Manual Microbiologia FINAL

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“Manual de Prácticas de Microbiologia”

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I. Objetivo general del manual Proporcionar al alumno las técnicas y entrenamiento para adquirir la capacidad para el manejo y control de los microorganismos, que permita su uso en procesos sustentables.

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II. Número, Nombre y Objetivos específicos de cada práctica Práctica 1. Clasificación, preparación, esterilización y manejo del material utilizando en el laboratorio. Diferenciará y aplicará los métodos de esterilización adecuada para los diferentes materiales, usando los diferentes equipos del laboratorio.

Práctica 2. Diferenciación. Preparación y esterilización de medios de cultivo. Aplicará la metodología de preparación y esterilización de diferentes medios de cultivo.

Práctica 3. Determinación de los parámetros de letalidad térmica: valores D-Z. Aplicará las técnicas para determinar los valores de D y Z de los microorganismos.

Práctica

4. Obtención de cultivos puros, utilizando las diversas técnicas de

aislamiento. Aplicará las técnicas de varilla acodada y estría cruzada para la purificación de cultivos bacterianos.

Práctica 5. Observación colonial y microscópica de cultivos bacterianos. Obtendrá cultivos bacterianos puros y describirá su morfología colonial y aplicará las técnicas de tinción para su observación de la morfología microscópica.

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Práctica 6. Aplicación de los métodos de preservación de microorganismos y diseño de un cepario. Aplicará diferentes técnicas para la conservación de cepas microbianas.

Práctica 7. Cultivos de microorganismos en anaerobiosis. Aplicará las técnicas de cultivos anaerobios.

Práctica 8. Identificación de bioquímica de enterobacterias. Aplicará las técnicas y medios de cultivo para la identificación a través de pruebas bioquímicas del grupo de enterobacterias.

Práctica 9. Aislamiento, cultivo y observación colonial y microscópica de hongos filamentosos y levaduriformes. Aplicará las técnicas de aislamiento y purificación de hongos y levaduras para su observación de la morfología colonial y tinciones para la observación de su morfología microscópica.

Práctica 10. Producción de ácidos orgánicos por hongos. Aplicará técnicas de cultivo sumergido para la producción de ácidos orgánicos y evaluará su rendimiento.

Práctica 11. Pruebas de identificación para levaduras. Aplicará las técnicas de observación microscópica y pruebas bioquímicas para la identificación de levaduras. 3

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Práctica 12. Recuento en placa. Aplicará las técnicas de diluciones decimales y técnicas de cultivo para el recuento en placa.

Práctica 13. Técnica del número más probable (NMP). Aplicará la técnica del número más probable (NMP), y evaluará con sus resultados aplicando las tablas aceptadas por la NOM.

Práctica 14. Curva de crecimiento poblacional en cultivo sumergido. Aplicará técnicas de cultivo sumergido y conteo microbiano, durante el desarrollo poblacional para observar el modelo de crecimiento.

Práctica 15. Efecto de los agentes físicos y químicos sobre el crecimiento microbiano. Probará el efecto de diferentes agentes físicos y agentes químicos a diferentes grupos microbianos, evaluará el efecto de los agentes sobre el crecimiento microbiano.

Práctica 16. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Utilizará la técnica de PCR para la amplificación de moléculas de ADN, y evaluará el resultado de la amplificación.

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III. Prácticas de Microbiología Práctica 1. Clasificación, preparación, esterilización y manejo del material utilizado en el laboratorio.

1. OBJETIVO Diferenciará y aplicará los métodos de esterilización adecuada para los diversos materiales, usando los equipos del laboratorio.

2. INTRODUCCION El conocimiento de las áreas, materiales, equipos, así como el entrenamiento del uso de los mismos en un laboratorio de microbiología permite aplicarlos en cualquier ámbito de trabajo como son el industrial, alimentario, ambiental, investigación, etc. Los procesos que permiten el manejo seguro de áreas libres de microorganismos y poder transferir microorganismos ubicados de un ambiente natural a condiciones controlables de un ambiente artificial, sin contaminación ha permitido el avance de la microbiología como ciencia. La esterilización es un método de eliminación total de todo tipo de organismos y que asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente, mientras que la desinfección es un proceso que solo elimina formas vegetativas de los microorganismos, los procedimientos que impiden la llegada de microorganismos a un medio dejándolo libre de contaminación o asepsia permite manipularlos. Los procedimientos de mayor utilización en los laboratorios de microbiología para la esterilización son los métodos de calor seco, calor húmedo y filtración. La esterilización por calor seco produce la destrucción de los microorganismos por oxidación de sus componentes celulares. Éste es un proceso menos eficiente que la esterilización por calor húmedo, porque los microorganismos mueren con mayor

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rapidez cuando se encuentran en presencia de agua, ya que éste permite que se altere con mayor facilidad la configuración de sus proteínas y proporciona un medio para distribuir el calor uniformemente en toda la cámara interna del equipo de esterilización. Por esta razón, para lograr la esterilización del material empleando el calor seco, se deben aplicar temperaturas más altas durante mayor tiempo, como son desde 150 a 180°C, en un horno durante 2 horas. Para esterilizar medios de cultivo, soluciones y cultivos bacterianos, el más recomendable es el autoclave en el que se utiliza vapor de agua a presión de 1 atmosfera, para alcanzar la temperatura de 121ºC, el material se deja a esta temperatura por 15 minutos para asegurarse de la destrucción de endosporas, que son las estructuras bacterianas más resistentes al calor. Cuando se requiere esterilizar diferentes materiales sensibles al calor como

las

soluciones de vitaminas, aminoácidos, etc., se esterilizan por filtración de membranas estériles de 0.2 micras de diámetro y para el caso de materiales de plástico es recomendable el uso de gases con oxido de etileno o con radiaciones gamma. Las superficies generalmente se desinfectan con radiaciones u.v o compuestos químicos en forma líquida como: fenoles, compuestos cuaternarios de amonio

(alquil dimetil bencilamonio), formaldehído,

alcoholes, halógenos y

detergentes.

3. CORRELACION

CON

EL

PROGRAMA

DE

MICROBIOLOGIA

(ING.

BIOQUIMICA BQO-0525) Tema. Métodos y técnicas microbiológicas básicas. Subtema. Esterilización y asepsia. El manejo de las áreas estériles en forma aséptica para la aplicación de técnicas microbiológicas demanda que el material y los medios de cultivo empleados estén estériles, esto se logra con la selección y aplicación de la técnica de esterilización como son: esterilización con calor seco, con calor húmedo, filtración, etc.

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4. MATERIAL Y EQUIPO Descripción del material

Cantidad

Equipo

Tubos de ensaye de 18 x 150 mm

10

Autoclave

Cajas de petri

10

Estufa incubadora

Pipetas de 1 ml

10

Horno

Pipeta de 10 ml

1

Mechero Fisher

Probeta de 50 ó 100 ml

1

Campana de flujo laminar

Matraz Erlenmeyer de 250 ml

1

Matraz Erlenmeyer de 500 ml

1

Vaso de precipitados de 250 ml

1

Pinza de disección de acero inoxidable de 18 cm

1

Gradilla

1

Tijera

Algodón, gasa, papel Manila o estraza, cinta adhesiva y cinta testigo.

5. METODOLOGIA Preparación del material de vidrio 1.-Lavar perfectamente las cajas de petri, pipetas con escobillón y detergente. 2.- Enjuagar con abundante agua corriente. 3.-Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada con una pizeta, por las paredes interiores. Dejar escurrir el material sobre una toalla o papel de envoltura. No debe secar el material por ningún otro medio. 7

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4.-Una vez seco el material, se procederá a envolver las cajas de petri y pipetas con papel estraza. Para los tubos y matraces se elaboraran tapones de algodón y gasa procurando que ajuste con holgura, sobre los que finalmente se les colocara un gorro de papel. Elaboración de gorros Para tener una base para la elaboración de gorros, se toma como medida, aproximadamente, el tamaño carta; es adecuada para el gorro de un matraz de 500ml. 1.-Se corta papel dextrasa en forma de rectángulo, del tamaño según se necesita. 2.-Se dobla el papel a la mitad con respecto a la parte larga del mismo. 3.- se doblan las puntas superiores, uniéndolas en el centro. 4.-De la parte inferior se dobla hacia arriba al borde de la hoja que queda encima, hasta la altura de las puntas unidas en el paso tres. 5.-Se le da la media vuelta al papel. 6.-Se doblan las puntas de los lados, hasta la altura de donde sobresale el doblez del paso número cuatro. 7.-De la parte interior se dobla hacia arriba, el borde interior sobresaliente de la hoja hasta el doblez anterior. 8.- Se le da la media vuelta al pape obteniéndose de esta manera el gorro. Elaboración de tapones de algodón En la elaboración de tapones de algodón, como en el

caso de los gorros es

importante tener idea del tamaño del algodón a utilizar para obtener un tapón adecuado a las necesidades requeridas. Estos tapones son utilizados en los diferentes tamaños de tubos y matraces.

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Una base para la elaboración: con una tira de algodón de 15-20cm de largo, 3cm de ancho y un grosor de 0.5 cm, y con una gasa de 10x10cm, se obtiene un tapón adecuado para un matraz de 500ml. 1.- Se corta una tira de algodón, de largo adecuado a las necesidades. 2.-Con una pinza de disección se prensa uno de los extremos del algodón. 3.-Se enrolla el algodón en la pinza de manera que quede firme el enrollado. 4.-Seguidamente se corta el cuadro de gasa adecuado a tamaño requerido y se coloca en la boca del matraz, procurando centrarlo. 5.- Con la pinza y el algodón enrollado en ella, la gasa se presiona hasta adentro del matraz, de manera que entre uniformemente por todos lados a la boca de este, dejando a flote la punta superior del algodón. La pinza es sacada del algodón dando una vuelta en sentido contrario al enrollado para a que afloje, y jalando hacia arriba presionando el algodón, con la mano, para que no salga de la boca del matraz. 6.-Hasta este paso deben quedar las cuatro puntas de la gasa colgando de los lados de la boca del, matraz: dos de las puntas que se encuentran opuestamente, se amarran entre si formando un lazo. 7.-Luego se amarran las otras dos puntas restantes, obteniéndose de este modo el tapón de algodón. Cuando se esterilizan los matraces o tubos, estos deben contener líquido, para evitar que se deterioren por resecamiento del vidrio al calentarse a temperaturas muy elevadas. Si se utilizan tubos con tapas de rosca, cuando se esterilizan líquidos, estos deberán estar solo semicerrados. Preparación y envoltura de pipetas La preparación de las pipetas para su esterilización es muy sencilla, se lavan perfectamente con agua y jabón y se secan por 1 minuto en la estufa a 100°C. 9

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Con un clip se le introduce en la boquilla de succión un filtro de algodón, de tal forma que el algodón entre suavemente y sin romperse sin la presión de la punta del clip, este tapón tiene una doble función; una es para evitar que en un descuido de succión forzosa, por obstrucción de la pipeta, se ingiera el producto succionado al des taparse bruscamente; y la segunda razón es para evitar que por la boquilla de succión entren microorganismos que alteren los resultados del trabajo realizado. 1.-Se corta una tira de papel aproximadamente 5 cm de ancho y 30cm de largo. 2.-Se doble el extremo interior de aproximadamente 2cm. 3.- Se coloca la pipeta con la punta a la mitad del doblez anterior, y con un ángulo de aproximadamente 20-30 grados de inclinación con respecto a la posición del papel estraza. 4.-Se hace un segundo doblez, tapando la punta de la pipeta con la porción del papel que sobresale a la punta de la pipeta. 5.- Se le hace un tercer doblez a la punta del papel que queda en el ángulo de inclinación, de manera que cubra completamente la punta de la pipeta. 6.- Se da vuelta a la pipeta procurando que el papel vaya envolviéndola en forma de espiral, hasta cubrirla por completo y doblar el papel sobrante dejando este paralelo a la pipeta. 7.-Verificar que el enrollado no quede flojo, en caso de estarlo, reafirmar el papel con respecto a la forma de la pipeta. 8.-Cubrir con cinta adhesiva el último doblez. Preparación y envoltura de cajas de petri Al utilizar cajas petri en los cultivos microbianos tienen que ser esterilizados para poder vaciar dichos medios de cultivo que servirán de nutriente a los microorganismos tratados. Estas cajas se pueden esterilizar por calor húmedo o

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calor seco, siendo más recomendable el calor seco, por ser más confiable su efectividad. Es necesario envolver las cajas petri antes de esterilizarlas para evitar que al término de la esterilización estén expuestas al medio ambiente y se contaminen de nuevo. Para esterilizarlas se puede utilizar un recipiente cilíndrico de metal o envolviéndola en papel estraza. 1.- Se corta papel estraza del tamaño adecuado para el número de cajas que se desee envolver y se colocan las cajas en el centro del papel. 2.-Los bordes de los costados se unen al centro cubriendo las cajas que se envuelven. 3.-En la parte superior se unen los bordes de ambos lados y esta unión se dobla a la mitad, creando una cierre plegado. 4.-Al papel se le presiona a los costados quedando al relieve el volumen de las cajas envueltas en el papel. 5.-Se doblan las puntas del papel de cada una de las esquinas del centro. 6.-Las puntas salientes del papel en los lados de las cajas se doblan hacia arriba y al centro de las cajas y se les asegura con cinta adhesiva. Esterilización por aire caliente La esterilización por calor seco se puede realizar por varios métodos: Aire caliente Flama directa Incineración

Aire caliente.- El aire caliente es uno de los métodos de esterilización por calor seco más utilizados. Este proceso se lleva a cabo en hornos especiales que permiten la distribución uniforme del calor en su interior, donde el material se expone a temperaturas de aproximadamente 170ºC durante 2 horas. El tiempo de 11

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esterilización se debe determinar para cada tipo de material, por ejemplo en el caso de materiales muy resistentes al calor, se pueden usar temperaturas más altas por tiempos más cortos. Entre las ventajas de este método de esterilización están que no deja residuos, y es un método rápido y económico. Además permite la esterilización de materiales no miscibles con el agua como es el caso de polvos, aceites y grasas. Su principal desventaja es que sólo debe emplearse para esterilizar materiales termoestables. Para controlar este proceso de esterilización se utilizan indicadores físicos tales como los termómetros, los cuales permiten medir la uniformidad de la temperatura de la cámara interna del horno, indicadores químicos como las cintas testigo. El material de vidrio moderno permite la carga y descarga en caliente sin que se rompa, pero hay siempre un ligero riesgo de que el aire no estéril puede ser succionado hasta el interior de las cajas petri no envueltas mientras se enfrían. Cuando se cargan debe dejarse espacio entre cada artículo, puesto que la carga excesiva impide la circulación de aire y determina puntos calientes y fríos. La esterilización por aire caliente se utiliza principalmente para el material de vidrio como son: Cajas petri, tubos de ensaye, pipetas, sin líquidos en su interior, material de vidrio, instrumentos quirúrgicos, material y utensilios de metal. Flama directa.- Consiste en colocar el material directamente al fuego hasta que éste se ponga al rojo vivo. De esta forma se queman los contaminantes hasta reducirlos a cenizas. Su eficacia depende de la calidad de la llama. Es un procedimiento muy sencillo que se realiza de rutina en los laboratorios de microbiología para esterilizar el asa o el filamento con la llama del mechero. Cuando se realiza este procedimiento se debe evitar la formación de aerosoles (pequeñas gotas liberadas al aire) que podrían contaminar el ambiente.

