Manual Practicas Citogenetica General 2016

 

Departamento de Biología Celular y Genética

Universidad Nacional Mayor de San Marcos (Universidad del Perú, DECANA DE AMERICA) Facultad de Ciencias Biológicas Escuela Académico Profesional de Ciencias Biológicas Escuela Académico Profesional de Genética y Biotecnología

Manual de Prácticas CITOGENETICA GENERAL

“ the chromosomes do not obey  obey  the laws of genetic they make them” them”   Darlington) 

Blga. María Angélica Siles Vallejos Bach. Yajahaira Carbajal Gonzales

 

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INTRODUCCIÓN

La citogenética, tradicionalmente conocida como la fusión de dos disciplinas: la genética y la citología, constituye en la actualidad una disciplina muy útil para la comprensión de los fenómenos genéticos puesto va más allá de la simple observación de los cromosomas. La citogenética es hoy entendida como la disciplina que estudia las implicancias genéticas de la estructura y el comportamiento de los cromosomas durante los procesos de división celular. Permite también el estudio de la cromatina en el núcleo interfásico aportando información sobre su organización y disposición en el mismo. Mucho se ha avanzado desde las primeras observaciones de los cromosomas con técnicas simples, y en los últimos años el estudio de la citogenética se ha concentrado en la estructura y evolución del genoma de diferentes especies, tanto animales como vegetales, lo que posibilita el mapeo genético. Un mapa citogenético permite posicionar genes, así como a los marcadores ligados a éstos con respecto a los marcadores estructurales de regiones específicas del cromosoma. La citogenética clásica nos permite conocer el conjunto de cromosomas de una especie, determinando su morfología, su número, el contenido de ADN y heterocromatina, la ubicación de las regiones organizadoras del nucléolo; en el caso de los núcleos meióticos permite detectar homologías entre genomas parentales en híbridos y poliploides, o el revelado de homologías crípticas, entre otros. Sin embargo, a pesar de su avance, la citogenética clásica no nos permite resolver otro tipo de problemas como por ejemplo: el origen de los alopoliploides en ausencia de marcadores visibles, o la presencia de reestructuraciones que no alteren la morfología ni el número de cromosomas, la presencia de regiones introgresantes o la distribución espacial de genomas o cromosomas, entre otros muchos aspectos. Y una información citogenética detallada es indispensable para combinar de forma coherente la información genética disponible con la estructura física de los cromosomas, es así que, aprovechando el avance de las técnicas de biología molecular, la citogenética se provee de herramientas que permiten el estudio estructural y funcional detallado de los genomas, dando origen a lo que llamamos citogenética molecular. Actualmente la mayoría de las técnicas de la citogenética molecular se basan en la tecnología de la hibridación in situ con fluorocromos  fluorocromos   o FISH, la cual abrió la posibilidad de estudiar regiones específicas de la cromatina gracias a la información de la secuencia de ADN; esto a su vez es de suma utilidad en la detecciónderivada de alteraciones cromosómicas submicroscópicas numéricas o Citogenética General  |

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estructurales, en el estudio detallado de segmentos cromosómicos específicos, las regiones centroméricas y teloméricas, brindando la posibilidad de establecer mapas de secuencias e identificación de cromatina extraña en nuevas líneas de cultivo, en el caso de vegetales por ejemplo, así como de resolver muchas preguntas, incluso a veces en ausencia de metafases, observando las señales de núcleos interfásicos. A esta tecnología se une la posibilidad técnica de aislar cromosomas enteros o partes de éstos, para obtener librerías específicas de utilidad para el aislamiento de secuencias y genes de interés presentes sobre un cromosoma particular. Es decir, que en la actualidad el desarrollo de la citogenética va más allá de la genómica descriptiva, puesto que las nuevas metodologías permiten combinar técnicas de inmunocitogenética y de citogenética molecular para el estudio de la arquitectura nuclear y de los procesos bioquímicos implicados en la transcripción y la replicación del ADN.

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OBJETIVOS GENERALES

1. Familiarizar al estudiante con las técnicas básicas de citogenética. 2. Familiarizar al estudiante en la observación y discriminación de cromosomas vegetales y animales. 3. Familiarizar al estudiante en el análisis del comportamiento cromosómico durante el ciclo celular. Competencias y destrezas que deben ser desarrolladas

A. Competencias Transversales:

1. Adquirir una actitud crítica ante la in información formación recibida, a través de la reflexión y discusión razonada de cuestiones genéticas y método científico. 2. Desarrollar actitudes de colaboración y trabajo en equipo para el buen ejercicio de su futura labor l abor profesional. B. Competencias Específicas:

a) Cognitivas 1. Adquirir los conocimientos conocimientos bás básicos icos específicos específicos de la Citogenética. 2. Integrar los conocimientos adquiridos, junto con los de otras asignaturas, en el conjunto del saber científico.

b) Procedimentales / Experimentales 1. Manejar fuentes de información información sobre temas relacionados con el área. 2. Desarrollar capacidades de decisión y destreza en las técnicas experimentales más usuales e importantes dentro del carácter teórico-práctico de la citogenética. 3. Capacidad de sintetizar y relacionar aspectos de la Genética Genética y la Citogenética ya vistos con anterioridad. 4. Adquirir hábito y actitud para la resolución de p problemas roblemas que puedan puedan ser trasladados en el futuro a problemas profesionales que se planteen.

c) Actitudinales 1. Adquirir una actitud crítica crítica ante la informac información ión recibida, a través de la reflexión y discusión razonada de cuestiones genéticas y método científico aplicado a la citogenética. 2. Coordinación con sus compañeros a través de un trabajo en equip equipo. o.

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Capítulo I Citogenética Clásica

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SESION 1

GENERALIDADES Para la observación al microscopio, las muestras pueden ser preparadas en forma temporal o directamente, en láminas permanentes. Para ello, se debe seguir un procedimiento general que incluye varios momentos:

1.- SELECCIÓN DEL TEJIDO En todos los casos, tanto en animales como en vegetales, ha de tenerse en cuenta la disponibilidad tanto del espécimen como del tejido; igualmente importante resulta el índice mitótico del tejido así como los reactivos disponibles en el laboratorio. Lo más utilizado en citogenética animal es: linfocitos de sangre periférica, células de médula ósea, cultivo de fibroblastos, cultivo de líquido amniótico, hígado, bazo, orina, entre otros. En el caso de vegetales, se utiliza las raíces primarias o secundarias germinadas a partir de semillas, bulbos, o yemas.

2.- SEMBRADO DE MUESTRA Cuando se trabaja con especímenes animales, la toma de muestra y la siembra debe hacerse en condiciones estériles; igualmente, todo el material a utilizar debe encontrarse esterilizado. Debe usarse guantes, mascarilla, bombas de succión y flameo constantes durante el proceso de sembrado. En cada sembrado deberá cambiarse de agujas y el material de vidrio utilizado así este haya sido previamente esterilizado.

