Manualul de microbiologia alimentelor.pdf

Coordonator: Simona Ivana Autori: Simona IVANA, Nicolae Alexandru POPESCU

Microbiologia alimentelor Manual de laborator * ediţie îmbunătăţită şi adăugită *

Editura Asclepius Bucureşti, 2013

© 2013 Editura Asclepius

Toate drepturile sunt rezervate Editurii Asclepius All rights reserved to Asclepius Publishing House ISBN electronic: 978-606-8236-34-6 Editura Asclepius este o editură recunoscută internaţional. Lucrările acestei edituri sunt indexate in peste 500 biblioteci internaţionale. Comitetul editorial al editurii este format din persoane de prestigiu internaţional din domeniul ştiinţelor vieţii. Asclepius Publishing House books are indexed in over 500 internaional libraries. Editorial board is made of prestigious persons in the Life Sciences domain. Această carte este protejată prin copyright©. Reproducerea integrală sau parţială, multiplicarea prin orice mijloace şi sub orice formă, cum ar fi xeroxarea, scanarea, transpunerea în format electronic sau audio, punerea la dispoziţia publică, inclusiv prin internet sau prin reţele de calculatoare, stocarea permanentă sau temporară pe dispozitive sau sisteme cu posibilitatea recuperării informaţiilor cu scop comercial sau gratuit precum şi alte fapte similare săvârşite fără permisiunea scrisă a deţinătorului copyright©-ului reprezintă o încălcare a legislaţiei cu privire la protecţia proprietăţii intelectuale şi se pedepsesc penal şi/sau civil în conformitate cu legile în vigoare. This book is protected by copyright©. Reproduction in whole or in part, reproduction by any means and in any form, such as copying, scanning, electronic or audio implementation, providing the public, including via the Internet or computer networks, permanent or temporary storage devices or systems with the possibility of recovering information or free commercial and other similar acts committed without written permission of the copyright's owner is an infringement on intellectual property and is punished by criminal and/or civil liability under applicable law.

Director: Nicolae Alexandru POPESCU Design copertă: Ioana Irinel POPESCU Grafică şi tehnoredactare: Ioana Irinel POPESCU

Referenţi Ştiinţifici: Prof. univ. Dr. Marian Neguţ Universitatea de Medicină şi Farmacie "Carol Davila", Bucureşti Prof. univ. Dr. Iulian Ţogoe Facultatea de Medicină Veterinară, Bucureşti Prof. univ. Dr. Gheorghe Răpuntean Facultatea de Medicină Veterinară, Cluj-Napoca Prof. univ. Dr. Constantin Vasiu Facultatea de Medicină Veterinară Cluj-Napoca.

În memoria profesorului Ion Miclăuş, cel care a fost şi va rămâne veşnic în sufletele noastre.

Cuprins Cuvant înainte 1 Norme de protecţia muncii în laboratorul de microbiologie 3 Noţiuni introductive privind tehnicile de diagnostic de laborator Aparatura utilizată în laboratorul de microbiologie 5 Posibilităţi de transmitere a infecţiilor de laborator la om 6 Sterilizarea 7 Transportul şi conservarea probelor 10 Triajul de calitate al probelor 11 Conduita generală a identificării bacteriilor 13 Clasificarea bacteriilor din alimente 19

4

CAPITOLUL 1 RECOLTAREA PROBELOR ALIMENTARE 20 1.1. Noţiuni introductive 20 1.2. Ambalarea şi expedierea probelor 22 1.3. Primirea şi prelucrarea probelor în laborator 22 1.4. Examenul de laborator 23 1.5. Determinarea numărului total de germeni (NTG) 23 CAPITOLUL 2 DETERMINAREA TITRULUI COLI ŞI A BACTERIILOR COLIFORME 27 2.1. Testul de confirmare pentru coliformii totali 28 2.2. Testul de confirmare pentru coliformii fecali 29 2.3. Testul de confirmare pentru Escherichia coli 29 2.4. Metoda MUG pentru numărarea rapidă a lui E. coli 29 2.5. Testul prezumptiv LT-MUG pentru E. coli 30 2.6. Testul de confirmare a LT-MUG 30 CAPITOLUL 3 IZOLAREA ŞI IDENTIFICAREA SALMONELELOR DIN ALIMENTE DETERMINAREA BACTERIILOR DIN GENUL SALMONELLA 34 3.1. Consideraţii generale 34 3.2. Metoda de lucru 35 3.3. Sistemele microtest 38 CAPITOLUL 4 IDENTIFICAREA GENULUI SHIGELLA 42 4.1. Caracterizare generală 42 4.2. Izolarea şi identificarea shigelelor din alimente 42 CAPITOLUL 5 IZOLAREA ŞI IDENTIFICAREA STAFILOCOCILOR DIN ALIMENTE 48 5.1. Caractere generale 48 5.2. Metoda de numărare directă în plăci Petri 50 5.3. Teste auxiliare 51 5.4. Determinarea numărului cel mai probabil de germeni 52 CAPITOLUL 6 IZOLAREA ŞI IDENTIFICAREA LUI BACILLUS CEREUS DIN ALIMENTE 6.1. Caractere generale 58 6.2. Determinarea numărului cel mai probabil de germeni 59 v

58

6.3. Confirmarea lui B. cereus 59 6.4. Teste pentru diferenţierea membrilor grupului B. cereus 61 CAPITOLUL 7 IZOLAREA ŞI IDENTIFICAREA SPECIEI LISTERIA MONOCYTOGENES DIN ALIMENTE 67 7.1. Caractere generale 67 7.2. Metoda şi schema de lucru utilizată pentru izolarea şi identificarea lui Lis. monocytogenes 7.3. Identificarea şi confirmarea lui Lis. monocytogenes 68

68

CAPITOLUL 8 IZOLAREA ŞI IDENTIFICAREA LUI VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS DIN ALIMENTE 73 8.1. Caractere generale 73 8.2. Tehnica de lucru 74 CAPITOLUL 9 IZOLAREA ŞI IDENTIFICAREA GENULUI CAMPYLOBACTER DIN ALIMENTE 9.1. Caractere generale 81 9.2. Prepararea probelor 82 9.3. Izolarea speciilor de Campylobacter 83 9.4. Identificarea speciilor de Campylobacter 84 9.5. Confirmarea campilobacteriilor 84

81

CAPITOLUL 10 DETERMINAREA PREZENŢEI ŞI A NUMĂRULUI DE BACTERII DIN SPECIA CLOSTRIDIUM PERFRINGENS 91 10.1. Caractere generale 91 10.2. Izolarea şi identificarea lui C. perfringens 93 CAPITOLUL 11 IZOLAREA ŞI IDENTIFICAREA SPECIEI CLOSTRIDIUM BOTULINUM DIN ALIMENTE 98 11.1. Caractere generale 98 11.2. Detectarea lui C. botulinum viabil 100 11.3. Detectarea toxinei botulinice 101 CAPITOLUL 12 DETERMINAREA NUMĂRULUI DE DROJDII ŞI MUCEGAIURI DIN ALIMENTE 12.1. Scurtă prezentare a genurilor de drojdii şi mucegaiuri din alimente în ordine alfabetică 12.2. Metoda de lucru 119 CAPITOLUL 13 MEDII DE CULTURĂ, REACTIVI, DILUANŢI 130 13.1. Caractere generale 130 13.2. Medii de cultură folosite în diagnosticul de laborator 13.3. Prepararea mediilor de cultură 133 13.4. Clasificarea mediilor de cultură 133 13.5. Diluanţi 156

vi

131

103 103

Motto: “Dacă o bacterie funcţionează cu virtuozitate, aceasta se datorează faptului că strămoşii săi şi-au exercitat dibăcia în această chimie, timp de 2 miliarde de ani, notându-şi cu conştiinciozitate reţeta fiecărei reuşite.”

Cuvânt înainte Lucrarea de faţă intitulată “Microbiologia alimentelor - Manual de laborator” se adresează, în primul rând studenţilor dar şi masteranzilor şi doctoranzilor pentru parcurgerea unui minim de cunoştinţe, în ceea ce priveşte activitatea de laborator. Manualul oferă o lectură plăcută şi o expunere clară, putându-se parcurge astfel, de orice categorie de cititori, indiferent de nivelul de pregătire. Lucrarea este structurată în 13 capitole, şi anume: Capitolul 1 cuprinde recoltarea probelor alimentare, fiind format din 5 subcapitole şi anume: noţiuni introductive, ambalarea şi expedierea probelor, precum şi primirea şi prelucrarea lor în laborator. Tot în acest capitol este inclusă şi determinarea numărului de germeni (NTG). Capitolul 2 se referă la determinarea titrului coli şi a bacteriilor coliforme; confirmarea coliformilor totali, fecali şi pentru Escherichia coli. Capitolul 3 cuprinde izolarea şi identificarea salmonelelor din alimente. Capitolul 4 cuprinde identificarea genului Shigella. Capitolul 5: izolarea şi identificarea stafilococilor din alimente; Capitolul 6: izolarea şi identificarea lui Bacillus cereus; Capitolul 7: izolarea şi identificarea speciei Listeria monocytogenes; Capitolul 8: izolarea şi identificarea lui Vibrio parahaemolyticus; Capitolul 9: izolarea şi identificarea genului Campylobacter; Capitolul 10: determinarea prezenţei şi a numărului de bacterii din specia Clostridium perfringens; Capitolul 11: izolarea şi identificarea speciei Clostridium botulinum; Capitolul 12: prezentarea genurilor comune de mucegaiuri din alimente; Capitolul 13: medii de cultură, reactivi, diluanţi şi coloranţi. Manualul cuprinde 20 de tabele, 8 scheme şi 102 imagini color. 1

Autorii adresează sincere mulţumiri tuturor celor care şi-au oferit ajutorul în realizarea acestui manual. În acest sens mulţumeşte cu recunoştinţă profesorilor referenţi ştiinţifici ai lucrării, pentru bunele aprecieri, grija şi competenţa ştiinţifică cu care au analizat manuscrisul. Autoarii.

2

Norme de protecţia muncii în laboratorul de microbiologie Pentru protejarea stundenţilor şi a personalului din laboratorul de microbiologie este necesar să se cunoască şi să respecte următoarele norme de protecţia muncii: 1. Este obligatorie folosirea halatului de protecţie, care asigură reducerea riscului de contaminare, efectuarea corespunzătoare a operaţiunilor de sterilizare, protejarea hainelor împotriva acţiunii diferiţilor agenţi chimici; 2. Păstrarea lucrurilor personale în locuri special amenajate, departe de masa de lucru; 3. Păstrarea într-o ordine perfectă a laboratorului şi încăperilor anexe; 4. Efectuarea experimentelor în cadrul lucrărilor practice de către studenţi nu se realizează decât după primirea instrucţiunilor preliminare de la cadrul didactic; 5. În timpul lucrărilor practice , pentru a preveni contaminarea se interzic deplasările, vorbitul, fumatul, mâncatul, etc. 6. Dacă masa de lucru a fost contaminată cu produse care conţin germeni, se va anunţa cadrul didactic răspunzător; se va acoperi zona respectivă cu un tifon îmbibat cu atiseptice şi numai după ce a trecut timpul necesar distrugerii acestora se efectuează curăţirea propriu-zisă a locului respectiv; 7. Dacă pe masa de lucru s-au răspândit substanţe chimice periculoase, ele vor fi în prealabil neutralizate, după care se recurge la îndepărtarea lor; 8. Mediile însămânţate se incubează la termostat, culturile folosite se trimit la infecte pentru autoclavare, frotiurile şi pipetele se inscripţionează şi se depun în cutii speciale 9. După fiecare lucrare se curăţă şi se dezinfectează mesele de lucru, pentru ca la începerea unei alte lucrări practice să existe condiţii corespunzătoare de lucru; 10. Nu se va atinge aparatura de laborator sau culturile pregătite în prealabil pentru lucrările practice, decât după acceptul cadrului didactic răspunzător; 11. Se vor respecta normele minime de asepsie şi se va menţine distanţa corespunzătoare faţă de becul de gaz; 12. Nu se vor amesteca la întâmplare substanţele, coloranţii, reactivii, care se găsesc în laborator; 13. Microscoapele se vor folosi cu mare atenţie, iar la terminarea lucrului se vor strânge corespunzător, se vor aranja la marginea mesei de lucru şi se va şterge oleul de cedru cu pulpa degetului, după care se vor acoperi cu huse. 14. Înainte de a părăsi laboratorul, studentul respectiv va trece la spălarea şi dezinfecţia mâinilor; Respectarea acestor norme minime în laboratorul de microbiologie va permite desfăşurarea lucrărilor practice în condiţii de siguranţă deplină.

3

Noţiuni introductive privind tehnicile de diagnostic de laborator Tehnicile de diagnostic în laboratorul de microbiologie au drept scop izolarea şi identificarea speciilor bacteriene care se găsesc în alimente. Probele de alimente o dată recepţionate şi triate calitativ sunt preluate de către microbiolog, care trebuie să hotărască: - mediile de cultură şi metodele indicate pentru izolare; - atmosfera, temperatura şi intervalul necesar pentru izolarea microorganismelor respective. Metodele de investigaţie le putem împărţi în două mari grupe:  metode directe;  metode indirecte. Prin metodele directe se urmăreşte depistarea rapidă a microorganismelor prin diverse examene, ca:  efectuarea de preparate microscopice colorate şi necolorate;  tehnici de biologie moleculară (de exemplu: reacţia PCR = Polymerase Chain Reaction);  izolarea şi identificarea microorganismelor în cultură pură, precum şi efectuarea antibiogramei. Metodele indirecte se referă la diagnosticul serologic, diagnosticul prin reacţii intradermice, etc. Identificarea bacteriilor în laborator este posibilă după izolarea în cultură pură din proba de examinat şi studiul caracteristicilor morfobiologice ale acestora. Examenul bacteriologic se desfăşoară în mai multe etape, astfel: • recoltarea probelor; • izolarea bacteriilor în cultură pură; • identificarea bacteriilor în funcţie de caracteristicile lor morfologice, culturale, metabolice, antigenice, de patogenitate, etc., folosind teste corespunzătoare. Selecţionarea testelor de diagnostic, în vederea stabilirii genului şi a speciei bacteriene se face pe baza rezultatelor obţinute la examenul caracterelor morfologice şi culturale. Identificarea unui germen reprezintă de multe ori o operaţie dificilă şi în astfel de cazuri se face apel la determinatorul „Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology”. Diagnosticul se trece în registrul laboratorului, la numărul sub care a fost înregistrată proba. Fiecare tulpină se individualizează fie printr-un număr, fie printr-un simbol. Pentru a avea condiţii cât mai riguroase de sterilizare, în cursul diferitelor operaţiuni în laboratoarele de bacteriologie, se recomandă ca lucrările să se efectueze în încăperi speciale, denumite boxe, cu restricţii de circulaţie şi prevăzute cu lămpi cu ultraviolete, utilizarea hotelor simple sau a hotelor „laminar/linear flow”. În astfel 4

de hote, aerul pătrunde linear spre operator şi este forţat să treacă printr-un prefiltru şi apoi printr-un sistem de filtre HEPA (high efficiency particulate air). Aparatura utilizată în laboratorul de microbiologie Recipienţii utilizaţi în microbiologie trebuie să fie din sticlă neutră (pentru a nu altera pH-ul conţinutului) şi suficient de groasă şi termorezistentă, pentru a evita spargerea lor şi contaminarea consecutivă a mediului. Recipienţii din sticlă boro-silicată (Pyrom, Turdaterm, Ryrex şi Jena) sunt cei mai indicaţi, pentru că prezintă o rezistenţă mare la şocurile termice (25-255°C) invers proporţională cu grosimea) şi eliberează cantităţi nesemnificative de alcali în mediu. Sticla ordinară, calcosodică are o rezistenţă redusă la şocurile termice (între 40-90°C) şi eliberează alcali în soluţii. Fiecare lot trebuie supus unui tratament de neutralizare. Aparatura care nu poate lipsi din nici un laborator de microbiologie este reprezentată de:  eprubete (pentru 2-4 ml de mediu); trebuie să aibă gura dreaptă, fără boruri;  tuburi de centrifugă, cu fund rotund sau conic, din sticlă şi din material plastic;  tuburi Durham: reprezentate de tubuleţe de sticlă, care se introduc cu gura în jos, în mediul de cultură lichid, pentru a detecta formarea de gaz;  plăci (cutii) Petri: plăcile din sticlă boro-silicată; nu se zgârie, sunt perfect plate şi uşor de stivuit, dar extrem de scumpe şi fragile; cele din sticlă calco-sodică sunt mai groase, mai rezistente şi mai ieftine; cele din material plastic, de unică folosinţă sunt ieftine, uşor de manipulat şi stivuit;  pipete Pasteur – pot fi scurte sau lungi, cu calibrul de 6-7 mm, confecţionate din sticlă sau polipropilenă. Se sterilizează ca şi pipetele gradate, ambalate în cutii de aluminiu;  pipete gradate – au o capacitate de 1, 2, 5, 10 şi 25 ml. Se folosesc închise cu vată nehidrofilă la extremitatea de secţiune, pentru a preveni contaminarea lichidului pipetat cu microbi din propipetă;  propipete – pot fi reprezentate de o pară de cauciuc adaptată la extremitatea de secţiune;  lame şi lamele de microscop – lame cu margini palisate sau simple (mai ieftine). Pentru colorarea preparatelor microscopice, folosim: 1. stative din sârmă anexate la tăvi metalice emailate; 2. cutii pentru băi de colorat. Stative şi panere. Pentru tuburile şi flacoanele cu medii de cultură sunt indicate stative autoclavabile din propilenă, care reduc riscul spargerii eprubetelor, un dezavantaj al stativelor din metal. 5

Stativele din lemn sunt total neigenice şi dificil de decontaminat. Coşurile din sârmă se folosesc numai pentru recipienţii cu material neinfecţios. Firul de însămânţare este confecţionat din sârmă inoxidabilă, de platină sau crom nichel, cu grosime în funcţie de consistenţa materialului microbian de manipulat. Este fixat într-un port fir din metal, care trebuie ţinut perfect curat prin frecare periodică, uşoară, cu şmirghel fin, a extremităţii inferioare, pentru îndepărtarea materialului carbonizat. Port firul din sticlă este contraindicat. Firul perfect drept. Este utilizat pentru însămânţări prin înţepare. Ansa (firul buclat la o extremitate) – pentru însămânţarea în medii lichide şi pentru epuizarea inoculului în striuri. Firul spatulat – pentru manipularea coloniilor microbiene, cu consistenţă fermă. Posibilităţi de transmitere a infecţiilor de laborator la om În laborator, agenţii infecţioşi pot pătrunde în organism pe următoarele căi:  mucoasa digestivă (ingestia) – în cursul pipetării cu gura, introducerea în gură a degetelor şi obiectelor de pe mesele de laborator (creioane, ţigări, alimente) contaminate prin scurgeri, stropiri neobservate sau insuficient dezinfectate. Riscul inhalării se realizează prin aerosoli (culturi liofilizate) la deschiderea sau spargerea fiolelor. Stropii de fluid infecţios ajunşi în ochi pot determina infecţii grave;  transmiterea transcutanată a infecţiilor în laborator se poate realiza prin înţepături cu ace de seringă, pipete Pasteur sau cioburi de sticlă contaminate; prin contaminarea plăgilor tăiate, zgâriate, a abraziunilor. Evoluţia infecţiilor de laborator este atipică şi frecvent gravă. OMS a stabilit 4 niveluri de exigenţă, în ceea ce priveşte clasificarea laboratoarelor din punct de vedere al exigenţei: nivelurile 1 şi 2 corespund laboratoarelor de bază, nivelul 3, laboratoarelor cu regim restrictiv şi nivelul 4, celor cu regim de maximă restricţie. Ne interesează nivelurile 1 şi 2, care corespund sistemelor de învăţământ şi sănătate publică. Nivel

Aplicat în:

Mijloace de protecţie

Locul de muncă

1 (de bază)

Învăţământul secundar

Tehnologie microbiologică foarte bună

Lucru pe masa deschisă

2 Învăţământul universitar (de bază) Sănătate publică

Halat de protecţie Semnalizarea riscului biologic Tehnologie microbiologică foarte bună 6

Lucru pe masa deschisă Boxă de siguranţă, clasa I sau a II-a (pentru activităţi generatoare de aerosoli)

În laboratorul de microbiologie diferenţiem trei bariere antiinfecţioase:  primare – care previn răspândirea unui microb în laborator;  secundare – care protejează personalul în cazul depăşirii accidentale, de către microorganisme a barierelor primare;  terţiare, care previn răspândirea în comunitate a microorganismelor care au depăşit barierele primare şi secundare. Sterilizarea Sterilizarea reprezintă operaţia de îndepărtare a microorganismelor dintr-un spaţiu sau de pe o suprafaţă delimitată cu ajutorul agenţilor fizici sau chimici. Fizicianul englez John Tyndall a demonstrat că bulionul de cultură, încălzit, nu se alterează, dacă este păstrat în camere fără praf. Studiile sale au furnizat dovada că unii microbi din praf sau din aer prezintă o termorezistenţă extrem de mare, iar pentru distrugerea lor este necesar un tratament deosebit de energic. Mai târziu, descoperirea şi descrierea detaliată a unor endospori bacterieni termorezistenţi, de către bacteriologul german Ferdinand Cohn, au elucidat de ce căldura nu reuşeşte uneori să elimine complet microorganismele. Sensul modern de „steril” (care implică absenţa oricărei forme de viaţă), a fost stabilit pornind de la această constatare. Capacitatea de sterilizare a obiectelor şi materialelor constituie o parte esenţială a microbiologiei, precum şi, a altor sectoare, ca medicina, industria, etc. Încă de timpuriu, microbiologii au început să suspecteze că nu numai alterarea şi descompunerea sunt provocate de microorganisme, dar şi bolile infecţioase. Ei au mers până acolo, încât să susţină că însuşi corpul uman reprezintă o sursă de infecţie. Oliver Holmes (medic american) a observat că mamele care năşteau la domiciliu, prezentau mai puţine infecţii decât cele care năşteau în maternităţi, iar medicul ungur Ipraz Semmebicis a arătat, clar, că unele femei se infectau în saloanele maternităţilor, după ce erau examinate de medici, care veneau direct din camerele unde se făceau autopsiile. Chirurgul englez Joseph Lister, a fost primul care a introdus tehnicile aseptice*, având ca obiectiv reducerea microbilor într-un mediu medical şi prevenirea infectării plăgilor. Această asepsie a constat în esenţă, în dezinfectarea mâinilor şi aerului, înainte de manoperele chirurgicale, cu substanţe chimice antiseptice puternice, ca fenolul. Aceste tehnici şi aplicarea căldurii, pentru sterilizare au devenit bazele controlului microbian prin metode fizice şi chimice, care mai sunt şi azi utilizate. Reguli de asepsie în laborator:  Se ordonează pe masa de lucru echipamentul strict necesar;  Studentul se aşează comod pe scaun cu antebraţele complet pe blatul mesei, executând toate mişcările sub controlul vederii; * asepsie = manipulare la adăpost de microorganisme

7

 Ansa se ţine în mâna dreaptă, apucându-se ca pe un creion, de extremitatea opusă firului;  În mâna stângă se ţine recipientul în care se prelevă sau se introduce materialul manipulat, cât mai aproape de extremitatea inferioară;  Se scoate dopul recipientului cuprinzându-l între auricular, inelar şi palma mâinii drepte;  Se sterilizează, prin flambare gura eprubetei;  Se introduce ansa în eprubetă pentru prelevarea şi depunerea materialului microbian. Se evită atingerea cu ansa a pereţilor recipientului;  După retragerea ansei, se flambează gura recipientului şi se introduce dopul sau se înşurubează capacul;  Se resterilizează ansa. În laboratorul de microbiologie sterilizarea se obţine prin tehnici bazate pe următorii agenţi: • căldura uscată: o încălzire la roşu; o flambare; o aer cald; o incinerare. • căldura umedă: o peste 100°C: autoclavare; o la sau sub 100°C: tindalizare. • filtrare; • radiaţii ultraviolete; • sterilizare chimică prin oxid de etilen. Sterilizarea prin încălzire la roşu este indicată pentru firul drept, ansa şi spatula de însămânţare. Flambarea se foloseşte pentru sterilizarea capilarului eprubetelor Pasteur, a gurii eprubetelor şi flacoanelor. Incinerarea presupune arderea, cu reducere la cenuşă. Este indicată pentru materialele din plastic, reziduuri organice. Sterilizarea prin aer cald se realizează în etuvă la 160-180°C, timp de o oră. Timpul creşte peste o oră în cazul ambalajelor voluminoase sau a obiectelor, substanţelor care se încălzesc greu. Este indicată în sterilizarea obiectelor de laborator din sticlă sau porţelan, instrumente chirurgicale, substanţe groase, pulberi termostabile. Această metodă este contraindicată în sterilizarea unor soluţii apoase, obiecte de cauciuc sau cu garnituri de cauciuc, seringi din sticlă cu metal, ţesături, vată, bumbac, 8

fibră sintetică, materiale contaminate de laborator. Etuva este o incintă cilindrică sau paralelipipedică cu pereţi dubli, din tablă termorezistentă. Rezistenţele electrice şi un termostat permit menţinerea constantă a temperaturii selectate, uniformizată în incinta de sterilizare printr-un sistem de ventilaţie. Obiectele de sterilizat se aşează în etuvă pe rafturi confecţionate din sită metalică. Sterilizarea prin căldură umedă se realizează cu ajutorul autoclavelor, în care vaporii de apă saturaţi realizează 115°C la 0,5 atmosfere, 121°C la 1 atmosferă şi 134°C la 2 atm. Prezenţa aerului compromite acest tip de sterilizare. Autoclavul este un cazan cu pereţi rezistenţi, în care după închiderea etanşă cu un capac masiv, fixat prin buloane, vaporii de apă se comprimă la presiunea necesară sterilizării. Tindalizarea sau sterilizarea fracţionată evită încălzirea la temperaturi peste 100°C, fiind destinată sterilizării unor medii de cultură, alimente, etc., care se degradează la temperaturi mai mari. Sterilizarea fracţionată constă în încălzirea materialelor de sterilizat la temperatura impusă de compoziţia lor, timp de 30-60 de minute, la interval de 24 de ore, de trei ori consecutiv. În prima zi de încălzire se distrug formele vegetative, ale bacteriilor, sporii rezistând. Aceştia se transformă (în intervalul de 24 de ore de incubaţie la 37°C) în forme vegetative, care vor fi distruse prin încălzire, a doua zi. Încălzirea de a treia zi se face pentru distrugerea ultimelor forme vegetative, rezultate din germinarea sporilor. În intervalul dintre încălziri, recipienţii cu substanţele supuse sterilizării se menţin la temperatura camerei, pentru germinarea sporilor. Pasteurizarea ca şi ultrapasteurizarea (uperizarea) distruge numai formele vegetative, nefiind o sterilizare propriu-zisă. Se folosesc în industria alimentară (la sterilizarea laptelui, a berii, a sucurilor, etc). Pasteurizarea constă în încălzirea lichidelor la temperaturi între 55°C şi 95°C, un timp variabil (la 65°C, 90 de minute, la 90°C, câteva secunde), iar ultrapasteurizarea în injectarea de vapori supraîncălziţi (150°C) în masa lichidelor destinate sterilizării. Sterilizarea prin radiaţii ultraviolete se realizează cu ajutorul lămpilor germicide. Acestea reprezintă tuburi de sticlă specială, în care descărcările electrice într-o atmosferă cu vapori de mercur la joasă presiune generează radiaţii ultraviolete. Viaţa de funcţionare este de aproximativ 100 de ore. Instalarea lămpilor germicide este indicată pentru: • reducerea încărcăturii microbiene a spaţiilor de lucru; 9

• constituirea unei bariere protectoare între aria cu animale inoculate, boxele de necropsie, etc. şi personalul de laborator sau animalele sănătoase. Controlul eficacităţii sterilizării Se realizează prin indicatori fizici (manometru, termometru), chimici şi biologici. Indicatorii fizici şi chimici ne dau indicaţii asupra timpului, cât s-a menţinut temperatura de sterilizare. Indicatorii biologici: tuburi cu fire de bumbac impregnate cu spori de Geobacillus (Bacillus) stearothermophilus şi uscate (pentru etuve) sau fiole cu suspensie de acelaşi bacil (pentru autoclavare), prezintă o mare fidelitate. Prezervarea sterilizării se realizează diferit, în funcţie de material. Eprubetele şi flacoanele se sterilizează, prevăzute cu dopuri de vată şi tifon, protejate cu capişon de hârtie, sau aluminiu. Foarte eficientă este protejarea prin capac înşurubat. Pipetele se sterilizează prevăzute cu filtru de vată, învelite individual în benzi de hârtie pergament sau grupate în cutii de tablă de aluminiu, prevăzute cu capac. Plăcile Petri se sterilizează învelite, individual sau grupate în hârtie pergament. Mojarele şi pistilele se învelesc separat în hârtie. Sterilizarea prin agenţi chimici se poate realiza cu ajutorul:  substanţelor dezinfectante, pe care le putem aplica numai pe suprafeţe inerte din cauza efectelor iritante ori toxice (de exemplu: sublimat corosiv 1‰, formol 40%, sodă caustică, clorură de var);  substanţelor antiseptice, care pot fi aplicate pe tegument, unele mucoase sau plăgi, având o toxicitate mai redusă (de exemplu: alcool medicinal, etilic 70%, tinctură de iod, apă oxigenată, permanganat de potasiu 0,1%, acid acetic 1%, cloramină, detergenţi). Niciodată această metodă nu se va utiliza pentru sterilizarea materialelor (instrumente, medii) destinate cultivării sau manipulării microbilor. Transportul şi conservarea probelor Transportul şi conservarea probelor se realizează după următoarele reguli:  menţinerea cât mai mult posibil a condiţiei microbiologice iniţiale a probei, care constă în: − supravieţuirea microbului infectant; − inhibarea multiplicării microbilor contaminanţi, pe baza nutrienţilor din prelevatul patologic sau distrugerea acestora.  prevenirea răspândirii microbului infectant la personal şi în colectivitate. Moartea microbilor poate fi provocată de razele solare, deshidratare, modificări de pH, autoliză, oxigen (în cazul germenilor anaerobi). De aceea, o dată recoltate, 10

probele trebuiesc examinate în cel mai scurt timp posibil sau conservate prin refrigerare şi medii de transport adecvate. • Refrigerarea se realizează la 0°C (în container izoterm cu gheaţă umedă) sau la 4°C (la frigider). Majoritatea microbilor patogeni supravieţuiesc în aceste condiţii câteva ore necesare transportului, multiplicarea contaminanţilor fiind oprită. Foarte puţine bacterii nu rezistă la refrigerare: meningococul, gonococul, Haemophilus influenzae. • Mediile de transport asigură supravieţuirea microorganismelor prevenind disecarea, variaţiile de pH, oxidarea şi autoliza. Cel mai frecvent sunt utilizate, în bacteriologie, mediile care conţin substanţe stabilizatoare non-nutritive: Cary-Blair, Amies sau Stuart. Pentru monitorizarea pH-ului se poate folosi un indicator (roşu fenol) când această condiţie este critică pentru supravieţuirea unor microbi (virusuri, shigele, etc.). Microbii care se izolează pe culturi de celule sau embrioni de găină (virusuri, chlamidii) se transportă în medii cu antibiotice (penicilină, streptomicină, nistatină). Când, însă, în acelaşi prelevat urmărim şi virusuri şi bacterii, proba va fi suspensionată în mediile de transport fără antibiotice, urmând ca acestea să fie adăugate diferenţiat la prelucrarea probei în laborator. O atenţie aparte trebuie să acordăm bacteriilor anaerobe, astfel:  dacă transportul şi examinarea se fac fără întârziere, cea mai accesibilă metodă este aspirarea probelor fluide în seringă etanşă, cu îndepărtarea imediată a bulelor de aer şi obturarea acului prin înţepare într-un dop steril;  pentru probele biopsice şi tampoane sau dacă intervalul până la examinare se prelungeşte sunt indispensabile containere comerciale speciale (tuburi, flaconaşe, pungi), care conţin un sistem generator de dioxid de carbon, un agent reducător şi un indicator „redox” (resazurină sau albastru de metilen) pentru monitorizarea vizuală a anaerobiozei. Containerele speciale cu atmosferă îmbogăţită în dioxid de carbon şi mediu microaerofil sunt avantajoase pentru probele în care urmărim Neisseria sau Campylobacter. Cei interesaţi de expedierea produselor microbiene prin poştă, trebuie să respecte exigenţele de conservare şi securitate impuse de standarde recunoscute internaţional. Triajul de calitate al probelor Are loc în două etape: • controlul macroscopic, care se realizează prin înscrierea datelor în registrul de intrări sau introducerea acestora în terminalul unui computer. Se urmăresc: − consemnarea completă a datelor de identificare a probei, de pe eticheta recipientului şi din cererea de analiză; − consemnarea diagnosticului prezumptiv şi a datelor anamnetice esenţiale; 11

− recoltarea probelor sub terapie antimicrobiană; − formularea precisă a diagnosticului solicitat în raport cu diagnosticul prezumptiv şi natura prelevatului; − intervalul dintre prelevare şi înregistrare; − natura mediului de transport; − virajul indicatorilor de pH sau redox; − tipul şi starea ambalajului. • controlul microscopic se realizează pe preparate umede sau colorate Gram.

12

Conduita generală a identificării bacteriilor Identificarea şi clasificarea bacteriilor trebuie să folosească în mod obligatoriu un număr cât mai mare de caractere distinctive de ordin morfologic, biochimic, fiziologic, antigenic, ecologic, etc., uşor de observat şi relativ stabile, independent de modificările mediului. În identificarea unei bacterii trebuie să se ţină seama de caracterele unitare (de exemplu: sporogeneza, fermentarea, etc.). Se va evita practicarea unui număr excesiv de teste, preferându-le pe cele care se efectuează rapid şi simplu. Datorită faptului că, bacteriile izolate direct de la animale, plante sau din medii naturale apar rar în culturi pure, este necesară izolarea lor în culturi pure (axenice), lipsite de prezenţa altor microorganisme. Caracterele morfologice şi tinctoriale reprezintă un criteriu preliminar, necesar pentru plasarea unei tulpini necunoscute într-o subdiviziune primară. În unele cazuri ele pot fi utilizate în practică drept un prim criteriu de diagnostic (de exemplu, prezenţa bacilului tuberculozei în spută). Caracterele de cultură. Deşi variază în limite largi, în funcţie de vârsta culturii, de natura mediului şi de temperatură şi pH, acestea pot furniza informaţii cu caracter ajutător pentru identificarea bacteriilor respective. Caracterele biochimice şi fiziologice furnizează date importante în ceea ce priveşte capacitatea de a utiliza anumiţi nutrienţi; de a metaboliza anumite substraturi specifice ale unor enzime (fermentarea unor zaharuri, cu sau fără producere de gaz, modificări de pH evidenţiate de un indicator colorat). Condiţii de cultivare. Pe baza acestui aspect se pot obţine informaţii privind limitele de temperatură, pH, care permit multiplicarea, reacţia la presiunea osmotică, relaţia cu oxigenul şi lumina. Caracterele antigenice (serologice). Sunt deosebit de importante deoarece permit identificarea unui antigen (microorganism) necunoscut pe baza unui anticorp cunoscut, în diferite reacţii serologice:  de aglutinare;  de precipitare;  RFC;  ELISA  PCR  de imunofluorescenţă, şi multe altele. Caracterul de patogenitate a cărui manifestare depinde în primul rând de virulenţă. Acest caracter este relativ şi neunitar, deoarece virulenţa variază cu tulpina şi se poate atenua sau chiar pierde în culturi de laborator. 13

Pe de altă parte, eficacitatea acţiunii patogene depinde şi de receptivitatea individuală a gazdei, folosite pentru evidenţierea ei. Patogenitatea se testează prin inoculare experimentală la organisme sensibile, pe o cale adecvată. Sunt luate în consideraţie numai rezultatele pozitive, deoarece cele negative pot fi datorate fie utilizării unei gazde neadecvate, fie unor condiţii de inoculare nepotrivite. Caracterele ecologice. Habitatul natural al microorganismelor şi relaţiile lui în mediul natural cu alte forme de viaţă pot varia în funcţie şi de alţi factori decât cei proprii speciei date, precum şi pentru faptul că una şi aceeaşi specie bacteriană poate trăi în medii naturale foarte diferite. Parametrii ecologici utili pentru caracterele unei specii sunt reprezentaţi de: temperatura optimă de creştere sau de patogenitate, temperatura tolerantă, intensitatea luminii, pH, simbioza cu unele microorganisme, etc. Sensibilitatea la fag. Se testează stabilind activitatea unui set standard de fagi cunoscuţi. Permite stabilirea de subdiviziuni în cadrul speciei (fagovar) cu importanţă în epidemiologie, pentru determinarea sursei de infecţie şi a căilor de transmitere. Deoarece multe tulpini sunt lizogene, ele pot fi caracterizate prin tipizare fagică indirectă (lizogenotipie), adică prin detectarea şi identificarea fagilor temperaţi prezenţi ca profag în genomul lor. Cheile de identificare. Cheile de identificare conţin enumerarea caracterelor constante („caractere-cheie”) prezente sau absente totdeauna la un taxon dat. Cea mai cunoscută cheie de identificare este cea elaborată de Skerman şi publicată în determinatorul lui Bergey. Caracterele cheie pozitive sunt considerate markeri sau caractere de diagnostic. Colecţiile de culturi. Menţinerea tulpinilor bacteriene în colecţii se poate realiza prin: • transfer activ (în subculturi efectuate la intervale fixe, în funcţie de particularităţile biologice ale speciei respective); • prin uscare (pe diferite suporturi inerte ca: nisip, silicogel, etc.); • prin liofilizare (uscare în vid urmată de congelare la temperaturi joase -30 – - 80°C); • prin crioprezervare la -70°C – - 90°C, care asigură nivelul maxim de supravieţuire în timp. Pentru fiecare specie microbiană nou apărută se recomandă păstrarea unei culturi pure, a tulpinii tip originare, cu o descriere completă, care să poată fi completată cu noi caractere, pe măsură ce tehnicile de investigare se perfecţionează. Dacă tulpina este pierdută se recomandă înlocuirea ei cu o tulpină neotip, care îi seamănă foarte mult. Păstrarea unui astfel de „specimen tip practicabil” este extrem de dificilă. Din grupele de caractere enumerate se examinează un număr variabil, dar minimal 14

pentru identificarea tulpinii, fiind foarte utile schemele de diagnostic şi cheile de identificare. Pentru a definitiva identificarea unei tulpini, datele examenului bacteriologic, trebuie selectate, asamblate şi comparate. În acest scop se impune confruntarea caracterelor evidenţiate cu datele prezentate în determinatoare, manuale, ghiduri. Determinatoarele cuprind descrierea completă a speciilor bacteriene care prezintă interes pentru ramurile aplicative ale bacteriologiei. Sistemele de clasificare utilizate în determinatoare variază uneori de la un autor la altul, mai ales în ceea ce priveşte taxonii de rang superior (încrengătură, ordin). Determinatorul cel mai folosit în lume, este lucrarea „Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology”, a cărei primă ediţie a apărut în 1923. În 1984, a apărut primul volum al manualului reeditat sub titlul „Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology”. Indexurile conţin liste alfabetice ale tuturor denumirilor utilizate în prezent şi în trecut pentru bacterii. Cataloagele de colecţii cuprind liste alfabetice cu laboratoarele şi bacteriologii posesori de colecţii de tulpini, pe specii bacteriene şi adresele acestora. În fiecare colecţie bacteriană, tulpinile trebuie să posede o fişă individuală cu simbolul tulpinii, locul, data şi materialul din care a fost izolată, proprietăţile ei morfologice, culturale, biochimice, antigenice, de patogenitate, etc.