6. SUGERENCIAS DIDACTICAS 1. Fomentar la investigación a través de observar el efecto de las condiciones de asepsia y su relación con el control de

contaminación microbiana en el 12

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laboratorio y generar criterios de selección de los métodos más adecuado para los distintos tipos de materiales que se manejen en el laboratorio. 2. Vincular los resultados obtenidos mediante experimentos de esterilización de diferentes materiales y medios de cultivo en el laboratorio con los conocimientos teóricos y su experiencia con el entorno a través de la discusión en grupo.

7. REPORTE DEL ALUMNO 1. Escribir las diferencias entre esterilización y asepsia. 2. Escriba la finalidad de manejar un área estéril si el material a usar y los medios fueron esterilizados previamente. 3. Describa a través de una tabla los siguientes resultados: Descripción del Método

de Indicador

material

esterilización

Pipeta

Método y parámetros

de Resultado

Observaciones

esterilización

de control etc

4. Compare sus resultados con los resultados de sus compañeros y presente un resumen. 5. Escriba sus conclusiones.

8. BIBLIOGRAFIA 1. Bradshaw J., 1979. “Microbiología de laboratorio”. Editorial El manual Moderno, S.A. 2. Carpenter P., 1969, Microbiología”. Editorial Interamericana. 13

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3. Pelczar M., 1984,”Microbiología”. Editorial McGraw Hill. 4. www.danival.org/notasmicro/medioscult/madre_medios.html

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Práctica 2. Diferenciación, preparación y esterilización de medios de cultivo.

1. OBJETIVO Aplicará la metodología de preparación y esterilización de diferentes medios de cultivo.

2. INTRODUCCION

La ubicuidad de los microorganismos se relaciona con las capacidades de cada uno de estos y sus especificidades en adaptarse a las condiciones medioambientales con sus mecanismos enzimáticos y sus relaciones poblacionales en un ecosistema. Para crecer, los microorganismos deben tomar del ambiente todas las sustancias necesarias para la síntesis de sus componentes celulares y para la generación de energía. Estas sustancias se denominan nutrientes. Un medio de cultivo artificial deberá contener todos los nutrientes y las cantidades necesarias a los requerimientos específicos para el microorganismo que quiere ser aislado. La formulación de un medio de cultivo está basada en los principios de la nutrición y la composición química de las células, como ejemplo el agua es el componente principal que se encuentra entre un 80 y 90% del peso total de la célula, por lo cual es el componente y nutriente principal y esencial, en términos cuantitativos. Los componentes sólidos en la célula son constituidos hasta en un 95% por las sustancias en las cuales sus componentes elementales son el carbono, nitrógeno, fósforo y azufre, ordenados en forma decreciente con relación a su abundancia. El carbono es el componente principal del peso seco de una célula, participando comúnmente con un 50%, los microorganismos fotosintéticos toman esencialmente del CO2 su fuente de carbono y toman de los compuestos inorgánicos oxidándolos y 15

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de la luz su energía. Todos los demás organismos toman su fuente de carbono de sustancias orgánicas además de utilizarla como principal fuente de energía. Los microorganismos son extraordinariamente diversos tanto a la clase como al número de compuestos orgánicos que pueden usar como fuente principal de carbono y energía. Esta diversidad se manifiesta en el hecho de que no hay en la naturaleza ningún compuesto orgánico que no pueda ser utilizado como fuente de carbono y energía por algún microorganismo, por lo que algunos muestran una gran versatilidad y otros extremadamente especializados en el uso de la fuente de carbono orgánico, estas características permiten diseñar diferentes tipos de medios de cultivo como son: Por su contenido de agua el medio líquido, semisólido y sólido; Por su composición cualitativa y cuantitativa de su componentes, medio complejo, semisintético y sintético; Por su capacidad de soportar microorganismos, medio general, selectivo; diferenciales, ricos, etc. En la actualidad los medios de cultivo comúnmente empleados, se encuentran en el comercio bajo la forma de productos deshidratados, presentado ventajas como son: estabilidad, fáciles de usar, una pequeña cantidad del polvo basta para preparar una cantidad de medio de cultivo, necesitan poco espacio para almacenarse y de alguna manera son económicos.

3. CORRELACION

CON

EL

PROGRAMA

DE

MICROBIOLOGIA

(ING.

BIOQUIMICA BQO-0525) Tema. Métodos y técnicas microbiológicas básicas. Subtema. Medios de cultivo. El cultivo de los microorganismos en condiciones artificiales se logra reproduciendo las condiciones medioambientales, adicionando los nutrientes semejantes de donde fue extraído.

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4. MATERIAL Y EQUIPO Descripción del material

Cantidad

Equipo

Agar nutritivo (g/l)

23

Autoclave

Caldo nutritivo (g/l)

8

Estufa incubadora

Cajas petri

10

Horno

Tubos de 18 x 150 mm con tapón de rosca

10

Mechero Fisher

Probeta de 100 ml

1

Campana de flujo laminar

Matraz Erlenmeyer de 250 ml

1

Potenciómetro

matraz Erlenmeyer de 500 ml

1

gradilla

1

Asa de nicromo

1

Asa varilla de vidrio

1

Algodón, gasa, papel Manila o estraza, cinta adhesiva, cinta testigo, muestra de tierra y agua fresca.

5. METODOLOGIA Preparación: 1. Pesar la cantidad indicada en el frasco de medio de cultivo. (Caldo nutritivo 0.8 g para 100 ml y agar nutritivo 4.6 g para 200 ml). 2. Disolver al inicio en una cantidad de la fracción del volumen total de agua. 3. Mezclar bien y agregar el resto de agua necesaria enjuagando con el agua las paredes del recipiente. 4. Calentar suavemente entre 50 y 60°C, agitando constante el recipiente hasta su incorporación del medio al agua o clarificar, en caso de un medio contenga agar,

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espere 5 minutos agitando antes de llevarlo a ebullición. (Nunca sobrecaliente, uno o dos minutos de ebullición es suficiente). 5. Revise el valor indicado en la etiqueta del pH y de ser necesario ajústelo utilizando soluciones ácidas o bases con concentraciones de 0.1 M. 6. Antes de su esterilización vierta en cada tubo 9 ml de caldo nutritivo y cierre suavemente el tubo con el tapón de rosca. 7. El agar nutritivo se esteriliza en el matraz Erlenmeyer y las cajas de petri deberán esterilizarse previamente por separado. 8. Los medios deshidratados son altamente higroscópicos, por lo que es necesario mantenerlos convenientemente cerrados los frascos después de utilizarlos y mantenerlos en un lugar fresco, seco y protegidos de la luz. 9. La esterilización, en todos los casos es conveniente seguir las instrucciones indicadas en las etiquetas de los frascos y nunca deberá exceder la temperatura de esterilización. (Caldo y agar nutritivo se esteriliza a 121°C a 1 atm de presión manteniendo estas condiciones durante 15 minutos, cortar un segmento de cinta testigo para cada lote). 10. Los tubos con el caldo nutritivo se cierran después de su esterilización y que estos estén a una temperatura entre 50 y 60°C. 11. El agar nutritivo estéril se vacía a las cajas petri cuando éste alcance una temperatura entre 45 y 50°C. 12. Los medios preparados es recomendable utilizarlos el mismo día de su preparación, sin embargo es posible mantenerlos por varios días en refrigeración, debiéndose llevar a temperatura ambiente antes de usarse. 13. Inocule el caldo nutritivo y el agar nutritivo con las muestras de los distintas fuentes de microorganismos. 14. Incube las cajas y tubos inoculados en la estufa de incubación a 35°C. 15. Observe el desarrollo de su crecimiento a las 24 y 48 horas de incubadas.

6. SUGERENCIAS DIDACTICAS 1. Fomentar la investigación a través de observar el efecto de el tipo de medio de cultivo y la muestra. 18

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2. Generar una discusión en grupo de los resultados obtenidos con los distintos medios de cultivo y muestras utilizados.

7. REPORTE DEL ALUMNO 1. Escribir las diferencias de los desarrollos en los medios de cultivo. 2. Describa a través de una tabla los siguientes resultados: Medio

de Fuente

del Forma

cultivo

microorganismo

Líquido

Muestra sólida

Líquido

Muestra líquida

Sólidor

Muestra sólida

Sólidor

Muestra líquida

de Resultado

Observaciones

Crecimiento

3. Compare sus resultados con los resultados de sus compañeros y presente un resumen. 4. Escriba sus conclusiones.

8. BIBLIOGRAFIA 1. Bradshaw J., 1979. “Microbiología de laboratorio”. Editorial El manual Moderno, S.A. 2. Carpenter P., 1969, Microbiología”. Editorial Interamericana. 3. Pelczar M., 1984,”Microbiología”. Editorial McGraw Hill. 4. Stanier R., Doudoroff M. y Adelberg E. 1981.”Microbiología”. Editorial Aguilar. 5. www.danival.org/notasmicro/medioscult/madre_medios.html.

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Práctica 3. Determinación de los parámetros de letalidad térmica: valores D-Z.

1. OBJETIVO Aplicará las técnicas para determinar los valores de D y Z de los microorganismos.

2. INTRODUCCION La tecnología microbiana y alimentaria requiere que sus procesos sean operados sin contaminación biológica. En general se necesita un alto grado de limpieza y se procura que las operaciones sean asépticas. Para mantener un proceso en condiciones asépticas sería necesario contar con un método cuantitativo seguro y confiable de medir la concentración de contaminantes que entran al proceso, además que cada contaminante en particular varia su efecto potencial sobre el proceso. Dentro de los métodos utilizados por la industria para esterilizar sus procesos el más empleado es la destrucción por calor, en el cual el concepto básico es la mortalidad térmica, la cual intenta explicar el mecanismo de inactivación térmica de los microorganismos, en lo particular en nuestro caso solo se tratará el aspecto cinético. La destrucción de los microorganismos depende de muchas variables: pH de medio, estado vegetativo o esporular de las células, iones metálicos, etc. La destrucción de los microorganismos sigue una reacción de primer orden, es decir la tasa de mortalidad en cualquier tiempo es proporcional al número de células vivas a una temperatura específica. dN/dt = -k N En donde N es el número de células vivas en cualquier tiempo y k la constante de velocidad de muerte. La relación de estas variables se comporta lineal entre el 20

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logaritmo del número de células vivas y el tiempo de esterilización, esta relación se conoce como la Ley logarítmica de mortalidad. Dentro de las expresiones para la taza de esterilización, se tienen las siguientes: PMT.- Punto de muerte térmica es la temperatura mínima requerida para destruir la totalidad de los microorganismos. TMT.- Tiempo de muerte térmica es el tiempo requerido para destruir todas las células a una temperatura determinada. Método del porcentaje.- Porcentaje de células sobrevivientes a la exposición al calor por unidad de tiempo. TRD.- Tiempo de reducción al décimo es el tiempo que tarda un número de células en reducirse al 10% y su valor es D. Z.- Son los grados de temperatura necesarios para reducir el tiempo de destrucción térmica diez veces. Ln 10 = kt

t = D = 2.3/k

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Instituto Tecnológico de Mérida 3. CORRELACION

CON

EL

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PROGRAMA

(ING.

DE

MICROBIOLOGIA

BIOQUIMICA BQO-0525) Tema. Métodos y técnicas microbiológicas básicas. Subtema. Muerte térmica y valores D y Z. Los tratamientos térmicos a los materiales o alimentos permiten mantener condiciones para poder trabajar libres de contaminación y dar más tiempo de anaquel. 4. MATERIAL Y EQUIPO Para cada tratamiento térmico. Descripción del material

Cantidad

Equipo

Agar nutritivo (g/l)

23

Autoclave

Caldo nutritivo (g/l)

8

Estufa incubadora

Cajas petri

40

Horno

Tubos de 18 x 150 mm con tapón de rosca

25

Baño metabólico con control de temperatura

Probeta de 100 ml

1

Campana de flujo laminar

Matraz Erlenmeyer de 1000 ml

1

Potenciómetro

Matraz Erlenmeyer de 500 ml

2

Mechero Fisher

gradilla

1

Centrifuga

Asa varilla de vidrio

1

Micropipeta de 0.1 a 1 ml

Tubos para centrifuga 10 ml

10

Vortex

Pipetas de 1 ml

10

Puntas para micropipeta de 1 ml

100

Algodón, gasa, papel Manila o estraza, cinta adhesiva, cinta testigo, cepa pura.

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5. METODOLOGIA Soluciones 1. Solución salina al 0.85 % .- Colocar 8.5 g de NaCl en un matraz volumétrico de 1000 ml; disolver y llevar a volumen con agua destilada. 2. Hidróxido de sodio 1 N.- En un matraz volumétrico de 100 ml, pesar 4.0 g de NaOH disolver y aforar con agua destilada. 3. Solución amortiguadora de fosfatos.- Disolver 34 g de fosfato monobásico de potasio en 500 ml de agua destilada; ajustar el pH a 7.2 con hidróxido de sodio 1 N. Se requieren aproximadamente 175 ml. Diluir a 1000 ml con agua destilada, esterilizar durante 20 min a 121°C y conservar en refrigeración hasta su uso. 4. Solución de trabajo.- A 1000 ml de solución salina al 0.85 %, adicionar 1.25 ml de solución amortiguadora de fosfatos; si es necesario, ajustar el pH a 7.2. 5. Transferir 9 ml de solución de trabajo en 20 tubos con tapón de rosca y esterilizar. Paquete Celular 1. Crecer el microorganismo seleccionado durante 24 horas, en un matraz de 500 ml con un volumen de 200 ml de medio de cultivo. 2. Centrifugar, y resuspender en 20 ml de la solución de trabajo el paquete celular. Refrigerar hasta su transferencia. Sobrevivencia térmica 1. Transferir 1 ml del paquete celular resuspendido en la solución trabajo a cada uno de los 20 tubos conteniendo 9 ml de solución de trabajo estéril. 2. Mantener los tubos bajo las condiciones de tratamiento térmico siguientes: a. 100°C b. 105°C c. 110°C d. 115°C e. 120°C f. 125°C

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3. Por cada temperatura, obtener muestras por triplicado a los siguientes tiempos (minutos): 1, 2, 4, 8, 16, 25. Tomar 2 tubos como muestra control (tiempo 0). 4. Determinar viabilidad celular en cada una de las muestras. 5. Graficar los resultados. 6. Determinar los valores de D y Z.

6. SUGERENCIAS DIDACTICAS 1. Fomentar la investigación a través de observar el efecto del tratamiento térmico y su influencia en la muerte térmica de los microorganismos. 2. Generar una discusión en grupo de los resultados obtenidos con los tratamientos y muestras utilizados.

7. REPORTE DEL ALUMNO 1. Calcule los valores de D y Z. 2. Describa a través de una tabla los siguientes resultados: Tratamiento térmico

Tiempo

Concentración celular

(°C)

(minutos)

(viables)

100

0, 1, 2, 4, etc

Número/ml, etc

105

0, 1, 2, 4, etc

Número/ml, etc

Observaciones

etc

3. Compare sus resultados con los resultados de sus compañeros y presente un resumen. 4. Escriba sus conclusiones.

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8. BIBLIOGRAFIA 1. Bradshaw J., 1979. “Microbiología de laboratorio”. Editorial El manual Moderno, S.A. 2. Carpenter P., 1969, Microbiología”. Editorial Interamericana. 3. Frazier W., 1976. “Microbiolgía de los alimentos”. Editorial Acribia. 4. Pelczar M., 1984,”Microbiología”. Editorial McGraw Hill. 5. Quintero R., 1981. “Ingeniería bioquímica. Teoría y aplicaciones. Editorial Alhambra Mexicana, S:A. 6. Stanier R., Doudoroff M. y Adelberg E. 1981.”Microbiología”. Editorial Aguilar.

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Práctica 4. Obtención de cultivos puros, utilizando las diversas técnicas de aislamiento.