2.- PRE  – TRATAMIENTO (PRE-FIJACION) Para estudiar las características de los cromosomas, ya sea en tejidos animales como en vegetales, se utilizan agentes que inhiben la formación del huso acromático, lo que aumenta significativa el número metafases. Otra consecuencia de en la forma utilización de inhibidores es de el acortamiento y dispersión de los cromosomas lo que facilita su individualización y conteo. Entre los inhibidores más utilizados tenemos: Colchicina, Colcemid, Colcemid, para-Dicloroben para-Diclorobenceno, ceno, 8-hidroxiquinolina, entre entre otros.

4.- HIPOTONIZACION Para obtener una buena dispersión de los cromosomas metafásicos, es necesario romper la membrana celular. Para ello se utilizan las soluciones hipotónicas como cloruro de potasio o citrato de sodio trisódico, a distintas concentraciones. En el caso de tejidos vegetales, como se encuentra la pared celular, la hipotonización suele ser un poco más difícil, generalmente se mantiene el tejido en agua por tiempo más o menos prolongado.

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5.- FIJACIÓN La fijación tiene la finalidad preservar las estructuras celulares de interés. Los fijadores pueden actuar de manera variable, pudiendo congelar las proteínas sin combinarse con ellas o combinándose con ellas. Otros se reducen al contacto con las sustancias orgánicas y forman un precipitado fino o pueden actuar como oxidantes. El fijador a elegir depende de la muestra a estudiar, pero el más utilizado es una solución de etanol (o metanol) y ácido acético glacial, en una proporción de 3:1. El material debe permanecer por los menos 30 minutos en la solución fijadora. Si las muestras han sido fijadas correctamente y son mantenidas en el congelador (-20ºC), pueden conservarse durante años. Es preferible preparar el fijador en el momento del trabajo y no conservar la solución por mucho tiempo, puesto que se oxida y va perdiendo sus propiedades.

6.- MONTAJE Y COLORACION En el caso caso de utiliz utilizar ar la técnica de goteo de suspensión celular, celular, hay q que ue tener en cuenta lo siguiente: a) Las láminas limpias y desengrasadas; ponen a enfriar a 4°C deben en unaestar mezcla de etanol: agua destiladase1:1, lo que favorece la adherencia del tejido sobre sobre la superficie. superficie. b) El goteo de la suspensión celular se hace desde una distancia aproximada de 40 40 a 50 cm, con la lámina ligera ligeramente mente inclinada en un ángulo de 30°, esto permite una mejor dispersión de las células. En el caso de tejidos vegetales, se utiliza la técnica del aplastado o “squash”;

previamente el tejido se ha macerado en el colorante por un tiempo determinado, y el “squash” se realiza sobre la lámina por taobjeto agregando gotas de colorante. Los colorantes pueden ser ácidos, básicos o neutros. Estos términos se refieren a los grupos funcionales coloreados. Consecuentemente, algunos tiñen el núcleo, otros el citoplasma, o pueden ser específicos, pudiéndose emplear dos o tres colorantes a la vez en un mismo corte. La tinción puede ser: a) Progresiva: en la cual, el tejido se dej deja a permanecer e en n el colorante h hasta asta alcanzar la intensidad del color preciso. b) Regresiva: en la cual, el tejido se deja sobre teñir para luego diferenciarlo hasta conseguir la intensidad i ntensidad conveniente. La tinción puede ser temporal o permanente y teñir toda la estructura o solo sectores de la misma, dependiendo de la técnica empleada y del análisis citogenética a seguir. Citogenética General  |

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7.- APLASTADO O SQUASH Consiste en presionar uniformemente el tejido con la finalidad de obtener una sola capa de células (monocapa).

8.- MONTAJE Es la etapa final de todo el proceso, consiste en preservar el preparado citológico colocando el cubreobjeto de forma temporal (por días o semanas) o permanente (por años). Para el montaje temporal se sella la laminilla con parafina líquida o esmalte de uñas transparente. Para el montaje permanente se utiliza Bálsamo de Canadá, o resinas sintéticas como Euparal, Entellan, Merckoglass, entre otras, siendo la ventaja de estas últimas, de ser transparentes. SOLUCIONES

a) ADHESIVOS: Se usan para impregnar las láminas portaobjetos con una cubierta que permita la adherencia del material biológico.

Gelatina Gelatina  Alumbre de cromo y potasio  Agua destilada

5 grs 0,5 grs 1000 cc

b) PRE - FIJADORES:  

8 - hidroxiquinolina 0,002M 8 - hidroxiquinolina  Agua destilada

 

0,058 200 ccgrs

Colchicina 0,025% Preparar solución de 0,025 gr de colchicina en 100 ml de agua destilada o de una pastilla de 0,5 mg, se pulveriza y se disuelve en 5 ml de agua destilada.

c) FIJADORES:  

Solución de Farmer (algunos autores le llaman Carnoy I)  Ácido acético glacial Etanol

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25 cc 75 cc 8 

 

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Solución de Carnoy II  Alcohol etílico  Ácido acético glacial Cloroformo

60 cc 10 cc 30 cc

d) COLORANTES  

Orceína Acética Solución Madre: Se calientan 55 cc de ácido acético glacial. Al iniciarse la ebullición, se agregan 2 gr de Orceína; se agita la solución cuidadosamente y se mantiene a fuego lento durante 10 minutos. Se deja enfriar y se filtra.

 

Orceína Lacto Acética 1% (OLA)  Ácido láctico  Ácido acético glacial Orceína

50 cc 50 ml 1 gr

Disolver Filtrar. la orceína en ácido láctico y luego adicionar ácido acético.  

Orceína Acética 2%  Ácido acético 40%  Agua destilada Orceína

70 cc 30 cc 1,5 – 2 gr

Se calienta el ácido en baño María y se junta con la orceína, enseguida se adiciona el agua, cuidadosamente. Se deja enfriar y filtrar.  

Carmín Propiónico  Ácido propiónico  Agua destilada Carmín

 

45 cc 55 cc 0,5 gr

Giemsa Solución Madre: Disolver 1 gr de Giemsa en 84 cc de metanol y 50 cc de glicerina. Colocar la solución en baño María a 60 C, agitar continuamente durante 10 minutos. Dejar enfriar y posteriormente, filtrar. °

Solución de trabajo: Diluir la solución madre en buffer Sorensen, de acuerdo a la concentración que requiera el Giemsa. Citogenética General  |

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e) VARIOS  

Solución Targa  Ácido acético  Ácido láctico  Agua destilada

 

45 cc 25 cc 30 cc

Buffer Sorensen, pH 6,8 Preparar dos soluciones: Solución A: Disolver 16,0848 gr de fosfato dibásico de sodio en 1 litro de agua destilada Solución B. Disolver 8,1654 gr de fosfato ácido de potasio en 1 litro de agua destilada Mezclar 9,0 ml de A con 10,5 ml de B para obtener un pH 6,8. ajustar el

pH, si es necesario. Guardar en frasco estéril y en refrigeración.   KCl 0,075M Diluir 5,592 gr de KCl en 1 litro de agua bidestilada.  

Solución Salina Citratada (2xSSC) Disolver 17,55 gr de cloruro de sodio y 8,82 gr de citrato de sodio en 1 litro de agua destilada. Conservar en recipiente cerrado y mantener en refrigeración.

