiologiques de base pour répondre aux questions suivantes: Combien de bactéries et d'espèces différentes est-ce qu’il y a dans la voie navigable? Est-ce que les résultats obtenus sont les mêmes sur différents milieux? À cet effet, obtenir vos étalements d’eau et compter le nombre de bactéries obtenues. Choisissez la dilution la plus appropriée (pas trop ou trop peu de colonies, idéalement environ 100 - 300). Enregistrez vos comptes de colonies et enregistrer les sur le chiffrier Excel à l'ordinateur au podium. Vous aurez besoin des données de toute la classe pour votre devoir. VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATIONS SIMPLES (Groupes de 2) Les cellules microbiennes sont incolores et donc difficiles à visualiser. Donc, plusieurs méthodes de colorations ont été développées pour visualiser et classifier les microorganismes. Les types de colorations sont généralement classifiés comme simples ou différentiels. Dans le cas des colorations simples, un seul colorant non spécifique et non discriminatoire, tel que le bleu de méthylène, est utilisé afin d’examiner les morphologies et les agrégations cellulaires bactériennes au microscope. (Voir la figure sur la page 26) Matériaux Lames de microscope Pipettes Pasteurs Échantillons environnementaux Colorants Méthode 1. Préparer des frottis de trois différentes colonies de votre échantillonnage environnemental. Utiliser une boucle d’ensemencement stérile pour transférer des bactéries (TRÈS PEU) à une goutte d’eau déposée sur une lame de microscope. 2. Suspendre les bactéries dans la goutte d’eau et étaler sur une petite surface de la lame. 3. Laisser les frottis s’assécher complètement à l’air sur votre table de travail.

23

Labo de Microbiologie-2012 4. Fixer vos frottis bactériens à la chaleur en les passants rapidement dans la flamme du brûleur Bunsen. Ne chauffez pas trop vos lames!! Les bactéries brûlées ne se colorent pas bien. 5. Assembler votre station de coloration comme suit : Tapis de papier absorbant (côté plastique en dessous) Contenant pour la coloration (« Gladware ») 6. Déposer vos lames au-dessus des ouvertures du contenant « Gladware ». Ajouter une goutte d’un des colorants suivants à chacun de vos frottis. Bleu de méthylène Cristal violet Safranine

7. Laisser le colorant sur les frottis pour approximativement 30 secondes. 8. Rincer l’excédant du colorant avec de l'eau distillée. 9. Assécher en tamponnant la lame entre les couches de papier absorbant. 10. Examiner au microscope et faire la prise de photos numériques. Sauvegarder. Jetez vos solutions des colorations dans les tonneaux fournis à cet effet. NE PAS DÉVERSER LES COLORANTS DANS LES ÉVIERS Présentation PowerPoint 1. Chaque groupe doit préparer une présentation PowerPoint de leurs images. La première diapo de la présentation doit inclure un titre, les noms de tous les membres du groupe, le numéro du groupe et la date. La présentation doit inclure les images suivantes (une par diapo) : 2. Un exemple de chacune des colorations simples avec les différents colorants incluant les informations suivantes (3 images) Type de coloration et le colorant utilisé Morphologie cellulaire Agrégation cellulaire Grossissement

24

Labo de Microbiologie-2012 MORPHOLOGIES CELLULAIRES

Neisseria

Micrococci

Micrococci

25

Labo de Microbiologie-2012 LABO NO 3 DÉNOMBRER LES BACTÉRIES

Jour 1 Il existe plusieurs façons d’obtenir une estimée du nombre de bactéries dans un environnement donné. Parmi la plus commune est le compte viable que vous avez vu la semaine passée. Le compte viable détermine le nombre de bactéries vivantes dans un échantillon. Cette méthode nécessite la croissance des bactéries sur un milieu approprié jusqu’à l'obtention de colonies simples. Puisqu'on présume qu’une colonie simple est le fruit d'une cellule unique, le nombre de colonies représente le nombre de bactéries viables présentes dans l'échantillon. De plus, suite à leurs croissances, le chercheur peut évaluer le nombre de différentes espèces présentes d’après les différentes morphologies observées. Il existe plusieurs variantes des comptes viables. Un des critères qui dicte le choix de la méthode est la source de l’échantillon. Par exemple, est-ce que vous désirez échantillonner une surface, un échantillon solide, ou un échantillon liquide? COMPTES VIABLES (Groupes de 2) Matériaux Bouillon de culture d’E.coli 6 éprouvettes de 10ml 100 ml de saline physiologique (0.9% m/v) 16 géloses TSA Méthode 1. Préparer des dilutions en série dans de la saline physiologique (SP) de la culture d’E.coli telle qu’illustrée ci-dessous : 1.0mL

1.0mL

9.0mL SP

9.9mL SP

4.5mL 9.9mL TSB SP

2

1.0mL

9.0mL SP

0.1mL

9.0mL SP

0.1mL

9.9mL SP

Culture microbienne

0.1mL

H2 O

2. Étaler 0.1ml de chacune des dilutions (10-2-10-9) sur des géloses TSA étiquetées de façon appropriée. 3. Répéter l’étape 1 sur un deuxième jeu de géloses. 4. Placer vos géloses dans le sac fourni à cet effet. Fermer le sac avec du papier collant sur lequel est indiqué votre nom et numéro de groupe. 5. Incuber les géloses à 28oC. 26

Labo de Microbiologie-2012 LES COMPTES LES PLUS PROBABLES (Groupes de 2) Une variante des comptes viables dépend de la probabilité pour déterminer le nombre de bactéries dans un échantillon. Comme les comptes viables, cette méthode nécessite la croissance dans un milieu approprié. Mais, contrairement aux comptes viables, la détection est fondée sur la présence ou l’absence de croissance ou la production d’un sous-produit. Matériaux Échantillon d’eau d’une voie navigable Eau stérile 18 X 5 ml de bouillon TSB 3 éprouvettes stériles Méthode 1. Préparer les dilutions suivantes de votre échantillon d’eau d’une voie navigable dans un volume final de 10ml d’eau : 10-2, 10-4 and 10-6. 2. Étiqueter 6 jeux de 3 tubes contenant 5ml de TSB 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 et 10-6. 3. Transférer 0.1ml de l’échantillon d’eau non dilué aux trois bouillons TSB étiquetés 10-1. 4. Transférer 1.0ml de la dilution (10-2) aux trois bouillons TSB étiquetés 10-2. 5. Transférer 0.1ml de la dilution (10-2) aux trois bouillons TSB étiquetés 10-3. 6. Transférer 1.0ml de la dilution (10-4) aux trois bouillons TSB étiquetés 10-4. 7. Transférer 0.1ml de la dilution (10-4) aux trois bouillons TSB étiquetés 10-5. 8. Transférer 1.0ml de la dilution (10-6) aux trois bouillons TSB étiquetés 10-6. 9. Incuber vos tubes à 28oC.

27

Labo de Microbiologie-2012 COMPTES DIRECTS (Groupes de 2) Comme le nom l’indique, un compte direct implique l’énumération directe du nombre de microorganismes présents dans un échantillon, sans avoir à les faire croître a priori. Il est important de noter qu'un compte direct ne permet pas de distinguer les microorganismes vivants de ceux qui sont morts. Pour obtenir une estimation rapide et précise du nombre de cellules dans un échantillon donné, on peut faire un compte direct. Ceci est accompli en utilisant une lame spéciale possédant une cavité à laquelle un volume de liquide connu peut être appliqué. La cellule de comptage d'une lame d’hemacytomètre standard possède deux cellules de comptage identiques burinées dans le verre, qui sont constituées de neuf carrés aux dimensions de 1 mm2 chacun (1 mm X 1 mm; voir la figure). Lorsque la lame d'hemacytomètre est recouverte d'une lamelle, l'espace libre disponible est d’une profondeur de 0.1 mm. Le volume de chaque carré est donc de 0.1 mm3 ou 10-4 cm3. Une fois que l'échantillon à dénombrer est appliqué, les cellules sont visualisées et énumérées. Les cellules dans chacun de trois carrés de tailles moyennes sont comptées. La moyenne est ensuite calculée et le nombre total de cellules dans l'échantillon original est déterminé. Exemple de calcul: Si l'on compte 10, 14 et 6 cellules dans trois carrés indépendants, l'on a une moyenne de 10 bactéries par carré. Ce nombre équivaut à avoir 10 bactéries/0.1 mm3 ou 10 bactéries/0.0001 cm3 ou 10 bactéries /0.0001 ml La concentration totale de bactéries dans l'échantillon examiné est donc de 1 X 105/ml. Hémacytomètre

Y Y

28

Labo de Microbiologie-2012 Matériaux Suspension de levure Lame d’hémacytomètre Eau stérile Tubes Pipettes Pasteurs Méthode 1. Préparer les dilutions suivantes de la suspension de levure : 10-1, 10-2, et 10-3. Assurez-vous de bien mélanger la suspension avant de faire vos prélèvements. 2. Remplir la cellule de comptage de la lame d’hémacytomètre avec un échantillon de la dilution la plus élevée (voir l’image ci-dessous ou demander à un aide enseignant de vous le démontrer). Assurez-vous de bien mélanger la suspension avant de faire vos prélèvements. 3. Compter le nombre de cellules dans chacun de trois carrés de la taille indiqué par un « Y » dans l’image sur la page précédente. 4. Si le nombre de cellules est trop petit, recommencer avec la dilution précédente. Si le nombre de cellules est trop élevé, préparer une dilution plus élevée d’un facteur de 10. 5. Enregistrer les données suivantes sur le fichier Excel au podium à l’avant : Groupe

Dilution

No de cellules

Dimensions du carré

29

No de cellules/ml original

Labo de Microbiologie-2012

Jour 2 COMPTES VIABLE 1. Obtenir vos géloses sur lesquelles vous avez fait l’étalement de vos dilutions d’E.coli. 2. Compter le nombre de colonies sur les géloses qui possèdent entre 30-300 colonies. 3. Répéter l’étape 2 avec votre deuxième jeu de géloses. COMPTE LES PLUS PROBABLES Afin de comprendre la théorie du nombre le plus probable (NPP), pensez à des dilutions en série de facteurs 10 qui sont faites avec des échantillons de 1ml de chaque dilution inoculé dans différents tubes qui contiennent un milieu donné. Après l’incubation, les bouillons sont observés pour la présence ou l’absence de croissance. Théoriquement, si au moins un organisme était présent dans n’importe lequel des inocula, une croissance visible devrait être observée pour ce tube. Si le bouillon inoculé à partir de la dilution 10-3 démontre de la croissance, mais que le bouillon inoculé à partir de la dilution 10-4 n’en démontre pas, il est donc possible de dire qu’il y avait plus de 1X103 organismes par ml de l’échantillon original, mais moins que 1X104 par ml. Les bactéries ne sont que rarement, ou même jamais, distribuées de façon uniforme dans un échantillon. Par exemple, si un échantillon de 10ml contient un total de 300 organismes, pas toutes les aliquotes de 1 ml contiendront 30 organismes; certains contiendront plus ou moins de 30 organismes, mais en moyenne tous les dix aliquotes dans l’échantillon entier de 10ml sera 30. Ceci est tout aussi vrai pour n’importe lesquelles des dilutions desquelles des inocula sont pris. Pour augmenter la précision statistique de ce type de test, plus d’un bouillon est inoculé pour chaque dilution. Le NPP standard utilise un minimum de 3 dilutions et 3, 5 ou 10 tubes par dilution. Après l’incubation, le patron de tubes positifs et négatifs est noté, puis un tableau de NPP standardise est consulté afin de déterminer le nombre le plus probable d’organismes (qui causent les résultats positifs) par unité de volume de l’échantillon original. Dans l’exemple suivant, un jeu de 3 tubes de bouillons est inoculé avec 1 ml à partir de chacune des dilutions de facteur 10.

Après l’incubation, le nombre de tubes qui démontre de la croissance est enregistré. À un certain point, les dilutions sont si élevées, qu’aucun organisme ne se retrouvait dans l’inoculum 30

Labo de Microbiologie-2012 (enregistré comme négatif). Afin d’estimer le nombre d’organismes par ml d’échantillon qui serait responsable du patron de croissance observe, les observations faites dans une série de trois dilutions successive sont utilisées d’après les critères suivants : Cas 1. Une ou plusieurs des dilutions démontrent toutes des tubes négatifs; une extinction est observée. Choisir la dilution la plus faible (le jeu le moins dilué) qui donne des résultats négatifs dans tous les tubes (3 de 3) (la dilution 10-4 dans l’exemple ci-dessus). Vérifier que les prochains jeux de dilutions après la série choisie (10-4 dans l’exemple ci-dessus), démontre tous une extinction (0 de 3).Choisir les trois jeux de dilutions précédente (10-1, 10-2 et 10-3 dans l’exemple ci-dessus). (Tableau: ex. a et b). Cas 2. Une extinction n’est pas observée dans toutes les prochaines séries de dilutions qui n’ont pas été choisies. Choisir la dilution la plus faible (le jeu le moins dilué) qui donne des résultats négatifs dans tous les tubes (3 de 3) (la dilution 10-4 dans l’exemple ci-dessus). Vérifier que les prochains jeux de dilutions après la série choisie (10-4 dans l’exemple ci-dessus), démontre tous une extinction (0 de 3). Choisir les trois jeux de dilutions précédentes (10-1, 10-2 et 10-3 dans l’exemple ci-dessus). Si une extinction n’est pas observée dans le prochain jeu de dilutions non sélectionné (c.-à-d. Il y a encore des tubes positifs dans les dilutions plus élevées non choisies) additionner les résultats positifs de ces dilutions plus élevées aux résultats pour le jeu de dilutions le plus élevé choisis (ex. c). Cas 3. Les dilutions n’étaient pas suffisamment élevées pour démontrer une extinction. Si le nombre de dilutions testées n’était pas suffisamment élevé pour pouvoir choisir trios dilutions après lesquelles une extinction est observée, alors choisir les trois dilutions les plus élevées (ex. d). Cas 4. Aucune des dilutions ne démontre toute des tubes positifs. Choisir les trois dilutions les plus faibles (moins dilué; ex. f). Si des résultats positifs sont observés dans les dilutions plus élevées qui n’ont pas été choisies, additionnez ces résultats positifs de ces dilutions plus élevées aux résultats de la dilution la plus élevée choisie (ex. e).

31

Labo de Microbiologie-2012 Tableau Exemple

100

10-1

10-2

10-3

10-4

a b c d e f

3 2 3 3 0 2

3 3 2 3 0 2

1 1 2 3 1 1

0 0 0 3 0 1

0 0 1 2 0 0

Combinaison de positifs 3-1-0 3-1-0 3-2-3 3-3-2 0-0-1 2-2-2

NPP/ml 4.6 0.36 2.9 11 0.03 0.35

Une fois qu’un jeu approprié de dilutions a été choisi, les résultats de ces trios jeux sont utilisés pour déterminer le NPP dans le deuxième jeu de tubes à partir du tableau de NPP standard sur la prochaine page. À noter: Des quantités autres qu’un millilitre peuvent être inoculées. Par exemple, une inoculation de 0.1 ml d’une dilution de 10–3 est équivalente à une inoculation de 1 ml d’une dilution de 10–4. La quantité de milieux dans le tube n’a aucune importance puisque la même croissance serait observée dans tous les cas.

32

Labo de Microbiologie-2012 Tableau de NPP à trois tubes No de tubes positifs dans: 1er 2e 3e Jeu Jeu Jeu 0 0 0 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 2 0 0 2 1 0 2 2 0 2 3 0 3 0 0 3 1 0 3 2 0 3 3 1 0 0 1 0 1 1 0 2 1 0 3 1 1 0 1 1 1 1 1 2 1 1 3 1 2 0 1 2 1 1 2 2 1 2 3 1 3 0 1 3 1 1 3 2 1 3 3

No de tubes positifs dans: 1er 2e 3e Jeu Jeu Jeu 2 0 0 2 0 1 2 0 2 2 0 3 2 1 0 2 1 1 2 1 2 2 1 3 2 2 0 2 2 1 2 2 2 2 2 3 2 3 0 2 3 1 2 3 2 2 3 3 3 0 0 3 0 1 3 0 2 3 0 3 3 1 0 3 1 1 3 1 2 3 1 3 3 2 0 3 2 1 3 2 2 3 2 3 3 3 0 3 3 1 3 3 2 3 3 3

NPP de l’inoculum du 2e jeu de tubes 24

Vos Résultats: o Enregistrer vos résultats pour vos NPP: Groupe

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

33

10-6

Combinaison de positifs

NPP/ml

Labo de Microbiologie-2012 VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATION DE GRAM (Groupe de 2) Précédemment, vous avez fait des colorations simples qui vous ont permis de comparer les tailles, les formes et les agrégations cellulaires. Plusieurs autres méthodes de colorations ont été développées qui se disent différentielles. Ces méthodes colorent les bactéries de façon différentielle en fonction de différentes propriétés de la cellule. Le docteur Christian Gram a développé une technique de coloration différentielle, la coloration de Gram. La coloration de Gram permet non seulement d'observer la forme et la taille des bactéries, mais aussi de les classifier dans un de deux groupes: Gram positif ou Gram négatif. La technique de coloration de Gram utilise quatre composés chimiques: Le violet de cristal, un colorant primaire qui teint bleu toutes les cellules sans distinction, L'iode de Gram, qui s’associe avec le colorant primaire agissant comme un mordant, L’éthanol, qui cause la déshydratation des parois cellulaires et le Safran, un colorant qui teint rouge toutes les cellules sans distinction. L’ajout séquentiel de ces 4 composés aura pour effet de colorer en mauve (Gram positif) ou en rouge (Gram négatif) les bactéries, selon leur espèce. Le potentiel différentiel de la coloration de Gram est une fonction de la composition des parois cellulaires des bactéries. Typiquement, les bactéries Gram positives possèdent des parois cellulaires très épaisses, composées de 10-20 couches de peptidoglycanes contenant très peu de lipides. Les bactéries Gram négatives ont plutôt des parois cellulaires relativement minces constituées de 1-3 couches de peptidoglycanes avec un contenu élevé de lipides. L’étape critique dans la technique de coloration de Gram, qui lui confère ses propriétés discriminatoires, est le rinçage à l'éthanol. Dans le cas d’organismes Gram positifs, la paroi des cellules est très facilement déshydratée en raison de son faible contenu de lipides: ces cellules ont tendance à conserver le complexe d'iode de Gram/violet de cristal. Par contre, la paroi des organismes Gram négatifs n’est pas facilement déshydratée par l'éthanol en raison de sa haute teneur en lipides, ce qui lui permet de conserver une grande perméabilité. Ainsi, le traitement à l'éthanol réussit à laver efficacement les complexes d'iode de Gram/violet de cristal, rendant les cellules incolores. Ces cellules deviennent donc rouge suite à leurs contre coloration avec le Safran.