15

Taxonii de rang superior ai speciilor bacteriene importante Clasă/ Subclasă

Ordin/ Subordin

Ord. Bacillales

Cl. Bacilli

Familie (nr. genuri)

Gen (nr. de specii)

Staphylococcaceae (5)

Staphylococcus (41)

Bacillaceae (17)

Bacillus (184)

Listeriaceae (2)

Listeria (8)

Lactobacillaceae (3)

Lactobacillus (130)

Streptococcaceae (2)

Streptococcus (83) Lactococcus (5)

Enterococcaceae (5)

Enterococcus (35)

Leuconostocaceae (3)

Leuconostoc (19)

Clostridiaceae (23)

Clostridium (180) Acetivibrio (4)

Ord. Lactobacillales

Cl. Clostridia

Ord. Clostridiales

Ord. Actinomycetales Actinomycetaceae (5) Srd. Actinomycineae

Ord. Cl. Actinobacteria Actinomycetales Srd. Scl. Actinobacteridae Corynebacterineae

Actinomyces (37) Actinobaculum (3) Arcanobacterium (6)

Corynebacteriaceae (1)

Corynebacterium (89)

Nocardiaceae (2)

Nocardia (73) Rhodococcus (37)

Mycobacteriaceae (1)

Mycobacterium (118)

Ord. Actinomycetales Micrococcaceae (9) Srd. Micrococcineae 16

Micrococcus (10)

Clasă/ Subclasă

Taxonii de rang superior ai speciilor bacteriene importante Ordin/ Familie Gen Subordin (nr. genuri) (nr. de specii)

Enterobacteriaceae (44)

Escherichia (7) Klebsiella (12) Morganella (1) Plesiomonas (1) Proteus (8) Providencia (6) Salmonella (9) Serratia (13) Shigella (4) Yersinia (13)

Ord. Pasteurellales

Pasteurellaceae (7)

Pasteurella (22) Actinobacillus (18) Haemophilus (23) Lonepinella (1) Mannheimia (5)

Ord. Thiotrichales

Francisellaceae (1)

Francisella (3)

Ord. Pseudomonadales

Pseudomonadaceae (10)

Pseudomonas (161) Cellvibrio (7)

Ord. Vibrionales

Vibrionaceae (8)

Vibrio (77)

Ord. Enterobacteriales

Cl. Gammaproteobacteria

Ord. Aeromonadales Aeromonadaceae (4)

Aeromonas (20)

Ord. Cardiobacteriale

Cardiobacteriaceae (3)

Dichelobacter (1)

Legionellaceae (1)

Legionella (50)

Coxiellaceae (3)

Coxiella (1)

Burkholderiaceae (10)

Burkholderia (42)

Alcaligenaceae (11)

Bordetella (8)

Ord. Rhizobiales

Brucellaceae (3)

Brucella (6)

Ord. Rickettsiales

Rickettsiaceae (2)

Rickettsia (23) Orientia (1)

Ord. Legionellales

Cl. Betaproteobacteria

Ord. Burkholderiales

Cl. Alphaproteobacteria

17

Clasă/ Subclasă Cl. Spirochaetes

Cl. Spirochaetes

Cl. Epsilonproteobacteria

Ordin/ Subordin Ord. Spirochaetales

Familie (nr. genuri)

Gen (nr. de specii)

Leptospiraceae (2)

Leptospira (13) Leptonema (1)

Spirochaetaceae (9)

Borrelia (32) Treponema (23) Cristispira (1) Brevinema (1)

Serpulinaceae (2)

Brachyspira (5) Serpulina (6)

Campylobacteriaceae (4)

Campylobacter (25)

Helicobacteraceae (4)

Helicobacter (23)

Ord. Spirochaetales

Ord. Campylobacterales

Cl. Deltaproteobacteria

Ord. Desulfovibrionales

Desulfovibrionaceae (3)

Lawsonia (1)

Cl. Fusobacteria

Ord. Fusobacteriales

Fusobacteriaceae (7)

Fusobacterium (20)

Cl. Mollicutes

Ord. Mycoplasmatales

Mycoplasmataceae (4)

Mycoplasma (121) Eperythrozoon (5) Ureaplasma (7)

Cl. Chlamydiae

Ord. Chlamydiales

Chlamydiaceae (2)

Chlamydia (5) Chlamydophila (6)

Clasificarea bacteriilor a fost realizată după: George M. Garrity, Julia A. Bell, Timothy G. Lilburn – Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 2nd ed. (rel. 5.0), 2004, J.P. Euzéby - List of Prokaryotic Names with Standing in Nomenclature, 2006.

18

CLASIFICAREA PRINCIPALELOR BACTERII PATOGENE DIN ALIMENTE Bacterii Gram negative: 1. Salmonella 2. Shigella 3. Escherichia 4. Yersinia 5. Vibrio 6. Campylobacter 7. Aeromonas 8. Brucella 9. Plesiomonas Bacterii Gram pozitive: 1. Staphylococcus 2. Bacillus cereus 3. Bacillus anthracis 4. Clostridium botulinum, Clostridium argentiensis, Clostridium perfringens 5. Listeria monocytogenes 6. Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis

19

CAPITOLUL 1 RECOLTAREA PROBELOR ALIMENTARE 1.1. Noţiuni introductive Prin noţiunea de probă se înţelege orice produs sau material destinat examenului microbiologic. Indiferent de natura probelor sau de tipul examenului solicitat recoltarea se efectuează după următoarele reguli: - trimiterea probelor la laborator trebuie să se facă cât mai rapid şi în condiţii de asepsie, respectând cât mai mult posibil condiţiile de păstrare originale; - fiecare probă se individualizează prin înscrierea pe banda de marcare de pe recipient a denumirii acesteia; - este indicat să se recolteze cel puţin 100 g/probă; - instrumentele de lucru reprezentate de linguri, pensule, spatule, foarfece din oţel inoxidabil, etc., se sterilizează prin autoclavare (este periculoasă sterilizarea prin imersie în alcool sau la flacără); - pentru probele lichide se pot utiliza recipienţi ca: borcane de plastic, căni de metal etanşe, etc. (se evită folosirea recipienţilor de sticlă); probele solide se recoltează în cutii, saci, sticle de plastic sau pachete sterile; - probele sunt însoţite de un certificat în care se specifică ora şi data recoltării, precum şi a primirii acestora în laborator; - recoltarea eşantioanelor relativ mici dintr-o cantitate mare de alimente trebuie să fie cât mai uniformă; - trimiterea probelor la laborator se face în recipienţi sterili, intacţi; - probele refrigerate se transportă la laborator în gheaţă la 0-4 °C; nu trebuie analizate la mai mult de 36 de ore de la recoltare; - în cazul probelor lichide se va recolta şi o probă suplimentară pentru controlul temperaturii. recoltarea probelor de carne: • carnea în carcase şi semicarcase: se recoltează două cuburi de carne şi grăsime, unul de la suprafaţă şi altul din profunzime, cu latura de minimum 8-10 cm şi un os lung; • organele: se recoltează întregi sau porţiuni din acestea în pungi sau recipienţi sterili în cantitate de minim 200 g; • carnea preambalată, carnea de pasăre, specialităţi de pasăre: se recoltează 1 % din numărul pachetelor care alcătuiesc lotul, însă nu mai puţin de 5 pachete; • carnea de lucru (din întreprinderile producătoare): se recoltează o probă 20

de 500-1.000 g din fiecare lot dacă acestea sunt uniforme în privinţa caracterelor organoleptice; în caz contrar lotul se împarte în 3 subloturi: o cu caractere organoleptice normale; o cu uşoare modificări organoleptice; o cu caractere organoleptice evident modificate. Din fiecare sublot se recoltează o probă de 500-1.000 g. • carnea tocată: se recoltează 200-300 g din fiecare ambalaj în proporţie de 1% din numărul acestora (nu mai puţin de 2 şi nu mai mult de 5 ambalaje); • preparate din carne: batoanele sau calupurile recoltate se secţionează longitudinal realizându-se examenul organoleptic; cele două jumătăţi constituie proba şi contraproba; dintr-una din jumătăţi se recoltează (de la mijloc şi de la capete) 300800 g şi se trimit la laborator; astfel:

Recoltarea probelor de conserve: se face în funcţie de mărimea lotului, Mărimea lotului Până la 1.000 1.001-5.000 5.001-10.000 10.001-50.000 50.001-150.000

Numărul de recipienţi recoltaţi 2 5 10 20 30

• recoltarea semiconservelor: se recoltează pe loturi în funcţie de mărimea acestora, astfel: o până la 1.000 de recipiente se recoltează 2 recipiente; o între 1.001-2.000 recipiente se recoltează 4 recipiente; o între 2.001-3.000 recipiente se recoltează 6 recipiente; o între 3.001-5.000 recipiente se recoltează 8 recipiente. Recoltarea probelor de lapte: dacă recoltarea se face în fermă se va ţine cont şi de igiena adăpostului a mulgătorului şi a animalului; recoltarea se face în recipienţi sterili din fiecare sfert în parte eliminând primele jeturi; pentru depistarea mamitelor streptococice recoltarea se va realiza de la începutul mulsului; pentru tuberculoză de la sfârşitul mulsorii, iar pentru bruceloză de mijlocul mulsului; În cazul produselor în ambalaje sub un kilogram proba va fi constituită din ambalajul original, iar în cazul celor peste un kilogram se recoltează aseptic 250-500 ml de lapte. • recoltarea probelor de lapte praf: se efectuează cu o sondă sterilă, îndepărtându-se stratul superficial pe o adâncime de 5-10 cm; în cazul ambalajelor mici se recoltează 1% din lot, iar a celor mari 10% din lot realizându-se o probă medie de 250 g; 21

• recoltarea probelor de lapte concentrat: se realizează din 5% din numărul ambalajelor care formează lotul; acesta este format din maximum 2.000 l de lapte concentrat pentru ambalajele mari (bidoane, butoaie) şi maximum 3.000 l pentru cutii; recipienţii se sterilizează prin flambare şi se deschid cu un perforator steril; se recoltează 25 g din care se cântăresc aseptic 10 g; prima diluţie se face cu citrat de sodiu 1,25%; • recoltarea probelor de smântână: lotul este format din maximum 500 kg (în cazul ambalajelor de desfacere) şi maximum 3.000 kg (la ambalajele de transport); în cazul smântânii ambalate în bidoane se deschid 5% din numărul acestora şi se recoltează 250 g; în cazul ambalajelor de transport se recoltează 1% din unităţile de ambalaj; • recoltarea produselor lactate acide: din ambalajele mici se recoltează 1%, iar din cele mari 10% (circa 500 ml), în recipienţi sterili adecvaţi; • recoltarea probelor de unt: se face cu ajutorul unei sonde speciale atât de la suprafaţă cât şi din profunzime, recoltându-se câte 200 g din care se face o probă medie; • recoltarea probelor de îngheţată: se realizează pe loturi; lotul reprezintă o şarjă de fabricaţie din acest sortiment; examenul bacteriologic se realizează pe minimum 3 ambalaje; • recoltarea probelor de brânzeturi: se realizează cu cuţitul, sonda sau se pot recolta bucăţi întregi; brânza telemea ambalată în butoaie: se recoltează o bucată de la suprafaţă şi o bucată din profunzime, precum şi 200-300 ml de saramură; brânza proaspătă de vaci se recoltează prin deschiderea a 10% din ambalajele care formează lotul; dacă ambalajele sunt mari (bidoane, tăvi) se iau probe de la suprafaţă şi din profunzime şi se formează o probă medie din care se recoltează 200-300 g, care se trimit la laborator; dacă ambalajele sunt mici (pachete de 300 g) se recoltează 2% din numărul unităţilor de ambalaj; Probele de peşte: se recoltează de la mijlocul şi din partea inferioară a ambalajului cel puţin câte 2 peşti sau două bucăţi de peşte; în cazul peştilor peste 1 kg, se recoltează o fâşie transversală de carne (200-500 g), care se ambalează în hârtie cerată, se etichetează şi se sigilează păstrându-se în loc uscat, întunecos şi rece (maximum 8°C); probele se supun analizei în maxim 12 ore de la recoltare; peştele afumat (lot maxim 500 kg) se prelucrează în acelaşi mod. 1.2. Ambalarea şi expedierea probelor Ambalarea se realizează corespunzător fiecărui tip de probă, se sigilează şi se individualizează prin etichetare, trimiţându-se în cel mai rapid timp la laborator. 1.3. Primirea şi prelucrarea probelor în laborator - probele se înregistrează, se verifică şi se stabileşte conduita de lucru; 22

- se controlează recipienţii de recoltare, cum ar fi sacii sau sticlele de plastic, care trebuie să fie intacte; - se etichetează corect fiecare probă şi se individualizează; - este de dorit ca examinarea să se realizeze imediat după primirea probelor; dacă acest lucru nu este posibil probele se păstrează la frigider (probe perisabile, necongelate) sau la congelator (-20°C) în cazul probelor congelate. 1.4. Examenul de laborator Se realizează prin îmbogăţirea, izolarea şi identificarea agentului microbian presupus prin metode cât mai simple, precise şi rapide. Rezultatele obţinute se consemnează în registrele de diagnostic ale laboratorului pe baza cărora se întocmeşte buletinul de analiză. 1.5. Determinarea numărului total de germeni (NTG) NTG reprezintă un indicator microbiologic sanitar, care poate furniza informaţii asupra stării de contaminare a produsului sau obiectului analizat. 1. Metoda culturilor în plăci Petri pentru determinarea unităţilor formatoare de colonii (UFC). Din materialul examinat se fac diluţii zecimale astfel: • la o cantitate de 50 g de probă se adaugă 450 ml de tampon fosfat Butterfield şi se amestecă bine într-un blender 2 minute; astfel se obţine diluţia 10-1; • se folosesc pipete sterile, care se schimbă la fiecare diluţie, transferând 10 ml din diluţia 10-1 în diluţia 10-2 şi aşa mai departe până la ultima diluţie în 90 ml de diluant; numărul diluţiilor se stabileşte în funcţia de condiţia microbiologică urmărită; • din diluţiile executate se fac însămânţări în plăci Petri introducând câte 1 ml din fiecare diluţie într-o placă; rezultate mai exacte se obţin dacă se însămânţează câte 2 plăci pentru fiecare diluţie; • în fiecare placă se toarnă apoi peste suspensie 20 ml de agar topit şi răcit la 44-46°C; • se omogenizează bine astfel încât bacteriile să fie repartizate uniform în mediul de agar, în vederea obţinerii coloniilor izolate; se consideră că o colonie izolată reprezintă rezultatul multiplicării unei singure celule bacteriene; • plăcile însămânţate se pun la termostat la 35°C, iar după 48 ± 2 ore se numără coloniile rezultate din fiecare diluţie; se numără plăcile cu un conţinut între 25 şi 225 de colonii; • pentru a afla numărul de germeni se înmulţeşte numărul coloniilor existente într-o placă cu diluţia respectivă; pentru obţinerea unor rezultate mai precise se numără 23

coloniile din mai multe plăci, se înmulţeşte fiecare cifră aflată cu diluţia respectivă, iar apoi se face media aritmetică; rezultatul se exprimă prin UFC, care corespunde cu numărul coloniilor găsit pe unitatea de volum sau greutate din materialul examinat. ALTE METODE ACCEPTATE - metoda plăcilor spiralate; - metoda gelului de pectină; - metoda filmelor rehidratabile uscate. Metode indirecte pentru determinarea NTG 1. Metoda cu albastru de metilen. Principiul metodei: Se adaugă o cantitate mică de albastru de metilen la proba de lapte. Datorită acţiunii oxidoreducătoare a microorganismelor se va produce decolorarea laptelui. În funcţie de intervalul de timp în care s-a produs decolorarea se apreciază indirect NTG din lapte. Materiale necesare. • eprubete cu diametrul de 2 centrimetri; • baie de apă electrică sau termostat; • soluţie de albastru de metilen. Tehnica de lucru: Într-o eprubetă sterilă se adaugă 1 mililitru soluţie de albastru de metilen. Se adaugă 10 ml lapte din proba de analizat (încălzită în prealabil la 3840ºC). Se omogenizează bine. Se introduce eprubeta în baie de apă sau în termostat la o temperatură de 38ºC. Se urmăreşte decolorarea: după 20 minute; după 2 ore şi după 5 ore şi jumătate. Determinarea se consideră încheiată, când întreaga probă de lapte s-a decolorat. În funcţie de intervalul de timp, în care are loc decolorarea, laptele se poate împărţi în patru clase de calitate: 2. Metoda cu resazurină Principiul metodei: Resazurina este o oxazonă, care introdusă în lapte determină o coloraţie albastră. Sub acţiunea microorganismelor este redusă în rezorufină de culoare roz-roşiatică şi apoi în dehidrorezorufină, care este incoloră. Materiale necesare: • eprubete sterile cu dop de cauciuc; • pipete sterile de 1 ml şi de 10 ml; • resozurină, soluţie apoasă 0,05% (proaspăt pregătită cu apă sterilă); • baie electrică sau termostat reglabil la 37ºC. Tehnica de lucru: Se depune 1 ml de soluţie de resazurină într-o eprubetă sterilă. Se adaugă 10 ml de lapte, din proba de analizat. Se închide eprubeta cu un dop de 24

cauciuc, se omogenizează şi se introduce în baie de apă sau în termostat la 37ºC. După o oră, proba se omogenizează din nou şi se apreciază nuanţa de culoare, în funcţie de care laptele se încadrează, în 4 grupe. 3. Proba catalazei. Cantitatea de catalază din lapte variază în funcţie de încărcătura microbiană a acestuia şi de conţinutul în leucocite. Prin dozarea catalazei se poate aprecia atât starea de sănătate a glandei mamare, cât şi condiţiile de igienă în care a fost recoltat, manipulat şi păstrat laptele. Principiul metodei: Se bazează pe proprietatea catalazei de a descompune apa oxigenată, eliberând oxigenul sub forma bulelor de gaz. Materiale necesare: • apă oxigenată, soluţie 3%; • catalazometru (dispozitiv Lobek). 1. Laptele cu un conţinut normal de germeni pune în libertate oxigen, care este capabil să disloce mai puţin de 1 ml apă. 2. Laptele cu un conţinut mai mare de germeni (suspect) - eliberează oxigen, care dislocă 1- 3 ml apă. 3. Laptele cu germeni peste limita admisă (necorespunzător) - eliberează oxigen care dislocă mai mul de 3 ml de apă.

25

DEtErMInarEa nUMĂRULUI TOTAL DE GERMENI (NTG)

(schemă adaptată după W. Andrews, 1992)

1. Se amestecă proba alimentară într-un blender rotativ de înaltă viteză.

450 g diluant tampon fosfat Butterfield

1:10 (10-1)

50 g aliment se amestecă la 10.000-12.000 RPM pentru 2 minute 10 ml 10 ml

10 ml

10 ml

10 ml

10 ml

2. Se diluează omologatul de probă alimentară.

1:100

1:1000

1:10000

1:100000

1:1000000

(10-2)

(10-3)

(10-4)

(10-5)

(10-6)

3. Se transferă din fiecare diluţie, 1 ml, în câte 2 plăci Petri sterile. 4. Se toarnă 20 ml agar în plăcile de numărare.

5. Se incubează la 35 grade Celsius pentru 48 de ore 6. Se numără plăcile ce conţin între 25 şi 250 de colonii şi se înmulţeşte numărul coloniilor dintr-o placă cu reciproca diluţiei; NTG se exprimă prin numărul de microorganisme/g aliment

26

CAPITOLUL 2 DETERMINAREA TITRULUI COLI ŞI A BACTERIILOR COLIFORME Enterobacteriaceele sunt prezente în intestinul animalelor şi al omului, iar fecalele conţin peste 1010 per gram enterobacterii, de unde ajung în mediul ambiant (sol, apă, plante, animale). Sunt cunoscute ca fiind agenţii etiologici ai sindromului diareic infecţios. Grupul coliformilor se limitează la bacterii care cresc în tractul gastrointestinal al omului şi al animalelor şi include 5 genuri: Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Raoultella - adăugat de curând, formând o parte din genul Klebsiella. Aceste bacterii prezintă o mare importanţă pentru microbiologia alimentară deoarece reprezintă unul din cei mai utilizaţi indicatori microbiologici sanitari care reflectă condiţiile de igienă la prelucrarea şi manipularea produselor, iar în multe situaţii reflectă modul de respectare al diferitelor tratamente termice (de exemplu, pasteurizare) aplicate diverselor produse. Separarea bacteriilor coliforme în cele de origine fecală şi nefecală se face prin folosirea temperaturilor ridicate. Prin definiţie grupul coliformilor fecali conţine bacili sau cocobacili Gram negativi, nesporogeni, aerobi şi facultativ anaerobi, mobili prin flageli peritrichi sau imobili care fermentează lactoza cu producere de gaz şi produc colonii închise la culoare ce au suprafaţa cu luciu metalic şi reflex auriu-verzui în decurs de 48 de ore la 45,5°C. Din genul Enterobacter, speciile mai importante pentru microbiologia alimentară sunt: E. (Pantoea) agglomerans, care a fost transferat în genul Pantoea şi E. sakazakii. Citrobacter produce colonii tipice pigmentate în galben, fermentează lent lactoza şi utilizează citratul ca unică sursă de carbon. Specia prevalentă din alimente este C. freundii, care se găseşte de obicei în legume şi carnea proaspătă. Klebsiella cuprinde mai multe specii trecute de curând în genul Raoultella: K. (Raoultella) terrigena, R. planticola, R. ornitinolytica, ce se izolează din sol, apă, plante dar şi de la nivelul tubului digestiv. Contaminează frecvent alimentele, de obicei în asociaţie cu alte microorganisme, determinând alterarea acestora. Escherichia, încadrează specia E. coli, care este larg răspândită în natură şi reprezintă microflora dominantă a intestinului gros, de unde prin intermediul fecalelor se elimină în mediul exterior contaminând solul, apa, furajele, alimentele, etc. Tulpinile capabile de a provoca îmbolnăviri la om se situează într-una din cele 4 categorii de E. coli enteropatogen: 1. Tulpini enteropatogene (EPEC); 2. Tulpini enterotoxigene (ETEC); 3. Tulpini enterohemoragice (EHEC); 4. Tulpini enteroinvazive (EIEC). 27

Tehnica de lucru: Determinarea prezenţei şi a numărului de bacterii coliforme se poate efectua atât în medii lichide cât şi pe medii solide, de izolare selectivă (fără îmbogăţire). 1. Se cântăresc 50 g de probă într-un blender de înaltă viteză. Se adaugă 450 ml de fosfat tampon Butterfield şi se omogenizează 2 minute la 10.000-12.000 rot/ min. Astfel se obţine diluţia 10-1. 2. Toate diluţiile zecimale se pregătesc cu 90 ml diluant + 10 ml din diluţia anterioară. Diluţiile pregătite depind de densitatea anticipată a coliformilor. Se omogenizează bine fiecare diluţie. 3. Pentru testul prezumptiv se transferă câte 1 ml din fiecare diluţie în câte 3 tuburi per diluţie cu bulion LT (lauril-triptoză). Pipeta se ţine în aşa fel încât marginea sa inferioară să fie sprijinită de tub. 4. Se incubează tuburile 24-48 de ore, la 35°C. Se examinează la 24 de ore pentru producţia de gaz în tubul Durham. 5. Se reincubează tuburile negative încă 24 de ore şi se examinează pentru a doua oară pentru producţia de gaz. 6. Se efectuează testul de confirmare pe toate tuburile prezumptiv pozitive (producătoare de gaz). Se consideră că bacteriile coliforme sunt prezente dacă se observă atât dezvoltarea bacteriană cât şi apariţia gazelor în tubul de fermentare, iar în urma coloraţiei Gram, la examinarea frotiului apar exclusiv bacili sau cocobacili Gram negativi. În acest caz, în funcţie de diluţiile pozitive se raportează prezenţa sau absenţa coliformilor la o anumită cantitate de produs. De exemplu: s-au confirmat bacterii coliforme în diluţiile 10-1­­, 10-2. Aceasta denotă că bacteriile coliforme sunt prezente în 0,01 g probă, dar sunt absente în 0,001 g de probă. 2.1. Testul de confirmare pentru coliformii totali 1. Se agită uşor fiecare tub cu mediul LT (lauril-triptoză), care eliberează gaze şi se transferă o ansă din suspensie într-un tub cu mediu BGB (bulion cu bilă verdebriliant 2%). 2. Se incubează tubul BGB 48 de ore la 35°C. 3. Se examinează pentru producţia de gaz şi se înregistrează. 4. Se consideră reacţie pozitivă atunci când prezenţa gazelor apare în cel puţin 1/10 din înălţimea tubului Durham. 5. Se calculează numărul cel mai probabil de germeni (MPN = most probable number) pe baza combinaţiei unor tuburi LT (M47), cu eliberare de gaze confirmate de-a lungul a trei diluţii consecutive. În funcţie de numărul de eprubete pozitive, din fiecare diluţie se raportează MPN per gram (ml) produs, conform tabelului Mc Crady. De exemplu: dacă s-au confirmat bacterii coliforme în 3 eprubete cu diluţia 10-1­­, în două eprubete cu diluţia 10-2, şi în două eprubete cu diluţia 10-3­, se va obţine combinaţia de 3 cifre 322, în dreptul căreia se va citi din tabelul Mc Crady MPN-ul. 28

2.2. Testul de confirmare pentru coliformii fecali 1. Se agită uşor fiecare tub LT care eliberează gaze şi se transferă o ansă din fiecare suspensie în tubul cu mediu EC. 2. Tubul cu mediul EC se incubează 48 de ore la 45,5°C. Examinarea producţiei de gaz se face după 24 de ore, iar dacă testul este negativ se examinează din nou după 48 de ore. 3. Se calculează MPN pentru de coliformii fecali pe baza proporţiei tuburilor confirmate producătoare de gaz pe mediul EC, pentru 3 diluţii consecutive. 2.3. Testul de confirmare pentru Escherichia coli Se aplică o ansă de suspensie din fiecare tub eliberator de gaz, cu mediul EC pe agar L-EMB (Levine eozină albastru de metilen) (M 49). Se incubează plăcile timp de 18-24 de ore la 35°C. Se examinează coloniile, iar cele tipice pentru E. coli au centrul întunecat şi suprafaţa cu sau fără luciu metalic. Se transferă 2 colonii tipice din fiecare placă cu agar L-EMB pe pante PCA (plate count agar) (M 8) pentru testele morfologice şi biochimice. Se incubează mediul însămânţat 18-24 de ore la 35°C. Se recoltează 2 colonii din fiecare placă. Se efectuează coloraţia Gram din fiecare cultură. Pentru toate culturile Gram negative cu bacili scurţi sau cocobacili se urmăreşte în continuare: producţia de indol; testul Voges-Proskauer; testul roşului metil, producţia de gaz din lactoză. Interpretarea reacţiei: toate culturile care fermentează lactoza cu producţie de gaz în 48 de ore la 35°C; sunt bacili sau cocobacili Gram negativi asporogeni; şi dau tipuri de IMViC de ++-- (biotipul 1) sau -+-- biotipul 2 sunt considerate a fi E. coli. Se calculează MPN pe baza proporţiei de tuburi cu mediu EC în 3 diluţii succesive care s-au dovedit a fi E. coli. 2.4. Metoda MUG pentru numărarea rapidă a lui E. coli din alimente refrigerate sau congelate Acest test se bazează pe determinarea glucuronidazei, enzimă posedată de majoritatea tulpinilor de E. coli spre deosebire de celelalte bacterii intestinale. Substratul MUG (4-metilumbeliferil beta D-glucuronidază) se încorporează în bulionul LT. Tuburile inoculate se incubează în condiţii specifice şi se examinează în lumina UV pentru prezenţa ca produs final a unei glucuronidaze fluorogene. Fluorescenţa în mediul LT-MUG (M 48) termolabil indică prezenţa lui E. coli. 29

2.5. Testul prezumptiv LT-MUG pentru E. coli 1. Se prepară probele alimentare după cum s-a descris la metoda convenţională. 2. Se prepară diluţii zecimale ca la metoda convenţională. 3. Se inoculează 1 ml în trei tuburi LT-MUG pentru fiecare diluţie. 4. Se incubează tuburile 24 de ore la 35°C şi se examinează: creşterea, producţia de gaz şi fluorescenţa. Fluorescenţa se examinează la o lampă cu UV la întuneric. Dacă aceasta este albăstruie testul este pozitiv. 2.6. Testul de confirmare a LT-MUG 1. Din fiecare tub fluorescent, se însămânţează prin striere o ansă pe agar LEMB şi se incubează 24 de ore la 35°C. 2. Interpretare: toate culturile care devin fluorescente în mediul LT-MUG; fermentează lactoza cu producţie de gaz în 48 de ore la 35°C; apar ca bacili sau cocobacili Gram negativi asporogeni; dau tipurile ++-- (biotipul 1) sau -+-- (biotipul 2), sunt considerate a fi E. coli. SPECIA

I

M

V

C

E. coli

+

+

-

-

E. aerogenes

-

-

+

+

Citrobacter sp.

+/-

+

-

+

K. pneumoniae

+/-

-

+

+

Lactoză

Sorbitol

I

VP

Roşumetil

Pigment galben

Decarboxilază

E. albertii

-

-

-

-

+

-

+

E. blattae

-

-

-

-

+

-

+

E. fergusonii

-

-

+

-

+

-

+

E. vulneris

-/+a

-

-

-

+

-/+

+

E. hermannii

-/+

-

+

-

+

+

-

+

+

+

-

+

-

+

Specia

E. coli

30

DEtErMInarEa COlIFOrMIlOr tOtalI

1. Se amestecă proba alimentară într-un blender rotativ de înaltă viteză.

450 g diluant tampon fosfat Butterfield 50 g aliment se amestecă la 10.000-12.000 RPM pentru 2 minute 90 ml diluant

2. Se diluează omologatul de probă alimentară.

3. test prezumptiv. Se incubează la 35°C pentru 24-48 de ore

Bulion lauril-triptoză

4. test de confirmare. Se incubează la 35°C 48 de ore

(schemă adaptată după W. Andrews, 1992) Bulion BGB 2%

5. Interpretare: Se numără tuburile gaz-pozitive şi se calculează MPN din tabele.

31

DEtErMInarEa lUI E. COLI - tEStUl MUg 1. Se amestecă proba alimentară într-un blender rotativ de înaltă viteză.

450 g diluant tampon fosfat Butterfield 50 g aliment se amestecă la 10.000-12.000 RPM pentru 2 minute 90 ml diluant

2. Se diluează omologatul de probă alimentară.

3. test prezumptiv. Se incubează la 35°C pentru 24 de ore

Bulion lauril-triptoză - MUG fluorescent nefluorescent

4. Însămânţarea tuburilor fluorescente.

Tuburile EC gaz pozitive pentru coliformii fecali

Agar Levine-EMB

5. Reacţia IMViC E. coli: I +/-; M +; VP -; C -.

32

(schemă adaptată după W. Andrews, 1992)

DEtErMInarEa COlIFOrMIlOr FECalI ŞI a lUI E. COLI – MEtODa COnvEnŢIONALĂ – 1. Se amestecă proba alimentară într-un blender rotativ de înaltă viteză.

450 g diluant tampon fosfat Butterfield 50 g aliment se amestecă la 10.000-12.000 RPM pentru 2 minute 90 ml diluant

2. Se diluează omologatul de probă alimentară.

3. test prezumptiv. Se incubează la 35°C pentru 24-48 de ore

Se transferă bulioanele LT gaz pozitive pe mediul EC Bulion lauril-triptoză

4. test de confirmare.

Tuburile EC gaz pozitive pentru coliformii fecali

Se incubează la 35°C 48 de ore Mediu

5. Însămânţare în plăci Petri pentru obţinerea de colonii izolate 6. Reacţia IMViC E. coli: I +/-; M +; VP -; C -.

33

(schemă adaptată după W. Andrews, 1992)

CAPITOLUL 3 IZOLAREA ŞI IDENTIFICAREA SALMONELELOR DIN ALIMENTE DETERMINAREA BACTERIILOR DIN GENUL SALMONELLA 3.1. Consideraţii generale Bacteriile din genul Salmonella au o răspândire universală, putând afecta întregul regn animal, inclusiv omul. Toxiinfecţiile alimentare produse de salmonele, din punct de vedere al frecvenţei şi al implicaţiilor igienico-sanitare ocupă primul loc în majoritatea ţărilor. Acestea apar mai frecvent în anotimpurile calde (mai-octombrie), când există mai mulţi purtători umani şi animali, temperatura fiind factor favorabil pentru dezvoltarea şi multiplicarea germenilor. Majoritatea salmonelelor care produc toxiinfecţii alimentare la om, nu produc semne clinice la animale. Principalele rezervoare pentru infecţia umană sunt reprezentate de păsări, bovine, ovine şi porcine. La animale infecţia este întreţinută de reciclarea deşeurilor din abatoare ca hrană pentru animale, transmiterea fecal-orală şi contaminarea fecală a ouălor. Transmiterea la om are loc o dată cu introducerea carcaselor de carne, lapte nepasteurizat sau ouă infectate în bucătării. Acestea se multiplică în alimente datorită condiţiilor de igienă necorespunzătoare, cum ar fi: modul de preparare, contaminarea încrucişată a alimentelor deja preparate şi depozitarea inadecvată. Există mai multe tipuri de epidemii produse de către salmonele la om: • „tipul sursă punctiformă”, în care majoritatea cazurilor primare apar într-o perioadă de 12-72 ore de la consumul alimentului contaminat; • „tipul sursă comună continuă sau larg răspândită”, în care alimentul (medicamentul) contaminat este distribuit pe scară largă (epidemii răspândite în Marea Britanie prin salam şi păstăi de fasole, consum de ouă şi carne de pui insuficient preparate). • epidemii cu transmitere interumană; se întâlnesc cel mai frecvent în instituţii în care există dificultăţi în menţinerea igienei (spitale psihogeriatrice). • epidemii care întrunesc caracteristicile tuturor celor trei tipuri descrise mai sus, întâlnite în spitale. Salmonelele sunt bacili sau cocobacili mici, Gram negativi, mobili (cu excepţia lui S. pullorum-gallinarum) nesporogeni şi necapsulogeni, indistincţi microscopic sau pe mediile de cultură de E. coli. Există peste 2400 de serotipuri de Salmonella, grupele majore fiind reprezentate de: - grupul I – S. enterica subsp. enterica; 34

- grupul II – S. enterica subsp. salamae; - grupul III – S. enterica subsp. arizonae; - grupul III b – S. enterica subsp. diarizonae; - grupul IV – S. enterica subsp. houtenae; - grupul V – S. enterica subsp. indica. Grupul V a căpătat statutul de specie, ca S. bongori. Aceste schimbări au avut loc pe baza hibridizărilor ADN-ARN şi a electroforezei enzimatice multiloculare. Serovarurile se pot scrie cu literă mare. De exemplu: S. enterica serovar Typhimurium poate fi notată S. Typhimurium. Din punct de vedere epidemiologic, salmonelele pot fi plasate într-una din următoarele trei grupe: 1. Serotipuri monopatogene pentru om: S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi C, care sunt agenţii febrei tifoide şi paratifoide. 2. Serovaruri adaptate gazdei (patogeni umani ce pot fi contactaţi din alimente). S. Gallinarum (carnea de pasăre), S. Dublin (carnea de vită), S. Abortus-equi (cal), S. Abortus-ovis (oaie), S. cholerae-suis (carnea de porc). 3. Serovaruri inadaptate (fără gazdă preferenţială); patogeni pentru oameni şi animale şi includ majoritatea serovarurilor care produc toxiinfecţiile alimentare. 3.2. Metoda de lucru Controlul curent al alimentelor pentru detectarea salmonelelor se face conform metodelor stabilite de standarde, din care menţionăm pe cea descrisă în ISO 6579/1995. 1. Preîmbogăţire neselectivă: se cântăresc 25 grame de produs alimentar în 225 ml apă peptonată tamponată; 2. Se incubează la 35°C, 24 de ore; 3. Îmbogăţire selectivă: a) se transferă 0,1 ml cultură obţinută în faza de preîmbogăţire într-o eprubetă care conţine 10 ml de bulion tetrationat (M72); b) se transferă 1 ml cultură din mediul de preîmbogăţire selectivă într-o eprubetă cu 10 ml de bulion selenit cistină (SC). Numai în cazul amestecului de probe incubate care conţin moluşte, se transferă 0,1 ml la 10 ml de mediu Rappaport-Vassiliadis (RV) (M59) şi un alt mililitru la 10 ml de bulion TT. 4. Se incubează bulioanele la 35°C, 24 de ore. 5. Izolarea pe medii selective agarizate: a) Se striază cu ajutorul unei anse pe suprafaţa unei plăci Petri mari (140 mm), care conţine primul mediu selectiv de izolare în trei plăci cu agar BS (agar cu sulfit de bismut HE (agar Hektöen enteric) (M43) şi XLD (agar cu xiloză-lizină-dezoxicolat) (M69). Plăcile cu sulfit de bismut se prepară cu o zi înainte şi se păstrează până la însămânţare la întuneric şi la temperatura camerei. 35

Se repetă însămânţarea cu 3 ml de bulion din cultura obţinută în mediul RappaportVasiliadis pe agar cu roşu fenol şi verde briliant Edel şi Kampelmaker, pentru probele de moluşte. b) Se procedează la fel şi cu cel de-al doilea mediu de izolare selectivă SC (bulion selenit cistină) în vederea obţinerii de colonii izolate. Mediul BS este înalt selectiv, iar HE şi XLD sunt moderat selective. 6. Se incubează plăcile la 35°C, 24-48 ore. 7. Se examinează plăcile pentru prezenţa unor colonii suspecte de a face parte din genul Salmonella. a) Agar Hektöen enteric (HE) (M43) – coloniile tipice sunt albastre verzui sau bleu cu sau fără centru negru; multe culturi de Salmonella pot produce colonii cu centre mari, negre, lucioase sau pot să apară sub forma unor colonii aproape complet negre; în mod atipic, câteva specii de Salmonella produc colonii galbene, cu sau fără centre negre. b) Agar cu sulfit de bismut (BS) (M23) – coloniile tipice de Salmonella pot fi maro, gri sau negre; uneori prezintă luciu metalic; mediul din jurul coloniilor este, de obicei, la început cafeniu, dar poate deveni negru, o dată cu prelungirea incubaţiei, producând aşa numitul „efect de halou”. Unele tulpini pot produce colonii verzi, mediul înconjurător fiind slab negricios. c) Agar cu xiloză-lizină-dezoxicolat (XLD) (M69) – coloniile tipice sunt roz, cu sau fără centre negre; multe culturi de Salmonella pot avea centre mari, negre, lucioase sau colonii aproape complet negre; atipic, câteva specii de Salmonella pot produce colonii galbene, cu sau fără centre negre. 8. Confirmare: Selectarea coloniilor: se recoltează din fiecare placă cu mediu selectiv de izolare 5 colonii caracteristice şi se însămânţează pe agar TSI (M73) şi agar LI (lizină fier) (M74); se incubează mediile la 35°C, 24 de ore, în cazul agarului TSI şi 48 de ore la 35°C (LI agar). Agar TSI: Se însămânţează suprafaţa înclinată a agarului prin striere şi porţiunea dreaptă (baza) prin înţepare; se incubează; se interpretează: a) Masa mediului (porţiunea dreaptă):  galbenă = denotă fermentarea glucozei (G+);  roşie = nu are loc fermentarea glucozei (G-);  neagră = la limita între porţiunea dreaptă şi cea înclinată (H2S + → formare de hidrogen sulfurat);  bule sau fisuri = formare de gaz din glucoză. b) Suprafaţa înclinată (panta):  galbenă = fermentează lactoza şi zaharoza;  roşie = lactoză şi zaharoză negative; 36

Culturile tipice de Salmonella fermentează glucoza şi nu fermentează lactoza şi zaharoza: • panta (porţiunea înclinată) de culoare roşie (alcalină); • baza (porţiunea dreaptă) – galbenă (acidă); • cu formare de bule de gaz (spargerea mediului); • formare de hidrogen sulfurat – înnegrire (90% din cazuri). În agarul LI, Salmonella produce o reacţie alcalină, coloraţie purpurie (violet) în porţiunea dreaptă a mediului. Se consideră reacţie negativă (acidă) numai culoarea galben distinctă în porţiunea dreaptă a mediului. Majoritatea salmonelelor produc H2S în agar LI. Alte teste biochimice: 1. Testul ureazei: Se inoculează câteva colonii prezumptiv pozitive de pe fiecare pantă de agar în tuburi cu bulion cu uree (M75). Se incubează 24 de ore la 35°C. Reacţie pozitivă: în urma însămânţării unei bacterii care hidrolizează ureea mediul iniţial galben se colorează în roşu, datorită virării roşului fenol în prezenţa amoniacului, metabolit rezultat din descompunerea ureei. 2. Mediul cu cianură de potasiu (KCN) (M58): Dacă are loc creşterea bacteriilor (indicată prin turbiditate) reacţia este pozitivă. Majoritatea speciilor de Salmonella sunt negative la acest test. 3. Bulion cu malonat: Se inoculează 3 mililitri de cultură bacteriană de 24 de ore prezumptiv pozitivă în bulion malonat (M76). Se incubează 48 de ore la 35°C, dar se examinează şi după 24 de ore. Dacă testul este pozitiv mediul devine albastru, iar dacă este negativ culoarea bulionului va rămâne nemodificată. 4. Testul indolului – reacţie negativă-inel galben. 5. Reacţia Voges-Proskauer (M68)– reacţia pozitivă este indicată de apariţia unei culori roz, până la roşu în toată coloana mediului. Salmonelele dau reacţii negative la acest test. 6. Testul roşului metil – majoritatea salmonelelor dau test pozitiv, indicat de culoarea roşie, difuză a mediului. Se consideră ca nefiind Salmonella, culturile care dau rezultate pozitive la KCN şi VP şi rezultate negative la testul roşului metil. 7. Agar cu citrat Simmons (M64): Test pozitiv: prezenţa creşterii este însoţită de modificarea culorii mediului din verde în albastru; majoritatea culturilor de Salmonella sunt citrat-pozitive. Confirmarea serologică: Punerea în evidenţă a antigenelor O, H şi Vi ale salmonelelor se face prin reacţia de aglutinare pe lamă cu serul corespunzător al coloniilor pure, după eliminarea surselor autoaglutinabile. Eliminarea surselor autoaglutinabile: Se aplică pe o lamă de sticlă bine spălată soluţie salină în care se dispersează o 37

parte din coloana ce urmează a fi testată obţinând o suspensie omogenă şi tulbure. Se oscilează lama în plan orizontal 30-60 secunde; se examinează pe un fond întunecat; dacă bacteriile aglutinează (se adună în grămezi) înseamnă că sursa este autoaglutinabilă şi nu se mai supune încercărilor ulterioare. Punerea în evidenţă a antigenelor „O”: Se foloseşte o colonie pură neautoaglutinabilă şi se procedează ca mai sus, numai că soluţia salină se înlocuieşte cu o picătură de antiser „O”. Test pozitiv: aglutinare în amestecul testat; absenţa aglutinării în martorul salin. Reacţia negativă nu exclude prezenţa unei specii a acestui gen, deoarece Ag „O” poate fi mascat de Ag „Vi” de la suprafaţa bacteriei (antigen de înveliş), în această situaţie fiind necesară aglutinarea rapidă cu ser anti „Vi”. Această reacţie se efectuează în prezenţa unor martori constituiţi din suspensiile de antigen, la care se adaugă ser fiziologic, ser normal şi ser cunoscut pozitiv. Aglutinarea cu seruri de grup „O” se foloseşte pentru stabilirea grupei serologice din care face parte tulpina supusă analizei. 3.3. Sistemele microtest Micrometodele (microtestele) reduc volumul substratului enzimatic şi permit deseori o citire rapidă între 4 şi 6 ore până la 18 ore de incubare. După izolarea pe medii selective coloniile suspecte se pot identifica biochimic prin intermediul sistemelor „microtest”, folosind scheme, tabele sau sisteme codificate de încadrare. Sistemele microtest sunt cunoscute sub diverse denumiri comerciale. Pentru identificarea salmonelelor din alimente se va folosi oricare din cele 4 sisteme biochimice comerciale (API 20E, Enterotub II, Enterobacteriaceae II, MICRO-ID). Pentru confirmare se recurge apoi la testul serologic somatic (O) şi testul flagelar (H) sau testul flagelar Spicer-Edwards. Se confirmă a fi Salmonella acea cultură clasificată cu kit-urile biochimice comerciale ca prezumptivă, când aceasta este pozitivă la testul somatic (O) şi testul flagelar (H).

