MANUAL DE TINCIONES.docx

2013 MANUAL DE TINCIONES HEMATOLOGICAS

JORGE LUIS PALOMINO SÁNCHEZ 06/09/2013

CONTENIDO

INTRODUCCIÓN .............................................................................................................................. 1 OBJETIVOS ....................................................................................................................................... 1 TINCIONES EFECTO DE ROMANOWSKY ................................................................................... 2 TINCION DE WRIGHT ..................................................................................................................... 4 TINCIÓN DE GIEMSA ...................................................................................................................... 5 INDUCCIÓN DE DREPANOCITOS ................................................................................................. 7 TINCIÓN DE PERLS ......................................................................................................................... 9 TINCIÓN DE PASHIFF ................................................................................................................... 11 MIELOPEROXIDASA LEUCOCITARIA ...................................................................................... 14 HEMOGLOBINA FETAL ................................................................................................................ 18 SUDAN BLACK B ........................................................................................................................... 21 CONCLUSIÓN ................................................................................................................................. 23 BIBLIOGRAFIAS ............................................................................................................................ 23

INTRODUCCIÓN Las tinciones son técnicas del laboratorio clínico que consisten en colorear, partículas y componentes de una célula especifica que se quiera observar, algunos de estos componentes son el núcleo, el citoplasma, la presencia de gránulos, enzimas, metales entre muchas cosas mas y que son apreciables gracias a que existes diversas técnicas que nos permiten teñir dichos componentes, pero a la vez realizar contrastes entre los colores para así poder identificar y describir mejor a la célula que se quiere observar. En este manual nos enfocaremos en las técnicas de tinción mas utilizadas en el laboratorio de hematología.

OBJETIVOS   

Conocer la importancia de técnicas de tinción hematológicas mas utilizadas en el laboratorio. Conocer la metodología adecuada para cada una de las técnicas. Conocer los componentes de cada una de las tinciones, así también las estructuras que estas colorean.

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TINCIONES EFECTO DE ROMANOWSKY INTRODUCCION La tinción de Wright es un tipo de tinción usada en histología para facilitar la diferenciación de los tipos de células de la sangre. Se usa principalmente para teñir frotis de sangre y punciones medulares, para ser examinadas al microscopio. En citogenética se usa para teñir cromosomas, para facilitar el diagnóstico de síndromes y enfermedades. Lleva el nombre de James Homer Wright, su descubridor, que la obtuvo modificando la tinción de Romanowsky, en 1902. Debido a que ayuda a distinguir fácilmente las células de la sangre se convirtió en una técnica muy usada para el conteo de los glóbulos blancos, una técnica rutinaria usada cuando hay sospecha de infecciones. La tinción de Romanowsky es una técnica de tinción prototípica que fue predecesora de varios métodos distintos, pero basados en principios similares entre los que se incluyen las tinciones de Giemsa, Jenner, Wright, Field, y Leishman, las cuales son utilizadas para diferenciar diferentes tipos de células en especímenes patológicos. FUNDAMENTO Una tinción de Romanowsky consiste en azul de metileno y sus productos de oxidación, así como eosina Y o eosina B. La acción combinada de estos colorantes produce el efecto Romanowsky que da una coloración púrpura a los núcleos de los leucocitos y a los gránulos neutrofílicos y da color rosado a los eritrocitos. Los componentes de este efecto son el azul B y la eosina Y. Las propiedades de tinción de Romanowsky dependen del enlace de los colorantes a las estructuras químicas y de las interacciones del azul B y la eosina Y. Los agrupamientos de ácidos nucleicos, las proteínas de los núcleos celulares y el citoplasma inmaduro reactivo, fijan el azul B, colorante básico. La eosina Y, colorante ácido, se fija a los agrupamientos básicos de las moléculas de hemoglobina y a las proteínas básicas. La tinción de la muestra permite distinguir la forma, tamaño y contorno de los hematíes, leucocitos y plaquetas y el núcleo, citoplasma y granulaciones de las distintas células ya que adquieren diferentes colores: azul, púrpura, rosa o salmón. Esta separación por colores es el llamado efecto Romanowsky.

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PROCEDIMIENTO 1. Colocar el frotis secado al aire sobre una rejilla o cubeta de tinción con la sangre hacia arriba. 2. Cubrir completamente el portaobjetos o cubreobjetos con el colorante de Romanowsky gota a gota. Dejarlo que permanezca en el frotis aproximadamente de 5-8 minutos, para fijar los glóbulos sanguíneos. El colorante deberá cubrir completamente el portaobjetos, pero no debe derramarse por los bordes. Deberá agregarse una cantidad adicional si éste se comienza a evaporar. 3. Agregar directamente al colorante un volumen igual de amortiguador de Romanowsky, para evitar la coloración débil. Esperar la formación de brillo metálico. Puede usarse de igual manera agua des ionizada. Dejar actuar de 10-15 minutos. 4. Lavar con agua en el chorro cuidadosamente hasta que la extensión presente un aspecto rosado al examinarlo a simple vista. 5. Limpiar el dorso del portaobjetos con una gasa o algodón humedecido en alcohol para eliminar cualquier resto de colorante. 6.

