Manual de Procedimientos de Hematologia

 

  MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE HEMATOLOGIA

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CARLOS ARMANDO ESQUECHE ANGELES Biologo – Microbiologo C.B.P. 3913 2011

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  TOMA DE MUESTRA ♦

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Se elige la vena que favorece la toma de la muestra, preferiblemente de la región venosa antecubital, porque a este nivel la piel es fina y móvil y las venas son de grueso calibre y relativamente superficiales. Cuando este lugar no favorece para la punción, se observan otras venas como de la mano o de la cara anterior del antebrazo. El personal encargado de la toma de muestras se colocara los guantes de látex, previo lavado de las manos. Si las venas venas no son muy su superfic perficiales iales se co coloca loca un to torniqu rniquete ete 5cc arriba del sitio elegido para puncionar, se le pide al paciente que empuñe la mano y si es necesario se frota suavemente suavemente con la mano d dee quie qu ien n va a pu punc ncio iona narr el luga lugarr de la vena vena el eleg egid ida. a. Si la ve vena na es superficial solo se le pide al paciente que empuñe la mano. Unaa ve Un vezz el eleg egid idaa el área de punc punció ión n se este esteri rili liza za con alg algod odón ón empapado con alcohol antiséptico, se emplea jeringa desechable y se procede a la punción. La cinta elástica debe retirarse después de introducida la aguja en la vena ve na,, se as aspi pira ra la sa sang ngre re co con n la je jeri ring ngaa y un unaa ve vezz re reti tira rada da,, se presionará la zona puncionada con un algodón empapado en alcohol antiséptico. Cuando se va a to tomar mar únicamente pa para ra exámenes de hematología, se toman 2cc de sangre, cuando además el paciente tiene orden para exámen exá menes es de quími química ca clín clínica ica y/o inm inmuno unolog logía ía se toma toman n 5cc. La muestra para CH se almacena en los tubos tapa lila que son previamente organizados y deben contener 2 gotas de EDTA.

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  FROTIS SANGUINEO Y COLORACION

Para el frotis sanguíneo se emplea el método de los dos portaobjetos: ♦ Identificar la lámina. ♦

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Colocar una pequeña gota de sangre no más de 3 mm de diámetro de un portaobjetos a 2 cm de uno de los extremos. Colocar el canto de otro portaobjetos, por la parte anterior a la gota de sangre san gre,, sob sobre re la sup superf erfici iciee del pri primer mer po portao rtaobje bjetos tos,, for forman mando do un ángulo de 45 grados y desplazarlo suavemente hacia atrás, hasta que alcance la gota de sangre. Esperar que por capilaridad toda la sangre se distribuya uniformemente, es aconsejable que la sangre no llegue a los lados del portaobjetos, sobre el que se realiza la extensión. Deslizar suavemente y a veloci velocidad dad moderada un portaobjetos sobre el otro en sentido longitudinal, hasta que la gota de sangre quede bien extendida, sobre la superficie del primer portaobjeto. El grosor del frotis sanguíneo puede variar de acuerdo al ángulo empleado durante la extensión, si es superior a 45° será gruesa y corta y si es inferior  será larga y fina. Se deja secar a te temperatura mperatura ambiente y en en posición horizontal.

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Para la coloración, una vez seco el extendido no se deja pasar más de una hora: ♦ Se aplica 1 cm colorante de Wright por 1 minuto. ♦ Se aplica buffer Giordano Giordano (que debe mantenerse en la ne nevera, vera, pero a ♦

temperatura ambiente en el momento de emplearlo) por 6 minutos. Se lava la lámina con agua de chorro, se seca por la parte posterior y se deja secar a temperatura ambiente en posición vertical.

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  HEMOGLOBINA

Servir en un tubo de ensayo 2,5 ml de Drabkin y tomar 10 ul de sangre con anticoagulante, limpiar muy bien la punta y llevar al fondo del tubo y aplicar, enjuagar la punta con el reactivo en la parte superior. Homogeneizar el tubo por inversión con movimientos suaves. Dejar en reposo de 5 a 10 minutos. Leer a 540 nm, llevando a cero con el blanco del reactivo y calibrando con el patrón de hemoglobina.