38

IZOlarEa ŞI IDEntIFICarEa gEnUlUI SalMOnElla

(schemă adaptată după W. Andrews, 1992)

1. Omologat alimentar

225 ml mediu de preîmbogăţire 25 g aliment

2. Preîmbogăţire Incubare la 35°C, 24 de ore

10 ml bulion selenit cistină

3. Îmbogăţire selectivă. Incubare la 35°C, 24 de ore

10 ml bulion tetrationat

4. Însămânţare în plăci Petri. Incubare la 35°C, 24-48 de ore

5. Însămânţare pe mediul tSI şi lI. Incubare la 35°C, 24 de ore (agar TSI) sau 48 de ore (agar LI).

Agar TSI

Pantă alcalină (roşie) Bază acidă (galbenă) Agar lI

5. Confirmare biochimică şi serologică

39

Bază alcalină (purpurie) Cu sau fără înnegrire (producţia de H2S)

Salmonella enterica. Microscopie electronică. Se remarcă prezenţa flagelilor peritrichi

Salmonella Typhi - coloraţie flagelară CDC

Salmonella sp. - Agar XLD Cultură de 24 de ore. Zonele de culoare neagră reprezintă depozite de H2S, în condiţii alcaline

40

Salmonella choleraesuis subsp. arizonae (Salmonella Arizonae) Agar cu sânge

Salmonella – mediul Edel şi Kampelmacher (colonii izolate) Salmonella – mediul TSI (mediu politrop)

Salmonella Typhimurium Cultură pe agar Hektoen enteric (HE) Formează colonii albastre verzui

Salmonella spp. Agar CSE (Chromogenic Salmonella Esterase) După 24 de ore de incubare la 37°C sau la 42°C, coloniile de Salmonella sp. apar colorate în vişiniu, pe fond galben-transparent al mediului de cultură

Salmonella spp. Cultură pe agar SS (Salmonella-Shigella).

41

CAPITOLUL 4 IDENTIFICAREA GENULUI SHIGELLA 4.1. Caracterizare generală Shigeloza este o boală infecţioasă, care se răspândeşte cel mai frecvent de la o persoană la alta. Categoria de populaţie cea mai afectată este reprezentată de copiii mici ţinuţi în condiţii de igienă precară, aglomeraţie, etc. Boala se poate răspândi şi prin apă şi alimente contaminate. Alimentele se contaminează de obicei, prin contactul cu mâinile. Alimentele cel mai frecvent implicate în producerea infecţiei sunt reprezentate de: salată, carne de pui, carne tocată, sandvişuri, fructe şi legume, alimente marine. Doza infecţioasă este de numai 10 bacterii. Genul Shigella aparţine familiei Enterobacteriaceae, ca şi Salmonella şi Escherichia. Genul cuprinde 4 specii Shi. dysenteriae (grupa A), Shi. flexneri (grupa B), Shi. boydii (grupa C), Shi sonnei (grupa D). Cele 4 specii sunt plasate în grupe serologice, pe baza antigenelor somatice „O”. Sunt bacili sau cocobacili Gram negativi, imobili, acapsulogeni, asporogeni, oxidază negativi, produc acid din zaharuri, nu folosesc citraţii ca unică sursă de carbon, nu se dezvoltă în prezenţa cianurii de potasiu, nu produc hidrogen sulfurat. Tabel comparativ între Salmonella, Shigella şi Escherichia Genul Escherichia Salmonella Shigella

Glucoză AG AG A

Mobilitate + (de obicei) + (tipul 1) -

H2S + -

Indol + (tipul 1) -

Citrat + -

G+C mol % 48-52 50-53 49-53

Shigella dysenteriae este agentul patogen primar al dizenteriei bacilare clasice, iar celelalte 3 specii produc toxiinfecţii alimentare la om. Shigella este patogenă, în mod natural pentru om şi maimuţă. Are drept ţintă plăcile Peyer de la nivelul ileonului. Are loc un proces inflamator acut, cu dizenterie. Acest lucru este valabil în special pentru Shi. flexneri. Dintre toate speciile de Shigella, Shi sonnei cauzează diaree în majoritatea cazurilor. Toxina Shiga acţionează ca o citotoxină cu rol neurotoxic. Este implicată în producerea SUH (sindrom uro-hemoragic) şi de cele mai multe ori se asociază cu tulpinile EHEC de E. coli. 4.2. Izolarea şi identificarea shigelelor din alimente Îmbogăţirea la Shi. sonnei: Se cântăreşte aseptic o probă de 25 de grame în 225 ml de bulion Shigella cu 42

novobiocină 0,5 mg/ml. Amestecul se lasă 10 minute la temperatura camerei şi se agită permanent, după care se toarnă într-un balon Erlenmeyer steril de 500 ml. Balonul se incubează anaerob într-un sistem Gas Pak, în baie marină, la 44°C, timp de 20 de ore. Se omogenizează bine suspensia şi se striază în plăci cu agar Mac Conkey. Se incubează 20-48 de ore la 35°C. Îmbogăţirea altor specii de Shigella: Se procedează ca mai sus, dar se încorporează o cantitate de novobiocină de 3 mg/ml şi se incubează anaerob în baie marină la 42°C. Izolarea shigelelor: Se examinează plăcile cu agar Mac Conkey. Coloniile de Shigella apar roz palide şi translucide. Coloniile suspecte se însămânţează în bulion cu glucoză, agar TSI, bulion cu lizin-decarboxilază, agar pentru testarea mobilităţii şi triptonă. Se incubează la 35°C, 20-48 de ore, dar se examinează la 20 de ore. Se îndepărtează toate culturile care prezintă mobilitate, produc H2S, formează gaz, lizin-decarboxilază, fermentează sucroza sau lactoza şi produc indol. Identificarea biochimică: Shigelele pot fi caracterizate biochimic astfel:  teste negative pentru: hidrogen sulfurat, urează, glucoză (gaz), mobilitate, lizin-decarboxilază, ornitin decarboxilază (exceptând Shi. sonnei), sucroză, adonitol, lactoză (2 zile), salicină, inozitol, cianură de potasiu, malonat, citrat, VogesProskauer;  teste pozitive pentru: manitol (excepţie Shi. dysenteriae) şi reacţia roşului metil. Caracterizarea biochimică şi serologică a genului Shigella Substrat

Pozitiv

Negativ

Reacţia shigelelor

Glucoză (TSI)

Bază galbenă

Bază roşie

+

Glucoză (bulion cu brom-crezol purpur)

Culoare galbenă şi/sau gaz

Culoare neschimbată/ Fără gaz

+

Lactoză (TSI)

Pantă galbenă

Pantă roşie

-

Lactoză (bulion cu bromcrezol purpur)

Culoare galbenă şi/sau gaz

Culoare neschimbată/ Fără gaz

-

Sucroză (TSI)

Pantă galbenă

Pantă roşie

-

Sucroză (bulion cu bromcrezol purpur)

Culoare galbenă şi/sau gaz

Culoare neschimbată/ Fără gaz 43

-

Substrat

Pozitiv

Negativ

Reacţia shigelelor

Înnegrire

Fără înnegrire

-

Urează

Roşu purpuriu

Fără schimbarea culorii mediului

-

Substrat

Pozitiv

Negativ

Reacţia shigelelor

Culoare purpurie

Culoare galbenă

-

Culoare purpurie

Culoare galbenă

- (multe tulpini de Shi. sonnei sunt pozitive)

Inel roşu

Inel galben

-

Creştere difuză

Fără creştere difuză

-

Turbiditate

Fără turbiditate

-

Culoare bleu

Fără schimbarea culorii mediului

-

Turbiditate

Fără turbiditate

-

Culoare roşie difuză

Culoare galbenă difuză

+

Culoare roz-roşu

Fără schimbarea culorii mediului

-

Aglutinare

Fără aglutinare

+

Hidrogen sulfurat (TSI)

Bulion cu lizindecarboxilază Bulion cu ornitin decarboxilază Indol Mobilitate Cianură de potasiu Malonat Citrat Roşu metil Voges-Proskauer Testul somatic polivalent

Caracterizarea serologică: Se împarte placa Petri cu un creion de ceară în 9 dreptunghiuri (3 x 1 cm). În fiecare dreptunghi se pune câte o picătură dintr-o suspensie de cultură bacteriană de pe agar cu infuzie de viţel de 24 de ore în 3 ml de ser fiziologic. Se adaugă apoi o picătură de antiser polivalent şi ser fiziologic. Se amestecă conţinutul fiecărui dreptunghi cu un ac fin, având grijă să nu se producă un amestec între dreptunghiuri. Se balansează placa Petri 3-4 minute pentru a se accelera aglutinarea. Se citeşte gradul de aglutinare astfel:  0 = absenţa aglutinării, picătura rămâne densă şi omogenă;  1+ = aglutinare abia decelabilă;  2+ = aglutinare cu limpezirea picăturii 50%;  3+ = aglutinare cu limpezirea picăturii 75%;  4+ = aglutinare cu limpezire totală. Se reexaminează suspensia cu seruri monovalente din fiecare ser polivalent în care a avut loc o reacţie pozitivă netă (2+, 3+, 4+). În eventualitatea unei reacţii negative, se încălzeşte suspensia în autoclav, 30 de minute, pentru a hidroliza antigenul capsular 44

care interferează. Se reexaminează cu antiser polivalent şi dacă este pozitiv în serurile monovalente corespunzătoare. Dreptunghi

Suspensie

Antiserul polivalent A

1

+

2

+

3

+

4

+

5

+

6

+

7

+

8

+

9

+

A1

B

C

C1

Soluţia salină C2

D

A-D

+ + + + + + + + +

45

IDENTIFICAREA GENULUI SHIGELLA 1. amestecul probei alimentare cu mediul de îmbogăţire

225 ml bulion Shigella cu novobiocină 25 g aliment

2. Decantarea supernatantului într-un balon steril

3. Incubare anaerobă 20 de ore la 44°C (Shi. Sonnei) sau la 42°C (celelalte specii)

4. Însămânţare în placa Petri. Incubare la 35°C, 20-48 de ore

Agar Mac Conkey

5. Însămânţare pe mediul TSI şi alte teste biochimice

6. Confirmarea serologică

Pantă alcalină (roşie) Bază acidă (galbenă); fără H2S Agar TSI

46

(schemă adaptată după W. Andrews, 1992)

Shigella flexneri. Microscopie electronica

Shigella dysenteriae - coloraţia Gram

Shigella - EMB

Shigella - MacConkey

Shigella - ENDO

Shigella - agar SS

Shigella - Hektoen

47

CAPITOLUL 5 IZOLAREA ŞI IDENTIFICAREA STAFILOCOCILOR DIN ALIMENTE 5.1. Caractere generale Genul Staphylococcus face parte din familia Staphylococcaceae care cuprinde 5 genuri. Genul cuprinde 40 de specii dintre care, 16 sunt considerate ca fiind patogeni alimentari. Din punct de vedere morfologic stafilococii sunt coci Gram pozitivi, sferici sau ovali, ce se grupează caracteristic în grămezi asemănătoare unor ciorchini de strugure. Sunt necilogeni, nesporogeni şi necapsulogeni. Cele mai multe specii sunt catalază pozitive şi facultativ anaerobe. Se cultivă bine pe medii uzuale, însă pentru izolarea lor din alimente se utilizează medii selective hiperclorurate (7-10% NaCl):  mediul Chapman – pentru fermentarea manitolului;  mediul Bayrd-Parker;  mediul Vogel-Johnson – pentru activitatea coagulazică. Examinarea caracterelor morfologice şi culturale precum şi izolarea stafilococilor pe medii selective hiperclorurate sunt edificatoare pentru încadrarea bacteriilor în acest gen. Prin imunodifuzie au fost identificate 13 variante antigenice de enterotoxine notate cu A, B, C1, C2, C3, D, E, G, H, I, J, K, L. Enterotoxinele reprezintă una dintre cauzele cele mai frecvente ale toxiinfecţiilor alimentare. Speciile sensibile la acţiunea enterotoxinelor stafilococice (ES) sunt omul, maimuţa şi pisica. Acestea acţionează asupra centrilor nervoşi declanşând contracţii peristaltice şi antiperistaltice ale intestinului responsabile de producerea sindromului diareic şi al vomei. Specii şi subspecii de stafilococi care produc coagulază, nuclează şi enterotoxine Specia/Subspecia

Coagulază

Nuclează

Enterotoxine

Hemoliză

Manitol

Stp. aureus subsp. - anaerobius - aureus Stp. intermedius

+ + +

TS TS TS

+ +

+ + +

+ (+)

Stp. hyicus subsp. - hyicus - chromogenes

(+) -

TS -

+ +

-

V

+

-

+

+

+

Stp. delphini

48

Specia/Subspecia

Coagulază

Nuclează

Stp. schleiferi subsp. - coagulans - schleiferi Stp. caprae Stp. cohnii Stp. epidermidis Stp. haemolyticus Stp. lentus Stp. saprophyticus Stp. sciuri Stp. simulans Stp. warneri Stp. xylosus

+ TS TS TL TL V TL TS = termostabilă; TL = termolabilă; V = variabil; (+) = reacţie săptămânală.

Enterotoxine

Hemoliză

Manitol

+ + + + + + + + + + + +

+ + (+) V + V +

(+) V V + + + + + V

Stafilococii coagulază pozitivi formează colonii tipice pe suprafaţa mediilor selective de cultură, producerea de coagulază fiind luată drept un criteriu principal pentru aprecierea enterotoxicităţii. Specia tip a genului este Stp. aureus care produce la om gastroenterită. Aceasta este cauzată de ingestia de alimente cu enterotoxine. Gastroenteritele sunt produse numai de câteva specii şi tulpini de stafilococi producţia lor fiind asociată în general cu Stp. aureus care produce coagulază şi termonuclează. Alte specii de stafilococi recoltaţi din alimente au fost: Stp. condimenti (izolat din sosul de soia), Stp. piscifermentans (izolat din peşte fermentat în Thailanda), Stp. fleurettii (izolat din brânza de capră). Aceste specii nu produc coagulază, termonuclează şi enterotoxine. Numărul cel mai mare de stafilococi se găseşte în următoarele regiuni anatomice: axilară, inghinală, perineală precum şi la nivelul nărilor, unde numărul lor pe centimetru pătrat poate ajunge până la 103-106. Contaminarea alimentelor se poate face prin contactul acestora cu mâinile manipulatorului infectate cu abcese sau carbunculi sau de la nivelul nasului. De asemenea, laptele ce provine de la vacile cu mastite stafilococice consumat sau folosit la prepararea brânzei reprezintă o cauză importantă de producere a toxiinfecţiilor alimentare. Bryan a identificat 16 factori implicaţi în producerea toxiinfecţiilor alimentare dintre care amintim 5 ca fiind cei mai frecvenţi, şi anume:  refrigerarea inadecvată;  prepararea alimentelor cu mult timp înainte de consumul lor;  persoane infectate sau persoane cu igienă personală precară care manipulează alimentele;  prepararea alimentelor în condiţii inadecvate; 49

 păstrarea alimentelor la temperatura de multiplicare a acestor bacterii. 5.2. Metoda de numărare directă în plăci Petri a lui Stp. aureus Tehnica de lucru: Din produsul omogenizat şi din fiecare diluţie se însămânţează aseptic 1 ml de probă în trei plăci Petri cu agar Bayrd-Parker (M21). Inoculul se distribuie astfel: 0,4 ml în prima placă, 0,3 ml în cea de-a doua şi 0,3 ml în cea de-a treia. Plăcile se inversează şi incubează 45-48 de ore la 35°C. Se selecţionează plăcile Petri care conţin între 20 şi 200 colonii caracteristice. Coloniile formate de stafilococi sunt circulare, netede, convexe, umede, cu diametrul de 2-3 mm, de culoare gri până la negru, cu margini de culoare deschisă, aproape albă, înconjurată de o zonă opacă şi frecvent de o zonă exterioară clară. Au o consistenţă untoasă, până la cleioasă. Uneori se pot observa tulpini nelipolitice, cu un aspect similar cu excepţia faptului că zonele înconjurătoare opace şi clare sunt absente. Tulpinile izolate din alimentele congelate sau uscate păstrate pe perioade mai lungi, prezintă frecvent o coloraţie mai puţin neagră decât cele tipice, care pot avea un aspect rugos şi o textură uscată. Pentru stabilirea numărului prezumptiv de stafilococi pe un gram de produs se verifică 10 colonii, din plăcile cu până la 100 de colonii caracteristice şi 20 de colonii din plăcile cu mai mult de 100 de colonii caracteristice. Verificarea constă în examenul microscopic şi în reacţia coagulazei. Se însămânţează coloniile coagulază pozitive, pe un set de plăci triple şi se multiplică cu factorul de diluţie al probei. Această valoare se raportează la numărul de stafilococi aurii per gram din produsul testat. Testul coagulazei. Se transferă coloniile suspecte de a fi Stp. aureus în tuburi cu bulion BHI (M26), 0,2-0,3 ml şi se amestecă bine. Se însămânţează pe mediul TSA (M77) (sau alt mediu de întreţinere adecvat), conţinutul unei anse de suspensie BHI. Se incubează tuburile cu bulion BHI şi mediul TSA însămânţat, 18-24 de ore la 35°C. Se menţin culturile la temperatura camerei pentru folosirea unor teste auxiliare în cazul în care rezultatele sunt îndoielnice. Se adaugă la cultura de BHI 0,5 ml de plasmă citratată de om sau de iepure, (integrală sau diluată 1/5), cu EDTA şi amestecă bine. Eprubetele se incubează la 35°C (într-o baie de apă sau într-o etuvă), timp de 18-24 de ore şi se examinează din oră în oră timp de 6 ore pentru coagulare. Testul se consideră pozitiv numai în cazul în care se formează un coagul ferm şi complet care rămâne pe loc când tubul este inversat. Coagularea parţială (reacţiile 2+ şi 3+) trebuie testată în continuare. Concomitent cu culturile suspecte se testează şi culturile cunoscute ca pozitive şi negative. Formarea de coagul în eprubetele însămânţate cu coloniile de verificare şi în cea cu tulpina de referinţă şi lipsa de coagul în eprubeta martor negativ, se consideră reacţie pozitivă. 50

Se efectuează coloraţia Gram a tuturor culturilor suspecte şi se examinează microscopic. 5.3. Teste auxiliare 1. Testul catalazei. Catalaza este o hemoproteină care descompune peroxidul de hidrogen în apă şi oxigen. Bacteriile care o produc se protejează astfel de efectele letale ale peroxidului de hidrogen apărut ca metabolit final în metabolismul aerob al carbohidraţilor. Se poate realiza în mediul lichid sau pe mediu solid. - testul în bulion nutritiv: se adaugă la cultura de 18-24 de ore, în bulion 1 ml soluţie 3% H2O2. - testul pe agar nutritiv: se întinde 1 ml soluţie H2O2 3% peste cultura de 18-24 de ore a organismului testat cu tubul înclinat în mod adecvat. Rezultatul reacţiei: Se observă imediat şi după 5 minute apariţia bulelor de gaz. Viteza descompunerii H2O2 creşte o dată cu temperatura. Reacţiile fals pozitive pot fi datorate oxigenului dizolvat în reactiv. Inconvenientul poate fi evitat dacă se agită reactivul cu pipeta înainte de utilizare. 2. Utilizarea anaerobă a glucozei. Se însămânţează masiv fiecare tub cu mediu de fermentaţie a carbohidraţilor ce conţine glucoză 0,5%. Ca indicator se foloseşte albastrul de bromtimol. Se acoperă suprafaţa mediului cu un strat de 25 mm de ulei de parafină. Se incubează 5 zile la 37°C. Rezultatul reacţiei: Testul este pozitiv dacă indicatorul îşi modifică culoarea în galben şi negativ dacă mediul rămâne albastru. 3. Utilizarea anaerobă a manitolului. Se repetă procedura de mai sus folosind ca hidrat de carbon manitolul. 90% dintre tulpinile de Stp. aureus sunt pozitive la acest test. Concomitent se folosesc martori pozitivi şi negativi. 4. Sensibilitatea la lizostafin. Se transferă cu ansa de însămânţare o colonie izolată din placa cu agar într-un ml de fosfat tampon salin şi se omogenizează bine. Se adaugă 25 nanograme/ml de lizostafin. Se incubează la 35°C, maxim 2 ore, dacă are loc limpezirea mediului testul este considerat pozitiv. Majoritatea tulpinilor de Stp. aureus sunt pozitive la acest test. 5. Producerea nucleazei termostabile. Reprezintă o modalitate indirectă de diferenţiere a multiplicării speciei Stp. aureus în prelevat, la un nivel de peste 106 germeni per gram de aliment. Această reacţie poate fi considerată un test de confirmare în special pentru reacţiile de coagulază 2+. 51

Tehnica de lucru: Se prepară microlame pe care se toarnă agar cu acid deoxiribonucleic şi albastru de toluidină, în grosime de aproximativ 3 mm. După solidificarea agarului se fac 10-12 godeuri (scobituri), cu diametrul de 2 mm, cu ajutorul unui dispozitiv special, îndepărtând prin aspiraţie dopul de agar. Se adaugă pe lama astfel preparată aproximativ 0,01 ml de probă încălzită (15 minute într-o baie marină fierbinte) din culturile în bulion folosite pentru testul coagulazei. Lamele se incubează în camere umede 4 ore la 35°C. Rezultatul reacţiei: Reacţia pozitivă este semnalată de dezvoltarea unui halou roz-deschis, care se extinde la cel puţin 1 mm de la periferia godeului. 5.4. Determinarea numărului cel mai probabil de germeni Tehnica de lucru: Se inoculează 3 tuburi cu bulion tripticază soia, ce conţine 10% clorură de sodiu şi 1% piruvat de sodiu, cu cantităţi de 1 ml, de diluţii zecimale din fiecare probă. Diluţia maximă trebuie să fie negativă. Tuburile însămânţate se incubează 48 de ore la 35°C. Se transferă conţinutul unei anse din fiecare tub ce prezintă turbiditate pe mediul Bayrd-Parker, care trebuie să aibă suprafaţa foarte bine uscată. Plăcile se incubează 48 de ore la 35°C. Din fiecare placă se recoltează una sau mai multe colonii suspecte, se continuă procedura pentru identificare şi confirmarea lui Stp. aureus, ca mai sus. Stabilirea numărului cel mai probabil de stafilococi se face în concordanţă cu tabelul Mac Crady, în funcţie de numărul de eprubete şi diluţii confirmate ce conţin stafilococi coagulază pozitivi.

52

MEtODa DE nUMĂRARE DIRECTĂ ÎN PLĂCI PETRI a StaFIlOCOCIlOr aUrII

(schemă adaptată după W. Andrews, 1992)

1. Omogenizare

450 ml tampon fosfat Butterfield 1: 10

50 g aliment; se amestecă la 10.00012.000 rpm pt 2 min.

10 ml

10 ml

10 ml

Diluţii seriate în 90 ml tampon fosfat

2. Diluarea omogenatului de probă alimentară

1: 100

1: 1000

3. Pipetarea de 0,4; 0,3; 0,3 în plăci separate de agar BairdParker

4. Incubarea la 35°C, 45-48 de ore 5. Selectarea plăcilor ce conţin între 20-200 de colonii. 6. Numărarea coloniilor din fiecare tip morfologic suspicionate de a fi Stp. aureus; se testează > de o colonie din fiecare tip pentru coagulază; se adaugă un număr de colonii pe un set de 3 plăci Petri ce dau testul coagulazei pozitiv şi se multiplică factorul de diluţie; această valoare se exprimă ca fiind numărul de celule de Stp. aureus per gram

53

Teste biochimice de confirmare pentru Stp. aureus, Stp. epidermidis şi micrococi

Stp. aureus

Stp. epidermidis

Micrococi

Catalază

+

+

+

Coagulază

+

-

-

Termonuclează

+

-

-

Lizostafin

+

+

-

+ +

+ -

-

Test biochimic

Utilizarea anaerobă a:

glucozei manitolului

54

Stip. aureus. Frotiu efectuat din cultură de pe mediul solid. Coloraţia Gram. Se observă gruparea “stafilo” (grămezi cu aspect de ciorchine de strugure) a cocilor (Pietzckel T.)

Mediul MSA (Mannitol salt agar) Staphylococcus aureus - fermentarea manitolului (ingalbenirea mediului); Serratia marcescens - nu s-a dezvoltat datorita continutului mare de sare al mediului 55

Agar Columbia. Stp. aureus. Mediu nutritiv de bază mai complet decât agarul nutritiv simplu, devine un excelent mediu selectiv când este adiţionat şi cu substanţe inhibitorii; conţine trei tipuri de peptone, produse prin digestie şi prin infuzie, amidon clorură de sodiu şi agar

Mediul MSA (Mannitol salt agar) Streptococcus agalactiae - nu s-a dezvoltat datorita continutului mare de sare al mediului); Staphylococcus epidermidis - s-a dezvoltat dar nu a fermentat manitolul

Diferenţierea genurilor Staphylococcus şi Streptococcus poate fi confirmată biochimic prin testul catalazei; genul Staphylococcus este catalază pozitiv, iar genul Streptococcus catalază negativ; după plasarea unei mici cantităţi de cultură bacteriană pe suprafaţa unei lame de sticlă curată se adaugă o picătură de peroxid de hidrogen 3%, care în cazul testului pozitiv va produce o efervescenţă puternică (picătura de jos), iar în cazul testului negativ picătura rămâne neschimbată (picătura de sus)

Staphylococcus aureus pe agar nutritiv. Se remarcă colonii izolate de mărime mijlocie, pigmentate în auriu

Staphylococcus aureus – mediul Bayrd Parker Mediu selectiv diferenţial pentru izolarea stafilococilor din alimente. Clorura de litiu şi teluritul de potasiu inhibă creşterea contaminanţilor, în timp ce piruvatul şi glicina stimulează efectiv creşterea stafilococilor. 56

Mediul TSA (Tripticase salt agar) Streptococcus epidermidis - coagulaza negativ (stanga) Staphylococcus aureus - dreapta

CHROMagar Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus – mov Alte bacterii – albastre, incolore sau inhiate

Staphylococcus epidermidis – mov în Staphylococcus epidermidis – testul de hidroliza a interiorul tubului şi galben în exterior- amidonului - nu hidrolizeaza amidonul şi nu produce amilaza reacţie pozitivă – Fermentarea glucozei 57

CAPITOLUL 6 IZOLAREA ŞI IDENTIFICAREA LUI BACILLUS CEREUS DIN ALIMENTE 6.1. Caractere generale B. cereus este un germen Gram pozitiv, sporogen, necapsulogen, flagelat peritrich. Este larg răspândit în natură, putând fi izolat dintr-o diversitate de alimente. Totuşi, în afară de cazul în care numărul de germeni este foarte mare, el nu reprezintă un risc semnificativ pentru sănătate. Consumul alimentelor care conţin peste 105 germeni viabili per gram au ca urmare epidemiile de toxiinfecţii alimentare. Alimentele incriminate în acest fel de epidemii includ orezul fiert şi prăjit, paste fierte, cărnuri fierte, legume, supe, salate, budinci. Pe baza consumului de alimente contaminate cu B. cereus au fost puse două tipuri de îmbolnăviri, şi anume:  „sindromul diareic” – ce se caracterizează prin dureri abdominale, tenesme şi diaree apoasă; febra este în general absentă; perioada de incubaţie este de 8-16 ore, iar simptomele persistă 18-24 de ore; alimentele incriminate sunt reprezentate de: preparate din cereale, care conţin porumb sau amidon de porumb, piure de cartofi, legume, carne tocată, leberwurst, carne porţionată, lapte, carne gătită, budinci, supe şi altele; serovarurile izolate din epidemii au fost 1, 6, 8, 9, 10, 12; simptomele sunt asemănătoare cu cele produse de intoxicaţiile cu C. perfringens;  „sindromul emetic” (cu vomă) – care se caracterizează printr-o criză acută de greaţă şi vărsături la 1-5 ore după masă; diareea nu este caracteristică, dar poate apărea în unele cazuri; serovarurile asociate cu sindromul emetic sunt 1, 3, 4, 5, 8, 12, 19; sindromul emetic a fost deseori asociat cu consumul de orez şi preparate pe bază de orez; tulpinile de B. cereus implicate în producerea acestui sindrom se dezvoltă optim între 35 şi 40°C; simptomele sunt asemănătoare cu cele din toxiinfecţiile alimentare produse de stafilococi; B. cereus produce o largă varietate de toxine şi enzime ce includ: lecitinazele, proteazele, betalactamazele, sfingomielinazele, cereolizenele şi hemolizina BL. Sindromul diareic pare să fie produs de către hemolizina BL, care reprezintă un complex alcătuit din 3 componente: B, L1 şi L2. Acest complex este responsabil de producerea hemolizei, citolizei, dermonecrozei, permeabilităţii vasculare şi activităţii enterotoxice. Sindromul diareic este în general asociat cu B. cereus şi complexul toxic HBL, dar au mai fost implicate în producerea lor alte 14 specii din genurile Bacillus şi Paenibacillus. 58

Specii de Bacillus şi Paenibacillus producătoare de enterotoxină HBL asociate cu B. cereus în producerea sindomului diareic B. cereus B. amyloliquefaciens P. circulans B. coagulans B. lentimorbis B. lentus B. licheniformis B. megaterium

B. mycoides B. pasteurii B. pseudomycoides B. subtilis B. thuringiensis B. weihenstephanensis P. polymyxy

Transportul probelor la laborator se face cu promptitudine şi dacă este posibil fără congelare. Containerul de transport trebuie să conţină suficient gel refrigerant pentru a menţine probele la o temperatură de sub 6 grade Celsius. O dată ajunse la laborator acestea se depozitează la frigider, iar analiza lor se face cât mai repede posibil. Dacă probele nu se pot analiza în decurs de 4 zile de la recoltare, acestea se vor congela rapid păstrându-se la -20°C, până la examinare. Decongelarea se realizează la temperatura laboratorului. Alimentele deshidratate se păstrează la temperatura camerei şi se transportă fără refrigerare. Tehnica de lucru: Prepararea probelor: folosind o tehnică aseptică se cântăresc 50 g probă, într-un blender steril; se adaugă 450 ml de tampon fosfat Butterfield şi se amestecă 2 minute la 18.000-21.000 rpm, obţinându-se astfel diluţia 10-1; se fac diluţii seriate pentru numărarea lui B. cereus. 6.2. Determinarea numărului cel mai probabil de germeni (most probable number, MPN) Din fiecare diluţie a probei alimentare se însămânţează câte 1 ml în trei eprubete per diluţie, cu bulion triptic de soia; se incubează tuburile 48 de ore la 30°C şi se verifică pentru o creştere densă, tipică pentru B. cereus; din tuburile în care se dezvoltă colonii suspecte se fac pasaje în plăci Petri prin etalare pe suprafaţa mediilor de izolare MYP (manitol cu emulsie de gălbenuş de ou şi polimixină B) (M78) şi agar cu sânge (M15) şi se incubează 24-48 de ore la 30°C; din coloniile care au produs lecitinază se efectuează subculturi pe agar sânge pentru confirmarea lui B. cereus; se calculează MPN de B. cereus per gram din fiecare probă pe baza numărului de tuburi pentru fiecare diluţie în care s-a confirmat prezenţa germenului. 6.3. Confirmarea lui B. cereus Se verifică pe mediul MYP prezenţa lecitinazei şi lipsa fermentării manitei; coloniile de B. cereus apar mari, de culoare roz închis, pe fond violaceu, fiind 59

înconjurate de o zonă de precipitare a gălbenuşului. În cazul prezenţei betahemolizei, pe mediul cu agar sânge apar colonii mari înconjurate de un halou evident de hemoliză, care nu se intensifică după depozitare la rece (specific pentru B. cereus). Pentru confirmarea lui B. cereus se aleg din fiecare placă cu agar MYP, 5-6 colonii lecitinază pozitive, care se transferă pe pante cu agar nutritiv. Se efectuează frotiuri colorate Gram şi se examinează la microscop. B. cereus va apărea ca un bacil Gram pozitiv, mare, cu capetele rotunjite grupat în lanţuri mai lungi sau mai scurte şi cu endospori elipsoidali situaţi central sau subterminal, care de obicei nu deformează celula vegetativă. Se transferă o ansă de cultură bacteriană de pe fiecare pantă într-un tub cu soluţie sterilă cu tampon fosfat. Se amestecă bine şi se foloseşte cultura în suspensie pentru inocularea următoarelor medii de confirmare: 1. Bulion cu glucoză şi roşu fenol. Se inoculează o ansă de cultură bacteriană (aproximativ 2 mm) în trei ml de bulion. Tuburile se incubează anaerob într-un sistem GasPack, 24 de ore la 35°C. Tuburile se agită riguros şi se verifică pentru creştere după cum arată turbiditatea şi modificarea culorii mediului din roşu în galben, ceea ce arată că a avut loc eliberarea de acid din glucoză. 2. Bulion cu nitrat (M71). Se realizează prin adăugarea la cultura în bulion a 0,25 ml de reactiv. Dacă în aproximativ 10 minute va apărea o coloraţie portocalie înseamnă că testul este pozitiv. 3. Mediul VP modificat (M68). Se inoculează o ansă de cultură bacteriană (aproximativ 3 mm) în 5 ml de mediu. Se incubează 48 de ore la 35°C. Se testează pentru prezenţa de acetil-metil-carbinol prin pipetarea a 1 ml de cultură într-o eprubetă Wassermann, la care se adaugă 0,6 ml de soluţie de alfa-naftol şi 0,2 ml de soluţie de hidroxid de potasiu 40%. Se agită şi se adaugă câteva cristale de creatină. Rezultatele se citesc după păstrarea timp de o oră la temperatura camerei. Testul este pozitiv dacă apare o culoare roz sau violet. 4. Agar cu tirozină. Se însămânţează mediul de cultură şi se incubează 48 de ore la 35°C. Dacă se produce clarificarea mediului înseamnă că tirozina a fost descompusă. 5. Bulion cu lizozim. Se inoculează mediul cu o ansă de cultură bacteriană. Se foloseşte ca martor pozitiv, bulion nutritiv simplu însămânţat. Tuburile se incubează 24 de ore la 35°C. Se înregistrează creşterea ca pozitivă sau negativă, iar tuburile negative se incubează alte 24 de ore înainte de îndepărtare. Se înregistrează rezultatele obţinute prin testele de confirmare considerându-se pozitive, cele care: - sunt bacili Gram pozitivi, ce formează spori, care nu deformează sporangiul; - produc lecitinază şi nu fermentează manitolul pe agar MYP; 60

- cresc şi produc acid din glucoză pe cale anaerobă; - reduc nitraţii în nitriţi; - produc acetil-metil-carbinol; - descompun tirozina; - cresc în prezenţa lizozimului 0,001%. Aceste caracteristici fundamentale sunt comune cu ale altor membrii ai grupului B. cereus, incluzând tulpinile rizoide de B. cereus var. mycoides, bacterii patogene ale insectelor cristalifere ca B. thuringiensis şi cele patogene pentru mamifere ca B. anthracis. 6.4. Teste pentru diferenţierea membrilor grupului B. cereus 1. Testul mobilităţii: Se inoculează un mediu BC pentru testarea mobilităţii prin înţepare cu un ac drept de însămânţare (3 mm suspensie de cultură de 24 de ore). Se incubează 18-24 de ore la 30°C. Dacă creşterea bacteriană difuzează în tot mediul de cultură, bacteriile sunt mobile, iar dacă aceasta are loc numai de-a lungul liniei de însămânţare înseamnă că bacteriile sunt imobile. Alternativ se însămânţează circa 3 mm de suspensie bacteriană pe suprafaţa unei pante de agar cu 0,2 ml de apă distilată sterilă. Se incubează 6-8 ore la 30°C. Se testează mobilitatea prin examenul între lamă şi lamelă. Majoritatea tulpinilor de B. cereus şi B. thuringiensis sunt mobile, având flageli peritrichi. B. anthracis şi aproape toate tulpinile de B. cereus var. mycoides sunt imobile. 2. Creşterea rizoidă: Se însămânţează bacteria de cercetat în plăci Petri cu agar nutritiv. Se incubează 48-72 de ore la 30°C. Se controlează pentru creşterea rizoidă care se caracterizează prin producerea de colonii cu structuri asemănătoare unor rădăcini ce se pot extinde pe mai mulţi centimetri de la locul inoculării. B. cereus formează de obicei colonii rugoase în formă de galaxie care nu trebuiesc confundate cu cele rizoide tipice pentru B. cereus var. mycoides. Majoritatea tulpinilor din această varietate sunt imobile. 3. Testul pentru activitatea hemolitică: Se însămânţează o suspensie de cultură bacteriană de 24 de ore într-o placă Petri cu agar sânge de oaie şi tripticază soia. Plăcile se incubează 24 de ore la 35°C. Culturile de B. cereus sunt de obicei puternic hemolitice şi produc o zonă de 2-4 mm de hemoliză completă (beta) în jurul coloniei bacteriene. Majoritatea tulpinilor de B. thuringiensis şi B. cereus var. mycoides sunt tot betahemolitice. Tulpinile de B. anthracis sunt de obicei nehemolitice după o incubaţie de 24 de ore. 4. Testul pentru cristalele de toxină proteică: Se inoculează pe pante cu agar nutritiv o suspensie bacteriană de 24 de ore. Se incubează la 30°C, 24 de ore şi se lasă la temperatura camerei 2-3 zile. Se fac frotiuri care se usucă la aer şi se fixează prin flambare. Lamele se plasează pe suportul băiţei de colorare şi se acoperă cu metanol. Se lasă 30 de secunde, se îndepărtează metanolul şi se usucă bine lama trecând-o prin flacără. Se pune din nou lama pe suport şi se acoperă 61

cu fuxină bazică 0,5% sau fuxină ZN (Difco). Se încălzeşte lama uşor la flacără până la apariţia vaporilor. Se aşteaptă 1-2 minute şi se repetă această etapă. Se lasă 30 de secunde, se îndepărtează colorantul, iar lama se clăteşte bine cu apă de robinet. Se usucă lama (fără ştergere) şi se examinează la un microscop cu imersie pentru prezenţa endosporilor şi a cristalelor tetragonale întunecate (în formă de diamant). Cristalele sunt de obicei, mai mici decât sporii. Acestea sunt abundente într-o cultură veche de 3-4 zile de B. thuringiensis, dar nu pot fi detectate prin tehnici de colorare, decât după liza sporangiului. De aceea, dacă nu se pot observa spori liberi culturile se ţin la temperatura camerei câteva zile în plus şi se reexaminează. De obicei, cristalele de toxină proteică sunt produse de B. thuringiensis.

62

B. cereus. Coloraţia Gram. Metodă indirectă de evidenţiere a sporului care apare necolorat, oval şi deformează uşor celula vegetativă. Se remarcă prezenţa unei grupări în lanţ.

B. cereus. Microscopie electronică. Bacili asemănători cu Bacillus anthracis dar cu capetele mai rotunjite, mobili, flagelaţi peritrich. 63

B. cereus – agar cu sânge de oaie, hemoliză beta. Se remarcă colonii mari, neuniforme, opace de tip R (rough), lipsite de tenacitate, fiind înconjurate de o zonă largă de beta hemoliză. Se remarcă aspectul caracteristic de picături de ceară.

B. cereus – coloraţia Leifson, se observă flageli dispuşi peritrich. 64

B. cereus. Agar cu sânge de oaie. Se remarcă beta hemoliza, ce se traduce prin clarificare mediului de cultură în dreptul şi în jurul coloniilor bacteriene datorită unui proces de hemoliză şi hemodigestie.

B. cereus. Coloraţia cu verde de malachit (metodă directă pentru evidenţierea endosporilor). Se remarcă prezenţa sporilor coloraţi în verde. Celulele vegetative apar colorate în roşu.