 

HANKS STOCK Solución A: KCl NaCl

8 gr 160 gr

Disolver en 600 cc de agua destilada y llevar a 1000 cc. Agregar 2 cc de cloroformo.

Solución B: Na2HPO4 .12 H2O KH2PO4  Dextrosa

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2,4 gr 1,2 gr 10 gr

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Disolver en 600 cc de agua destilada, agregar 80 cc de rojo fenol 0,5%, completar a 1000cc. Agregar 2 cc de cloroformo. Tomar 50 cc de solución A y 50 cc de solución B, completar a 1000 cc.  

Hidróxido de Bario Diluir 5 gr de hidróxido de bario en 100 cc de agua destilada. Preparar en el momento de usar. Antes de usar, debe filtrarse la solución.

 

Nitrato de Plata acuoso, 2% Disolver 2 gr de plata en 100 cc de agua destilada.

 

Tripsina, 0,5% a) Medio Diluyente: NaCl KCl Na2HPO4.12H2O

8 gr 0,2 gr 0,063 gr

Dextrosa 2 gr Disolver en el mismo orden en 600 ml de agua destilada y luego completar a 1 litro.

b) Solución Tripsina 0,5% Disolver lentamente 5 gr tripsina en 1L de diluyente y filtrar. Para disolver, se agrega el diluyente suavemente y al matraz se le agita en círculo para evitar que se produzcan grumos. Luego, se sigue agregando diluyente hasta completar 1 litro. Se agregan 2 cc de rojo fenol al 0,5% y se deja a 37 C por dos horas. °

 

Solución para lavar láminas 3 partes de etanol 1 parte de HCl

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SESION 2 OBSERVACION DE MICRONÚCLEOS EN CÉLULAS EPITELIALES DE LA MUCOSA ORAL I.

INTRODUCCIÓN

Los micronúcleos (MN) son pequeños cuerpos extra nucleares que se forman durante la división celular por fragmentos cromosómicos acéntricos o cromosomas completos que no segregaron adecuadamente, quedando varados en el citoplasma, para posteriormente formar su propia membrana nuclear y posicionarse dentro del citoplasma y guardando propiedades similares a las del núcleo principal. Su número aumenta ante un efecto genotóxico por lo que son utilizados como una prueba de monitoreo de daño genético en una amplia gama de células y organismos. Se pueden analizar a partir de mucosa bucal o nasal, células epiteliales de vejiga, linfocitos de sangre. La utilización de células epiteliales de la mucosa oral como biomarcador de riesgo genético visualizando micronúcleos ha sido bien documentada desde los años ochenta. Luego de varios estudios, los l os investigadores postularon que este sistema puede utilizarse para el estudio de efectos genotóxicos. En la actualidad y gracias a la implementación de diferentes técnicas, como el uso de anticuerpos contra el cinetocoro, la hibridación in situ de sondas con marcas fluorescentes (FISH) o la amplificación in situ de secuencias genéticas (PRINS), se ha logrado la identificación de micronúcleos con cromosomas específicos, además de obtener información del mecanismo de genotoxicidad, distinguiendo entre un efecto clastogénico (fragmentos de cromosomas) y un efecto aneugénico (pérdida de cromosomas).   La diferencia entre un efecto u otro se hace con respecto al centrómero, es decir, si en el MN se identifica la presencia del centrómero, se interpreta como la pérdida de un cromosoma y, por lo tanto, un efecto aneugénico; mientras que la falta de detección del centrómero en un MN se explica como un fragmento cromosómico producto de un evento clastogénico, aunque es mediante el uso combinado de sondas específicas para el centrómero y los telómeros que se puede hacer una Citogenética General  |

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interpretación más acertada del tipo de daño que dio origen a un MN (Fenech et al., 2011b).

EJEMPLOS: CÉLULAS ANIMALES

CÉLULAS ANIMALES

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SESION 3 OBSERVACION DE CROMOSOMAS MITOTICOS EN VEGETALES i.

INTRODUCCION

Usualmente los libros de texto, cuando se refieren al estudio de la mitosis y de la meiosis, ponen énfasis en la diferenciación de los distintos estadios de la división celular, más que en los hechos que ocurren y en el significado de éstos en el proceso general de la mitosis y la meiosis. La mitosis es el proceso de división celular que mantiene constante el número de cromosomas. El cromosoma mitótico se observa durante este proceso, siendo la metafase la etapa en la que alcanza su máxima condensación. Cada cromosoma está compuesto por una larga fibra f ibra de cromatina condensada que presenta un alto grado de heterogeneidad, conformando una serie de estructuras, las cuales se mantienen a lo largo de todo el ciclo celular, permitiendo la caracterización de la especie. La primera estructura que salta a la vista se refiere a una estrangulación o constricción primaria, que separa la fibra en dos porciones o brazos de los cromosomas, esta constricción primaria recibe el nombre de centrómero. El centrómero no se tiñe con colorantes básicos y de acuerdo a la posición que ocupa a lo largo de la fibra, le confiere al cromosoma una morfología determinada, la cual se mantiene constante de una generación a otra, y es la misma para todos los individuos normales de la misma especie, por lo que constituye un primer marcador citogenético. En algunos cromosomas, existe una segunda estrangulación, llamada constricción secundaria, secundaria, separando un fragmento de cro cromosoma mosoma que recibe el nombre de satélite, cuyo tamaño y posición son fijos cuando existe, por lo que es considerado como un marcador citogenético. En esta constricción suele ubicarse la región organizadora del nucléolo (NOR). Los extremos de los cromosomas reciben el nombre de telómeros o regiones teloméricas. Estas regiones confieren estabilidad al cromosoma y presentan una relación con la membrana nuclear, la cual se evidencia con más claridad durante la meiosis.

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Para la obtención de cromosomas mitóticos de manera que puedan ser adecuadamente observados e individualizados, las técnicas citogenéticas utilizan un paso previo a la fijación, en el cual se trata el tejido, ya sea vegetal o animal, con sustancias inhibidoras de la formación del huso mitótico, permitiendo acumular un mayor número de metafases. Estos inhibidores del huso ocasionan, también, también, el acortamiento de los cromosomas lo que facilita su individualización y conteo. En general, en el caso de los vegetales, se utilizan las raíces secundarias que puedan originarse a partir del enraizamiento principal de un esqueje, bulbo, tubérculo, semilla, etc. Hay que tener en cuenta que las raíces germinadas a partir de semillas casi siempre se recubren de sustancias de reserva, lo que dificulta la observación de los cromosomas. El estudio de la mitosis en los diferentes organismos es interesante porque permite la observación observación de forma directa de la base base física de la herencia y la forma de transmisión de los genes de una célula a otra. Además, es útil por su aplicación en citotaxonomía y mejora genética de plantas y animales, debido a que se puede observar observar la morfología cromosómica así ccomo omo su número, lo que proporciona más caracteres de clasificación de las especies. En nuestro caso, observaremos el comportamiento de los cromosomas durante la metafase mitótica identificando los diferentes sectores que los componen.

II.

OBJETIVOS

  Individualizar los cromosomas e identificarlos.   Recuento del número cromosómico   Reconocimiento de la morfología cromosómica

 



III.