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HEMOGLOBINA: ESPECTROFOTOMETRICA ICSH

FUNDAMENTO

El ión ferroso de la HB se oxida a ión férrico por acción del ferricianuro potásico formándose hemiglobina (metahemoglobina). La hemiglobina reacc rea ccio iona na co con n el ci cian anur uro o pa para ra forma formarr ci cian anhe hemi migl glob obin inaa (cianmetahemoglobina) que se puede medir por espectrofotometría. REACTIVOS

Reactivo concentrado y patrón de Hb, deben guardarse en refrigeración, bien cerrados, protegidos de la luz y evitar su contaminación durante su uso para que se conserve hasta la fecha indicada en la etiqueta. Presencia de turbidez, partículas en el reactivo y el blanco son indicaciones de deterioro, además de lecturas superiores de 0,010 a 540 nm del blanco.

Reactivo de trabajo: Diluir el contenido del frasco de reactivo concentrado hasta 1000 ml con agua destilada, agitar. Para preparar otros volúmenes mezclar en proporción 1 ml de reactivo concentrado + 49 ml de agua destilada. Conservar en frasco oscuro siendo estable 6 meses a 15-30°C: No congelar. MUESTRAS

Sangre capilar o venosa recogida con EDTA o heparina. La Hb en sangre es estable 6 días de 2-8°C.

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  PROCEDIMIENTO

BLANCO

PATRON

MUESTRA

PATRON MUESTRA

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10 ul --

-10 ul

REACTIVO TRABAJO

2.5 ml

2.5 ml

2.5 ml

Agitar y dejar por 3 minutos a temperatura ambiente. Leer las absorbancias a 540 nm frente al blanco. El color es estable por  varias horas. Cálculos:

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Con patrón: A muestra ------------ X C patrón = C muestra A patrón Sin patrón: A muestra X 37,5 = C muestra

VALORES NORMALES: HOMBRES

12-14 años 15-17 años 18-74 años

12,0-16,0 g/dl 11,7-16,6 g/dl 13,5-17,5 g/dl

MUJERES

11,5-15,0 g/dl 11,7/15,3 g/dl 12,0-16,0 g/dl

CARACETERISTICAS CARACETERISTIC AS METROLOGICAS   

Límite de detección: 0,2 g/dl de Hb. Límite de linealidad: 20 g/dl. Para valores superiores diluir la muestra ½ con agua des destilada tilada y repetir. Interferencias: La bilirrubina no interfiere. La lipemia puede elevar  falsamente los resultados debido a la turbidez. Otros medicamentos y sustancias pueden interferir.

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  HEMATOCRITO

Se llena el capilar de la muestra tomada con anticoagulante, hasta las 3/4 partes y sellar por este extremo con plastilina, colocarla en la microcentrifuga de 5 a 10 minutos entre 10.000 y 5.000 r.p.m. Cuando la centrifuga pare, leer el valor en la tabla de hemotocrito. Tomando el punt pu nto o cero cero dond dondee la plas plasti tili lina na se une une co con n la mues muestra tra ha hast staa la lí líne neaa superior que marque con sangre en el capilar. Solamente se lee si no han quedado espacios, ni burbujas.

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RECUENTO DE LEUCOCITOS

Aspirar mediante la pipeta de Thoma sangre total hasta el enrose de 0.5 y limpiar la punta de la pipeta. Aspirar líquido de turk hasta el enrose de 11. Con el dedo índice tapar la parte superior de la pipeta y con el dedo pulgar la parte inferior y mezclar suavemente. Desechar las tres primeras gotas. Llenar la cámara. Realizar la observación y conteo en 10X. Contar los leucocitos presentes en los 4 cuadrados grandes (los de las 4 esquinas), se cuentan las células contenidas en el interior del área de recuento y las que sean tangente o secantes a las líneas de demarcación superior y derecha. El total de leucocitos en los 4 cuadrados se multiplica por 50 y este será el valor del recuento r ecuento de leucocitos. RECUENTO DIFERENCIAL

En la lámina una vez coloreada se lee con objetivo de 100X las células vistas hasta llegar a 100 células contadas. La lectura se realiza en sentido vertical y de derecha a izquierda buscándose con anterioridad en 10X la zona ideal, en la parte media del frotis. Cada valor se dará en porcentaje de células vistas. Es importante diferenciar los tres tipos de células que podemos observar: ♦ Células nucleadas (leucocitos) con función f unción defensiva.