Secar al aire y observar con el microscopio con el objetivo de inmersión. IMPORTANCIA

La tinción de la muestra con este colorante permite distinguir la forma, tamaño y contorno de los hematíes, leucocitos y plaquetas y el núcleo, citoplasma y granulaciones de las distintas células ya que adquieren diferentes colores: azul, púrpura, rosa o salmón. Este colorante es muy usado para el conteo de los glóbulos blancos, una técnica rutinaria usada cuando hay sospecha de infecciones. Se usa principalmente para teñir frotis de sangre y punciones medulares, para ser examinadas al microscopio. En citogenética se usa para teñir cromosomas, para facilitar el diagnóstico de síndromes y enfermedades.

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TINCION DE WRIGHT Tinción son un conjunto de procesos que conducen a la coloración de las estructuras. Esto tiene por objeto el aumentar el contraste entre esas estructuras y el medio que las rodea, y permite por tanto que las células sean visualizadas microscópicamente con mayor facilidad. IMPORTANCIA La tinción de Wright. Es de gran trascendencia clínica ya que gracias a ella es capaz de identificarse diversas estructuras en una célula así como la morfología y en su caso patología celular no solo de las células del sistema inmunológico sino de todas aquellas que componen la sangre ya sea en un paciente sano o con un estado patológico. FUNDAMENTO La tinción de Wright cuyo colorante está compuesto de azul de metileno (que tiñe de color azul las partes acidas de las células) y eosina (que tiñe las partes alcalinas) disueltos en metanol (que permite la fijación de las células), adicionando a la preparación buffer de fosfatos (que rehidrata a las células después de la exposición con metanol) PROCEDIMIENTO 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Colocar una gota de sangre o impronta de células. Hacer la extensión de las sangre con un movimiento suave y firme. Secar al aire Cubrir el frotis completamente con el colorante de Wright durante 7 minutos. Sin tirar el colorante agregar el buffer de fosfatos durante 15 minutos. Decantar y enjuagar con agua destilada. Observar al microscopio.

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TINCIÓN DE GIEMSA Los colorantes más utilizados para la tinción hematológica se basan en la coloración de Romanowsky, constituido fundamentalmente por una mezcla de Eosina y azul de metileno. La naturaleza acida o básica de las estructuras celulares determina su avidez por los componentes del colorante poli cromático de Wight; es así como los ácidos nucleicos se tiñen con azul de metileno que es básico (azul-morado) y la hemoglobina con la eosina que es acida (rosada). MATERIAL Microscopio óptico Portaobjetos Puentes de tinción Pipetas Pasteur con tapón Tubos de ensayo Reactivos Colorantes en solución según Giemsa de Panreac Solución tampón pH 7,2 de Panreac Metanol Aceite de inmersión. MUESTRA Sangre capilar fresca o venosa anti coagulada. El anticoagulante de elección es la heparina o el EDTA, ya que el citrato sódico y el oxalato potásico pueden dar preparaciones defectuosas. TÉCNICA Preparamos una frotis sanguíneo Colocamos el frotis sobre el puente de tinción en posición horizontal. Cubrimos con metanol durante 3 minutos. Escurrimos y dejamos secar al aire. Con esto procedemos a fijar el frotis. Diluimos en el tubo de ensayo 0,2 ml de azur-eosina-azul de metileno según Giemsa con 2 ml de solución tampón pH 7,2. Es importante realizar esta dilución en el momento de la tinción, ya que el colorante precipita y no es válido para otro día. Mezclamos suavemente en el tubo y con una pipeta Pasteur cubrimos el frontis dejando actuar durante 25 minutos. Escurrimos y lavamos con agua del grifo. Posteriormente lavamos con tampón pH 7,2 hasta eliminar los restos del colorante. Dejamos escurrir y secamos en posición vertical.

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RESULTADOS Se controla con extendidos de sangre en donde cada una de las diferentes células sanguíneas tiñen de acuerdo a su composición así: 1. Glóbulos rojos: rojo amarillento. 2. Neutrófilos: cromatina púrpura oscuro; citoplasma rosa pálido; gránulos lila. 3. Eosinófilos: cromatina púrpura oscuro; citoplasma azul pálido; gránulos rojo brillante. 4. Basófilos: cromatina púrpura oscuro; gránulos azul oscuro. 5. Linfocitos: cromatina púrpura oscuro; citoplasma azul cielo. 6. Monocitos: cromatina púrpura medio; citoplasma azul grisáceo; gránulos lila. 7. Plaquetas: granulomero de violeta a púrpura; hialomero azul claro 8. Observar en el microscopio