MATERIALES

faba, Allium   Raíces de Viciasativum, cepa, Allium Lens



culinaris, Pisum sativum.

       



  

Solución de Colchicina 0,5%  Carnoy  Orceína lacto acética 2%  Láminas y laminillas 

IV.

        

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

 



  Hoja Lunasdedeafeitar reloj  o de bisturí Papel filtro  Pinzas y estiletes  Papel lente 

PROCEDIMIENTO.

a)  Obtención de cromosomas mitóticos en vegetales  1. Coloque las raíces en solución de colchicina 0,5% durante 2 2. horas. Enjuagar con ag agua ua destilada, destilada, 5 minutos Citogenética General  |

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3. Fijar en carnoy, 30 minutos 4. Enjuagar con ag agua ua destilada, destilada, 5 minutos 5. Macerar en HCl 1N, 10 minutos a temperatura ambiente. 6. Agregar solución Targa, 15 minutos 7. Colorear las raíces co con n orceína acética 2%, 20 minutos 8. Pase la raíz a una lámina y corte el ápice 9. Añada 1 ó 2 gotas de OLA 2% fresca 10. Cubra con la laminilla y con la ayuda de un lápiz, golpee suavemente sobre el tejido para que éste se disperse. 11. Realice el aplastado o “squash” en forma más o menos fuerte, ayudándose del papel filtro. 12. Observe al microscopio.

Nota: Es importante establecer el tiempo de pre - fijación para cada tipo de muestra utilizada. b) Observación de metafases metafases polares polares Observe las metafases polares, identifique e individualice los

V.

cromosomas ubicando las estructuras de los mismos. ACTIVIDADES

1. Realice esquemas esquemas de su suss obse observaciones. rvaciones. 2. Determine el número diploide de la especie con la cual está trabaj trabajando. ando. 3. Determine si hay presencia de constricción secundaria en el complemento; si ésta existiera, determine su número y en qué cromosoma(s) está. 4. Fotografíe las mejores metafases, a 100x.

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VI.

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EJEMPLOS

Figura 1.  1.  Cromosomas mitóticos de Vicia faba, “haba”; la flecha señala la constricción secundaria

Figura 2. 2. Cromosomas mitóticos de Vicia faba, “haba”; la flecha señala la constricción secundaria seguida de la región SAT.

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Figura 3. Cromosomas 3. Cromosomas mitóticos de Allium de  Allium cepa , “cebolla”; la flecha señala el centrómero

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SESION 3

OBSERVACION DE CROMOSOMAS MITOTICOS EN MAMÍFEROS  I.

INTRODUCCION

En mamíferos, la obtención de cromosomas mitóticos se da en aquellos tejidos en los que las mitosis son más frecuentes. Estos tejidos pueden ser por ejemplo: sangre periférica, médula ósea, orina, hígado, entre otros. Hay que tener en cuenta que las técnicas citogenéticas difieren según el tejido utilizado. En animales de fácil obtención y que pueden ser sacrificados, el tejido más utilizado es la médula ósea, ya que es un tejido que renueva sus elementos constantemente. En el caso de animales difíciles de colectar o que no deben ser sacrificados, se utilizan las técnicas de cultivo de tejidos. Para elevar el número de metafases a obtener, se inyecta Colchicina al animal vivo, interfiere enenla formación mitótico. el caso de animales viejosla ocual mantenidos cautiverio del porhuso largo tiempo,Ense les inyecta una suspensión de levadura lo que induce la proliferación de leucocitos (Lu y Elder, 1980). Es importante el uso de soluciones hipotónicas ya que permiten la separación correcta de los cromosomas, evitando superposiciones. Estas soluciones fueron utilizadas por primera vez por Hsu (1952) y su empleo fue decisivo para determinar correctamente el número diploide en seres humanos por Tjio y Levan (1956).

II.

OBJETIVOS



  Observación cromosomas mitóticos en mamíferos Recuento delde número cromosómico   Reconocimiento de la morfología cromosómica





III.

MATERIALES

  Ratones blancos adultos (entre 5 y 8 meses de edad), uno por cada sub grupo de trabajo   Solución de colchicina 0,01% (1 ml/100 gr peso corporal)   Jeringa hipodérmica de tuberculina









  Cloroformo Solución de KCl 0,075 M



Citogenética General  |

         

Carnoy fresco Giemsa 4% Láminas y laminillas Estuche y tabla de disección Tubos de centrífuga de polietileno y con tapa rosca   Pipetas Pasteur, nuevas

   



 

   Beakers Recipientes de vidrio

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  Vasos de coloración de vidrio   Estufa regulada   Refrigeradora

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  Microscopio óptico   Papel lente

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

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

IV.

PROCEDIMIENTO A. Obtención de los cromosomas: cromosomas: 1. Inyectar la colchicina 0, 01% a los ratones, intraperitonealmente. Dejar actuar por espacio de 1 hora. Cuide que el animal no sufra durante el proceso. 2. Sacrificar al animal en en forma rápida y cuidadosa, evitando en todo momento sufrimiento por parte del animal. 3. Obtener los huesos lar largos gos completamente limpios. 4. Con una jeringa de tuberculina previamente cargada con solución hipotónica, lavar la médula ósea presente en los huesos y depositarla en un tubo de centrífuga con 5 ml de solución hipotónica. Completa hasta 8 ml de solución hipotónica. Homogenizar con pipeta Pasteur. 5. Incubar a 37 C por 40 minutos. 6. Centrifugar a 1200 1200 rpm, por por 10 minutos. minutos. Eliminar el sobrenadante. sobrenadante. 7. Agregar 4 cc de solución fijadora fría. Homogenizar Homogenizar suavemente con pipeta Pasteur. 8. Centrifugar a 1200 1200 rpm por por 10 minutos. Eliminar el so sobrenadante. brenadante. 9. Agregar 1 cc de solución solución fijadora fría, gota a gota sobre el se sedimento. dimento.  Adicional 4 cc de solución fijadora. Homogenizar y dejar a temperatura ambiente por 20 a 30 minutos. 10. Centrifugar a 1200 rpm por 10 minutos. 11. Lavar el material con solución fijadora fría, dos o tres t res veces. 12. Eliminar el sobrenadante hasta dejar un volumen pequeño de sedimento. Agregar solución fijadora y homogenizar. 13. Dejar reposar la suspensión en el fijador como mínimo 1 media hora o durante toda la noche en refrigeración. °

Fig. 1:  1:  Ejemplo de cómo inyectar a un ratón por la vía intraperitoneal.

B. Preparación de láminas: Utilizar láminas nuevas y colocarlas en un recipiente con agua destilada y etanol (1:1), refrigerarlas. Las láminas preparadas serán coloreadas con el siguiente procedimiento: Citogenética General  |

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1. Sacar las láminas y dejar caer 2 gotas de la suspensión, suspensión, evitando la sobreposición. 2. Dejar secar secar las láminas a temperatu temperatura ra ambiente 3. Colorear con Giemsa 4% por 8 a 12 minutos. Monitorear la ccoloración. oloración. 4. Enjuagar con buffer Sorensen o agua destilada y secar al a ambiente mbiente 5. Observar al microscopio 6. Fotografiar las mejores placas.