Agar Cromogen Oxoid pentru Bacillus cereus (CM1036 & SR0130E), substratul cromogen 5bromo-4-cloro-3-indolil-beta-glucopiranozidă este clivat de către beta-glucozidază, rezultatul fiind formarea unor colonii de B. cereus albastre-verzui. În mediu mai sunt incorporaţi agenţi selectivi care împiedică creşterea altor specii din genul Bacillus capabile să utilizeze substratul cromogen. 65

B. cereus – colonii mari, neregulate, margini ondulate de tip R.

B. cereus – indol negativ

B. cereus – lactoză negativ

B. cereus – formare de bule = catalază pozitiv

B. cereus – glucoză pozitiv

B. cereus – reduce nitraţii în nitriţi

B. cereus – hidroliza amidonului pozitiv. Amidonul din jurul coloniilor a fost hidrolizat de amilazele extracelulare 66

CAPITOLUL 7 IZOLAREA ŞI IDENTIFICAREA SPECIEI LISTERIA MONOCYTOGENES DIN ALIMENTE 7.1. Caractere generale Genul Listeria face parte din familia Listeriaceae, împreună cu genul Brochothrix. Cuprinde 7 specii: Lis. denitrificans (Jonesia denitrificans), Lis. grayi (Lis. murrayi), Lis. innocua, Lis. ivanovii (cu două subspecii: ivanovii şi londoniensis), Lis. monocytogenes, Lis. seeligeri, Lis. welshimeri.

Testul CAMP Stp. Rco. aureus equi

Beta hemoliză

Hidroliza hipuratului

Manitol

Ramnoză

Galactoză

Lactoză

Specii

Xiloză

Câteva caractere diferenţiale între speciile de Listeria G+C mol%

v v + + + + + 37-39 Lis. monocytogenes + - (+) + + 36-38 Lis. innocua + + W 36 Lis. seeligeri + V 36 Lis. welshimeri + + v + + ++ 37-38 Lis. ivanovii + + + 41-42 Lis. grayi Legendă: v = variabil, w = slab, + = majoritatea tulpinilor pozitive * 1/2a, b, c; 3a, b, c; 4a, ab, c, d, e; „7” † Aceleaşi ca la Lis. monocytogenes şi Lis. innocua dar fără serovarurile 5 sau „7”.

Serovaruri

* 4ab, 6a, 6b † 6a, 6b 5

Lis. monocytogenes este o bacterie Gram pozitivă polimorfă (bacili scurţi, cocobacili, forme filamentoase). Este necapsulogenă, nesporogenă. În culturile incubate la temperaturi sub 35°C este mobilă, cu 4-5 flageli dispuşi peritrich, iar la 37-46°C devine imobilă sau monoflagelată. Listeriile sunt bacterii facultativ anaerobe ce se cultivă bine pe medii uzuale între 20 şi 37°C. Izolarea se realizează deseori dificil, necesitând medii selective sau de îmbogăţire, cum ar fi: infuzie de creier-inimă, tripticază soia, bulion cu triptoză. Uneori, pentru izolarea din diverse produse alimentare cu floră mixtă este necesară „îmbogăţirea la rece”, care se realizează prin păstrarea probei alimentare la frigider (4°C) timp de 4 săptămâni şi executarea de însămânţări din 4 în 4 zile. Are nevoie pentru creştere de următoarele vitamine: biotină, riboflavină, tiamină şi acid tioctic (acid alfa-lipoic) şi aminoacizii: cisteină, glutamină, izoleucină, leucină, valină. Pe baza antigenelor somatice şi a celor flagelare au fost identificate 17 serotipuri. 67

Lis. monocytogenes cuprinde 13 serovaruri dintre care câteva au fost împărţite cu Lis. innocua şi Lis. seeligeri. Serotipul cel mai des izolat a fost 1/2 şi 4. După Prior, tipul 1 este predominant în Europa şi Africa, iar tipul 4 în America de Nord. În general, listeriile se izolează din lapte crud, brânzeturi, carne proaspătă şi îngheţată, carne de pui, produse de mare, fructe şi legume. Identificarea speciei se bazează pe următoarele caractere fenotipice:  testul CAMP;  reducerea nitraţilor;  spectrul de fermentare a carbohidraţilor;  patogenitatea experimentală. 7.2. Metoda şi schema de lucru utilizată pentru izolarea şi identificarea lui Lis. monocytogenes Se obţine omologatul alimentar din amestecarea a 25 grame de aliment cu 225 mililitri de apă peptonată şi se amestecă bine într-un blender steril. Incubarea se realizează la 20°C, timp de 1-2 ore. Preîmbogăţirea. Se amestecă 25 grame de probă cu 225 mililitri bulion DemiFraser (M82). Incubarea se realizează la 30°C, timp de 24 de ore. Îmbogăţirea selectivă. Câte 1 mililitru din cultura obţinută prin resuscitare şi preîmbogăţire se însămânţează în 100 mililitri bulion Demi-Fraser. Incubarea se realizează la 30°C, timp de 24 de ore. Trecerea pe mediul selectiv de izolare. 0,1 mililitri din cultura ca atare sau din amestecul 0,5 mililitri cultură + 4,5 mililitri KOH se striază pe suprafaţa agarului Palcom (M83). Incubarea se realizează la 35°C, timp de 24-48 de ore. Izolarea coloniilor caracteristice. Se selectează 5 colonii tipice şi se pasează în plăci Petri cu agar nutritiv (sau agar TSYEA). Se incubează la 35-37°C, timp de 18-24 de ore. 7.3. Identificarea şi confirmarea lui Lis. monocytogenes 1. Coloraţia Gram: listeriile apar ca bacili Gram pozitivi sau cocobacili. 2. Testul mobilităţii: se transplantează de pe mediile agarizate, selective, 5 colonii caracteristice într-o eprubetă cu bulion creier şi cord de bovină şi 3 colonii într-o eprubetă cu agar nutritiv moale şi se incubează la 25°C, 24 de ore. Se execută, din cultura în bulion, examenul între lamă şi lamelă. Lis. monocytogenes prezintă o mobilitate intensă şi caracteristică şi execută mişcări de rostogolire ce alternează cu scurte perioade de repaus. Pe agarul moale, mobilitatea bacteriei este exprimată prin dezvoltarea culturii sub formă de umbrelă. 3. Testul catalazei: Catalaza este o enzimă hemoporfirinică, ce catalizează reacţia de descompunere a apei oxigenate. Reacţia se evidenţiază, atunci când se pune 68

în contact o ansă de cultură cu o picătură de apă oxigenată. Apariţia bulelor de gaz se interpretează ca reacţie pozitivă, fiind specifică pentru listerii. 4. Fermentarea carbohidraţilor: Se foloseşte apă peptonată cu roşu-fenol. Listeria monocytogenes fermentează glucoza şi ramnoza, cu producere de acid, fără producere de gaz, dar nu fermentează xiloza şi manitolul. Teste de confirmare: a) Testul hemolizei. Prin acest test se pot diferenţia două specii strâns înrudite şi anume Lis. monocytogenes şi Lis. innocua. Speciile hemolitice de listerii sunt: Lis. monocytogenes, Lis. ivanovii, Lis. seeligeri. Se procedează astfel: suprafaţa agarului cu sânge de oaie se striază cu cultura bacteriană de testat. Se incubează 24 de ore la 35-37°C. Lis. monocytogenes formează colonii mici cu un halou mic, clar, în jur, specific hemolizei beta. Lis. ivanovii are o activitate hemolitică puternică formând în jurul coloniilor zone clare, întinse, iar Lis. seeligeri produce o hemoliză slabă. b) Testul CAMP. Poate evidenţia clar caracterele hemolitice şi se realizează prin însămânţarea lui Stp. aureus şi Rco. equi sub formă de striuri, într-o singură direcţie pe placa cu agar sânge, iar tulpinile de Listeria perpendicular, faţă de traiectoria acestora, fără a le atinge. Hemoliza tulpinilor de Lis. monocytogenes este mai exacerbată în apropierea striului de Stp. aureus, iar pentru Lis. ivanovii, numai în apropierea striului de Rco. equi. Testarea patogenităţii: se realizează pe baza următoarelor teste: • testul lui Anton; • pe şoareci imunocompromişi, infectaţi intraperitoneal cu tulpini virulente de Lis. monocytogenes; • prin inocularea pe membrana corioalantoidiană a oului embrionat. Testul lui Anton: se realizează pe cobai, prin instilare în sacul conjunctival a câtorva picături dintr-o cultură proaspătă de 24 de ore. În cazul reacţiei pozitive apar simptome de cheratoconjunctivită purulentă, care se vindecă spontan în câteva zile.

69

Lis. monocytogenes – frotiu din cultură. Se remarcă polimorfism, forme predominant bacilare, dar şi forme cocobacilare, cocoide.

Lis. monocytogenes microscopie electronică Bacili scurţi, drepţi sau încurbaţi

Lis. monocytogenes – microscopie electronică, coloraţie negativă

Lis. monocytogenes – hemocultură. Listeriile apar fie extracelular, fie fagocitate, ceea ce constituie o probă certă în diagnosticul listeriozei

Lis. monocytogenes – testul CAMP

Lis. monocytogenes – testul mobilităţii. În mediile semisolide, după însămânţarea listeriei prin înţeparea mediului în profunzime şi incubarea la 37°C, aceasta creşte sub forma unei “umbrele”. 70

Lis. monocytogenes – testul bilă-esculină

Lis. monocytogenes – agar TSI

Lis. monocytogenes – reacţia de imunofluorescenţă indirectă cu anticorpi policlonali, infecţie de laborator pe rinichi de şoarece, roşu (rodamină) = filamentele de actină, verde = Listeria

Lis. monocytogenes – frotiu din cultură din mediul solid

Repartiţia listeriozei în diferite zone ale globului. prezentă; larg răspândită; localizată raportată de curând; prezenţă neconfirmată

Lis. monocytogenes – microscopie electronică 71

Nucleu

Listeria în citoplasmă Microscopie electronică a unui macrofag după 8 ore de la infecţia cu Lis. monocytogenes. Bacteria a trecut de bariera lizozomilor şi se divide în citoplasmă. Cromatina nucleului macrofagului apare condensată şi citoplasma se află într-un stadiu progresiv de liză

Mediul OCLA (Oxoid Chromogenic Listeria Agar) coloniile de Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes – beta hemoliză 72

CAPITOLUL 8 IZOLAREA ŞI IDENTIFICAREA LUI VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS DIN ALIMENTE 8.1. Caractere generale Genul Vibrio face parte din familia Vibrionaceae (cu 8 genuri). Cuprinde 76 de specii. Genul reuneşte bacili Gram negativi cu aspect caracteristic de virgulă (rar în „S”), necapsulogeni, nesporogeni şi extrem de mobili. În mediile lichide prezintă flageli polari (mono sau lofotrichi), iar pe mediile solide formează flageli laterali. V. parahaemolyticus reprezintă principala cauză a gastroenteritelor epidemice, mai ales în zonele unde se consumă peşte crud (Japonia). Există dovezi că încă alte 4 specii halofile de Vibrio sunt patogene pentru om: V. alginolyticus, V. fluvialis, V. metschnikovii şi V. vulnificus. Toate aceste specii halofile se diferenţiază printr-unul sau mai multe teste biochimice. Teste biochimice de diferenţiere între V. parahaemolyticus şi alte specii de Vibrio Specia V. parahaemolyticus V. alginolyticus V. vulnificus Flageli laterali pe mediul solid + + Bacili D D C Reacţia Voges-Proskauer + Creşterea în mediu cu 10% NaCl + Dezvoltarea în NaCl 6% + + + Fenomenul de „roire” + Producţia de acetoină/ diacetil + Sucroză + Celobioză + Utilizarea putresceinei + % Agar TCBS v g v Legendă: D = drept; C = curb; v = verde; g = galben; % = 11-90% din tulpinile pozitive

Alimentele frecvent implicate în epidemiile cu V. parahaemolyticus sunt reprezentate de: peşte, stridii, creveţi, crabi, homari, scoici. Toxiinfecţiile alimentare sunt probabil provocate de refrigerarea necorespunzătoare, de fierberea insuficientă, de contaminarea încrucişată sau de recontaminare. Tulpinile izolate de la bolnavi sunt de regulă hemolitice, iar activitatea hemolitică a acestei bacterii poartă denumirea de „fenomenul Kanagawa”. Tulpinile Kanagawa pozitive produc o hemolizină directă termostabilă, iar tulpinile Kanagawa negative produc o hemolizină termolabilă. Există tulpini care produc ambele hemolizine. Hemolizina termolabilă înrudită reprezintă un factor important de virulenţă pentru unele tulpini 73

de V. parahaemolyticus. Acesta este un organism halofil ce poate fi detectat în apele oceanice şi costiere la temperaturi în jur de 19-20°C. Un studiu efectuat de Chasapeake Bey arată că bacteriile supravieţuiesc în sedimentul marin pe timpul iernii, iar apoi sunt eliberate în coloana de apă prin zooplancton din aprilie până la sfârşitul lui iunie. Aceste microorganisme nu se găsesc de obicei în adâncimile oceanelor deoarece nu pot tolera presiunea hidrostatică. V. parahaemolyticus se dezvoltă optim la un pH de 7,2-7,3 şi 3% NaCl sau la un pH 7,6 şi 7% NaCl. 8.2. Tehnica de lucru Prepararea probei a) probe de peşte: se recoltează ţesuturi de suprafaţă, intestine, branhii; b) crustacee cu cochilie: se recoltează întregul conţinut interior; se adună 10-12 crustacee, din care se recoltează 50 g pentru o probă test. c) crustacee fără cochilie: se prepară în întregime sau se recoltează porţiunea centrală inclusiv branhii şi intestine. Ziua I: Se amestecă 450 ml de bulion cu NaCl 3% şi polimixină B, într-un blender steril pentru 1 minut, cu 8.000 rpm. Aceasta reprezintă diluţia 1:10. În continuare se fac diluţii seriate (1:100, 1:1.000, 1:10.000, etc.). Din fiecare diluţie seriată se trec câte 10 ml în câte 3 tuburi per diluţie cu bulion GST (glucose salt Teepol). Îmbogăţirea: Se incubează bulioanele respective la 35°C, 18-24 de ore. Dacă diluarea şi incubarea nu se pot realiza în aceeaşi zi, probele se păstrează pe ziua următoare la o temperatură cuprinsă între 0 şi 5°C. În cazul produselor congelate se recomandă să se efectueze o a doua izolare după 18 ore de incubare. Ziua a II-a: Izolarea şi identificarea: după incubare se însămânţează din fiecare tub o ansă de cultură pe suprafaţa mediului de izolare TCBS (agar cu sucroză-sare-bilă-citrattiosulfat) (M65) în plăci Petri (câte 3 per diluţie) astfel încât să se obţină colonii izolate. Se incubează plăcile la 35°C, timp de 18-24 de ore. Ziua a III-a: Testul diferenţial I: Se recoltează cu acul de însămânţare două sau mai multe colonii tipice (netede, verzi, zaharoză negative, cu diametrul de 2-3 milimetri), de pe suprafaţa plăcilor cu agar TCBS şi se transferă pe următoarele medii: a) Agar TSI salin: V. parahaemolyticus şi V. vulnificus realizează o pantă alcalină (roşie = lactoză şi zaharoză negative); baza mediului este acidă (galbenă = glucoză pozitiv), fără producere de gaze şi nu prezintă înnegrire (hidrogen sulfurat negativ). Aceasta este o reacţie tipic shigeloidă (Shigella-like). V. alginolyticus, V. fluvialis şi V. metschnikovii dau o pantă acidă şi o bază fără gaz. b) Mediul TSA (3% NaCl) şi TSB (3% NaCl): Se însămânţează mediile TSA şi TSB cu bacteria de cercetat şi se însămânţează 18-24 de ore la 35°C. Aceste culturi 74

se folosesc ca surse de inoculare pentru alte teste, pentru coloraţia Gram şi examinări microscopice. Vibrionii sunt bacterii Gram negative, pleomorfe, cu aspect de bastonaşe, curbe sau drepte, prevăzute cu flageli polari. c) Mediul pentru testarea mobilităţii: Se inoculează un tub cu mediu pentru testare mobilităţii prin înţeparea centrului coloanei de mediu în profunzime. Se incubează 1824 de ore la 35°C. O creştere circulară difuză de la linia de înţepare constituie un test pozitiv. V. parahaemolyticus şi vibrionii înrudiţi sunt mobili. Ziua a IV-a: Testul diferenţial II: a) Bulion cu glucoză Hugh-Leifson (Hugh-Leifson glucose broth): Se inoculează două tuburi de mediu HLGB cu un ac de însămânţare de pe mediul TSA. Se acoperă suprafaţa mediului cu ulei mineral steril într-un strat de aproximativ 3 cm şi se incubează 2-3 zile la 35°C. Dacă culoarea mediului se modifică din purpuriu în galben înseamnă că microorganismul fermentează hidraţii de carbon. V. parahaemolyticus şi vibrionii înrudiţi fermentează glucoza fără producţie de gaz. b) Testul de citocrom oxidază: Se însămânţează bacteria de cercetat pe mediul TSA şi se incubează 24 de ore la 35°C. Se adaugă 2-3 picături de reagent pentru testul oxidazei peste coloniile bacteriene crescute pe pantă sau peste coloniile din plăci Petri. Dacă în aproximativ 2 minute mediul se va colora în albastru închis testul este pozitiv. V. metschnikovii este negativ, iar toţi ceilalţi vibrioni halofili sunt pozitivi. c) Testul pentru dihidrolaza argininei, lizinei şi ornitindecarboxilazei: Mediile au culoare galbenă, ca rezultat al producerii de acid din glucoză. Apariţia unei culori violete şi tulburarea mediului la sfârşitul perioadei de incubare este considerată reacţie pozitivă. Rezultatul acestor teste şi a altor teste diferenţiale sunt prezentate în tabelul de mai jos:

V. anguillarum

V. vulnificus

V. fluvialis

V. metschnikovii

Aeromonas hydrophila

Plesiomonas shigelloides

TCBS (colonii verzi) Creşterea la 42°C Creşterea în medii cu: NaCl 0% NaCl 6% NaCl 8% NaCl 10% Lizindecarboxilază Arginindihidrolază Ornitindecarboxilază

V. alginolyticus

Test

V. parahaemolyticus

Teste de diferenţiere a lui V. parahaemolyticus de bacteriile înrudite

+ +

+

-

+ nd

var

var

-

+ -

+ + + +

+ + + + var

+ var var -

var + var

+ var + -

+ var var + -

+ var var

+ + + var

75

Test

V. parahaemolyticus

V. alginolyticus

V. anguillarum

V. vulnificus

V. fluvialis

V. metschnikovii

Aeromonas hydrophila

Plesiomonas shigelloides

Fermentarea sucrozei Fermentarea lactozei Fermentarea manitolului Fermentarea arabinozei Voges-Proskauer

+ + -

+ + +

+ + var

+ var -

+ + + -

+ var + +

var var + var var

var -

d) Mediul TSB (salt tripticase broth), halofilismul: Se însămânţează 4 tuburi cu mediu TSB ce conţin 0, 6, 8 şi 10% NaCl, din cultura de TSB cu 3% NaCl. Se incubează 24 de ore la 35°C. Speciile halofile de Vibrio care cresc şi în absenţa sării se dezvoltă bine în mediul cu 6% NaCl. V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. fluvialis şi ocazional, tulpinile de V. metschnikovii se dezvoltă în 8% NaCl. Numai V. alginolyticus creşte bine în mediile cu 10% NaCl. e) Creşterea la 42°C: Se inoculează un tub cu bulion TSB cu NaCl 2% cu o ansă de cultură bacteriană de 24 de ore de pe mediul TSB cu NaCl 3% şi se incubează în baie marină la 42°C, timp de 24 de ore. Dacă creşterea are loc în profunzimea mediului reacţia este considerată pozitivă. V. parahaemolyticus, V. alginolyticus şi ocazional tulpinile de V. fluvialis şi V. metschnikovii sunt pozitive la acest test. f) Bulionul MP-VP (testul Voges-Proskauer) (M56): se însămânţează un mediu MP-VP cu o ansă dintr-o cultură de pe mediul TSA şi se incubează 2 zile la 35°C. Se efectuează testul Voges-Proskauer. V. parahaemolyticus, V. vulnificus şi V. fluvialis sunt VP negative, în timp ce V. alginolyticus şi V. metschnikovii sunt pozitive. g) Reacţiile de fermentare în bulion cu bromcrezol purpuriu: Se inoculează câte un tub cu bulion cu sucroză, lactoză, manitol şi arabinoză cu o cultură bacteriană de pe mediul TSA şi se incubează la 35°C pentru 4, 5 zile. Reacţia acidă se traduce prin virarea culorii bulionului din purpuriu în galben. Rezultatele acestor teste de fermentaţie sunt incluse în tabelul de mai sus. h) Fenomenul „Kanagawa” (agar Wagatsuma) (M71): Reacţia „Kanagawa” reprezintă un test pentru determinarea prezenţei hemolizinei termostabile directe specifice pe agarul Wagatsuma. S-a constatat că reacţia pozitivă se corelează strâns cu patogenitatea rezultatelor de V. parahaemolyticus. Izolatele care produc boala la om, sunt de obicei Kanagawa pozitive, în timp ce izolatele recuperate din hrana marină sunt Kanagawa negative, aproape întotdeauna. Pentru efectuarea testului Kanagawa se introduce o picătură dintr-o cultură de 18 ore în TSB cu NaCl 3% cu o scobitoare sterilă pe o placă cu agar sânge Wagatsuma, bine uscată. Se pot face mai multe înţepături de tip circular pe o singură placă. Se însămânţează întotdeauna culturi pozitive şi negative pe fiecare placă. Se incubează la 35°C şi se urmăresc rezultatele înregistrându-se la 76

24 de ore. Testul pozitiv constă în beta-hemoliză, adică în clarificarea mediului în jurul coloniei datorită unui proces de hemodigestie. Zona are o singură margine, clar delimitată, fără inele concentrice multiple. Hemoliza este pe deplin clară, fără să aibă loc înverzirea mediului. Zonele de hemoliză se observă de la marginea coloniei până la marginea externă a zonei. Izolatele care produc zone clare de hemoliză, mai mici de 3 mm pot fi slab patogene prin testul ansei ileale de la iepure. Este important de reţinut că în acest test nu e valabilă nici o observaţie după 24 de ore. i) Conservarea culturilor bacteriene: Se inoculează un mediu de conservare semisolid pe termen lung prin înţepare în profunzime. Se lasă capacul lax, până la apariţia unei creşteri vizibile în cursul incubării la 35°C, timp de 24 de ore. Se închide etanş capacul pentru a împiedica deshidratarea şi se păstrează la temperatura camerei. Pentru conservarea lui V. parahaemolyticus şi a lui V. vulnificus pentru câteva luni la -70°C se plasează 1 ml dintr-o cultură de 6-12 ore de TSB NaCl 3% şi 0,09 ml de dimetil-sulfoxid (DMSO) în criotuburi sterile; se congelează imediat la -70°C. f) Confirmarea serologică a lui V. parahaemolyticus: Antigenele „K”, care cuprind diferite grupe somatice sunt prezente în tabelul de mai jos: O grup 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 TOTAL

Tipul „K” 1, 25, 26, 32, 38, 41, 56, 58, 64 3, 28 4, 5, 6, 7, 29, 30, 31, 33, 37, 43, 45, 48, 54, 57, 58, 59 4, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 34, 42, 49, 53, 55, 63 15, 17, 30, 47, 60, 61 18, 46 19 20, 21, 22, 39, 62 23, 44 19, 24, 52 36, 40, 50, 51 60 de tipuri „K”/63 de serotipuri

Se procedează astfel: se spală o pantă cu 2 ml dintr-o soluţie de NaCl 3% (o suspensie mai mare este optimă pentru acest test de aglutinare pe lamă). Suspensia de celule se împarte în două volume egale în tuburi separate. Se autoclavează tubul o oră la 121°C. Această suspensie autoclavată reprezintă antigenul „O”. Suspensia netratată reprezintă antigenul „K”. Pentru efectuarea reacţiei de aglutinare „O” se împarte lama în 12 compartimente egale, folosind un creion de ceară. Se introduce o picătură în fiecare compartiment şi se adaugă câte o picătură din cele 11 antiseruri de grup „O”. În compartimentul al 12-lea care conţine martorul de aglutinare se adaugă o picătură de NaCl 3%. Se balansează uşor lama timp de 1 minut pentru amestecarea componentelor. Aglutinarea pozitivă se citeşte imediat. Aceasta determină ce 77

antigene de tip „K” trebuiesc testate. În acest sens se marchează pe lamă numărul de compartimente pozitive. Se plasează o picătură mică de suspensie neautoclavată în fiecare compartiment şi se adaugă câte o picătură de antiser „K” adecvat în fiecare compartiment. În compartimentul de control se adaugă o picătură de NaCl 3%. Se balansează uşor lama înainte şi înapoi pentru amestecarea componentelor, timp de un minut. Se citeşte imediat.

78

Izolarea şi identificarea lui V. parahaemolyticus -schema de lucru-

1. Diluarea

(schemă adaptată după W. Andrews, 1992)

450 ml de diluant (apă cu 3% NaCl)

probei alimentare 50 g aliment; se amestecă la 8.000 rpm pt 1 min.

Diluţii seriate în 90 ml tampon fosfat

2. Efectuarea diluţiilor seriate

3. Îmbogăţirea Incubarea la 35°C, 18-24 de ore

1 g de inocul în fiecare tub GSTB

0,1 g de inocul în fiecare tub GSTB

4. Obţinerea coloniilor izolate Agar TCBS 5. Teste biochimice şi serologice de confirmare

79

0,01 g de inocul în fiecare tub GSTB

Aspectul culturii de 18-24 ore pe mediul TCBS a speciilor de Vibrio, comparativ cu alte specii posibil asociate (după Buiuc D., 1999)

Specia V. cholerae V. alginolyticus V. fluvialis V. furnissi V. metschnikovii V. parahaemolyticus Aeromonas hydrophila Plesiomonas shighelloides Proteus vulgaris Alte Enterobacteriaceae Pseudomonas spp.

Diametrul Fermentarea coloniei (mm) zaharozei (% tulpini) 2-3 100 2-5 99 2-3 100 2-3 100 2-4 100 2-5 1 0-3 > 90 1

0

2-3 0-1 variabilă

97 variabilă 0 80

Culoarea coloniilor galbenă galbenă galbenă galbenă galbenă verde galbenă

bună bună bună bună poate fi slabă bună variabilă

verde

variabilă

galbenă transparente verde

bună variabilă variabilă

Creştere

CAPITOLUL 9 IZOLAREA ŞI IDENTIFICAREA GENULUI CAMPYLOBACTER DIN ALIMENTE 9.1. Caractere generale Genul Campylobacter conţine 25 de specii, iar dintre acestea cea mai importantă specie izolată din alimente este Cam. jejuni subsp. jejuni. Spre deosebire de Cam. jejuni subsp. doylei este rezistentă la cefalotin, creşte la 42°C şi reduce nitraţii în nitriţi. Diferenţierea de Cam. coli constă în capacitatea de a hidroliza hipuratul. Genul Campylobacter este strâns înrudit cu genul Arcobacter. Campilobacteriile au fost clasificate în trecut ca specii Vibrio. Din punct de vedere morfologic Cam. jejuni este un bacil subţire în formă de virgulă sau litera „S”. Se pot întâlni şi forme mai lungi, multispiralate, cât şi scurte, cocoide. Este monoflagelat, iar flagelul poate fi dispus la unul sau la ambii poli ai celulei bacteriene. Produce oxidază şi catalază şi nu se dezvoltă la 25°C, în prezenţă de NaCl 3,5%. Este microaerofil, necesitând pentru creştere cantităţi mici de oxigen (3-6%). Temperaturile minime, optime şi maxime de creştere pe mediile solide sunt de 30°C, 40°C şi respectiv 45°C. Se dezvoltă bine la un pH între 5,5-8,0 şi în prezenţă de NaCl 1,75%. Creşterea este inhibată de oxigen 21%. Dioxidul de carbon 10% este necesar pentru creşterea bacteriană. Metabolismul este respirator. Datorită dimensiunilor lor mici, campilobacteriile pot fi separate de alte bacterii Gram negative folosind filtre de 0,65 microni. Campilobacteriile cresc mai lent pe mediile de cultură decât enterobacteriaceele. De obicei, nu sunt asociate cu mediul înconjurător ci cu animalele homeoterme. S-a dovedit că majoritatea animalelor de carne conţin aceste microorganisme în fecale, în special păsările de casă. Cel puţin câteva tulpini de Cam. jejuni produc o enterotoxină termolabilă asemănătoare cu enterotoxinele produse de Vibrio cholerae şi Escherichia coli. Producţia maximă de toxină într-un mediu special are loc la 42°C, în 24 de ore şi sporeşte prin adăugarea de polimixină. Simptomele toxiinfecţiilor provocate de aceste microorganisme includ durere sau crampe abdominale, diaree, disconfort, cefalee, febră. Perioada de incubaţie este de obicei de 48-82 de ore, dar poate ajunge şi la 7-10 zile, organismul putând fi detectat chiar şi după două luni de la încetarea simptomelor. Enteritele campilobacteriene sunt de origine alimentară în proporţie de 90%. Cam. jejuni, ca şi Vibrio parahaemolyticus şi Yersinia enterocolytica sunt bacterii ce se distrug uşor la temperatura de pasteurizare a laptelui. Campilobacteriozele pot fi prevenite prin prepararea termică a alimentelor de origine animală, în special a laptelui şi a cărnii de pui. 81

9.2. Prepararea probelor 1. Bucăţi de carne, moluşte, picioare de broască. Se amestecă 25 g de probă alimentară cu 100 ml de bulion de îmbogăţire cu soluţia numărul 1 de antibiotice, într-un sac cu filtru Stomacher, timp de 3 minute. Proba se recoltează cu ajutorul unei pense sterilizate prin alcool flambare sau unui cleşte steril. Dacă proba este reprezentată de o carcasă întreagă sau dacă este sângerândă sau foarte grasă se clăteşte 3 minute cu peptonă 0,1% la un raport probă/bulion de 1/6. Se îndepărtează grăsimea prin filtrare, printr-un tifon steril. Se centrifughează timp de 10 minute la 4°C. Se îndepărtează supernatantul şi se resuspendă depozitul în 5 ml de peptonă 0,1%. Se obţine diluţia 1/10 dintr-un ml de sediment şi 9 ml de peptonă 0,1%. Se striază în plăci Petri cu agar de izolare. Se incubează 24-48 de ore la 42°C, într-o atmosferă microaerofilă. 2. Produse lactate. a) Lapte şi cremă de îngheţată. Se determină şi la nevoie se reglează pH-ul probei la 7,6. Pentru probele de lapte nefiert se elimină etapa de preîmbogăţire. În cazul probelor lactate procesate se utilizează o etapă de preîmbogăţire, care durează 4 ore. Se cântăresc 2 porţii de câte 25 ml şi se centrifughează la 16.000 x g în condiţii de refrigerare, 40 de minute. Se îndepărtează supernatantul, se recoltează o ansă de sediment şi se amestecă cu 1 ml de peptonă 0,1%. Se pipetează 0,1 ml de suspensie de cultură emulsifiată într-un tub steril şi se adaugă 0,1 ml de tampon peptonă 0,1%. Se amestecă uşor şi se striază pe medii de izolare. Plăcile se incubează 24-48 de ore la 42°C, în condiţii microaerofile. b) Brânză şi unt. Se amestecă 2 probe de câte 25 g fiecare cu 100 ml de peptonă 0,1%, la 10.000-12.000 rpm, 30 de secunde. Se filtrează probele printr-un tifon steril şi se centrifughează în condiţii de refrigerare la 16.000 x g, timp de 40 de minute. Se îndepărtează supernatantul şi din sediment se fac însămânţări pe un agar de izolare. Se resuspendă un sediment în 100 ml de bulion de îmbogăţire ce conţine suplimentul de antibiotic nr. 1 şi un alt sediment se resuspendă în 100 ml de bulion de îmbogăţire ce conţine suplimentul antibiotic nr. 3. Se reglează pH-ul bulioanelor inoculate la 7,5. 3. Carne tocată sau organe. Se centrifughează 25 g de probă cu 100 ml de peptonă 0,1% la 10.000-12.000 rpm, 15 secunde, după care se centrifughează în condiţii de refrigerare la 2.000 x g timp de 2 minute. Se transferă supernatantul într-o altă cupă de centrifugă sterilă şi se centrifughează la 5.000 x g pentru 30 minute. Se îndepărtează supernatantul. Se resuspendă sedimentul în 2 ml de peptonă 0,1% şi se prepară o diluţie de 1/10 folosind 0,1 ml suspensie şi 0,9 ml peptonă 0,1%. Se striază în plăci Petri pe agarul de izolare. Se incubează la 42°C, 24-48 de ore, într-o atmosferă microaerobă. Sedimentul rămas se introduce în 100 ml bulion. Pentru a crea o atmosferă microaerofilă pentru creşterea optimă a campilobacteriilor 82

se utilizează una dintre următoarele metode de producere de gaze: • sistemul de gaz cu bule fluent: o se poate folosi o baie marină cu agitator care poate fi reglată la 3 temperaturi (pentru procedura de preîmbogăţire de 5 ore) sau la 2 temperaturi (pentru procedura de 4 ore); incubarea cu agitator este preferabilă deoarece stimulează o rată de creştere mult mai rapidă; se reglează baia la 30°C şi se plasează sacii Stomacher; se conectează pipete la liniile de barbotare şi se începe producţia de gaze; viteza agitatorului se reglează la 50 rpm; se incubează 3 ore; se reglează temperatura la 37°C şi se incubează 2 ore; în final se reglează temperatura la 42°C şi se incubează 19 ore; o dacă se folosesc preîmbogăţiri timp de 5 ore, în baie de apă statică, probele îmbogăţite se incubează într-o primă etapă la 30°C pentru 3 ore, fără barbotare deoarece bulionul devine anaerob şi va fi stimulată creşterea clostridiilor; probele îmbogăţite se transferă într-o baie de apă la 37°C şi se conectează pipetele din saci la liniile de barbotare; începe formarea gazelor; după 2 ore se reglează la 42°C; o dacă se utilizează o preîmbogăţire de 4 ore, sacii se plasează într-un agitator sau într-o baie marină statică la 37°C; se conectează liniile de barbotare şi începe producerea gazului; după 4 ore instalaţia se reglează la 42°C şi se incubează încă 20 de ore; • sistemul de agitare (incubator cu aer): o dacă se foloseşte procedura de preîmbogăţire de 4 ore, se începe incubarea la 37°C, după care se reglează temperatura la 42°C şi se incubează 20 de ore; o dacă se foloseşte procedura de preîmbogăţire de 5 ore, se plasează sticlele gazate într-un incubator cu agitator la 30°C şi se începe agitarea la 200 rpm; după 3 ore se ajustează temperatura la 37°C; după 2 ore se reglează la 42°C şi se incubează 19 ore; • sistemul de vase gazate: o dacă se foloseşte procedura de preîmbogăţire de 5 ore vasele se introduc într-un incubator la 30°C, pentru 3 ore, iar apoi se transferă la 37°C, timp de 2 ore, şi în cele din urmă la 42°C, timp de 19 ore; o dacă se foloseşte procedura de preîmbogăţire de 4 ore, vasele se incubează la 37°C, 4 ore şi apoi la 42°C, 20 de ore. 9.3. Izolarea speciilor de Campylobacter Se striază mediul de izolare dintr-o placă Petri cu o ansă de cultură bacteriană din mediul de îmbogăţire. Probele de lapte (aproximativ 3 ml) se trec prin filtre de 0,65 microni. Este suficient un filtrat de 0,25-0,5 ml. Se însămânţează atât culturile filtrate cât şi cele nefiltrate. Plăcile se plasează în vasele de gazare şi se incubează la 42°C, timp de 24 de ore. Dacă după 4 ore de incubare cultura bacteriană nu se dezvoltă, 83

aceasta se reincubează 48 de ore la 37°C. 9.4. Identificarea speciilor de Campylobacter Coloniile tipice de Campylobacter sunt rotunde sau de formă neregulată, de culoare albă până la incolor cu marginile netede. Se aleg cel puţin 2 colonii per placă şi se emulsifiază pe o lamă de sticlă într-o picătură de ser fiziologic. Se acoperă cu o lamelă şi se examinează la un microscop cu câmp întunecat sau cu ulei la un microscop cu contrast de fază. Celulele de Campylobacter sunt curbe cu lungimea de 1,5-5 microni, ce execută mişcări în zigzag dacă preparatul este făcut din medii solide sau mişcări în tirbuşon în cazul celulelor din bulion. Aproximativ 20% din izolatele de Cam. jejuni nu sunt mobile. Celulele bătrâne sau stresate pot prezenta o mobilitate diminuată şi o formă cocoidă. Dacă este necesară resuscitarea plăcilor, acestea se păstrează la 4°C, într-o atmosferă microaerofilă, ferită de lumină. 9.5. Confirmarea campilobacteriilor Se recoltează aproximativ 5 colonii caracteristice. Se transferă 2 colonii bacteriene în sticle cu bulion de confirmare. Se incubează la 42°C, într-o atmosferă microaerofilă 24 de ore, până când bulionul devine tulbure. Pentru inocularea substanţelor biochimice se folosesc culturi în bulion simplu, iar dacă cultura respectivă nu se dezvoltă bine în acest mediu, se folosesc bulioane, cu ser bovin fetal. Se studiază următoarele proprietăţi: • producţia de catalază: se recoltează o colonie pozitivă şi se testează; prezenţa bulelor arată că testul este pozitiv; • sensibilitatea la antibiotice: se inoculează uniform cu un tampon steril imersionat în cultura în bulion, suprafaţa unei plăci Petri cu agar infuzie de inimă, cu 5% sânge integral (sau lizat) şi FBP 0,25%; se aplică un disc de cefalotină şi unul de acid nalidixic; se incubează la 37°C, timp de 24-48 de ore, într-o atmosferă microaerofilă; se măsoară zonele de inhibiţie din jurul fiecărui disc; majoritatea tulpinilor de Cam. jejuni sunt sensibile la acid nalidixic şi rezistente la cefalotină; • coloraţia Gram: se foloseşte carbol-fuxină pentru coloraţia de contrast; speciile de Campylobacter sunt Gram negative; • hidroliza hipuratului: se însămânţează într-o eprubetă cu soluţie de hipurat o colonie mare de pe placa cu agar infuzie de inimă (folosit la testul de sensibilitate la antibiotice); se incubează 2 ore la 37°C într-o baie marină; se adaugă 0,5 ml de reactiv minhidrină, se agită şi se incubează 10 minute; tuburile se citesc rapid, o culoare violet închis indică o reacţie pozitivă; Cam. jejuni este pozitiv pentru acest test; • agar TSI: se inoculează mediul TSI şi se incubează la 35-37°C timp de 5 zile, în atmosferă microaerobă; Cam. jejuni produce o pantă şi o bază alcalină, fără 84

producţie de hidrogen sulfurat; • utilizarea glucozei: se însămânţează de 3 ori cu cultura de testat, 2 tuburi cu mediu fermentativ oxidativ; un tub conţine glucoză, iar celălalt numai bază; se incubează la 35-37°C, timp de 4 zile, într-o atmosferă microaerofilă; speciile de Campylobacter nu utilizează glucoza sau alte zaharuri; • testele de catalază şi oxidază: se inoculează din culturi în bulion o pantă de agar cu infuzie de inimă şi se incubează la 35-37°C, 48 de ore într-o atmosferă microaerofilă; se recoltează o ansă de cultură de pe pantă şi se plasează într-o picătură de peroxid de hidrogen 3%; se adaugă o picătură de oxidază; dacă reactivul devine purpuriu, cultura este considerată oxidază pozitivă; Cam. jejuni este catalază şi oxidază pozitiv; • toleranţa la temperatura de creştere: se diluează 2 ml din cultura în bulion cu peptonă 0,1%, până la turbiditatea standard Mc Farland nr. 1; se striază o linie în fiecare dintre cele 3 plăci cu agar-sânge şi infuzie de inimă FBP cu o ansă de cultură diluată; în fiecare placă se pot inocula 4 culturi; se incubează o placă la 25°C, una la 35-37°C şi a treia la 42°C, pentru 3 zile într-o atmosferă microaerofilă; dacă se produce o turbiditate accentuată în mediul de cultură, înseamnă că testul este pozitiv; Cam. jejuni nu creşte la 25°C, dar se dezvoltă la 35-37°C şi la 42°C; • creşterea pe agar Mac Conkey: se însămânţează o ansă din cultura în bulion pe agarul Mac Conkey; pot fi testate pe aceeaşi placă, până la 4 culturi diferite; se incubează la 35-37°C, 3 zile, în condiţii microaerofile; Cam. jejuni se dezvoltă pe agarul Mac Conkey; • teste biochimice pe medii semisolide: mediul semisolid conţine bulion Brucella, cu agar 0,18%; se aplică 0,1 ml de cultură diluată pe suprafaţa mediului şi se incubează 5 zile; o creşterea în glicină 1%: Cam. jejuni este pozitiv; o creşterea în NaCl 3,5%: Cam jejuni este negativ; o producerea de H2S din cisteină: se inoculează mediul cu bacteria de cercetat şi se introduce pe lângă dopul eprubetei o bandă de hârtie de filtru îmbibată cu acetat de plumb la aproximativ 1-2 cm distanţă de mediu: înnegrirea benzii reprezintă reacţia pozitivă; Cam jejuni înnegreşte banda în porţiunea de deasupra mediului; o reducerea nitratului: înroşirea coloniilor după adăugarea reactivilor de nitrit este considerată reacţie pozitivă; Cam. jejuni reduce nitraţii în nitriţi.