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INDUCCIÓN DE DREPANOCITOS INTRODUCCIÓN Los hematíes son las células más numerosas en sangre periférica con una vida media en torno a los 120 días. Posee una estructura bicóncava con diámetro de unas 7 micras. El hematíe es una célula que presenta importantes diferencias con respecto a otras células del organismo. En primer lugar, no tiene núcleo, por lo que le falta la capacidad de división. Tampoco tiene mitocondrias o ribosomas, ni ADN o ARN. No obtiene energía del ciclo de Krebs, y no tiene un sistema de transporte de electrones para la fosforilación oxidativa. A pesar de estas deficiencias, el hematíe es una célula compleja y metabólicamente activa. La integridad del hematíe depende de la interacción de 3 unidades celulares que lo capacitan para realizar su función primaria de transporte de oxigeno y CO2. Estas tres unidades celulares son la hemoglobina, la membrana eritrocitaria y los elementos solubles intracelulares (enzimas, coenzimas y substratos del metabolismo de la glucosa). La alteración de una de estas unidades celulares da lugar a alteraciones en las otras dos, dando como resultado un acortamiento de la vida media eritrocitaria (hemólisis). El gen de la drepanocitosis se ha hecho frecuente en áfrica por que el rasgo heterocigoto confiere cierta resistencia al paludismo por Plasmodium falciparum durante la infancia, favoreciendo así la supervivencia del huésped y la consiguiente transmisión del gen de la hemoglobina anormal aunque en la presencia de un único gen anormal puede proteger del paludismo, la herencia de dos genes anormales produce anemia falciforme y no confiere la mencionada protección, por lo que el paludismo constituye una importante causa de enfermedad y muerte en niños con anemia drepanocitica.

FUNDAMENTO Inducción de drepanocitos: En un medio carente de oxígeno (O2) la hemoglobina S se hace menos soluble y forma agregados cristalinos con la consiguiente formación de drepanocitos. Se coloca una gota de sangre en un portaobjetos, se le agrega meta bisulfito de sodio 2%, que es un reactivo consumidor de O2 , se tapa con un cubreobjetos y se sellan los bordes con petrolato;8 en pocos minutos se puede observar el fenómeno. Si no se agrega la meta bisulfito habría que esperar entre seis y 24 horas para que ocurriera.

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MATERIAL Solución de meta bisulfito de sodio al 2% Portaobjetos Muestra con edta Cubreobjetos Parafina Microscopio Pipetas de transferencia Aplicador de madera PROCEDIMIENTO Colocar en un tubo: a) Meta bisulfito de sodio 0.05gr b) Agua destilada 2.5 mL Preparar al momento de usarse TÉCNICA 1. Colocar 1 gota de solución de meta bisulfito de sodio al 2% en un portaobjetos y una gota de sangre anti coagulada. 3. Mezclar con un aplicador. 4. Tomar una pequeña porción con la orilla de un cubreobjetos y cuidadosamente sobre un portaobjetos, evitando la formación de burbujas.

colocar éste

5. Sellar las orillas del cubreobjetos con parafina fundida. 6. Observar al microscopio a los 15, 30, 60 minutos, 2 horas y 24 horas

RESULTADOS

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TINCIÓN DE PERLS La tinción de Perls (o azul de Prusia) pone en manifiesto la presencia de hemosiderina en el citoplasma de cualquier tipo de célula, aunque se emplea fundamentalmente sobre frotis de medula ósea para localizar estos depósitos de hierro no hemicos en las células del sistema mononuclear fagocitico (macrófagos histicos) y en Eritroblastos (sideroblastos). INTRODUCCION El Fe de depósito se encuentra en el interior de las células en forma de agregados o gránulos de hemosiderina detectables citoquímicamente mediante la reacción de Perls. Esta reacción se basa en la liberación de los iones férricos de su unión con las proteínas por la acción del ácido clorhídrico; dichos iones férricos al reaccionar con el ferrocianuro potásico dan un precipitado azul verdoso de ferrocianuro férrico. Por esta reacción se detecta el Fe hemosiderínico, que es insoluble, pero no el Fe contenido en la ferritina que es hidrosoluble. Las partículas hemosiderínicas se observan en el interior de los eritroblastos (sideroblastos), en algunos eritrocitos (siderocitos) y en los macrófagos medulares, del hígado y del bazo, dónde se acantonan constituyéndose en Fe de depósito. En condiciones normales se observa de un 30 a un 60% de sideroblastos en cuyo interior aparecen de 1 a 4 gránulos distribuidos por la superficie del citoplasma. El aumento en el número de gránulos indica un acúmulo excesivo de Fe y la existencia de una disfunción en su metabolismo; esta disfunción puede conducir a un depósito de Fe en el interior de las mitocondrias, fenómeno que ópticamente se traduce por la disposición de los gránulos hemosiderínicos alrededor del núcleo en forma de collarete constituyendo los denominados sideroblastos en anillo, característicos y definitorios de la anemia refractaria sideroblástica, en la que deben hallarse en una proporción superior al 15%. Este tipo de tinción se usa para valorar de forma directa el hierro de reserva. Al igual que la ferritina sérica, la valoración del hierro medular constituye un criterio diagnóstico de ferropenia pre latente. En esta etapa del desarrollo de la ferropenia se observa una práctica desaparición del hierro macrofágico y una disminución significativa del número de sideroblastos. FUNDAMENTO Se basa en la producción de ferrocianuro férrico (azul de Prusia) cuando los iones (Fe+++) Férricos, reaccionan con ferrocianuro en solución ácida.