V.

ACTIVIDADES 1. Identifique las características del complemento complemento cromosómico. cromosómico. 2. Fotografíe la mejor metafase, a 100x.

VI.

EJEMPLOS

A

B

C Figura1(A –  C):  C):  Cromosomas

mitóticos de Mus musculus. musculus. Observe cómo va modificándose la fibra, conforme avanza el proceso de condensación.

NOTA: Estas placas metafásicas corresponden al trabajo realizado por tus compañeros de años mayores. Citogenética General  |

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SESION 4

OBSERVACION DE CROMOSOMAS MEIOTICOS EN VEGETALES Y ANIMALES

I.

INTRODUCCIÓN

Las transformaciones que sufren los cromosomas a través de todo el proceso meiótico son muy importantes para la comprensión de la genética. En el transcurso de la meiosis, el aspecto de los cromosomas se modifica notablemente, sufriendo espiralizaciones y acortamientos, se entrecruzan y desespiralizan; éstos son los detalles que se analizarán en la presente práctica. Para la obtención de cromosomas meióticos en vegetales se utilizan botones florales muy tiernos y en el caso de animales es muy útil el  tejido gonadal, usualmente los testículos, en los que se puede encontrar todos los tipos celulares que intervienen en la espermatogénesis. La aplicación de las técnicas que aquí se presentan se dirige especialmente a la obtención de microesporocitos o espermatocitos en los diversos estadios de la Meiosis, a fin de permitir la observación y caracterización de los distintos componentes del núcleo meiótico, así como sus interrelaciones a lo largo del proceso de división.

II.

OBJETIVOS   Observación de de las transformaciones transformaciones sufridas por los cro cromosomas mosomas durante el proceso meiótico.   Analizar fenómenos de sobrecruzamiento, sobrecruzamiento, coorientación y segregación segregación en condiciones normales.

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III.

MATERIALES   Botones florares tiernos de Tradescantia virginiana     Testículos de Mus musculus , adulto    Testículos de Ortópteros machos, adultos    Carnoy   Carmín propiónico al 1%   Giemsa 2%   Citrato de sodio al 1%

  Fijador metanol-ácido acético (3:1)   Pinzas   Estiletes   Placas petri   Lunas de reloj   Tubos de centrífuga de polietileno, con tapa rosca   Mechero de alcohol   Láminas y laminillas

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IV.

2016 - I 

PROCEDIMIENTO  

 ) TEJIDO VEGETAL (Darlington & La Cour, 1970  ) Modelo: Tradeschantia virginiana 

1. Retire los botones más tiernos de Tradeschantia virginiana y con la ayuda de un estilete, abra los botones y colóquelos en solución Carnoy durante 40 minutos. 2. Identifique las anteras anteras de la flor y retírelas retírelas.. 3. Coloque las anteras sobre una lámina portaobjeto que contenga carmín propiónico. 4. Bajo un microscopio estereoscópico divida las anteras en dos partes y extraiga la masa de esporocitos presionando las anteras con la punta del estilete. Las paredes de las anteras deberán luego ser removidas y desechadas. Espere a que el colorante penetre el material, cinco minutos aproximadamente. 5. Colocar una laminilla cuidadosamente sobre la gota de carmín con los esporocitos. 6. Calentar suavemente suavemente la preparación sob sobre re la flama del mechero, evitando que la muestra se seque. 7. Realice el squash. 8. Si Observe microscopio. microscopio. Si la los lámina contiene contiene granos deproceda polen, descártela. por el alcontrario, presenta estados de meiosis, a sellar la lámina con esmalte de uñas transparente. 9. Observe el mayor mayor número de fases de la meiosis y vis visualice ualice los fenómenos más representativos. EJEMPLO:

Figura 1: Metafase 1: Metafase I, lineal, Tradescantia sp. sp. Fotografia tomada por los estudiantes del curso 2008 – I.

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EN ORTOPTEROS: Modelo: Gryllus assimilis, Acheta domesticus 

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2016 - I 

1. Cortar en forma transversal transversal la parte inferior del del abdomen con una tijera de disección. Después, cortar perpendicularmente al primer corte hasta encontrar los testículos. 2. Seleccionar los testículos y se fijarlos en etanol - ácido acético 3:1 ó 2:1 por 0,5 a 2 horas horas como mínimo. mínimo. El material fijado puede conservarse conservarse en refrigerador. 3. Pasar los testículos fijados a una solución solución de alc alcohol ohol 70%, 10 min minutos. utos. Con cada testículo se pueden obtener unos 10 preparados. 4. Colocar en un portaobjetos, una peq pequeña ueña porción de tejido y, sobre él, una gota de carmín acético. Disgregar el material con una lanceta. 5. Cubrir con la laminilla siliconizada. Flamear suave e intemitentemente, cuidando de no calentar demasiado. 6. Realizar el “squash”, suave, sobre una superficie plana. Retirar el exceso de colorante con papel filtro. 7. Sellar el preparado con cera, parafina o esmalte esmalte transparente para uñas. uñas. Después de 2 horas puede hacerse permanente. 8. Observar al microscopio y fotografiar. EJEMPLO:

Figura 2: 2: Cromosomas meióticos de Gryllus sp . Fotografías tomadas por estudiantes durante las prácticas del curso.

CUANDO LA MUESTRA HA ESTADO FIJADA UNA SEMANA O MÁS:

…

9. Colocamos los testículos testículos en agua destilada para su hidratación durante durante 10 minutos. A partir de este momento realizar todo el proceso en el mismo recipiente, preferiblemente plástico y no vidrio. No utilizar ningún material metálico. 10. Hidrolizar los testículos t estículos en HCl 5N durante 30 min. Transcurrido este tiempo se lavan en abundante agua destilada. 11. Posteriormente se introducen en reactivo de Schiff durante 30 minutos a temperatura ambiente. Este proceso es preferible realizarlo en oscuridad. 12. Se lavan los testículos, que tendrán un color violeta, en agua sulfurosa y posteriormente en agua del caño, donde se almacenarán hasta la confección de los aplastados. 13. Separamos un par de túbulos del testículo y los colocamos sobre un portaobjetos. Sobre ellos se coloca inmediatamente una gota de ácido Citogenética General  |

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acético al 50% en agua destilada y se deja un par de minutos. ¡Cuidado, no dejar secar el material!. 14. Se coloca sobre el túbulo un cubreobjetos y utilizando la punta de un lápiz y con presión muy suave se dispersa el material. 15. Con un trozo de papel de filtro se elimina el ácido acético que ha rebosado por los costados del cubreobjetos y, con cuidado de no moverlo, se realiza el squash. 16. Observar al microscopio m icroscopio y ffotografiar otografiar a 100x.  