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  Células anucleadas (hematíes) con función respiratoria. ♦ Seudofragmentos citoplasmáticos (plaquetas) con hemostática.

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función

Los leuc Los leucoc ocit itos os tien tienen en la ca carac racte terí ríst stic icaa de te tene nerr nú núcl cleo eo y orga organé nélo loss citoplasmáticos lo que permite su diferenciación morfológica con los hematíes y las plaquetas. Estos pueden ser: Polinu Pol inucle cleare ares: s: de núcle núcleo o lob lobula ulado do de apa aparie rienci nciaa múl múltip tiple le como los neutrofilos, eosinófilos y basofilos. Mononucleares: núcleo único y redondo como los linfocitos y monocitos.

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Neutrofilos: Es el más predominante, su citoplasma es ligeramente acidófilo (rosa pálido) y contiene abundantes granulaciones distribuidas en todo el citoplasma; el núcleo es de color violeta oscuro y de cromatina densa y esta divido en lóbulos unidos por puentes de cromatina, dando la apariencia de tener varios núcleos, cuando el puen pu ente te es muy muy an anch cho o ad adqu quie iere re forma forma de C si sien endo do pro propi pio o de lo loss cayados o células inmaduras de esta línea granulocítica. Eosi Eo sino nofi filo los: s: Su ci cito topl plas asma ma es esta ta llen lleno o de gra granu nula laci cion ones es de co colo lor  r  naranj nar anjaa que se obs observ ervan an de gra gran n tam tamaño año,, bie bien n ind indivi ividua dualiz lizado adoss y redondos, casi nunca cubren el núcleo, el que se observa de un violeta más tenue que el neutrofilo y por lo general de dos masas. Baso Ba sofi filo los: s: Es el men menos os ab abun unda dant nte. e. su ci cito topl plas asma ma se ob obse serv rvaa de gránulos irregulares que cubren completamente el núcleo y se observan de El color muy oscuro entreser azul y morado. Linfocitos: citoplasma puede escaso o abundante y de color  azull cla azu claro, ro, se obs observ ervan an peq pequeñ ueñas as y esc escasa asass gan ganula ulacio ciones nes de col color  or  rosado a rojo. Su núcleo es redondo y abarca gran parte de la células, se pueden observar espacios en el núcleo que están compuestos por  cromatina laxa. Monocitos: De citoplasma abundante y color gris azulado. Aveces posee pos ee vacuol vacuolas. as. Pos Posee ee gra granul nulaci acione oness fin finas as azu azurofi rofilas las por tod todo o el citoplasma , el núcleo es central por lo general redondo aunque con una o más escotaduras ocupa gran parte del citoplasma, su cromatina es laxa, filamentosa e irregular.

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  Se deb debee inf inform ormar ar la pre presen sencia cia de neu neutró trófil filos os con gra granul nulaci ación ón tóx tóxica ica,, restos nucleares nucleares o normoblasto normoblastos, s, cayad cayados, os, linfo linfocitos citos atípicos atípicos (cuand (cuando o es superior a el 10% del total de linfocitos), reacción leucoeritoblástica que serán contados dentro de las 100 células del recuento diferencial. Ante la presencia de normoblastos realizar la corrección de leucocitos. RECUENTO DE PLAQUETAS

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Se busca busca entre el cue cuerpo rpo y la cola del frot frotis is sang sanguín uíneo eo una zon zonaa de distribución uniforme de hematíes (que no estén amontonados y no se observen observ en grand grandes es espac espacios ios en blan blanco co entre ellos), se cuen cuenta ta la prese presencia ncia de 100 de estos por campo. Así, se contara en cada campo, siendo 10 en total, el número de plaquetas observadas, se suman, se divide por 10 y se multiplica por 21.000, siendo este el valor del número total de plaquetas por milímetro cúbico. ANALISIS DE FROTIS DE SANGRE PEIFERICA

Seleccionamos la zona ideal de lectura en 10X, hacia la parte de la pluma y el cuer cuerpo po de dell fro froti tis, s, do dond ndee las las cé célu lula lass se en endo dosa san n un unas as co con n ot otra rass observándose bien delimitados sus contornos. 