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REACTIVOS 1. Ferrocianuro de potasio al 2%........................................ 1 vol. 2. Ácido clorhídrico exento de Fe al 2%.............................. 1 vol. 3. Solución de safranina al 0.5% en agua bicarbonatada a pH 7.5- 8.0

PROCEDIMIENTO 1. Fijar los frotis con vapores de formol por 5 minutos (aproximadamente de 6 a 8 gotas de Formol) 2. Vaciar la mezcla de incubación solución C precalentada a 56 ºC en un vaso de Copplin, inmediatamente colocar los frotis (previamente fijados) y tapar 3. Incubar por 30 minutos. 4. Lavar con agua de la llave. 5. Secar al aire. 6. Contra teñir con solución de rojo rápido nuclear por 5 minutos. 7. Lavar con agua de la llave. 8. Secar al aire. 9. Cubrir en resina sintética (Permount) y cubreobjetos del No. 1.

RESULTADOS

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TINCIÓN DE PASHIFF La técnica de Schiff, es una reacción colorimétrica que se usa comúnmente en Histoquímica. Utiliza PAS, ácido peryódico de Schiff, o leucofucsina, un colorante incoloro pero que se torna rojo estable al contacto con los grupos aldehídos. La técnica de PAS se utiliza en los preparados para microscopía óptica, permite la tinción de componentes celulares que contienen hidratos de carbono, por ejemplo algunas membranas celulares, células caliciformes en la mucosa del intestino, fibras reticulares que están rodeados por hidratos de carbono, etc. Entonces en esta técnica, el ácido peryódico oxida a los grupos oxidrilos (OH) de dos carbonos cercanos, formando de esta manera grupos aldehídos compuestos por carbono, oxígeno e hidrógeno. así la leucofucsina puede reaccionar con estos y dejar una tinción rojiza.

La tinción de PAShiff es una técnica utilizada para teñir glucógeno ( presente en neutrófilos) almidón, glucoproteínas, plaquetarias y glicoforinas eritrocitarias, estas estructuras se tiñen de un color magenta (rosa mexicano). Los fijadores siempre son alcoholes, además de fijar tienen otra acción, estos precipitan las moléculas de glucosa. El Acido peryódico libera los radicales aldehído de las estructuras con las que entra en contacto. Al utilizar el reactivo de shiff este tiñe los aldehídos liberados por el ácido peryódico. FUNDAMENTO Durante la tinción de PAS, el ácido periódico es un oxidante potente capaz de romper el enlace covalente entre dos funciones ±OH de una glucopiranosa. Las dos funciones de aldehídos creadas reducen el leuco derivado de la fucsina básica de Schiff, que se vuelve rosa a rojo púrpura. La hematoxilina se usa como contra colorante para intensificar el contraste. Los diagnósticos tan solo pueden darse por personas autorizadas y preparadas.

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IMPORTANCIA Permite la determinación del glucógeno, delas mucinas, de los mucopolisacáridos neutros así como de los filamentos y esporasmicelianos. El ácido periódico transforma los glicoles en aldehído. El reactivo de Schiff, desteñido por el ácido sulfúrico, reacciona con los aldehídos libres formando un producto de condensación de color rojo, contra teñido con la hematoxilina. La manipulación de este producto queda reservada a los profesionales. MATERIALES 1 SOLUCIÓN FIJADORA 1 SOLUCIÓN DE ÁCIDO PERYÓDICO AL 1% 1 REACTIVO DE SHIFF 1 REACTIVO DE HEMATOXILINA DE GILL

CONSERVACIÓN: a 4 ºC: - Solución fijadora - Solución de ácido peryódico al 1% - Reactivo de shiff - Hematoxilina de Gill a temperatura ambiente en un lugar fresco y seco. Tejido bien fijado en secciones de parafina.

REACTIVOS

Reactivo A Ácido peryódico Reactivo B Reactivo de Schiff Reactivo C Potasio meta-Bisulfito solución Reactivo D Solución fijadora Reactivo E Hematoxilina de Mayer

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PROCEDIMIENTO

1. Fijar los frotis por 5 minutos (utilizar la solución fijadora a temperatura ambiente). 2. Lavar con agua de la llave. 3. Secar al aire. 4. Colocar en ácido peryódico durante 10 minutos (utilizar la solución a temperatura ambiente) 5. Lavar con agua de la llave y secar perfectamente. 6. Sumergir en el reactivo de Shiff por 20 minutos. (utilizar el reactivo a temperatura ambiente). 7. Lavar con agua de la llave y secar perfectamente. 8. Contra teñir con hematoxilina de Gill por 10 minutos. 9. Lavar con agua de la llave y secar perfectamente. 10. Cubrir con resina sintética (Permount) y cubreobjetos del No. 1 11. Observar en el microscopio.