85

86

+ + +

-

-

+

+

+

+

+

-

+

S

R

NaCl 3,5 %

H2S, TSI

Catalază

Oxidază

Mac Conkey

Mobilitate

Creşterea în 1% glicină

Utilizarea glucozei

Hidroliza hipuratului

Rezistenţa la acid nalidixic

Rezistenţa la cefalotin

Cam. jejuni

25°C 35-37°C 42°C Reducerea nitratului:

Creşterea la:

Caractere biochimice

R

S

-

-

+

+

+

+

+

+

-

+ + +

Cam. coli

R

R

-

-

+

+

+

+

+

-

-

+ + +

Cam. lari

S

R

-

-

+

+

+

+

+

-

-

+ + + +

S

S

-

-

+

+

-

+

+

-

-

+ + +

S

S

-

-

+

+

-

+

+

-

-

+ + -

Cam. fetus Cam. Cam. subsp. cinaedi fennelliae fetus

S

S

-

-

-

+

-

+

+

-

-

+ + +

Cam. cryaerophilus

Diferenţierea speciilor de Campylobacter

S

R

-

-

+

+

+

+

+

+

-

+ + + +

S

S

-

-

+

+

-

+

-

-

-

+ + +

Cam Cam. hyointestinalis upsaliensis

Medii selective pentru Campylobacter Mediul

Componenta bazală (nutritivă)

Componenta selectivă

Aspectul coloniilor

Skirow

Vancomicină Agar Columbia Trimetoprim – sânge de cal Polimixină

- 1-2 mm - semitransparente - rotunde, bombate - suprafaţă umedă - tendinţă de a se întinde pe striuri

Butzler

Agar Columbia – sânge defibrinat Novobiocină de cal

- 1-2 mm - semitransparente, gri-metalic, strălu- citoare - rotunde - nehemolitice

Blaser-Wang

Vancomicină Agar Columbia Trimetoprim – sânge de berbec Cephalothin ori sânge de cal Amfotericină B Polimixină B

- 1-2 mm - semitransparente, gri, umede - rotunde, de mărimi diferite - nehemolitice

Campy-ic

Vancomicină Agar nutritiv Cam- Rifampicină pylobacter sânge Cefalotin de berbec 7-10% Trimetoprim Colistin

- 1-2 mm - rotunde, bombate - de culoare gri-castaniu - cu tendinţa de a se întinde pe striu

Cefoprazonă Agar Columbia Campylosel Colistin – sânge de berbec (bio-Mérieux) Vancomicină 5% Amfotericină B Polimixină B Rifampicină Trimetoprim Cicloheximidă

Preston

Agar de bază Campylobacter – sânge de cal

Karmali

Hemină Piruvat de Na Agar Columbia Cefoperazonă – cărbune activat Vancomicină Cicloheximidă

CCDA

Agar nutritiv cărbune activat Hidrolizat de Cefoperazonă cazeină Amfotericină B Sulfat feros Piruvat de Na 87

- 1-2 mm - translucide - plate, cu margini neregulate - cu tendinţă de întindere pe striu - nehemolitice - 1 mm - semitransparente - preponderent rotunde - 3-5 mm - semitransparente - mucoase - de formă neregulată cu tendinţă de a se întinde pe striu - 2-3 mm - semitransparente - polimorfe, rotunde - deseori mucoide

Campylobacter jejuni. Frotiu din cultură de pe mediu solid. Bacili în formă de virgulă sau litera “S”, dar şi forme mai lungi, cât şi scurte cocoide

Campylobacter fetus. Hemocultură. Coloraţia Gram. Se remarcă prezenţa bacteriilor poliforme cu predominanţă a formelor încurbate, în formă de “S” sau spiralate

Campylobacter fetus. subsp. intestinalis. Agar cu sânge 88

Campylobacter sp. Agar cu sânge Campy

Campylobacter jejuni. Microscopie electronică Flageli bipolari

Campylobacter fetus. Agar tioglicolat

Campylobacter jejuni

Campylobacter lari - rezistent; Campylobacter jejuni subsp. jejuni - sensibil. Scopul acestui test este acela de a determina sensibilitatea unui microorganism la acid nalidixic. Este de obicei folosit pentru identificarea lui Cam. lari. Discul cu acid nalidixic se plasează în centrul plăcii Petri şi se incubează, după însămânţare în condiţii microaerofile. Dacă apare o zonă de inhibiţie mai mare de 5-7 mm (măsurată de la marginea coloniilor) cultura respectivă este considerată pozitivă.

Campylobacter sp. Agar Campy. 89

Hidroliza hipuratului de sodiu Acest test este folosit pentru a determina dacă un microorganism poate hidroliza hipuratul de sodiu în acid benzoic şi glicină prin acţiunea enzimei hidrolază hipurat. După inoculare, mediul cu 1% hipurat de sodiu în apă distilată este incubat la 37ºC, 2 ore. Se adaugă soluţia de ninhidrină şi se incubează 10 minute. Acest test nu asigură condiţii de creştere microorganismelor, dar detectează prezenţa enzimei formate prin testarea produsului final de hidroliză (glicină). Dacă glicina este prezentă se formează un complex colorat în albastru. 1. Reacţie pozitivă: Campylobacter jejuni 2. Reacţie negativă: Campylobacter coli

Testul hidrogenului sulfurat Acest mediu se foloseşte pentru determinarea posibilităţii unui microorganism de a utiliza metabisulfitul pentru a produce hidrogen sulfurat. Este folosit de obicei, pentru a diferenţia speciile de Campylobacter termofile. Reacţia pozitivă se traduce prin înnegrirea mediului în jurul inoculului 1. Mediu neinoculat. 2. Reacţie pozitivă: Campylobacter lari. 3. Reacţie negativă: Campylobacter jejuni subsp. jejuni biotype I.

90

CAPITOLUL 10 DETERMINAREA PREZENŢEI ŞI A NUMĂRULUI DE BACTERII DIN SPECIA CLOSTRIDIUM PERFRINGENS 10.1. Caractere generale Genul Clostridium face parte din familia Clostridiaceae şi cuprinde peste 180 de specii, sporogene, în general mobile, cu flagelii dispuşi peritrich. Speciile care produc toxiinfecţii alimentare sunt reprezentate de Clostridium perfringens (Clostridium welchii) şi Clostridium botulinum. C. perfringens provoacă una dintre cele mai frecvente tipuri de toxiinfecţii alimentare. Morfologic, este un bacil scurt şi gros, cu capetele retezate, dispus în perechi sau în lanţuri scurte, capsulogen, necilogen, sporogen. Sporul este oval, dispus subterminal sau central. C. perfringens îşi manifestă patogenitatea prin virulenţă şi toxigeneză. Exotoxina este o proteină cu structură complexă. Până în prezent s-au studiat 14 factori numiţi toxine sau antigene, minore şi majore. Dintre acestea, patru sunt toxine letale, majore (alfa, beta, epsilon, iota), pe care se bazează încadrarea tulpinilor de C. perfringens în tipurile toxigene A, B, C, D şi E. Alte zece sunt toxine minore, care pot avea sau nu rol în patogenitate, precum şi enterotoxina responsabilă de toxiinfecţiile alimentare. Enterotoxina acţionează asupra enterocitelor, alterând permeabilitatea mucoasei intestinale. Are o acţiune parasimpaticomimetică. În intestin, pe lângă creşterea permeabilităţii vasculare, stimulează şi activitatea glandulară. Produce o hipersecreţie exocrină a pancreasului. Asupra pielii are efect eritematogen, fenomen folosit ca test în determinările cantitative ale enterotoxinei, considerat de 1000 de ori mai sensibil decât testul ansei ligaturate. Toxinele de Clostridium perfringens tipurile A şi C C. perfringens

Toxine α

Tipul A (termosensibil) +++ Tipul A (termorezistent) ± Tipul C (termorezistent) + * sursa: B. C. Hobbs, 1962

β

γ

δ

ε

φ

ι

κ

λ

μ

ν

+

+

-

-

++ -

-

++ +/-

-

+/+++/-

+ +

Câteva tulpini din tipul C produc enterotoxine şi pot cauza intoxicaţii alimentare. Tulpinile clasice care produc toxiinfecţii diferă de tulpinile din tipul C, prin faptul că nu produc beta toxină. În tabelul 11.1 sunt comparate tulpinile din tipul A şi din tipul C, pe baza termorezistenţei. Tipul A de tulpini termorezistente produce toxine teta, 91

cum ar fi perfringolizina O (PLO), o hemolizină tiol activată, similară cu listeriolizina O (LLO) produsă de Listeria monocytogenes. LLO şi PLO au o greutate moleculară de 60 Kda. Tulpinile de C. perfringens izolate din toxiinfecţiile alimentare se găsesc în sol, apă, diverse alimente (carne de pui crudă sau fiartă, legume crude, supe deshidratate, condimente), praf, precum şi în tractul intestinal al omului şi animalelor. C. perfringens se poate găsi chiar şi în carnea fiartă deoarece la temperatura de fierbere sunt distruse numai formele vegetative, iar sporii termorezistenţi pot să supravieţuiască, să germineze şi să se multiplice în alimentele incorect refrigerate. Prezenţa mai multor sute de mii de celule per gram de aliment justifică un diagnostic de toxiinfecţie alimentară cu C. perfringens când este verificat prin investigaţii clinice şi epidemiologice. Proba trebuie manipulată cu grijă, deoarece refrigerarea sau congelarea poate avea ca rezultat o reducere semnificativă a populaţiei de celule de C. perfringens. Transportul probelor la laborator. Probele se transportă şi se examinează rapid, fără congelare, ţinându-se la 10°C, până la examinare. Dacă analiza nu se poate realiza în decurs de 8 ore, iar proba trebuie transportată la laborator, aceasta se tratează cu soluţie salină, glicerinată, tamponată. Se foloseşte o tehnică aseptică pentru prepararea probei în vederea păstrării sau a transportului. O porţiune de 25 de grame de probă se transferă într-un sac de plastic. Se adaugă 25 de mililitri de soluţie salină glicerinată, tamponată şi se elimină aerul din sac. Probele lichide, cum ar fi: sosurile sau sucurile de carne, trebuiesc amestecate bine cu un volum egal de soluţie fiziologică glicerinată, tamponată, de concentraţie dublă. Probele tratate cu glicerină se păstrează de la -20°C la -32°C într-un congelator sau cu gheaţă uscată, astfel încât congelarea să se producă cât mai rapid. Pentru analiza în laborator, probele se decongelează şi se transferă împreună cu soluţia fiziologică salină glicerinată, într-un blender steril. Se adaugă 200 mililitri de peptonă diluată şi se începe examinarea. Aparatură şi materiale.  blender de înaltă viteză şi vase de sticlă sau metal de 1 litru cu capac;  jar anaerob, BBL, Gas Pak sau Oxoid;  incubator 35°C;  numărător de colonii, Quebec sau echivalent;  pipete serologice de 1 mililitru cu gradaţii de 0,1 mililitri şi pipete de 10 mililitri cu gradaţii de 1 mililitru;  plăci Petri sterile, 15 x 100 milimetri;  ansă de platină, 3 milimetri. Medii şi reactivi.  TSC (triptoză-sulfit-cicloserină) (M85);  bulion cu ficat (M34);  bulion cu tioglicolat, cu sau fără resazurină; 92

 bulion cu lapte şi fier;  bulion cu lactoză şi gelatină;  bulion de sporulare;  mediul pentru mobilitate cu nitrat;  reagenţi pentru detectarea nitriţilor;  soluţia cu sare glicerinată;  reactivi pentru coloraţia Gram;  soluţie de albastru de bromtimol 0,04%. 10.2. Izolarea şi identificarea lui C. perfringens Identificarea acestei specii se bazează pe următoarele caracteristici principale:  morfologia specifică şi proprietăţile tinctoriale: bacil relativ scurt şi cu capetele tăiate drept, Gram pozitiv;  lipsa mobilităţii (marea majoritate a clostridiilor sunt mobile);  fermentarea tumultoasă şi acidifierea glucozei, lactozei şi zaharozei;  posibilitatea de a se multiplica la 45-47°C;  producerea de hidrogen sulfurat;  capacitatea de a liza hematiile de oaie şi de a produce lecitinază. Procedee de cultivare. Se execută frotiuri colorate Gram din proba alimentară. Se examinează pentru bacili Gram pozitivi mari. Tehnica determinării prezenţei şi a numărului de bacterii de C. perfringens direct de pe mediile solide: 1. În plăci Petri: Se amestecă într-un blender steril 25 de grame de probă alimentară cu 225 de mililitri de diluant cu peptonă şi se amestecă 1-2 minute la 10.000-12.000 rpm. Se prepară diluţii seriate de la 10­-1 la 10-6 prin transferul a 10 mililitri din diluţia anterioară în 90 de mililitri de diluant cu peptonă. Se toarnă 6-7 mililitri de agar TSC (triptoză-sulfit-cicloserină), fără gălbenuş de ou, în fiecare dintre cele 12 cutii Petri de 15 x 100 milimetri. Când agarul s-a solidificat se transferă aseptic 1 mililitru din fiecare diluţie de omogenat în duplicat în centrul fiecărei plăci Petri. Se adaugă 15 mililitri de agar TSC fără gălbenuş de ou şi se amestecă prin rotaţie uşoară. După ce agarul s-a solidificat, plăcile se plasează vertical într-un jar anaerob. Se stabilesc condiţiile de anaerobioză şi se plasează jarul la 35°C, 20-24 de ore. După incubare, se examinează plăcile pentru formarea de colonii negre. Se selectează plăcile care prezintă între 20 şi 200 de colonii negre. Se utilizează un numărător de colonii Quebec şi se calculează numărul de clostridii per gram de aliment. Se păstrează placa Petri pentru testele de identificare. 2. În eprubete: Se prepară bulionul cu ficat prin încălzire 10 minute, în apă clocotită sau cu vapori continui şi se răceşte rapid fără agitare. 93

Se toarnă în fiecare eprubetă inoculată agar TSC. Se omogenizează bine inoculul prin rotirea uşoară a eprubetelor în palme pentru a se evita formarea bulelor de aer. Se introduc într-un vas cu apă rece. Se toarnă apoi agar cu tioglicolat în fiecare eprubetă într-un strat de aproximativ 2 centimetri. Se introduc din nou eprubetele într-un vas cu apă rece pentru solidificarea rapidă a mediului de cultură. Se incubează 18-24 de ore, la 35°C. Se numără coloniile caracteristice, în eprubetele în care s-au dezvoltat între 5 şi 20. Teste de confirmare prezumptivă.  Prezenţa unor bacili Gram pozitivi, scurţi, cu capete tăiate drept, în frotiurile efectuate Gram, precum şi dezvoltarea unor colonii lenticulare în geloza Veillon (M5), cu zone de hemoliză în agarul Zeisler şi Willis-Hobbs se consideră prezenţă de C. perfringens.  Testul prezumptiv în lapte cu fier: se inoculează un mediu modificat de laptefier, cu 1 mililitru de cultură de tioglicolat lichid, cu creştere intensă şi se incubează la 46°C, în baie marină. După 2 ore, se verifică din oră în oră pentru fermentare puternică. Această reacţie se caracterizează printr-o coagulare rapidă a laptelui, urmată de transformarea cheagului într-o masă spongioasă, care de obicei se ridică la suprafaţă. Culturile care prezintă o fermentare puternică în decurs de 5 ore sunt considerate pozitive. Ocazional, o tulpină poate necesita chiar şi 6 ore sau mai mult pentru producerea fermentării, dar acesta este considerat un rezultat îndoielnic ce trebuie controlat prin alte teste de confirmare. Teste de confirmare definitivă. Se inoculează cultura bacteriană din mediul cu tioglicolat lichid sau o porţiune de colonie de pe agarul TSC, în mediile cu lactoză, gelatină şi mediul de mobilitate cu nitrat tamponate. Se perforează lactoza (gelatina) în mod repetat cu un ac drept pentru a ne asigura că inocularea este corectă şi se clăteşte ansa într-un pahar cu apă caldă, înainte de flambare pentru a evita spargerea. Se incubează mediile inoculate 24 de ore la 15°C. Se examinează cultura de pe mediul lactoză-gelatină, pentru producerea de gaz şi pentru modificarea culorii din roşu în gălbui, ceea ce arată producţia de acid. Tuburile se răcesc o oră la 5°C şi se controlează pentru lichefierea gelatinei. Dacă mediul nu se gelatinizează, se mai incubează 24 de ore, la 35°C şi se controlează din nou. Se inoculează bulionul de sporulare cu 1 mililitru de cultură de mediu tioglicolat lichid şi se incubează 24 de ore la 35°C. Se efectuează un frotiu colorat Gram, şi se examinează microscopic pentru spori. Culturile sporulate se păstrează la 4°C, dacă se doreşte efectuarea în continuare a testării izolatelor. C. perfringens nu este mobil. Se examinează tuburile cu mediul de mobilitate cu nitrat, în lumină transmisă pentru tipul de creştere de-a lungul liniei de însămânţare. Microorganismele imobile cresc numai în şi de-a lungul acestei linii, iar cele mobile produc o creştere difuză în mediu. Reducerea nitraţilor în nitriţi: Se adaugă 0,5 mililitri de reactiv A şi 0,2 mililitri de reactiv B, la o cultură dintr-un mediu de mobilitate cu nitrat tamponat. Culoarea 94

violetă dezvoltată în decurs de 5 minute arată prezenţa nitriţilor. Dacă nu apare nici o culoare se adaugă câteva granule de pulbere de zinc şi se lasă în repaus câteva minute. Un test negativ (neapariţia culorii violet) după adăugarea prafului de zinc, arată că nitraţii au fost reduşi complet. Un test pozitiv (apariţia culorii violet) indică faptul că microorganismul este incapabil să reducă nitraţii. Rezultatele se înregistrează în tabele. C. perfringens este identificat prezumptiv, ca bacil Gram pozitiv, ce produce colonii negre în agar TSC, reduce nitraţii în nitriţi, fermentează lactoza, cu eliberare de acid şi gaz şi lichefiază gelatina după 48 de ore. Este de aşteptat ca unele tulpini să producă reacţie pozitivă în mediul de sporulare. Microorganismele suspecte, care nu îndeplinesc însă criteriile menţionate se vor testa în continuare. Se execută subculturi din izolatele care sunt non-motile, reduc nitratul, fermentează lactoza, cu producere de acid şi gaz şi lichefiază gelatina în 48 de ore, într-un mediu lichid cu tioglicolat. Se incubează 24 de ore la 35°C şi se efectuează un frotiu colorat Gram şi se controlează pentru puritate şi pentru morfologia celulară tipică. De cele mai multe ori bacteriile din alimente se găsesc în stare latentă. Activarea lor se face mai greu în medii solide, motiv pentru care produsul de cercetat se inoculează mai întâi în medii lichide, în care se realizează nu numai revigorarea germenilor, dar şi înmulţirea acestora. Din produsul omogenizat şi din fiecare diluţie se inoculează câte un mililitru în câte o eprubetă cu bulion cu ficat sau bulion cu tioglicolat, cu sau fără resazurină sau cu bulion-glucoză-amidon-cistină. Dacă se urmăreşte prezenţa lui C. perfringens într-o cantitate mai mare de produs (10, 100 grame) se vor folosii volume mai mari de mediu. În general, proporţia între inocul şi mediu trebuie să fie de 1/5-1/10. Mediile inoculate se incubează la 45°C, 24 de ore şi se observă din oră în oră, începând cu a cincia oră de incubare. În momentul apariţiei primelor bule de gaze se fac treceri prin striere pe mediile Zeisller sau Willis-Hobbs turnat şi solidificat în plăci Petri. Acestea se incubează la 45°C, 24-48 de ore. Se citeşte rezultatul prin observarea coloniilor specifice pentru C. perfringens. Pe mediul Zeisller, C. perfringens formează colonii mari, netede, lucioase, uşor bombate, opace, uneori pigmentate în verde, înconjurate de o zonă de hemoliză beta şi de o zonă mai mare de hemoliză incompletă. Pe agarul Willis-Hobbs formează colonii roşii (fermentarea lactozei) înconjurate de un halou opac (activitatea lecitinazică).

95

Clostridium perfringens. Microscopie electronică. Se remarcă celule cu spori dispuşi subterminal şi aspect caracteristic de sticlă de lampă de petrol sau de barcuţă

Clostridium perfringens. Coloraţia Gram.

Clostridium perfringens. Coloraţia Gram.

Clostridium perfringens. Agar cu gălbenuş de ou. Se remarcă apariţia unui precipitat alb. Sursa: CDC/Dr. Stuart E. Starr (PHIL #3873), 1971

Clostridium perfringens. Se remarcă producţia de lecitinază în placa din stânga. În dr., test negativ

Testul CAMP. Săgeata indică cultura de Clostridium perfringens. 96

Clostridium perfringens. Mediul TSC. Se remarcă prezenţa coloniilor negre. Clostridium perfringens. Mediul lapte-fier. Coagulare rapidă, cu cheag spongios.

Clostridium perfringens. Agar VL.

Clostridium perfringens. Mediul TSC. Se remarcă colonii negre.

97

CAPITOLUL 11 IZOLAREA ŞI IDENTIFICAREA SPECIEI CLOSTRIDIUM BOTULINUM DIN ALIMENTE 11.1. Caractere generale Clostridium botulinum este un germen strict anaerob, cu temperatura optimă de dezvoltare în funcţie de grupa metabolică. Din punct de vedere morfologic este un bacil mare, drept sau uşor încurbat, flagelat peritrich, necapsulogen, Gram pozitiv. Este sporogen, cu sporul oval, situat subterminal, ce deformează celula vegetativă sub formă de „sticlă de lampă de petrol” sau de „bărcuţă”. Clostridium botulinum a fost izolat pentru prima dată de către Van Ermengem (1896) dintr-un jambon alterat, care a provocat 23 de îmbolnăviri, denumindu-l Bacillus botulinum (lat. botulus = cârnat). Landmann (1904) izolează la Darmstadt, pentru prima dată pe C. botulinum, din alimentele de origine vegetală (salată sau fasole conservată). Au fost identificate 7 tipuri de toxine, notate cu literele mari ale alfabetului A, B, C, D, E, F, G, care determină sindroame identice, dar nu pot fi neutralizate decât de antitoxina omoloagă. Tipul A a fost considerat biotipul toxigenic izolat de către Ermengem. Tipul B a fost izolat de către Leuch (1910), fiind evidenţiat pe tot globul, în sol, precum şi în intestinul de porc (botulus). Tipul C identificat de către Bergston (1922) a fost izolat mai ales de la păsări, animale mici, şobolani, pisică. Tipul D a fost izolat, atât din sol, apă, vegetale, cât şi de la bovine şi ecvine. Tipul E a fost izolat exclusiv de la peşti, tipul F, din pateul de ficat, iar tipul G numai din sol. Tipul F elaborat de către Clostridium baratii produce o neurotoxină similară antigenic, dar nu identică cu tipul E, produs de către Clostridium butyricum. Pe baza caracterelor metabolice, cele 7 biotipuri au fost clasificate în 4 grupe:  Grupa I, care include tipul A şi tulpinile proteolitice ale tipurilor B şi F;  Grupa a II-a cu tipul F şi tulpinile glucidolitice ale tipurilor B şi F;  Grupa a III-a cu tipurile C şi D;  Grupa a IV-a cu tipul G. Cele 7 tipuri de Clostridium botulinum produc toxine distincte antigenic, deşi evoluţia clinică este identică. În cadrul tipului C se disting 2 subtipuri diferite antigenic, C alfa (patogen pentru păsări) şi C beta (patogen pentru mamifere). Între tipul A şi D există înrudiri antigenice, serul specific tipului D, fiind capabil să neutralizeze toxina de tip A. 98

Toxina botulinică este o neurotoxină, fiind considerată împreună cu tetanospasmina, cele mai puternice otrăvuri din natură. S-a stabilit că 198,422 de grame de toxină ar fi suficiente pentru a distruge viaţa pe toată suprafaţa globului. Este compusă dintr-o fracţiune toxică (neurotoxina) şi mai multe fracţiuni netoxice, care includ şi o hemaglutinină. Se absoarbe pe cale digestivă, o dată cu hrana sau cu apa contaminate ca şi proteinele din ingesta, având un neurotropism exclusiv. Ea blochează transmiterea influxului nervos în fibrele nervoase colinergice, prin inhibarea eliberării de acetilcolină la nivelul plăcilor neuromusculare ale nervilor motori, rezultând paralizia de tip flasc activitate similară cu a curarei, fără a fi identică. Toxina botulinică inhibă activitatea toxinei tetanice. Clostridium botulinum este larg distribuit în sol şi pe fundul oceanelor şi lacurilor. Detectarea tipului E în mediile acvatice înconjurătoare se corelează cu cazurile de botulism din acest tip, care au fost puse pe seama unor peşti contaminaţi. Tipurile A şi B sunt cel mai frecvent izolate din alimentele contaminate cu pământ. Materiale şi aparatură. 1. Frigider. 2. Prosoape uscate, curate. 3. Arzător Bunsen. 4. Deschizător de cutii de conserve steril bacteriologic. 5. Mojar cu pistil steril. 6. Forceps steril. 7. Pipete sterile cu dop de vată. 8. Dispozitiv mecanic de pipetare. 9. Tuburi de cultură sterile. 10. Jaruri anaerobe (Gas Pak). 11. Anse de însămânţare. 12. Incubator. 13. Vase sterile de rezervă pentru probe. 14. Stative. 15. Lame microscopice. 16. Microscop cu contrast de fază sau în câmp luminos. 17. Plăci Petri sterile de 15 x 100 ml. 18. Tuburi de centrifugă. 19. Centrifugă de înaltă viteză. 20. Seringi sterile de 1 sau 3 mililitri pentru injectarea şoarecilor. 21. Şoareci (15-20 g). 22. Cleşti pentru şoareci, etc. Medii şi reactivi. 1. Bulion cu ficat sau bulion cu carne (M4). 2. TPGY (bulion cu extract de drojdie, glucoză, peptonă, tripticază) sau TPGYT (cu tripsină) (M86). 99

3. Agar cu gălbenuş de ou şi ficat de viţel sau agar pentru anaerobi cu gălbenuş de ou (M87). 4. Soluţie alcoolică de iod (4% iod şi 70% etanol). 5. Fosfat de gel tamponat steril (pH 6,2) 6. Soluţie salină fiziologică sterilă. 7. Soluţie de hidroxid de sodiu. 8. Acid clorhidric. 9. Etanol absolut. 10. Soluţie de tripsină (preparată de Difco) 1:250. 11. Reactivi pentru coloraţia Gram. Prepararea probelor. Manipularea preliminară. Se refrigerează probele până la testare, cu excepţia conservelor nedeschise, care nu se refrigerează decât dacă se umflă foarte tare şi prezintă pericolul de a crăpa. În laborator containerul se curăţă şi se marchează cu un cod de identificare. Alimentele lichide şi solide. Se transferă aseptic alimentele cu puţin lichid sau fără într-un mojar steril. Se adaugă o cantitate egală de soluţie de gel fosfat tampon şi se fărâmiţează bine cu un pistil steril. Alternativ, se inoculează bucăţi mici din produs direct în mediul de îmbogăţire cu un forceps steril. Alimentele lichide se inoculează direct în mediul de cultură cu ajutorul unor pipete sterile. Se prepară şi o probă de rezervă. După cultivare se transferă aseptic porţia de rezervă într-un vas steril pentru testele ulterioare. 11.2. Detectarea lui C. botulinum viabil Îmbogăţirea. Se îndepărtează oxigenul dizolvat din mediul de îmbogăţire prin autoclavare 10-15 minute şi se răceşte rapid fără agitare înainte de inoculare. Se inoculează două tuburi de mediu cu carne fiartă cu 1-2 grame de aliment solid sau 1-2 mililitri de aliment lichid la 15 mililitri de bulion de îmbogăţire. Se incubează la 35°C. Se inoculează două tuburi de bulion TPGY ca mai sus. Se incubează la 26°C. Se foloseşte TPGYT, ca o alternativă numai atunci când microorganismul implicat este foarte suspect de a fi o tulpină neproteolitică a tipurilor B, E sau F. Introducerea inoculului în bulion se realizează foarte uşor. După 5 zile de incubare se examinează culturile pentru turbiditate, producţia de gaz şi digestia particulelor de carne, precum şi mirosul. Examinarea culturilor se poate realiza direct prin montare umedă cu contrast de fază de mare putere sau prin efectuarea unui frotiu colorat Gram în câmp luminos. Se studiază morfologia microorganismelor şi se notează existenţa unor celule clostridiale tipice, apariţia şi extinderea relativă a sporulării şi localizarea sporilor în celulele vegetative. În acest moment se testează fiecare cultură pentru prezenţa toxinei. De obicei, o perioadă de incubaţie de 7 zile reprezintă creşterea activă în care are loc producerea unei concentraţii maxime de toxină botulinică. Dacă 100

după 7 zile nu se remarcă nici un fel de creştere bacteriană în mediul de cultură aceasta se mai incubează încă 10 zile pentru detectarea unei germinări, eventual întârziată a sporilor. Pentru izolarea germenilor în culturi pure se păstrează la frigider o cultură de îmbogăţire în apogeul sporulării. Izolarea culturilor pure. C. botulinum se izolează mai rapid din flora mixtă a unei culturi bacteriene dintr-un mediu de îmbogăţire sau dintr-un specimen original. Tratamentul prealabil al probelor prin etalare. Se adaugă un volum egal de alcool absolut sterilizat prin filtrare la 1-2 mililitri de cultură într-un tub steril prevăzut cu capac cu şurub. Se amestecă bine şi se incubează o oră la temperatura camerei. Pentru izolare se iau 1-2 mililitri din porţia reţinută; se adaugă un volum egal de alcool absolut sterilizat prin filtrare, într-un tub steril cu capac înşurubat. Se amestecă bine şi se incubează o oră la temperatura camerei. Alternativ, se încălzesc 1-2 mililitri de probă pentru distrugerea celulelor vegetative (80°C, 10-15 minute). Nu se foloseşte tratamentul termic pentru tipurile non-proteolitice de C. botulinum. Etalarea în plăci Petri a culturilor tratate. Se însămânţează cultura bacteriană tratată termic într-un mediu de agar cu gălbenuş de ou şi ficat de viţel sau într-un mediu de agar anaerob cu gălbenuş de ou în vederea obţinerii de colonii izolate. Se incubează plăcile însămânţate la 35°C, 48 de ore în condiţii anaerobe. Selecţionarea coloniilor tipice de C. botulinum. Se selecţionează aproximativ 10 colonii tipice care pot fi proeminente sau plate, netede sau rugoase, de obicei cu o margine neregulată şi care prezintă o oarecare răspândire. Dacă sunt examinate în lumină oblică produc iridiscenţă pe un mediu cu gălbenuş de ou. Această zonă lucioasă este deseori denumită zonă perlată şi de obicei se extinde dincolo de conturul coloniei. În afară de zona perlată coloniile de C. botulinum ce aparţin tipurilor C, D, E sunt de obicei înconjurate de o zonă lată de 2-4 milimetri de precipitat galben. Coloniile produse de tipurile A şi B prezintă în general o zonă mai mică de precipitare. Tipul E de C. botulinum se inoculează în bulion TPGY. Celelalte tipuri de toxine se inoculează în bulion cu ficat mărunţit sau în bulion cu carne fiartă. Se incubează 5 zile. Se testează pentru producerea de toxine. Izolarea în cultură pură. Se reînsămânţează o cultură toxică în duplicat pe un mediu de agar cu gălbenuş de ou. Se incubează anaerob prima placă la 35°C, iar a doua aerob tot la 35°C. Dacă coloniile tipice apar numai în placa anaerobă, se consideră cultură pură. O transferare în serie prin etape suplimentare de îmbogăţire poate creşte numărul bacteriilor în măsură suficientă pentru a permite izolarea acestora. Cultura pură în stare sporulată se păstrează prin congelare pe perle de sticlă sau prin liofilizare. 11.3. Detectarea toxinei botulinice Prepararea probei alimentare. Se recoltează o porţiune de probă pentru detectarea bacteriilor viabile de C. botulinum şi o altă porţiune pentru testarea toxicităţii. Restul probei se păstrează la frigider. Se centrifughează probele ce conţin particule solide în suspensie sub refrigerare şi se utilizează supernatantul pentru determinarea toxinei. 101

Se extrag alimentele solide cu un volum egal de gel fosfat, tamponat la pH 6,2. Se utilizează cât mai puţin tampon pentru a evita diluarea toxinei după detectare. Determinarea toxicităţii în probele alimentare sau în culturi. Tratarea cu tripsină. Toxinele non-proteolitice necesită o activare cu tripsină pentru a putea fi detectate. Deoarece mediul TPGY conţine deja tripsină nu mai necesită alt tratament în acest sens pentru că ar putea avea loc degradarea unei toxine complet activată prezentă în cultură. Se ajustează pH-ul supernatantului la un pH de 6,2 cu NaOH 1N sau cu HCl. Se adaugă 0,2 mililitri de soluţie apoasă saturată de tripsină la 1,8 mililitri din fiecare supernatant ce urmează să fie testat pentru toxicitate (pentru prepararea soluţiilor de tripsină se plasează un gram de tripsină Difco 1/250 într-un tub steril de cultură şi se adaugă 10 mililitri de apă distilată după care se agită şi se încălzeşte în scopul dezvoltării). Preparatul tratat cu tripsină se incubează la 3537°C timp de o oră cu agitare uşoară. Testarea toxicităţii. Se efectuează teste paralele cu materiale tratate cu tripsină şi cu duplicate netratate. Se fac diluţii seriate la 1/2, 1/10 şi 1/100 dintr-o cantitate netratată de probă lichidă sau solidă, în gel fosfat tamponat. Se execută apoi aceleaşi diluţii din fiecare probă lichidă sau cultură tratată cu tripsină. Se injectează intraperitoneal fiecare din perechile separate de şoareci cu 0,5 mililitri de lichid nediluat şi netratat şi cu 0,5 mililitri din fiecare diluţie din proba netratată folosind o seringă de 1,0 mililitri sau 3,0 mililitri. Se repetă procedura cu probe duplicate tratate cu tripsină. Se încălzesc 1,5 mililitri de lichid supernatant netratat sau de cultură netratată timp de 10 minute la 100°. Proba încălzită se răceşte şi fiecare şoarece dintr-o pereche se injectează cu 0,5 mililitri de lichid nediluat. Este de aşteptat ca şoarecii să nu moară deoarece dacă toxina botulinică este prezentă, va fi inactivată prin încălzire. Toţi şoarecii se urmăresc periodic 48 de ore. Se înregistrează simptomele şi decesele. Semnele tipice de botulism încep de obicei, în primele 24 de ore, cu horipilaţie, respiraţie grea, slăbiciunea membrelor şi, în final paralizie, urmată de dispnee şi moarte prin insuficienţă respiratorie. Sfârşitul letal al şoarecilor nu constituie o dovadă suficientă că materialul injectat conţine toxină botulinică. Uneori moartea poate fi provocată chiar de substanţele chimice prezente în lichidul injectat sau de un traumatism.

102

CAPITOLUL 12 DETERMINAREA NUMĂRULUI DE DROJDII ŞI MUCEGAIURI DIN ALIMENTE 12.1. Scurtă prezentare a genurilor de drojdii şi mucegaiuri din alimente în ordine alfabetică Mucegaiurile sunt fungi filamentoşi care cresc sub forma unei mase încolăcite şi se răspândesc rapid putând acoperi o suprafaţă de mai mulţi centimetri în 2-3 zile. Masa totală este denumită miceliu. Un miceliu este format din ramuri sau filamente denumite hife. Cele mai importante se înmulţesc prin ascospori, zigospori sau conidii. Ascosporii unor genuri sunt importanţi pentru gradele lor extreme de termorezistenţă. Un grup formează picnidii sau acervuli (celule mici în formă de flacon, iar corpii de fructificare sunt conidiofori). Artrosporii rezultă din fragmentarea hifelor din unele grupe. În anii 1980 nu s-au produs modificari radicale in sistematica fungilor alimentari. Cele mai importante observatii se refera la descoperirea inmultirii sexuate sau perfecte a catorva specii si genuri binecunoscute. În această privinţă starea de ascomicet este considerată de micologi ca fiind starea reproductivă cea mai importantă a unor fungi, starea denumită teleomorfă. Numele de specie dat unei ciuperci teleomorfe are prioritate faţă de aceea de anamorfă (denumirea dată stării imperfecte sau conidiale). Termenul de holomorfă arată că ambele stadii sunt cunoscute, dar se foloseşte denumirea de teleomorfă. Poziţiile taxonomice ale genurilor descrise sunt rezumate mai jos: Diviziunea: Zygomycota Clasa: Zygomycetes (micelii aseptate, reproducere prin sporoangiospori, creştere rapidă). Ordin: Mucorales Familia: Mucoraceae Gen: Mucor Rhizopus Thamnidium Diviziunea: Ascomycota Clasa: Plectomycetes (miceliu septat, ascospori producători de asce în număr de 8). Ordin: Eurotiales Familia: Trichocomaceae Gen: Byssochlamys Emericella 103

Eupenicillium Eurotium Diviziunea: Deuteromycota (fungi imperfecţi, anamorfi, stadiile perfecte nu sunt cunoscute). Clasa: Coelomycetes Genul: Colletotrichum Clasa: Hypomycetes (hife producatoare de conidii). Ordinul: Hyphomycetales Familia: Moniliaceae Genul: Alternaria Aspergillus Aureobasidium (Pullularia) Botrytis Clodosporium Fusarium Geotrichum Helminthosporium Monilia/Sclerotinium Penicillium Stachybotrys Trichothecium Mai jos sunt prezentate câteva genuri implicate în microbiologia alimentelor, în ordine alfabetică: 1. Alternaria. Produc micelii septate cu conidiofori şi conidii cafenii mari. Conidiile au atât septuri transversale cât şi longitudinale prezentând forme variate. Ele produc putregaiul fructelor cu sâmburi, al merelor şi smochinelor. Putregaiul negru al citricelor este provocat, de asemenea, de specii sau tulpini ale acestui gen. Acesta este un fung de câmp care creşte pe grâu. Se poate găsi şi pe cărnurile roşii. Unele specii produc micotoxine. 2. Aspergillus. Produce lanţuri de conidii – în cazul în care se dezvoltă cleistoteci* cu ascospori stadiul perfect al celor găsiţi în alimente este Emericella, Eurotium sau Neosartorya. Eurotium (grupul A. glaucus) produce cleistoteci de culoare gălbui-deschisă, toate speciile fiind xerofile. E. herbariorum produce deteriorarea gelurilor şi a jeleurilor de struguri. Emericella produce cleistoteci albi, iar E. nidulans este teleomorfa speciei Aspergillus nidulans. Neosartorya produce cleistoteci albi şi ascospori incolori. N. fischeri este termorezistentă, iar rezistenţa sporilor săi este similară cu cea a (*) cleistoteci = ascocarp închis, cu ascii dispersate la întâmplare ascocarp= structură fungică de complexitate variabilă ce poartă asce şi ascospori. 104

celor de Byssochlamys. Aspergilii apar pe un număr mare de alimente, fiind pigmentaţi în galben-verde până la negru. Putregaiul negru al piersicilor, citricelor şi smochinelor constituie una din condiţiile de alterare a fructelor. Unele specii se găsesc şi pe şunca afumată de ţară sau pe slanină, iar altele produc alterarea uleiurilor de palmier, alune şi porumb. A. oryzae şi A. soyae sunt implicate în fermentaţii ale shogu şi koji. A. glaucus produce un produs de peşte fermentat Katsuobushi. Grupul A. glaucus - A. restrictus conţine fungi de depozitare care invadează seminţele, boabele de soia şi fasolea. A. niger produce β-galactozidază, glucoamilază, invertază, lipază şi pectinază, iar A. oryzae produce α-amilază. Iniţial, se produc colonii pseudolevurice. Mai târziu, se răspândesc şi produc pete negre. 3. Aureobasidium (Pullularia). A. pullulans (Pullularia pullulans) reprezintă specia cel mai frecvent izolată din alimente. Se pot găsi în crevete, sunt implicate în boala “petelor negre a cărnii de vită” conservată pe termen lung, fiind frecvente şi pe fructe şi legume. 4. Botrytis. Produc conidiofori lungi, subţiri şi adesea pigmentaţi. Miceliul este septat, conidiile sunt prezente pe celulele apicale, de culoare cenuşie sau neagră, iar uneori se produc sclerotii* neregulate. B. cinerea este cea mai frecventă specie găsită în alimente. Sunt importante pentru că produc mucegaiul gri al merelor, perelor, zmeurei, căpşunilor, strugurilor, merelor, citricelor şi a unor fructe cu sâmburi. 5. Byssochlamys. Acest gen este teleomorfa speciilor de Paecilomyces, dar acesta din urmă nu apare în alimente. Ascomicetul produce ciorchini de ascii deschise, fiecare cu 8 spori. Aceast gen este important pentru termorezistenţa sa, care are ca rezultat alterarea unor alimente consumate ce conţin mult acid. În timpul creşterii pot tolera valori potenţial reduse de oxidoreducere. Unele specii sunt producătoare de pectinaze, iar B. fulva si B. nivea alterează fructele conservate şi îmbuteliate. 6. Cladosporium. Produce hife septate cu conidii arborescente de culoare închisă, cu ramificaţii diverse. În cultură are o creştere catifelată, colorată în măsliniu, până la negru. Unele conidii au formă de lămâie. C. herbarum produce pete negre pe carnea de vită şi oaie congelată. Pot altera untul şi margarina, iar unele specii provoacă putregaiul restrâns al fructelor şi al strugurilor. Sunt fungi de câmp, care cresc pe grăunţele de orz şi grâu. C. herbarum şi C. cladosporiodes sunt speciile cel mai des întâlnite în fructe şi legume. 7. Colletotrichum. Fac parte din clasa Coelomycetes şi formează conidii în interiorul acervulilor. Formează conidiofori simpli elongaţi şi conidii hialine unicelulare ovoide sau dolice. Au formă de disc sau de pernă, ceroase şi în general de culoare închisă. C. gloeosporioides este specia care se găseşte în alimente; ea produce antracoză, în special pe fructele tropicale, ca mango şi papaya. (*) sclerotium (Ag) = un corpuscul de dimensiuni variabile format dintr-o masă indurată de hife cu sau fără ţesut gazdă prezentând o scoarţă de culoare închisă, din care se pot dezvolta conidiofori sau micelii. 105