Para valorar el recuento total de blancos, miramos 3 campos en forma vertical verti cal en 10X, homógen homógenos os en cuent cuento o a número de hemat hematíes, íes, contar  la cantidad de células blancas en cada uno de ellos. Promediar y multiplicar este valor por la constante 250, dándonos el valor de leucocitos en mm3. (a+b+c) / 3 X 250 = leuc / mm3 Estos datos son confiables cuando la cantidad de blancos no sobrepasa los 20.000 mm3. Cifras mayores se pueden considerar fuentes de error y es necesario realizar el recuento total por líquido de turk confirmando el valor repitiendo la prueba. Observar la morfología de los leucocitos en 100X e informar: • Cuantitativamente: la cantidad por mm3 como normales, leucocitosis, leucopenia.

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  Cualitativamente: el diferencial, si hay disminución o aumento en alguna de las líneas, morfología normal o las alteraciones observadas en las las dife diferen rente tess líne líneas as.. An Anot otar ar la pres presen enci ciaa de ne neut utró rófi filo loss co con n granulación tóxica, cuerpos de Dohle, degranulados, macropolicitos

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(hiperseg (hiper segmen mentad tados) os),, hip hipolo olobul bulaci ación ón (sí (síndr ndrome ome de Pel Pelger ger – Hue Huet) t) vacuolas; linfocitos atípicos, vacuolados; monocitos vacuolados; eosinófilos y basófilos hiperlobulados, con alteraciones en los gránulos; restos nucleares; núcleos picnóticos; presencia de células inmaduras.

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Para linfocitos atípicos se debe informar: si son mas del 10% (es decir, sumándolos al total de los linfocitos) se deben informar en el diferencial de los 100 leucocitos. Si es menor del 10% del total de linfocitos solo se anotan como: se observan linfocitos atípicos escasos.

En caso de reacción leucoeritoblástica se incluyen por aparte dentro del recuen rec uento to dif difere erenci ncial. al. Ade Además más la pre presen sencia cia de nor normob moblas lastos tos deb deberá erán n incluirse como se menciono. En caso de reacción leucoblástica o desviación a la izquierda también se deberá incluir en el recuento diferencial). 

Observar en 100X los eritrocitos para determinar y valorar: el tamaño o anisocitosis, el color, la variación de formas o poiquilocitosis y, la inmadurez globular o policromatofilia que es la presencia de hematies con tonalidad gris azulada y de mayor tamaño. • La anisocitosis se puede cuantificar así: Se determina al compararlos con los linfocitos pequeños, un glóbulo rojo normal debe tener el mismo tamaño de un linfocito. Se cuantifica en 10 campos: Normal Ligera Moderada Marcada 0–5 6 – 15 16 – 30 mayor 30 El tamaño se relaciona con el VCM 76 – 96 fl. Puede ser normocítico, microc mic rocíti ítico co o mac macroc rocíti ítico, co, par paraa est estos os dos últ último imoss se inf informa orma lig ligera era,, moderada o marcada. De acuerdo al VCM: Macrocitosis:

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  Ligera H 95 – 108, M101 – 108; moderada 109 – 120; marcada m arcada mayor de 120. Microcitosis: Ligera 76 – 80, moderada 66 – 75, marcada menor de 65. •

El color dado normocrómico como: Normal 0- 5

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por la cantidad de hemoglobina presente puede ser  o hipocromía. Esta última se determina en 10 campos Ligera 6 – 15

Moderada 16 – 30

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Marcada mayor 30

Para la poi Para poiqui quiloc locito itosis sis se deb debee inf inform ormar ar la for forma ma pre preval valent entee y cuantificar así: Normal Ligera Moderada Marcada 0 1–5 6 – 15 mayor de 15

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Pueden ser: esferocitos, ovalocitos, estomatocitos, codocitos, dacriocitos, esquitocitos, queratocitos, acantocitos, knizocitos, célula falciforme. La policromatofilia y los reticulositos (se valoran con coloración de azul de cresil brillante) son proporcionales en 10 campos, pero solo determinaremos la policromatofilia como: Normal Ligera Moderada Marcada 0–2 2–3 3–4 mayor 4 •

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Además se debe informar la presencia de inclusiones como punteado basófilo, cuerpos de Howell Jolly, cuerpos de Heinz, anillos de Cabot, restos nucleares, parásitos y normoblastos si los hay.