34

Labo de Microbiologie-2012 Matériaux Lames de microscope Culture en bouillon de S. aureus et d’E. coli NPP des échantillons d’eau Colorants Méthode 1. Préparer des frottis fixés à la chaleur de chacun des bouillons de culture fournis. 2. Préparer des frottis fixés à la chaleur de la dilution la plus élevée et de la dilution la plus faible de l’essai de NPP qui a démontré de la croissance. 3. Colorer avec le violet de cristal pour une minute. 4. Laver soigneusement l’excédant du colorant avec de l’eau distillée. 5. Appliquer l'iode de Gram pour une minute. 6. Laver soigneusement l’excédant d’iode de Gram avec de l'eau distillée. 7. Laver soigneusement à l’éthanol 95% en appliquant le solvant goutte à goutte jusqu’à ce que l’afflux d’alcool soit incolore. 8. Laver l’excédant d'éthanol avec de l'eau distillée. 9. Contre-colorer avec le Safran durant 45 secondes. 10. Laver l’excédant de colorant avec de l’eau distillée. 11. Assécher la lame à l'aide de papier bilbueu. 12. Examiner au microscope et faire la prise de photos numériques. Sauvegardé.

35

Labo de Microbiologie-2012 VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATION ACIDO-RÉSISTANTE (Groupe de 2) La coloration acido-résistante est une autre procédure de coloration spécialisée. Cette technique est particulièrement utile pour colorer des bactéries ayant des constituants semblables à de la cire dans leurs parois cellulaires. Les microbes de ce type incluent plusieurs pathogènes de l’être humain, comme les Mycobacteriaceae dont certains membres causent la tuberculose et la lèpre. La haute teneur en acide mycoïque, une composante semblable à la cire, des parois cellulaires des les rend littéralement imperméables aux colorants. Cependant, une fois que le colorant a pénétré, il ne peut pas être facilement retiré par des décolorants tels que l’éthanol. Le principe de la technique est de rendre les bactéries perméables au colorant et ensuite de vérifier leur résistance à une décoloration ardue. Ces objectifs sont atteints en employant la fuchsine de carbol comme colorant primaire. Ce composé, étant miscible dans les lipides, pénètre facilement la couche cireuse des Mycobactéries. De par leur couche cireuse, les bactéries résistent au dur traitement de décoloration subséquent effectué avec de l'alcool acide. Matériaux Lames de microscope Culture sur pentes de B. subtilis et de M. smegmantis Carbol Fuschine de Kinyoun Alcool acide Méthode 1. Préparer un frottis fixé à la chaleur de chacune des cultures bactériennes. 2. Inonder les frottis avec fuchsine de carbol pour 5 minutes. 3. Rincer avec de l’eau distillée. 4. Décolorer avec de l’alcool acide jusqu'à ce qu’il n’y a pu de colorant. 5. Rincer avec de l’eau distillée. 6. Contre colorer avec du bleu de méthylène pour 30 secondes. 7. Rincer le colorant avec de l'eau distillée. 8. Assécher la lame à l'aide de papier bilbueu. 9. Examiner au microscope et faire la prise de photos numériques. Sauvegardé.

36

Labo de Microbiologie-2012 VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATION DES SPORES Les cellules d'espèces bactériennes appartenant aux genres Bacillus et Clostridium peuvent prendre la forme de cellules végétatives qui sont métaboliquement actives ou la forme de spores qui sont métaboliquement inactives. Les spores représentent une forme cellulaire dormante qui possède un grand niveau de résistance à des conditions environnementales extrêmes telles que la chaleur et la sécheresse. Quand les conditions environnementales deviennent défavorables à la poursuite de la croissance des cellules végétatives, celles-ci initient la sporogenèse pour générer une nouvelle structure intracellulaire, l’endospore. L’endospore, telle que la semence d’une plante, est recouverte de plusieurs couches successives qui lui confèrent une grande résistance. Éventuellement, l’endospore est relâchée comme entité indépendante de la cellule végétative, sous la forme d’une spore. Lorsque les conditions environnementales redeviennent favorables à la croissance, les spores germent et reprennent la forme de cellules végétatives. La résilience des spores les rend résistantes aux méthodes de coloration standard, ce qui nécessite l'utilisation d'une méthode de coloration spécialisée. En bref, la coloration des spores se fait de la façon suivante. Les cellules sont traitées avec un colorant primaire, le vert de malachite. Comme les spores sont imperméables, le colorant est appliqué en chauffant le frottis, de façon à augmenter la perméabilité des spores. Suite à cette étape, la cellule végétative et la spore sont colorées en vert. Le frottis est ensuite rincé à l’eau pour enlever l’excédant de colorant. Le vert de malachite ayant peu d’affinité pour la cellule, les cellules végétatives sont aisément décolorées alors que les spores demeurent vertes. Finalement, le frottis est contre-coloré avec le Safran, lequel ne colore pas les spores, mais par contre, colore les cellules en rouge. Voir la lame de démonstration 1. Préparer des frottis fixés à la chaleur. 2. Inonder les frottis avec le vert de malachite. 3. Faire bouillir sur la flamme du brûleur de Bunsen pendant cinq minutes. Assurez-vous que le colorant ne s'assèche pas. Ajouter du colorant au besoin. 4. Rincer le frottis à l'eau distillée. 5. Contre-colorer avec le rouge de safran. 6. Rincer à l'eau distillée, puis assécher. 7. Examiner au microscope.

37

Labo de Microbiologie-2012 Présentation PowerPoint Chaque groupe doit préparer une présentation PowerPoint de leurs images. La première diapo de la présentation doit inclure un titre, les noms des membres du groupe, le numéro du groupe et la date. La présentation doit inclure les images suivantes (une par diapo) : Une coloration de Gram de chacune des cultures en bouillon fourni. (2 images) Une coloration de Gram à partir des NPP (2 images) Une coloration acido-résistante de Mycobacterium smegmantis et de B. subtilis (2 images) Chacune des images doit être accompagnée d’une légende appropriée qui inclut l’information suivante : o Genre et espèce bactérienne (si connue) ou la source o Type de coloration utilisé o Morphologie cellulaire o Agrégation cellulaire o Grossissement Le fichier PowerPoint, contenant toutes les images, doit être sauvegardé sur le disque K:\ dans un fichier nommé comme suit : Colorations_Groupe (votre numéro de groupe) BIOREMÉDIATION (Partie 2) Matériaux Flacon de Bioremédiation Glycérol Tube à capuchon bouton-pression Méthode 1. Enregistrer toute observation en ce qui à trait à l’apparence de votre culture de bioremédiation. 2. Transférer 0.85 ml de la culture bactérienne à un tube à capuchon bouton-pression. 3. Ajouter 0.15 ml de glycérol stérile (15%, v/v). 4. Mélanger la culture au vortex pour vous assurez que le glycérol et bien dispersé 5. Étiqueter de façon appropriée avec votre numéro de groupe et la date. 6. Congeler à –20 C pour un entreposage à long terme.

38

Labo de Microbiologie-2012 LABO NO 4 LES MILIEUX DE CROISSANCE ET LES BACTÉRIES DU SOL

Jour 1 Il existe plusieurs types de milieux microbiologiques, qui se classent comme étant complexe défini, différentiel ou sélectif. Les milieux définis sont très variés et diffèrent beaucoup dans leurs compositions. Ils peuvent contenir très peu ou beaucoup d’ingrédients. Leur particularité est que la composition exacte du milieu et tous les ingrédients qui les composent sont connus. Par contre, les milieux complexes sont créés à partir d’ingrédients dont la composition exacte est inconnue; par exemple un milieu fait d’extraits de bœuf. Dans les deux cas, ces milieux peuvent être rendus soit différentiels ou sélectifs. Les milieux différentiels possèdent des composés qui permettent de distinguer visuellement, habituellement par des changements de couleur, différents métabolismes bactériens. Par contre, les milieux dits sélectifs contiennent des composés qui préviennent la croissance de certains microorganismes. La source de carbone et le métabolisme par lequel celui-ci est utilisé sont très variés parmi différentes bactéries. En présence de plus d'une source de carbones et de différentes conditions environnementales, les bactéries font des choix, d'après leurs capacités et leurs préférences, du type de métabolisme utilisé. Certaines bactéries utilisent exclusivement un métabolisme oxydatif, qui requière un capteur d'électrons final inorganique, tel que l'oxygène. D'autres utilisent un métabolisme fermentatif qui requière un capteur final organique. Différents milieux de croissance différentiels ont été conçus afin d'évaluer le type de métabolisme utilisé. Ces derniers incluent habituellement un indicateur de pH qui change de couleur en fonction des sous-produits générés à partir du métabolisme et de la source de carbone utilisée. Généralement, la présence d'acide indique le métabolisme d'un sucre par un mode oxydatif ou de fermentation. Par contre, l'accumulation de sous-produits alcalins indique le catabolisme de protéines par un mode oxydatif.

39

Labo de Microbiologie-2012 BACTÉRIES DU SOL Les bactéries représentent les microorganismes les plus abondants dans les sols. Leurs nombres peuvent atteindre 1 X 108 par g de sol. Elles peuvent être généralement classifiées parmi les catégories suivantes: Les décomposeurs : Ces bactéries ont un rôle important dans la décomposition de matières organiques. Les bactéries du genre Bacillus et Pseudomonas sont des exemples de décomposeurs. Puisque la majorité des composés organiques initialement présents dans les sols représente des polymères complexes tels la cellulose ou l'amidon, plusieurs de ces bactéries ont la capacité de sécréter dans leurs environnements des enzymes exocellulaires qui peuvent dégrader ces polymères en unité plus facilement digérés. Bactéries qui fixent l'azote : Parmi ce type de bactéries sont les Rhizobiums qui peuvent établir des relations symbiotiques avec les racines des plantes. Ces bactéries font l'extraction de l'azote gazeux de l'atmosphère qu'ils convertissent en une forme utilisable par les plantes. D'autres genres bactériens, tels qu’Azotobacter, Azospirillum, Agrobacterium, Gluconobacter, Flavobacterium et Herbaspirillum fixent eux aussi l'azote, mais sont non symbiotiques. Bactéries nitrifiantes : Ces bactéries changent l'ammonium (NH4+) au nitrite (NO2-) et ensuite au nitrate (NO3-) – une source d'azote qui est préférée par la majorité des plantes. Bactéries dénitrifiantes: Ces bactéries convertissent le nitrate à l'azote gazeux. Celles-ci sont des bactéries qui vivent en absence d'oxygène; des anaérobies. Aérobies et anaérobies : La disponibilité d'oxygène étant très variable dans les sols, les exigences parmi les bactéries et très diverses. L'oxygène peut être employé par quelques organismes, tels que les êtres humains et quelques espèces bactériennes, comme capteur final d’électrons dans la respiration en aérobie. En ce qui à trait à leurs exigences, les bactéries peuvent être placées dans des classes différentes d’après leurs capacités d’utiliser l'oxygène comme capteur final d’électrons et leurs capacités de croître en présence d'oxygène. Aérobie strict Anaérobie facultatif Anaérobie Anaérobie strict

Le besoin d’oxygène est absolu pour survivre. Le besoin d'oxygène est facultatif, mais la croissance en sa présence est optimale. N’utilise pas l'oxygène pour la croissance, mais peuvent croître en sa présence. N’utilisent pas l’oxygène pour la croissance et ne peuvent croître en sa présence.

Aérobie Anaérobie Anaérobie Anaérobie strict strict Facultatif Croissance en présence d’O2 + + + Croissance sans O2 + + + – Capteur e final : O2 + + La présence ou l’absence d’oxygène moléculaire peut être un facteur qui déterminera si une espèce bactérienne peut croître.

40

Labo de Microbiologie-2012 LES BACTÉRIES DANS DU COMPOST (Groupe de 2) Préparation de l'échantillon Matériaux Composte (à côté de la balance) Bouteille de 250 ml qui contient 90 ml d'eau stérile Tube Falcon stérile de 50 ml. 6 Éprouvettes stériles Eau stérile Méthode 1. Faire la pesée d'un gramme de compost. 2. Ajouter le composte à la bouteille d'eau stérile. (Notez; ceci représente une dilution de 10-2). 3. Mélanger vigoureusement pour 1-2 minutes. 4. Laisser reposer pour 5 minutes sur votre table, puis répéter l'étape 3 une fois de plus. 5. Laisser reposer pour 10 minutes sur votre table. 6. Prudemment déverser approx. 20-30 ml du surnageant à un tube Falcon stérile de 50 ml. Éviter autant que possible de récolter du sédiment. 7. Préparer une série de dilution dans 10 ml d'eau stérile représentant les facteurs de dilutions suivantes 102X, 103X, 104X, 105X et 106X. COMPTE DE BACTÉRIES AÉROBIES HÉTÉROTROPHES (Groupes pairs) Matériaux Dilutions du compost préparé dans l'exercice précédent 5 géloses TSA + 0.1% glycérol Méthode 1. Étaler 0.1 ml de chacune des dilutions de compost (10-2 à 10-6) sur des géloses TSA + 0.1% glycérol étiquetées de façon appropriée. 2. Incuber à 28oC. COMPTE DE BACTÉRIES ANAÉROBIES HÉTÉROTROPHES (Groupes impairs) Matériaux Dilutions du compost préparé dans l'exercice précédent 5 géloses TSA + 0.1% glycérol Méthode 1. Étaler 0.1 ml de chacune des dilutions de compost (10-2 à 10-6) sur des géloses TSA + 0.1% glycérol étiquetées de façon appropriée. 2. Incuber dans la cuve d'anaérobie à 28oC.

41

Labo de Microbiologie-2012 COMPTE DE BACTÉRIES GRAM NÉGATIVES ET POSITIVES Afin d'obtenir une estimation de la distribution de bactéries Gram négatives et positives dans le sol, nous utiliserons des milieux différentiels et sélectifs; l'Agar de MacConkey et l'Agar CNA de Colombie L'Agar MacConkey est un milieu sélectif et différentiel qui contient du lactose et des protéines en tant que sources de carbones potentielles. La sélectivité de ce milieu est attribuable à l'ajout du cristal violet qui inhibe la croissance d'organisme Gram positif et des levures. L'aspect différentiel du milieu permet de distinguer la fermentation du lactose par l'inclusion d'un indicateur de pH. Les bactéries qui fermentent le lactose sont rose, tandis que les non-fermenteurs sont incolores. L'Agar CNA de Colombie est un milieu riche qui contient une combinaison de peptones (peptides protéiques) obtenues de tissus animaux et d'extrait de bœuf. De l'extrait de levure est inclus comme source des vitamines B. L'inclusion de l'acide nalidixique et du colistin rend ce milieu sélectif pour les bactéries Gram positives. L'acide nalidixique bloque la réplication de l'ADN tandis que le colistin perturbe la membrane plasmique d'organismes Gram négatifs. Matériaux Dilutions du compost préparé dans l'exercice précédent 5 géloses MacConkey (Groupes pairs) 5 Gélose CNA de Colombie (Groupes impairs) Méthode (Groupes pairs) 1. Étaler 0.1 ml de chacune des dilutions (10-2 à 10-6) du compost sur des géloses de MacConkey étiquetées de façon appropriée. 2. Incuber à 28oC. Méthode (Groupes impairs) 1. Étaler 0.1 ml de chacune des dilutions (10-2 à 10-6) du compost sur des géloses de CNA de Colombie étiquetées de façon appropriée. 2. Incuber à 28oC.

42

Labo de Microbiologie-2012 CYCLE DE L'AZOTE Le cycle de l'azote implique cinq procédés -- la fixation, l'absorption, la minéralisation, la nitrification, et la dénitrification -- qui sont tous entrainés par des microorganismes. La fixation (N2 → NH4+) est un procédé par lequel le N2 est converti en ammonium; composé essentiel, car c'est la seule façon que les organismes peuvent obtenir d'azote directement de l'atmosphère. L'absorption de l'azote (NH4+ → N organique) produit par les bactéries est rapidement incorporée dans les protéines et d'autres composés azotés organiques par les plantes, les bactéries ou d'autres organismes. La minéralisation (N organique → NH4+) survient souvent par la décomposition. Quand les organismes meurent, des décomposeurs tels que les bactéries consument la matière organique et convertissent des quantités importantes de l'azote dans l'organisme mort en ammonium. Sous la forme d'ammonium, l'azote est disponible pour l'utilisation par les plantes ou pour être transformé en nitrate (NO3-) par un procédé appelé la nitrification. La nitrification (NH4+ → NO3-) plusieurs bactéries obtiennent de l'énergie en convertissant une partie de l'ammonium, qu'ils utilisent comme source d'électrons, produits par la décomposition au nitrate. La dénitrification (NO3- → NO2-) est faite par les bactéries dénitrifiantes qui convertissent le nitrate (NO3-) en nitrite (NO2-) et dans certain cas à de l'azote gazeux : NO3- → NO2- → NO → N2O → N2.

43

Labo de Microbiologie-2012 BACTÉRIES QUI FIXENT L'AZOTE (Groupes impairs) Matériaux Dilutions du compost préparé dans l'exercice précédent 150ml de milieu d’essai de fixation d’azote 20 éprouvettes stériles Méthode 1. Faire un compte NPP tel qu’indiqué ci-dessous dans 4 jeux de 5 tubes de milieu d’essai de fixation d’azote pour les dilutions de 100 à 10-3. 2. Incuber à 28oC. BACTÉRIES NITRIFIANTES (Groupes pairs) Matériaux Dilutions du compost préparé dans l'exercice précédent 150ml de milieu d’ammonium 20 éprouvettes stériles Méthode 1. Faire un compte NPP tel qu’indiqué ci-dessous dans 4 jeux de 5 tubes de milieu d'ammonium pour les dilutions de 100 à 10-3. 2. Incuber à 28oC. Échantillon de compost 100 100 10-2 10-2

Volume d’inoculum

Vol. du milieu 5 tubes 5ml 5ml 5ml 5ml

1.0 ml 0.1 ml 1.0 ml 0.1 ml

44

Dilution finale 10-0 10-1 10-2 10-3

Labo de Microbiologie-2012 L'ASSIMILATION DU CARBONE La grande majorité du carbone initialement disponible dans les sols est de sources végétales et représente des polymères de sucres, tel que la cellulose, composante des parois végétale, et l'amidon, forme principale de stockage des sucres chez les plantes. L'utilisation de ces composés requiert la production et la sécrétion d'enzyme exocellulaire qui ont pour but de faire la dégradation de ces derniers en composés plus simples qui peuvent être transportés à l'intérieur de la cellule et métabolisés. Ces enzymes sont donc très communes chez les microorganismes décomposeurs. Amylase ou Cellulase

Amidon ou Cellulose BACTÉRIES QUI DÉGRADENT L'AMIDON (Groupes pairs) Matériaux Dilutions du compost préparé dans l'exercice précédent 5 Géloses d'amidon Méthode 1. Étaler 0.1ml de chacune des dilutions de compost (10-2 à 10-6) sur des géloses d’amidon étiquetées de façon appropriée. 2. Incuber à 28oC.