RESULTADOS

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MIELOPEROXIDASA LEUCOCITARIA INTRODUCCIÓN La Peroxidasa leucocitaria (Mieloperoxidasa) de Sigma-Aldrich se utiliza para la demostración histoquímica en peroxidasa leucocitaria. Los reactivos de peroxidasa leucocitaria son para uso diagnóstico in vitro. Los métodos clásicos de la localización citoquímica de la mieloperoxidasa (MPO) incluyen el uso de benzidina1 o diaminobenzidina2. En 1977, Hanker y cols.3 describieron el uso de p-fenilenediamina y catecol para detectar la peroxidasa de rábano inyectada. Este sistema indicador es la base del procedimiento de Sigma-Aldrich al detectar la mieloperoxidasa por medio de la siguiente reacción: MPO p-fenilenediamina + Producto de reacción insoluble marrón-negro Catecol + H2O2 FUNDAMENTO Se hace a una muestra (frotis) para saber si las células (blastos) son de origen mieloide. Cuando se realiza no se sabe si las células inmaduras son linfoides o mieloides. Cabe mencionar que la mieloperoxidasa no la tienen las células linfoides, sólo las mieloides. La peroxidasa es la enzima que esta presente en los gránulos primarios de los neutrófilos y con lo que se tiñe es con su sustrato y un indicador de la reacción, y al trasnsformar el sustrato, que es el agua oxigenada, se oxida el indicador que es la bencidina y la célula que tenga mieloperoxidasa se tiñe de café o azul y las células que no la tengan no se tiñen, pero se pueden teñir con safranina para que los que no reaccione se tiñaa de naranja APLICACIÓN El kit de peroxidasa (mieloperoxidasa) es un sistema de tinción citotécnica para detectar polimorfonucleocitos en frotis de sangre o médula ósea. Las características detinción de los polimorfonucleocitos se utilizan para diferenciar la leucemia mielocítica de otros tipos de leucemia. Los reactivos de peroxidasa son para uso diagnóstico in vitro.

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REACTIVOS TAMPÓN TRIZMAL™ 6,3 CONCENTRADO, con cloroformo como conservante. REACTIVO INDICADOR DE PEROXIDASA, p-fenilenediamina diHCl (1 parte) y catecol (2 partes). SOLUCIÓN DE HEMATOXILINA ÁCIDA, Hematoxilina certificada, 1 g/l, pH 3,3 a 25 °C.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD Almacenar el tampón Trizmal™ 6,3 concentrado y la solución de hematoxilina ácida a temperatura ambiente (18–26 °C). El reactivo indicador de peroxidasa debe almacenarse refrigerado (2–8 °C). La solución de hematoxilina ácida no debe devolverse al recipiente original después de su uso en un vaso de Coplin. El peróxido de hidrógeno al 3 % en una solución salina tamponada con fosfato debe guardarse en el frigorífico (2–8 °C). Desechar si presenta turbidez. Los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad.

DETERIORO Desechar el tampón Trizmal™ 6,3 concentrado si presenta turbidez. Desechar la solución de hematoxilina ácida cuando el tiempo requerido para obtener la tinción adecuada supere en más de 5 minutos el tiempo recomendado en el procedimiento.

PREPARACIÓN (REACTIVOS) El tampón Trizmal™ 6,3 diluido se prepara mezclando 1 volumen de tampón TRIZMAL™ 6,3 concentrado, número de catálogo 90-3C, con 9 volúmenes de agua desionizada. Utilizar una sola vez y desecharlo. La solución fijadora de etanol, 95 % (v/v), se prepara mezclando 5 ml de formaldehído al 37 % con 45 ml de etanol al 95 %. Las preparaciones deben ser del día. Mantenga el envase bien cerrado.

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El peróxido de hidrógeno al 3 % en una solución salina tamponada con fosfato se prepara añadiendo 1 parte de peróxido de hidrógeno, 30 %, a 9 partes de solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4. Debe prepararse al momento.

PROCEDIMIENTO 1 RECOGIDA DE LA MUESTRA Se recomienda que la recogida de la muestra se lleve a cabo de acuerdo con las directrices del documento M29-A2 de la NCCLS. Ningún método de prueba puede garantizar la completa seguridad de que las muestras de sangre o tejido no transmitan infecciones. Por lo tanto, todos los derivados de la sangre o muestras de tejido deben considerarse potencialmente infecciosos. Para el ensayo deben utilizarse frotis de sangre total o de médula ósea recién preparados. La sangre puede recogerse en heparina o EDTA. Debe reducirse al mínimo la exposición a la luz ya que la peroxidasa leucocitaria es fotosensible. Los frotis sin fijar son estables durante 3 semanas si se guardan en la oscuridad1. Antes de la fijación, los frotis deben dejarse al aire durante 10 minutos, protegidos de la luz.

MATERIAL ESPECIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO Solución de formaldehído, 37 % Etanol, 95 % (v/v) Solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4, número de catálogo P 3813 Peróxido de hidrógeno, 30 % NOTAS A efectos de comprobación del funcionamiento del sistema, se recomienda procesar los frotis de sangre procedentes de donantes sanos junto con las muestras de paciente. Aunque la mieloperoxidasa generalmente se considera un marcador de células de alineación mielocitica, es obligatorio reconocer que las células monocitoides también pueden mostrar actividad leve de peroxidasa. Los datos obtenidos mediante este procedimiento sólo sirven como ayuda en el diagnóstico y deben ser revisados junto con otras pruebas clínicas o información de diagnóstico.