1. OBJETIVO Aplicará las técnicas de varilla acodada y estría cruzada para la purificación de cultivos bacterianos.

2. INTRODUCCION Un cultivo puro es aquel que se desarrolla a partir de una célula única y que pertenece a la misma especie y cepa. Obtener un cultivo puro es uno de los problemas en la microbiología, ya que el estudio organizado de cualquier organismo requiere que se le examine una especie a la vez, el método analítico no se puede aplicar cuando hay más de una. Idealmente, uno debería aislar una sola célula individual y luego transferirla a un medio estéril hasta que se divida para generar una sola población a la cual se le denomina clona y, en este caso tener un cultivo puro. Generalmente las bacterias son inoculadas e introducidas en medios líquidos (caldos) o solidificados con agar para su propagación y/o conservación, como para estudiar sus características de crecimiento. Es importante recordar que la inoculación de los microorganismos en los medios de cultivo, siempre deben realizarse en zona aséptica (cerca del mechero o en campana de flujo laminar), condiciones que limitan la presencia de microorganismos indeseables o contaminantes. Los cultivos puros al estar formados por un solo tipo de microorganismos; nos permite conocer las características morfológicas, propiedades de tinción, actividad química, patogenicidad, sensibilidad a antibióticos e identificación a las especies microbianas; para todo esto se utilizan las técnicas de aislamientos quienes permiten la obtención de microorganismos a partir de muestras complejas (suelo, agua, 26

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alimentos, etc.) en las que hay una gran diversidad microbiana, así como para comprobar la pureza de los cultivos obtenidos, esto se logra con las técnicas de aislamiento y s purificación. Una manera para favorecer el aislamiento de cultivos de baja densidad, es aplicar métodos de cultivos especiales, en los que se utilizan medios que contienen nutrientes como: antibióticos, altas concentraciones de sales y/o pH, luz o temperatura para favorecer el crecimiento del microorganismo de interés. SIEMBRA.-Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio adecuado que provee los requerimientos necesarios, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, la creencia de transferir una gran cantidad del material de cultivo para tener éxito es un error. Luego de sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento. La siembra puede realizar en medio líquido, sólido o semisólido, utilizando punta, asa, hisopo o pipeta estéril, etc.

3. CORRELACION

CON

EL

PROGRAMA

DE

MICROBIOLOGIA

(ING.

BIOQUIMICA BQO-0525) Tema. Métodos y técnicas microbiológicas básicas. Subtema. Métodos y técnicas de aislamiento y selección. Tema. Microorganismos procariotas. Subtema. Morfología y estructura bacteriana; Reproducción bacteriana.

El cultivo de los microorganismos en condiciones artificiales se logra reproduciendo las condiciones medioambientales, adicionando los nutrientes que le den ventajas de crecer al microorganismo de interés, a través de técnicas de siembra que permiten obtener un cultivo puro.

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4. MATERIAL Y EQUIPO Descripción del material

Cantidad

Equipo

Agar nutritivo (g/l)

23

Autoclave

Cajas petri

20

Estufa incubadora

Tubos de 18 x 150 mm con tapón de rosca

10

Horno

Probeta de 100 ml

1

Campana de flujo laminar

Matraz Erlenmeyer de 250 ml

1

Potenciómetro

Matraz Erlenmeyer de 500 ml

1

Mechero Fisher

gradilla

1

Vortex

Asa de platino

1

Asa de varilla acodada

1

Pipetas de 1 (ml)

10

Alcohol 96° (ml)

100

Vaso de precipitado 500 ml

1

Lactosa (g/l)

10

NH4H2PO4 (g/l)

2

K2HPO4 (g/l)

5

MgSO4 (g/l)

1

KCl (g/l)

0.2

Purpura de bromocresol (ml)

1

Agar bacteriológico (g/l)

15

Algodón, gasa, papel Manila o estraza, cinta adhesiva, cinta testigo, tierra.

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5. METODOLOGIA Preparación del material 1. Pesar la cantidad indicada en el frasco de medio de cultivo. (agar nutritivo 4.6 g para 200 ml para 10 cajas petri). 2. Pesar las sales y lactosa calculando para la preparación de 200 ml. (para 10 cajas petri). 3. Disolver al inicio en una cantidad de la fracción del volumen total con agua. 4. Mezclar bien y agregar el resto de agua necesaria enjuagando con el agua las paredes del recipiente. 5. Calentar suavemente entre 50 y 60°C, agitando constante el recipiente hasta su incorporación del medio al agua o clarificar, espere 5 minutos agitando antes de llevarlo a ebullición. (Nunca sobrecaliente, uno o dos minutos de ebullición es suficiente). 6. Prepare 5 tubos con 9 ml con la solución de trabajo (solución salina y amortiguador de fosfatos) para hacer las diluciones decimales y cierre suavemente el tubo con el tapón de rosca. 7. El agar nutritivo se esteriliza en el matraz Erlenmeyer y las cajas de petri deberán esterilizarse previamente por separado. 8. La esterilización por autoclave a 121°C a 1 atm de presión manteniendo estas condiciones durante 15 minutos, cortar un segmento de cinta testigo para cada lote). 9. Los tubos con las diluciones decimales se cierran después de su esterilización y que estos estén a una temperatura entre 50 y 60°C. 10. El agar nutritivo estéril se vacía a las cajas petri cuando éste alcance una temperatura entre 45 y 50°C. Aislamiento 1. Cernir la muestra de tierra y pesar 1 g. 2. Transferir la muestra de tierra al primer tubo (1) con la solución de trabajo estéril. 3. Homogenizar con el vortex y esperar que sedimente la tierra. 4. Tomar 1 ml del tubo (1) y transferirlo al siguiente tubo (2) con la solución de trabajo estéril. 29

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5. Homogenizar con el vortex y esperar que sedimente la tierra. 6. Tomar 1 ml del tubo (2) y transferirlo al siguiente tubo (3) con la solución de trabajo estéril. 7. Homogenizar con el vortex y esperar que sedimente la tierra. 8. Repetir el procedimiento hasta agotar los tubos con solución de trabajo estéril. (serie de diluciones decimales de 1/10, 1/100, etc.) 9. Inocular por duplicado (transferir 0.5 ml de las diluciones decimales 1,3 y 5) a los medios de agar nutritivo y agar de lactosa. 10. Extender la alícuota con el asa de varilla acodada (previamente esterilizada con alcohol) en toda la superficie de la caja petri con el medio de cultivo no presionando el agar. 11. Incubar a 35°C y observar cada 24 horas, por 3 días. 12. Escoger 2 colonias aisladas diferentes y marcarlas con un circulo (por fuera de la caja). Purificación 1. Esterilizar el asa de platino en la llama directa del mechero, que esté en contacto con la parte exterior de llama en posición vertical hacia abajo (20-30°). 2. Transfiera la colonia seleccionada a una caja de petri estéril con medio fresco, tocando sobre la colonia y sembrar con la técnica de estría cruzada. 3. Incubar a 35°C, durante 24 horas, observar colonias separadas y que solo exista un solo tipo de colonia. 4. Repetir la siembra en medio fresco hasta obtener el cultivo puro.

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6. SUGERENCIAS DIDACTICAS 1. Fomentar la investigación a través de observar el efecto de los diferentes medios de cultivo en los microorganismos. 2. Generar una discusión en grupo de los resultados obtenidos con los tratamientos y muestras utilizados.

7. REPORTE DEL ALUMNO 1. Describa a través de una tabla los siguientes resultados: Medio

de Dilución decimal

cultivo

Colonias

Observaciones

diferentes

Agar nutritivo

1, 3, 5

Número/característica

Agar de lactosa

1, 3, 5

Número/característica

2. Compare sus resultados con los resultados de sus compañeros y presente un resumen. 3. Escriba sus conclusiones.

8. BIBLIOGRAFIA 1. Bradshaw J., 1979. “Microbiología de laboratorio”. Editorial El manual Moderno, S.A. 2. Carpenter P., 1969, Microbiología”. Editorial Interamericana. 3. Frazier W., 1976. “Microbiolgía de los alimentos”. Editorial Acribia. 4. Pelczar M., 1984,”Microbiología”. Editorial McGraw Hill.

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5. Quintero R., 1981. “Ingeniería bioquímica. Teoría y aplicaciones. Editorial Alhambra Mexicana, S:A. 6. Stanier R., Doudoroff M. y Adelberg E. 1981.”Microbiología”. Editorial Aguilar.

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Práctica 5. Observación colonial y microscópica de cultivos bacterianos.

1. OBJETIVO Obtendrá cultivos bacterianos puros y describirá su morfología colonial y aplicará las técnicas de tinción para su observación de la morfología microscópica.

2. INTRODUCCION Una bacteria simple esta formada por tres capas externas que envuelven las estructura internas; la capa pegajosa protege la pared celular rígida, que a su vez cubre la membrana celular semipermeable. El flagelo es un medio de locomoción y los pelos que se extienden por fuera de la cápsula, ayudan la bacteria a sujetarse de las superficies. Hay dos grupos principales de bacterias: las saprofitas, que viven sobre los cuerpos muertos de animales y vegetales, y los simbiontes, que viven en animales o plantas vivas. Las

saprofitas son importante s por

plantas o animales muertos en

que descomponen

los cuerpos de

sus componentes esenciales, haciendo se

accesibles para ser utilizados como alimento por las

plantas. Muchas bacterias

simbiontes se encuentran en condiciones normales, en los tejidos humanos, incluso en el tubo digestivo y la piel, donde pueden resultar indispensables para los procesos fisiológicos este tipo de relación recibe el nombre de mutualismo. En el comensalismo, las bacterias simbiontes obtienen los nutrientes de sus huéspedes vivos causándoles un daño considerable. El tercer tipo los parásitos, pueden provocar la destrucción de las plantas o los animales en los que viven. Cada bacteria es una porción definido.

microscópica de materia viva sin un núcleo bien

En su mayoría las bacterias son incoloras, aun que algunas tienen

sustancias y colorantes. Por término medio miden una micra (0.001mm) de diámetro. 33

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En cuanto as tipo de agrupación pueden ser, respecto a los cocos: Diplococos, se agrupan de dos en dos; estreptococos, si se agrupan en fila, tetra cocos, si se agrupan en cuatro; sarcinas, si forman cubos; estafilococos si lo hacen en racimos. También se caracterizan algunas bacterias por la facultad que tienen de producir cuerpos ovales de pared gruesa (una por célula) que es una célula de alta resistencia llamada endospora o más comúnmente espora. Todos los organismos del género Bacillus y Clostridium se caracterizan por su capacidad de producir esporas.

3. CORRELACION

CON

EL

PROGRAMA

DE

MICROBIOLOGIA

(ING.

BIOQUIMICA BQO-0525) Tema. Métodos y técnicas microbiológicas básicas Subtema. Aislamiento de microorganismos; Cultivo de microorganismos; Criterios utilizados en la identificación de microorganismos Tema. Microorganismos procariotas. Subtema. Morfología y estructura bacteriana; Reproducción bacteriana. La observación de la morfología colonial y microscópica de las bacterias, permite determinar el tamaño, forma, agrupación, características de sus estructuras como la membrana, pared celular, esporas, etc., lo cual ayuda para su clasificación. 4. MATERIAL Y EQUIPO Descripción del material

Cantidad

Equipo

Cajas petri

2

Microscopio

Portaobjetos (caja por equipo)

1

Mechero bunsen

Cubreobjetos (caja por equipo)

1

Cultivo bacteriano

1

Aceite de inmersión

1

Safranina

1

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Asa de Platino

1

Alcohol 96° (frasco de 500 ml, por equipo)

1

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Algodón, cinta adhesiva, papel absorbente, cultivo puro (joven).

5 METODOLOGIA Para las observaciones de las características macroscópicas se estudia el tiempo de colonia formada por cepa. Procedimiento 1.-Del cultivo puro de la cepa se toma una asada y empleando la técnica de estría cruzada se inocula una caja petri con agar nutritivo. 2.-Se incuba durante 24-48 horas, después de la caja se escoge para la observación una colonia aislada. 3.-Se hace la observación de la colonia. Observación de morfología colonial a) Edad: tiempo transcurrido a partir e la inoculación b) Tamaño de la colonia: Diámetro de la colonia. c) Color: se compara con un catalogo de colores. d) Consistencia: suave, dura, cremosa, otras (especificar) e) Luz translúcida, puede ser: transparente, translúcida u opaca. f) Borde: entero, ondulado, gastado, filamentoso, arborescente, ensortijado. g) Elevación: esparcida, plana, elevada, convexa, encazoleta, umbilicada. h) Estructura interna: Homogénea, granulosa y rizada. 35

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i) superficie. Pudiendo ser; lisa, rugosa, anular. Observación morfología microscópica Para las observaciones microscópicas se procede de la siguiente manera: De la caja de cultivo puro se toma una azada. Se hace un frotis fijo. Preparación de frotis fijo Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material que se va a teñir (si es líquido) o se hace rodar el hisopo con que se tomó la muestra. Una vez que el hisopo ha tocado la superficie del portaobjetos, que no está estéril, ya no puede ser empleado para inocular los medios de cultivo. Puede usarse una aguja estéril para transferir una pequeña cantidad de un cultivo bacteriano a la superficie del portaobjetos. Este material es suspendido en una gota de agua o solución salina previamente colocada sobre el portaobjetos. Cuando se trata de colonias muy pequeñas que pueden perderse en una gota de líquido se emplea una varilla delgada de madera estéril con la cual se toca la colonia obteniéndose así una fracción apreciable del desarrollo. El material se frota directamente sobre el portaobjetos, donde puede visualizarse con facilidad. El material colocado en el portaobjetos se deja secar al aire o bien se pasa varias veces por la zona azul de la llama de un mechero de Bunsen hasta que el vidrio esté tan caliente que moleste al tacto pero no queme y se coloca el portaobjetos sobre un vaso de precipitados. A continuación se tiñe la muestra: Se le adiciona cristal violeta por un minuto, Se le agrega lugol por un minuto, después se lava suavemente con un chorro de agua 36

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Se le agrega alcohol-cetona durante 10 o 15 segundos, Se le agrega safranina por un minuto, después se lava suavemente con un chorro de agua hasta que el agua salga sin colorante. Una vez que la preparación está totalmente seca, observar en los objetivos de 10, 45, y 100x, poniendo en este último el aceite de inmersión.

6 SUGERENCIAS DIDACTICAS 1 Fomentar la investigación a través de observar las tinciones y el tipo de microorganismo aislado en el cultivo puro. 2 Generar una discusión en grupo de los resultados obtenidos con los distintos cepas puras y su morfología colonial y microscópica. 37

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7 REPORTE DEL ALUMNO 1. Describir en una tabla y figura la morfología colonia y microscópica de cada cepa pura observada. Morfología colonial Forma de Crecimiento Forma

Elevación

Borde

Estría en agar

Picadura en gelatina

Crecimiento en caldo

Forma

Línea

Licuefacción

Medio

Superficie

Puntiforme

Plana

Entero

Filiforme

Filiforme

Crateriforme

Floculenta

Peliculada

Circular

Elevada

Ondulado

etc

etc

Etc

etc

etc

Filamentosa

Convexa

etc

Amiboide

etc

etc

Morfología microscópica Edad del cultivo (hrs)

Tinción

Forma unicelular

Modo de agrupación

Gram ( )

Bacilo

Células sueltas

Acidorresistente

Coco

Diplos

etc

etc

etc

8 BIBLIOGRAFIA 1. Bradshaw J., 1979. “Microbiología de laboratorio”. Editorial El manual Moderno, S.A. 2. Carpenter P., 1969, Microbiología”. Editorial Interamericana. 3. Frazier W., 1976. “Microbiolgía de los alimentos”. Editorial Acribia. 4. Pelczar M., 1984,”Microbiología”. Editorial McGraw Hill.