45

Labo de Microbiologie-2012 BACTÉRIES QUI DÉGRADENT LA GÉLATINE (Groupes impairs) Matériaux Dilutions du compost préparé dans l'exercice précédent Agar fondu de tryptone + 4% gélatine 5 boîtes de Pétri Bêcher de 1L Méthode 1. Laisser couler l’eau chaude du robinet jusqu'à ce qu’elle atteigne la température maximale. 2. Remplir d’eau chaude approximativement à moitié d'un bécher. 3. Obtenir 5 tubes d’agar fondus de tryptone + gélatine et les placer dans le bécher d’eau chaude. 4. Transférer 0.1ml de votre dilution de compost de 10-2 au premier tube d’agar fondu. 5. Bien mélanger quelques secondes, puis verser dans une première boîte de Pétri étiquetée de façon appropriée. 6. Répéter l’étape 4-5 pour chacun des dilutions suivantes (10-3-10-6). 7. Laisser les boîtes de Pétri coulées refroidir jusqu'à la solidification de l’Agar. 8. Incuber les géloses à 28oC.

46

Labo de Microbiologie-2012

Jour 2 LES BACTÉRIES DANS DU COMPOST Chaque groupe doit obtenir les comptes suivants et déterminer le compte bactérien/g de compost original : Compte hétérotrophe en aérobie Compte hétérotrophe en anaérobie Compte de bactéries Gram positives Compte de bactéries Gram négatives NPP des bactéries qui fixent l'azote NPP des bactéries nitrifiantes Compte de bactéries qui dégradent l'amidon Afin de déterminer quelles bactéries dégradent l'amidon, inonder les géloses d'amidon avec de l'iode de Gram. L’iode de Gram réagit avec l'amidon générant une couleur bleue à noir. En absence d'amidon, l'iode demeure brunâtre. Compter les colonies qui démontrent un halo d'iode qui ne réagit pas avec l'amidon. Compte de bactéries qui dégradent la gélatine Afin de déterminer quelles bactéries dégradent la gélatine, regarder pour des zones autour des colonies. Compter les colonies qui démontrent un halo nuageux autour d’elles. COLORATIONS DE GRAM (Groupes de 4) Faire des colorations de Gram et la prise de photo de la croissance obtenue pour les NPP des bactéries qui fixent l'azote et les bactéries nitrifiantes. Faire des colorations de Gram et la prise de photo de deux colonies qui dégradent l'amidon et de deux colonies qui dégradent la gélatine. Faire des colorations de Gram et la prise de photo de deux colonies obtenues sur le compte hétérotrophe en aérobie et de deux colonies du compte hétérotrophe en anaérobie.

47

Labo de Microbiologie-2012 Tableau de NPP à 5 tubes À noter : Les NPP sont donnés par 100g ou 100ml d’échantillon

48

Labo de Microbiologie-2012 ISOLATION DE BACILLES INCONNUS GRAM POSITIFS (Groupes de 2) Matériaux 2 géloses TSA Méthode 1. À partir de la gélose CNA, retrouver deux différentes colonies qui représentent des bacilles Gram positifs. Pour ce faire, faites des colorations de Gram de quelques colonies. Notez: ne pas utiliser la colonie au complet, car vous devrez faire des stries pour colonies simples des colonies choisies. 2. Prendre des photos des colorations de Gram des colonies choisies. 3. Faire des stries pour colonies simples sur des géloses TSA des colonies choisies. 4. Incuber à 28oC. Présentation PowerPoint Chaque groupe doit préparer une présentation PowerPoint de leurs images. La première diapo de la présentation doit inclure un titre, les noms des membres du groupe, le numéro du groupe et la date. La présentation doit inclure les images suivantes (une par diapo) : Coloration de Gram de bactéries qui fixent l'azote. (1 image) Coloration de Gram de bactéries nitrifiantes. (1 image) Colorations de Gram de bactérie qui dégradent l'amidon. (3 images) Colorations de Gram de bactérie qui dégradent la gélatine. (3 images) Colorations de Gram d'inconnus bactériens isolés d'une gélose CNA (2 images) Le fichier PowerPoint, contenant toutes les images, doit être sauvegardé sur le disque K:\ dans un fichier nommé comme suit : Colorations_Groupe (votre numéro de groupe)

49

Labo de Microbiologie-2012 BIOREMÉDIATION (Partie 3) Matériaux Flacon de bioremédiation Glycérol Huile de Canola (Gr. 1-4), huile de maïs (Gr. 5-8), huile d’arachide (Gr. 9-12), et huile de diesel (Gr.13-16) Engrais pour plantes Flacon de 250ml Tube à capuchon Bouton-pression 1% (m/v) Solution de triphenyltetrazolium chloride (TTC) Méthode 1. Enregistrer toute observation en ce qui a trait à l’apparence de votre culture de bioremédiation. 2. Transférer 0.85 ml de la culture bactérienne à un tube à capuchon bouton-pression. 3. Ajouter 0.15 ml de glycérol stérile (15%, v/v). 4. Mélanger la culture au vortex pour assurer une dispersion uniforme du glycérol. 5. Étiqueter de façon appropriée avec votre numéro de groupe et la date. 6. Congeler à –20 C pour un entreposage à long terme. 7. Ajouter 40 ml d’eau distillée à un nouveau flacon de 250ml. 8. Ajouter de l’engrais de plante pour obtenir une concentration finale de 0.1% (m/v). 9. Ajouter du TTC pour obtenir une concentration finale de 0.01% (m/v). 10. Transférer 10ml de votre culture de bioremédiation à ce nouveau milieu frais. 11. Ajouter approximativement 10ml de l’huile assignée au flacon. La quantité n’est pas importante, mais vous voulez avoir une quantité qui est suffisante pour obtenir une fine couche qui recouvre la surface. 12. Étiqueter de façon appropriée le flacon avec votre numéro de groupe, votre section et le type d’huile. 13. Enregistrer toute observation en ce qui a trait à l’apparence du mélange. Soyez aussi détaillé que possible. 14. Amener le flacon à l’endroit désigné pour qu’il soit incubé avec agitation à la température de la pièce (Groupes pairs) ou à 40C (Groupes impairs).

50

Labo de Microbiologie-2012 LABO No 5 DIAGNOSTIC BACTÉRIEN – BACTÉRIES GRAM POSITIVES

Jour 1 IDENTIFICATION DE BACILLES GRAM POSITIFS (Groupes de 2) Les deux formes principales des bactéries Gram positives sont les bacilles et les coques. Les coques seront traitées dans une section ultérieure. Les familles prédominantes des bacilles Gram positifs incluent les Bacillaceae, les Clostridiaceae et les Lactobacillaceae. Ces familles sont divisées en deux groupes généraux; les bactéries sporulantes qui incluent les Bacillaceae et les Clostridiacea, et les non-sporulantes, les Lactobacillaceae. Les Bacillaceae comportent le genre bactérien Bacillus qui inclut des aérobies et des anaérobies facultatifs. Ces bactéries ont une vaste diversité d’exigences de croissance. Une variété d’activités biochimiques est notée dans cette famille incluant des activités de fermentation, protéolytiques, et la capacité de dégrader des composés de carbones complexes. La famille des Clostridiaceae, qui inclut le genre bactérien Clostridium, possède des caractéristiques très semblables aux Bacillaceae, mais ceux-ci se distinguent par le fait qu’ils sont des anaérobies stricts. Les organismes dans la famille des Lactobacillaceae peuvent des anaérobies ou des aérobies facultatifs, avec des exigences nutritionnelles très complexes. Certains produisent de l’acide lactique de la fermentation des hydrates de carbone. Rarement pathogène, à l’exception du genre Listeria, un aérobie ou microaérophile. Matériaux Géloses sur lesquelles vous avez isolé et strié des bacilles inconnus Gram positifs Méthodes MORPHOLOGIE COLONIALE 1. Examiner les géloses sur lesquelles vous avez strié vos inconnus pour des colonies simples. 2. À l’aide du microscope à dissection, obtenir des photos numériques de colonies typiques de chacun de vos inconnus. 3. Enregistrerez la morphologie coloniale ainsi que les couleurs de chaque inconnu. COLORATION DE GRAM 1. Faire une coloration de Gram de chacun des inconnus. 2. Faire la prise de photos pour votre rapport. 3. Prendre en note la coloration de Gram, la forme cellulaire et l’agrégation cellulaire.

51

Labo de Microbiologie-2012 MÉTABOLISME DE SOURCES DE CARBONE SIMPLES La source de carbone et le métabolisme utilisé sont très variés parmi différentes bactéries. La croissance en bouillons de phénol rouge est très utilisée pour évaluer le métabolisme des sources de carbones simples. Ces bouillons contiennent deux sources de carbones; un sucre de votre choix et des protéines. De plus, l’indicateur de pH, le phénol rouge est inclus. Le phénol rouge tourne au jaune en milieu acide et tourne au rouge en milieu alcalin. De plus, une fiole inversée est utilisée pour déceler l’accumulation de gaz. Généralement, la présence d'acide et de gaz indique un métabolisme de fermentation, tandis qu’une croissance en absence de gaz indique un métabolisme oxydatif. Noter, la production de sous-produits neutres ou acides indique le catabolisme d'un sucre, tandis que des sous-produits alcalins indiquent le catabolisme de protéines. Matériaux Stries pour colonies simples de bacilles inconnus Gram positifs isolés la semaine passée 2 pairs de bouillons de phénol rouge avec glucose, arabinose, xylose ou mannitol Saline physiologique (0.9% m/v) Huile minérale 2 éprouvettes stériles

Bact. 1

Bact. 1

PRG:

PRG:

Méthode 1. Préparer des suspensions de 1 ml de chacun de vos inconnus dans de la saline physiologique. Vous désirez obtenir une turbidité qui est détectable. 2. Inoculer une paire de bouillons phénols rouge + glucose avec 0.1 ml d’un des bacilles. 3. Recouvrir d'huile minérale stérile UN des tubes de bouillon de phénol rouge avec glucose que vous avez inoculé avec un millilitre d’huile minérale stérile. 4. Inoculer une paire de bouillons phénols rouge + arabinose avec 0.1 ml d’un des bacilles. 5. Recouvrir d'huile minérale stérile UN des tubes de bouillon de phénol rouge avec arabinose que vous avez inoculé avec un millilitre d’huile minérale stérile. 6. Inoculer une paire de bouillons phénols rouge + xylose avec 0.1 ml d’un des bacilles. 7. Recouvrir d'huile minérale stérile UN des tubes de bouillon de phénol rouge avec xylose que vous avez inoculé avec un millilitre d’huile minérale stérile. 8. Inoculer une paire de bouillons phénols rouge + mannitol avec 0.1 ml d’un des bacilles. 9. Recouvrir d'huile minérale stérile UN des tubes de bouillon de phénol rouge avec mannitol que vous avez inoculé avec un millilitre d’huile minérale stérile. 10. Répéter les étapes 2-9 avec le 2e inconnu. Donc 8 tubes/inconnu pour un total de 16 tubes. 11. Incuber à 28°C.

Huile minérale Paire de bouillons phénol rouge glucose (PRG) inoculées avec 0.1ml de la même suspension bactérienne. Tube 1 représente des conditions d’aérobie Tube 2 est recouvert d’huile minérale pour créer des conditions d’anaérobies

52

Labo de Microbiologie-2012 FERMENTATION DU GLUCOSE: PRODUCTION D'ACIDES MIXTES OU D'ACÉTOINE Certaines bactéries fermentant le glucose génèrent de grandes quantités d'acides de toutes sortes. Ces acides sont facilement décelés en présence du réactif méthylrouge. D'autres espèces bactériennes ne génèrent que de faibles quantités d'acides, mais de grandes quantités de sousproduits neutres comme l'éthanol et le butanediole. Un des intermédiaires de la production de ces sous-produits est l'acétoine, composé qui peut être décelé à l'aide d'un réactif chimique. Le test de Méthyl-Rouge-Vogues-Proskauer est utilisé pour déterminer le type de fermentation utilisé par un microorganisme donné.

MR/VP : Bact. 2

Méthode 1. Inoculer avec 0.1 ml de chacun vos bacilles inconnus deux bouillons MR-VP. 2. Incuber à 28oC.

MR/VP : Bact. 1

Matériaux Suspensions, préparées dans l’exercice précédent, des bacilles inconnus 2 bouillons MR-VP

URÉASE Certains microorganismes peuvent d'utiliser l'urée comme source de carbone et ou d’azote. L'urée est un sous-produit généré par le catabolisme des protéines chez les vertébrés. Le catabolisme de l'urée par les microorganismes nécessite l’uréase, une enzyme hydrolysant l'urée en l'ammoniac, du bioxyde de carbone et de l'eau. L'ammoniac relâché dans le milieu de culture le rend alcalin. Un indicateur de pH dans le milieu de culture, le phénol rouge, permet de déceler la présence de produits alcalins, en changeant de couleur au rose.

53

Bact. 1

Bact. 2 Urée:

Méthode 1. Strier vos bacilles inconnus sur des pentes d’Agar d’urées. 2. Incuber à 28oC.

Urée:

Matériaux Stries pour colonies simples d’un bacille inconnu Gram positif isolé la semaine passée 2 Pentes d’Agar d’urée

Labo de Microbiologie-2012

Bact. 2 Citrate

Méthode 1. Strier chacun de vos inconnus à la surface d’une pente de citrate de Simmons 2. Incuber à 28oC.

Bact. 1

Matériaux Stries pour colonies simples de bacilles inconnus Gram positifs isolés la semaine passée 2 Pentes de citrate de Simmons

Citrate

L'UTILISATION DU CITRATE COMME SOURCE DE CARBONE Cet essai est conçu pour déterminer si un microorganisme peut utiliser le citrate comme source unique de carbone et des sels d'ammoniums inorganiques comme source unique d'azote. L'utilisation du citrate génère des sous-produits alcalins qui sont décelés par l'inclusion d'un indicateur de pH, le brome thymol bleu, qui est vert à un pH de 6.8 et bleu à un pH de 7.6 ou plus.

UTILISATION DE SOURCES DE CARBONE COMPLEXES: ENZYMES EXOCELLULAIRES Les sources de carbone simple, tels les monosaccharides, les disaccharides et les acides aminés pénètrent la cellule par diffusion simple ou par un système de transport spécifique. Par contre, les sources de carbones complexes, tels les polysaccharides et les protéines, sont des molécules trop grosses pour pouvoir employer l’un ou l’autre de ces mécanismes de transports. Afin d’être utilisées, ces molécules doivent d'abord être clivées en unités plus petites, plus maniables. Le clivage des molécules polymériques en unités monomériques est fait par la sécrétion d'enzymes exocellulaires spécialisées qui fonctionnent à l'extérieur de la cellule. Des exemples de sources de carbone complexes utilisées par certaines bactéries sont l'amidon, un polysaccharide, la caséine, un polypeptide (protéines), la tributyrine, un polymère d’acides gras (un lipide) et l’ADN, un polymère d’acides nucléiques. Certaines espèces bactériennes peuvent synthétiser et excréter l' amylase, une enzyme qui clive le lien -1,4 joignant les monomères de glucose dans l'amidon. Certaines bactéries synthétisent aussi des protéases telles que la caséinase, qui clive le lien peptidique joignant les monomères d’acides aminés. Les lipides peuvent être réduits en acides gras simples par les lipases. Enfin, l’ADNase clive les liens phosphodiestères entre les nucléotides d’une chaîne polynucléotidique. Matériaux Stries pour colonies simples de bacilles inconnus Gram positifs isolés la semaine passée 2 géloses d’amidon, 2 de lait, 2 de tributyrine et 2 d’ADN Méthode 1. Faire des stries pour colonies simples d’un de vos bacilles inconnus sur chacune des géloses d’amidon, de lait, de tributyrine et une d’ADN. 2. Répéter l’étape 1 avec votre deuxième bacille inconnu. 3. Incuber à 28oC. RÉDUCTION DU NITRATE ET DU NITRITE Certaines espèces bactériennes peuvent réduire le nitrate en nitrite, puis réduire le nitrite en ammoniac. Ces réactions sont faites par des enzymes nommées "nitrates réductases", lesquelles 54

Labo de Microbiologie-2012 sont requises pour l'assimilation du nitrate. L'ammoniac produit par ces réactions peut ensuite être utilisé pour la synthèse d'acides aminés. D'autres espèces bactériennes utilisent le nitrate plutôt que l'oxygène comme capteur final d'électrons. La réduction du nitrate au nitrite constitue un sentier dissimilatoire du nitrate. L'utilisation du nitrate comme capteur final d'électrons représente un exemple de respiration anaérobie. NO3NO2NH4+ N2 Nitrate réductase Nitrite réductase d'autres enzymes Matériaux Suspensions d’inconnus bacilles préparés dans l’exercice précédent 2 bouillons de nitrates Méthode 1. Inoculer avec 0.1 ml de chacun vos bacilles inconnus deux bouillons de nitrates. 2. Incuber à 28oC. TOLÉRANCE À DES CONCENTRATIONS ÉLEVÉES DE SELS À des concentrations élevées, le sel agit comme un agent sélectif qui interfère avec la perméabilité des membranes et l’équilibre osmotique de la majorité des bactéries. Les organismes tolérants au sel n’auront aucun problème pour croître sous un tel environnement. Matériaux Stries pour colonies simples de bacilles inconnus Gram positifs isolés la semaine passée 2 bouillons TSB + 6.5% NaCl Méthode 1. Inoculer chacun de vos inconnus dans un des bouillons TSB + NaCl. 2. Incuber à 28oC.

55

Labo de Microbiologie-2012 CYTOCHROME OXYDASE Plusieurs espèces de bactéries aérobies et quelques espèces de bactéries anaérobies facultatives possèdent le cytochrome oxydase dans leur chaîne de transport d’électrons. Le cytochrome transfère des électrons à l'oxygène, produisant de l'eau. La présence du cytochrome oxydase est facilement déterminée par l’ajout de p-aminodimethylaniline oxalate, réactif pouvant faire don d'électrons (devenant ainsi oxydé) à la cytochrome oxydase. De ce fait, le p-aminomethylaniline oxalate devient rose et éventuellement noir quand il est oxydé. Matériaux Stries pour colonies simples de bacilles inconnus Gram positifs isolés la semaine passée Réactif p-aminodimethylaniline oxalate Méthode 1. Demander à un aide enseignant d’ajouter une goutte du réactif permettant la détection du cytochrome oxydase sur une des colonies de vos inconnus bactériens. 2. Examiner s'il y a un changement de couleur, de la colonie et non pas du milieu, après 1-2 minutes.

LA MOTILITÉ BACTÉRIENNE Plusieurs bactéries peuvent nager en utilisant le flagelle. Le flagelle est semblable à ceux des eucaryotes, mais de structure très différente. Pas toutes les bactéries possèdent des flagelles, ces dernières sont beaucoup plus commune chez les bacilles, mais il y a quelques rares coques qui les possèdent aussi. Le fait qu’une bactérie soit motile ou non peut être utilisé pour permettre à leur identification. Une des façons de déceler la motilité est de faire croitre les cultures dans des milieux contenant une faible concentration d’Agar et d’observer si les bactéries se sont éloignées de site initial de l’inoculation. Du triphenyl tetrazolium chloride est souvent inclus dans ces milieux pour aider à la visualisation. Cet indicateur est réduit par la majorité des bactéries, le rendant rouge. Matériaux Stries pour colonies simples de bacilles inconnus Gram positifs isolés la semaine passée 2 tubes profonds de TSA contenant 0.001% triphenyl tetrazolium chloride et 0.5% d’agar

56

Labo de Microbiologie-2012 Méthode 1. Utiliser une aiguille d’inoculation stérilisée (pas la boucle) afin de récolter de la croissance d’un de vos inconnus puis l’enfoncer dans le milieu d’essai de motilité en piquant au centre. 2. Répéter avec votre deuxième inconnu dans un autre tube profond. 3. Incuber à 28oC.