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PROCEDIMIENTO 2 (Tecnica) 1. Fijar los frotis a temperatura ambiente durante 30 segundos con solución fijadora. 2. Lavar los portaobjetos con agua corriente a chorro suave durante 2 minutos y secar al aire durante 10 minutos, en la oscuridad. 3. Precalentar 50 ml de tampón TRIZMAL™ 6,3 diluido, en un baño de agua a 37 °C. 4. Inmediatamente antes de su uso, añadir 1 vial de reactivo indicador de peroxidasa, de hidrógeno al 3 %, al tampón Trizmal™ 6,3 diluido precalentado. Mezclar a conciencia. Desechar después de su uso. 5. Colocar los portaobjetos lavados, fijados (paso 2) con solución de reactivo indicador de peroxidasa (paso 4) durante 30 minutos, en un baño de agua a 37 °C, en la oscuridad. 6. Tras la incubación, lavar los portaobjetos con agua corriente a chorro suave durante 15– 30 segundos y dejarlos secar. 7. Contrateñir los portaobjetos con solución de hematoxilina ácida, 8. Aclarar los portaobjetos en agua desionizada corriente durante 15–30 segundos. Secar los portaobjetos al aire y examinarlos con el microscopio. CARACTERÍSTICAS DE FUNCIONAMIENTO Los frotis de sangre procedentes de donantes normales se tiñeron para mieloperoxidasa de acuerdo con este procedimiento y mediante el método de benzidina1. Los neutrófilos muestran una granulación marrón-negra con este procedimiento, y una granulación azul con el procedimiento de benzidina. En ambos casos, los monocitos se tiñeron menos intensamente y los linfocitos no mostraron ninguna actividad de mieloperoxidasa. RESULTADOS

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HEMOGLOBINA FETAL APLICACIONES Los reactivos de hemoglobina fetal están diseñados para la determinación semicuantitativa de la elución ácida de la hemoglobina fetal en extensiones de sangre. Los reactivos de tinción de la hemoglobina fetal son “para uso diagnóstico in vitro.” Ya en 1864, Korber descubrió que la hemoglobina del feto era más resistente a la desnaturalización alcalina que la de los adultos. Los avances en las técnicas de aislamiento y caracterización de proteínas han propiciado el descubrimiento de la existencia de varias propiedades distintivas que hacen posible diferenciar la hemoglobina fetal de la adulta. Entre ellas, se encuentra la resistencia de la hemoglobina fetal (hemoglobina F) a la eluciónácida. Cuando las extensiones de sangre se sumergen en tampón ácido, por ejemplo, la hemoglobina adulta se eluye de los eritrocitos, pero la hemoglobina fetal, no. Si las extensiones de sangre se tratan de esta manera y luego se tiñen, los eritrocitos con hemoglobina F adquirirán la tinción, mientras que aquéllos que contienen sólo hemoglobina adulta aparecerán como “fantasmas”. La técnica de portaobjetos para la demostración de la hemoglobina fetal en relacióncon su resistencia a la elución ácida, fue propuesta por primera vez por Kleihauer y cols ,y más tarde fue modificada por Shepard y cols. El procedimiento de Sigma mejora aún más este enfoque según lo describen Oski y Naiman. Las estimaciones de la hemoglobina fetal algunas veces se hacen para determinar posibles hemorragias en el recién nacido, especialmente en casos en los que existen signos de sangrado rectal. El ensayo de hemoglobina F también se aplica a adultos como ayuda en el diagnóstico de ciertos tipos de anemia. Por ejemplo, en pacientes con talasemia mayor la hemoglobina fetal se encuentra en un 10–90 %. Asimismo, generalmente se observan pequeños aumentos de pigmento de sangre fetal en pacientes con drepanocitemia. En los casos de incompatibilidad de Rh, cada vez es más común suprimir las reacciones inmunes a los hematíes que pasan a la circulación materna desde el feto. La cantidad de gammaglobulina específica que contiene el anti-Rh (D) a administrar, se calcula evaluando la magnitud de las hemorragias feto-maternas. Según la técnica descrita, las extensiones de sangre, debidamente secas y fijadas, se sumergen en un tampón citrato de pH 3,3 a 37 °C. La hemoglobina adulta A (HbA) se disuelve fuera de las células, mientras que la hemoglobina fetal (HbF), que es ácido rresistente, permanece en el interior de las células y puede ser teñida para proceder al examen microscópico. 18

REACTIVOS CONCENTRADO DE TAMPÓN FOSFATO-CITRATO, número de catálogo 285-1 Citrato sódico, 0,7 mol/l, y fosfato sódico, 0,6 mol/l. SOLUCIÓN DE HEMATOXILINA ÁCIDA, número de catálogo 285-2 Hematoxilina certificada, 1 g/l, sulfato de amonio y aluminio, yodato sódico y estabilizantes, pH 3,3. SOLUCIÓN DE EOSINA B, número de catálogo 285-3 Eosina B, 0,1 %, solución acuosa. Azida sódica, 0,1 %, como conservante. Fijador de etanol, número de catálogo 285-8 (80 % v/v, alcohol etílico).