EN MAMÍFEROS (Evans,E.O.; 1964) Modelo: Mus musculus 

1. Separar y descartar descartar la albugínea. Separar Separar los túbulos seminí seminíferos feros en gotas de citrato de sodio al 1% 2. Homogenizar con con bisturíes cruzados, cortan cortando do finamente repetidas vveces. eces. 3. Agregar más citrato y pipetear hasta obtener una suspensión suspensión celular de color lechoso. 4. Transferir a un tubo de centrífuga. Agreg Agregar ar citrato de sodio has hasta ta completar de 3 a 5 ml. Homogenizar con la pipeta Pasteur. 5. Dejar decantar por 10 a 30 minutos (el tiempo varía varía según la especie). Extraer el pellet grueso con una pipeta Pasteur, cuidando de no agitar el 6. sobrenadante. Transferir a una placa placa petri y homogenizar homogenizar nuevamente co con n bisturí y pipeta. Transferir a otro tubo de centrífuga y agregar citrato de sodio al 1% hasta completar 3 a 5 ml. Homogenizar. 7. Centrifugar ambos tubos a 650 rpm por 10 minutos. 8. Eliminar el sobrenadante sobrenadante y agregar agregar solución fijadora sin remov remover er el fondo. Dejar 30 minutos a temperatura ambiente. Homogenizar y dejar por otros 5 minutos. 9. Centrifugar a 800 rpm rpm por 10 minutos minutos,, lavar una vez más con fijador fresco. fresco. 10. Gotear la suspensión en una una lámina limpia y fría. Dejar secar al aire. 11. Colorear con Giemsa al 2% de 20 a 30 minutos. Enjuagar con Sorensen o agua destilada. 12. Observe al microscopio 13. Fotografiar las mejores placas a 100x. EJEMPLO:

Figura 3:  Cromosomas meióticos de Mus musculus. musculus. Fotografías tomadas por los estudiantes durante las prácticas del curso. Citogenética General  |

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V.

2016 - I 

ACTIVIDADES

  Esquematice y describa las características más importantes de la meiosis.   Identifique cromómeros, quiasmas.   Dibuje un único único bivalente e identifique las las cromátides hermanas, los cromosomas homólogos y los puntos de quiasmas.   En las células en diploteno, diacinesis y metafase I, es esquematice quematice los

  

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distintos tipos de bivalentes, señalando preferencialmente las distintas cromátidas   Marcar los quiasmas intersticiales y terminales con una pequeña flecha, colocando las inciales qi  y qt, en diploteno, diacinesis y metafase I. Señale bivalentes abiertos y cerrados.

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SESION 5

BANDAS G I.

INTRODUCCIÓN

La técnica de bandeos bandeo G es la más utilizada dentro de los cromosómicos. En el patrón de bandas se destacan las zonas de secuencias repetitivas A-T, resultando un patrón diferencial de bandas que se observa en cada cromosoma. La técnica de bandeo G implica el tratamiento de los cromosomas con una enzima proteolítica y su posterior tinción con el colorante Giemsa. Las zonas de afinidad Foto: Morales & Fernández; 2004-I por el colorante se tiñen fuertemente formando las bandas, y las zonas que no presentan afinidad por el colorante permanecen más claras formando las interbandas.  Actualmente existen muchos tipos de Bandeo G; en la presente práctica utilizaremos la técnica GTC, es decir, bandas G por tratamiento enzimático con tripsinas y utilizando Giemsa.

II.

OBJETIVO Conocer el patrón de bandas G en Mus musculus. 

III.

MATERIALES

IV.

PROCEDIMIENTO 1. prepar adas y previamente env envejecidas ejecidas de 5 a 7 día días. s. Mg++ por 2. Láminas Sumergirpreparadas las preparaciones prepa raciones en solu solución ción Hanks sin Ca++ y sin 10 minutos a 37 C. 3. Transferir a una solución de tripsina 0,5% (4-10 C) por 15 a 20 segundos. 4. Lavar nuevamente en a agua gua des destilada tilada (4-10 C) por 15 a 20 segundos. 5. Teñir con Giemsa al 2% en buffer fosfato, pH 6,9 por 15 a 30 minu minutos. tos. 6. Lavar con agua corriente – agua destilada – agua destilada 7. Dejar secar al ambiente. 8. Observar al al microscopio y fotografiar fotografiar las mejores mejores placas. °

°

°

V.

ACTIVIDADES   Identificar las bandas G y compararlas con el patrón.

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VI.

2016 - I 

EJEMPLOS:

a

b

Figura 1(a, b):  b):  Bandas G (flechas) en cromosomas mitóticos de M.

musculus. Fotografías tomada por estudiantes del curso.

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SESION 6

BANDAS C I.

INTRODUCCIÓN

Las Bandas C secomo visualizan como una tinción preferencial de algunas regiones cromosómicas, la región pericentromérica, región telomérica, la constricción secundaria y el cromosoma y de algunas especies. La tinción de las regiones mencionadas permite identificar la heterocromatina constitutiva, que se caracteriza por la presencia de ADN altamente repetitivo. El método se basa en un proceso de desnaturalización del ADN en un medio alcalino seguido de una renaturalización del mismo en soluciones salinas, con la posterior tinción con Giemsa. En las zonas de heterocromatina constitutiva, el ADN renaturaliza más rápido lo que origina el bandeado. Para analizar las láminas preparadas ha de tenerse en cuenta lo siguiente: Tabla Tabl a 1: G rado de denat denaturaci uraci ón

PLACAS METAFÁSICAS a) Núcleos enteros y teñidos. Cromosomas totalmente teñidos

DENATURACION INSUFICIENTE

b) Núcleos vacíos y escasa tinción. Cromosomas deformes y sin tinción.

EXCESIVA

c) Núcleos parcialmente digeridos y teñidos. Cromosomas con esca escasa sa tinción y fuerte tinción en centrómero y telómero.

BUENA

Para evaluar el rendimiento de la técnica se debe realizar un recuento de placas con cromosomas bandeados en 10 campos diferentes: Tabla Tabl a 2: E val valuación uación de rendi miento

PLACAS METAFASICAS 0 1 – 4 5 ó más II.

RENDIMIENTO Malo Regular Bueno

OBJETIVO

 A. cepa  y   Identificación de Bandas C en cromosomas mitóticos de de A.  y V. faba  

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III.

2016 - I 

MATERIALES

  Láminas previamente envejecidas de V. faba   y A. y A. cepa     Solución de colchicina 1%   Carnoy   Solución Targa



         

Giemsa 2% Buffer fosfato, pH 6,9 Agua destilada Papel filtro Hoja de afeitar, nueva

      

Papel lente Estufa regulada Baño María Microscopio óptico

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IV.

Solución de HCl 1 N Hielo seco Etanol Hidróxido de Bario 4% Solución 2xSSC

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PROCEDIMIENTO a) Obtención de cromosomas mitóticos: 1. Colocar las raíces en el pre  –  fijador durante el tiempo ya establecido para cada especie. 2. Fijar en carnoy, 24 horas a 20 C, luego por una hora a 40 C. 3. Pasar a Carnoy fresco durante 5 minutos a temperatura temperatura ambien ambiente. te. °

4. 5. 6. 7.