CATALASE La catalase est une enzyme qui se retrouve dans la plupart des organismes vivants en présence d'oxygène, comme les microorganismes aérobies et facultatifs. Le métabolisme de l'oxygène génère des radicaux libres, tel le peroxyde, qui endommage la cellule. Afin de se protéger, ces microorganismes génèrent la catalase qui réduit le peroxyde en le convertissant en eau et en oxygène par le sentier suivant : 2H2O2

2H2O + O2

L'émission d'oxygène est facilement décelée en tant que petites bulles. Matériaux Stries pour colonies simples de bacilles inconnus Gram positifs isolés la semaine passée Peroxyde 3% (v/v) Méthode 1. Ajouter 1-2 gouttes de peroxyde 3% sur une des colonies de vos inconnus. 2. Observer s'il y a formation de bulles.

57

Labo de Microbiologie-2012 IDENTIFICATION DES COCCI GRAM POSITIFS; FAMILLES DES MICROCOCCACEAE ET DES STREPTOCOCCACEAE (Groupe de 2) Les Micrococcaceae La famille des Micrococcaceae inclut des organismes pathogènes et non pathogènes souvent associés à la flore naturelle humaine. Cette famille inclut deux genres principaux, les Staphylococcus et les Micrococcus. Tous deux peuvent utiliser l’oxygène et possèdent un métabolisme typiquement respiratoire. Plus spécifiquement, les membres du genre Micrococcus sont des aérobies stricts tandis que ceux du genre Staphylococcus sont des aérobies facultatifs. En effet, les Micrococcus produisent de l’acide du glucose seulement en conditions d’aérobie tandis que les Staphylococcus le font sous des conditions d’aérobies et d’anaérobies. Plusieurs espèces de Micrococcus ont des colonies pigmentées, tel que M. luteus (jaune) ou M. roseus, (rose). Leurs cellules ont souvent un arrangement de tétrade. Résident de la peau, ce genre bactérien est rarement pathogène, étant plutôt un opportuniste. Contrairement aux Micrococcus, les Staphylococci sont des parasites humains qui peuvent sous certaines conditions être la cause de maladies graves. Les trois espèces principales du genre Staphylococcus sont S. aureus, S. saprophyticus et S. epidermidis. S. epidermidis est un organisme non pigmenté non pathogène habituellement retrouvé sur la peau ou les muqueuses. S. aureus, une espèce de couleur jaune, est souvent associé à l’acné, les pneumonies, des méningites, et le choc toxique. S. Saprophyticus, un autre organisme souvent retrouvé sur la peau, est non pigmenté et souvent associé aux infections urinaires. Les Streptococcaceae Cette famille inclut les bactéries du genre Streptococcus, qui inclut des espèces pathogènes et non pathogènes. Ce genre est divisé en trois groupes d’espèces apparentées; les Lactococcus, qui inclut les streptocoques d’importance pour l’industrie laitière, les Enterococcus, qui inclut les streptocoques d’origine fécale et les Streptococcus, qui regroupe la majorité des espèces pathogènes. Ces dernières sont classifiées d’après le système de classification de Lancefield, divisant ces bactéries en 8 groupes (A-H et K-U). Cette classification est fondée sur la réaction immunologique des polysaccharides de leurs parois. Les membres d'importance clinique du genre Streptococcus incluent celle du groupe A; S. pyogenes. Cette bactérie est la cause principale des streptococcies de la gorge et dans de rares cas cause la détérioration massive des tissus (« mangeuse de chair »). S. agalactiae, seul membre du groupe B, cause des septicémies chez les nouveau-nés, causant la mort dans 75% des cas. Les entérocoques du groupe D, sont impliqués dans les infections du système urinaire, les endocardites, ainsi que les infections des plaies. D’autres Streptococci qui ne sont pas classifié d’après les groupes de Lancfield incluent, S. pneumoniae, la cause principale des pneumonies ainsi que S. mutans et S. mitis responsables des caries dentaires.

58

Labo de Microbiologie-2012 Matériaux Bouillon de culture catalase positif (C+No) Bouillon de culture catalase négatif (C-No) 2 géloses de chocolat Méthodes Morphologie Coloniale 1. Faire des stries pour colonies simples de chacun de vos inconnus sur des géloses de chocolat. 2. Incuber la culture catalase négative à 37oC dans la cuve à chandelle. o 3. Incuber la culture catalase positive à 37 C. Coloration de Gram 1. Faire une coloration de Gram de chacun des inconnus. 2. Faire la prise de photos numériques pour votre rapport. 3. Prendre en note la coloration de Gram, la forme cellulaire et l’agrégation cellulaire. DIAGNOSTIC DE COCCI GRAM POSITIF CATALASE NÉGATIF HÉMOLYSE SANGUINE L’Agar de sang (BA) contient des nutriments généraux et 5% de sang de mouton. Il est utile pour la croissance d’organisme fastidieux et pour la détermination des capacités hémolytique. Certaines bactéries produisent des exoenzymes qui lysent les globules rouges et dégradent l’hémoglobine; les hémolysines. Il existe différents types d’hémolysines. Les Beta-hémolysines lyse les globules rouges et dégradent l’hémoglobine complètement. Ceci résulte en une zone d’éclaircissement complète. De tels résultats se disent une hémolyse-β. Plusieurs espèces pathogènes des Streptococcus et quelque une des Staphylococcus appartiennent à ce groupe. L’hémolysine alpha dégrade partiellement les globules rouges laissant une couleur verdâtre. Ceci se dit une hémolyseα. La couleur verdâtre est causée par la présence de biliverdine, un sous-produit de la dégradation. Plusieurs espèces non pathogènes des Streptococcus sont de ce groupe. Si l’organisme ne produit pas d’hémolysines et ne dégrade pas les globules rouges, il n’y aura pas d’éclaircissement. Ceci s’appelle une hémolyse-γ. La plupart des Streptococcus de ce groupe ne sont pas pathogènes. Matériaux Bouillon de culture catalase négatif (C-No) Gélose de sang Méthode 1. Faire des stries pour colonies simples de l’inconnu catalase négatif sur une gélose de sang. 2. Incuber à 37oC dans la cuve à chandelle.

59

Labo de Microbiologie-2012 BILE-ESCULINE Ce test est utile pour l’identification des streptocoques de groupe D; les Enterococcus. Ceux-ci font l’hydrolyse de l’esculine à l’esculitine et du glucose. L’esculitine réagit avec un sel du fer, le citrate ferrique, générant complexe brun foncé ou noir. De la bile est incluse pour inhiber la croissance de bactéries Gram positive autre que les Enterococci. Matériaux Bouillon de culture catalase négatif (C-No) Pente de bile esculine Méthode 1. Strier une pente de bile-esculine avec votre inconnu catalase négatif. 2. Incuber à 37oC. SENSIBILITÉ À LA BACITRACINE ET À L’OPTOCHINE La sensibilité à ces antibiotiques permet l’identification présomptive de différents membres du genre S. pyogenes et S. pneumoniae. Matériaux Bouillon de culture catalase négatif (C-No) Applicateur à embout de coton stérile 1 Gélose de chocolat 1 disque de bacitracine 1 disque d’optochine Méthode 1. Plonger un applicateur à embout de coton stérile dans la culture de votre inconnu catalase négatif. 2. Étaler la bactérie sur la surface d'une gélose de chocolat, recouvrant autant de la superficie que possible. 3. Utiliser des forceps stériles pour déposer un disque de bacitracine et un disque d’optochine sur la surface de la gélose. 4. Incuber la gélose à 37°C dans la cuve à chandelle.

60

Labo de Microbiologie-2012 DIAGNOSTIC DES MICROCOCCACEAE GÉLOSES DE MANNITOL + SELS Ce milieu contient une concentration élevée de sels (7.5%) qui permet d’enrichir les bactéries du genre Staphylococcus. Comme les bouillons phénol rouges, ce milieu fournit deux sources de carbones, le mannitol ou des protéines. L’inclusion d’un indicateur de pH, le phénol rouge, permet de discriminer les Staphylococcus fermenteurs, tel que S. aureus, des non-fermenteurs. Matériaux Bouillon de culture catalase positif (C+No) 1 Gélose mannitol + sels Méthode 1. Strier pour colonies simples l’inconnu catalase positif sur une gélose de mannitol + sels. 2. Incuber à 37oC. AGAR DE TELLURITE OU AGAR DE BAIRD PARKER Ce milieu est sélectif pour l’identification présomptive de staphylococci coagulase positifs. La sélectivité de ce milieu est due au chlorure de lithium et une solution de 1% de Potassium de Tellurite, qui inhibent la croissance d’organismes autres que les staphylococci. La discrimination de staphylococci coagulase-positif est fondée sur le Potassium Tellurite et une émulsion de jaune d’œuf. Les staphylococci qui possèdent la lecithinase dégradent le jaune d’œuf causant une zone d’éclaircissement autour des colonies. La réduction du Potassium de Tellurite, une caractéristique des staphylococci coagulase-positifs, cause le noircissement des colonies. Matériaux Bouillon de culture catalase positif (C+No) 1 gélose d’agar de Tellurite Méthode 1. Strier pour colonies simples l’inconnu catalase positif sur une gélose de Tellurite. 2. Incuber à 37oC. SENSIBILITÉ À LA NOVOBIOCINE La sensibilité à la novobiocine permet de discriminer S. saprophyticus des autres bactéries du genre Staphylococcus; S. saprophyticus étant résistant. Matériaux Bouillon de culture catalase positif (C+No) Une gélose de chocolat Applicateur à embout de coton stérile Méthode 1. Plonger un applicateur à embout de coton stérile dans la culture catalase positive. 2. Étaler la bactérie sur la surface d'une gélose de chocolat, recouvrant autant de la superficie que possible. 3. Avec des forceps stériles, déposer un disque de novobiocine sur la surface de la gélose. 4. Incuber la gélose à 37°C. 61

Labo de Microbiologie-2012

Jour 2 IDENTIFICATION DE BACILLES GRAM POSITIFS – INTERPRÉTATION DES TESTS Métabolisme de sources de carbone simples 1. Obtenir vos pairs de tubes de phénol rouges et faire les observations suivantes : Est-ce qu’il y a eu croissance De quelle couleur est le bouillon Est-ce qu’il y a accumulation de gaz

Acide Alcalin Acide + Gaz 2. D’après vos observations, déterminez quels sucres ont été utilisés et par quel métabolisme. FERMENTATION DU GLUCOSE: PRODUCTION D'ACIDES MIXTES OU D'ACÉTOINE 1. Afin de compléter les tests de MR et VP, transférer 1 ml du bouillon de culture MRVP que vous avez préparé au labo précédant à chacun de deux nouveaux tubes. 2. Pour le test de MR, ajouter 2 gouttes de méthyl rouge à l'un des deux tubes. Observer la couleur à la surface du bouillon. Une couleur rouge indique la présence d'une grande quantité d'acides, tandis qu'une couleur jaune indique une absence d'acides.

3. Afin de compléter le test de VP, ajouter 6 gouttes d'alpha-naphtol au deuxième tube. 4. Ajouter 3 gouttes de KOH à 40% au tube. 5. Bien mélanger et laisser la réaction se poursuivre pour 10-15 minutes. 6. Observer s'il y a un changement de couleur. Le développement d'une couleur rouge indique la présence d'acétoine.

62

Negatif

Positif

Positif

Negatif

Labo de Microbiologie-2012 URÉASE 1. Examiner vos pentes pour tout changement de couleur au rose. Cette couleur indique la présence de produits alcalins générés par l’action de l’uréase.

UTILISATION DU CITRATE COMME SOURCE DE CARBONE 1. Examiner vos pentes pour un changement de couleur au bleu. Cette couleur indique que des sous produits alcalins ont été générés ce qui indique que le citrate a été utilisé comme source de carbone.

Negatif Positif

Negatif

Positif

UTILISATION DE SOURCES DE CARBONE COMPLEXES: ENZYMES EXOCELLULAIRES 1. Obtenir les géloses d’amidon, de lait, de tributyrine et d’ADN que vous avez inoculées. 2. Examiner les géloses de lait, de tributyrine et d’ADN pour un éclaircissement autour de la croissance. Un tel éclaircissement indique la production de l’enzyme exocellulaire. 3. Dans le cas de la gélose d’amidon, inonder la croissance sur la gélose avec de l’iode de Gram. L’iode de Gram réagit avec l’amidon pour donner une couleur bleu foncé. L’absence de cette couleur indique la dégradation de l’amidon

Amylase

Caséinase

Lipase

63

ADNse

Labo de Microbiologie-2012 RÉDUCTION DU NITRATE ET DU NITRITE 1. Afin de déterminer si vos inconnus peuvent réduire le nitrate, ajouter 3 gouttes d'acide sulfanilique et 3 gouttes d'alpha-naphtylamine à votre culture dans le bouillon de nitrate. Ces réactifs réagissent avec le nitrite générant une couleur rouge. 2. Observer s'il y a un changement de couleur après une minute. S'il n'y a pas changement, ajouter un peu de poussière de zinc. 3. Observer s'il y a un changement de couleur. Le zinc réduit les nitrates aux nitrites qui réagissent avec l'acide sulfanilique et alpha-naphtylamine générant une couleur rouge.

Résultats après l’ajout de l'acide sulfanilique et alpha-naphtylamine

Résultats après l’ajout de zinc

LA MOTILITÉ BACTÉRIENNE Examiner vos tubes profonds afin de déterminer si vos inconnus bactériens sont motiles.

TOLÉRANCE À DES CONCENTRATIONS ÉLEVÉES DE SELS Examiner vos cultures pour une croissance abondante. IDENTIFICATION DE VOS BACILLES GRAM POSITIFS INCONNUS Utiliser l’organigramme sur la page web du cours pour identifier les genres et espèces bactériennes de vos inconnus. http://mysite.science.uottawa.ca/jbasso/microlab/IDFlowcharts.pdf

64

Labo de Microbiologie-2012 DIAGNOSTIC DES MICROCOCCACEAE ET DES STREPTOCOCCACEAE DIAGNOSTIC DES COCCI GRAM POSITIFS CATALASE NÉGATIF HÉMOLYSE SANGUINE 1. Examiner vos géloses de sang et déterminer le type d’hémolyse observé : alpha, bêta ou gamma.

BILE-ESCULINE 1. Examiner vos pentes de bile esculine. L’assombrissement du milieu indique la présence d’esculitine qui résulte de l’hydrolyse de l’esculine

SENSIBILITÉ À LA BACITRACINE ET À L’OPTOCHINE Les tests de sensibilité à la bacitracine et à l’optochin sont utilisés pour identifier Streptococcus pyogenes et Streptococcus pneumoniae, respectivement. Seules ces deux espèces de Streptococcus sont sensibles aux antibiotiques respectifs quand le test est fait.

65

Labo de Microbiologie-2012 DIAGNOSTIC DES COCCI GRAM POSITIFS CATALASE POSITIF GÉLOSES DE MANNITOL + SELS

Négatif

Positif

AGAR DE TELLURITE Vérifier votre étalement sur l’agar de Tellurite pour déterminer si des colonies typiques de Staphylococcus aureus sont observées. Si une identification positive présomptive de S. aureus est faite, faire le test de Coagulase indiqué ci-dessous.

66

Labo de Microbiologie-2012 COAGULASE Ce test est utile pour différentier S.aureus des autres staphylococci coagulase négatifs. La majorité des souches de S.aureus produisent 2 types de coagulases, libre et liée. La libre est une enzyme sécretée extracellulairement, tandis que celle liée est associée à la paroi. La coagulase libre est détectée en tube tandis que la coagulase liée est détectée sur lame. TEST DE COAGULASE SUR LAME Principe: La coagulase liée est aussi connue comme le facteur d’agglutination. Elle crée des liens croisés entre les chaînes α et β du fibrinogène du plasma formant des caillots de fibrine qui se dépose sur la paroi cellulaire. En conséquence, les coccus individuels se collent les uns aux autres et une agglutination est observée. Matériaux Colonies simples de la culture de S.aureus suspecte sur gélose de chocolat Plasma citré de lapin Eau stérile Méthode 1. Diviser une lame en deux sections avec un crayon-feutre tel qu’illustré ci-dessous:

Test

Control

2. Étiqueter un côté ―Test‖ et l’autre ―Contrôle‖. 3. Ajouter une petite goutte d’eau à chaque côté. 4. Avec la boucle d’inoculation stérile, suspendre deux à trois grosses colonies de la bactérie

suspecte dans chacune des gouttes d’eau. Bien mélanger pour obtenir une bonne suspension turbide. 5. Ajouter une goutte de plasma de lapin citré à la région test et bien mélanger. 6. L’agglutination des cocci observée dans les 5-10 secondes est interprétée comme positif.