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Para las plaquetas se debe informar si son normales en número y morfología. Si no se solicito antes un recuento de plaquetas que nos de un valoración de la cantidad se observa 100X, 10 campos en proporción cada uno de 100 hematíes y se debe encontrar de 7 a 21 plaquetas plaqu etas por campo para considerar considerarlas las normal, , en casos contra contrarios rios se informa trombocito trombocitosis sis o trombocit trombocitopeni openiaa y la morfología cua cuando ndo se encuentran mas de 3 macroplaquetas lo que se debe informar o por  el contrario microplaquetas.

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  NORMOBLASTOS

Ante la presen Ante presencia cia de no normob rmoblas lastos tos se deb debee rea realiz lizar ar la correc correcció ción n de leucoc leu cocito itos. s. En est estee rec recuen uento to inter interfie fiere re los nor normob moblas lastos tos y los resto restoss nucleares. Se corrigen siempre que se encuentren mas del 10% al realizar  el recuento diferencial. Deberán ser anotados a medida que se realice el recuento diferencial anotán ano tándol dolos os ape apearte arte y se inf inform ormaa la can cantid tidad ad de nor normob moblas lastos tos en1 en100 00 células blancas contadas.

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FORMA DE CORRECCION: 1. Hacer el recuento diferencial. 2. Saber cuánt cuántos os normobla normoblastos stos o cuan cuantos tos restos nuclea nucleares res se obtu obtuvieron vieron en este recuento. 3. Conocer el recuento tota totall de blancos.

Leucocitos corregidos: número de leucocitos contados X 100 / número de normoblastos + 100 Recuento total de leucocitos por mm3 por cualquier método, es decir, automatizado o manual por líquido de Turk. X 100 % que es le número de leucocitos contados para el diferencial / (100 % que es el número de leucoc leu cocito itoss cont contado adoss para el di difere ferenci ncial al + el % de rest restos os nuc nuclea leares res o normoblastos contados en el diferencial). Ejemplo: 7.500 mm3 de leucocitos por líquido de turk  100 % de células contadas para el diferencial 20% de restos nucleares o normoblastos hallados en el diferencial 7.500 mm3 de leu 7.500 leucoc cocito itoss X 100% 100% tot total al de cél célula ulass con contad tadas as en el diferencial / 12 120% 0% = 6.250 mm3 de leucocitos corregidos.

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  LINEA MEGACARIOCITICA 

MEGACARIOBLASTO: De tamaño grande, núcleo con cromatina laxa, presencia de nucleolo, citoplasma intensamente azul, sin gránulos, presenta prolo gránulos, prolongac ngaciones iones a modo de seud seudópodo ópodoss útile útiless para su identificación morfológica.

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PROMEGACARIOCITO: De mayor tamaño que la anterior, núcleo multilobulado, citoplasma basófilo con abundantes granulaciones y desflecado.

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MEGACAROC MEGACA ROCITO ITO:: Es el de may mayor or tam tamaño año.. Gra Gran n cit citopl oplasm asmaa de colo co lorr gris grisác áceo eo y rep reple leto to tota totalm lmen ente te de grán gránul ulos os azur azuróf ófil ilos os,, gran gran número de los cuales se agrupan y rodean lo que se denomina una membrana membra na de demarc demarcación ación.. La fragme fragmentaci ntación ón final del citop citoplasma lasma dará origen a las plaquetas.

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PLAQUETAS: Se observan de pequeño tamaño, de color rosado y con gránulos en su interior.

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LINEA ERITROIDE

La maduración eritropoyética se caracteriza por: 1. El au aumen mento to prog progre resi sivo vo de la acid acidof ofil ilia ia ce celu lula lar, r, má máss qu quee la lí líne neaa mieoloide. 2. Desaparición de todos los organel organelos os citoplasmátic citoplasmáticos. os. 3. Su núcleo es más central y pequeño pequeño que la llínea ínea granulocítica. 

PROERITOBLASTO: Gran tamaño, intensa basofilia citoplasmática, núcleo grande con cromatina laxa, alrededor del núcleo se observa como com o enca encaje, je, en el que pued pueden en apre aprecia ciarse rse dos o más núcle núcleolo olos, s, aunque son muy difusos.