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD Almacenar el concentrado de tampón fosfato-citrato en el frigorífico (2–8 °C). Desechar si el crecimiento microbiano es evidente. Almacenar la solución de tampón fosfato-citrato en el frigorífico (2–8 °C). Estable durante 2 semanas. Usar una alícuota fresca cada día. Desechar si el crecimiento microbiano es evidente. Almacenar las soluciones de hematoxilina y eosina B a temperatura ambiente (18–26 °C). Las soluciones se pueden reutilizar si se almacenan en frascos de tinción herméticos con luz atenuada. Almacenar el fijador de etanol a temperatura ambiente. Almacenar herméticamente cerrado y como líquido inflamable. La solución puede utilizarse varias veces, pero debe desecharse si la fijación no es la adecuada.

DETERIORO Desechar la solución de hematoxilina ácida cuando el tiempo requerido para obtener la tinción adecuada supere en más de 8 minutos el tiempo recomendado.

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PROCEDIMIENTO 1. La solución de tampón fosfato-citrato debe calentarse a 37 °C en un vaso de Coplin o en un plato de tinción. 2. Utilizando portaobjetos de microscopio, limpios y etiquetados, preparar extensiones de sangre finas. Preparar portaobjetos de CONTROL utilizando sangre HbF positiva (cordón umbilical) y sangre adulta normal. Secar al aire durante unos 10 minutos. 3. Fijar los portaobjetos sumergiendo fijador de etanol, número de catálogo 285-8, durante 5 minutos, aclarar bien con agua del grifo y secar al aire. 4. Sumergir los portaobjetos de PRUEBA y de CONTROL en solución de tampón fosfatocitrato precalentada a 37 °C durante 5 minutos. Agitar tras 1 y 3 minutos de inmersión. El grado de agitación puede variarse para conseguir los resultados deseados. Aclarar bien con agua destilada y secar al aire completamente para evitar artefactos de tinción. 5. Teñir los portaobjetos durante 3 minutos en solución de hematoxilina ácida, número de catálogo 285-2. Aclarar los portaobjetos con agua destilada y sacudir el exceso de agua. 6. Contra teñir los portaobjetos durante 4 minutos en solución de eosina B, número de catálogo 285-3, al 0,1 %. Aclarar bien con agua destilada y secar al aire. 7. Colocar cubreobjetos secos en el portaobjetos y examinar mediante inmersión de aceite (1000X). La ausencia de HbF se evidencia mediante la presencia de células fantasma, mientras que la HbF retenida hace que las células aparezcan de color rojo brillante. No aplicar aceite directamente en el portaobjetos. NOTA: Puede utilizarse una ampliación de 400X, pero el campo resultante será más grande y más difícil de contar. RESULTADOS La proporción de eritrocitos con hemoglobina fetal puede estimarse de diferentes formas. Al estudiar la sangre materna para ver las células con contenido de HbF, Oski y Naiman4 recomendaron lo siguiente: 1. Contar el número total de eritrocitos en 5 campos y determinar el promedio por campo. 2. Seguidamente, contar el número de eritrocitos con HbF que hayan quedado profundamente teñidos en unos 30 campos, y determinar el promedio por campo. 3. Calcular el porcentaje de eritrocitos con HbF basándose en el número total de eritrocitos por campo. Los resultados se informan como porcentaje de HbF presente. 20

SUDAN BLACK B APLICACIÓN El sistema de tinción Sudan Black se utiliza en la demostración histoquímica de gránulos neutrófilos en frotis de sangre o médula ósea. El sistema de tinción Sudan Black B es para uso diagnóstico in vitro. Varios lípidos, incluyendo los fosfolípidos, las grasas neutras y los esteroles, se tiñen intensamente con Sudan Black B. La reacción de los gránulos neutrófilos con el tinte fue descrita por Sheehan y Storey en 19471. Generalmente, el patrón de tinción leucocitaria de Sudan Black B es parecido al de la mieloperoxidasa. Las células que se encuentran a lo largo de las vías linfáticas muestran una tinción negativa, mientras que las formas mieloides y monocitoides muestran las reacciones positivas características. Por lo tanto, Sudan Black B está considerado como un auxiliar útil en la identificación de las leucemias mielocíticas y mielomonocíticas. Los métodos antiguos utilizaban una fijación de vapor de formaldehído en los frotis de sangre, técnica que puede dar como resultado una pérdida celular y artefactos de tinción. El procedimiento de utiliza un fijador de glutaraldehído tamponado y un tiempo de incubación más corto, lo que da como resultado una excelente tinción sinpérdida celular ni distorsión. REACTIVOS REACTIVO DE TINCIÓN SUDAN BLACK B, Sudan Black B, 0,18 % (p/v), en 69 % de etanol y con fenol tamponado con fosfato. SOLUCIÓN DE HEMATOXILINA, GILL Nº 3, Hematoxilina certificada, 6 g/l, yodato sódico, 0,6 g/l, sulfato de aluminio, 52,8 g/l, y estabilizante. SOLUCIÓN DE GLUTARALDEHÍDO, Glutaraldehído, 4 % en tampón borato, pH 7,6.