À noter: Quelques souches de S. aureus pourraient ne pas produire de Coagulase liée et de telles souches doivent être identifiée par le test de coagulase en tube. 67

Labo de Microbiologie-2012 SENSIBILITÉ À LA NOVOBIOCINE 1. Mesurer la zone d'inhibition. Un diamètre de 17mm ou moins indique une résistance, tandis qu’un diamètre de plus de 17mm indique que l’isolat est sensible. OXYDASE Ce test permet de discriminer les bactéries du genre Staphylococcus de celles du genre Micrococcus. Contrairement aux staphylocoques, les microcoques sont oxydase positive. 1. Ajouter une goutte du réactif de l’oxydase sur la croissance de votre inconnu. 2. Examiner s'il y a un changement de couleur après 1-2 minutes. Identification de vos inconnus de la famille des Micrococcaceae Utiliser l’organigramme sur la page web du cours pour identifier les genres et espèces bactériennes de vos inconnus. http://mysite.science.uottawa.ca/jbasso/microlab/IDFlowcharts.pdf BIOREMÉDIATION (Partie 4) Matériaux Flacon de bioremédiation Glycérol Tube à capuchon bouton-pression Méthode 1. Enregistrer toute observation en ce qui a trait à l’apparence de votre culture de bioremédiation. 2. Transférer 0.85 ml de la culture bactérienne à un tube à capuchon bouton-pression. 3. Ajouter 0.15 ml de glycérol stérile (15%, v/v). 4. Mélanger au vortex afin de vous assurer que le glycérol est dispersé uniformément. 5. Étiqueter de façon appropriée avec votre numéro de groupe et la date. 6. Congeler à –20 C pour un entreposage à long terme. RAPPORT SUR L’IDENTIFICATION D’INCONNUS BACTÉRIENS Chaque personne ou équipe de deux doit rédiger et remettre un manuscrit qui rapporte leurs résultats. Le manuscrit devrait inclure ce qui suit: A. Titre et les noms des auteurs B. Introduction : Cette section devrait traiter des raisons pourquoi l’isolation et l’identification d’organismes bactériennes est importantes ainsi que les techniques générales qui sont utilisées a cette fin (Non seulement celle vue en labo). C. Résultats : Présenter les tests qui ont été faits, quelles observations ont été faites et leurs interprétations respectives. Des tableaux et figures seraient utiles pour cette section. Présentez comment certains ou tous les résultats obtenus ont permis d’identifier l’organisme inconnu. Un organigramme serait une bonne idée pour cette section. D. Discussion : Dans cette section vous devez écrire (environ une page pour chaque organisme) une description détaillée de l’organisme identifié. Vous devriez trouver de l’information sur leurs caractéristiques générales, physiologie, impacte environnementales (s’il y en a) utilités, importance clinique et traitement. E. Références : Lister toutes les références utilisées d’après le style recommandé par le « Journal of Bacteriology ». 68

Labo de Microbiologie-2012 LABO NO6 CONTRÔLE DE LA CROISSANCE MICROBIENNE

Jour 1 COMPOSÉS ANTIBACTÉRIENS - ANTIBIOTIQUES (Groupe de 2) Les antibiotiques sont des composés synthétiques, semi-synthétiques ou naturels qui inhibent ou tuent les bactéries. Les antibiotiques sont généralement classés selon leurs modes d’action : bactériostatique, bactériolytique ou bactéricide. Les antibiotiques bactériostatiques inhibent les bactéries sans les tuer. Les bactériolytiques tuent les bactéries en lysant les cellules alors que les bactéricides tuent sans lyse concomitante. ESSAI DE DIFFUSION DE KIRBY-BAUER Avant de pouvoir utiliser un antibiotique sur un nouveau pathogène il est essentiel d'évaluer la sensibilité du pathogène à l'antibiotique. Initialement, la sensibilité du pathogène cible à une variété d'antibiotiques est testée afin de déterminer lesquels peuvent être utilisés. Cela est habituellement fait par un essai semi-quantitatif appelé « la méthode de sensibilité de disque de Kirby-Bauer ». Cet essai consiste à évaluer la sensibilité d'une espèce bactérienne à une variété d’antibiotiques. L'essai est fait sur une gélose sur laquelle est étalé un inoculum de la bactérie étant examinée. Des disques contenant des quantités connues d'antibiotiques à être évaluées sont alors déposés sur la surface de la gélose. Après une période d'incubation appropriée pour la croissance optimale de la bactérie examinée, l’efficacité des antibiotiques est évaluée en fonction des étendues des zones d’inhibitions de la croissance bactérienne à proximité des disques; les zones d'inhibition forment des halos autour des disques. Le diamètre du halo formé constitue une mesure de la sensibilité relative de la bactérie à l'antibiotique (voir la figure) Les recommandations des tailles des zones d’inhibitions pour l’interprétation de l’essai de KirbyBauer (résistant, intermédiaire, sensible) ont été établies par des organisations impliquées dans le contrôle des maladies.

69

Labo de Microbiologie-2012 Matériaux Bouillon de culture de 5 ml de S. aureus Bouillon de culture de 5 ml de S. epidermididis Bouillon de culture de 5 ml d’E.coli 3 géloses de chocolat Écouvillons stériles Disques imprégnés d'antibiotiques Forceps Méthode 1. Étiqueter trois géloses de chocolat d’après la souche bactérienne à être testée (Staphylococcus, Streptococcus et E.coli) 2. Immergé un écouvillon dans le bouillon de culture jusqu’à ce qu’il soit complètement imbibé. Enlever le surplus de la suspension de l’écouvillon en exerçant une pression contre la paroi de l’éprouvette. 3. Étaler la culture appropriée sur la surface entière de chaque gélose appropriée. Une distribution égale est essentielle; étalé de façon uniforme dans trois directions afin qu’un étalement égal et une croissance confluente en résulte. 4. Les géloses étant recouvertes, permettez aux inocula de s’assécher pour 3 à 5 min. 5. Déposer les disques d’antibiotiques sur vos géloses. Utiliser des forceps stériles pour appliquer une légère pression sur chaque disque afin d’assurer un bon contact avec l’Agar. 6. Incuber les géloses inversées à 37°C. DÉTERMINATION DE LA DOSE THÉRAPEUTIQUE Lorsqu'un antibiotique est utilisé à des fins thérapeutiques, on doit au préalable déterminer sa concentration efficace minimale, à défaut de quoi, un dosage trop élevé ou trop faible pourrait être prescrit. Pourquoi l’un ou l’autre de ces scénarios représente-t-il un problème? La méthode de dilution de bouillon est la façon la plus courante de déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI) et la concentration minimale bactéricide (CMB) d'un antibiotique. Cette méthode consiste à ensemencer une quantité constante de bactéries dans un bouillon de croissance avec différentes concentrations de l'antibiotique à être évalué. La plus basse concentration d'antibiotique pour laquelle aucune croissance bactérienne n'est observée, après une période d'incubation appropriée, représente le CMI. Croissance

CMI

70

Pas de Croissance

Labo de Microbiologie-2012 Matériaux Bouillon de culture de 5 ml de S. aureus Bouillon de culture de 5 ml de S. epidermididis Bouillon de culture de 5 ml d’E.coli 10 ml de l'antibiotique assigné (1mg/ml dans du TSB) Approx. 100 ml de TSB 27 Éprouvettes stériles Antibiotique Ampicilline Kanamycine Acide naladixique Tétracycline Érythromycine

Classe Bêta-lactamine Aminoglycoside Quinolone Tétracycline Macrolide

Abréviation A K N T M

Méthode 1. Étiqueter trois jeux de 8 éprouvettes (Un jeu/espèce bactérienne) avec l’espèce bactérienne étant testée, l’antibiotique testé et votre numéro de groupe. 2. Ajouter 2.5ml de TSB à chacune des éprouvettes. 3. Ajouter 2.5ml de la solution stock de l’antibiotique assigné au premier tube de chaque jeu de huit. Bien mélanger. 4. Transférer 2.5ml du premier tube de chaque jeu au second tube de chaque jeu. Bien mélanger. 5. Transférer 2.5ml du deuxième tube de chaque jeu au troisième tube de chaque jeu. Bien mélanger. 6. Poursuivre cette démarche pour les 8 éprouvettes. Vous devriez donc avoir généré huit jeux de dilutions en série de facteurs 2 de l’antibiotique assigné. Toutes les éprouvettes devraient contenir 2.5ml de milieu sauf pour la dernière. 7. Retirer et jeter 2.5ml de la dernière éprouvette de chaque jeu. 8. Dilué dans du TSB chacune des cultures fournit afin d’obtenir 5 ml de bouillon qui représente un facteur de dilution de 1 000X. 9. Ensemencer chacune des 8 éprouvettes d’un jeu avec 0.1 ml de la culture de Staphylococcus que vous avez dilué précédemment. 10. Ensemencer chacune des 8 éprouvettes de la deuxième série avec 0.1 ml de la culture de Streptococcus que vous avez dilué précédemment. 11. Ensemencer chacune des 8 éprouvettes de la troisième série avec 0.1 ml de la culture d’E.coli que vous avez dilué précédemment. 12. Incuber les éprouvettes ensemencées à 37oC.

71

Labo de Microbiologie-2012 DÉSINFECTANTS & ANTISEPTIQUES (Individuellement) Il existe plusieurs classes de produits antibactériens, tels que les antiseptiques, les désinfectants et les antibiotiques. Ceux-ci ont tous pour but de soit réduire le nombre de bactéries, de les éliminer ou d’inhiber leurs croissances. Certains ont un usage thérapeutique, tels les antiseptiques et les antibiotiques tandis que d’autres sont utilisés pour des buts préventifs ou esthétiques, tels les désinfectants. L'utilisation des antiseptiques et des désinfectants vise à réduire de façon significative le nombre de bactéries dans un secteur donné et d’empêcher leurs croissances. Les antiseptiques sont des composés chimiques destinés à l'utilisation humaine, tandis que les désinfectants sont destinés aux objets. L'EFFICACITÉ DES SAVONS À MAINS Probablement les désinfectants/antiseptiques les plus couramment utilisés dans la vie de tous les jours sont les savons. Une de leurs utilisations populaires est le lavage des mains; soit avant de commencer à cuisiner ou dans le cas d’un chirurgien, avec qu’il opère sur un individu. Le but de se laver les mains est double. Éliminer les bactéries que vous auriez pu acquérir de la manipulation de différents objets (la flore transitoire) et de réduire le nombre de bactéries qui résident normalement sur vous (la flore résidente). Évidemment, la stérilisation des mains n'est pas possible, car les microorganismes vivent non seulement à la surface, mais aussi, dans les couches profondes de la peau. Cette flore naturelle est principalement constituée de bactéries non pathogènes du genre Staphylococcus. Dans l'exercice suivant, nous évaluerons l'efficacité de différents savons à mains et de différents antiseptiques pour les mains.

The skin microbiome Elizabeth A. Grice & Julia A. Segre Nature Reviews Microbiology 9, 244-253 (April 2011)

72

Labo de Microbiologie-2012 Matériaux Savon assigné: Purell, Savon antibiotique, Savon naturel (glycérine), Eau 4 géloses de chocolat Écouvillons stériles Eau stérile Méthode 1. Assigner à chacune des personnes du groupe de 4 un des traitements ci-dessus. 2. Chaque personne devra obtenir 4 géloses de chocolat. 3. Étiqueter trois des géloses avec votre nom, la lettre « D » et le numéro du traitement (0, 1 et 2). Ces géloses sont celles sur lesquelles vous étalerez des échantillons de votre main dominante (celle avec laquelle vous écrivez) 4. Étiqueter la quatrième gélose avec votre nom, la lettre « M » (pour mineure) et « 0 » (pas de traitement). Cette gélose sera celle sur laquelle vous étalerez des échantillons de votre autre main (celle que vous utilisez le moins souvent) 5. Humecter un écouvillon stérile avec un peu d’eau stérile. Nettoyer avec l’écouvillon humecté autant de la surface de la paume de votre main mineure (votre main gauche si vous êtes droitier). 6. Étaler sur toute la surface de la gélose étiquetée ―M0‖ avec cet échantillonnage. 7. Répéter les étapes 3 et 4 pour votre main dominante et étaler cet échantillonnage sur la gélose étiquetée ―D0‖. 8. Après votre échantillonnage initial, lavez vos mains pour deux minutes avec le traitement assigné. 9. Échantillonner la paume de votre main dominante telle que précédemment et étaler cet échantillonnage sur la gélose étiquetée ―D1‖. 10. Répéter le lavage de vos mains pour 2 minutes additionnelles, puis échantillonner la paume de votre main dominante telle que précédemment et étaler cet échantillonnage sur la gélose étiquetée ―D2‖. 11. Incuber les géloses inverses à 37oC. Remplir le questionnaire suivant : Genre (male ou femelle) Main dominante (Droite ou gauche) Traitement

73

Labo de Microbiologie-2012

Jour 2 COMPOSÉS ANTIBACTÉRIENS - ANTIBIOTIQUES ESSAI DE DIFFUSION DE KIRBY-BAUER Obtenir les diamètres des zones d’inhibitions pour chacun des antibiotiques avec chacune des cultures bactériennes testées.

Utiliser les données du tableau ci-dessous afin de déterminer la susceptibilité de chacune des bactéries. I = mm étendue

AMC

R = mm ou moins 19

S = mm ou plus 20

AMC

13

14-17

18

Ampicilline (Staph)

AM

28

Ampicilline (autre bactéries)

AM

11

12-13

14

Carbénicilline (Pseudomonas)

CB

13

14-16

17

Carbénicilline (autres bactéries)

CB

17

18-22

23

Céfoxatime

CTX

14

Céphalothin

CF

14

15-17

18

Chloramphénicol

C

12

13-17

18

Érythromycine

E

13

14-22

23

GM

12

13-14

15

M (or DP)

9

10-13

14

Pénicilline

P

28

Streptomycine

S

11

12-14

15

SXT-TMP

10

11-15

16

TE

14

15-18

19

Agent antimicrobien

CODE

Amoxicilline (Staph) Amoxicilline (autres bactéries)

Gentamycine Méthicilline (Staph)

Sulfamethoxazole-trimethoprim Tétracycline

74

29

23

29

Labo de Microbiologie-2012 DÉTERMINATION DE LA DOSE THÉRAPEUTIQUE Puisque la plupart des antibiotiques sont bactériostatiques à de faibles concentrations, il n'est pas possible de déterminer par le CMI la dose à laquelle un antibiotique bactéricide a une efficacité maximale. Pour ce faire, il faut avoir recours à la détermination du CMB. La méthode utilisée est la même que celle utilisée pour la détermination du CMI sauf que des sous-cultures sont préparées à partir des essais du CMI pour lesquels aucune croissance n'a été observée, dans du bouillon de croissance dépourvu d’antibiotiques: La concentration d'antibiotique pour laquelle aucune croissance bactérienne n’est réchappée représente la CMB. Croissance

CMI

Pas de Croissance

Inoculation à partir du CMI dans du milieu dépourvu d’antimicrobien

Matériaux Essai de CMI fait précédemment Tubes contenant 5ml de TSB

CMB

Méthode 1. Obtenir un tube contenant 5 ml de bouillon TSB pour chaque concentration à laquelle aucune croissance n'a été observée dans l'expérience de la détermination du CMI. 2. Étiqueter chaque tube avec la concentration d'antibiotique à laquelle aucune croissance n'a été observée. 3. Ensemencer chaque tube avec 0.1 ml du bouillon de culture qui correspond aux tubes d’essais du CMI où aucune croissance n'a été observée. 4. Incuber jusqu’a demain à 37oC. 5. Déterminer la plus basse concentration d'antibiotique où la croissance bactérienne ne pouvait pas être réchappée.

75

Labo de Microbiologie-2012 L'EFFICACITÉ DES SAVONS À MAINS 1. En premier lieu, vous allez vouloir déterminer la superficie approximative de la paume de vos mains. Pour ce faire, placer votre main, paume vers le bas, sur une feuille de papier tel qu’illustré, puis tracer le contour sans inclure la région de votre poignet. Ensuite, déterminez le poids de la feuille de papier. Après avoir déterminé le poids de la feuille, découpez le profil de votre main et déterminez son poids. 2. Une feuille de papier standard (8po X 11po) possède une superficie

d’approximativement 603 cm2. Déterminez la relation entre le poids et la superficie, puis utilisez cette même relation afin de déterminer la superficie approximative de votre paume. 3. Déterminer le nombre d’UFC sur chacune des géloses et enregistrer vos données comme suit

dans le chiffrier Excel au podium: Genre

Traitement

Superficie de la main dominante

UFC D0

D1

D2

M

CINÉTIQUE DE MORTALITÉ Différents microorganismes possèdent des susceptibilités variées aux traitements Par exemple, les spores sont particulièrement résistant. Tout comme pour la croissance bactérienne, la mortalité survient de façon exponentielle. Donc, des fonctions mathématiques qui décrivent le profil de la mort cellulaire sous une condition donnée ont été formulées. De telles fonctions sont utiles pour déterminer le temps minimal requis pour réduire une population microbienne sous un seuil néfaste. Le temps de réduction décimale, s’appelle la valeur D, qui représente la durée de temps sous de conditions donnée nécessaire pour réduire une population de microorganismes par une valeur de un log ou de 90%. En autres mots, si la valeur D d’E. coli est 1 minute, ceci indique qu’une exposition d’une minute est requise pour réduire la population bactérienne de 90%. Donc, pour réduire une population de 1 x 106 à 1 x 104 cellules d’E. coli cela prendrait 2D se qui équivaut à 2 minutes. Les valeurs D sont influencées par l’espèce bactérienne, leur forme, ainsi que les conditions dans lesquelles elles se retrouvent. Par exemple, la valeur D pour des spores est habituellement beaucoup plus élevée que celle de cellules végétatives. Lire l’article de recherche disponible sur la page web de ce cours sous la rubrique Devoirs, afin de répondre aux questions pertinente dans votre devoir.

76

Labo de Microbiologie-2012 BIOREMÉDIATION (Partie 5) Matériaux Flacon de bioremédiation Glycérol Tube à capuchon bouton-pression Méthode 1. Enregistrer toute observation en ce qui a trait à l’apparence de votre culture de bioremédiation. 2. Transférer 0.85 ml de la culture bactérienne à un tube à capuchon bouton-pression. 3. Ajouter 0.15 ml de glycérol stérile (15%, v/v). 4. Mélanger au vortex afin de vous assurer que le glycérol est dispersé uniformément. 5. Étiqueter de façon appropriée avec votre numéro de groupe et la date. 6. Congeler à –20 C pour un entreposage à long terme.

77

Labo de Microbiologie-2012 LABO NO 7 MICROBIOLOGIE DE L’EAU ET DES ALIMENTS

Jour 1 QUALITÉ MICROBIOLOGIQUE DE L’EAU (Groupe de 2) L'importance de l'approvisionnement en eau potable (buvable) ne peut pas être surestimée. Avec l'industrialisation croissante, les sources d'eau disponibles pour la consommation et les loisirs ont été corrompues par des déchets industriels ainsi que de source animale et humaine. En conséquence, l'eau est devenue un formidable facteur de transmission de maladies. Les eaux polluées contiennent de grandes quantités de matière organique qui sont d'excellentes sources nutritionnelles pour la croissance et la multiplication des micro-organismes. La présence et le nombre de bactéries coliformes, des bactéries qui sont normalement résidents de l'intestin des mammifères, et d'autres organismes entériques dans l'eau est un signe de contamination fécale et peut suggérer la présence d'agents pathogènes. Ces agents pathogènes sont responsables d'infections intestinales telles que la dysenterie bacillaire, la fièvre typhoïde, le choléra et la fièvre paratyphoïde. L'analyse des échantillons d'eau sur une base routinière ne serait pas possible si la détection de chacun des pathogènes était requise. Par conséquent, l'eau est examinée pour détecter les micro-organismes indicateurs tels qu’Escherichia coli. Il convient de souligner que la présence de bactéries indicatrices ne signifie pas que l'eau contient des microorganismes pathogènes, mais plutôt que le potentiel existe pour la présence de pathogènes puisque les bactéries indicatrices signalent la présence de matières fécales dans l'échantillon. Des méthodes qualitatives et quantitatives sont utilisées pour déterminer l'état sanitaire de l'eau. La contamination de l'eau potable ou des réservoirs d'eau naturels avec ces micro-organismes indicateurs est une bonne indication de la mauvaise gestion des déchets. Plusieurs microorganismes indicateurs différents sont utilisés pour déterminer le niveau de contamination par des matières fécales. MICROORGANISMES INDICATEURS D’UNE CONTAMINATION FÉCALE Coliformes totaux : des petits bacilles de la famille des Enterobacteriacae qui fermentent le lactose à 37oC avec formation d’acide et de gaz en 48 heures. Elles incluent des bactéries résidentes de l’intestin des mammifères et de l’environnement tel qu’Escherichia coli, Klebsiella sp., Enterobacter sp., Citrobacter sp., Serratia sp., Shigella sp., et Proteus sp. Coliformes fécaux (Escherichia coli): seule bactérie coliforme qui n'est pas retrouvée naturellement hors de l’environnement intestinal. Sa présence est donc une excellente indication de contamination fécale. Mais, leurs viabilités réduites en dehors de son environnement naturel font qu’un test négatif n’est pas nécessairement indicateur d’une absence de contamination fécale. Streptococci fécal : Inclus des espèces des Streptococcus et Enterococcus, parmi lesquels plusieurs ont des origines entériques ou fécales. Ceux-ci ont l’avantage de survivre pour de plus longues durées dans l’environnement. Par contre, il est difficile de les distinguer des habitants naturels des sols et des cours d’eau.