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ERITOBLASTO BASOFILO: Es de menor tamaño que la anterior, la cromatina es más burda como grumos y los nucleolos poco distinguibles o completamente ausentes. El citoplasma conserva su intensa basofilia, núcleo más central. 12

 

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ERITOBLASTO POLICROMATICO: Es de menor tamaño que la anterior, su citoplasma es de color gris azulado, cromatina gruesa e irregularmente condensada se nota como un tablero de ajedrez.

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ERITOBLASTO ORTOCROMATICO: Su tamaño es un poco menor  a la anterior sin ser muy notoria la diferencia, núcleo picnótico, más pequeño y más condensado, citoplasma gris rosado.

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RETICULOCITO:: Tiene un tamañ RETICULOCITO tamaño o un poco mayor que el he hematie matie,, no tiene núcleo, citoplasma de tono azulado, con coloración supravital revela un retículo granulofilamentoso. LINEA GRANULOPOYETICA

Es cara caract cter erís ísti tico co qu quee el nú núcl cleo eo dism dismin inuy uyaa de ta tama maño ño en rela relaci ción ón al citoplasma. 

MIELOBLASTO:: Citop MIELOBLASTO Citoplasma lasma azula azulado do y granu granulacio laciones nes primar primarias ias o azurófilas muy escasas o inexistentes. Cromatina muy laxa con dos o tres nucleolos definidos definidos y os oscuros, curos, el núcleo ocupa la mayor parte de la célula quedando solo una pequeña cantidad del citoplasma.

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PROMIELOCITO: De mayor tamaño que la anterior, con abundante granulación azurófila (se observan rojos, toscos y grandes) citoplasmática. Los redondo gránulosyson visibles engrande, el núcleo en el citoplasma. Núcleo relativamente aúncomo se pueden distinguir los nucleolos. El citoplasma es azul con una zona relativamente clara alrededor del núcleo.

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MIELOCITO: De menor tamaño que la anterior, la cual se caracteriza por la gran abundancia de granulaciones específicas citoplasmáticas. Según su naturaleza se clasifican en neutrófilo, eosinófilo y basófilo. El núcleo contiene una cromatina más condensada que la del prom promie ielo loci cito to,, es ex excé cént ntri rico co y no po pose seee nu nucl cleo eolo los. s. Es de forma forma redonda u ovalada.

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METAMIELOCITO: De menor tamaño que la anterior con núcleo excéntrico, presenta una ligera invaginación dando aspecto de frijol, citoplasma rosado.

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EN BA BAND NDA A O CA CAYA YADO DO:: La inva invagi gina naci ción ón es má máss pro pronu nunc ncia iada da arqueando la totalidad del núcleo, que se va a lobular generalmente a neutrófilo, eosinófilo o basófilo según los gránulos que se observan cerca del núcleo.

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LINEA MONOCITICA

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MONOBL MONO BLAS ASTO TO:: So Son n si simi mila lare ress a los los mie mielo lobl blas asto toss y di difí fíci cill de diferenciar difere nciar entre sí. El citoplasma es basófilo basófilo y tiene tienen n un halo pálid pálido o alrededor del núcleo. El núcleo tiene una cromatina fina, suave y homogénea que se ve interrumpida por los núcleolos, que pueden ser  de 2 a 4 redondos y de color azul claro.

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PROMONOCITO: Tiene un núcleo regular e irregular, citoplasma azul grisáceo más abundante que en el monoblasto. Escasos gránulos azurófilos, el citoplasma presenta ligeras prolongaciones simulando pseudópodos.

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MONOCITO: Núcleo irregular en forma de frijol. Un pliegue en el núcleo es bastante característico. La cromatina es fina e irregularmen irregu larmente te distri distribuid buida. a. El citop citoplasma lasma es de colo colorr azul – grisá grisáceo. ceo. Casi siempre contiene gránulos azurófilos. HISTIOCITOS

Son los monocitos que de sangre periférica pasan a los diferentes tejidos, con actividad macrofágica. Sus características dependen del tejido al cual ha migrado: NOMBRE TEJIDO Histiocitos Conjuntivo Células de Kupfer Hígado Macrófagos alveolares Pulmón Macr. Ma cr. de co cord rdon ones es y se seno noss es espl plén énic icos os 14

Ba Bazo zo

 

  Células sinusoidales Macrófagos medulares Macrófagos de las serosas Osteoclastos

Ganglio linfático Médula ósea Pleura y peritoneo Hueso

Células de la microglia

Sistema nervioso

Los histiocitos son células grandes con abundante citoplasma que contiene vacuolas digestivas y/o partículas fagocitadas bien visibles, de núcleo excéntrico. El citoplasma es azul claro o gris azulado, con o sin gránulos. Algunos pueden presentar seudópodos obtusos, sin gránulos. Otros bordes citoplasmáticos dilacerados, característicos de células tisulares fijas que han sido arrancadas de su sitio normal.