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5. Quintero R., 1981. “Ingeniería bioquímica. Teoría y aplicaciones. Editorial Alhambra Mexicana, S:A. 6. Stanier R., Doudoroff M. y Adelberg E. 1981.”Microbiología”. Editorial Aguilar. 7. www.escuelasecundariaanexa.com.mx

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Práctica 6. Aplicación de los métodos de preservación de microorganismos y diseño de un cepario.

1. OBJETIVO Aplicará diferentes técnicas para la conservación de cepas microbianas.

2. INTRODUCCION Desde tiempos remotos los microorganismos han sido empleados como materiales esenciales de trabajo en la obtención de medicamentos (antibióticos, vitaminas y aminoácidos), elaboración de alimentos (pan, queso, leche, bebidas y licores) y fabricación de solventes y reactivos, entre otras aplicaciones. El creciente uso de estos materiales biológicos en la biotecnología y la protección medioambiental han fortalecido la necesidad de mantener los cultivos microbianos de manera que las propiedades que los hacen importantes permanezcan estables. La preservación de cepas microbianas no es tarea fácil y debe garantizar la viabilidad, pureza y estabilidad genética de los cultivos, características que coinciden con los objetivos de un buen método de conservación. El conocimiento de las peculiaridades de las disímiles técnicas de preservación existentes para su correcta aplicación, así como el seguimiento continuo de las propiedades de las cepas, propician su empleo como inóculo confiable en la industria, la docencia y la investigación. Con frecuencia la elección de la técnica más adecuada para conservar cultivos microbianos resulta difícil, pues deben tomarse en consideración los criterios de viabilidad y pureza de las cepas, cambios poblacionales y genéticos, número y valor de los cultivos, costo, suministro y transporte de cepas, así como la frecuencia del uso de los cultivos. Los procedimientos de conservación utilizados para estos microorganismos son: 40

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Subcultivos: Alta probabilidad de que se produzcan mutaciones, alto riesgo de contaminación, escasa vialibidad a largo plazo. Conservación a bajas temperaturas: En placas de agar Conservación de las esporas en agua Conservación en congelación Se requiere el uso de crioprotectores (DMSO, glicerol, trehalosa), las temperaturas más utilizadas son –80ºC y mediante nitrógeno líquido entre –150 y –196ºC, se recomienda una congelación lenta y una descongelación rápida, buena estabilidad genética, suele ser caro mantener temperaturas tan bajas. Conservación en forma deshidratada: Cultivos con aceite mineral Liofilización Es un método muy utilizado, tiene buena estabilidad genética, es una técnica sofisticada.

3. CORRELACION

CON

EL

PROGRAMA

DE

MICROBIOLOGIA

(ING.

BIOQUIMICA BQO-0525) Tema. Métodos y técnicas microbiológicas básicas Subtema. Aislamiento de microorganismos; Cultivo de microorganismos; Criterios utilizados en la identificación de microorganismos Tema. Microorganismos procariotas. Subtema. Morfología y estructura bacteriana; Reproducción bacteriana. 41

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La conservación de microorganismos en los laboratorios y la industria permite poder disponer de los microorganismos en el momento que se requiera, además de poder realizar todos los trabajos necesarios para su clasificación y determinar sus características de interés.

4. MATERIAL Y EQUIPO Descripción del material

Cantidad

Equipo

Agar nutritivo (g/l)

23

Autoclave

Caldo nutritivo

8

Horno

Cajas petri

4

Estufa incubadora

Tubos de 18 x 150 mm con tapón de rosca

30

Campana de flujo laminar

Tubos de 2 ml para microcentrifuga

20

Refrigerador

Probeta de 100 ml

1

Mechero Fisher

Matraz Erlenmeyer de 250 ml

2

Vortex

Matraz Erlenmeyer de 125 ml

5

Microcentrifuga

gradilla

1

Asa de platino

1

Algodón, gasa, papel Manila o estraza, cinta adhesiva, cinta testigo

5. METODOLOGIA Preparación de la muestra 1. Incubar de 24 a 48 horas en medio líquido un cultivo puro hasta alcanzar concentraciones de 107 a 108 células/ml, para poder obtener un paquete celular. 2. Centrifugar y obtener el paquete celular resuspender las células con la menor cantidad de solución de trabajo estéril.

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3. Incubar de 24 a 48 horas en cultivo sólido un cultivo puro, aplicando la técnica de estría cruzada, seleccionar las colonias separadas. 4. Preparar tubos de 18x150 mm con tapón de rosca con 10 ml de agar nutritivo, esterilizar y al sacar los tubos de la autoclave inclinar hasta que el menisco del agar este a 2 cm del cuello de la rosca del tubo, esperar hasta que gelifique. (tubos con agar inclinado). 5. Esterilizar 100 ml de aceite mineral en un matraz de 250 ml. 6. Esterilizar por calor seco tubos de 18x150 mm con tapón de rosca conteniendo 2 gramos de sílica gel. 7. Esterilizar por calor seco tubos de 18x150 mm con tapón de rosca conteniendo 2 gramos de tierra cernida. Aplicación de la técnica de conservación Resiembra periódica: 1. Transferir por triplicado las colonias seleccionadas del cultivo puro joven al tubo de agar inclinado, aplicando la siembra de estría a todo lo largo del medio inclinado. 2. Incubar los tubos sembrados utilizando las mismas condiciones ambientales de donde proviene, esperar hasta tener un buen crecimiento del cultivo puro. 3. Refrigerar los tubos con las cepas ya crecidas, hasta la fecha de su resiembra. (repetir los pasos 3 y 4 del paso de preparación de la muestra y todos de la resiembra periódica). 4. Los tubos con las cepas crecidas podrán añadirles el aceite mineral hasta cubrir todo el agar inclinado, refrigerar hasta la fecha de su resiembra. (repetir los pasos 3, 4 y 5 del paso de preparación de la muestra y todos de la resiembra periódica). 5. Etiquetar todos tubos de conservación antes de refrigerar, con la siguiente información: cepa, clave de identificación, medio de cultivo utilizado, fecha de siembra, fecha de resiembra, número de resiembra, nombre del alumno, institución, carrera, asignatura. Deshidratación: 1. Transferir por triplicado el paquete celular resuspendido al tubo con sílica gel, cerrar y dejar reposar 12 horas permitiendo que se efectué la deshidratación. (usado principalmente para cepas productoras de esporas). 43

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2. Refrigerar los tubos con las cepas, hasta la fecha de su resiembra. (repetir los pasos 1, 2 y 6 del paso de preparación de la muestra y todos de la deshidratación).

Limitación de nutrientes: 1. Transferir por triplicado el paquete celular resuspendido al tubo con suelo estéril, cerrar y dejar reposar por 12 horas y refrigerar posteriormente. (el suelo está limitado en nutrientes y por estar seco atrapa la humedad de las células secándolas, esta técnica es muy económica empleándose principalmente para cepas que esporulan). 2. Refrigerar los tubos con las cepas ya crecidas, hasta la fecha de su resiembra. (repetir los pasos 1, 2 y 7 del paso de preparación de la muestra y todos de la limitación de nutrientes).

6. SUGERENCIAS DIDACTICAS 1. Fomentar la investigación a través de observar el efecto de los métodos de conservación sobre la sobrevivencia de las cepas. 2. Generar una discusión en grupo de los resultados obtenidos con los distintos medios de cultivo y muestras utilizados.

7. REPORTE DEL ALUMNO 1. Escribir las diferencias de las técnicas de conservación. 2. Describa a través de una tabla los siguientes resultados: Técnica

de Costos

conservación

conservación

de Dificultad de la Resultado

Observaciones

técnica

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3. Compare sus resultados con los resultados de sus compañeros y presente un resumen. 4. Escriba sus conclusiones.

8. BIBLIOGRAFIA 1. Bradshaw J., 1979. “Microbiología de laboratorio”. Editorial El manual Moderno, S.A. 2. Carpenter P., 1969, Microbiología”. Editorial Interamericana. 3. Pelczar M., 1984,”Microbiología”. Editorial McGraw Hill. 4. Stanier R., Doudoroff M. y Adelberg E. 1981.”Microbiología”. Editorial Aguilar.

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Práctica 7. Cultivos de microorganismos en anaerobiosis.

1. OBJETIVO Aplicará las técnicas de cultivos anaerobios.

2. INTRODUCCION La presencia de una atmósfera terrestre rica en oxígeno permitió a los seres vivos evolucionar desarrollando un metabolismo aeróbico, el cual se caracteriza por ser una forma muy eficiente de obtención de energía. Las bacterias anaerobias precedieron largamente a las aeróbicas y sin duda, predominaron largamente en un mundo vivo que comenzaba a desarrollarse. El reconocimiento de la naturaleza anaerobia de determinados microorganismos se acredita a Pasteur, quien en 1863 observó que la motilidad de ciertas bacterias desaparecía con la exposición al aire. El conocimiento sobre las bacterias anaerobias es poco y relativamente reciente, ya que para poder lograr condiciones de anaerobiosis en el laboratorio se necesitaban, hasta los años 60, equipos costosos y técnicas bacteriológicas muy dificultosas. A partir de la introducción de sistemas simples para producir anaerobiosis con equipos y reactivos de bajo costo, el conocimiento de los anaerobios se desarrolla intensamente. Aun así, no hay un gran número de microbiólogos que se dediquen al tema, la taxonomía está en permanente revisión e infinidad de aspectos se mantienen oscuros. Anaerobios son aquellos gérmenes que sólo pueden desarro llarse en ausencia de cantidades significativas de oxígeno (O 2) y bajo condiciones de potenciales redox (Eh) muy reducidos, por tanto son estrictos en cuanto a sus exigencias de medio ambiente. Las formas vegetativas mueren cuando son expuestos al oxígeno molecular libre en la atmósfera, aunque el grado de resistencia bajo estas condiciones es variable (aerotolerancia). Los esporos bacterianos no son afectados

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por tratarse de formas biológicas metabólicamente inertes y con muy escasa proporción de agua en su composición. Si bien se considera bacteria anaerobia aquel germen que puede crecer sólo en ausencia de oxígeno, la sensibilidad frente al oxígeno varía ampliamente de una especie a otra. Así, distinguimos bacterias microaerófilas, aerotolerantes y anaerobios estrictos u obligados. Las bacterias microaerófilas resultan dañadas por niveles altos de oxígeno como el atmosférico (21%) y requieren niveles bajos de O2 para crecer, en el rango de 2 a 10%. Anaerobios aerotolerantes son aquellos microorganismos

que

toleran

exposiciones

breves

al

oxígeno

atmosférico

desarrollando óptimamente en condiciones anaerobias. Los anaerobios estrictos no toleran el oxígeno y mueren en su presencia, por tanto sólo desarrollan en condiciones anaerobias; (de aquí en adelante los denominaremos simplemente anaerobios). Los anaerobios en general poseen un metabolismo de tipo fermentativo, en el cual sustancias orgánicas son los aceptores finales de electrones, aunque también pueden obtener energía a partir de la respiración anaerobia. Otras características comunes a los microorganismos anaerobios son sus requerimientos nutricionales complejos, su lento crecimiento y su labilidad, lo cual, sumado a sus requerimientos atmosféricos estrictos (de O2 y CO2) hace que su aislamiento sea difícil; además, al ser la mayoría de las infecciones mixtas (aerobios y anaerobios) otros microorganismos menos exigentes y de crecimiento más rápido pueden crecer e inhibirlos si no se toman las precauciones necesarias. Otro factor crucial para el éxito en el aislamiento de anaerobios es el transporte adecuado de la muestra. Se debe proteger a los microorganismos de los efectos nocivos del oxígeno atmosférico durante el tiempo que transcurre entre la extracción y la siembra anaeróbica de la muestra. La primera y más efectiva medida es “correr” ya que en ninguna otra ocasión como esta el envío inmediato al laboratorio es tan fundamental. Las muestras deben ser colocadas en un sistema de transporte que asegure la anaerobiosis. Existen tubos, comercialmente disponibles en los que se ha sustituido el aire por otro gas, como CO 2 o N2, denominados tubos gaseados y que contienen un indicador de anaerobiosis. Dichos tubos sirven para el transporte de 47

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2009

muestras líquidas que se inyectan a través de un tapón de goma luego de eliminar todo el aire de la jeringa y aguja. Luego de sembrar la muestra en un medio de cultivo adecuado, la incubación en anaerobiosis se consigue por medio de alguno de los siguientes sistemas: jarras anaeróbicas, bolsas de anaerobiosis y la cámara de anaerobiosis o “cámara de guantes”. El último método es muy caro, requiere equipamiento complejo, es lento y se usa para estudios de flora normal y en laboratorios altamente especializados. Desde el punto de vista práctico las jarras y los sobres o bolsas son equiparables en rendimiento a los sistemas más sofisticados y son aceptables para el aislamiento de bacterias anaerobias en el laboratorio clínico. Con estos sistemas son posibles los cultivos en medios sólidos para la obtención de aislamientos que permitan la identificación bacteriana. Jarras de anaerobiosis Es el sistema más utilizado para generar una atmósfera anaeróbica. Consiste en una jarra de plástico con una tapa que cierra herméticamente. La atmósfera anaerobia puede lograrse por dos métodos diferentes. El más sencillo utiliza un sobre comercial generador de hidrógeno y CO2 que es activado, ya sea mediante la adición de agua o por la humedad de las placas de agar. El H 2 se combina con el O2 del aire para formar agua generando la anaerobiosis. Esta reacción es catalizada por granallas de zinc recubiertas de paladio que se encuentran depositadas en una canastilla fija a la tapa de la jarra. El segundo método consiste en la extracción del aire contenido en la jarra a través de la generación de vacío, sustituyendo el mismo por otro gas libre de O2 como el nitrógeno. El contenido final de la jarra consiste en una mezcla de gases conteniendo generalmente 80-90% de nitrógeno, 5-10% de hidrógeno y 5-10% de CO2. Una tirilla de papel impregnada en azul de metileno (azul en presencia de O 2, incoloro en su ausencia) introducida en la jarra es el indicador de anaerobiosis.

3. CORRELACION

CON

EL

PROGRAMA

DE

MICROBIOLOGIA

(ING.

BIOQUIMICA BQO-0525) Tema. Métodos y técnicas microbiológicas básicas 48

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“Manual de Prácticas de Microbiologia”

2009

Subtema. Aislamiento de microorganismos; Cultivo de microorganismos; Criterios utilizados en la identificación de microorganismos Tema. Microorganismos procariotas. Subtema. Morfología y estructura bacteriana; Reproducción bacteriana. El cultivo de los microorganismos anaerobios en condiciones artificiales se logra con una adecuada toma y manejo de la muestra (condiciones anaeróbicas), incubando para su desarrollo en ambientes anaeróbicos.

4. MATERIAL Y EQUIPO Descripción del material

Cantidad

Caldo tioglicolato (g/l) Caldo nutritivo (g/l)

Equipo Autoclave

8

Estufa incubadora

Agar gelosa sangre

Jarra de anaerobiosis

Agar tripticasa sulfato de neomicna y polimixina TSN (g/l)

Horno

Aceite mineral (ml)

8

Mechero Fisher

Cajas petri

10

Campana de flujo laminar

Tubos de 18 x 150 mm con tapón de rosca

20

Vortex

Probeta de 100 ml

1

Matraz Erlenmeyer de 250 ml

1

matraz Erlenmeyer de 500 ml

1

Vaso de precipitados de 500 ml

1

gradilla

1

Asa de platino

1

49

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2009

Algodón, gasa, papel Manila o estraza, cinta adhesiva, cinta testigo.