78

Labo de Microbiologie-2012 ANALYSE QUALITATIVE STANDARD DES EAUX POUR DES COLIFORMES Les trois tests de base pour détecter les coliformes bactériens de l'eau sont présumés confirmés, et complétés. Les tests sont effectués de façon séquentielle sur chaque échantillon en cours d'analyse. Ils détectent la présence de bactéries coliformes (indicateurs de contamination fécale) qui sont des bacilles Gram négatifs non sporulant qui fermentent le lactose avec production d'acide et de gaz qui est détectable après une période d'incubation de 48 heures à 37 º C. TEST DE COLIFORME PRÉSOMPTIF Détermination du nombre le plus probable de coliformes But : 1. Évaluer la présence de coliformes dans un échantillon d’eau 2. Obtenir un indice quant au nombre possible d’organismes présents dans l’échantillon sous analyse Principe : Le test présomptif est spécifique pour la détection des bactéries coliformes. Des aliquotes d’eau mesurées à tester sont ajoutés à un bouillon de fermentation du lactose contenant une fiole inversé de collecte de gaz (Tube Durham). Puisque ces bactéries sont capables d'utiliser le lactose comme source de carbone (d'autres organismes entériques ne le sont pas), leur détection est facilitée par l'utilisation de ce milieu. Des tubes de ce milieu au lactose sont inoculés avec des aliquotes de 10 ml, 1 ml, et 0,1 ml de l'échantillon d'eau. La série se compose d'au moins trois groupes, chacun composé de trois tubes du milieu spécifié. Les tubes de chaque groupe sont ensuite inoculés avec le volume désigné de l'échantillon d'eau. Le développement de gaz dans l'un des tubes est une présomption de la présence de bactéries coliformes dans l'échantillon. Le test présomptif permet également au microbiologiste d’estimer le nombre d’organismes présents au moyen du test du nombre le plus probable (NPP). Le NPP est estimé en déterminant le nombre de tubes dans chaque groupe qui montrent de l'acide et du gaz suite à la période d'incubation. Bouillon Lauryl-trypotose. Ce milieu contient des peptones comme source de carbone et d'azote ainsi que d'autres nutriments. En outre, ce milieu contient du lactose comme un glucide fermentescible et du lauryl sulfate de sodium qui inhibe la croissance des organismes autres que les coliformes. Une fiole inversée est incluse pour détecter l'accumulation de gaz. Un test positif, l'accumulation de gaz après une période d'incubation de 48 heures à 37 ° C indique la présence présumée de coliformes.

79

Labo de Microbiologie-2012 Matériaux Échantillon d’eau 3 bouillons de lauryl sulfate lactose double force 6 bouillons lauryl sulfate lactose force simple Méthode 1. Étiqueter trois tubes de bouillons de lauryl sulfate double force "10". 2. Étiqueter trois tubes de bouillons de lauryl sulfate force simples "0.1" et les trois autres "1". 3. Inoculer les trois tubes à double force avec 10 ml de l’eau à être testée. 4. Inoculer trois des tubes à force simple avec 1 ml de l’eau à être testée. 5. Inoculer trois des tubes à force simple avec 0.1 ml de l’eau à être testée. 6. Incuber tous vos tubes à 37oC.

Inoculums d’eau 0.1 ml

[1X]

[1X]

1.0 ml

[1X]

[1X]

[1X]

10 ml

[1X]

Bouillons Lactose

80

[2X]

[2X]

[2X]

Labo de Microbiologie-2012 ANALYSE QUANTITATIVE STANDARD DE L’EAU POUR DES COLIFORMES L’essai de Pétrifilm. Ce test représente une variable du compte viable sur des milieux sélectifs et différentiels. Les plaques de Pétrifilm sont de minces couches de milieu déshydraté qui possèdent plusieurs avantages comparativement aux géloses conventionnelles; telles que la confirmation biochimique visuelle, la facilité d'utilisation, le plus petit espace qu'ils occupent et le fait qu'aucune préparation du milieu n'est requise. Matériaux Échantillon d’eau Plaque de Pétrifilm Méthodes 1. Appliquer 1 ml de l’eau à être testée sur le Pétrifilm tel qu’illustré. 2. Recouvrir de la couche de plastique, puis étendre l’échantillon par le roulement d’une pipette de 10 ml sur la surface. 3. Étiqueter et incuber à 37oC.

ANALYSE QUALITATIVE STANDARD DE L'EAU POUR STREPTOCOQUES FECAUX Les excréments humains et des animaux contiennent un grand nombre de bactéries streptocoques qui peuvent être classées comme appartenant au groupe des streptocoques fécaux. Il existe six espèces de streptocoques: S. faecalis, S. faecium, S. avium, S. gallinarum, S. Source Rapport bovis et S. équin. Ces bactéries sont des cocci Gram positifs, anaérobies Homme 4.4 facultatifs, catalase négative, non sporulantes, qui fermente le glucose à 37 °C. Canard 0.6 Ils se trouvent principalement dans les excréments des animaux à sang chaud. Mouton 0.4 Contrairement aux coliformes, le nombre de streptocoques fécaux est Poulet 0.4 généralement plus élevé que pour les coliformes fécaux. En outre, le rapport Porc 0.4 entre leurs nombres (CF / SF) dans un échantillon d'eau est une indication de la Vache 0.2 source de la contamination fécale (humaine vs animale).

81

Labo de Microbiologie-2012 TEST DES ENTÉROCOQUES Les entérocoques sont un sous-groupe des streptocoques fécaux qui incluent les quatre premières espèces de streptocoques fécaux énumérés ci-dessus. Des méthodes de culture analogues aux tests de coliformes ont été développées pour déterminer la présence et la concentration de ces bactéries dans des échantillons d'eau. Comme pour le test présomptif pour les coliformes, des aliquotes mesurés de l'eau à tester sont ajoutés à un milieu sélectif (bouillon SF). La croissance de toutes les bactéries cocci Gram négatives et d'autres est inhibée dans ce milieu par l'azote de sodium. La fermentation du glucose est indiquée par un changement de couleur dans le bouillon. Le pourpre de bromocrésol est l'indicateur. Matériaux Échantillon d’eau 3 bouillons SF double force 6 bouillons SF simple force Méthode 7. Étiqueter trois tubes de bouillons SF double force "10". 8. Étiqueter trois tubes de bouillons SF simple force "0.1" et les trois autres "1". 9. Inoculer les trois tubes à double force avec 10 ml de l’eau à être testée. 10. Inoculer trois des tubes à simple force avec 1 ml de l’eau à être testée. 11. Inoculer trois des tubes à simple force avec 0.1 ml de l’eau à être testée. 12. Incuber tous vos tubes à 37oC.

Inoculums d’eau 0.1 ml

[1X]

[1X]

1.0 ml

[1X]

[1X]

[1X]

10 ml

[1X]

Bouillons SF

82

[2X]

[2X]

[2X]

Labo de Microbiologie-2012 QUALITÉ MICROBIOLOGIQUE DES ALIMENTS (Groupe de 2) Les bactéries dans les aliments contribuent à la détérioration (autolyse) des aliments et aux maladies. Les microorganismes provoquant l’autolyse appartiennent principalement à la famille des Pseudomonaceae. Ces bactéries contribuent à la détérioration des propriétés organoleptiques des aliments. Elles génèrent des odeurs et des arrière-goûts déplaisants, altèrent la texture et peuvent causer une décoloration. Les espèces de cette famille sont des petits bacilles Gram négatifs aérobies stricts. Une des espèces particulièrement problématiques est Pseudomonas aeruginosa. Les maladies alimentaires peuvent être regroupées en deux classes: Les infections alimentaires et les intoxications alimentaires. Les infections alimentaires sont le résultat de l’ingestion suivie de la croissance de bactéries pathogènes. Les genres principaux impliqués incluent des membres de la famille des Enterobacteriacae, telle qu’E. coli, Salmonella sp., et Shigella sp., et quelques genres Gram positifs non sporulants de la famille des Listeriaceae, telle que Listeria et quelques espèces sporulantes de genre Bacillus tel que Bacillus cereus. Contrairement aux infections alimentaires, les intoxications sont le résultat de l’ingestion de toxines préformées qui peuvent s’accumuler dans les aliments entreposés de façon inadéquate ou pour des périodes prolongées permettant donc la croissance de microorganismes. Les espèces prédominantes responsables appartiennent au genre Clostridium. Les espèces de ce genre sont de courts bacilles Gram-positif sporulants qui sont des anaérobies stricts. La détection des contaminants alimentaires est faite tout comme avec l'eau. Des tests qualitatifs et quantitatifs fondés sur l'utilisation de milieux sélectifs et différentiels sont faits. SALMONELLOSE La salmonellose est l'une des plus importantes maladies d'origine alimentaire et provoque d'importantes charges médicales et économiques à travers le monde. La nourriture est la principale source de l'infection par Salmonella chez l'homme. Les œufs, ovoproduits, et la volaille sont les sources les plus importantes de la salmonellose humaine. Les salmonelles peuvent entrer dans la chaîne alimentaire à tous les stades, et les conséquences pour les êtres humains après la consommation du produit final contaminé dépendent des conditions de transformation des aliments. Par exemple, une source bien connue de contamination est l'environnement des abattoirs. Plus tard, les salmonelles peuvent se multiplier à des niveaux nuisibles dus à des conditions d’entreposage inappropriées. En général, Salmonella ne croit pas sur la viande de poulet à des températures inférieures à 6°C, tandis qu’une croissance significative est observée à 8 ° C. Le test du nombre le plus probable (NPP) est particulièrement utile pour la détermination de faibles concentrations de la bactérie Salmonella. Dans ce cas-ci, trois échantillons ou cinq répliquas sont préparés à partir de dilutions de facteur 10. Le rapport entre les résultats positifs et négatifs relativement à la concentration permet d’obtenir une valeur NPP/g. Le bouillon de Rappaport-Vassiliadis Est un milieu sélectif utilisé pour l'enrichissement des espèces de Salmonella. La sélectivité est due à la présence du vert de malachite, une pression osmotique élevée, et un faible pH. La forte concentration de chlorure de magnésium augmente la pression osmotique, et en combinaison avec le vert de malachite, inhibe les bactéries autres que Salmonella. Le faible pH du milieu augmente la sélectivité en inhibant la flore associée, y compris les bactéries intestinales. 83

Labo de Microbiologie-2012 Matériaux Pilon de poulet frais avec la peau dans un sac « Ziploc » (Goupes pair) Pilon de poulet avec la peau entreposé au frigidaire pour 7 jours dans un sac « Ziploc » (Groupes impairs) 3 bouillons bouillon de Rappaport-Vassiliadis double force 6 bouillons bouillon de Rappaport-Vassiliadis simple force Méthode Préparation de l’échantillon 1. Peser et enregistrer le poids de votre échantillon de poulet dans le sac. 2. Ajouter 2 ml d’eau par gramme de poulet dans le sac. 3. Mélanger en berçant et en massant le poulet pour 5 minutes. 4. Récolter et transférer autant de la solution de lavage à un tube Falcon stérile. NPP 1. Inoculer les bouillons bouillon de Rappaport-Vassiliadis avec la solution de lavage tel qu’illustré ci-dessous :

Inoculums de la solution de lavage1.0 ml

0.1 ml

[1X]

[1X]

[1X]

[1X]

[1X]

[1X]

10 ml

[2X]

Bouillons de Rappaport-Vassiliadis

84

[2X]

[2X]

Labo de Microbiologie-2012 BACTÉRIES GRAM NÉGATIVES ET LES INFECTIONS ALIMENTAIRES Il ya de nombreux groupes de bactéries Gram négatives dont la plupart ne sont pas pathogènes. La plupart des pathogènes d'origine alimentaire appartiennent au groupe appelé Proteobacteria qui comprend plusieurs agents pathogènes potentiels tels qu’E. coli, Salmonella, Pseudomonas, Moraxella, Helicobacter, Stenotrophomonas, Legionella, et bien d'autres. L'infection par ces bactéries conduit à la libération d'endotoxine (une substance toxique associée à la paroi cellulaire bactérienne) provoquant une inflammation des tissus et des gastro-entérites. La détermination du nombre d’hétérotrophes aérobies Gram négatifs est habituellement effectuée sur des géloses MacConkey, un milieu sélectif et différentiel qui contient du lactose et des protéines en tant que sources potentielles de carbone. La sélectivité de ce milieu est due à l'inclusion du cristal violet qui inhibe la croissance des organismes Gram positifs et des levures. La propriété différentielle de ce milieu permet de discriminer la fermentation du lactose par l'addition d'un indicateur de pH. Les bactéries qui fermentent le lactose sont de couleur rose, tandis que les non-fermenteurs sont blancs. Matériaux Solution de lavage du poulet frais (Groupes pairs) Solution de lavage du poulet entreposé au réfrigérateur pour 7 jours (Groupes impairs) 75 ml saline physiologique stérile 5 tubes stériles 5 Géloses MacConkey Méthode 1. Préparer des dilutions en série de facteurs 10 (100-10-4) dans de la saline physiologique de la solution de lavage du poulet préparé précédemment. 2. Étaler 0.1ml de chaque dilution sur des géloses MacConkey étiquetées de façon appropriée. 3. Incuber à 370C BIOREMÉDIATION (Partie 6a) Matériaux Échantillons de bioremédiation entreposés 12 Géloses Eau stérile Méthode 1. Préparer les dilutions 10-1, 10-3, et 10-5 de chacun des échantillons de bioremédiations entreposés. 2. Étaler 0.1ml de chaque dilution de chacun des échantillons sur des géloses TSA étiquetées de façon appropriée. Vos plaques devraient être étiquetées avec votre numéro de groupe et la date d’échantillonnage. 3. Incuber à 28oC.

85

Labo de Microbiologie-2012

Jour 2 QUALITÉ MICROBIOLOGIQUE DE L’EAU ESSAIS QUALITATIFS DE L'EAU 1. Récolter tous vos tubes pour les essais présomptifs. 2. Pour chacun des essais, déterminer le nombre de tubes sur trois (pour chaque jeu de 3) qui sont positifs pour l’organisme étant testé. Bouillon Lauryl sulfate: Présence de gaz (>10%) Bouillon SF : Production d’acide 3. Utiliser le tableau ci-dessous pour déterminer le NPP/100 ml pour chaque microorganisme. Indice NPP pour Différentes Combinaisons de Résultats dans les Essais Présomptifs: Nombre de tubes avec une réaction positive: 3 de 10 ml chacun 3 de 1 ml chacun 3 de 0.1 ml chacun 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 2 0 2 0 0 2 0 1 2 1 0 2 1 1 2 2 0 2 2 1 3 0 0 3 0 1 3 0 2 3 1 0 3 1 1 3 1 2 3 2 0 3 2 1 3 2 2 3 3 0 3 3 1 3 3 2 3 3 3

Indice NPP par 100 ml 2,400

Source: Standard methods for the examination of water and waste water, 13th ed., American public health association, New York, 1971.

4. Obtenir les données pour les quatre échantillons d’eaux distribuées dans la classe.

86

Labo de Microbiologie-2012 TEST DE COLIFORME CONFIRMÉ La présence d'un test présomptif positif suggère immédiatement que l'échantillon d'eau est non potable. La confirmation de ces résultats est nécessaire, étant donné que les tests positifs présomptifs peuvent être le résultat d'organismes d'origine non-coliformes qui ne sont pas reconnus comme des indicateurs de pollution fécale. Le test a confirmé exige que des milieux sélectifs et différentiels tels que l'agar endo soient striés à partir d'un bouillon de lactose positif. Les bactéries Gram positives sont inhibées sur ce milieu par le sulfate de lauryl et le désoxycholate. Les fermenteurs du lactose produisent des aldéhydes qui réagissent avec le réactif de Schiff (fuchsine basique et le sulfite de sodium) pour donner des zones rouges autour des colonies. Les colonies des coliformes sont donc rouges avec un éclat métallique typique. Méthode 1. Faire des stries pour colonies simples à partir de tous les bouillons de lauryl sulfate positifs. 2. Incuber à 37oC pour 24 heures. 3. Enregistrer le nombre de tubes confirmé à l’ordinateur au podium. Une personne de chaque groupe devra se présenter au temps désigné afin d’obtenir les résultats.

ESSAIS QUANTITATIFS (ESSAI DE PETRIFILM) 1. Déterminer le nombre/ml de coliformes (colonies rouges ou bleu avec gaz) ainsi que le nombre d’E.coli (colonies bleues avec gaz) 2. Obtenir les données pour les quatre échantillons d’eaux distribuées dans la classe.

STANDARDS DE QUALITÉ MICROBIOLOGIQUE DE L’EAU EN ONTARIO Bactéries coliformes totales: Escherichia coli: Streptoccoci fécaux:

Eaux potables 0/100ml 0/100ml 0/100ml

87

Eaux récréatives 100/100ml 100/100ml S.O.

Labo de Microbiologie-2012 QUALITÉ MICROBIOLOGIQUE DES ALIMENTS SALMONELLOSE: NPP DE SALMONELLA 1. Obtenir tous vos bouillons de Rappaport-Vassiliadis. 2. Déterminer le nombre de tubes positifs sur trois (pour chaque jeu de 3) qui montrent de la croissance. 3. Utilisez le tableau à la page 87 afin de déterminer le NPP/g de poulet. 4. Obtenir les données pour tous les échantillons de poulet répartis dans la classe. ESSAI DE SALMONELLA CONFIRMÉ Comme pour le test de coliformes, la présence de Salmonella doit être confirmée sur un milieu sélectif comme l’agar de Salmonella et Shigella. De l’extrait de bœuf, une digestion enzymatique de la caséine, et une digestion enzymatique de tissus animaux fournissent des sources d'azote, de carbone, et les vitamines nécessaires à la croissance des organismes. Le lactose est le glucide présent dans l’agar de Salmonella et Shigella. Des sels biliaires, du citrate de sodium et du vert brillant inhibent les bactéries Gram positives et la majorité des bactéries coliformes, tout en permettant à Salmonella de croître. Le sodium de thiosulfate et du de fer de citrate permettent la détection du sulfure d'hydrogène par la production de colonies avec un centre noir. 1. Faire des stries pour colonies simples à partir de tous les bouillons positifs de RappaportVassiliadis. 2. Incuber à 37 ° C pendant 24 heures. 3. Enregistrer le nombre de tubes confirmés à l'ordinateur podium. Une personne de chaque groupe devra passer aux temps précisés afin d’obtenir leurs résultats. BACTÉRIES GRAM NÉGATIVES ET LES INFECTIONS ALIMENTAIRES 1. Déterminer le compte de bactéries Gram négatives/g de poulet. 2. Déterminer le nombre de bactéries qui fermentent le lactose/g de poulet. 3. Déterminer le nombre de bactéries qui ne fermentent pas le lactose/g de poulet. 4. Obtenir les données pour tous les échantillons de poulet distribués dans la classe.