°

°

Pasar raíces a HCl 1N, a 37Targa porpor 3 minutos Colocarlaslas raíces en solución TaCrga 5 minutos. Hacer el squash. Sellar las láminas con esmalte transparente y mantenerlas en refrigeración por 5 días, como mínimo. míni mo. (envejecimiento)

b) Técnica de bandeo bandeo C: C: 1. Transcurrido el tiempo tiempo de envejecimiento envejecimiento de lá láminas, minas, levantar la laminilla con hielo seco. 2. Sumergir las láminas en etanol absoluto absoluto por 1 minuto. 3. Dejar secar al ambiente. 4. Coloque las láminas en solución solución de hidróxido de Bario a 50 C durante 4 minutos. 5. Lavar las láminas láminas cuidados cuidadosamente amente con agua destilada durante 10 minutos. 6. Coloque las láminas en solución 2x SSC a 60 C por 45 minutos. 7. Lavar con agua agua des destiladA, tiladA, tres veces. 8. Colorear con Giemsa 2% durante 60 minutos a temperatura ambiente. 9. Enjuagar en buffer fosfato. 10. Secar al aire caliente 11. Observa al microscopio y fotografiar f otografiar las mejores placas. °

°

V.

ACTIVIDADES

  Presente una tabla que muestre el rendimiento rendimiento de la técnica.   Identifique las bandas C a lo largo de los cromosomas.

 

  Fotografíe la mejor placa.

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VI.

2016 - I 

EJEMPLOS

 b

a

Figura 1.  1.  Obsérvese los cromómeros intensamente teñidos en los núcleos profásicos (a). Presencia de bandas C (b). Fotografía tomada por estudiantes durante las prácticas del curso.

Figura 2.  2.  Bandas C (b) en cromosomas mitóticos de  A. cepa. La flecha señala las bandas características, en la región telomérica. Fotografía tomada por estudiantes durante las prácticas del curso.

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SESION 7

CROMOSOMAS CROMOSOMA S POLITÉNICOS INTRODUCCIÓN Drosophila melanogaster  presenta   presenta cuatro

pares de cromosomas, tres autonómicos (II, III y IV) y un par sexual. Los cromosomas politénicos se originan por la endorreplicación del ADN genómico. Las células de las glándulas salivares de Drosophila  detienen sus divisiones mitóticas después de 18 horas de desarrollo larvario, sin embargo, la replicación del ADN y el crecimiento celular continúan por endorreplicación. Esta replicación del ADN afecta F oto: oto: M orales orales & F er nánde nández, 2004 2004-I  -I  principalmente a la eucromatina, debido a   que la heterocromatina no se politeniza. Los cromosomas homólogos se aparean entre si, lo que se conoce como aparea apareamiento miento somático. Asimismo, se fusionan los centrómeros de todos los cromosomas dando lugar al cromocentro, que es de naturaleza. Entonces tenemos que en Drosophila, los cromosomas se reúnen en el cromocentro, alrededor del cual se irradian 5 brazos muy largos y uno muy corto (el par IV y el cromosoma Y del macho)

OBJETIVO   Obtención de de cromos cromosomas omas politénicos politénicos en glándulas salivales de larvas de tercer estadio de Drosophila melanogaster .

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MATERIALES              

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Larvas de D. melanogaster Solución Salina al 0,9% Fijador Carnoy Solución Targa Orceína lacto acética Pinza de punta fina Estiletes entomológicos

Citogenética General  |

             

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Láminas gelatinizadas Laminillas siliconizadas Placas petri Papel filtro Papel lente Microscopio estereoscópico Microscopio óptico

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2016 - I 

PROCEDIMIENTO 1. Disección de las larvas en solución salina: separar las glándulas salivales con la ayuda de estiletes.

Fig. 2:  2:  A) Vista interna de la anatomía de una larva de 3er estadío de D. melanogaster . B) Proceso de extracción de glándulas salivales. Es importante identificar la boca y el ano de la larva.

2. Fijación de las glándulas salivales en una laminilla siliconizada que contiene una gota de carnoy, durante 3 minutos.

Fig. 3:  3:  Glándulas salivales aisladas de D. melanogaster.  melanogaster.  Fuente: http://ciber-genetica.blogspot.com/ 2014/09/material-para-la-practica-de.html

3. Agregar solución Targa, d durante urante 5 – 8 minutos. 4. Finalmente se adiciona adiciona una gota de orceína lacto acética acética (OLA), dejar colorear por 10 a 15 minutos. 5. Colocar sobre la laminilla una una lámina gelatinizada y vvirar irar de inmediato, evitando perder la muestra. 6. Realizar el squ squash, ash, suavemente. suavemente. Sellar la lámina. 7. Observar al microscopio 8. Fotografiar las mejores placas.

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2016 - I 

ACTIVIDADES Identifique: 1. El cromocentro y los brazos irradiando a su alrededor. alrededor. 2. Detecte la posible existencia de puffs. 3. Observe la presencia de bandas, interbandas, posibles ligaciones, número de la brazos. 4. Fotografíe mejor mejor placa y esquematice se señalando ñalando sus observacione observaciones. s.

EJEMPLOS

a

melanogaster.  Se Fig. 4:  4:  Cromosoma politénico de D. melanogaster.  observa la puff en el brazo 3L (a) y la formación de asinapsis (b).

melanogaster.  Se Fig. 5:  5:  Cromosoma politénico de D. melanogaster.  observa la presencia del cromocentro y los brazos del cromosoma.

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SESION 9

MORFOLOGÍA DE LOS CROMOSOMAS I. INTRODUCCIÓN El cariotipo es una herramienta citogenética que sirve para caracterizar a las especies animales y vegetales, tomando como base el tamaño y forma de los cromosomas. Constituye una valiosa herramienta como fuente de datos importante para la citogenética comparada. Para el estudio de la morfología de los cromosomas se tiene en cuenta, tamaño, número y forma, que so son n todas características del complemento. Estas características son siempre constantes, sea cual fuere la célula considerada, mientras pertenezca a un determinado tejido, afirmación que es válida para todos los individuos de la misma especie. Para la identificación de los cromosomas y su posterior clasificación se tiene en cuenta la posición del centrómero, la cual determina una longitud en los brazos cromosómicos; estos datos permiten establecer índices en base a los cuales, finalmente, se determina la morfología cromosómica y el cariotipo del organismo en estudio.

a) Índice Centromérico (IPC):  

      

 

b) Índice Braquial (IB)  

  

 

  

c) Índice de Proporcionalidad de Brazos (IPB) o Índice Cromosómico  

     

 

La nomenclatura usada para la descripción de la morfología de los cromosomas es la propuesta por Levan et al. (1964). De acuerdo con ello, los cromosomas se asignan a cuatro categorías morfológicas diferentes según el índice centromé centroméric ric o: Citogenética General  |

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2016 - I 

INDICE

METACENTRICO

SUBMETACENTRICO

ACROCENTRICO

TELOCENTRICO

IPC

0,50 – 0,38

0,38 – 0,25

0,25 – 0,12

- 0,12

1,0 – 1,70

1,70 -3,00

3,00 – 7,00

+ 7,00

1,0 – 0,59

0,59 – 0,33

0,33 – 0,14

0,01 – 0,13

IB IPB

Cuando los valores se hallan muy en el límite se indican ambas categorías, separadas por un guión (ejemplo: m-sm). Para realizar la identificación de los cromosomas debemos de analizar por lo menos 10 placas metafásicas, las cuales deben presentar cromosomas enteros, en un solo plano y dispersos.