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PROCEDIMIENTO 1. Enfriar la solución fijadora de glutaraldehído en el frigorífico (2–8 °C). 2. Las extensiones o frotis de sangre o médula ósea se fijan durante 1 minuto a 2–8 °C con una suave agitación seguida de un lavado concienzudo con agua desionizada. 3. Para teñir con el reactivo de tinción Sudan Black B, sumergir durante 5 minutos con agitación intermitente. 4. Enjuagar 3 veces o más en etanol al 70 % hasta que ya no desprenda tinte. Seguidamente, enjuagar a fondo con agua destilada. 5. Contra teñir con solución de hematoxilina, Gill Nº 3, durante 5 minutos y seguidamente enjuagar a fondo con agua del grifo. 6. Después de secar al aire, los portaobjetos pueden montarse en DPX para histología, o en otro medio de montaje permanente que sea adecuado.

RESULTADOS Los neutrófilos y sus precursores muestran una granulación intracelular azul-negra. Los monocitos se tiñen menos intensamente y los linfocitos no se tiñen con Sudan Black B2. Los frotis de sangre procedentes de donantes normales se tiñeron con Sudan Black B de acuerdo con el procedimiento descrito y mediante el método clásico de Sheehan Storey. Los neutrófilos mostraron una granulación azul-negra con este procedimiento y también con el procedimiento de Sheehan-Storey. En ambos casos, los monocitos se tiñeron menos intensamente y los linfocitos no mostraron ninguna actividad de mieloperoxidasa.

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CONCLUSIÓN Este pequeño manual es una recopilación de muchos artículos, libros, ideas y comentarios de maestros y compañeros que colaboraron conmigo para poder realizarlo, del cual pienso que podría ser una herramienta de gran utilidad tanto para estudiantes de química de secundaria, preparatoria y nivel superior que estén interesados por la hematología, y que además de contener información útil considero que es muy practico. Además me gustaría agregar que este manual solo es una pequeña recopilación de la información más importante y que en un futuro puede que se expanda la información que esta contiene.

BIBLIOGRAFIAS 1- KRAFTS K, HEMPELMANN E, OLEKSYN BJ (2011). «IN SEARCH OF THE MALARIAL PARASITE: BIOGRAPHICAL SKETCHES OF THE BLOOD STAIN CONTRIBUTORS». PARASITOL RESEARCH 109 (3): PP. 521–529. 2- ROMANOWSKY D (1891). «ZUR FRAGE DER PARASITOLOGIE UND THERAPIE DER MALARIA». ST PETERSBURG MED WOCHENSCHR 16: PP. 297–302, 307– 315. 3- HEMATOLOGY: PRINCIPLES AND PROCEDURES, SIXTH EDITION, BROW AB, LEA & FEBIGER, PHILADELPHIA 1993 P. 101 4- GRIGNASCHI U. J.; DIAGNÓSTICO CITOLÓGICO DE LAS HEMOPATÍAS; ED. MÉDICA PANAMERICANA; MADRID ESPAÑA 1991. 5- MCKENZIE SHIRLY B; HEMATOLOGÍA CLÍNICA; SEGUNDA REIMPRESIÓN DE LA PRIMERA EDICIÓN; ED. MANUAL MODERNO; 1994 6- GUILLERMO J. RUIZ ARGÜELLES, FUNDAMENTOS DE HEMATOLOGIA 7- J. M. ARRIBAS CASTRILLO, EMILIO VALLINA ÁLVAREZ, HEMATOLOGÍA CLÍNICA. TEMAS DE PATOLOGÍA MÉDICA 8- HEMATOLOGY: PRINCIPLES AND PROCEDURES, SIXTH EDITION, BROWN AB, LEA & FEBIGER, PHILADELPHIA 1993 P101 9- CLARK, GEORGE, STAINS AND STAINING (MICROSCOPY), 4TH EDITION, WILLIAMS & WILKINS, (1981).

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11- BURCK, H. C.: “TÉCNICA HISTOLÓGICA. MANUAL PARA REALIZAR PREPARACIONES MICROSCÓPICAS EN EL LABORATORIO”. ED PAZ MONTALVO. MADRID, 1969 12- RAIMUNDO GARCÍA DEL MORAL: “LABORATORIO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA”. ED INTERAMERICANA - MCGRAW-HILL. MADRID, 1993. 13- HEMATOLOGÍA: MEDICINA DE LABORATORIO - PÁGINA 224 14- PEROXIDASA (MIELOPEROXIDASA) PROCEDIMIENTO NÚMERO 391, SIGMA – ALDRICH. 15- INSERTOS TINCIONES MACEDONIO (COMAC)

HEMATOLOGICAS,

COMERCIALIZADORAS

16- SISTEMA DE TINCIÓN SUDAN BLACK B (PROCEDIMIENTO NÚMERO 380), SIGMA-ALDRICH 17- HEMOGLOBINA FETAL, (PROCEDIMIENTO NÚMERO 285) 18- MARMONT AM, DAMASIO E, ZUCKER-FRANKLIN D: LOS NEUTRÓFILOS. EN ATLAS DE LAS CÉLULAS SANGUÍNEAS - FUNCIÓN Y PATOLOGÍA, VOL. 1, D ZUCKER-FRANKLIN, MF GREAVES, CE GROSSI, AM MARMONT, EDITORS, LEA Y FEBIGER, PHILADELPHIA, 1981, PP 149-242

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