Non-fermentor Fermentor

STANDARDS DE QUALITÉ MICROBIOLOGIQUE DU POULET CRU Coliformes : Escherichia : Salmonella

500 UFC/g 100 UFC/g Pas plus de 5 échantillons positifs parmi 51-échantillons 88

Labo de Microbiologie-2012 COLORATIONS DE GRAM ET ISOLATION D’INCONNUS GRAM NÉGATIFS (Groupes de 2) Matériaux Une gélose TSA Méthode 1. Faire des colorations de Gram et la prise de photos de chacun des échantillons suivants : Un des bouillons positifs de Lauryl-tryptose pour le NPP des coliformes dans l’eau Un des bouillons positifs de SF pour le NPP des Enterococci fécales dans l’eau Un des bouillons positifs de Rappaport-Vassiliadis pour le NPP de Salmonella Une des colonies sur les géloses MacConkey Notez, si vous n’avez pas obtenu de croissance ou vous n’avez pas fait l’essai en question, empruntez un échantillon d’un autre groupe 2. Faire des stries pour colonies simples sur une gélose TSA d’une colonie obtenue de la gélose MacConkey dont vous avez confirmé que c’est une bactérie Gram négative. 3. Incuber à 37oC. 4. Prendre en note si la colonie choisie fermente le lactose ou non.

89

Labo de Microbiologie-2012 BIOREMÉDIATION (Partie 6b) Matériaux Comptes viables des échantillons de bioremédiations 1 Gélose TSA Méthode 1. Obtenir des comptes de colonies appropriés pour chacun des temps d’échantillonnage de l’essai de bioremédiation. 2. Faire des observations en ce qui a trait aux nombres de différentes morphologies coloniales et leurs nombres relatifs pour chaque temps d’échantillonnage. 3. À partir du dernier temps d’échantillonnage, identifier le type de colonie prédominant et faire une coloration de Gram. Obtenir une photo numérique. 4. Faire des stries pour colonies simples du type prédominant de colonie et incuber à 28oC. Celles-ci seront entreposées à 4oC après une période d’incubation de 48 heures. Devoir Soumettre une courte proposition de tests que vous utiliserez pour l’identification du genre bactérien isolé. Basez-vous sur les organigrammes disponibles sur la page web de ce cours. Votre proposition doit inclure un organigramme clair qui démontre les résultats attendus et le procédé d’identification. Seulement réquisitionner des tests qui ont été faits précédemment dans ce cours de laboratoire (incluant ceux de la semaine prochaine). Indiquer dans la section des matériaux, les tests requis et le nombre requis. Votre proposition ne doit pas dépasser une page.

90

Labo de Microbiologie-2012

LABO NO8 DIAGNOSTIC BACTÉRIEN – BACTÉRIES GRAM NÉGATIVES

Jour 1 Les Enterobacteriaceae Les bactéries de la famille des Enterobacteriaceae sont parmi les microorganismes le plus souvent retrouvés dans les spécimens cliniques. Les Enterobacteriaceae représentent une grande famille diverse qu’on appelle communément les bacilles Gram négatifs entériques fermenteurs, indiquant qu’ils sont des bâtonnets Gram négatifs qui fermentent les sucres. Plusieurs font partie de la flore naturelle du tractus intestinal des humains et des animaux. Certains infectent le tractus intestinal. Les membres de cette famille ont les quatre caractéristiques suivantes en communs: 1. 2. 3. 4.

Ce sont des bâtonnets Gram négatifs Ce sont des anaérobies facultatifs Ils sont oxydase négative Ils fermentent tous le glucose, mais variant énormément quant à leurs caractéristiques biochimiques

Les Pseudomonaceae Contrairement aux Enterobacteriaceae, les Pseudomonaceae sont des bacilles Gram négatifs non-fermenteurs. Les bacilles Gram négatifs non-fermenteurs sont des résidents naturels des sols et des eaux. Ils peuvent causer des infections chez l’humain quand ils colonisent des individus immunodéprimés ou obtiennent accès à l’intérieur du corps suite à un traumatisme. Le plus commun des bacilles Gram négatifs non-fermenteur qui cause des infections chez les humains est Pseudomonas aeruginosa. Les Nesseriaceae Cette famille inclut les genres Neisseria et Moraxella des organismes non motiles, Gram négatifs diplocoques. Les membres de cette famille sont tous oxydase-positifs — un test biochimique clé pour l’identification de cette famille. Le genre Neisseria inclut plusieurs espèces saprophytiques qui se retrouvent dans la flore naturelle des membranes muqueuses des tractus respiratoires et génitaux. Deux espèces pathogènes sont: N. gonorrhoeae (agent de la gonorrhée) et N. meningitidis (responsable de méningites).

91

Labo de Microbiologie-2012 DIAGNOSTIQUE D’INCONNUS GRAM NÉGATIFS (Groupes de 2) Dans l’exercice suivant, on vous demandera d’identifier un inconnu Gram négatif que vous avez isolé la semaine passée ainsi que de confirmer l’identité d’un inconnu Gram négatif qui vous sera fourni. Matériaux Bouillon de culture TSB d’une bactérie Gram négative oxydase négative connue Colonies simples sur gélose TSA d’un inconnu Gram négatif isolé la semaine précédente 2 géloses MacConkey 2 pentes de citrate de Simmons 2 pentes d’urée 2 pentes TSI 2 tubes profonds SIM 2 bouillons de décarboxylase dépourvus d’acides aminés 2 bouillons de décarboxylase avec ornithine 2 bouillons de décarboxylase avec lysine Une Bande API Méthodes Faire tous les tests suivants avec chacune de vos 2 bactéries Gram négatives COLORATION DE GRAM 1. Faire une coloration de Gram de chacune des bactéries. 2. Faire la prise de photos pour vos rapports. 3. Prendre en note la coloration de Gram, la forme cellulaire et l’agrégation cellulaire. OXYDASE 1. Faire le test d’oxydase sur les géloses de l’inconnu que vous avez isolé. CROISSANCE SUR MILIEU MACCONKEY 1. Faire des stries pour colonies simples de vos deux bactéries sur des géloses MacConkey et incuber à 37oC. L'UTILISATION DU CITRATE EN TANT QUE SOURCE DE CARBONE 1. Strier vos deux bactéries sur des pentes de citrate de Simmons et incuber à 37oC. URÉASE 1. Strier vos deux bactéries sur des pentes d'urées et incuber à 37°C.

92

Labo de Microbiologie-2012 CROISSANCE EN MILIEU TSI (TROIS SUCRES ET FER) Ce milieu de croissance est couramment utilisé pour l'identification préliminaire de membres de la famille des Enterobacteriacae. Il contient quatre différentes sources de carbones potentielles, dont le glucose, le lactose, le sucrose, et des protéines. La présence d'un indicateur de pH permet de distinguer entre l'utilisation des sucres et des protéines. L'utilisation de sucre par un mode de fermentation donne lieu à une réaction acide, tandis que l'oxydation de protéines génère une réaction alcaline. Le milieu est pourvu sous forme de pente, créant ainsi des conditions d’aérobies et d’anaérobies. La surface de la pente est essentiellement aérobie, tandis que la portion interne est plutôt anaérobie; favorisant ainsi la fermentation. Parmi les trois sucres, le glucose est limitant (0.1%) tandis que le sucrose et le lactose sont en excès (1.0%). Puisque les Enterobacteriaceae peuvent tous métaboliser le glucose, son métabolisme rend le milieu initialement acide (jaune). Pour une croissance continue, suite à l’épuisement du glucose, une des autres sources de carbone devra être utilisée. Si le sucrose et le lactose ne peuvent pas être utilisés, la source de carbone qui sera métabolisée sera donc les protéines, générant des produits alcalins. La hausse de pH résultante changera le milieu à une couleur neutre ou alcaline (orange ou rouge respectivement). Par contre, si le sucrose et/ou le lactose peuvent être utilisés en anaérobies, les acides produits feront que le milieu demeurera acide (jaune). En plus de permettre la distinction entre la fermentation de différents sucres, le milieu de croissance TSI permet de déterminer si une bactérie peut dégrader des acides aminés qui possèdent un groupement sulfhydrile, tel que la méthionine et la cystéine. La dégradation de ces acides aminés génère du sulfure d'hydrogène qui réagit avec le sulfate ferreux, générant un précipité noir. 1. Inoculer la surface et le bout de pentes TSI avec vos deux bactéries. (Voir l’image) 2. Incuber à 37oC.

Introduire la boucle d’inoculation Pente jusqu’au fond du milieu dans le bout. En sortant, strier la surface de la pente.

Bout

93

Labo de Microbiologie-2012 SIM: PRODUCTION DE SULFIDE D’HYDROGÈNE, D’INDOLE ET LA MOTILITÉ PRODUCTION DE H2S Tout comme avec le milieu TSI, la dégradation d’acides amines à base de soufre peut être déterminée par la production d’un précipité noir. MOTILITÉ Certains microorganismes possèdent la capacité de se mouvoir à l'aide de flagelles. Cette caractéristique peut être observée par l'inoculation de milieux semi-solides. Les bactéries non motiles croissent seulement dans la région qui est inoculée, tandis que les bactéries motiles démontrent une croissance qui s'étend au-delà de la région d'inoculation. PRODUCTION D'INDOLE SUITE À LA DÉGRADATION DU TRYPTOPHANE Un autre acide aminé qui peut être utilisé comme source de carbone par certains microorganismes est le tryptophane. La dégradation du tryptophane génère un sous-produit, l'indole, et l'acide pyruvique. L'acide pyruvique est utilisé comme source de carbone, tandis que l'indole est excrété dans le milieu en tant que déchet. La production d'indole peut être décelée par sa réaction avec le réactif dimethylaminobenaldehyde (réactif de Kovacs). 1. Obtenir des tubes de milieu SIM solide. 2. Utiliser une aiguille d’inoculation pour inoculer chacune de vos bactéries jusqu’au bas du tube le long d’une ligne droite. 3. Incuber à 37oC. LES DÉCARBOXYLASES D’ORNITHINE ET DE LYSINE Le milieu utilisé pour vérifier la présence de différentes décarboxylases d’acides aminés contient du glucose, source de carbone fermentable, et l’acide aminé désiré, l’ornithine ou la lysine. L’acide produit par la fermentation du glucose réduit le pH du milieu et change la couleur de l’indicateur de pH du mauve au jaune. Ces conditions acides permettent de stimuler l’activité des décarboxylases. La décarboxylation de la lysine génère de la cadavérine, tandis que la décarboxylation de l’ornithine génère de la putrescine. Ces derniers causent une hausse du pH, qui change la couleur de l’indicateur du mauve au violet. Si l’organisme ne produit pas l’enzyme appropriée, le milieu demeure acide (jaune). 1. Inoculer des bouillons du milieu de décarboxylase dépourvu d’acide amine avec chacune de vos bactéries. 2. Inoculer des bouillons de décarboxylase contenant de la lysine avec chacune de vos bactéries. 3. Inoculer des bouillons de décarboxylase contenant de l’ornithine avec chacune de vos bactéries. 4. Recouvrir tous les bouillons d’huile minérale pour créer des conditions d’anaérobies. 5. Incuber à 37oC.

94

Labo de Microbiologie-2012 API 20E SYSTÈME ENTEROBACTERIACEAE Cette bande test API-20E (de bioMerieux, Inc.) qui est utilisée pour identifier les bacilles Gram négatifs entériques possède 20 compartiments de test déshydraté séparés. Une suspension bactérienne est utilisée pour réhydrater chacun des puits. Certains des puits auront des changements de couleur résultants des différences de pH. D’autres produisent des sous produits qui doivent être identifiés avec des réactifs. Méthode (Ce test est à être fait seulement avec la bactérie Gram négative connue qui vous a été fournie) 1. Préparer une dilution de 1/10 de la culture bactérienne dans de la saline physiologique. Inoculer la bande API 1. Voir l’animation pour une description du procédé décrit ci-dessous. Cette animation est disponible sur le site web de ce cours : suivre le lien pour API. 2. En tenant la bande à un léger angle avec le dessus de la table, vous allez maintenant inoculer la suspension bactérienne dans chacun des puits avec une pipette pasteur stérile. 3. Toucher l’extrémité de la pipette sur le côté de la cupule permettant au fluide de pénétrer dans le puits par l’action capillaire tout en appliquant une pression légère sur le bulbe. Ceci devrait prévenir la formation de bulles dans les puits. Chaque puits doit être rempli jusqu’au cou (voir diagramme). Puits ou cupule

Ligne de remplissage pour la majorité des puits ou cupule

4. Remplir le tube et la section de la cupule des tubes [CIT], [VP] et [GEL]. 5. Suite à l’inoculation, remplir complètement la section de la cupule des microtubes ADH, LDC, ODC, H2S et URE avec de l’huile minérale. Incuber la bande dans sa chambre 6. Remplir le bas de la chambre avec juste assez d’eau pour remplir les indentations. 7. Placer la bande dans ce réservoir du bas. 8. Placer le dessus de la chambre d’incubation sur le bas et étiquetée là. 9. Placer la bande à 37o C.

95

Labo de Microbiologie-2012 BIOREMÉDIATION (Partie 7a) Matériaux Stries pour colonies simples d’OEM 1 gélose TSA Méthode 1. Faire une coloration de Gram sur votre isolation de colonies simples et obtenir une photo numérique. 2. Faire des stries pour colonies simples pour une deuxième fois et incuber à 28oC.

96

Labo de Microbiologie-2012

Jour 2 CROISSANCE SUR MILIEU MACCONKEY Examiner la croissance sur votre gélose MacConkey afin de déterminer si vos bactéries fermentent le lactose.

Fermenter

Non Fermenter

URÉASE Examiner vos pentes d’urée afin de déterminer si vos bactéries peuvent utiliser l'urée en tant que source de carbone.

UTILISATION DU CITRATE EN TANT QUE SOURCE DE CARBONE Examiner vos pentes de citrate de Simmons afin de déterminer si vos bactéries peuvent utiliser le citrate en tant que source de carbone.

97

Negatif Positif

Negatif Positif

Labo de Microbiologie-2012 CROISSANCE EN MILIEU TSI (TROIS SUCRES ET FER) Faire l’analyse de vos pentes TSI afin d’obtenir les données suivantes : Quelle est la réaction de pente : acide, alcaline ou neutre Quelle est la réaction bout : acide, alcaline ou neutre Est qu’il y a production de H2S o Si oui, est-elle produite sous aérobie, anaérobie ou les deux Est-ce qu’il y a accumulation de gaz

A A. B. C. D.

B

C

D

Bout et pente acide + accumulation de gaz Pente alcaline et bout acide Bout acide et pente alcaline + H2S en anaérobie Pente alcaline et bout neutre

Observations typiques en milieu TSI de bactéries de la famille des Enterobacteriaceae Réactions TSI Bactérie Bout Pente H2 S Gaz Enterobacter A A + Escherichia A A + Klebsiella A A + Proteus mirabilis A C + + Proteus vulgaris A A/C + + Morganella A C + Serratia A C Shigella A A Salmonella A K + A= acide, C = alcalin

98

Labo de Microbiologie-2012 SIM: PRODUCTION DE SULFIDE D’HYDROGÈNE, D’INDOLE ET LA MOTILITÉ Faire l’analyse de vos tubes profonds de milieu SIM afin d’obtenir les données suivantes : Vos bactéries sont-elles motiles Est qu’il y a production de H2S Le tryptophane est-il utilisé comme source de carbone o Est-ce qu’il y a production d’indole? Afin d’obtenir ce résultat, ajoutez quelques gouttes du réactif de Kovacs. Si de l’indole a été produit, le réactif devient rouge

A A. B. C. D.

B

C

D

Motile +H2S Motile + Indole Non-motile Aucune croissance Résultats typiques Microorganismes Escherichia Enterobacter Citrobacter Klebsiella Salmonella Shigella Prot. vulgaris Prot. mirabilis Morganella Serratia

H2S + + + + -

99

Indole + +/+ + -

Motilité +/+ + + + + + +

Labo de Microbiologie-2012 LES DÉCARBOXYLASES D’ORNITHINE ET DE LYSINE

LDB : Milieu avec acide aminé (ornithine ou lysine) DCB : Milieu sans acide aminé 1. Résultat négatif : Réaction alcaline avec et sans acide aminé 2. Résultat positif : Réaction alcaline avec acide aminé, mais réaction acide sans acide aminé 3. Résultat négatif : Réaction acide avec ou sans acide aminé

100

Labo de Microbiologie-2012 SYSTÈME ENTEROBACTERIACEAE API 20E Interprétation 1. Ajouter les réactifs appropriés aux compartiments o 1 goutte de Kovac's au IND (faire la lecture dans les minutes qui suivent) o 1 goutte de 40% KOH et alpha-naphtol au VP (une réaction positive peut prendre jusqu'à 10 minutes) o 1 goutte de FeCl3 au TDA 2. Faire la lecture de tous les autres tests, tel que dans le tableau, sans l’ajout de réactifs. 3. Noter les résultats et comparer les réactions positives avec le tableau de différentiation. TESTS SUBSTRAT

REACTION TESTÉ

RESULTATS -

RESULTATS +

ONPG

ONPG

bêta-galactosidase

incolore

jaune

ADH

arginine

arginine dihydrolase

jaune

rouge/orange

LDC

lysine

lysine décarboxylase

jaune

rouge/orange

ODC

ornithine

ornithine décarboxylase jaune

rouge/orange

CIT

citrate

utilisation de citrate

Vert pâle/ jaune

bleu/bleu-vert

H2S

Na thiosulfate

production d’H2S

incolore/gris

dépôt noir

URE

urée

hydrolyse d’urée

jaune

rouge/orange

TDA

tryptophane

déaminase

jaune

brun-rouge

IND

Tryptophane

production d’indole

jaune

rouge (2 min.)

VP

Na pyruvate

production d’acétoine

incolore

rose/rouge(10 min.)

GEL

charbon gélatine gélatinase

GLU

glucose

fermentation/oxydation bleu/bleu vert

jaune

MAN

mannitol

fermentation/oxydation bleu/bleu vert

jaune

INO

inositol

fermentation/oxydation bleu/bleu vert

jaune

SOR

sorbitol

fermentation/oxydation bleu/bleu vert

jaune

RHA

rhamnose

fermentation/oxydation bleu/bleu-vert

jaune

SAC

sucrose

fermentation/oxydation bleu/bleu vert

jaune

MEL

melibiose

fermentation/oxydation bleu/bleu vert

jaune

AMY

amygdalin

fermentation/oxydation bleu/bleu vert

jaune

ARA

arabinose

fermentation/oxydation bleu/bleu vert

jaune

OX

oxydase

oxydase

violet

Pas de diffusion du noir Noir diffus

incolore/jaune

101

Labo de Microbiologie-2012 GÉNÉRER LE NUMÉRO DE PROFIL En lisant la bande, inscrire + ou – sur le formulaire du rapport. Le formulaire a des lignes verticales plus foncées qui divisent les sept sections. Faire la somme de toutes les réactions positives dans chaque bloc de trois tests et inscrire la valeur dans la boîte du bas. Vous aurez besoin des résultats pour la réaction d’oxydase pour le dernier numéro (suit le panneau de fermentation des hydrates de carbone). Voir l’exemple ci-dessous :

Enregistrer votre numéro de profil sur l’ordinateur au podium.