8. Fusarium. Formează un miceliu închis, cu aspect de vată, cu nuanţe de roz, roşu, purpuriu sau cafeniu. Macroconidiile sunt septate, având formă fusiformă, până la falciformă (în formă de seceră). Produc putregaiul moale al smochinelor. Ca fungi de câmp, unele specii se dezvoltă pe grăunţele de orez sau grâu. Unele specii produc zearalenona, fumonizinele, trihotecenele. 9. Geotrichum (cunoscut în trecut ca Oidium lactis şi Oospora lactis). Aceşti fungi “yeast-like” sunt, de obicei, de culoare albă. Hifele sunt septate, iar reproducerea are loc prin formarea de artroconidii din hifele vegetative. Artroconidiile au extremităţile aplatizate. G. candidum, anamorfa speciei Dipodascus geotrichum este cea mai importantă specie din alimente. Este recunoscută şi sub denumirea de “ciuperca lactică”, pentru că ea conferă o aromă specifică multor tipuri de brânză şi “ciuperca de aparate” pentru că se dezvoltă pe echipamentul ce vine în contact cu alimentele, în fabricile de procesare ale acestora, în special în cele de conservare a tomatelor. Cauzează putregaiul acru al citricelor şi piersicilor şi altereză smântâna. Sunt larg răspândite putând fi găsite pe carne şi legume. Unele specii participă la fermentarea lui gari. 10. Monilia/Sclerotinium. Produce conidii roz, gri sau cafenii. M. sitophila este stadiul conidial al speciei Neurospora intermedia. Monilia este stadiul conidial al speciei Monilinia fructicola. Ele produc putregaiul cafeniu al fructelor cu sâmburi, ca de exemplu, piersicile. Monilina sp. provoacă mumificarea afinelor. 11. Mucor. Hifele sunt neseptate şi produc sporangiofori purtători de columelă cu sporangii la vârf. Membrii acestui nou gen nu produc rizoizi sau stoloni. Produc colonii vătoase, iar unele specii produc “whiskers” (mustăţi de pisică) la carnea de vită şi “puncte negre” ale cărnii la carnea de oaie congelată. Cel puţin o specie, M. miehei produce lipază. Se găseşte în alimente fermentate, smântână, legume. Unele specii fermentează zerul de soia. 12. Penicillium. Conidioforii şi conidiile sunt singurele structuri de reproducţie prezente, genul fiind plasat în clasa Deuteromycota. Sunt plasate între ascomicete, atunci când se formează cleistoteci* cu ascospori, ca de ex. Talaromyces sau Eupenicillium. Eupenicillium. Dintre cele 2 genuri teleomorfe, genul Talaromyces este cel mai important în contaminarea alimentelor. T. flavus este teleomorfa lui P. dangeardii, fiind implicat în alterarea concentratului de suc de fructe. Produce spori termorezistenţi când se formează conidii, acestea cad din fialide. Culorile tipice pe care le au în alimente sunt albastru sau albastru verzui. Unele specii produc putregaiul albastru şi verde al citricelor, strugurilor, perelor şi fructelor cu sâmburi. 13. Rhizopus. Hifele aseptate produc stoloni şi rizoizi. Sporangioforii se dezvoltă tipic sub formă de ciorchine din capul stolonilor la punctul de origine al rizoizilor. R. stolonifer reprezintă specia cea mai frecventă din alimente. Uneori, sunt denumite “mucegaiurile pâinii” şi produc putregaiuri moi, apoase ale merelor, perelor, fructelor (*) cleistoteci = ascospori închişi în ascii dispersaţi la întâmplare. 106

cu sâmburi, strugurilor, smochinelor şi a altor fructe. Unele produc “petele negre” ale cărnii de vită şi de oaie congelate. Pot fi găsite pe slănină şi pe alte produse de carne procesate. Unele produc pectinaze, iar R. oligosporus este important în producerea de oncom, bongkrek şi tempeh. 14. Thamnidium. Aceste mucegaiuri produc sporangii mici, purtate de structuri extrem de ramificate. T. elegans este specia cea mai cunoscută datorită faptului că se dezvoltă pe membrele posterioare ale cărnii de vită refrigerate, creşterea fiind cunoscută sub denumirea “whiskers”. Se dezvoltă şi în ouăle stricate. 15. Trichothecium. Hifele sunt septate purtând conidiofori lungi, subţiri şi simpli. T. roseum este singura specie de culoare roz şi produce mucegaiul roz al fructelor. De asemenea, provoacă mucegaiul moale al dovlecilor, găsindu-se frecvent pe orz, grâu şi porumb, uneori produc micotoxine. 16. Alte mucegaiuri. Aici sunt prezentate două categorii de microorganisme. Prima categorie este reprezentată de genuri diverse prezente în unele alimente, dar în general nu sunt considerate semnificative. Acestea sunt genurile Cephalosporium, Diplodia şi Neurospora. Cephalosporium este un deuteromicet ce se găseşte pe carnea congelată. Microsporii unor specii de Fusarium sunt asemănători celor din acest gen. Diplodia este un alt deuteromicet, care provoacă mucegaiul cafeniu apos al piersicilor. Neurospora este un ascomicet, iar N. intermedia este cunoscut sub denumirea de “mucegaiul roşu al pâinii” Monilia sitophila este anamorfa lui N. intermedia. Aceasta din urmă este importantă în fermentarea oncomului şi a fost găsită pe diferite cărnuri. Petele albe (white spot) ale cărnii de vită sunt provocate de Sporotrichum spp; mucegaiurile diverselor fructe sunt cauzate de Gloeosporium spp. Speciile de Helminthosporium sunt patogene pentru foarte multe plante. Neosartorya fischeri: (anamorfa lui Aspergillus fischerianus) a fost pentru prima dată recunoscută în 1960, ca fiind cauza alterării unor produse din fructe. Ascosporii săi sunt extrem de termorezistenţi, fiind capabili să reziste la fierbere în apă distilată timp de o oră. Are un D87C de aproximativ 11 minute în tampon fosfat. Este interesant faptul că produce o serie de micotoxine – fumitremorgină A, B şi C; tereină, veruculogene şi fişerină. Cea de-a doua categorie conţine mucegaiuri xerofile, cu rol foarte important în alterare. Pe lângă Aspergillus şi Eurotium, Pitt şi Hocking includ printre xerofile şi alte şase genuri: Basipetospora, Chrysosporium, Eremascus, Polypaecilum, Wallemia şi Xeromyces. Aceste mucegaiuri se caracterizează prin abilitatea lor de a creşte sub aw (water activity) = 0,85. Ele se găsesc în alimentele ce îşi datorează conservabilitatea unui aw redus. Dintre cele şase genuri numai două sunt discutate mai amănunţit: Wallemia şi Xeromyces. Wallemia: produce pe mediile de cultură şi pe alimente, colonii de culoare cafenie. W. sebi este specia cea mai importantă şi poate creşte la aw de 0,69. Produce mucegaiul gri (dun) pe peştele uscat şi sărat. 17. Xeromyces. Are o singură specie: X. bisporus. Produce cleistoteci incolori 107

cu ascii evanescente* ce conţin doi ascospori. Acest microorganism are creşterea cea mai redusă în aw dintre toate celelalte microorganisme cunoscute. Creşterea sa maximă este de aproximativ 0,97, cu un optim de 0,88 şi un minim de 0,61. Are un D termic de 82,2°C şi 2-3 minute. Cauzează probleme la lichioruri, prune, ciocolată, sirop şi alte produse similare. Prezentarea sinoptică a genurilor comune de levuri din alimente ! Levurile pot fi considerate ca fungi unicelulari în contrast cu mucegaiurile care sunt multicelulare, totuşi aceasta nu reprezintă o definiţie precisă, pentru că multe din levurile obişnuite produc în realitate micelii cu grade variate. Levurile pot fi diferenţiate de bacterii atât prin dimensiunile mai mari ale celulelor lor cât şi prin formele acestora care sunt ovale, alungite, elipsoidale sau sferice. Celulele levurice tipice au un diametru ce variază între 5-8 µm, unele fiind chiar mai mari. Culturile mai vechi prezintă celule mai mici. Majoritatea levurilor importante din alimente se divid prin înmugurire sau fisiune. Levurile pot creşte în limite mai largi ale pH-ului acid şi în etanol până la 18%. Multe cresc în prezenţa sucrozei 55-60%. Produc mulţi pigmenţi mergând de la crem până la roz şi roşu. Ascosporii şi artrosporii unor levuri sunt termorezistenţi. În ceea ce priveşte taxonomia ciupercilor, în deceniul trecut s-au folosit metode mai noi, ce constau dintr-o compoziţie bazică de ARNr 5S, ADN şi din profiluri ale coenzimei Q. Din cauza dimensiunilor mari ale genomului levurilor, analizele secvenţelor de ARNr 5S se folosesc mai mult pentru fracţiunile de ARN mai mari. În sistematica levurilor s-au produs multe modificări, datorită folosirii unor metode mai noi, dar şi datorită unei filozofii ce pare a fi îndreptată mai mult spre gruparea taxonilor decât spre separarea lor. Una din lucrările de bază privind sistematica levurilor este aceea editată de Kreger-van Rij, publicată în 1984. În acest volum, genul Torulopsis din trecut a fost transferat în genul Candida, iar unele specii Saccharomyces au fost transferate în genul Torulaspora şi Zygosaccharomyces. Starea teleomorfă sau perfectă a mai multor levuri face ca referirile din literatura mai veche să fie dificile. Taxonomia a circa 15 genuri este prezentată rezumativ mai jos. Pentru o discuţie excelentă privind levurile din alimente trebuie consultate contribuţiile lui Deak şi Beuchat, Beneke şi Stevenson, Pitt şi Hocking. Aceştia au prezentat pentru identificare, o cheie excelentă, simplificată, privind levurile din alimente.

* evanescente = care dispar repede 108

Diviziunea: Ascomycotina Familia: Saccharomycetaceae (formează ascospori şi artrospori; reproducere vegetativă prin fisiune sau înmugurire) Subfamilia: Nadsonioideae Genul: Hanseniaspora Subfamilia: Saccharomycotoideae Genul: Debaryomyces Issatchenkia Kluyveromyces Pichia Saccharomyces Torulaspora Zygosaccharomyces Subfamilia: Schizosaccharoycetoideae Genul: Schizosaccharomyces Diviziunea: Deuteromycotina Familia: Cryptococcaceae (fungi imperfecţi; reproducere prin înmugurire) Genul: Brettanomyces Candida Cryptococcus Rhodotorula Trichosporon Genurile de mai sus sunt enumerate în contiunare în ordine alfabetică: 1. Brettanomyces (stadiul perfect este Dekkera). Această levură este nesporogenă, cu celule ogivale şi înmugurire terminală, producând acid acetic din glucoză, numai în condiţii aerobe. B. intermedius reprezintă specia tip şi poate creşte la un pH scăzut de 1,8. Aceste levuri produc alterarea berii, vinului şi băuturilor nealcoolice, a murăturilor, iar unele sunt implicate în postfermentarea unor beri blonde. B. bruxellensis contribuie la formarea aminelor biogene din vinurile roşii. 2. Candida. Acest gen a fost creat în 1923 de către Berkhout şi a suferit o serie de modificări în ceea ce priveşte definiţia şi clasificarea. Este considerat ca fiind un taxon heterogen important ce poate fi divizat în 40 de segmente cu 3 grupe principale, bazat în principal pe compoziţia de acizi graşi şi cariotipizarea electroforetică. Numele generic înseamnă “alb strălucitor”, iar celulele nu conţin pigmenţi carotenoizi. Speciile imperfecte de ascomicete sunt plasate aici, incluzând şi fostul gen Torulopsis, după cum urmează: Candida famata (Torulopsis candida, T. famata); Candida kefyr (Candida pseudotropicalis, T. kefyr, Torula cremoris); Candida stellata (Torulopsis stellata); Candida holmii (Torulopsis holmii). 109

Multe din formele anamorfe de Candida sunt azi incluse în genul Kluyveromyces şi Pichia. Candida lipolytica este anamorfa lui Saccharomycopsis lipolytica. Membrii acestui gen sunt levurile cele mai frecvente din carnea de vită şi pui tocate recent, iar C. tropicalis reprezintă genul predominant din alimente. Unii membrii sunt implicaţi în fermentarea boabelor de cacao, ca o componentă a granulelor de kefir şi în multe alte produse incluzând unele tipuri de bere şi sucuri de fructe. 3. Cryptococcus. Reprezintă anamorfa genului Filobasidiella şi a altor basidiomicete. Sunt nesporogene, se reproduc prin înmugurire multilaterală şi nu fermentează zaharurile. Sunt hialine, de culoare roşie sau portocalie şi pot forma artrospori. Au fost găsite pe plante, soluri, căpşuni şi alte fructe, peşte marin, creveţi şi carne de vită proaspătă, tocată. 4. Debariomyces. Levuri ascosporogene ce produc uneori un pseudomiceliu şi se reproduc prin înmugurire multilaterală. Ele sunt reprezentate de 2 genuri ce se găsesc în produsele lactate. D. hansenii reprezintă ceea ce au fost în trecut D. subglobosus şi Torulaspora hansenii, fiind specia predominantă din alimente. Poate creşte în NaCl 24% şi la un aw scăzut de numai 0,65. Creşte în saramură şi pe brânzeturi provocând alterarea concentratului de suc de portocale şi a iaurtului. 5. Hanseniaspora. Sunt levuri apiculate ale căror anamorfe sunt speciile Kloeckera. Ele produc o înmugurire bipolară şi drept urmare se produc celule în formă de lămâie. Ascele conţin 2-4 spori în formă de pălărie. Fermentează zaharurile şi se găsesc pe tomate, smochine, căpşuni, citrice şi intervin în fermentarea boabelor de cacao. 6. Issatchenkia. Membrii acestui gen produc pseudomiceliu şi se multiplică prin înmugurire multilaterală. Aici au fost incluse unele specii ce făceau parte din genul Pichia. Teleomorfa speciei Candida krusei este I. orientalis şi se găseşte în medii lichide unde formează pelicule caracteristice. Conţine coenzima Q7, fiind frecvent întâlnită într-o mare diversitate în alimente. 7. Kluyveromyces (Fabospora). Sunt formatoare de ascospori, se reproduc prin înmugurire multilaterală, iar sporii sunt sferici. K. marxianus include fostele specii K. fragilis, K. lactis, K. bulgaricus, Saccharomyces lactis şi S. fragilis. K. marxianus este una din cele 2 levuri predominante din produsele lactate. Aceasta conţine coenzima Q6, fiind implicată în fermentarea kumisului*. Este de asemenea folosită pentru producerea lactozei din zer. Se găseşte într-o largă diversitate de fructe şi produce alterarea brânzeturilor. 8. Pichia. Genul cel mai larg de levuri adevărate. Se reproduc prin înmugurire multilaterală, iar ascele au de obicei 4 spori sferoidali în formă de pălărie sau saturniană. Pot forma pseudomicelii şi artrospori. Unii spori, în formă de pălărie aparţin speciilor Williopsis, iar unele din speciile mai vechi sunt acum clasificate în genul Debaryomyces.

(*) kumis = băutură fermentată din lapte de iapă 110

P. guilliermondii este starea perfectă a speciei Candida guilliermondii. Anamorfa speciei P. membranaefaciens este Candida valida. Speciile lui Pichia formează în mod caracteristic pelicule pe mediile lichide şi sunt importante în producerea unor alimente indigene în diferite părţi ale lumii. Unele au fost găsite pe peştele proaspăt şi pe creveţi şi cresc frecvent în saramura de măsline şi alterează murăturile şi varza murată. 9. Rhodotorula. Aceste levuri sunt anamorfe ale familiei Basidiomycetes. Cele care produc teleospori sunt incluse în genul Rhodosporidium. Se reproduc prin înmugurire multilaterală şi sunt nefermentativi. R. glutinis şi R. mucilaginosa sunt speciile prevalente din alimente. Ele produc pigmenţi roz până la roşu, majoritatea fiind de culoare portocalie sau roz. Se găsesc pe carnea proaspătă de pui, crevete, peşte şi vită şi unele cresc pe suprafaţa untului. 10. Saccharomyces. Aceste levuri ascosporogene se multiplică prin înmugurire multilaterală şi produc spori sferici în asce. Sunt diploizi şi nu fermentează lactoza. Cele clasificate în trecut ca speciile S. bisporus şi S. rouxii sunt acum incluse în genul Zygosaccharomyces, iar specia S. rosei este clasificată în prezent în genul Torulaspora. Toate levurile din bere, pâine, vin, şampanie sunt incluse în specia S. cerevisiae. Ele se găsesc în granulele de kefir putând fi izolate dintr-o gamă largă de alimente: salam uscat şi fructe. S. cerevisiae produce rar alterări ale alimentelor. 11. Schizosaccharomyces. Se divid prin fisiune laterală sau prin formarea de pereţi transversali şi pot produce hife adevărate şi artrospori. Ascele conţin 4-8 spori în formă de boabe şi nu produc muguri. Sunt considerate ca fiind rudele îndepărtate ale levurilor adevărate. S. pombe este specia tip. Este osmofilă şi rezistentă la unii conservanţi chimici. 12. Torulaspora. Se reproduc prin înmugurire multilaterală, cu formare de spori sferici cu asce. Trei specii haploide incluse în trecut în genul Saccharomyces sunt azi incluse în acest gen. Ele sunt agenţi puternici de fermentare a zaharurilor şi conţin coenzima Q6. T. delbrueckii este specia cea mai prevalentă în alimente. 13. Trichosporon. Aceste levuri oxidative neformatoare de ascospori se multiplică prin înmugurire şi prin formarea de artroconidii. Produc micelii adevărate, iar fermentarea zaharurilor este absentă sau slabă. Sunt implicate în fermentaţiile boabelor de cacao şi idli şi au fost identificate în crevetele proaspăt, carnea de vită, pui, miel congelat şi alte alimente. 14. Yarrowia. În trecut aparţineau genului Saccharomycopsis. Fac parte din ordinul Endomycetales şi apar frecvent pe fructe, legume, carnea de vită şi pui. Candida lipolytica reprezintă stadiul amamorf, iar Y. lipolytica este stadiul teleomorf (perfect). 15. Zygosaccharomyces. Se reproduc prin înmugurire multilaterală, iar ascosporii în formă de boabe sunt în general liberi în asce. Majoritatea sunt haploide fiind agenţi de fermentare puternici ai zaharurilor. Z. rouxii este specia tip şi poate creşte la un aw de 0,62, după Xeromyces bisporus cunoscut pentru abilitatea sa de a creşte la un aw scăzut. 111

Unele specii sunt implicate în fermentarea shoyu şi miso, iar altele sunt agenţi obişnuiţi de alterare a maionezei şi a garniturilor de salată, în special Z. bailii, care poate creşte la un pH de 1,8. Descrierea principalelor drojdii şi mucegaiuri din alimente Drojdiile şi mucegaiurile sunt microorganisme foarte răspândite în natură. Prezenţa lor în număr mare în produsele alimentare indică nerespectarea regulilor de igienă în timpul procesului de obţinere şi de depozitare al acestora. De asemenea, aceste microorganisme pot provoca modificarea însuşirilor organoleptice ale produselor alimentare, afectându-le totodată şi capacitatea de conservare; unele dintre ele elaborează micotoxine, care afectează grav sănătatea consumatorilor, de exemplu: • Aspergillus flavus, produce aflatoxina; • Alternaria (A. citri, A. alternata, A. solani, A. tenuissima) produce substanţe toxice ce se găsesc în mere, cereale, roşii, mure, etc. Toxinele produse de aceste specii includ arternariolul, altenuenul, acidul tenuazonic, alter-toxina I; • Penicillium citrinum, Penicillium veridicatum, izolaţi din orez, pâine dospită, şuncă, făinoase, etc. Aceste specii produc toxina numită citrinină. • Aspergillus (A. ochraceus, A. ostiamus, A. alliaceus, A. mellus, A. niger, A. carbonarius) produc ocratoxinele: A, B, C (OA, OB, OC). • Penicillium (P. claviforme, P. expansum, P. patulum) şi câteva specii din genul Aspergillus (A. clavatus, A. terreus, etc.) şi Byssochlamys (B. nivea, B. fulva) produc patuline. • Penicillium pubenelum şi grupul Aspergillus ochraceus produc o micotoxină ce posedă proprietăţi similare cu acidul penicilic. Se găseşte în cereale. • Aspergillus versicolor, Aspergillus nidulans, Aspergillus rugulosus produc sterigmatocistina. • Fusarium spp produc fumonizina. • Fusarium sambucinum şi Fusarium oxysporum produc sambutoxina, care se găseşte în cartofii uscaţi, stricaţi, cu incidenţă mare în producerea cancerului de esofag. • Fusarium graminearum şi Fusarium tricinatum produc zearalenona. Aceasta se găseşte în porumb, grâu, ovăz, etc. Unele specii de drojdii şi mucegaiuri au rol benefic, fiind utilizate în industria alimentară (de exemplu: industria alcoolului şi a berii, în panificaţie, industria laptelui şi a produselor lactate, industria cărnii, etc.), unde este valorificată activitatea lor enzimatică pentru obţinerea unor produse (brânzeturi tip Roqueford, Camembert, Bucegi, Homorod, salamuri tip Sibiu, etc.). Particularităţi morfologice şi taxonomice. Prin caracterele microscopice şi ale coloniilor formate de ciupercile microscopice se diferenţiază: 112

• levuri; • fungi filamentoşi; • fungi dimorfi. Levurile au celulele ovale sau sferice, înmugurite, şi formează colonii rotunde, bombate, lucioase, cremoase, fiind asemănătoare cu bacteriile. Fungii filamentoşi (mucegaiurile) formează hife (filamente ramificate septate sau neseptate) întreţesute într-un miceliu care are două părţi: • miceliul vegetativ, cu creştere submersă în mediul de cultură de unde absoarbe nutrienţii; • miceliul aerian care creşte erect la suprafaţa mediului şi formează organele de fructificare care sunt formatoare de spori (conidii). Fungii dimorfi cresc ca levuri în ţesuturile gazdei sau în culturi la temperatura de 37°C şi au o creştere miceliană în culturi la 22-30°C sau în sol. După aspectul microscopic al hifelor, se deosebesc următoarele forme de fungi: • fungi cu hife hialine, neseptate, groase, răsucite formate de zigomicete; • fungi cu hife hialine septate şi nepigmentate, cu variate şi numeroase organe de fructificare (uneori apar pigmentate); • fungi dematiacei, cu hife septate şi pigmentate în brun. Forme de multiplicare ale ciupercilor microscopice. Înmulţirea fungilor se realizează: • sexuat, forma teleomorfă, fungii perfecţi; • asexuat (vegetativ), fungii imperfecţi. Înmulţirea sexuată se produce prin fuziunea a două celule, gameţii, care dau naştere unei formaţiuni în care, după meioză, apar sporii: • zigospori; • ascospori; • bazidiospori. Clasificarea naturală a fungilor se realizează după înmulţirea sexuată astfel: • clasa Zigomycetes; • clasa Ascomycetes; • clasa Basidiomycetes; • clasa Deuteromycetes. Înmulţirea vegetativă, se face prin sporangiospori la zigomicete şi prin conidii la celelalte clase. • sporangiosporii se formează în organele de fructificare numite sporangii, care au aspect de săculeţ şi sunt purtate de sporangiofori, segmente diferenţiate ale miceliului aerian. • conidiile sunt formate de levuri sau sunt purtate la extremitatea unor conidiofori diferenţiaţi din miceliul aerian. Conidiile formate de levuri sunt reprezentate de: 113

• blastoconidii, care apar prin înmugurire la levuri sau la unii fungi şi poartă „cicatrice” bazale la locul desprinderii de celula mamă (de exemplu, Cladosporium); • chlamidoconidiile apar prin creşterea şi rotunjirea unor celule de la extremitatea hifelor (terminate) sau intercalare (sesile) (de exemplu: Candida albicans); • artroconidiile se formează din celulele hifale care cresc şi îşi îngroaşă peretele (Geotrichum). Conidioforii, sunt segmente hifale specializate la extremitatea cărora se formează conidiile. Acestea pot fi mici şi unicelulare (microconidii) sau mari şi multicelulare (macroconidii) purtate de conidiofori bine diferenţiaţi. La unii fungi extremitatea conidioforilor este ramificată în segmente secundare numite fialide sau anelide. Fialidele produc la apexul lor conidii acropetale (Penicillium). Anelidele sunt celule conidiogene care prin creştere şi strangulare, formează un lanţ de conidii în secvenţă baziseptală (Scopulariopsis). Caracteristicile levurilor şi mucegaiurilor. Aceste microorganisme sunt eucariote. Toate levurile şi mucegaiurile sunt heterotrofe, fiind lipsite de clorofilă, dependente de o sursă externă, pentru a-şi acoperi nevoile energetice. Unitatea structurală de bază se numeşte hifă, iar totalitatea hifelor alcătuiesc miceliul. Trebuie menţionat că majoritatea levurilor şi mucegaiurilor din alimente nu au un stadiu sexual. Creşterea acestor microorganisme depinde de mai mulţi factori de mediu şi anume: • temperatura – majoritatea levurilor şi mucegaiurilor din alimente sunt mezofile (20-28°C), dar există şi specii psihrofile (se pot dezvolta până la -2°C) sau termofile (până la 60°C). Există, de asemenea, un număr de specii termotolerante şi psihrotolerante, care sunt capabile să supravieţuiască, dar nu să se şi multiplice la temperaturi excesive. • umiditatea – majoritatea levurilor şi mucegaiurilor pot creşte pe substraturi ce generează o umiditate relativă de 85% sau chiar mai mult. Unele mucegaiuri, în special cele depozitate, pot creşte la umidităţi relativ reduse (60-70%). Tot astfel unele specii de levuri se pot multiplica în condiţii de umiditate redusă, în substraturi cu 50-60% glucoză. • pH-ul – limitele pH-ului pentru iniţierea creşterii sunt cuprinse între 2 până la peste 9. În absenţa unui tampon puternic, majoritatea acestor organisme pot modifica pH-ul într-unul care este mai favorabil pentru creşterea lor, de obicei la o valoare între 4 şi 6,5. • oxigenul – toate speciile de mucegaiuri sunt obligat aerobe, totuşi unele specii au capacitatea să se dezvolte deasupra alimentelor din conserve sau într-o 114

atmosferă lipsită de oxigen prin procurarea acestuia de la substratul însuşi. Principalele levuri din alimente şi nutreţuri Levuri (drojdii). Deşi există peste 30 de genuri recunoscute de levuri, numai 3 dintre acestea se întâlnesc cu regularitate în alimente: Saccharomyces, Candida şi Rhodotorula. 1. Genul Saccharomyces. Specia S. cerevisiae. S. cerevisiae este un ascomicet cu celule rotunde, multiplu înmugurite, cu blastoconidii rotunde, rar ovale. Formează pseudohife scurte, rudimentare. Coloniile în creşterea aerobă sau anaerobă sunt frecvent bombate, zbârcite, alb-cenuşii, cu periferia ruginie, când îmbătrânesc. Ascele poartă 1-4 ascospori rotunzi, netezi, aşezaţi în tetradă sau lineari. Se găsesc în boabele de chefir şi pot fi izolate dintr-o largă varietate de alimente, cum ar fi salamul afumat, uscat şi numeroase fructe. Cauzează foarte rar alterarea alimentelor. 2. Genul Candida. Specii: C. famata (Torulopsis famata); C. kefyr (Torulopsis kefyr, Torula cremoris); C. stellata (Torulopsis stellata); C. holmii (Torulopsis holmii); C. tropicalis Genul Candida cuprinde un număr mare de specii, este heterogen şi ca atare a fost şi va fi supus unor remanieri taxonomice. Multe forme anamorfe de Candida sunt incluse în prezent în genurile Kluyveromyces şi Pichia. Numele generic înseamnă „alb-strălucitor”. Membrii acestui gen se găsesc în carnea proaspătă de vită şi păsări de curte. C. tropicalis este specia cea mai des izolată din alimente. Aceasta formează pseudohife, ce evoluează după 3-4 zile în hife; blastoconidiile sunt dispuse aleatoriu de-a lungul pseudohifelor sau apar grupate în ciorchini la nivelul septurilor. Pe mediile de cultură formează colonii uscate, bombate, netede sau zbârcite, albe până la crem, cu periferia franjurată prin hife cu creştere submersă. Unele specii sunt implicate în fermentaţia boabelor de cacao, altele intră în compoziţia boabelor de chefir, a berii de malţ şi a sucurilor de fructe. 3. Genul Rhodotorula. Specii: R. glutinis; R. mucilaginosa Speciile din genul Rhodotorula sunt anamorfele bazidiomicetelor. Se reproduc 115

prin înmugurire multilaterală şi sunt nefermentative. Produc colonii roz sau portocalii pe agarul cu extract de malţ şi pe agarul cu dextroză de cartofi. Genul conţine multe specii psihotrofe. Se găsesc în carnea proaspătă de pui, peşte şi carnea de vită. Unele specii se dezvoltă pe suprafaţa untului. Principalele mucegaiuri din alimente şi nutreţuri Mucegaiuri. În alimente şi nutreţuri se găsesc numeroase specii de mucegaiuri. Genurile predominante sunt: Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria şi Cladosporium. 1. Genul Aspergillus. Specii: Grupul A. glaucus A. flavus A. parasiticus Grupul A. niger Grupul A. ochraceus Grupul A. fumigatus 1. Grupul A. glaucus formează colonii verzi cu reversul necolorat sau galben pal. Conidioforii au peretele neted fiind incolori sau bruni-palid. Fialidele uniseriate înconjoară complet vezicula şi formează un cap conidial radiar. Conidiile subglobulare, fin echinulate, au diametrul de 4 microni. Un număr de 16 specii au un stadiu sexual cunoscut prezentând vezicule colorate în galben aprins sau portocaliu, numite cleistotecii, care conţin mai mulţi saci incolori, denumiţi asce. În interiorul fiecărei asce se află 8 spori incolori numiţi ascospori (produşi pe cale sexuată). Teleomorfa speciei Eurotium amstelodami formează cleistotecii galbene, sferice, ce conţin ascospori (3,5-4 microni), rugoşi, cu două creste. 2. A. flavus. Coloniile de pe agarul Czapek, agarul cu extract de malţ sau agarul cu dextroză de cartofi sunt galben-verzui, până la verde închis, fiind acoperite de miceliul aerian pufos. Reversul coloniilor este roşu brun. Conidioforii lungi şi groşi, incolori, prezintă asperităţi grosiere şi poartă o veziculă globulară sau subglobulară (24-45 microni în diametru), fiind complet acoperită de fialide, uni sau biseriate şi cu dispoziţie aproximativ radiară, iar apoi cu vârsta columnară. Conidiile sferice, rar elipsoide, au diametrul de 3-6 microni şi sunt rugoase. 3. A. parasiticus. Această specie este asemănătoare cu A. flavus, cu două excepţii: posedă un singur set de sterigme; conidioforii sunt netezi. Produce aflatoxina şi este un agent patogen oportunist. 4. Grupul A. niger. Grupul este alcătuit din peste 12 specii. Privite cu ochiul liber apar colorate în negru, datorită producerii de conidii de culoare închisă, dar când sunt privite la un grosisment redus, apar mai mult cafenii. Coloniile au o circumferinţă 116

albă, şanţuri radiare şi reversul galben. Conidioforii sunt foarte lungi şi groşi, au peretele neted, fiind incolori, cu extremitatea distală palid-brună. Veziculele sferice sunt mari (30-75 microni), complet acoperite cu fialide uni sau biseriate, prin metule. Conidiile dispuse iniţial radiar, apoi columnar, sunt brune sau negre, sferice, cu perete gros, neregulat, rugos şi diametrul de 4-5 microni. Grupul nu produce micotoxine dar pot fi agenţi patogeni oportunişti. 5. Grupul A. ochraceus. Acest grup cuprinde cel puţin 10 specii care produc colonii galbene până la cafenii, pe agarul Czapek şi pe agarul cu extract de malţ. Multe specii produc pe suprafaţa coloniilor structuri osoase de culori închise numite scleronţi. Conidioforii au două seturi de sterigme şi produc conidii ovale, netede. Peretele tijei este galben. Unele specii produc ochratoxine şi pot fi agenţi patogeni oportunişti. 6. Grupul A. fumigatus. Se dezvoltă optim la temperaturi cuprinse între 45°C şi 50°C, coloniile iniţial albe, devin ulterior albastre-verzui sau albastre, cu suprafaţa brăzdată de şanţuri radiare. Prezintă reversul, colorat, de obicei, în brun, iar suprafaţa coloniilor este plată, catifelată, până la pâsloasă. Conidioforii sunt relativ subţiri, cu perete neted şi poartă o veziculă în dom. Fialidele uniseriate formează conidii dispuse compact, columnar (ca nişte ţigarete), de formă sferică sau elipsoidă şi fin echinulate. Produce infecţii ale sistemului respirator la om şi animale şi se găseşte în zonele tropicale şi subtropicale. Nu produce toxine. 2. Genul Penicillium. Specii: P. frequentans P. islandicum P. oxalicum P. cyclopium P. viridicatum Acest gen este mai complex decât genul Aspergillus. Foarte puţine specii au un stadiu sexual. Astfel, identificarea speciilor se bazează pe morfologia conidioforilor. Există 3 tipuri de conidiofori, şi anume: • primul tip şi cel mai simplu este format dintr-o tijă, o veziculă mică şi un set de sterigme, în formă de butelie, care produc conidiile. • al doilea tip constă dintr-o tijă fără veziculă; la vârful tijei se produc o serie de celule strâns împachetate, numite metule. La capătul lor se află sterigmele, alungite în formă de lance, ce dau naştere conidiilor. • al treilea tip de conidiofori este extrem de asimetric; constă dintr-o tijă, ce se ramifică liber; de capătul fiecărei ramuri sunt ataşate metule, care poartă sterigme, în formă de butelie şi conidii; foarte puţine specii de Penicillium posedă „celulă picior”. 117

Coloniile formate de speciile din genul Penicillium sunt catifelate, pufoase sau granulare. Iniţial, albe, se pigmentează uzual în verde, albastru-verzui, galben, maroniu, roz sau portocaliu. Prezintă reversul crem, galben, maroniu sau roşu. Unele tulpini produc pigment difuzibil în mediul de cultură. 1. P. frequentans. Aceasta este probabil cea mai frecventă specie a genului. Conidioforul este format numai dintr-o tijă şi din sterigme. Pe agarul Czapek şi pe agarul cu extract de malţ, formează colonii de culoare verde închis cu reversul portocaliu, până la cafeniu. Coloniile sunt uşor rugoase, fiind produse în cruste. P. frequentans nu produce toxine şi nu este patogen. 2. P. islandicum. Această specie a fost detectată la tropice. Conidioforul este format dintr-o tijă, metule şi sterigme. Nu prezintă ramuri. Pe agarul Czapek sau pe cel cu extract de malţ formează colonii intens colorate în portocaliu verzui. Reversul coloniilor este roşu portocaliu. Conidiile sunt ovale şi au peretele neted. Produce câteva micotoxine, incluzând: luteoschirina şi islanditoxina. Nu produce infecţii. 3. P. oxalicum. Aceste specii de mucegaiuri se găsesc frecvent la câmp. Prezintă un conidiofor asimetric, cu ramuri, metule şi sterigme. Conidiile sunt netede, ovale, şi neobişnuit de mari (peste 6 microni în diametru). Coloniile sunt verzi-închise, până la negru, cu reversul negricios. Nu produce toxine şi nici infecţii. 4. P. cyclopium. Această specie este un microorganism de conservare extrem de important. Posedă un conidiofor asimetric, uşor rugos şi produce conidii globulare, netede, până la uşor rugoase. Coloniile sunt de obicei colorate în alb-deschis, cu picături incolore, până la galbene sau chiar roşii. Reversul este colorat asemănător. Textura suprafeţei coloniei este de obicei granulară, dar uneori poate fi şi catifelată. Produce micotoxine, ca acidul penicilic şi tremorgenii. Nu produce infecţii. 5. P. viridicatum. Ca şi P. cyclopium este un mucegai de conservare foarte important. Prezintă caractere morfologice aproape identice cu P. cyclopium. Formează colonii verzi-deschise pe agarul Czapek. Produce micotoxine ca: patulina, citrinina, xantomegnina. Poate fi un agent patogen oportunist. 3. Genul Alternaria. Acest gen se întâlneşte foarte frecvent în regiunile cu clime temperate şi, mai rar în cele cu climă tropicală şi subtropicală. Cultura apare rapid, în 2-6 zile. Coloniile pufoase, vătoase, cenuşiu-verzui până la negru, au reversul negru. După maturizare se acoperă cu hife cenuşii-albicioase. Hifele hialine, brune, septate produc conidiofori simpli sau ramificaţi. Conidiile brune, neuniforme, multiseptate, transversal şi longitudinal se întâlnesc în secvenţă acropetală. Lanţurile conidiale, cu aspect clavat, se rup uşor, încât frecvent apar conidii izolate. 118

Genul produce unii metaboliţi toxici (alternariol, altenuen, acid tenuazonic, alter-toxină I). Conidiile pot constitui o sursă importantă de alergii. Produce putregaiul maro şi negru al merelor şi smochinelor. 4. Genul Fusarium. Acest gen preferă temperaturile moderate, până la reci. Există cel puţin 100 de specii. Pe agar cu dextroză de cartof formează colonii albe-vătoase. Unele specii produc colonii roşii, galbene sau purpurii, eventual cu difuzia pigmenţilor în mediu. Formează hife hialine septate, groase, ramificate. Conidioforii sunt solitari sau grupaţi în sporodochii. Macroconidiile hialine, alungite în formă de canoe sau de virgulă şi multiseptate; lipsesc uneori. Microconidiile ovoide, până la cilindrice, se grupează în ciorchini gelatinoşi sau în lanţuri scurte. Câteva specii produc clamidospori, cu pereţi groşi, solitari, în lanţuri sau în grămezi. Unele specii produc micotoxine: zearalenone, trihotecene şi fumonizine. Produc putregaiul maro al citricelor şi ananasului şi putregaiul moale al smochinelor. 5. Genul Cladosporium. Speciile din acest gen sunt foarte frecvente în alimente şi nutreţuri. Produc un conidiofor scurt, uşor ramificat, de culoare maronie. Formează conidii de formă neregulată, alcătuite din 1-2 celule. Suprafaţa coloniilor este olive, catifelată, cu reversul în aceleaşi nuanţe. Nu produce toxine. C. herbarum produce petele negre pe carnea de vită şi de oaie îngheţată. C. herbarum şi C. cladosporiodes sunt speciile cel mai des întâlnite în fructe şi legume. 12.2. Metoda de lucru Din cauza creşterii lor lente şi a capacităţii relativ reduse de a concura cu bacteriile, levurile şi mucegaiurile se găsesc, cel mai probabil în alimentele al căror mediu înconjurător este mai puţin favorabil creşterii bacteriene: pH-redus, umiditate crescută, conţinut mare de sare sau zahăr, temperatură de depozitare redusă, prezenţa antibioticelor sau expunerea la radiaţii. 1. Analiza probelor. Se prepară un mediu steril de agar (porţii de 250 ml în sticle sau flacoane, autoclavate 15 minute la 121°C). Se răcesc la 45°C, în baie marină. Prepararea mediului se face cu mult timp înainte şi se lasă să se solidifice. Mediul nu se retopeşte, decât o singură dată sau sub presiune. Se recomandă o cameră de distilare Arnold. O dată ce mediul a fost răcit, acesta poate fi păstrat 2-3 ore înainte de folosire, cu condiţia ca nivelul apei din baia marină să fie cu 2-3 centimetri deasupra suprafeţei agarului. Mediul de elecţie este reprezentat de agarul cu dextroză de cartofi. 119

Agarul cu dextroză de cartofi şi sare este deosebit de util pentru analizarea probelor care conţin mucegaiuri „de răspândire” (Mucor, Rhizopus, etc.) deoarece NaCl inhibă creşterea lor permiţând detectarea altor propagule de levuri şi mucegaiuri. Pentru inhibarea creşterii bacteriene, mediul se amendează fie cu antibiotice, fie cu soluţie de acid tartaric 10% (după răcirea agarului şi imediat înainte de turnarea plăcilor), după cum urmează: • antibiotice: se recomandă clortetraciclină HCL, la un mediu de agar cu concentraţie de 40 ppm; mai pot fi folosite şi alte antibiotice (cloramfenicol, streptomicină) în aceeaşi concentraţie cu clortetraciclina HCL. Se prepară soluţia stoc prin dizolvarea a 1 gram de antibiotic în 100 ml de apă distilată sterilă şi prin filtrare, printr-o membrană de 0,45 microni. Soluţia stoc se păstrează la întuneric, la 4-8°C. Perioada de valabilitate nu trebuie să depăşească o lună. • soluţia de acid tartaric: se sterilizează soluţia prin filtrare printr-o membrană de 0,45 microni; se ajustează pH-ul la 3,5, după adăugarea soluţiei în mediu se verifică din nou pH-ul. Se prepară omologatul alimentar şi se efectuează diluţii seriate. Sunt suficiente diluţii până la 10-6­ . Se transferă câte 1 ml din fiecare diluţie în plăci Petri şi se adaugă imediat 20-25 ml de agar cu dextroză de cartofi, răcit cu antibiotic sau acid tartaric. Se amestecă bine conţinutul prin rotirea uşoară a plăcilor în sensul acelor de ceasornic şi în sens contrar, având grijă să se evite răspândirea pe capacul vasului. Fiecare diluţie se toarnă în plăci Petri în triplicat, utilizând pipete cu calibru mare. De la prepararea primei diluţii şi până la turnarea plăcii finale nu trebuie să treacă mai mult de 10-20 minute. Plăcile se incubează la întuneric la 22-25°C, pentru 5 zile. Nu se aşează mai mult de 3 plăci una peste alta şi nici nu se inversează. Plăcile nu se vor mai deplasa până la numărare, deoarece manipularea lor ar putea avea drept rezultat o creştere secundară din sporii dislocaţi invalidând numărătoarea după 5 zile. Se numără plăcile ce conţin între 10 şi 150 de colonii. Se raportează rezultatele în colonii per gram sau în colonii per mililitru, făcând media setului în triplicat. Dacă a treia cifră este 6 sau mai mult se rotunjeşte până la cifra superioară (de exemplu: 456 = 460). Dacă cifra a treia este 4 sau mai puţin, se rotunjeşte până la cifra inferioară (de exemplu 454 =450). Dacă a treia cifră este 5, se rotunjeşte până la cifra inferioară dacă primele două cifre sunt un număr par (de exemplu: 445 = 440); se rotunjeşte la cifra superioară dacă primele două cifre sunt un număr impar (455 = 460). Determinarea numărului de levuri şi mucegaiuri prin însămânţarea directă în plăci Petri (pentru alimente ca fasole uscată, nuci, condimente întregi, boabe de cafea şi cacao) Analiza alimentelor nedezinfectate pe suprafaţa (NSD). Înainte de însămânţarea în plăci Petri, probele se păstrează la -20°C, timp de 72 de ore, pentru a 120

omorî căpuşele sau alte insecte care ar putea împiedica analiza alimentelor. Prepararea plăcilor de agar. Se utilizează agar cu dextroză de cartofi şi sare (conţine 75 de grame NaCl per litru). Sarea inhibă creşterea mucegaiurilor de răspândire şi germinarea seminţelor viabile, care ar putea ridica capacul plăcii Petri. La agarul răcit se adaugă 40 ppm clortetraciclină HCL. Se toarnă aproximativ 30 ml de mediu în plăci Petri şi se lasă să se solidifice. Se prepară 10 plăci per probă. Perioada dintre preparare şi utilizare a plăcilor nu trebuie să depăşească 24 de ore. Însămânţarea probelor în plăcile Petri. Din fiecare probă se transferă aproximativ 50 de grame într-un pahar steril de 150 mililitri. Se plasează 5 porţiuni de probă per placă, sub formă de rozete (una în centru şi celelalte în fiecare cuadrant) cu ajutorul unei pense flambate în etanol. Se utilizează alternativ mai multe pense pentru a se evita supraîncălzirea. Nu se aplică pe porţiuni vizibil mucegăite sau decolorate. Incubarea probelor. Se aliniază plăcile Petri în stive de câte 10. Se notează numărul probei şi dată însămânţării, pe fiecare placă. Stivele incubate se lasă nederanjate la întuneric, la 22-25°C, timp de 14-21 de zile. Citirea plăcilor. Apariţia mucegaiului se determină în procente. De exemplu, dacă acesta a apărut în toate cele 50 de porţiuni de probă, mucegăirea este de 100%, dacă mucegaiul a apărut în 32 de probe, mucegăirea se consideră că are loc în proporţie de 64%.