5. METODOLOGIA 1. Colocar 1 gramo de muestra en solución de trabajo, homogenizar con el vortex y dejar sedimentar. 2. Tomar una asada del sobrenadante y sembrar por estría cruzada en una placa de agar TSN. 3. Incubar a 37°C durante 48 horas en una jarra de anaerobiosis conteniendo sílica gel en el fondo, introducir un indicador de oxido-reducción (papel filtro impregnado con azul de metileno). 4. Meter el sobre generador de H2 y CO2 (gas pak) y adicionar 10 ml de agua en el interior de sobre para activarlo. 5. Cerrar inmediatamente la jarra. 6. Homogenizar la muestra en el tubo y calentar a ebullición durante 10 minutos. 7. Dejar enfriar y esperar que sedimente. 8. Repetir los puntos del 2 al 5.

6. SUGERENCIAS DIDACTICAS 1. Fomentar la investigación a través de observar el cultivo de la muestra. 2. Generar una discusión en grupo de los resultados obtenidos con los distintos medios de cultivo y muestras utilizados.

7. REPORTE DEL ALUMNO 1. Escribir las diferencias de los desarrollos en los medios de cultivo. 2. Describa a través de una tabla los siguientes resultados:

50

Instituto Tecnológico de Mérida Medio

“Manual de Prácticas de Microbiologia”

de Morfología de la Forma

cultivo

colonia

de Resultado

2009

Observaciones

Crecimiento Tinción gram

3. Compare sus resultados con los resultados de sus compañeros y presente un resumen. 4. Escriba sus conclusiones.

8. BIBLIOGRAFIA 1. Bradshaw J., 1979. “Microbiología de laboratorio”. Editorial El manual Moderno, 2. Cowan S. y Steel K. 1985. “Manual para la Identificación de bacterias de importancia médica”. Editorial C.E.C.S.A. 3. Martínez A., 1983. “Manual de prácticas de laboratorio”. Edito CREGIT, IT Veracruz.

51

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2009

Práctica 8. Identificación bioquímica de enterobacterias.

1. OBJETIVO Aplicará las técnicas y medios de cultivo para la identificación a través de pruebas bioquímicas del grupo de enterobacterias.

2. INTRODUCCION Enterobacteriaceae es una familia de bacterias Gram negativas que contiene más de 40 géneros, más de 150 especies y 20 especies con patología humana. Pueden tener morfología de bacilos o cocos. Los miembros de esta familia forman parte de la microbiota del intestino (llamados coliformes) y de otros órganos del ser humano y de otras especies animales, aerobios o anaerobios facultativos En la definición clásica de una Enterobacteriaceae se usan siete criterios básicos, adicional a la aparición de nuevos métodos taxonómicos para incluir a ciertos géneros que no cumplen todos los siguientes criterios, pero que forman parte de esta familia: 1. Son bacterias gram negativas, la mayoría bacilos, otros cocobacilos y otros

pleomórficos. 2. No son exigentes, son de fácil cultivo. 3. Son oxidasa negativo (excepto Plesiomonas, que es oxidasa positivo), es decir,

carecen de la enzima citocromo oxidasa, catalasa positiva 4. Son capaces de reducir nitrato en nitrito. 5. Son anaeróbicos facultativos. 6. Son fermentadores de carbohidratos en condiciones anaeróbicas con o sin la

producción de gas (en especial glucosa y lactosa), y oxidadores de una amplia gama de substratos en condiciones aeróbicas. 7. Muchos géneros tienen un flagelo que sirve para desplazarse, aunque algunos

géneros no son móviles. 52

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2009

Adicional a ello, las Enterobacteriaceae no forman esporas, algunas producen toxinas y pueden ser encapsuladas y son organismos catalasa positivos. Son quimioheterótrofos, y necesitan para su crecimiento compuestos simples de carbono y nitrógeno, generalmente sólo con D-glucosa, aunque algunas requieren aminoácidos y vitaminas. La temperatura óptima de crecimiento es de entre 22ºC y 37ºC. En el intestino, representan una fracción importante de la flora aeróbica, se encuentran en grandes números en el colon (desde el ciego hasta el recto), donde contribuyen a la degradación de residuos alimenticios y a la producción de gas intestinal como parte de la fermentación. En ciertas oportunidades, los comensales del intestino pueden resultar patogénicos como oportunistas en infecciones urinarias, pulmonía, septicemia o sobreinfecciones, en especial en inmunosuprimidos, en el uso de ciertos antibióticos, desnutrición, etc. La presencia de Enterobacteriaceae dentro del organismo es anormal y determina la aparición de infecciones, cuya gravedad depende del punto de entrada. Introducidas por los alimentos, provocan problemas intestinales al adherirse y atravesar la barrera de la mucosa gastrointestinal, manifestada por diarreas y deshidratación. Ciertas especies provocan patologías específicas: La especie Salmonella typhi es responsable de la fiebre tifoidea. La especie Shigella dystenteriae es el agente responsable de la disentería bacilar. La especie Escherichia coli enterotóxica es responsable de la gastroenteritis infantil. La especie Yersinia pestis es responsable de la peste. La especie Serratia marcescens usualmente causa infecciones nosocomiales como resultado de tratamiento en un hospital. Para la identificación completa es necesaria la realización de las pruebas bioquímicas las cuales muestran las diferencias en sus rutas metabólicas de cada especie como parte de la expresión de su información genética.

53

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2009

El aislamiento de este grupo se realiza con pruebas presuntivas y su posterior prueba confirmativa, utilizando medios selectivos diferenciales, seguido de pruebas bioquímicas y por último el uso de pruebas serológicas. Las diferencias entre los nombres de los diversos géneros provienen de criterios más precisos, como la fermentación de los diferentes azúcares, la producción o no de azufre, la presencia de enzimas metabólicas (β-galactosidasa, desaminasas, descarboxilasas), etc. Los serotipos de importancia medica y sanitaria pueden distinguirse entre sí por la presencia o ausencia de antígenos en su constitución celular, tales como en el lipopolisacárido (antígeno O), el antígeno flagelar (antígeno H) o el antígeno capsular (antígeno K), etc.

3. CORRELACION

CON

EL

PROGRAMA

DE

MICROBIOLOGIA

(ING.

BIOQUIMICA BQO-0525) Tema. Métodos y técnicas microbiológicas básicas. Subtema. Criterios de clasificación en la identificación de microorganismos. La identificación de las Enterobacteriaceae se realiza a través de incubar a los presuntos microorganismo con medios de cultivo selectivos y diferencias y posterior incubación con sustratos específicos para determinar su asimilación y fermentación de los mismos, para la identificación de sus rutas metabólicas, como su expresión de su información genética.

4. MATERIAL Y EQUIPO Descripción del material

Cantidad

Equipo

Caldo lactosado (g/l)

12

Autoclave

Caldo verde bilis brillante (g/l)

40

Estufa incubadora

Agar MacConkey (g/l)

51.5

Horno

54

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Agar XLD (g/l)

55

Mechero Fisher

Caldo base fermentación (g/l)

15

Campana de flujo laminar

Glucosa (g/l)

7

Unidad filtración millipore

Lactosa (g/l)

7

Agar hierro de Kliger (KIA) (g/l)

52.5

Medio de SIM (g/l)

30

Medio de Citrato de Simmons (g/l)

23

Medio TSI (g/l)

63.5

Agar manitol (g/l)

35

KNO3 (g/l)

1

Cajas petri

20

Tubos 18 x 150 mm c/tapón de rosca

30

Probeta de 100 ml

1

Matraz Erlenmeyer de 250 ml

1

matraz Erlenmeyer de 500 ml

1

gradilla

3

Asa de platino

1

Asa varilla de vidrio

1

Tubitos Durham

40

Tubos 16 x 150 mm c/tapón de rosca

80

Algodón, gasa, papel Manila o estraza, cinta adhesiva, cinta testigo.

55

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5. METODOLOGIA Preparación del material 1. Esterilizar solución de trabajo en 5 tubos de 18 X 150 conteniendo cada uno 9 ml, para disolver la muestra en diluciones decimales conocidas. 2. Esterilizar 15 tubos (16 X 150 c tubo de Durham) con caldo lactosado. (Prueba presuntiva) 3. Esterilizar 10 tubos (16 X 150 c tubo de Durham) con caldo verde bilis verde brillante. (Prueba confirmativa). 4. Esterilizar 10 tubos (16 X 150 c tubo de Durham) con caldo base para fermentación 5. Esterilizar solución de azucares (glucosa y lactosa) utilizando el filtro millipore. 6. Añadir 1 ml de solución estéril de los azucares en tubos con caldo base por separado, al momento de aplicar la prueba. 7. Esterilizar los medios agar MAcConkey y XLD y transferir a 5 cajas petri por cada medio. (seguir indicaciones de etiqueta). 8. Esterilizar 5 tubos (16 x 150) con cada uno de los siguientes medios: agar manitol (con nitrato de potasio) y SIM. Solidificar el agar en forma vertical. (agar semisólido). 9. Esterilizar 5 tubos (16 x 150) con cada uno de los siguientes medios: agar hierro de Kliger, citrato de Simmons, TSI. Solidificar los medios inclinándolos hasta que el medio este entre 2 y 3 cm de la boca del tubo. Aislar 1. Tomar 1 gramo (o 1ml de muestra) previamente homogenizada y cuarteada y transferirla al primer tubo de la serie de diluciones decimales, esperar que sedimente y transferir 1 ml a la siguiente dilución hasta terminar la serie. 2. Inocular por triplicado, transfiriendo 1 ml de la muestra de cada una de las dilución a tubos con caldo lactosado, incubar a 37°C por 48 horas observando cada 24. (prueba presuntiva) 3. Inocular cada 1 ml del caldo incubado que resulto positivo (producción de gas en el tubito de Durham) en tubo con medio de caldo verde bilis brillante, incubar a 37°C por 48 horas observando cada 24. (prueba confirmativa, reportar).

56

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4. Inocular por duplicado, transfiriendo 1ml de la muestra de las primeras 3 diluciones por separado en cajas petri con agar MacConkey. Sembrar por estría e incubar a 37°C por 48 horas observando cada 24. (reportar morfología colonial). Purificar 1. Inocular el agar XLD con los tubos positivos de la prueba confirmativa. Sembrar por estría. Incubar a 37°C por 48 horas observando cada 24. (reportar morfología colonial). 2. Inocular el agar XLD con las colonias con características de enterobacterias de las cajas incubadas de agar MacConkey. Sembrar por estría. Incubar a 37°C por 48 horas observando cada 24. (reportar morfología colonial). Identificar 1. Inocular al menos tres colonias con características típicas de enterobacterias en cada uno de los siguientes medios: KIA, Citarto de Simmons, TSI, sembrando por picadura al fondo y estría sobre el agar inclinado; SIM y Manitol, sembrando por picadura recta en medio del agar semisólido. Usar el asa de platino recta. 2. Incubar a 37°C por 48 horas observando cada 24. (reportar).

6. SUGERENCIAS DIDACTICAS 1. Fomentar la investigación a través de observar la relación de los medios de cultivo diferenciales y selectivos con rutas metabólicas como expresión del genoma de las especies. 2. Generar una discusión en grupo de los resultados obtenidos con los distintos medios de cultivo y muestras utilizados.

57

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7. REPORTE DEL ALUMNO Prueba

Cepa 1

Cepa 2

Cepa 3

MAC HEK Colonias EMB

Coloración de Gram

Morfología Catalasa Oxidasa TSI

SIM

Lactosa Glucosa SH2 Movilidad Indol SH2 RM VP Citrato

LIA

Lisina SH2 Identificación

8. BIBLIOGRAFIA 1. Bradshaw J., 1979. “Microbiología de laboratorio”. Editorial El manual Moderno, 2. Cowan S. y Steel K. 1985. “Manual para la Identificación de bacterias de importancia médica”. Editorial C.E.C.S.A. 3. Koneman E., Allen S., Dowell V., Sommers H., 1989. “Diagnostico microbiológico. Editorial Médica Panamericana S.A. 4. Martínez A., 1983. “Manual de prácticas de laboratorio”. Edito CREGIT, IT Veracruz.

58

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Práctica 9. Aislamiento, cultivo y observación colonial y microscópica de hongos filamentosos y levaduriformes.

1. OBJETIVO Aplicará las técnicas de aislamiento y purificación de hongos y levaduras para la observación de la morfología colonial y tinciones para la observación de su morfología microscópica.

2. INTRODUCCION Los hongos son seres microscópicos o macroscópicos que viven sobre diversos materiales orgánicos, a los cuales descomponen para así alimentarse; gracias a ésta característica son la clave para la reincorporación de los materiales orgánicos en el suelo, favoreciendo no solo su formación sino también su enriquecimiento. Actualmente existen alrededor de 80,000 especies identificadas de hongos, con diversos hábitats; algunos son acuáticos, viviendo fundamentalmente en agua dulce, pero se sabe también de algunos hongos marinos; la gran mayoría son de hábitat terrestre y habitan en los suelos o en la sustancia muerta de las plantas, jugando un papel preponderante en la mineralización del carbono orgánico. Gran cantidad de hongos son parásitos de plantas terrestres, con esta particularidad

los hongos

producen las principales enfermedades económicamente significativas de los cultivos agrícolas.(1) Se identifican dos formas generales de crecimiento de hongos: los mohos y las levaduras.

La estructura vegetativa de los primeros recibe el nombre de talo,

compuesto por filamentos usualmente ramificados. A su vez cada uno de los filamentos es denominado como hifa y a un conjunto de ellas se les conoce como micelio. Las levaduras por su parte se diferencian de los mohos en su crecimiento, pues éstas a pesar de ser unicelulares en su mayoría, crecen por un proceso de gemación en que las células hijas se separan de las madres tan pronto han 59

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madurado y tienen un ciclo sexual en donde la fertilización tiene lugar por medio de fusión de dos células vegetativas de núcleos haploides que al fusionarse forman el núcleo diploide que se moverá al brote. Así pues la síntesis del DNA y la división nuclear de las levaduras se correlacionan íntimamente con el proceso de gemación, a comparación de los mohos que experimentan un crecimiento filamentoso por una extensión continua de las puntas de las hifas. Los hongos se clasifican en cuatro grupos diferentes: Phycomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes (también denominados hongos imperfectos). Ésta clasificación se basa en diversas características, pero la más importante es el tipo de espora reproductiva que se forma, tanto asexual como sexual. Como organismos sin clorofila, los hongos, a diferencia de las plantas verdes no poseen la capacidad de fotosíntesis, sino que necesitan el suministro de carbono fijado orgánicamente. La intensidad de crecimiento del hongo depende, entre otras cosas, de la concentración de materias nutritivas y ya que el anhídrido carbónico como fuente única de carbono no le es suficiente para vivir, la fuente de carbono actúa en forma limitadora. Las temperaturas especialmente altas (60º C) y frío extremo no excluyen la presencia de hongos, predominan en medios ricos en hidrógeno y a gran diversidad de pH (3,5 – 8,5). Dicho esto, se puede entender como la única condición para el crecimiento de los hongos en la naturaleza es, pues, la presencia previa o simultánea de otros organismos. Por ello, los hongos pueden ser hallados prácticamente en todas partes, incluso en lugares que a simple vista no presentan ni rastro de materiales nutritivos.

3. CORRELACION

CON

EL

PROGRAMA

DE

MICROBIOLOGIA

(ING.

BIOQUIMICA BQO-0525) Tema. Microorganismos eucariotas. Subtema. Hongos pluricelulares y unicelulares.

60

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El aislamiento, conservación y purificación de los microorganismos (hongos y levaduras) es una etapa crucial para su posterior clasificación, manejo, estudio y uso, permitiendo el desarrollo de la microbiología industrial.