102

Labo de Microbiologie-2012 RAPPORT SUR L’IDENTIFICATION D’INCONNUS BACTÉRIENS Chaque personne ou équipe de deux doit rédiger et remettre un manuscrit qui rapporte leurs résultats. Le manuscrit devrait inclure ce qui suit : A. Titre et les noms des auteurs B. Introduction: Cette section devrait traiter des raisons que l’isolation et l’identification d’organismes bactériens sont importantes, ainsi que les techniques générales qui sont utilisées a cette fin (non seulement celle vue en labo). C. Résultats: Présenter les tests qui ont été faits, quelles observations ont été faites et leurs interprétations respectives. Des tableaux et figures seraient utiles pour cette section. Présentez comment certains ou tous les résultats obtenus ont permis d’identifier l’organisme inconnu. Un organigramme serait une bonne idée pour cette section. D. Discussion: Dans cette section vous devez écrire (environ une page pour chaque organisme) une description détaillée de l’organisme identifié. Vous devriez trouver de l’information sur leurs caractéristiques générales, physiologie, impacte environnementales (s’il y en a) utilités, importance Clinique et traitement. E. Références: Lister toutes les références utilisées d’après le style recommandé par le « Journal of Bacteriology ». BIOREMÉDIATION (Partie 7b) Matériaux Isolation pour colonies simples d’OEM 1 bouillon TSB (5ml) Méthode 1. Faire une coloration de Gram sur votre isolation pour colonies simples et obtenir une photo numérique. 2. Inoculer 5ml de TSB et mettre le bouillon à l’endroit désigné pour une incubation à 28oC pour 48 heures. Après la période d’incubation, les bouillons de culture seront entreposés à 4oC.

103

Labo de Microbiologie-2012 LABO NO 9 HÉMATOLOGIE/ SÉROLOGIE

Jour 1 SÉROLOGIE MICROBIENNE (Groupes de 2) Une des méthodes de laboratoire utilisées pour le diagnostic des maladies infectieuses humaines est la sérologie microbienne. Elle inclut des méthodes indirectes fondées sur la recherche dans le sérum d’un patient d’anticorps spécifiques contre l’agent microbien, qu’il soit bactérien, viral, un parasite ou un champignon responsable de la pathologie. Il existe aussi des méthodes directes qui utilisent des anticorps afin de détecter le microorganisme d’intérêt. Ces méthodes diagnostics sont essentielles pour le diagnostic d’infections par des microorganismes qui sont difficiles à identifier ou dont la croissance en laboratoire est difficile ou même impossible; particulièrement les virus, les bactéries strictement intracellulaires, et les bactéries intracellulaires facultatives. Techniquement, la sérologie microbienne à pour but de déceler dans le sérum du patient une réaction antigène : où l’antigène est représenté par le microorganisme entier ou une partie de ce dernier et l’anticorps est représenté par des immunoglobulines spécifiques à l’agent microbien infectieux. Plusieurs méthodes immunologiques sont utilisées à cette fin. Le plus commun de ces tests et l’essai immunoabsorbant d’enzyme liée communément connu sous l’appellation d’ELISA. ELISA Cet essai représente un système à deux composantes. La première composante dépend d’anticorps qui peuvent reconnaître de façon spécifique et lier l’agent qu’on désire déceler; l’anticorps primaire. La deuxième composante dépend d’une enzyme conjuguée à un deuxième anticorps qui génèrera un produit coloré. Il y a plusieurs variantes de l’ELISA. Dans l’exercice suivant, vous ferrez un ELISA direct afin de détecter la présence d’un agent infectieux (l’antigène). Brièvement, cette procédure est faite comme suit : premièrement, les protéines dans l’échantillon (le sérum du patient) qui inclut l’agent à être décelé sont fixées sur une matrice solide telle que le plastique. Des anticorps qui peuvent spécifiquement reconnaître et lié l’agent d’intérêt sont ensuite ajoutés. Si la matrice a des antigènes qui y sont liés, quelques anticorps se lieront à l’antigène qui est lié à la matrice. Donc, tous deux, l’antigène et l’anticorps auquel il est lié sont maintenant immobilisés sur le support solide. Le but est ensuite de déterminer s’il y a des anticorps spécifiques à l’antigène qui sont liés. La détection de l’anticorps spécifique à l’antigène est faite à l’aide d’un anticorps secondaire (l’anticorps détecteur) qui reconnait de façon spécifique la région constante du premier anticorps. Ce deuxième anticorps possède une enzyme qui lui est liée. Donc, si l’anticorps primaire a été immobilisé par sa liaison à l’antigène, le deuxième anticorps et l’enzyme liée à celui-ci seront aussi immobilisés. Un substrat incolore est ensuite ajouté qui peut être clivé par l’enzyme qui est lié à l’anticorps secondaire. Le produit du clivage enzymatique du substrat est coloré et peut donc être quantifié avec un spectrophotomètre. La quantité de couleur qui est décelée est directement proportionnelle à la quantité d’enzyme qui a été immobilisée.

104

Labo de Microbiologie-2012

Étape 1: Liaison de l’antigène au support solide. Étape 2: Liaison de l’anticorps primaire. Étape 3: Liaison de l’anticorps secondaire auquel une enzyme est liée. Étape 4: Conversion du substrat incolore en un produit coloré.

105

Labo de Microbiologie-2012 Matériaux Tube de fluides corporels inconnu Fluides corporels positifs Fluides corporels négatifs Pissette de solution de lavage (PBS) Anticorps primaire (IgG de mouton anti - N. gonorrhea) Anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (IgG de souris anti - IgG de mouton Substrat pour peroxydase Plaque de 96 puits Micropipette de 0.2 ml Micropipette de 1 ml Méthode Propagation de l’agent infectieux 1. Quand on vous indiquera de le faire, chaque groupe partagera leurs fluides corporels avec ceux d’un autre groupe sur une autre table. Prendre en note le groupe avec lequel le partage a été fait pour la première ronde. Pour faire le partage, transférer la totalité du contenu du tube de vos fluides corporels inconnu (approx. 500µL) dans le tube des fluides corporels inconnu du groupe avec lequel vous faites le partage. Bien mélanger à l'aide de la micropipette, puis diviser l’échantillon de façon égale entre vous. Notez le numéro du groupe avec qui vous partagez les fluides ainsi que la ronde du partage. 2. Après que tout le monde aura fini avec la première ronde, on vous demandera de répéter le processus en partageant avec un autre groupe. Encore une fois, prendre en note le groupe avec lequel le partage a été fait pour cette deuxième ronde. 3. Après que tout le monde aura fini avec la deuxième ronde, on vous demandera de répéter le processus en partageant avec un autre groupe. Encore une fois, prendre en note le groupe avec lequel le partage a été fait pour cette troisième ronde. ELISA 1. Transférer 50 µL des fluides partagés dans chacun de trois puits d’une plaque d’ELISA. 2. Transférer 50 µL du témoin positif dans chacun de trois différents puits d’une plaque d’ELISA. 3. Transférer 50 µL du témoin négatif dans chacun de trois différents puits d’une plaque d’ELISA. 4. Laissez la plaque sur votre table de travail pour 15 minutes. 5. Vider la plaque dans l’évier. Afin de complètement vider les puits, frapper la plaque contre le côté de l’évier. 6. Utiliser la pissette de solution de lavage pour laver les puits, puis retirer le tampon de lavage tel qu’indiqué ci-dessus. 7. Répéter l'étape de lavage deux fois de plus. 8. Après avoir lavé les puits trois fois, frapper fermement la plaque à l’envers sur des essuietout pour retirer tout fluide résiduel. Une fois les lavages complétés, il ne devrait plus y avoir de liquide dans la plaque.

106

Labo de Microbiologie-2012 9. Utiliser un nouvel embout de micropipette pour ajouter 50 µL de la solution de l’anticorps primaire à chacun des puits. Laisser la plaque sur votre table de travail pour 15 minutes. 10. Vider la plaque et faire les lavages tel qu’indiqué aux étapes 6-7 ci-dessus. 11. Utiliser un nouvel embout de micropipette pour ajouter 50 µL de la solution de l’anticorps secondaire. Laisser la plaque sur votre table de travail pour 15 minutes. 12. Vider la plaque et faire les lavages tel qu’indiqué aux étapes 6-7 ci-dessus. 13. Dernière étape: Utiliser un nouvel embout de micropipette pour ajouter 50 µL du substrat pour la peroxydase à chacun des puits. Laisser la plaque sur votre table de travail pour 10 minutes 14. Observer les résultats. Les puits négatifs (―non-infecté ‖ et les témoins négatifs) demeureront totalement clairs. Les puis positifs (―infecté‖ et les témoins positifs) tourneront bleu. Récolte des résultats: À l’ordinateur au podium à l’avant, inscrire votre numéro de groupe et indiquer un plus (+) ou un moins (-) à ses cotés, d’après vos résultats. Faire de même et inscrire un plus ou un moins suivi du numéro de la ronde de partage au coté des trois groupes avec qui vous avez partagé des fluides corporels. C.-à-d., si votre résultat était positif vous devriez inscrire un plus au coté du numéro de votre groupe ainsi que ceux de trois autres groupes, et si votre résultat était négatif vous inscririez un symbole moins pour votre groupe et trois autres. Ex. Pour mon groupe (Groupe 2) Groupes avec qui les partages ont été faits Votre No de groupe Ronde 1 Ronde 2 Ronde 3 +2 +14 +7 +8 -8 -12 -5 -2 BIOREMÉDIATION (Partie 8a) Matériaux Isolation pour colonies simples de l’OEM Bouillon de culture de l’OEM Méthode 1. Faire les tests que vous avez proposés pour l’identification du genre de l’OEM’s. 2. Incuber tous les tests (si nécessaire) à 28oC.

107

Labo de Microbiologie-2012

Jour 1 ou 2 L'HÉMATOLOGIE (Groupes de 2) L'hématologie est un des domaines cliniques qui se préoccupe de l'étude du sang et de ces composantes. Le sang est composé de deux parties : le plasma et les éléments formés. Les éléments formés sont les cellules et les fragments cellulaires retrouvés dans le sang. Ceux-ci incluent les érythrocytes (globules rouges ou GR), les leucocytes (globules blancs ou GB) et les plaquettes (fragments cellulaires qui aident à la coagulation). Plus de 99 % des cellules sanguines sont des érythrocytes, qui transportent l'oxygène. La capacité du sang de transporter l'oxygène dépend sur la concentration de l'hémoglobine dans les GR ainsi que le nombre de GR dans le sang. Un nombre anormal de globules rouges représente soit une anémie (nombre sous la normale) ou une polycythémie (nombre plus élevé que la normale). COMPTE DE GLOBULES ROUGES Afin de pouvoir déterminer le compte de globules rouges (GR), un échantillon du sang est dilué et ensuite appliqué à une cellule de comptage de volume connu d'une lame d'hémacytomètre. La cellule de comptage d'une lame d’hemacytomètre standard possède deux secteurs de comptage identiques burinés dans le verre, qui sont constitués de neuf carrés aux dimensions de 1 mm2 chacun (1 mm X 1 mm; voir la figure). Lorsque la lame d'hemacytomètre est recouverte d'une lamelle, l'espace libre disponible est d’une profondeur de 0.1 mm. Le volume est donc de 0.1 mm3 ou 10-4 cm3. Une fois que l'échantillon à dénombrer est ajouté dans l'hemacytomètre, les cellules sont visualisées au microscope et énumérées. Les cellules contenues dans chacun de trois des carrés étiquetés "R" sont comptées pour en calculer une moyenne; après quoi le nombre de globules rouges/mm3 est déterminé.

108

Labo de Microbiologie-2012

B

B R

R

R

R

B

B

Exemple de calcul Si l'on compte 10, 14 et 6 cellules dans trois carrés indépendants, l'on a une moyenne de 10 cellules par carré. Ce nombre équivaut à avoir 10 cellules/(0.2mm X 0.2mm X 0.1mm) ou 10 cellules/0.004 mm3 ou 2500 cellules/mm3 Afin d'obtenir la concentration originale, vous devez ensuite multiplier par le facteur de dilution. Par exemple si l'échantillon de sang a été dilué par un facteur de 1 000, votre réponse finale serait 2.5 X 106 cellules /mm3.

109

Labo de Microbiologie-2012 Matériaux Un échantillon de sang dans tampon Alserver par groupes de 4 Saline physiologique de 0.9% (m/v) Lame d'hémacytomètre Pipette pasteur Méthode 1. Dans de la saline physiologique, préparer trois dilutions en série de facteurs 10 du sang. 2. Appliquer la dilution la plus élevée à la chambre de comptage de l’hémacytomètre. 3. Compter le nombre de GR observées dans chacun de trois carrés (R) indépendants et déterminer le nombre total de cellules dans la suspension originale. Si le nombre de cellules est trop petit, recommencer avec la dilution précédente. 4. Faire la moyenne de votre compte et de celui du groupe en face de vous. Étendues de concentrations normales – males: 4.5–5.2*106/mm3 – femelles: 4–4.5*106/mm3 L'HÉMATOCRITE Tel que mentionné précédemment, le sang est composé de deux parties : les éléments formés et le plasma. Les cellules représentent la fraction la plus dense. Le plasma constitue un peu plus de la moitié du sang d'un adulte. Cette fraction est 90% à 92 % d'eau avec divers soluté qui y sont dissouts. Le pourcentage d'érythrocytes qui se retrouve dans un volume donné de sang s'appelle l'hématocrite. L'hématocrite d'un adulte male est en moyenne 45 %, est peux varier entre 37 % à 48 %. Une lecture plus faible indique possiblement une anémie. L'hématocrite est habituellement déterminé suite à la centrifugation d'un tube capillaire remplie de sang. Le pourcentage de la colonne représentée par la fraction des globules rouges est ensuite déterminé.

Ménisque

Plasma

Globules Blancs

Globules Rouges

110

Labo de Microbiologie-2012 VOLUME CELLULAIRE MOYEN (VCM) Les valeurs obtenues pour le compte de GR et l'hématocrite peuvent être utilisées pour la détermination du volume cellulaire moyen (VCM) qui est utile pour la discrimination de différents types d'anémies. La taille moyenne des globules rouges est exprimée en femtolitres (1 femtolitre = 10-15 litres). Il est calculé en divisant le volume des cellules sédimentées (l'hématocrite) par le nombre de GB: VCM =

Hématocrite No de GB

NOTEZ: si l'hématocrite = 40%, inscrire 0.4 dans l'équation, pas 40. L'Étendue normale est typiquement 80-100 fl. En présence d'anémie hémolytique ou macrocytique le VCM peut être plus grand que 100 femtolitres. Ce type d'anémie est associé à l'alcoolisme et des déficiences d'acide folique. Une déficience en fer cause communément une anémie microcytique, dans quel cas le VCM est plus petit que 80 femtolitres. Une telle anémie peut aussi être observée dans les cas de thalassémie ou suite aux menstruations chez la femme. Le type d'anémie le plus commun se dit normocytique. Dans ce cas-ci, le VCM est normal (entre 80-100 fl.) mais le nombre de GR est faible. Matériaux Un échantillon de sang dans tampon Alserver par groupes de 4 Tube capillaire Méthode 1. Remplir par capillarité le tube capillaire de sang. 2. Boucher une des extrémités du tube capillaire avec un peu d'argile. 3. Centrifuger dans la centrifuge pour les capillaires pour 15 minutes. 4. Mesurer à l'aide d'une règle la hauteur totale de la colonne de fluide ainsi que la hauteur de la colonne de GR. 5. Déterminer l'hématocrite. Faire la moyenne de votre hématocrite et de celui du groupe en face de vous. 6. Calculer le VCM de votre échantillon de sang. Faire la moyenne de votre VCM et de celui du groupe en face de vous.

111

Labo de Microbiologie-2012 LES LEUCOCYTES Les leucocytes ou GB (globules blancs), qui représentent les cellules qui défendent le corps humain contre les infections, sont sous-divisés en cinq catégories : les neutrophiles, éosinophiles, basophiles, monocytes et lymphocytes. Ces cellules jouent un rôle vital dans les réponses immunitaires. Il est rare qu'une augmentation dans le nombre d'une de ces classes de leucocytes cause une augmentation dans le nombre d'une autre classe de leucocytes. Dépendamment du nombre de laquelle des classes de leucocytes sont observé différentes pathologies sont associées : lymphocytose, neutrophilie, éosinophilie, monocytose et basophilie. Un nombre généralement élevé de globules blancs se dit une leucocytose. Ceci peut être le résultat d'infections bactériennes, une inflammation, la leucémie, un traumatisme ou même le stress. Chacun des leucocytes possède des caractéristiques spécifiques qui peuvent être observées suite à une coloration (voir le tableau sur la prochaine page). Matériaux Lame préparée d'un frottis de sang humain Méthode 1. Examiner la lame préparée d'un frottis de sang humain afin d'identifier les différentes catégories de leucocytes. 2. Faire le balayage de la lame préparé (voir ci-dessous) au plus faible grossissement (10x) et compter le nombre de différents types de leucocytes sur un total de 100 leucocytes compté.

3. Calculer le pourcentage de chaque classe de GB en divisant le nombre de chaque type par le nombre total de GB compté. Compte différentiel de globules blancs Type cellulaire No de chaque % de chaque Neutrophiles Éosinophiles Basophiles Lymphocytes Monocytes Total:

112

Labo de Microbiologie-2012

Les leucocytes Nom

Granulocytes: Neutrophiles

Caractéristiques Fonction principale morphologiques Granules Deux lobes séparés par un Phagocytose des mince filament de bactéries chromatine

Granulocytes: Éosinophiles

Granules Noyau bilobé

Destruction des vers parasites

Granulocytes: Basophiles

Granules très abondants qui habituellement cachent le noyau

Libération de médiateurs chimiques (réaction inflammatoire)

Lymphocytes B

Lymphocytes T

Monocytes

Production d'anticorps (réponse humorale)

Absence de granules Noyau occupe la majorité Attaque des cellules du cytoplasme infectées (réponse cellulaire)

Pas de granules Noyau de forme irrégulière

Phagocytose (les monocytes se transforment en macrophages dans les tissus)

Vous êtes responsable de cette matière pour l’examen final!

113

Labo de Microbiologie-2012 Devoir: Hématologie Soumettre un tableau qui présente les données suivantes pour votre échantillon de sang.

Compte GR Hématocrite VCM Compte GB % Neutrophiles % Éosinophiles % Basophiles % Lymphocytes % Monocytes Assurez-vous d’indiquer les valeurs avec les unités appropriées. Inclure un commentaire, qui indique et explique toute condition médicale évidente s’il y en a une. BIOREMÉDIATION (Partie 8b) Méthode 1. Obtenir vos résultats et vos observations pour les tests métaboliques faits pour pouvoir identifier l’OEM.

114