121

DETERMINAREA NUMĂRULUI DE DROJDII ŞI MUCEGAIURI (schemă adaptată după W. Andrews, 1992)

1. Se amestecă ingredientele într-un blender

2. Se diluează omogenatul de probă alimentară

3. Se pipetează 1 ml din fiecare diluţie în plăci separate cu PDA

PDA (Potato Dextrose Agar) suplimentat cu Clortetraciclină HCL sau acid tartric 4. Se incubează la întuneric, la 22-25°C, timp de 5 zile. 5. Se numără plăcile ce conţin între 10 şi 150 colonii. 122

Saccharomyces cerevisiae Microscopie cu contrast de fază în câmp întunecat

Saccharomyces cerevisiae Microscopie electronică

Saccharomyces cerevisiae Microscopie cu contrast de fază în câmp întunecat (coloraţie cu floxină). Reproducere asexuată prin înmugurire

Saccharomyces cerevisiae Microscopie cu contrast de fază în câmp întunecat (coloraţie cu floxină). Se observă în mijlocul figurii o ască cu 4 ascospori

Saccharomyces cerevisiae Cultură pe agar cu dextroză de cartof

Saccharomyces cerevisiae Cultură pe mediul Czapek

123

Candida spp. Microscopie electronică

Candida kefyr

Mediul CDA (Chrome-Dextrose-Agar) Acest mediu nou permite identificarea drojdiilor: Candida albicans, C. kefyr, C. tropicalis sau a altor specii. Este un agar Sabouraud dextroză ce conţine ca substrat glucozamidă PPR. Toate tulpinile de C. albicans cresc pe acest agar şi formează pete adânci roz-roşii după 2448 de ore de incubare la 37°C. Coloniile de C. kefyr şi C. tropicalis apar pigmentate în roz, iar celelalte specii produc colonii albe. Un avantaj important al agarului CDA îl reprezintă faptul că drojdiile formează colonii de culori diferite

124

Candida tropicalis. CHROM-agar.

Candida tropicalis. Tween 80 agar. Blastoconidii împrăştiate de-a lungul hifelor

Candida spp.

Candida tropicalis. Imagine de detaliu cu blastoconidii.

Candida famata

125

Rhodotorula sp. Mediul Sabouraud

Rhodotorula glutinis

Rhodotorula glutinis. Mediul Sabouraud

Rhodotorula mucilaginosa. Mediul Sabouraud

Rhodotorula mucilaginosa (detaliu). Mediul Sabouraud 126

Conidie

Aspergillus fumigatus

Aspergillus fumigatus

Aspergillus flavus

Aspergillus flavus

Aspergillus niger

Aspergillus niger 127

Aspergillus glaucus

Aspergillus glaucus

Aspergillus ochraceus

Aspergillus ochraceus

Aspergillus ochraceus

Aspergillus ochraceus 128

Penicillium spp.

Penicillium spp.

Penicillium islandicum

Penicillium oxalicum

Penicillium viridicatum

Penicillium viridicatum 129

CAPITOLUL 13 MEDII DE CULTURĂ, REACTIVI, DILUANŢI 13.1. Caractere generale Mediile şi reactivii descrişi în acest capitol au fost evaluaţi ca eficienţi pentru utilizarea lor în anumite metode. Aceste medii şi reagenţi se vor folosi exact cum este specificat în reţetă, introducerea oricărei modificări (chiar aparent minoră), poate afecta rezultatele obţinute prin metoda respectivă. Pentru utilizarea diferitelor medii de cultură se vor respecta următoarele reguli generale: - bulionul de carne se poate înlocui cu extract de carne concentrat în proporţie de 3g extract concentrat la 1000 ml bulion; - dacă se folosesc fibrele de agar pentru prepararea mediilor solide, acestea în prealabil se înmoaie în apă distilată; - prin bulion de carne (dacă nu există altă specificaţie) se înţelege bulionul obţinut din carnea de bovine sau cabaline; - dacă nu se menţionează metoda de sterilizare, aceasta se va realiza prin autoclavare. De obicei, sterilizarea se va realiza la 121°C, timp de 15-20 de minute (pentru mediile care nu conţin zaharuri) şi respectiv la 115°C, 15-20 de minute (pentru mediile care au în compoziţia lor zaharuri). - prepararea oricărui mediu de cultură se va realiza după următoarea reţetă generală: 1. ingredientele din reţetă se adaugă pe rând (sub agitare), în apă distilată sau bulion de carne încălzite la 15-60°C; 2. se supun fierberii până ce se dizolvă complet (câteva minute); 3. se ajustează pH-ul; 4. se filtrează prin vată (în baloanele cu zaharuri, dacă este cazul); 5. se agită bine, pentru dizolvare; 6. se ajustează din nou pH-ul (dacă este necesar), având în vedere că acesta de obicei scade la o valoare cu 2-6 diviziuni (după caz), decât valoarea pH-ului final, specificat în reţetă; 7. se verifică dacă sterilizarea s-a realizat corect prin incubare la 35-37°C, timp de 24-48 de ore şi se înlătură recipienţii cu medii infectate. După preparare, mediile sterilizate se păstrează în locuri întunecoase şi răcoroase. Deşi, acest capitol prezintă formulele tuturor mediilor folosite în metodele descrise în manual, se preferă utilizarea mediilor deshidratate din comerţ, pentru uniformitatea metodei şi a scurtării timpului efectiv de lucru al analizatorului. În cazul în care nu există un mediu comercial, acesta trebuie preparat din componentele sale individuale. Climatul cu umiditate mare poate provoca întărirea 130

rapidă a mediilor deshidratate, putând afecta astfel performanţele metodei. În plus mediile alcaline pot absorbi dioxidul de carbon şi pot modifica pH-ul. Ori de câte ori este posibil, mediile trebuie furnizate cu data expirării pe recipient. Dacă aceasta nu este specificată, mediile nu se folosesc mai mult de un an de la primirea lor în laborator. Cele vizibil alterate prin formarea de cocoloaşe sau acumularea de umezeală trebuie aruncate. Compuşii chimici sunt folosiţi pe scară largă în compoziţia mediilor, ca agenţi selectivi, ca indicatori şi coloranţi în diferite proceduri microbiologice. Datorită faptului că impurităţile chimice pot, fie să inhibe, fie să stimuleze creşterea microorganismelor sau pentru că pot produce o reacţie nedorită, trebuie folosite numai substanţe chimice care îndeplinesc specificaţiile unei organizaţii de certificare. Spre deosebire de majoritatea mediilor deshidratate, substanţele chimice prezintă foarte rar marcată data de expirare. 13.2. Medii de cultură folosite în diagnosticul de laborator Mediile de cultură reprezintă amestecuri de substanţe organice şi anorganice, ce asigură microorganismelor ce dorim să le cultivăm condiţii optime pentru dezvoltare. După Răducănescu H., mediul de cultură poate fi definit ca un suport nutritiv, steril, care permite dezvoltarea şi studiul unui microb în afara nişei sale ecologice naturale. Gama mediilor de cultură utilizate în microbiologie s-a extins considerabil, datorită: • creşterii numărului de entităţi taxonomice, care trebuiesc izolate şi identificate; • cunoaşterea factorilor nutritivi proprii, îndeosebi a grupelor taxonomice nou descrise; • extinderii numărului de caractere fenotipice definitorii, cerinţă impusă de exigenţele taxonomice moderne; • exigenţele de lucru impuse laboratoarelor de diagnostic. Compoziţia mediilor de cultură variază de la câţiva compuşi organici foarte simpli, până la o listă complexă de compuşi organici şi anorganici. Manualul Difco (Digestive Ferments Company) fondat în 1895, enumeră aproximativ 500 de medii folosite în laboratoarele moderne de microbiologie. Datorită exigenţei produselor comerciale gata pentru folosire, mediile de cultură, în ziua de azi, se prepară foarte uşor. Nu însă, aceeaşi era situaţia şi în trecut. O cameră de preparare a mediilor avea aspectul unui „hibrid” între o bucătărie şi laboratorul unui alchimist. O carte de referinţă, care trece în revistă mediile de cultură până în anul 1930, poartă titlul de „O compilare de medii de cultură pentru cultivarea microorganismelor”, de Levine şi Shoenlein şi conţine 7000 de reţete. O combinaţie fantastică de materii prime se adăugau (şi uneori se mai adaugă) 131

preparatelor, unele forme fiind extrem de complexe. Nu era ceva neobişnuit ca pentru un singur mediu să fie necesare 25 de faze de preparare. Compoziţiile mediilor par să nu fi fost limitate decât de imaginaţia „bucătarului”. În reţete apar numeroase produse animale neconvenţionale, cum ar fi: oase, cartilaje, placentă, plămân, slănină, carne tocată de vită, testicule, spermă, puroi, fecale, urină. Materialele vegetale, care constituie de asemenea o sursă foarte bună de substanţe nutritive, erau măcinate, tăiate, tocate, pasate, filtrate şi gătite. O listă parţială sugerează o adevărată grădină: cartofi, morcovi, spanac, ceapă, mazăre, fructe (banane, prune), ierburi (paie, fân) şi zeci de diverse seminţe. Produse ca sucul de tomate, macaroane, cafea, condimente, unt şi bere şi-au avut, de asemenea, locul în unele amestecuri. Nici o sursă imaginabilă nu a fost omisă, incluzând componente ciudate ca: pământ, bălegar, cărămizi, cărbuni, rumeguş, cenuşă de lemne, scame, cuie ruginite, azbest, arsenic şi cianură. Pentru a putea fi folosite în cultivarea bacteriilor, mediile de cultură trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:  să conţină substanţe nutritive necesare metabolismului bacterian;  să aibă un pH necesar dezvoltării bacteriei respective;  să corespundă particularităţilor fiziologice ale bacteriilor, mai ales în funcţie de tipul respirator;  să fie steril. Mediile de cultură se prepară din ingrediente special destinate acestui scop, cum ar fi:  ingrediente rezultate în urma hidrolizei acide a unor produse de origine animală, vegetală sau microbiană (extract de carne de bovine, hidrolizat de cazeină, extract de drojdie);  săruri minerale; în compoziţia unui mediu intră aproape întotdeauna clorura de sodiu 0,5-0,7 %;  agarul este mediul solid şi se găseşte în comerţ sub formă de agar fibre sau pudră, fiind reprezentat de o algă marină (Gelidium corneum) din mările Japoniei. Descoperirea agarului. Bacteriologii au realizat încă din timpurile trecute, avantajul creşterii bacteriilor în colonii separate, faţă de creşterea lor în bulioane şi infuzii. În acest scop ei au avut nevoie de un mediu care să fie relativ solid pentru cultivarea bacteriilor şi care, în acelaşi timp să furnizeze nutrienţii necesari acestora. În trecut, se foloseau felii de cartof sau gelatină sterilizată, însă acestea lăsau mult de dorit, nefiind extrem de eficace în acest sens. Cartofii aveau un conţinut limitat de nutrienţi, iar gelatina îşi pierdea soliditatea la temperaturi mai calde, putând fi digerată de multe categorii de microorganisme. Bacteriologul german Walther Hesse a studiat microbii din aer, fiind dezamăgit de rezultatul derutant al culturilor în gelatină. Înţelegând necesitatea găsirii unui substituent al gelatinei, soţia sa Fanny, i-a sugerat să folosească o substanţă numită agar. Agarul era folosit tradiţional în Malaezia pentru prepararea jeleurilor şi îngroşarea 132

supelor, fiind un agent de solidificare aproape perfect. Prin această descoperire importantă, Hesse a reuşit un salt imens în istoria preparării mediilor de cultură, agarul fiind folosit şi în zilele noastre.  apa, reprezintă sediul reacţiilor chimice şi intră în compoziţia tuturor mediilor de cultură sub diferite forme (distilată, bidistilată, deionizată, de robinet, de izvor), în funcţie de necesităţile bacteriilor;  alte ingrediente care folosesc la prepararea unor medii speciale sunt reprezentate, de exemplu, de: extractul de malţ, extractul de larve de albine, ser sangvin, sânge, vitamine, antibiotice, indicatori de pH, etc. 13.3. Prepararea mediilor de cultură Se realizează conform unor reţete, a căror compoziţie variază în funcţie de exigenţele nutritive ale bacteriei cultivate. Etapele de preparare a celui mai simplu mediu de cultură (bulionul) sunt următoarele:  mediul original se prepară din macerat de carne, obţinut din 500 grame de carne, la care se adaugă 1000 mililitri de apă;  se lasă o noapte la temperatura camerei, se fierbe şi se filtrează prin vată;  la lichidul obţinut se adaugă peptona (10‰), clorura de sodiu (5‰);  se ajustează pH-ul prin adăugarea de soluţie normală de hidroxid de sodiu;  se filtrează din nou prin hârtie de filtru;  se repartizează în recipiente de sticlă, care se astupă cu dopuri de vată;  se sterilizează 30 de minute la 115°C. Maceratul de carne poate fi substituit cu extractul de carne, sub formă de pulbere purificată şi standardizată, produsă de diferite firme internaţionale (Merck, Difco, Bacto) sau de institute de produse biologice din ţara noastră. Prepararea unui mediu solid (agar) se realizează astfel: • la 1000 mililitri bulion se adaugă 17-30 grame agar, de preferat pulbere; • mediul se repartizează în eprubete şi se sterilizează; • dacă solidificarea se produce în poziţie înclinată se obţine agar înclinat, iar în poziţie verticală se obţine agar drept. Mediile cu ser se prepară din medii uzuale (bulion, agar), la care se adaugă ser normal (de obicei, de cal), în proporţie de 1/10. 13.4. Clasificarea mediilor de cultură Mediile pot fi clasificate după trei niveluri principale:  forma fizică;  caracteristicile chimice;  tipul funcţional. 133

Criterii de clasificare: 1. După consistenţă. • medii lichide – tind să curgă liber când vasul este înclinat; bulioane sterile, lichide lăptoase (lapte cu albastru de metilen, lapte cu turnesol), soluţii nutritive, thioglicolatul lichid (în cultivarea bacteriilor anaerobe); • medii semisolide – nu devin lichide la temperatura obişnuită a camerei, prezentând o consistenţă gelatinoasă, datorită faptului că ele conţin agar sau gelatină, care le întăreşte într-o oarecare măsură, dar nu produc un substrat tare; se folosesc pentru observarea mişcării bacteriilor şi pentru păstrarea bacteriilor în colecţii bacteriene; la încălzire se lichefiază. Exemple: mediul pentru testarea mobilităţii şi mediul SIM, ce conţin 0,3-0,5% agar. Mediul SIM mai este folosit şi pentru testarea producerii de hidrogen sulfurat şi reacţia indolului. Tot în această categorie se încadrează şi agarul cu cistină tripticază (CTA) şi mediile de transport. • mediile solide – prezintă o suprafaţă tare, pe care celulele pot forma colonii separate, fiind vitale în izolarea şi subcultivarea bacteriilor şi fungilor. Ele se prezintă sub două forme: − lichefiabilă; − nelichefiabilă. Mediile solide lichefiabile (medii solide reversibile) conţin un agent de solidificare care este termoplastic (modificat fizic în funcţie de temperatură). Cel mai folosit este agarul, un polizaharid complex, izolat din alga roşie Gelidium. Agarul prezintă numeroase avantaje. Este solid la temperatura camerei şi la temperatura de incubare (40-45°C) şi se lichefiază la temperatura de fierbere a apei (90-100°C). O dată lichefiat nu se resolidifică, decât după ce se răceşte la 42°C, ceea ce permite ca să fie turnat în eprubete sau în plăci Petri sub formă lichidă, la temperaturi care nu vor dăuna microbilor sau manipulatorului (45-50°C). Agarul este flexibil şi modelabil, reprezentând un cadru de bază pentru menţinerea umidităţii şi a nutrienţilor, deşi, pentru marea majoritate a microorganismelor, el însuşi nu reprezintă un nutrient utilizabil. Enzimele bacteriene nu sunt capabile să-l digere (degradeze). Exemple: Orice mediu, care conţine de la 1% până la 5% agar, conţine de obicei acest cuvânt în denumirea sa. 2. După compoziţia chimică, se împart în: • medii naturale; • medii sintetice; • medii semisintetice. Mediile sintetice. Mediile a căror compoziţie este determinată chimic, se numesc medii sintetice. Conţin compuşi organici şi anorganici cu un grad mare de puritate şi un conţinut molecular specificat printr-o formulă exactă. Astfel de medii sunt foarte utile în cercetare şi culturi celulare, în care nevoile nutriţionale ale organismelor testate sunt cunoscute. 134

Mediile naturale (empirice). Conţin cel puţin o componentă care nu poate fi determinată chimic (un compus care nu este foarte pur, simplu şi nu poate fi determinat printr-o formulă chimică). Exemple: medii cu sânge, ser şi extracte de carne, lapte, extract de levuri, boabe de soia digerate, glucide vegetale complexe, cartof glicerinat, peptonă. Peptona este o proteină parţial digerată, bogată în aminoacizi, folosită deseori ca sursă de carbon şi azot. 3. După frecvenţa şi scopul utilizării în laborator – se împart în medii uzuale şi medii speciale. Mediile uzuale sunt folosite frecvent în laborator, fiind destinate cultivării unui spectru larg de microbi. De regulă, sunt medii naturale şi conţin un amestec de nutrienţi care pot stimula în aceeaşi măsură creşterea microbilor patogeni şi nepatogeni. Exemple: agarul şi bulionul nutritiv, agarul cu sânge, agarul cu tripticază soia (TSA). Mediile speciale sunt reprezentate de: • medii de îmbogăţire – care conţin nutrienţii de bază, asemănătoare cu mediile uzuale, fiind îmbogăţite cu sânge, ser, factori de creştere. Exemple: Stc. pneumoniae se cultivă pe agar cu sânge; Neisseria, pe mediul agar şocolat (agar cu sânge fiert); H. influenzae se cultivă pe mediul Fildes, care conţine sânge de oaie digerat. • mediile selective conţin un agent (sau mai mulţi), care inhibă creşterea unui anumit microb A, lăsând să se dezvolte microbul B, ca urmare, stimulează sau selecţionează pentru creştere grupul B. Exemple: o mediul MSA (manitol salt agar) conţine 7,5% NaCl, care este inhibitor pentru majoritatea agenţilor patogeni, cu excepţia genului Staphylococcus; o agar Mac Conkey, agar cu eozină, albastru de metilen (EMB), conţin săruri biliare, care inhibă dezvoltarea majorităţii bacteriilor Gram pozitive. Coloranţii, ca albastrul de metilen şi cristal violet inhibă, de asemenea, dezvoltarea majorităţii bacteriilor Gram pozitive. Alţi agenţi cu proprietăţi selective sunt reprezentaţi de antibiotice, acizi sau oxigen (adăugat sau îndepărtat). • medii de identificare (de diagnostic diferenţial). Pe aceste medii pot creşte mai multe tipuri de microorganisme, însă datorită aspectului lor variat, se pot diferenţia unele de altele. Diferenţele constau în variaţii ale coloniilor în ceea ce privesc culoarea, dimensiunile şi modificării de culoare a mediilor. De exemplu, când o substanţă adăugată în mediul de cultură este vizibil modificată de microbul A, dar nu şi de microbul B, A va avea un aspect diferit de B, în prezenţa substanţei respective. Exemple: coloranţii şi substanţele hidrocarbonate (zahărul) pot servi ca agenţi diferenţiali, prin faptul că aceştia modifică culoarea, ca răspuns la modificările de pH. 135

Agarul Mac Conkey conţine lactoză şi roşu neutru, un colorant care este galben, când este neutru şi roz sau roşu, când e acid. E. coli, care fermentează lactoza cu producere de acid formează colonii roşii până la roz, iar Salmonella, care nu fermentează lactoza îşi păstrează culoarea naturală galbenă. • medii de reducere – conţin o substanţă care absoarbe oxigenul sau încetineşte pătrunderea acestuia într-un mediu inducând astfel potenţialul de oxidoreducere. Exemple de agenţi reducători sunt acidul thioglicolic, acidul ascorbic, cisteina. • mediile de transport – sunt folosite pentru transportul specimenelor mai sensibile (care mor repede) sau care urmează să fie transportate pe o distanţă mai mare, ce necesită un timp mai lung până la analiza lor chimică. Exemple: Stuart, Amies – conţin săruri, tampoane şi absorbanţi, pentru prevenirea distrugerii celulelor de către enzime, de modificările pH-ului sau substanţe toxice şi nu conţin nutrienţi pentru stimularea creşterii. • Medii de conservare – geloză moale. • Medii de testare – pentru testarea eficienţei medicamentelor antimicrobiene de către fabricanţii de medicamente, pentru evaluarea efectului dezinfectantelor, antisepticelor, cosmeticelor şi conservanţilor asupra creşterii microorganismelor. Medii de urmărire. Sunt folosite pentru calcularea numărului de microorganisme din lapte, apă, alimente, sol şi alte eşantioane. Reţetele mediilor de cultură şi a diluanţilor folosiţi în manual Majoritatea reţetelor de preparare prezentate mai jos sunt recomandate de farmacopeea USA-1992. 1. Bulion nutritiv simplu. Bulion de carne Peptonă Clorură de sodiu pH = 7,4

1000 ml 10 g 5g

2. Agar nutritiv (geloză) Bulion nutritiv Agar pH = 7,4

1000 ml 15-20 g

3. Bulion nutritiv glucozat Bulion de carne Peptonă Clorură de sodiu Extract de drojdie Glucoză pH = 7,4 Se repartizează câte 8-10 ml în eprubete şi se sterilizează. 136

1000 ml 10 g 5g 5g 10 g

4. Bulion VF (viande = carne; foie = ficat) Ficat de viţel 250 g Carne de viţel 250 g Apă de la robinet 1000 ml - ficatul şi carnea se toacă mărunt şi se fierb 20 minute; - se filtrează prin tifon; - fragmentele de carne şi ficat rămase în tifon se spală de 4-5 ori cu apă distilată, se usucă şi se repartizează în tuburi, în cantitate de circa 1-3 grame. - lichidul obţinut după filtrare se completează cu apă de la robinet la volumul iniţial; - se adaugă 5 g peptonă şi 5 g clorură de sodiu; - se ajustează pH-ul la 8; - se autoclavează 20 minute la 120°C; - se adaugă 2% glucoză; - se repartizează câte 6 ml în tuburi, în care s-au introdus în prealabil câte 3 g de carne şi ficat; - se sterilizează prin autoclavare timp de 15 minute la 115°C; - înainte de utilizare mediul se regenerează prin fierbere; 5. Geloză Veillon Bulion nutritiv Agar Glucoză Azotat de potasiu pH = 7,4

1000 ml 3g 5-10 g 1-2 g

Se repartizează în eprubete înalte, cu diametrul cât mai mic, astfel încât mediul să ocupe 3/4 din înălţimea acestora. Se sterilizează. 6. Agar nutritiv glucozat La bulionul nutritiv glucozat se adaugă 1,5-2% agar. Se fierbe pentru topirea şi omogenizarea agarului. Se filtrează prin vată şi se repartizează în recipienţi adecvaţi. Se sterilizează prin autoclavare. Pentru agarul glucozat înclinat se repartizează înainte de sterilizare 5-6 ml de mediu în eprubete, care se înclină imediat după scoaterea din autoclav. 7. Agar cu extract de drojdie-glucoză-gelatină (Frazier) (Mediu pentru izolarea şi identificarea fungilor ce contaminează produsele alimentare) Triptonă 5g Extract de drojdie 3g Gelatină 4g Agar 15 g Apă distilată 1000 ml pH=7,0 Se repartizează câte 12-15 ml în eprubete. Se sterilizează. 8. Agar cu triptonă-extract de drojdie-glucoză (plate count agar) (PCA) (mediu pentru determinarea numărului total de bacterii aerobe din produsele alimentare (NTG) Triptonă 5g Extract de drojdie 2,5 g Glucoză 1g Agar 15 g Apă distilată 1000 ml pH=7,0 137

9. Agar cu triptonă-extract de drojdie-glucoză-lapte (TEGA) Triptonă 5g Extract de drojdie 2,5 g Glucoză 1g Agar 15-20 g Apă distilată 1000 ml pH=7,1 Se repartizează câte 90 ml în baloane de 200 ml. Se sterilizează. În momentul folosirii la 90 ml mediu de bază topit şi răcit la 50°C. Se adaugă în condiţii aseptice 10 ml de lapte degresat, sterilizat, încălzit la 50°C. După răcire mediul prezintă un aspect alb-opac. 10. Bulion nutritiv cu ser La bulionul nutritiv cu pH 7,4 se adaugă ser sanguin de bou sau cal în proporţie de 1/10. Se omogenizează. 11. Agar nutritiv cu ser La agarul nutritiv cu pH 7,4, topit şi răcit la 50°C se adaugă ser sanguin de bou sau de cal în proporţie de 1/10. Se omogenizează. 12. Agar cu lapte La geloza nutritivă repartizată în eprubete, sterilizată şi lichefiată, se adaugă lapte smântânit, sterilizat, în cantitate de 1-2 ml, la 10 ml de mediu. Amestecul se toarnă în plăci Petri, în care se introduce inoculul. Mediul prezintă un aspect alb-opac. Interpretare. Coloniile de bacterii proteolitice peptonizează cazeina din lapte, iar mediul din jurul lor se clarifică. 13. Lapte turnesolat Se fierbe laptele. Se centrifughează timp de 15 minute la 3.000 rpm pentru îndepărtarea grăsimii. Se repartizează în eprubete şi se sterilizează prin autoclavare 15 minute la 105-106°C. Pentru a urmări modificările de pH ale mediului se foloseşte lapte turnesolat (se prepară la fel ca şi laptele degresat), la care se adaugă soluţie apoasă, sterilă de turnesol 10%, până la obţinerea culorii albastru-violet. Eprubetele cu mediu se însămânţează cu tulpina de testat şi se incubează 24-48 de ore la 37°C. Interpretare. - are loc dezvoltarea coloniilor bacteriene, fără modificarea mediului de cultură; - dezvoltarea coloniilor bacteriene poate fi însoţită de coagularea laptelui, fără acidifiere (mediul nu îşi modifică culoarea); - poate avea loc dezvoltarea coloniilor bacteriene, însoţită de coagulare şi acidifiere (decolorarea mediului); - dezvoltarea coloniilor bacteriene poate fi însoţită de alcalinizare, datorită producerii de amine şi amoniac (mediul îşi menţine culoarea). 14. Ser coagulat Se recoltează aseptic, ser sanguin (de bovine sau cabaline). Se repartizează câte 5-6 ml în eprubete sau câte 12-15 ml, în plăci Petri şi se coagulează, în poziţie înclinată, în etuvă la 70-75°C. După coagulare, mediul prezintă o culoare alb-cenuşie. Interpretare. Dacă are loc proteoliza mediul se va lichefia şi vor apare depresiuni pe suprafaţa lui în jurul şi în dreptul coloniilor bacterine. 15. Agar cu sânge Geloză nutritivă, pH = 7,2-7,4

90 ml 138

Sânge defibrinat 5-10 ml La geloza nutritivă topită şi răcită la 50°C se adaugă sânge defibrinat. Se însămânţează. Se incubează la 37°C. Interpretare. Coloniile bacteriene se pot dezvolta, fără ca mediul să se modifice; poate avea loc decolorarea şi clarificarea mediului, în dreptul şi în jurul coloniilor datorită unui proces de hemoliză şi hemodigestie; poate avea loc colorarea mediului în galben-verzui sau maroniu, în dreptul şi în jurul coloniilor datorită transformării hemoglobinei în met-hemoglobină sub acţiunea apei oxigenate. 16. Apă peptonată Peptonă Clorură de sodiu Apă distilată pH = 7,4

10 g 5g 1000 ml

17. Agar cu malţ Făină de malţ 250 g Agar 15-20 g Apă de robinet 1000 ml pH = 3,5 La 1000 ml de apă de la robinet se adaugă 250 g făină de malţ. Amestecul se introduce în baie de apă, la 57°C, timp de o oră. Temperatura se ridică treptat până la 63°C, menţinându-se la această valoare, până ce reacţia pentru amidon devine negativă. Se filtrează prin tifon. Se adaugă serul. Amestecul se fierbe până la topirea agarului, se filtrează şi se repartizează în cantităţi de 100-200 ml, în baloane. Se sterilizează prin autoclavare. În momentul folosirii, la mediul topit şi răcit la 50°C, se adaugă cantitatea necesară de acid tartric 10% sau acid lactic 5%, pentru obţinerea pH-ului de 3,5. 18. Agar Sabouraud Peptonă 10 g Glucoză (maltoză) 30-40 g Agar 15-20 g Apă distilată 1000 ml pH = 5,4-5,6 Se repartizează în recipienţi adecvaţi. Se sterilizează prin autoclavare. Pentru împiedicarea dezvoltării biotei bacterine, la un litru de mediu sterilizat, topit şi răcit se adaugă 20.000 UI penicilină şi 40 mg streptomicină. Streptomicina se poate înlocui cu 200 mg cloramfenicol sau cu 250 mg neomicină. Mediul cu antibiotice se foloseşte imediat sau în maximum 5-6 zile, dacă se păstrează la frigider. Pentru izolarea unor miceţi patogeni, pH-ul mediului va fi de 10,5. 19. Agar cu glucoză şi extract de drojdie Extract de drojdie 5g Glucoză 20 g Agar 15-20 g Apă distilată 1000 ml pH = 3,5 Se repartizează 100-200 ml în recipienţi adecvaţi. Se sterilizează. În momentul folosirii la mediul topit şi răcit la 50°C, se adaugă acid tartric 10% sau acid lactic în cantitatea necesară obţinerii pH-ului de 3,5. 20. Mediul cu arginină-dihidrolază (Sutter) Peptonă

2g 139

Clorură de sodiu 5g K2HPO4 (fosfat acid de potasiu) 0,3 g Albastru de bromtimol 0,03 g L-arginină 10 g Apă distilată 1000 ml Se încălzeşte uşor în vederea dizolvării tuturor componenţilor. Se distribuie porţii de 5 ml în tuburi de 13 x 100 mm, închise cu capac cu şurub. Se autoclavează 10 minute la 121°C. pH final = 6,0 ± 0,2. 21. Mediul Bayrd-Parker Mediul de bază: Triptonă 10 g Extract de carne de vită 5g Extract de levură 1g Piruvat de sodiu 10 g Glicină 12 g Clorură de litiu 6H2O 5g Agar 20 g Se autoclavează 15 minute la 121°C. pH-ul final = 7,0 ± 0,2. Dacă se intenţionează folosirea imediată a mediului, acesta se menţine topit la 48-50°C, înaintea adăugării mediului de îmbogăţire. Ca alternativă, se poate păstra mediul solidificat la 4°C ± 1°C, 48 de ore. Înainte de folosire mediul se foloseşte. Mediul de îmbogăţire este reprezentat de Bacto EY telurit. Mediul complet: Se adaugă aseptic 5 ml de mediu de îmbogăţire (45-50°C), Bacto EY telurit la o bază topită la 95°C. Se amestecă bine, evitând formarea bulelor şi se fac porţii de 15-18 ml care se toarnă în plăci Petri sterile de 15 x 100 mm. Mediul trebuie să fie foarte opac. Plăcile se usucă înainte de folosire. 22. Agar cu bilă-esculină Extract de carne de vacă 3g Peptonă 5g Esculină 1g Oxgall 40 g Citrat feric 0,5 g Agar 15 g Apă distilată 1000 ml Se încălzeşte cu agitare pentru dizolvarea componentelor. Se repartizează în tuburi, se autoclavează 15 minute, la 121°C şi se solidifică în eprubete, în poziţie înlinată. pH final = 6,6 ± 0,2. 23. Agar cu sulfit de bismut (Wilson-Blair) Peptonă 10 g Extract de carne de vită 5g Dextroză 5g N2HPO4 (fosfat acid de azot) 4g FeSO4 0,3 g Sulfit de bismut (indicator) 8g Verde briliant 0,025 g Agar 20 g Apă distilată 1000 ml Se amestecă bine componentele şi se încălzeşte cu agitare. Se fierbe 1 minut, pentru obţinerea unei suspensii uniforme (precipitatul nu se dizolvă). Se răceşte la 45-50°C. Se formează o suspensie de precipitat, prin agitare uşoară. Se toarnă porţii de câte 20 ml, în plăci Petri sterile. Se lasă plăcile la uscat aproximativ 2 ore, cu capacul întredeschis; se închid plăcile; pH final = 7,6 ± 0,2. Nu se autoclavează. 140

Plăcile se prepară în ziua premergătoare însămânţării şi se păstrează la întuneric. Selectivitatea se diminuează în decurs de 48 de ore. 24. Bază de agar cu sânge (infuzie de agar) Infuzie de inimă 375 g Tiotonă 10 g Clorură de sodiu 5g Agar 15 g Apă distilată 1000 ml Se încălzeşte uşor pentru dizolvarea componentelor. Se autoclavează 20 minute la 121°C; pH final = 7,3 ± 0,2. 25. Agar cu infuzie de creier-inimă (0,7%) (BHI) (pentru determinarea enterotoxinei stafilococice) Se prepară o cantitate adecvată de bulion cu infuzie creier-inimă. Se ajustează pH-ul la 5,3 cu 1 N HCl. Se adaugă agar în concentraţie 0,7%. Se dizolvă prin fierbere uşoară. Se repartizează porţii de 25 ml în tuburi. Se autoclavează 10 minute la 121°C. 26. Bulion şi agar BHI (Brain Heart Infusion) Infuzie de creier cu carne de viţel 200 g Infuzie de inimă cu carne de vită 250 g Peptonă 10 g Clorură de sodiu 5g Na2HPO4 12 H2O 2,5 g Dextroză 2g Apă distilată 1000 ml Se dizolvă ingredientele în apă distilată prin încălzire uşoară. Se repartizează bulionul în sticle sau tuburi pentru păstrare. Se autoclavează 15 minute la 121°C. pH final = 7,4 ± 0,2. Pentru prepararea agarului cu infuzie de creier inimă se adaugă 15 g de agar la 1 litru de bulion BHI. Se încălzeşte pentru dizolvarea agarului, înainte de introducerea în sticle, pentru depozitare. Se autoclavează 15 minute la 121°C. 27. Bulion cu bilă verde briliant 2% (BGB) (Brilliant Green Bile) Peptonă 10 g Lactoză 10 g Oxgall 20 g Verde briliant 0,0133 g Apă distilată 1000 ml Se dizolvă peptona şi lactoza în 500 ml de apă distilată. Se adaugă 20 g de oxgall deshidratat, dizolvat în 200 ml de apă distilată. pH-ul acestei soluţii trebuie să fie de 7,0-7,5. Se amestecă şi se adaugă apă, până la 975 ml. Se ajustează pH-ul la 7,4. Se adaugă 13,3 ml de verde briliant apos 0,1%, în apă distilată. Se adaugă apă distilată până la un litru. Se repartizează în tuburi de 20 x 150 mm, ce conţin tubuleţe inversate de fermentare de 10 x 75 mm, asigurându-ne că nivelul lichidului acoperă complet flacoanele respective. Se autoclavează 15 minute la 121°C. pH final = 7,2 ± 0,1. 28. Bulion cu bromcrezol purpuriu Bază: Peptonă Extract de carne de vită Clorură de sodiu Bromcrezol purpuriu Apă distilată

10 g 3g 5g 0,04 g 1000 ml 141

Se adaugă 5 g de carbohidraţi la 1 litru de bază. Se autoclavează 10 minute la 121°C. pH final = 7,0 ± 0,2. Pentru folosirea cu Vibrio parahaemolyticus se adaugă 25 g de clorură de sodiu per litru. 29. Bulion dextroză cu bromcrezol purpuriu (BCP) (Bromcresol Purple Dextrose Broth) Dextroză 10 g Extract de carne de vită 3g Peptonă 5g Bromcrezol purpuriu (1,6% în etanol) 2 ml Apă distilată 1000 ml Se dizolvă ingredientele în apă distilată. Se repartizează în tuburi 12-15 ml. Se autoclavează 15 minute la 121°C. pH final 7,0 ± 0,2. 30. Agar semisolid şi bulion Brucella Triptonă sau tripticază 10 g Tiotonă sau peptamină 10 g Dextroză 1g Autolizat de luvuri 2g Clorură de sodiu 5g NaHSO3 0,1 g Apă distilată 1000 ml Se formează o suspensie din ingrediente, într-un litru de apă distilată şi se amestecă bine. Se autoclavează 15 minute la 121°C. pH final = 7,0 ± 0,2. Pentru prepararea agarului semisolid Brucella se adaugă 1,8 g de agar şi 10 ml soluţie roşu neutru. Se încălzeşte uşor cu agitare pentru dizolvarea agarului. Se fierbe 1 minut. Se autoclavează 15 minute la 121°C. 31. Agar Campylobacter pentru screening biochimic Bază: Triptonă 10 g Peptamină 10 g Glucoză 1g Extract de levuri 2g Clorură de sodiu 5g Bisulfit de sodiu 0,1 g Agar 1,8 g Apă distilată 1000 ml Se dizolvă ingredientele în apă distilată prin încălzire până la fierbere. Se răceşte şi se repartizează în 4 porţii de câte 250 ml. Soluţia de roşu neutru. Se dizolvă 0,2 g de roşu neutru în etanol, într-un flacon volumetric de 100 ml. Se adaugă apă distilată până la semnul marcat. Se adaugă 2,5 ml de soluţie de roşu neutru la trei din volumele de 250 ml de bază. Substanţele biochimice. Glicină 1%, NaCl 3,5%, Cisteină 0,02%, Nitrit 1%. Se adaugă 2,5 g glicină la una din porţile de 250 ml ale bazei cu soluţie roşu-neutru, 0,75 g NaCl la a doua porţie cu soluţie de roşu neutru şi 0,05 g cisteină la a treia porţie cu soluţie roşu neutru. Se adaugă 2,5 g, KNO3, la a patra porţie, fără soluţie de roşu neutru. Se reglează valoarea de pH la 7,0 ± 0,2 şi se împarte în 7-10 ml per tub. Se autoclavează 15 minute la 121°C. 32. Bulion de îmbogăţire pentru Campylobacter Bază: Pudră Lab-Lemco (Oxoid L 29) Peptonă NaCl 142