4. MATERIAL Y EQUIPO Descripción del material

Cantidad

Equipo

Agar PDA (g/l)

39

Autoclave

Cajas Petri

30

Estufa incubadora

Tubos de 18 x 150 mm con tapón de rosca

5

Campana de flujo laminar vertical

Probeta de 250 ml

1

Horno

Matraz Erlenmeyer de 250 ml

2

Mechero bunsen

Matraz Erlenmeyer de 500 ml

2

Mechero Fisher

Gradilla

1

Microscopio

Asa de siembra

1

Vortex

Asa para picadura

1

Varilla de vidrio “V”

5

Pipetas de 1 ml

2

Pipetas de 2 ml

2

Pipetas de 10 ml

1

Porta objeto

20

Cubre objeto

20

Microespátula o Espátula

1

Algodón, gasa, papel Manila o estraza, cinta adhesiva, cinta testigo.

61

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5. METODOLOGIA Preparación del material 1. Solución de ácido Tartárico (10%).- Pesar 10 g y disolver en 100 ml de agua destilada, esterilizar durante 15 minutos a 121°C y 1 atm de presión, conservar en refrigeración hasta su uso. 2. Preparar medio PDA para hongos.- Pesar y diluir (39 g/l), esterilizar durante 15 minutos a 121°C y 1 atm de presión, esperar hasta alcanzar 45°C y agregar 1 ml de la solución estéril de ácido Tartárico por cada 100 ml, homogeneizar y vaciar en las cajas petri, esperar hasta su solidificación y conservar en refrigeración hasta su uso (el pH obtenido se aproxima a 4.0). a. Para la preparación de un microcultivo tomar una caja petri con medio de cultivo fresco y fraccionarlo en cortes de 1 centímetro cuadrado. b. Esterilizar una caja petri con un papel filtro. c. Esterilizar varillas de vidrio en forma de una “V” con tamaño adecuado para estar dentro de la caja petri. d. Esterilizar porta objeto y cubre objeto. e. Preparar una solución estéril de glicerol al 10 % en agua. 3. Preparar medio PDA para levaduras.- Pesar y diluir (39 g/l), esterilizar durante 15 minutos a 121°C y 1 atm de presión, vaciar en las cajas petri, esperar hasta su solidificación y conservar en refrigeración hasta su uso. 4. Esterilizar solución de trabajo en 3 tubos de 18 X 150 conteniendo cada uno 9 ml, para disolver la muestra en diluciones decimales conocidas. 5. Los medios conservados en refrigeración se utilizaran, sacándolos previamente hasta que estos alcancen la temperatura ambiente de trabajo. 6. Tomar 50 gramos de fruta madura con alto contenido de azucares, macerarla y dejarla reposar al menos 24 horas, acondicionando el lugar de reposo en forma aséptica, usarla como fuente de levaduras. Aislamiento 7. Aislamiento de hongos: a. abrir 2 cajas petri exponiéndolos al medios ambiente por 1 hora, con medio de cultivo PDA + ácido Tartárico, cerrar e incubarlos a 62

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temperatura ambiente, dejarlos hasta que estos desarrollen los microorganismos (72 a 96 horas). b. Tomar 1 gramo (o 1ml de muestra) previamente homogenizada y cuarteada y transferirla al primer tubo de la serie de diluciones decimales, esperar que sedimente y transferir 1 ml a la siguiente dilución hasta terminar la serie. Inocular transfiriendo 1 ml de la muestra de cada una de las dilución a una caja petri con medio de cultivo PDA + ácido Tartárico, incubar a temperatura ambiente hasta que estos desarrollen los microorganismos (72 a 96 horas). 8. Aislamiento de levaduras: Tomar 1 gramo de muestra (muestra de fruta macerada) previamente homogenizada y cuarteada y transferirla al primer tubo de la serie de diluciones decimales, esperar que sedimente y transferir 1 ml a la siguiente dilución hasta terminar la serie. 9. Inocular transfiriendo 1 ml de la muestra de cada una de las dilución a una caja petri con medio de cultivo PDA, incubar a temperatura ambiente hasta que estos desarrollen los microorganismos (48 a 72 horas). Purificación 10. Obtención de cultivo puro de hongos: De las cajas previamente inoculadas e incubadas, seleccionar al menos 2 colonias diferentes y transferirlas resembrándolas con el asa de picadura, rasgando el micelio y picando el medio de cultivo fresco en sus cuatro puntos separados y centro de la caja, incubar a temperatura ambiente hasta que estos desarrollen los microorganismos (48 a 72 horas). a. Obtención de microcultivo: Tomar la caja petri estéril adicionado con el papel filtro y colocar en su superficie la “V”, sobre esta el porta objeto y colocar en el porta el agar cortado de 1 cm2, resembrar el cultivo puro rasgando la superficie de la colonia y sembrar por picadura en los costados y al centro del agar, poner en la superficie del agar el cubre objeto estéril, verter la solución de glicerol estéril para crear un microambiente húmedo y cubrir con la tapa la caja petri, incubar en estufa de incubación a 35°C. 11. Obtención de cultivo puro de levaduras: De las cajas previamente inoculadas e incubadas, seleccionar al menos 2 colonias diferentes y transferirlas resembrándolas con el asa de siembra, tocando la superficie de la colonia y aplicar la técnica de estría cruzada en el medio de cultivo fresco, incubar a 63

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2009

temperatura ambiente hasta que se desarrollen los microorganismos (24 a 48 horas). Morfología colonial 12. Hongos: Observar los cultivos puros obtenidos al frente y reverso de la caja de crecimiento, calificar color, textura, superficie, edad del cultivo, producción de pigmentos. 13. Levaduras: Evaluar las siguientes características, edad del cultivo, diámetro de la colonia, color, textura, consistencia, luz transmitida, borde, superficie, elevación, estructura. Morfología microscópica 12. Hongos: Observar en el microcultivo el desarrollo de las estructuras del hongo, al inicio cada 12 horas desde la caja petri con un estereoscopio y cuando el micelio presente las estructuras de reproducción, tomar el porta y cubre para teñirlos y observar al microscopio. a. Observar e informar: Tipo de micelio vegetativo, aéreo y estructuras de reproducción. 13. Levaduras: Evaluar las siguientes características tiñendo y observando al microscopio, forma y tamaño de la célula vegetativa, tipo de reproducción, tipo de esporas. *Teñir con azul de algodón o azul de metileno.

6. SUGERENCIAS DIDACTICAS 1. Fomentar la investigación a través de observar las preparaciones y el tipo de microorganismo aislado en el cultivo puro. 2. Generar una discusión en grupo de los resultados obtenidos con las distintas cepas puras y su morfología colonial y microscópica.

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2009

7. REPORTE DEL ALUMNO 1. Describir en una tabla y figura la morfología colonia y microscópica de cada cepa pura observada. Morfología colonial hongos Edad (hs)

Forma (Frente)

Superficie

Color

Textura

Pigmento

Circular

Lisa

Azul 3215*

Algodonosa

Excreción ( ) Color*

etc

etc

etc

etc

etc

Forma (Reverso)

Superficie

Color

Textura

Pigmento

No aplica

Llisa

Azul 3215*

No aplica

Excreción ( ) Color*

etc

etc

etc

etc

etc

*Compare con catalogo de colores

Morfología microscópica hongos

Edad* (hrs)

Tinción

Tipo de micelio

Estructura reproductora

Forma de espora

Azul de metileno

Cenocítico ( ) Septado ( )

Tipo

Tipo

etc

etc

etc

etc

*Hora de observación del microcultivo.

Morfología colonial levaduras Forma de Crecimiento Forma

Elevación

Borde

Estría en agar

Picadura en gelatina

Crecimiento en caldo

Forma

Línea

Licuefacción

Medio

Superficie

Puntiforme

Plana

Entero

Filiforme

Filiforme

Crateriforme

Floculenta

Peliculada

Circular

Elevada

Ondulado

etc

etc

Etc

etc

etc

Filamentosa

Convexa

etc

Amiboide

etc

etc

Morfología microscópica levaduras 65

Instituto Tecnológico de Mérida Edad (hrs)

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Tinción

Forma unicelular

Modo de agrupación

Gram ( )

Bacilo

Células sueltas

Acidorresistente

Coco

Diplos

etc

etc

etc

2009

8. BIBLIOGRAFIA

1. Bradshaw J., 1979. “Microbiología de laboratorio”. Editorial El manual Moderno, S.A. 2. Carpenter P., 1969, Microbiología”. Editorial Interamericana. 3. Frazier W., 1976. “Microbiolgía de los alimentos”. Editorial Acribia. 4. Pelczar M., 1984,”Microbiología”. Editorial McGraw Hill. 5. Quintero R., 1981. “Ingeniería bioquímica. Teoría y aplicaciones. Editorial Alhambra Mexicana, S:A. 6. Stanier R., Doudoroff M. y Adelberg E. 1981.”Microbiología”. Editorial Aguilar. 7. Zapata M., 1988. “Manual de prácticas de microbiología avanzada”. Tesis, Editorial Instituto Tecnológico de Mérida. 8. Martínez A., 1983. “Manual de prácticas de microbiología general”. Editorial CREGIT, Instituto Tecnológico de Veracruz. 9. Cardenas A., 1989. “Identificación de hongos filamentosos y determinación de su capacidad biodegradativa del bagazo del henequén”. Tesis, Editorial Universidad Autónoma de Yucatán.

66

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2009

Práctica 10. Producción de ácidos orgánicos por hongos.

1. OBJETIVO Aplicará técnicas de cultivo sumergido para la producción de ácidos orgánicos y evaluará su rendimiento.

2. INTRODUCCION El ácido cítrico (ácido 2 hidroxipropano-1,2,3 tricarboxílico) es un producto metabólico primario y se forma en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos. La glucosa es la principal fuente de carbono utilizada para la producción de este ácido. En muchos microorganismos el 80% de la glucosa utilizada para esta biosíntesis se metaboliza por reacciones de la vía de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) y 20 % por reacciones del ciclo de la pentosa fosfato. El descubrimiento del ácido cítrico se atribuye al alquimista islámico Jabir Ibn Hayyan en el siglo octavo d.C. El ácido cítrico fue el primer ácido aislado en 1784 por el químico sueco Carl Wilhelm Scheele, que lo cristalizó a partir del jugo del limón. La producción de ácido cítrico a nivel industrial comenzó en 1860, basado en la industria italiana de los cítricos, en 1880 la compañía Pfizer fundada por los hermanos alemanes Charles Pfizer, Charles Erhart, comenzaron a fabricar ácido cítrico, utilizado por varias industrias, volviéndose su producto más importante. En 1893, C. Wehmer descubrió que cultivos de Penicillium podían producir ácido cítrico a partir de la sacarosa molecular. Sin embargo, la producción microbiana del ácido cítrico no llegó a ser industrialmente importante hasta la Primera Guerra Mundial que interrumpió las exportaciones italianas de limones. En 1917, el químico americano James Currie descubrió que ciertos cultivos de Aspergillus niger podían ser productores eficientes de ácido cítrico, desde 1920 en adelante fueron desarrollados con éxito procesos de fermentación, en donde se utiliza generalmente 67

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2009

cepas del hongo Aspergillus níger, aunque también han sido empleadas ciertas cepas de levaduras. En 1923, los hermanos Pfizer logran obtener ácido cítrico a partir de Aspergillus níger y la fermentación del azúcar, utilizó como sustrato la melazas de remolacha y se diversificó en sustratos como sacarosa, melazas de caña o jarabe de glucosa. En 1950, la producción de ácido cítrico alcanzaba las 50.000 toneladas/año. Posteriormente, se registró una importante expansión debido al desarrollo del proceso de fermentación sumergida, mucho más económico. El ácido cítrico puede ser producido tanto en procesos de superficie como sumergidos. Varios factores afectan la elección del tipo de proceso: la existencia de capital de inversión, la abundancia de energía, el costo, el entrenamiento de la mano de obra, la existencia de técnicas para la medida y la regulación. El ácido cítrico actualmente es obtenido principalmente en la industria gracias a la fermentación sumergida de azúcares como la sacarosa o la glucosa, utilizando cepas modificadas para industria del género Aspergillus. El proceso de obtención tiene varias fases como la preparación del sustrato de melaza, la fermentación aeróbica de la sacarosa por el hongo, la separación del ácido cítrico del sustrato por precipitación al añadir hidróxido de calcio o cal apagada para formar citrato de calcio. Después se añade ácido sulfúrico para descomponer el citrato de calcio. La eliminación de impurezas se realiza con carbón activado o resinas de intercambio iónico, se continúa con la cristalización del ácido cítrico, el secado o deshidratación y el empaquetado del producto.

3. CORRELACION

CON

EL

PROGRAMA

DE

MICROBIOLOGIA

(ING.

BIOQUIMICA BQO-0525) Tema. Crecimiento y propagación de microorganismos. Subtema. Cultivo sumergido. Tema. Actividades metabólicas de hongos y levaduras. Subtema. Producción de matabolitos. 68

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2009

El proceso para la obtención del ácido cítrico nos permite utilizar las técnicas del cultivo sumergido para la producción de un metabolito de interés, y relacionar el laboratorio con el amplio mundo de las industrias pues cuenta con aspectos genéricos utilizados en la elaboración de muchos otros productos.

4. MATERIAL Y EQUIPO Descripción del material

Cantidad

Equipo

PDA (g/l)

39

Autoclave

Tubos de 18 x 150 mm con tapón de rosca

5

Campana de flujo laminar vertical

Probeta de 250 ml

1

Horno

Matraz Erlenmeyer de 250 ml

15

Mechero bunsen

Matraz Erlenmeyer de 1000 ml

1

Vortex

Gradilla

1

Espectrofotómetro

Asa para picadura

1

Incubadora agitadora

Bureta

1

Pipetas de 1 ml

5

Pipetas de 10 ml

2

Microespátula o Espátula

1

Medio de producción

Algodón, gasa, papel Manila o estraza, cinta adhesiva, cinta testigo, cepa pura.

69

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2009

5. METODOLOGIA Preparación 1. Medio de cultivo básico para producción. Componentes principales

(g/l)

Trazas

Sacarosa

140

CuSO4.5 H2O

0.24

2.5

ZnSO4.7 H2O

1.50

KH2PO4

0.15

FeSO4.7 H2O

0.1

NaCl

0.15

(NH4)2SO4

MgSO4.7H2O

(mg/l)

1.1

Procedimiento 1. Esporulación: Tomar una azada de una colonia de Aspergillus niger e inocular en agar inclinado de PDA, se incuba (hasta su esporulación) durante 7 días a 30°C. a. Cosecha de esporas: Las esporas se resuspenden en 5 ml de solución de estéril de Tween-80 de solución salina (0.85%), rasgando suavemente el cultivo esporulado. b. Las células resuspendidas se homogenizan durante 1 minuto con el vortex. 2. Inoculación: Se inoculan 11 matraces Erlenmeyer de 250 ml conteniendo 50 ml de medio de cultivo con 0.5 ml de la suspensión de esporas. 3. Cultivo: Los cultivos se incuban durante 10 días a 30°C en un agitador a 200 rpm para favorecer una buena oxigenación del medio, se tomará un matraz cada día para determinar los parámetros de producción de ácido cítrico y biomasa a través del tiempo de fermentación. 4. Cosecha: Los cultivos se filtran sobre un papel de filtro pesado colocado en un embudo Buchner conectado a una trampa de agua. Se guarda el filtrado sobre el que se realizará la determinación de ácido cítrico y el micelio se lava con 50 ml de agua para eliminar los hidratos de carbono remanentes que caramelizarían y afectarían la determinación de peso seco. Se determinará peso seco (biomasa), consumo de azúcar y producción de ácido cítrico.