II.            

     

MATERIALES

Fotografías de placas metafásicas Regla de metal, 10 cm. Lápiz 2B Compás Papel Canson Cartulina negra

III.

PROCEDIMIENTO

1. Copiar a lápiz el contorno de los cromosomas de de la fotografía en papel canson. Si los cromosomas están sobrepuestos, trate de copiarlos separadamente. Numere los cromosomas al azar. 2. Fije lo mejor posible el punto medio que que correspondería al centrómero centrómero de cada cromosoma. 3. Con una regla, compás compás o curví curvímetro, metro, mida la longitud de ccada ada brazo, des desde de el punto medio hasta el telómero. 4. En el caso de cromosomas que presentan satélite, las mediciones se realizan sin considerar el satélite ni el filamento que lo une. 5. Consigne todas sus mediciones en una tabla. 6. Con los datos obtenido obtenidos, s, determine los índices de proporcionalidad. 7. Confeccione una tabla con los valores valores de los índices obtenidos. 8. Analice sus tablas y deduzca deduzca las características cromosómicas cromosómicas para cada especie.

Citogenética General  |

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2016 - I 

ANEXO 1 MODELO DE TABLA PARA MEDICIÓN DE CROMOSOMAS Especie:

CROM

p

q

C

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IPC

IB

IPB

TIPO

PARES

p

q

C

TIPO

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SESION 10

ELABORACION DEL CARIOTIPO INTRODUCCIÓN El cariotipo es el ordenamiento sistematizado de los cromosomas de una célula realizada por dibujo o fotografía, asumiéndose que los cromosomas de una célula pueden tipificar los cromosomas de un individuo o, incluso de una especie. A través del análisis del cariotipo podemos:   Establecer relaciones evolutivas y tax taxonómicas onómicas entre es especies pecies de u un n mismo grupo y entre los diferentes grupos.   Establecer el mecanismo de determinación sexual.   Establecer la presencia de cromosomas supernumerarios   Detectar alteraciones cromosómicas y determinar su origen y naturaleza. 



 

En la elaboración del cariotipo se considera:   Número cromosómico   Forma y tamaño relativo de los cromosomas   Número, tamaño y posic posición ión de satélites y constricciones ssecundarias, ecundarias, en especial las NOR.   Longitud total de los ccromosomas romosomas y contenido total del del ADN ADN..   Posición, tamaño tamaño y distribución de los seg segmentos mentos heteroc heterocromáticos romáticos de tinción diferencial (bandas C, DAPI, CMA)   Diferenciación longitudinal de los cromosomas (Bandas G, Q y R). 

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El cariotipo se obtiene después de analizar muchos cariogramas. El cariograma es el complemento cromosómico de una sola célula, aunque muchos autores utilizan el término cariotipo para denominar el ordenamiento de los cromosomas de una sola célula.

IDIOGRAMA Se denomina Idiograma (Navashin, 1922) a la representación esquemática de la morfología de los cromosomas y se utiliza diagnósticamente en la comparación de los cariotipos de diferentes individuos o especies. La longitud de las barras está determinada por la longitud media de los homólogos. Citogenética General  |

Fig. 1: Idiograma mossambicus (Pisces) 

de

Orestias

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2016 - I 

MATERIALES          

    

Fotografías de placas metafásicas Tablas de datos Tijeras Papel blanco o cartulina Lápiz 2B

  Goma en pasta   Cinta adhesiva   Papel milimetrado

  

PROCEDIMIENTO 1. Con la ayuda ayuda de los datos obtenidos por la morfometría de los cromoso cromosomas, mas, se procede a elaborar el cariotipo 2. Con los datos del esquema esquema y la fotografía, separe los cromosomas por por pares homólogos. De una de las fotografías, recorte los cromosomas de tal forma que quede un borde de 1  –  2 mm por todo su perímetro a fin de conservar su morfología. 3.  Sobre la plantilla realizada realizada en la hoja de pape papell blanco o ca cartulina, rtulina, ordene los 4. 5. 6. 7.

pares homólogos según su tamaño. tamaño, empezando por el de mayor tamaño y terminando por el de menor Cuando sea posible, posible, indique el sexo del del individuo estudiado estableciendo la presencia o ausencia del cromosoma Y. En el caso de los cromosomas sexuales, separarlos del grupo de los autosomas. Una vez que estén bien identificados los pares homólogos, pegue los cromosomas utilizando la cinta adhesiva o goma. Adjunte la fotografía de la metafase a la cual corresponde el cariotipo analizado e indique la escala. Con los datos de la tabla, proceda a la representación gráfica del set haploide del cariotipo, mediante un diagrama de barras.

PATRONES CARIOTIPICOS: Considerando el complemento cromosómico en su conjunto puede haber dos clases de cariotipos: simétrico y asimétrico: Esta diferenciación es de gran importancia cuando se hacen estudios de filogenia y evolución de las especies.   A. Simétrico: presenta todos los cromosomas aproximadamente del mismo tamaño y centrómero de posición media y submedia. B. Asimétrico: hay marcadas diferencias en el tamaño relativo de losconsecuencia cromosomas del complemento, como de reordenamientos cromosómicos Citogenética General  |

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2016 - I 

estructural. C. Bimodal: es la forma más extrema de asimetría, en la cual los cromosomas largos son 50 veces más largos que los pequeños.

CALCULO DE SIMETRIA  – ASIMETRIA DEL CARIOTIPO Utilizando estos índices y su representación gráfica simultánea en dos coordenadas, se puede realizar una comparación de variaciones numéricas de los diferentes cariotipos.  A.  ASIMETRIA INTRACROMOSOMICA INTRACROMOSOMICA (A1):

 A1 = 1 – 

3bi // Bi  _________

n bi y Bi , longitudes promedio de p y q respectivamente para cada para de homólogos. n, número de pares o grupos de homólogos  A1 varía entre 0 y 1; su valor disminuye cuando los cromosomas tienden a ser metacéntrico metacéntricos. s.

B.  ASIMETRIA INTERCROMOSOMICA INTERCROMOSOMICA (A2):

Estimador de asimetría del cariotipo.  A2 = S / X S, desviación estándar X, la media de la longitud cromosómica de cada muestra  A2 adopta valores más grandes cuanto mayor es la variación en la longitud cromosómica entre los pares o grupos de homólogos.

ACTIVIDADES   Elabore el cariotipo d de e la especie en est estudio, udio, ano anotando tando el código de lámina de la cual proviene la fotografía utilizada.   Calcule índice de simetría – asimetría.   Esquematice el idiograma del espécimen trabajado.

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Citogenética General  |

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2016 - I 

ANEXO 2 MODELO PARA ELABORACIÓN DE CARIOTIPO ESPECIE: ____________ _______________________ ________________ _____

---------1

---------2

---------3

---------4

---------5

---------6

---------7

---------8

---------9

---------10

---------11

---------12

---------13

---------14

---------15

---------16

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2016 - I 

Capítulo II Citogenética  MOLECULAR

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BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA

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