10 g 10 g 5g

Extract de drojdie 6g Apă distilată 950 ml Se repartizează în flacoane de dimensiuni adecvate. Se autoclavează 15 minute la 121°C. pH final 7,5 ± 0,2. 33. Agar de izolare pentru Campylobacter Bază: Bulion nutritiv 25 g Cărbune bacteriologic 4g Hidrolizat de cazeină 3g Deoxicolat de sodiu 1g Sulfat feros 0,25 g Piruvat de sodiu 0,25 g Agar 12 g Extract de drojdie 2g Apă distilată 1000 ml Se autoclavează 15 minute la 121°C. pH final 7,4 ± 0,2. După autoclavare şi înainte de distribuirea agarului în plăci Petri, se adaugă 100 ml de apă distilată, încălzită şi 4,4 ml de soluţie de cefoperazonă şi 4,4 ml de soluţie de cicloheximidă. Se îndepărtează spuma din ultima placă cu un depresor pentru limbă steril. Flambarea plăcii va precipita cărbunele. Plăcile cu agar se feresc de lumină în timpul depozitării. Suplimentul de antibiotic este compus din cefoperazonă sodică (30 mg) şi cicloheximidă (100 mg). Se dizolvă 0,75 g de cefoperazonă sodică în 100 ml de apă distilată. Se sterilizează prin filtrare prin membrane de 0,45 microni. Se dizolvă 2,5 g de cicloheximidă în 20-30 ml, 70% etanol în 100 ml, în flacoane volumetrice. Se adaugă apă distilată până la valoarea gradată şi se sterilizează prin filtrare printr-o membrană de 0,45 microni. 34. Agar cu Novobiocină-Cefsulodin-Irgasan (CIN) sau Agar selectiv Yersinia (YSA) (Yersinia Selective Agar) A. Mediu de bază: Peptonă specială 20 g Extract de drojdie 2g Manitol 20 g Acid piruvic 2g NaCl 1g MgSO4 7H2O (10 mg/ml) 1 ml Agar 12 g Apă distilată 756 ml B. Soluţie de Irgasan 0,40% în 95% etanol 1 ml Poate fi păstrat la -20°C, o săptămână C. Soluţie de dezoxicolat Dezoxicolat sodic 0,5 g Apă distilată 200 ml Se încălzeşte până la fierbere; se răceşte la 50-55°C. D. Hidroxid de sodiu 5N 1 ml E. Roşu neutru 3 mg/ml 10 ml F. Cristal violet 0,1 mg/ml 10 ml G. Cefsulodin 1,5 mg/ml 10 ml Poate fi păstrat la -70°C Se scoate la temperatura camerei înainte de folosire. H. Novobiocină 0,25 mg/ml 10 ml I. Clorură de stronţiu 10% sterilizată 10 ml 143

Preparare: Se dizolvă ingredientele soluţiei A (mediul bazal) în apă, care se fierbe. Se răceşte până la 80°C (prin menţinerea în baie de apă de 50°C, timp de 10 minute). Se adaugă soluţia B (Irgasan) şi amestecă bine. Se răceşte la 50-55°C. Se adaugă soluţia C (dezoxicolat). Soluţia trebuie să fie limpede. Se adaugă soluţia D şi H. Soluţia I se adaugă uşor. Se ajustează pH-ul la 7,4 cu 5N NaOH. Se repartizează în plăci Petri în porţii de câte 15-20 ml. Agarul selectiv pentru Yersinia deshidratat preparat comercial (Difco) cu suplimente poate fi substituit. Se urmează instrucţiunile de preparare. 35. Bulion cu ficat mărunţit Ficat proaspăt de vită 500 g Peptonă 10 g K2HPO4 1g Amidon solubil 1g Apă distilată 1000 ml Se mărunţeşte ficatul şi se adaugă în apă. Se fierbe la foc redus, o oră. Se răceşte. Se ajustează pH-ul la 7,0 şi se fierbe din nou 10 minute. Se filtrează prin tifon steril şi se stoarce lichidul în exces. Se adaugă celelalte ingrediente şi se ajustează pH-ul la 7,0. Se adaugă apă până la 1000 ml. Se filtrează prin hârtie de filtru groasă. Se păstrează bulionul şi carnea separat în congelator. Se adaugă în eprubete ficatul mărunţit. Se autoclavează 15 minute la 121°C. 36. Agar Christensen Bază: Peptonă 1g NaCl 5g Dextroză 1g KH2PO4 2g Roşu fenol 0,012 g Agar 15 g Apă distilată 900 ml Concentratul de uree: Uree 20 g Apă distilată 100 ml Se ajustează pH-ul la 6,8 ± 0,1. Se sterilizează prin filtrare. Se dizolvă agarul în 900 ml de apă distilată şi se adaugă celelalte ingrediente. Se autoclavează 15 minute la 121°C. Se răceşte la 50°C ± 0,2°C. Se adaugă concentratul de uree. Se amestecă bine şi se repartizează în eprubete sterile. Se toarnă în pante cu bază adâncă. 37. Mediul cu carne fiartă Inimă de vită 454 g Peptonă 20 g Dextroză 2g NaCl 5g Apă distilată 1000 ml Se obţine o suspensie de mediu comercial fiert deshidratat în 100 ml de apă rece distilată. Se amestecă şi se lasă să stea 15 minute, pentru ca particulele să se umezească bine; sau se distribuie 1,25 g în tuburi test de 20 x 150 mm, după care se adaugă 10 ml de apă distilată rece şi se amestecă bine pentru ca toate particulele să fie umezite. Se autoclavează 20 minute la 121°C. pH final 7,2. 38. Emulsie de gălbenuş de ou 50% Se spală ouăle cu o perie tare şi se drenează. Se lasă să se îmbibe o oră în HgCl2 0,1%. Se drenează soluţia; se înlocuieşte cu 70% etanol şi se la înmuiat 30 minute; se drenează etanolul; ouăle se sparg aseptic şi se îndepărtează albuşurile; gălbenuşurile se extrag cu o seringă sterilă sau cu o pipetă cu 144

gura largă; se plasează într-un container steril şi se amestecă aseptic cu un volum egal de soluţie salină sterilă 0,85%; se păstrează la 4°C, până la folosire. 39. Soluţia de gelatinază 5% Gelatinază 5g Apă distilată 100 ml Se suspendă gelatinaza în apă distilată. Se centrifughează 10 minute la 9.500 rpm şi se sterilizează prin filtrare prin membrane de 0,45 microni. Se repartizează în porţii de câte 100 ml în sticle. 40. Bulion Sare-Glucoză-Teepol Extract de carne de vită 3g Peptonă 10 g NaCl 30 g Glucoză 5g Violet de metil 0,002 g Soluţie Teepol 4 ml Apă distilată 1000 ml Se repartizează câte 10 ml de soluţie în tuburi de 20 x 150 mm. Dacă trebuie examinate cantităţi mai mari de probă se folosesc vase cu capace cu şurub ce conţin 225 ml de bulion pentru 25 g de probă. Se autoclavează 15 minute la 121°C. pH final 7,4 ± 0,2. 41. Mediul GPS Gelatină 10 g NaCl 10 g K2HPO4 5g Apă distilată 1000 ml Agar (dacă se preferă mediul solid) 10 g Se încălzeşte cu agitare continuă pentru dizolvarea componentelor. Se autoclavează 15 minute la 121°C. 42. Agar cu infuzie de inimă Infuzie de inimă 500 g Triptoză 10 g Clorhidrat de sodiu 5g Agar 15 g Apă distilată 1000 ml Se încălzeşte uşor pentru dizolvare; se toarnă în tuburi de 16 x 150 ml, până la o treime din înălţimea lor; se autoclavează 15 minute la 121°C. Înainte de solidificarea mediului tuburile se înclină pentru obţinerea pantelor de 45 cm şi a bazelor de 2-3 cm. pH final 7,4 ± 0,2. 43. Agar Hektoen Enteric (HE) Peptonă Extract de drojdie Săruri biliare Lactoză Sucroză Salicină Clorură de sodiu Tiosulfat de sodiu Citrat de amoniu feric Albastru de bromtimol

12 g 3g 9g 12 g 12 g 2g 5g 5g 1,5 g 0,064 g 145

Fuxină acidă 0,1 g Agar 13,5 g Apă distilată 1000 ml Se încălzesc toate componentele, până la temperatura de fierbere, cu agitare continuă pentru dizolvarea acestora. Nu se fierb mai mult de 1 minut. Se evită supraîncălzirea. Se răceşte în baie de apă. Se repartizează porţii de câte 20 ml, în plăci Petri sterile de 15 x 100 mm. Se lasă să se usuce 2 ore cu capacul parţial deschis. pH-ul final 7,6 ± 0,2. Nu se păstrează mai mult de o zi. 44. Bulion cu glucoză Hugh Leifson Peptonă 2g Extract de levură 0,5 g NaCl 30 g Dextroză 10 g Bromcrezol purpuriu 0,015 g Agar 3g Apă distilată 1000 ml Se încălzeşte cu agitare continuă pentru dizolvarea agarului. Se ajustează pH-ul la 7,4 ± 0,2. Se autoclavează 15 minute la 121°C. 45. Bulion cu lactoză Extract de carne de vită 3g Peptonă 5g Lactoză 5g Apă distilată 1000 ml Pentru E. coli: se dizolvă toate ingredientele şi se repartizează în porţii de câte 10 ml în tuburi de 20 x 150 mm cu tubuleţe de fermentaţie de 10 x 75 mm inversate. Se autoclavează 15 minute la 121°C. pH final 6,9 ± 0,2. Pentru Salmonella se toarnă porţii de 225 ml în baloane Erlenmeyer de 500 ml. După autoclavare, timp de 15 minute la 121°C şi imediat înainte de folosire volumul se ajustează aseptic la 225 ml; pH final 6,9 ± 0,2. 46. Mediul Lactoză-Gelatină (pentru C. perfringens) Triptoză 15 g Extract de drojdie 10 g Lactoză 10 g Roşu fenol (soluţie) 0,05 g Gelatină 120 g Apă distilată 1000 ml Se încălzeşte pentru dizolvarea triptozei, a extractului de levuri şi a lactozei în 400 ml de apă. Se formează o suspensie de gelatină în 600 ml de apă şi se încălzeşte la 50-60°C cu agitare continuă pentru dizolvare. Se amestecă cele două soluţii. Se ajustează pH-ul la 7,5 ± 0,2. Se adaugă roşu fenol şi se amestecă bine. Se repartizează porţii de câte 10 ml in tuburi de 16 x 150 mm; se autoclavează 10 minute la 121°C; dacă nu se foloseşte în decurs de 8 ore se elimină aerul prin încălzeşte la 50-70°C, cu 2-3 ore înainte de folosire. 47. Bulion cu Lauril-Triptoză (LT) Triptoză sau tripticază Lactoză K2HPO4 KH2PO4 NaCl

20 g 5g 2,75 g 2,75 g 5g 146

Lauril sulfat de sodiu 0,1 g Apă distilată 1000 ml Se repartizează porţii de 10 ml în tuburi cu tubuleţe de fermentare. Se autoclavează 15 minute la 121°C; pH final 6,8 ± 0,2. 48. Bulion cu Lauril-Triptoză-MUG (LT-MUG) Triptoză sau tripticază 20 g Lactoză 5g K2HPO4 2,75 g KH2PO4 2,75 g NaCl 5g Lauril sulfat de sodiu 0,1 g 4-metil umbeliferil beta-D-glucuronid (MUG) 50 mg Apă distilată 1000 ml Se prepară bulionul LT şi se adaugă MUG. Se dizolvă prin încălzire uşoară dacă este necesar. Se repartizează câte 10 ml în tuburi care conţin tubuleţe de fermentare inversate; se autoclavează 15 minute la 121°C; pH final 6,8 ± 0,2. 49. Agar Levine cu eozină-albastru de metilen (L-EMB) Peptonă 10 g Lactoză 10 g K2HPO4 2g Agar 15 g Eozină 0,4 g Albastru de metilen 0,065 g Apă distilată 1000 ml Se dizolvă toate ingredientele prin fierbere într-un litru de apă. Se repartizează câte 100 sau 200 ml în recipienţi corespunzători şi se autoclavează 15 minute la 121°C. pH final 7,1 ± 0,2. 50. Agar cu lizină, arginină şi fier Peptonă 5g Extract de levuri 3g Glucoză 1g N-Lizină 10 g L-Arginină 10 g Citrat feric de amoniu 0,5 g Tiosulfat de sodiu 0,04 g Bromcrezol purpuriu 0,02 g Agar 15 g Se ajustează pH-ul la 6,8; se încălzeşte prin fierbere şi se repartizează câte 5 ml în tuburi de cultură cu capac înşurubabil; se autoclavează la 121°C pentru 12 minute; se solidifică în poziţie înclinată pentru obţinerea de pante. 51. Agar Mac Conkey Peptonă Lactoză Săruri biliare Clorură de sodiu Roşu neutru Cristal violet Agar

20 g 10 g 1,5 g 5g 0,03 g 0,001 g 13,5 g 147

Apă distilată 1000 ml Se dizolvă ingredientele prin încălzire uşoară, prin agitare continuă. Se fierb 1-2 minute. Se autoclavează 15 minute la 121°C. Se răceşte la 45-50°C şi se împarte în porţii de 20 ml, care se repartizează în plăci Petri sterile. Se usucă la temperatura camerei, cu capacul închis. Nu se folosesc decât plăci perfect uscate. pH final 7,1 ± 0,2. 52. Agar cu extract de malţ Extract de malţ 30 g Agar 20 g Apă distilată 1000 ml Se dizolvă ingredientele în apă prin fierbere. Se autoclavează 15 minute la 121°C. Se repartizează câte 20-25 ml în plăci Petri sterile. pH final 5,5 ± 0,2. 53. Bulion cu extract de malţ Extract de malţ 15 g Apă distilată 1000 ml Se ajustează pH-ul la 4,7 ± 0,2. Se repartizează în tuburi sterile. Se autoclavează 15 minute la 121°C. 54. Mediul de mobilitate (pentru B. cereus) Tripticază 10 g Extract de drojdii 2,5 g Dextroză 5g Na2HPO4 2,5 g Agar 3g Apă distilată 1000 ml Se dizolvă agarul prin încălzire. Se repartizează porţii de 100 ml în sticle de 170 ml. Se autoclavează 15 minute la 121°C. pH final 7,4 ± 0,2. Se răceşte la 50°C. Se repartizează aseptic porţii sterile de 2 ml, în tuburi de 13 x 100 mm. Se păstrează la temperatura camerei cel mult 2 zile înainte de folosire. 55. Mediul de mobilitate nitrat, tamponat (pentru C. perfringens) Extract de carne de vită 3g Peptonă (Difco) 5g KNO3 1g Na2HPO4 2,5 g Agar 3g Galactoză 5g Glicerină 5 ml Apă distilată 1000 ml Se dizolvă toate ingredientele cu excepţia agarului. Se ajustează pH-ul la 7,3 ± 0,1. Se adaugă agarul şi se încălzeşte pentru dizolvare. Se împarte în porţii de 11 ml, care se repartizează în tuburi de 16 x 150 mm. Se autoclavează 15 minute la 121°C. Dacă nu se foloseşte în 4 ore se încălzeşte 10 minute în apă fiartă, apoi se răceşte brusc prin introducerea în apă rece. 56. Mediul MP-VP Peptonă tamponată 7g Glucoză 5g K2HPO4 5g Apă distilată 1000 ml Se dizolvă ingredientele în 800 ml de apă, prin încălzire uşoară. Se filtrează. Se răceşte la 20°C 148

şi se diluează la 1 litru. Se autoclavează 12-15 minute la 121°C. pH final 6,9 ± 0,2. Pentru izolarea lui V. parahaemolyticus se adaugă 30 g NaCl per litru. Pentru Salmonella se repartizează 10 ml în tuburi test şi se autoclavează 12-15 minute la 121°C. 57. Agar cu peptonă-extract de carne de vită-glicogen (PBG) Peptonă 10 g Extract de carne de vită 10 g Glicogen 4g Clorură de sodiu 5g Lauril-sulfat de sodiu 0,1 g Albastru de bromtimol 0,1 g Agar 15 g Apă distilată 1000 ml Se încălzeşte cu agitare pentru dizolvarea agarului. Se repartizează în flacoane corespunzătoare. Se autoclavează 15 minute la 121°C. pH final 7,0 ± 0,1. 58. Bulion cu cianură de potasiu (KCN) Cianură de potasiu 0,5 g Polipeptonă 3g NaCl 5g KH2PO4 0,225 g Na2HPO4 5,64 g Apă distilată 1000 ml Se dizolvă ingredientele şi se autoclavează 15 minute la 121°C. Mediul se răceşte şi se refrigerează la 5-8°C. pH final 7,6 ± 0,2. Se dizolvă 0,5 g KCN în 100 ml de apă distilată sterilă rece (5-8°C). Se foloseşte o pipetă cu bulă şi se adaugă 15 ml soluţie de KCN rece la 1 l de bază sterilă rece. Nu se pipetează cu gura. Se amestecă şi se repartizează aseptic câte 1,0-1,5 ml în tuburi sterile. 59. Mediul Rappaport-Vassiliadis Bulionul bază: Triptonă 5g Clorură de sodiu 8g KH2PO4 1,6 g Apă distilată 1000 ml Soluţia de clorură de magneziu: MgCl2 6H2O 400 g Apă distilată 1000 ml Soluţia de verde de malachit oxalat: Verde de malachit oxalat 0,4 g Apă distilată 100 ml Pentru prepararea mediului complet se combină 1000 ml de bulion bază, 100 ml de soluţie clorură de magneziu şi 10 ml de soluţie de verde de malachit oxalat (volumul total al mediului complet este de 1110 ml). Se repartizează câte 10 ml de mediu complet în tuburi de 16 x 150 mm. Se autoclavează 15 minute la 115°C. pH final 5,5 ± 0,2. Se păstrează la frigider şi se foloseşte în decurs de o lună. 60. Bulion şi Agar Sabouraud cu Dextroză Polipeptonă sau Neopeptonă 10 g Dextroză 40 g Apă distilată 1000 ml Se dizolvă complet componentele şi se repartizează în sticle în porţii de 40 ml. pH final 5,8. Se autoclavează 15 minute la 118°C-121°C. Pentru agarul Sabouraud cu dextroză se prepară bulionul 149

şi se adaugă 15-20 g de agar. pH final 5,6 ± 0,2. Se repartizează în tuburi şi se solidifică în pantă. Se autoclavează 15 minute la 118°C-121°C. 61. Bulion cu tripticază şi sare Tripticază 10 g Extract de drojdii 3g Apă distilată 1000 ml Se adaugă 0, 60, 80 şi 100 g de NaCl la 1 litru de bază, preparată din bulion 0, 6, 8 şi 10% bulion, pentru testele de toleranţă la sare. Se autoclavează 15 minute la 121°C. pH final 7,5 ± 0,2. 62. Bulion Shigella Bază: Triptonă 20 g K2HPO4 2g KH2PO4 2g NaCl 5g Dextroză 1g Tween80 1,5 ml Apă distilată 1000 ml Se autoclavează 15 minute la 121°C. pH final 7,0 ± 0,2. Soluţia de novobiocină: se cântăresc 50 mg de novobiocină şi se adaugă la 1 litru de apă distilată; se sterilizează prin filtrare, prin membrane de 0,45 microni; se adaugă 2,5 ml de concentrat la 225 ml de bază. 63. Mediul SIM Peptonă 30 g Extract de carne de vită 3g Fier peptonizat 0,2 g Tiosulfat de sodiu 0,025 g Agar 3g Apă distilată 1000 ml Se dizolvă ingredientele prin încălzire uşoară şi agitare ocazională. Se fierbe 1-2 minute, până când se dizolvă agarul. Se repartizează 6 ml de mediu în tuburi cu capac înşurubabil. Se sterilizează prin autoclavare 15 minute la 121°C. Mediul se solidifică în poziţie verticală. 64. Agar Simmons Citrat de sodiu 2H2O 2g NaCl 5g K2HPO4 1g NH4H2PO4 1g MgSO4 0,2 g Albastru de bromtimol 0,08 g Agar 15 g Apă distilată 1000 ml Se încălzeşte uşor pentru topirea ingredientelor. Se fierbe 1-2 minute pentru dizolvarea agarului. Se repartizează în tuburi de 13 x 100 mm până la 1/3 din înălţimea acestora. Se autoclavează 15 minute la 121°C. Înainte de solidificarea mediului tuburile se înclină pentru obţinerea pantelor de 45 cm şi a bazei de 2-3 cm. pH final 6,9 ± 0,2. 65. Agar tiosulfat-citrat-săruri biliare-sucroză (TCBS) Extract de drojdie 150

5g

Peptonă 10 g Sucroză 20 g Tiosulfat de sodiu 5H2O 20 g Citrat de sodiu 2H2O 10 g Colat de sodiu 3g Oxgall 5g NaCl 10 g Citrat feric 1g Albastru de bromtimol 0,04 g Albastru de timol 0,04 g Agar 15 g Apă distilată 1000 ml Se încălzeşte pentru dizolvarea ingredientelor şi se menţine la temperatura de fierbere 1-2 minute. Nu se autoclavează. Se repartizează câte 20 ml în plăci Petri sterile. pH final 8,6. 66. Agar tripticază soia Peptonă triptică 15 g Peptonă fitonă 5g NaCl 5g Agar 15 g Apă distilată 1000 ml Se încălzeşte cu agitare pentru dizolvarea agarului. Se fierbe un minut. Se repartizează în tuburi sau flacoane. Se autoclavează 15 minute la 121°C. pH final 7,3 ± 0,2. Pentru folosirea lui la izolarea lui V. parahaemolyticus se adaugă 25 g de NaCl. 67. Bulion triptic de soia cu ampicilină (TSBA) Peptonă triptică 15 g Peptonă fitonă 3g NaCl 5g K2HPO4­ 2,5 g Dextroză 2,5 g Apă distilată 1000 ml Se încălzeşte şi se agită uşor pentru dizolvare şi dispersare. Se autoclavează 15 minute la 121°C. pH final 7,3 ± 0,2. După răcire la 40-50°C şi sterilizare prin filtrare ampicilina trebuie să aibă concentraţia finală de 30 mg/litru. 68. Mediul Voges-Proskauer modificat Peptonă proteazică 7g NaCl 5g Dextroză 5g Apă distilată 1000 ml Se dizolvă ingredientele în apă şi se ajustează pH-ul dacă este necesar. Se repartizează câte 5 ml în tuburi sterile. Se autoclavează 10 minute la 121°C. pH final 6,5 ± 0,2. 69. Agar XLD (xiloză-lizin-dezoxicolat) Extract de drojdie L-lizină Xiloză Lactoză Sucroză Dezoxicolat de sodiu Citrat feric de amoniu

3g 5g 3,75 g 7,5 g 7,5 g 2,5 g 0,8 g 151

Tiosulfat de sodiu 6,8 g Clorură de sodiu 5g Agar 15 g Roşu fenol 0,08 g Apă distilată 1000 ml Se încălzeşte prin agitare uşoară, până la temperatura de fierbere. Nu se depăşeşte temperatura de fierbere. Se repartizează în plăci când mediul s-a răcit la 50°C. Se lasă să se usuce aproximativ 2 ore, cu capacul parţial deschis. Se închid plăcile. pH final 7,4 ± 0,2. Nu se păstrează mai mult de o zi. 70. Bază de agar selectiv Yersinia Extract de drojdie 2g Peptonă 17 g Peptonă protează 3g Manitol 20 g Dezoxicolat de sodiu 0,5 g Colat de sodiu 0,5 g NaCl 1g Piruvat de sodiu 2g Sulfat de magneziu 10 mg Agar 13,5 g Roşu neutru 30 mg Cristal violet 1 mg Irgasan 4 mg Apă distilată 1000 ml Se încălzeşte uşor până la dizolvarea completă a componentelor. Se sterilizează 15 minute la 121°C. Nu se depăşeşte temperatura de fierbere. Se răceşte la 45-50°C şi se adaugă aseptic 10 ml de supliment antimicrobian Yersinia, rehidratat (CN). Se amestecă bine şi se repartizează în plăci Petri sterile. Suplimentul antimicrobian Yersinia (CN): Cefsulodin 4 mg Novobiocină 2,5 mg 71. Agar Wagatsuma Extract de drojdie 3g Peptonă 10 g Clorură de sodiu 70 g K2HPO4 5g Manitol 10 g Cristal violet 0,001 g Agar 15 g Apă distilată 1000 ml Se încălzeşte cu agitare uşoară pentru dizolvarea agarului. Se ajustează pH-ul la 8,0 ± 0,2. Nu se autoclavează. Se răceşte la 50°C. Se spală globulele roşii de om sau de iepure de 3 ori cu soluţie fiziologică salină. Se adaugă 5% din volumul acestei suspensii la mediul răcit. Se amestecă şi se repartizează în plăci Petri (plăcile trebuie să fie bine uscate înainte de folosire). 72. Bulion tetrationat Polipeptonă Săruri biliare Carbonat de calciu Tiosulfat de sodiu 5H2O Apă distilată

5g 1g 10 g 30 g 1000 ml 152

Se suspendă ingredientele într-un litru de apă distilată, se amestecă şi se încălzesc, până ajung la temperatura de fierbere. Se răceşte la 45°C. Se depozitează la 5-8°C. pH final = 8,4 ± 0,2. 73. Agar TSI (Triple sugar iron) Mediul I Polipeptonă 20 g NaCl 5g Lactoză 10 g Sucroză 10 g Glucoză 1g Fe (NH4)2(SO4)2 6H2O 0,2 g Na2S2O3 0,2 g Roşu fenol 0,025 g Agar 13 g Apă distilată 1000 ml Mediul 2 Extract din carne de vită 3g Peptonă 15 g Peptonă protează 5g Glucoză 1g Lactoză 10 g Sucroză 10 g FeSO4 0,2 g NaCl 5g Na2S2O3 0,3 g Roşu fenol 0,024 g Agar 12 g Apă distilată 1000 ml Se suspendă ingredientele din Mediul 1 în apă distilată, se amestecă bine şi se încălzesc cu agitare uşoară. Se fierb 1 minut pentru dizolvarea completă a ingredientelor. Se autoclavează 15 minute la 118°C. Mediul 2 se prepară la fel ca şi Mediul 1, numai că autoclavarea se face 15 minute la 121°C. Tuburile se solidifică în poziţie înclinată pentru a obţine o pantă de 4-5 centimetri şi o bază de 2-3 centimetri. pH-ul final este de 7,3 ± 0,2 pentru Mediul 1 şi 7,4 ± 0,2 pentru Mediul 2. 74. Bulion cu lauril sulfat Triptoză Lactoză Clorură de sodiu Fosfat dipotasic Fosfat monopotasic Lauril sulfat de sodiu pH final = 6,8 ± 0,2

20 g 5g 5g 2,75 g 2,75 g 0,10 g

75. Bulion cu uree Uree 20 g Extract de drojdie 0,1 g KH2PO4 0,091 g Na2HPO4 0,095 g Roşu fenol 0,01 g Apă distilată 1000 ml Se dizolvă ingredientele în apă distilată. Nu se încălzeşte. Se sterilizează prin filtrare, prin 153

membrane de 0,45 μm. Se repartizează aseptic porţii de 1,5-3 ml în tuburi sterile. pH final = 6,8 ± 0,2. 76. Bulion cu malonat Extract de drojdie 1g (NH4)SO4 2g K2HPO4 0,6 g KH2PO4 0,4 g NaCl 2g Malonat de sodiu 3g Dextroză 0,25 g Albastru de bromtimol 0,025 g Apă distilată 1000 ml Se fierb ingredientele pentru dizolvare. Se autoclavează 15 minute la 121°C. Se repartizează câte 20-25 ml în plăci Petri sterile. pH final 5,5 ± 0,2. 77. Mediul TSA (tripticază-soia-agar) Peptonă triptică 15 g Peptonă-fitonă 5g NaCl 5g Agar 15 g Apă distilată 1000 ml Se dizolvă agarul prin încălzire. Se repartizează în tuburi. Se autoclavează 15 minute la 121°C. pH final = 7,3 ± 0,2. Pentru V. parahaemolyticus se adaugă 25 g NaCl. 78. Mediul MYP (manită, gălbenuş de ou, polimixină) Digerat peptic din ţesut animal 10 g Extract de carne 1g D-manitol 10 g NaCl 10 g Roşu fenol 0,25 g Agar 15 g pH final = 7,1 ± 0,2. Procedeu: Se dizolvă 46 grame din mediul deshidratat, în 900 ml de apă distilată şi se fierbe până la dizolvarea totală a ingredientelor. Se autoclavează 15 minute la 121°C. Se răceşte la 55°C. Se adaugă în mod aseptic soluţia de sulfat de polimixină B (FD 003) sterilizată prin filtrare, în aşa fel ca antibioticul să reprezinte 100 U.I./ml de mediu şi 100 ml emulsie de gălbenuş de ou (FD 045) sterilă la 1000 ml mediu. Se amestecă bine şi se toarnă în plăci Petri. Mediul are un aspect de gel clar sau uşor opalescent, roşu-oranj. 79. Bulion cu nitrat Extract de carne de vacă 3g Peptonă 5g KNO3 1g Apă distilată 1000 ml Se dizolvă ingredientele. Se repartizează câte 5 ml în tuburi de 16 x 125 mm. Se autoclavează 15 minute la 121°C. pH final = 7,4 ± 0,2. 80. Agar cu tirozină 1. Baza. Se prepară agarul nutritiv. Se repartizează porţii de 100 ml în sticle de 170 ml. Se autoclavează la 121°C timp de 15 minute. Se răceşte la 48°C. 2. Suspensia de tirozină. Se suspendă 0,5 g de L-tirozină în 10 ml de apă distilată în tuburi de 154

cultură. Se amestecă bine ingredientele cu un mixer Vortex. Se autoclavează 15 minute la 121°C. 3. Mediul final. Se combină 100 ml de bază cu suspensia de tirozină sterilă. Se amestecă cu grijă prin agitarea sticlelor de 2-3 ori. Se repartizează aseptic câte 3,5 ml în tuburi de 13 x 100 ml. Se formează pante şi se răcesc rapid pentru a preveni separarea tirozinei. 81. Bulion cu lizozim 1. Baza. Se prepară bulionul nutritiv. Se repartizează porţii de 99 ml în sticle de 170 ml. Se autoclavează 15 minute la 121°C. Se răceşte la temperatura camerei înainte de folosire. 2. Soluţia de lizozim. Se dizolvă 0,1 g de lizozim în 65 ml de soluţie sterilă de NaCl 0,01N. Se încălzeşte până începe să fiarbă, 20 de minute. Se diluează 100 ml cu soluţie NaCl 0,01N. Între timp se dizolvă 0,1 g lizozim în 100 ml de apă distilată. Se sterilizează prin filtrare prin membrane de 0,45 μm. Mediul trebuie să fie steril. Se adaugă 1 ml de soluţie de lizozim la 99 ml de bulion nutritiv. Se amestecă şi se repartizează în poziţii de câte 2,5 ml în tuburi sterile de 13 x 100 mm. 82. Bulion Demi-Fraser Protează peptonă 5g Hidrolizat enzimatic de cazeină 5g Extract de drojdie 5g Extract de carne de bovine 5g Clorură de sodiu 20 g Clorură de litiu 3g Fosfat disodic 12 g Fosfat monopotasic 1,35 g Esculină 1g Citrat feri-amoniacal 0,5 g pH final = 7,2 ± 0,2. Mediul deshidratat în cantitate de 57,85 se suspendă în 990 ml de apă distilată şi se fierbe până la dizolvarea completă. Se autoclavează 15 minute la 121°C. Se răceşte la 50°C. Se amestecă bine şi se repartizează în recipienţi adecvaţi. 83. Agar PALCAM (pentru identificarea Listeriozei) Digerat peptic din ţesuturi animale 23 g Amidon 1g Clorură de sodiu 5g Manitol 10 g Citrat feri-amoniacal 0,5 g Esculină 0,8 g Glucoză 0,5 g Clorură de litiu 15 g Roşu fenol 0,08 g Agar 13 g pH final = 7,0 ± 0,2. Mediul deshidratat (6,9 g) se suspendă în 1000 ml apă distilată şi se fierbe până la dizolvarea completă. Se autoclavează 15 minute la 121°C. Se răceşte la 50°C şi se adaugă aseptic conţinutul rehidratat în 5 ml apă distilată sterilă, al unei fiole cu supliment selectiv pentru Listeria (PALCAM), FD 061, format din 50.000 UI polimixină, 10 mg cetozidimă şi 2,5 mg acriflavină hidroclorică. Se amestecă bine şi se toarnă în plăci Petri. Mediul are aspect de gel uşor opalescent sau clar, de culoare roşie. 84. Bulion GST (Glucoză-Sare-soluţie Teepol) Extract de carne de vită Peptonă

3g 10 g 155

NaCl 30 g Glucoză 5g Violet metil 0,002 g Soluţie Teepol 4 ml Apă distilată 1000 ml Se repartizează porţii de 10 ml în tuburi de 20 x 150 mm. Se autoclavează 15 minute la 121°C. pH final 7,4 ± 0,2. 85. Agar TSC (Triptoză-Sulfit-Cicloserină) Triptoză 15 g Extract de drojdie 5g Soiatonă 5g Citrat feric de amoniu 1g Metabisulfit de sodiu 1g Agar 20 g Apă distilată 1000 ml Se încălzesc cu agitare uşoară pentru dizolvare. Se ajustează pH-ul la 7,6 ± 0,2. Se repartizează porţii de 250 ml în recipienţi de 500 ml. Se autoclavează 15 minute la 121°C. Se menţine mediul la 50°C, înainte de folosire. Soluţia D-cicloserină. Se dizolvă 1 g D-cicloserină (pudră cristalină albă) în 200 ml de apă distilată. Se sterilizează prin filtrare şi se păstrează la 4°C, până la folosire. Mediul final. Se adaugă 20 ml soluţie D-cicloserină la 250 ml de bază. Se adaugă 20 ml la 50% emulsie de gălbenuş de ou. Se amestecă bine şi se repartizează 18 ml în plăci Petri de 15 x 100 ml. Se acoperă plăcile cu un prosop şi se lasă la temperatura camerei 24 de ore înainte de folosire. 86. Bulion TPGY (tripticază-peptonă-glucoză-drojdie) Tripticază 50 g Peptonă 5g Extract de drojdie 20 g Dextroză 4g Tioglicolat de sodiu 1g Apă distilată 1000 ml Se dizolvă ingredientele şi se repartizează în tuburi. Se autoclavează 10 minute la 121°C. pH final = 7,0 ± 0,2. Se refrigerează la 5°C. 87. Agar pentru anaerobi cu gălbenuş de ou Ouă proaspete Extract de drojdie Triptonă Peptonă-protează NaCl Agar Apă distilată Se autoclavează 15 minute la 121°C. pH final = 7,0 ± 0,2.

2 5g 5g 20 g 5g 20 g 1000 ml

13.5. Diluanţi 1. Apă distilată tamponată a) Soluţia stoc: Fosfat monopotasic Apă distilată

34 g 500 ml 156

Se ajustează pH-ul la 7,2 cu NaOH (aproximativ 175 ml) şi se aduce volumul la un litru cu apă distilată. b) se iau 1,25 ml din soluţia A şi se completează la volumul de 1 litru cu apă distilată. Aceasta reprezintă soluţia de lucru care se repartizează în recipienţi şi se sterilizează. 2. Soluţia 2% (1,25%) citrat de sodiu Citrat de sodiu anhidru Apă distilată

20 (12,5) g 1000 ml

3. Ser fiziologic Clorură de sodiu Apă distilată

8,5 g 1000 ml

4. Ser fiziologic fenolat Clorură de sodiu Fenol Apă distilată

8,5 g 2,5 g 1000 ml

5. Ser fiziologic peptonat Clorură de sodiu Peptonă Apă distilată pH = 7,0

8,5 g 1,0 g 1000 ml

După amestecarea ingredientelor conform reţetelor specificate, se repartizează volumele dorite în recipienţi corespunzători. Se sterilizează prin autoclavare 15 minute, la 121°C. Pentru uşurarea mojarării şi omogenizării alimentelor cu conţinut mare de grăsime, la diluanţii folosiţi pentru prima diluţie (1/5 sau 1/10) este indicată adăugarea la reţete a tergitolului sau a produsului Tween80 în proporţie de 1%.

157

Grilă de autoevaluare În imaginea alăturată apar 3 genuri bacteriene diferite, cultivate pe mediul EMB. Acestea sunt numerotate de la 1 la 3. Care concluzie este adevărată? a) Bacteria 1 este Gram pozitivă şi incapabilă să fermenteze glucoza. b) Bacteria 2 este Gram negativă şi fermentează sucroza c) Bacteria 3 este Gram negativă şi fermentează lactoza d) Toate cele trei bacterii sunt Gram negative şi fermentează sucroza e) Nici o concluzie nu este adevărată

Sistemul microtest din imaginea alăturată este folosit pentru identificarea: a) Cocilor Gram pozitivi b) Cocilor Gram negativi c) Bacililor Gram pozitivi d) Bacililor Gram negativi e) Spirochetelor

Staphylococcus aureus este de obicei: a) alfa hemolitic; b) beta hemolitic;

c) gama hemolitic; d) delta hemolitic; e) nehemolitic Cultura pură bacteriană a fost însămânţată întrun mediu cu gelatină. Tuburile cu mediu au fost incubate 48 de ore şi apoi refrigerate timp de 30 minute. Săgeata indică un microorganism: a) capabil să degradeze gelatina; b) incapabil să degradeze gelatina; c) capabil să coaguleze plasma citratată; d) incapabil să coaguleze plasma citratată; e) capabil să producă catalază 158

Fiecare dintre cele două bulioane cu triptonă este inoculat cu bacterii diferite. Se adaugă câteva picături de reactiv E-Kovacs. Săgeata indică un test: a) Voges-Proskauer pozitiv; b) Voges-Proskauer negativ; c) Indol pozitiv; d) Indol negativ; e) Roşu metil pozitiv.

Săgeata din imagine indică ca bacteria analizată: a) produce acizi din glucoză; b) produce baze din glucoză; c) produce indol prin degradarea triptofanului; d) nu produce indol prin degradarea triptofanului; e) este capabilă să utilizeze citratul ca unică sursă de carbon

Bacteriile cultivate pe mediul MSA (mannitol-salt-agar), indicate de sageată sunt: a) capabile să fermenteze manitolul; probabil Stp. epidermidis; b) capabile să fermenteze manitolul; probabil Stp. aureus; c) incapabile să fermenteze manitolul; probabil Stp. epidermidis; d) incapabile să fermenteze manitolul; probabil Stp. aureus; e) capabile să fermenteze glucoza; probabil Stp. aureus; Imaginea prezintă dezvoltarea unor bacterie într-un mediu de mobilitate. Cea din tubul al doilea este: a) mobilă, posedă flageli; b) imobilă, fără flageli; c) mobilă, fără flageli; d) imobilă, posedă flageli Rezultatele testului roşu-metil prezentate pentru două bacterii diferite. Care concluzie este corectă? a) Tubul 1 indică un pH acid ca rezultat al fermentării lactozei; b) Tubul 2 indică un pH acid ca rezultat al fermentării lactozei; c) Tubul 1 indică un pH acid ca rezultat al fermentării glucozei; d) Tubul 2 indică un pH acid ca rezultat al fermentării glucozei; e) Nici una ditre concluzii nu este corectă. Patogenii care de obicei sunt beta hemolitici, includ: a) Staphylococcus aureus b) Streptococcus pyogenes (grup A) c) Streptococcus pneumoniae

d) răspunsurile a) şi b); e) răspunsurile a), b) şi c).

159

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ 1. Andrews W., Manual of food quality control, Rev. 1, Microbiological Analysis, FAOUN, Roma, 1992 2. Apostu S., Microbiologia produselor alimentare - Lucrări practice, vol. III, Editura Risoprint, Cluj-Napoca, 2006 3. Diaconescu Andra, Microbiologie specială, Editura AgroTehnica, Bucureşti, 2002 4. Euzéby J. P., LPSN, 2007. 5. Ivana Simona, Bacteriologie veterinară specială, Editura Ceres, Bucureşti, 2002 6. Ivana Simona, Bacteriologie generală, Editura Ştiinţelor Medicale, Bucureşti, 2005 7. Ivana Simona, Tratat de bacteriologie medical-veterinară şi introducere în micologie, Editura Ştiinţelor Medicale, 2006 8. James M. J., Martin J. L., David A. G., Modern food microbiology 7th ed., Ed. Springer, California, 2005 9. Răpuntean Ghe., Răpuntean S., Bacteriologie veterinară specială, Editura Academic Press, Cluj-Napoca, 2006 Imagini 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23.

http://www.pprdiag.co.uk http://www.vetmed.wsu.edu http://www.bact.wisc.edu http://www.bact.wisc.edu http://medinfo.ufl.edu http://www.bakteriologieatlas.de http://www.mc.maricopa.edu http://micro.fhw.oka-pu.ac.jp http://msc.tigr.org http://textbookofbacteriology.net http://res2.agr.ca http://www.univie.ac.at http://www.meddean.luc.edu http://www.doctorfungus.org

160

Lucrarea practica 1

Lucrarea practica 2

Lucrarea practica 3

Lucrarea practica 4

Lucrarea practica 5

Lucrarea practica 6

Lucrarea practica 7

Lucrarea practica 8

Lucrarea practica 9

Lucrarea practica 10