70

“Manual de Prácticas de Microbiologia”

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2009

6. SUGERENCIAS DIDACTICAS 1. Fomentar la investigación a través de observar el proceso para la obtención del ácido cítrico. 2. Relacionar sus resultados con la discusión con la industria biotecnológica.

7. REPORTE DEL ALUMNO 1. Reporte de los datos de fermentación. Tiempo

Sustrato

Concentración celular*

Acido Cítrico

(hs)

(g/l)

(g/l)

(g/l)

0

140

24 etc *Biomasa

2. Grafique los resultados en una sola tabla. 3. Determine el rendimiento de la producción de ácido cítrico. Yp/s (g cítrico producido / g azúcar consumida) 4. Compare sus resultados con los resultados de sus compañeros y presente un resumen. 5. Escriba sus conclusiones.

8. BIBLIOGRAFIA

1. Bradshaw J., 1979. “Microbiología de laboratorio”. Editorial El manual Moderno, S.A. 2. Quintero R., 1981. “Ingeniería bioquímica. Teoría y aplicaciones”. Editorial Alhambra Mexicana, S:A. 71

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2009

Práctica 11. Pruebas de identificación para levaduras.

1. OBJETIVO Aplicará las técnicas de observación microscópica y pruebas bioquímicas para la identificación de levaduras.

2. INTRODUCCION Se denomina levadura a cualquiera de los diversos hongos microscópicos unicelulares que son importantes por su capacidad para realizar la fermentación de hidratos de carbono, produciendo distintas sustancias. Aunque en algunos textos de botánica se considera que las levaduras "verdaderas" pertenecen sólo a la clase Ascomycota, desde una perspectiva microbiológica se ha denominado levadura a todos los hongos con predominio de una fase unicelular en su ciclo de vida, incluyendo a los hongos basidiomicetes. A veces suelen estar unidos entre sí formando cadenas o pseudomicelio, no existe conexión entre las células. Producen enzimas capaces de descomponer diversos sustratos, principalmente los azúcares. Una de las levaduras más conocidas es la especie Saccharomyces cerevisiae. Esta levadura tiene la facultad de crecer en forma aeróbica y anaerobia realizando fermentación alcohólica. Por esta razón se emplea en muchos procesos de fermentación industrial, de forma similar a la levadura química, por ejemplo en la producción de cerveza, vino, hidromiel, pan, producción de antibióticos, etc. Las levaduras se reproducen asexualmente por gemación o brotación y sexualmente mediante ascosporas o basidioesporas. Durante la reproducción asexual, una nueva yema surge de la levadura madre cuando se dan las condiciones adecuadas, tras lo cual la yema se separa de la madre al alcanzar un tamaño adulto, dejando una 72

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“Manual de Prácticas de Microbiologia”

2009

cicatriz en la madre. En condiciones de escasez de nutrientes las levaduras que son capaces de reproducirse sexualmente formarán ascosporas. Las levaduras que no son capaces de recorrer el ciclo sexual completo se clasifican como imperfectas, dentro de estas se encuentra el género Candida. La forma tradicional de identificar las levaduras son las de la observación de la morfología colonial, morfología microscópica, su formación de multiplicación vegetativa, formación de micelio, su reproducción sexual y por último las pruebas bioquímicas de su asimilación de compuestos carbonados y nitrogenados, fermentación de compuestos carbonados en condiciones de 25°C y su crecimiento a 4°C y 37°C, etc.

3. CORRELACION

CON

EL

PROGRAMA

DE

MICROBIOLOGIA

(ING.

BIOQUIMICA BQO-0525) Tema. Microorganismos eucariotas. Subtema. Clasificación de hongos y levaduras. Las células tienen codificado en su genoma las capacidades metabólicas con las que está armado, las pruebas bioquímicas nos permite observar su información a través de su expresión fenotípica de asimilación y fermentación con las diferentes fuentes de nutrientes que se adicionan a un medio base.

4. MATERIAL Y EQUIPO Para cada tratamiento térmico. Descripción del material

Cantidad

Equipo

Agar PDA (g/l)

39

Autoclave

YPG (g/l)

20

Baño metabólico

Agar YPG (g/l)

35

Estufa de incubación

73

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Agar extracto maltosa (g/l)

50

Microscopio

Glucosa

20

Filtro Millipore

Maltosa

20

Sacarosa

20

D-Galactosa

20

Lactosa

20

Rafinosa

20

L-Sorbosa

20

L-Ramnosa

20

Glicerol

20

D-Manitol

20

KNO3

10

(NH4)2SO4

10

KH2PO4

1

MgSO4 – 7H2O

0.5

Acetato de Sodio (g/l)

5

Tubos Durham

20

Tubos con tapón de rosca 18x150

30

Jugo V-8 (ml/l)

350

Extracto de levadura

2009

3

Algodón, gasa, papel Manila o estraza, cinta adhesiva, cinta testigo, cepa pura.

5. METODOLOGIA Preparación

74

“Manual de Prácticas de Microbiologia”

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2009

1. Preparar medio base para pruebas de asimilación de fuentes de C, esterilizar y conservar en refrigeración hasta su uso. Medio base Asimilación

Cantidad

Medio base Asimilación

y N,

Cantidad

Fuente de C* (g/l)

20

Fuente de N* (g/l)

10

(NH4)2SO4 (g/l)

10

(NH4)2SO4 (g/l)

10

KH2PO4 (g/l)

1

KH2PO4 (g/l)

1

MgSO4 – 7H2O (g/l)

.5

MgSO4 – 7H2O (g/l)

.5

Glucosa (g/l)

20

*Se esteriliza aparte con filtro Millipore y se adiciona a los medios base estériles al momento de su uso.

2. Preparar medio base para pruebas de fermentación de fuentes de C, esterilizar y conservar en refrigeración hasta su uso. Medio base Fermentación

Cantidad

Fuente de C* (g/l)

20

Extracto de levadura (g/l)

3

*Se esteriliza aparte con filtro Millipore y se adiciona a los medios base estériles al momento de su uso.

3. Preparar medio Agar extracto de malta en tubos de 12 x 150, esterilizar y solidificar en forma inclinada, conservar en refrigeración hasta su uso. 4. Preparar medio Agar de acetato (Fowell) en tubos de 12 x 150, esterilizar y solidificar en forma inclinada, conservar en refrigeración hasta su uso. 5. Preparar medio Agar V-8 en tubos de 12 x 150, esterilizar y solidificar en forma inclinada, conservar en refrigeración hasta su uso. 6. Preparar medio Agar de PDA en placas y en tubos de 12 x 150, esterilizar y solidificar en forma inclinada los tubos, conservar en refrigeración hasta su uso. 7. Preparar medio Agar de YPG en placas y en tubos de 12 x 150, esterilizar y solidificar en forma inclinada los tubos, conservar en refrigeración hasta su uso. 8. Preparar caldo YPG en tubos de 12 x 150, esterilizar y conservar en refrigeración hasta su uso Procedimiento

75

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1. Resembrar la cepa pura en medio de cultivo PDA y YPG por estría cruzada, incubar a 35°C, por 48 horas. 2. Cada cepa pura de levadura se observara y anotaran las características de la morfología colonial y microscópica. 3. Inocular cada cepa pura en los medios de agar inclinado, incubar a 25°C en oscuridad hasta 7 días, para inducir la reproducción sexual, observar características microscópicas de esporulación y anotar. 4. Probar la asimilación de las fuentes de C, inoculando la cepa pura (Glucosa, Maltosa, etc). 5. Probar la asimilación de las fuentes de N, inoculando la cepa pura (Nitrato de Potasio, Sulfato de Amonio). 6. Probar la fermentación de las fuentes de C, inoculando la cepa pura (Glucosa, Maltosa, etc). 7. Evaluar los resultados y determinar género por comparación bibliográfica.

6. SUGERENCIAS DIDACTICAS 1. Fomentar la investigación a través de observar y discutir los resultados.

7. REPORTE DEL ALUMNO 1. Compare sus resultados con los resultados de sus compañeros y presente un resumen. 2. Escriba sus conclusiones.

8. BIBLIOGRAFIA 1. Bradshaw J., 1979. “Microbiología de laboratorio”. Editorial El manual Moderno, S.A. 76

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2009

2. Frazier W., 1976. “Microbiolgía de los alimentos”. Editorial Acribia. 3. Meller S., Kutzman C., Lodder J., Van Rij K. y Fell J. 1984. “Manual de Taxonomia y Biotecnología de las Levaduras. Editorial CINVESTAV-IPN, México, D.F.

77

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2009

Práctica 12. Recuento en placa.

1. OBJETIVO Aplicará las técnicas de diluciones decimales y técnicas de cultivo para el recuento en placa.

2. INTRODUCCION La forma de cuantificar células viables más utilizada en Microbiología, es la de hacer diluciones y cuenta en placa con medios de cultivo específicos para la población de interés. Esta técnica se basa en la suposición de que cada bacteria incluida en un medio de agar o en su superficie se multiplicará y producirá una colonia visible, en consecuencia el número de colonias que se observarán a simple vista será igual al número de bacterias viables o unidades formadoras de colonias (UFC) inoculadas en el agar multiplicadas por la dilución. Esta técnica aplicada en muestras complejas, dará una estimación aproximada del número total de microorganismos, dependiendo del medio de cultivo utilizado, ya que no hay un medio y condiciones de incubación que favorezcan el crecimiento de todos los microorganismos. También pueden presentarse problemas relacionados con la falta de homogeneidad de las diluciones y en la inoculación de las muestras, por lo que se pueden obtener bajos valores si es que las células no se separan bien y valores elevados si la toma de las muestras se hacen del fondo del tubo donde se han concentrado por sedimentación los microorganismos.

3. CORRELACION

CON

EL

PROGRAMA

DE

MICROBIOLOGIA

(ING.

BIOQUIMICA BQO-0525) Tema. Microorganismos procariotas y/o eucariotas. Subtema. Crecimiento y reproducción. 78

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Los microorganismos cuando se encuentran en condiciones favorables para su desarrollo poblacional, lo expresan utilizando los nutrientes donde se encuentran, una de las formas de cuantificar el aumento de su población es el conteo en placa, que cuyo criterio es una célula viable una colonia.

4. MATERIAL Y EQUIPO Descripción del material

Cantidad

Equipo

Agar nutritivo (g/l)

23

Autoclave

Matraz Erlenmeyer 250 cc

1

Estufa de incubación

Matraz Erlenmeyer 500 cc

1

Horno

Pipetas de 1 cc

7

Cuenta colonias

Pipeta de 10 cc

1

Gradilla

1

Cajas Petri

15

Tubos de tapón de rosca de 18x150

5

Asa de varilla acodada

1

Algodón, gasa, papel Manila o estraza, cinta adhesiva, cinta testigo, cepa pura.

5. METODOLOGIA Preparaciones 1. Prepare 5 tubos con 9 ml de solución salina (0.85%) para hacer las diluciones decimales y cierre suavemente el tubo con el tapón de rosca, consérvela en refrigeración hasta su uso.. 2. Prepare 350 ml con medio Agar nutritivo, esterilice y vierta en 12 placas de caja Petri, espere hasta que solidifique el medio y consérvela hasta su uso en refrigeración.

79

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3. Utilice como fuente de microorganismos un agua fresca preparada en casa el día anterior. Procedimiento 1. Agite el agua fresca, espere que sedimente y que este a temperatura ambiente al igual que la solución salina y los medios de cultivo. 2. Transfiera 1 ml del agua fresca al primer tubo con 9 ml de solución salina y homogenice el tubo (dilución de 10 -1), tome 1 ml de esta dilución y transfiera 1 ml hasta completar la serie de diluciones (100, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5). 3. Siembre un duplicado del medio de cultivo en las cajas Petri con varilla acodada, transfiriendo 0.5 ml de cada una de las series, espere hasta que el agar absorba la solución de microorganismos, incube a 35°C y haga lecturas a las 24 y 48 horas. 4. Cuente el número de colonias en las cajas sembradas y saque un promedio con su duplicado, reporte solo los conteos de las cajas que el número de colonias es de 30 a 300 por caja, si el número es mayor en la dilución 10 -5, reporte mayor que 600,000 UFC /ml.

6. SUGERENCIAS DIDACTICAS 1. Fomentar la investigación y discusión a través de observar la concentración celular en los alimentos.

7. REPORTE DEL ALUMNO 1. Calcule la concentración celular del alimento y reperte la concentración con 2 dígitos y con exponenciación decimal. Tiempo (hs)

Dilución 100

10-1

24

67

etc

48

423

etc

10-2

10-3

Concentración celular 10-4

10-5

(UFC*/ml)

*Unidades formadoras de colonias

80

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2009

2. Compare sus resultados con los resultados de sus compañeros y presente un resumen. 3. Escriba sus conclusiones.

8. BIBLIOGRAFIA

1. Bradshaw J., 1979. “Microbiología de laboratorio”. Editorial El manual Moderno, S.A. 2. Quintero R., 1981. “Ingeniería bioquímica. Teoría y aplicaciones. Editorial Alhambra Mexicana, S:A.

81

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2009

Práctica 13. Técnica del número más probable (NMP).

1. OBJETIVO Aplicará la técnica del número más probable (NMP), y evaluará con sus resultados aplicando las tablas aceptadas por la NOM.

2. INTRODUCCION NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-112-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. DETERMINACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES. TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE. Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos.Secretaría de Salud. JOSE MELJEM MOCTEZUMA, Director General de Control Sanitario de Bienes y Servicios, por acuerdo del Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, con fundamento en los artículos 39 de la Ley Orgánica de la Administración Pública Federal; 38 fracción II, 47 de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización; 194 fracción I de la Ley General de Salud; 2o. fracción III, 34, 37, 40 y demás aplicables del Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Control Sanitario de Actividades, Establecimientos, Productos y Servicios; 8o. fracción IV y 13 fracción I del Reglamento Interior de la Secretaría de Salud. PREFACIO En la elaboración de la presente norma participaron los siguientes Organismos e Instituciones: SECRETARIA DE SALUD Dirección General de Control Sanitario de Bienes y Servicios Laboratorio Nacional de Salud Pública SECRETARIA DE AGRICULTURA, GANADERIA Y DESARROLLO RURAL Comisión Nacional del Agua SECRETARIA DE MEDIO AMBIENTE, RECURSOS NATURALES Y PESCA Instituto Nacional de la Pesca INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL 82

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2009

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas INDUSTRIAS VINICOLAS PEDRO DOMECQ, S.A. DE C.V. JUGOS DEL VALLE, S.A. DE C.V. LABORATORIO FERMI, S.A. LABORATORIO ICCABI, S.A. DE C.V. LECHE INDUSTRIALIZADA CONASUPO, S.A. DE C.V. LICONSA SIGMA ALIMENTOS, S.A. DE C.V. SOCIEDAD MEXICANA DE NORMALIZACION Y CERTIFICACION, S.C. NORMEX INDICE 0. INTRODUCCION 1. OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACION 2. FUNDAMENTO 3. REFERENCIAS 4. DEFINICIONES 5. SIMBOLOS Y ABREVIATURAS 6. REACTIVOS Y MATERIALES 7. APARATOS E INSTRUMENTOS 8. PREPARACION DE LA MUESTRA 9. PROCEDIMIENTO 10. EXPRESION DE LOS RESULTADOS 11. INFORME DE LA PRUEBA 12. CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES 13. BIBLIOGRAFIA 14. OBSERVANCIA DE LA NORMA 15. VIGENCIA 0. Introducción Las bacterias coliformes son un grupo heterogéneo compuesto por varios. Existe poca evidencia que indique que estas bacterias coliformes pertenezcan a un solo género taxonómico. La falta de certeza en cuanto a su filiación taxonómica y la imprecisa correlación entre los métodos recomendados para la detección de coliformes han presentado problemas. El primero, es que Escherichia coli es aceptada como bacteria coliforme, la especie contiene variantes que no producen gas de la lactosa o lo hacen después de 48 horas, por lo que no se les identifica por medio de esta técnica. Segundo, la capacidad de fermentar la lactosa está frecuentemente asociada a genes localizados en plásmidos. Estos determinantes extracromosomales son fácilmente transferidos 83

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entre otras bacterias Gram negativas no relacionadas a las coliformes, que pueden, en consecuencia, ser recuperadas en la etapa inicial del análisis. No obstante en la práctica, la técnica ha demostrado su efectividad. El número de organismos se establece mediante la cuenta de unidades formadoras de colonias (NOM-113-SSA1-1994. Método para la Cuenta de Microorganismos Coliformes Totales en Placa) o el uso de la técnica del número más probable. Esta última, también llamada técnica de dilución en tubo, proporciona una estimación estadística de la densidad microbiana presente con base a que la probabilidad de obtener tubos con crecimiento positivo disminuye conforme es menor el volumen de muestra inoculado. 1. Objetivo y campo de aplicación 1.1 Esta Norma Oficial Mexicana establece el método microbiológico para estimar el número de coliformes presentes en productos alimenticios, por medio del cálculo del número más probable (NMP) después de la incubación a 35 °C de la muestra diluida en un medio líquido. Este procedimiento puede aplicarse a agua potable, agua purificada, hielo y alimentos procesados térmicamente, así como a muestras destinadas a evaluar la eficiencia de prácticas sanitarias en la industria alimentaria. Este procedimiento debe seleccionarse cuando la densidad esperada es como mínimo de una bacteria en 10 ml de producto líquido o una bacteria por gramo de alimento sólido. Cuando la densidad bacteriana sea menor que la aquí citada y si la naturaleza del alimento lo permite, utilizar el método de filtrado en membrana. Si la densidad microbiana se espera sea mayor a 100 por mililitro o gramo de muestra, ampliar el intervalo de diluciones o utilizar el método en placa. 1.2 Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria en el territorio nacional para las personas físicas o morales que requieran efectuar este método en productos nacionales o de importación, para fines oficiales. 2. Fundamento El método se basa en que las bacterias coliformes, fermentan la lactosa incubadas a 35 ± 1°C durante 24 a 48 horas, resultando una producción de ácidos y gas el cual se manifiesta en las campanas de fermentación.

3. Referencias Esta norma se complementa con lo siguiente: 84

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2009

NOM-109-SSA1-1994 Procedimientos para la Toma, Manejo y Transporte de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico.* NOM-110-SSA1-1994 Análisis Microbiológico.*

Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su

4. Definiciones Para fines de esta norma se entiende por: Coliformes, bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios facultativos, que a 35 °C fermentan la lactosa con la producción de gas bajo las condiciones especificadas en esta norma. 5. Símbolos y abreviaturas Cuando en esta norma se haga referencia a los siguientes símbolos y abreviaturas se entiende por: g ml l mm °C % pH N NMP

gramo mililitro litro milímetro grado Celsius por ciento potencial de hidrógeno normal número más probable

4. CORRELACION

CON

EL

PROGRAMA

DE

MICROBIOLOGIA

(ING.

BIOQUIMICA BQO-0525) Tema. Microorganismos procariotas. Subtema. Crecimiento y reproducción. La cuantificación de los microorganismos puede ser basada en la medición indirecta de su actividad metabólica, la técnica de NMP (número más probable) es utilizada como técnica oficial dentro de las NOM (Normas Oficiales Mexicanas).

85

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2009

5. MATERIAL Y EQUIPO 6.Reactivos y materiales Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico. Cuando se indique agua debe entenderse como agua destilada con pH cercano a la neutralidad.

6.1 Reactivos 6.1.1 Soluciones diluyentes 6.1.1.1

Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada)

FORMULA INGREDIENTES

CANTIDADES

Fosfato monopotásico

34,0 g

Agua

1,0 l

Preparación: Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1 N. Llevar a un litro con agua. Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0 °C. Conservar en refrigeración (solución concentrada). Tomar 1,25 ml de la solución concentrada y llevar a un litro con agua. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml según se requiera. Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1 °C. Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a los iniciales. 6.1.1.2. Agua peptonada FORMULA INGREDIENTES

CANTIDADES 86

Instituto Tecnológico de Mérida Peptona

1,0 g

Cloruro de sodio

8,5 g

Agua

1,0 l

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Preparación: Disolver los componentes en un litro de agua. Ajustar el pH a 7,0 con hidróxido de sodio 1 N. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera. Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0 °C. Después de la esterilización los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a los iníciales. Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar obscuro a una temperatura entre 0 a 5 °C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición. 6.1.2 Medios de cultivo. Caldo lactosado (medio de enriquecimiento para agua potable y hielo). Caldo lauril sulfato triptosa (medio de enriquecimiento selectivo). Caldo lactosa bilis verde brillante (medio de confirmación). En el caso del análisis de agua potable y hielo puede utilizarse caldo lactosado o caldo lauril sulfato triptosa con púrpura de bromocresol (concentración 0,01 g/l de medio), como alternativa al uso de campanas de fermentación. Los tubos positivos se manifiestan por el vire del indicador a color amarillo. 6.1.2.1 Caldo lactosado CUADRO 1 Ingrediente Medio de concentración 1,5

concentración sencilla

Extracto de carne

4,5 g

3,0 g

Peptona de gelatina

7,5 g

5,0 g

Lactosa

7,5 g

5,0 g 87

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Instituto Tecnológico de Mérida Agua destilada

1000,0 ml

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1000,0 ml

Disolver los ingredientes en 1 litro de agua, calentando si es necesario o el medio completo deshidratado, siguiendo las instrucciones del fabricante. Ajustar el pH final de tal manera que después de la esterilización éste sea de 6,9 ± 0,2 a 25 °C. Distribuir en volúmenes de 10 ml en tubos con dimensiones de 16 x 160 mm el medio de concentración sencilla y de 20 ml en tubos de 20 x 200 mm el medio de concentración 1,5, cada tubo debe tener campana de fermentación. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 ± 1,0 °C. Enfriar rápidamente para evitar una exposición excesiva al calor. El aspecto del caldo es claro y de color beige. Se puede utilizar una concentración doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearán 10 ml del caldo preparado, cuando se agreguen 10 ml de la muestra. 6.1.2.2 Caldo lauril sulfato triptosa. CUADRO 2 Ingrediente Medio de concentración 1.5

concentración sencilla

Triptosa

30,0 g

20,0 g

Lactosa

7,5

5,0

Fosfato dipotásico

4,125 g

2,75 g

Fosfato monopotásico

4,125 g

2,75 g

Cloruro de sodio

7,50 g

5,0

g

Lauril sulfato de sodio

0,15 g

0,1

g

Agua destilada

1000,0

g

ml

g

1000,0

ml

Disolver los componentes en 1 litro de agua, calentando si es necesario o el medio de cultivo completo deshidratado, siguiendo las instrucciones del fabricante. Ajustar el pH de tal manera que después de la esterilización éste sea de 6,8 ± 0,2 a 25 °C.

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Distribuir en volúmenes de 10 ml en tubos con dimensiones de 16 x 160 mm el medio de concentración sencilla y de 20 ml en tubos de 20 x 200 mm el medio de concentración 1,5, cada tubo debe tener campana de fermentación. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 ± 1,0 °C. Se recomienda almacenar el medio una vez preparado. Las campanas de fermentación no deben de contener burbujas de aire después de la esterilización. Se puede utilizar una concentración doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearán 10 ml de caldo preparado, cuando se agreguen 10 ml de muestra. 6.1.2.3 Caldo lactosa bilis verde brillante FORMULA INGREDIENTES

CANTIDADES

Peptona

10,0

g

Lactosa

10,0

g

Sales biliares

20,0

g

Verde brillante

0,0133

Agua

1,0

g

l

Disolver los componentes o el medio completo deshidratado en agua, calentar si es necesario. Ajustar el pH, de tal manera que después de la esterilización éste sea de 7,2 a 25 °C. Distribuir el medio en cantidades de 10 ml en tubos de 16 X 160 mm conteniendo campana de fermentación. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 ± 1,0 °C. Las campanas de fermentación no deben contener burbujas de aire después de la esterilización. 6.2 Materiales Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 ml (o si es necesario de 11 y 2 ml), con tapón de algodón. Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total. 89

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Frascos de vidrio de 250 ml con tapón de rosca. Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas, etc. Tubos de cultivo 20 x 200 mm y de 16 x 160 mm con tapones metálicos o de rosca. Campanas de fermentación (tubos de Durham). Pipetas bacteriológicas graduadas de 10 y 1 ml. Gradillas. Asa de platino o nicromel de aproximadamente 3 mm de diámetro. Todo el material que tenga contacto con las muestras bajo estudio debe esterilizarse mediante: Horno, durante 2 horas a 170 a 175 °C o 1 h a 180 °C o autoclave, durante 15 minutos como mínimo a 121 ± 1,0 °C. El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las especificaciones deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por las esterilizaciones repetidas y éste debe ser químicamente inerte.

7. Aparatos e instrumentos Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170 °C. Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ± 1,0 °C, provista con termómetro calibrado. Termómetro de máximas y mínimas. Autoclave que alcance una temperatura mínima de 121 ± 1,0 °C. Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidades de pH a 25 °C.

8. Preparación de la muestra Las muestras deben prepararse y diluirse, siempre que sea posible, de acuerdo a la NOM-110-SSA1-1994. Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico.

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*Tomar la muestra de un alimento, agua fresca preparada en casa un día antes.

6. METODOLOGIA 9. Procedimiento 9.1 Para agua potable y hielo (*muestra de casa) 9.1.1 Prueba presuntiva 9.1.1.1 Inoculación. Agitar la muestra. Transferir volúmenes de 10 ml de muestra a cada uno de 5 tubos con 20 ml de caldo lactosado de mayor concentración y 1,0 ml y 0,1 ml de muestra a cada uno de los tubos de las series de 5 respectivamente con 10 ml de caldo lactosado de concentración sencilla o caldo lauril sulfato triptosa con púrpura de bromocresol. (Ver punto 6.1.2) 9.1.1.2 Incubación. Incubar los tubos a 35 °C. Examinar a las 24 ± 2 h y observar si hay formación de gas o la formación de gas no se observa en este tiempo, incubar por 48 ± 2 h. 9.1.2 Prueba confirmativa De cada tubo que muestre formación de gas, tomar una azada y sembrar en un número igual de tubos con medio de confirmación, caldo lactosa lauril bilis verde brillante. Incubar a 35 ± 0,5 °C por 24 ± 2 horas o si la formación de gas no se observa en este tiempo, incubar por 48 ± 2 horas. En esta Norma Oficial Mexicana, para el análisis de agua potable, agua purificada así como hielo, se emplea la serie de 5 tubos inoculados, 5 tubos con 10 ml, 5 tubos con 1 ml y 5 tubos con 0,1 ml, véase el cuadro 4. 2.2 Para alimentos. Preparar suficiente número de diluciones para asegurar que todos los tubos correspondientes a la última dilución rindan un resultado negativo. 9.2.1 Prueba presuntiva 9.2.1.1 Inoculación. Tomar tres tubos de medio de enriquecimiento de mayor concentración. Usar una pipeta estéril para transferir a cada tubo 10 ml de la muestra si es líquida o 10 ml de la dilución primaria inicial, en el caso de otros productos. 9.2.1.1.1 Tomar tres tubos de concentración sencilla del medio selectivo de enriquecimiento. Usar una pipeta estéril para transferir a cada uno de estos tubos 1 91

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ml de la muestra si es líquida o 1 ml de la dilución primaria en el caso de otros productos. 9.2.1.1.2 Para las diluciones subsecuentes, continuar como se indica en el párrafo anterior, usando una pipeta diferente para cada dilución. Mezclar suavemente el inóculo con el medio. 9.2.1.2 Incubación. Incubar los tubos a 35 ± 0,5 °C por 24 ± 2 horas y observar si hay formación de gas, en caso contrario prolongar la incubación hasta 48 ± 2 horas. 9.2.2 Prueba confirmativa De cada tubo que muestre formación de gas, tomar una azada y sembrar en un número igual de tubos con medio de confirmación. Incubar a 35 ± 0,5 °C por 24 ± 2 horas o si la formación de gas no se observa en este tiempo, prolongar la incubación por 48 ± 2 horas. En esta Norma Oficial Mexicana se considera una combinación de tres tubos por cada dilución de la serie. Para algunos productos y siempre que se requiera una mayor precisión en los resultados, será necesario inocular una serie de cinco o diez tubos. 10. Expresión de los resultados Tomar la serie de tubos de la prueba confirmativa que dé formación de gas después del periodo de incubación requerido y buscar el NMP en los cuadros correspondientes. El cuadro 3 muestra algunos ejemplos que se pueden presentar. Ejemplos: Ejemplo 1. Cuando sólo una dilución muestra tres tubos positivos, elegir ésta y las diluciones mayores posteriores. Ejemplo 2. Cuando más de una dilución muestra tres tubos positivos y la última da menos de tres, elegir esta última y las dos diluciones anteriores más bajas. Ejemplo 3. Cuando en ninguna dilución hay tres tubos positivos y éstos se encuentran en más de tres diluciones, seleccionar las dos diluciones mayores positivas y la siguiente. Ejemplos 4 y 5. Cuando los tubos positivos sólo se encuentran en la muestra sin diluir (10 ml o 1 g) y en la primera dilución (1 ml o 10-1 g), seleccionar las tres primeras diluciones para el cálculo del número más probable.

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En cada caso se obtiene un número de tres cifras, lo cual es representado en los cuadros 4 al 7, según corresponda. En la columna que indica el número de tubos positivos se busca el índice del NMP. La técnica de NMP puede admitir gran cantidad de variaciones. Los resultados obtenidos con esta técnica deben ser utilizados con precaución. Los límites de confianza están representados en los cuadros 4 al 7. Por ejemplo, para una muestra sólida con un NMP de 70 coliformes por gramo, los límites de confianza en el 95% de los casos variarán de 10 a 230 coliformes por gramo (ejemplo 3 del cuadro 3) y en un producto con 24 de NMP de coliformes por gramo, los límites de confianza son de 3,6 a 130 coliformes por gramo (ejemplo 2 cuadro 3). CUADRO 3.- Ejemplos de la selección de resultados positivos para el cálculo del NMP. Número de tubos positivos obtenidos de tres

NMPb

E

tubos incubados, para las siguientes cantidades

J

de muestra inoculada por tuboa

E

Producto

M

líquido(ml)

10

1

10-1 10-2 10-3 Producto

(g)

1

10-1 10-2 10-3 10-4 líquido

Otros

P L

Otros

O

productos

mayor dilución = menor concentración ml-1

g-1

1

3

3

2

1

15

(5)*

150

(6)*

2

3

3

3

0

24

(5)*

240

(6)*

3

2

2

1

1

0

7

(6)*

70

(7)*

4

3

3

0

0

0

2,4

(4)*

24

(5)*

5

2

2

0

1

0

0,21 (4)*

2,1

(5)*

0

productos

CUADRO 4. Indice del NMP y límites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados positivos cuando son usados varios números de tubos. (Diluciones 10, 1,0 y 0,1 g)a

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3 tubos por dilución 5 tubos por dilución combinación índice 95% Límites de índice 95% Límites de de del NMP confianza del NMP confianza positivos por g bajo alto por g bajo alto

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