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LINEA LINFOIDE 

LINFOBLASTO: Tiene la cromatina homógena y delicada pero es un poco más burda que la de los mieloblastos y monoblastos. Tiene uno o dos nucleolos, escaso citoplasma azul, sin gránulos y un halo claro perinuclear.

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PROLINFOCITO: Más basófilos que los linfocitos, más grandes, de núcleo núc leo lig ligera eramen mente te excént excéntric rico, o, con un nuc nucleo leolo, lo, cro cromat matina ina men menos os densa que el linfocito, el citoplasma a veces parece rugoso y granula granular. r. LINEA PLASMOCITICA

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PLASMOBLASTO: Célula de tamaño intermedio. Por lo general es redonda pero no necesariamente, de núcleo grande con cromatina fina y presencia de nucleolo bien definido, citoplasma de color azul oscuro y algunas veces se puede observar una zona clara perinuclear.

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PROPLASMOCITO: PROPLASMOC ITO: forma oval ovalada, ada, núc núcleo leo excén excéntrico trico grand grandee que contiene el nucleolo, mayor cantidad de citoplasma que presenta color  azul intenso y la zona clara perinuclear se observa mejor.

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PLASMOCITO: el núcleo es muy excéntrico con una cromatina muy condensada da el aspecto de radios de rueda, el citoplasma ha tomado 15

 

  forma ovalada. El citoplasma citoplasma no es granuloso granuloso pero sí de gran tamaño contrario al linfocito, se tiñe de azul oscuro y presenta una brillante translucidez o zona clara. HEMOCLASIFICACION

Si el paciente llega únicamente con orden de hemoclasificación, se toma la muestra del pulpejo de su dedo índ índice. ice. Se limpia la zona con algodón impregnado con alcohol antiséptico, se deja secar a temperatura ambiente toma una lanceta y se punciona por la zona del lado del pulpejo del dedo, se de desc scar arta ta la prim primer eraa go gota ta y se toma toma tr tres es go gota tass en un unaa lá lámi mina na portaobjetos, separadas entre sí, se colocara una torunda de algodón en la zona puncionada y se le dirá al paciente que la sostenga por un minuto.

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La lámina portaobjetos en su posición horizontal se divide en 3 partes, en cada una en la parte superior se marca como A, B y D. Cada gota se colo co loca ca de deba bajo jo de cada cada letra letra y se apli aplica can n lo loss reac reacti tivo voss de dell jueg juego o de hemoclasificadores, en la zona A, se aplica una gota de Anti A, en la zona B una gota de Anti B y en la zona d una gota de Anti D. Para los dos primeros espacios se determina el grupo sanguíneo y para el último el Rho. Si solo se observa aglutinación en la zona A, el paciente es grupo A; si solo se observa aglutinación el la zona B, el paciente es grupo B; si la aglutin aglutinación ación eess para las dos zona zonas, s, el pacien paciente te es grupo AB y si no se observa observa aglutinac aglutinación ión para n ningun ingunaa de las dos zo zonas, nas, el paciente es grupo sanguíneo O. En la zona D la presencia de aglutinación nos indica rho positivo y la no aglutinació aglutinación n un rho negativo. Si la orden además indica otro examen que implique la toma de tubo con EDTA, la muestra será tomada del mismo tubo y no se puncionara al paciente en su dedo índice. DETERMINACION DE GRUPO SANGUINEO PRINCIPIO BOLOGICO DE LA PRUEBA

Se basa en la hemaglutinación directa. La incubación de los hematíes muestra con el reactivo Anti A, Anti B, Anti D produce una reacción específica de antígeno - anticuerpo, si el correspondiente antígeno esta

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  presente presen te en los hem hematí atíes es mue muestr stra. a. La reacci reacción ón es dem demost ostrad radaa por la aglutinación visible. La no aglutinación indica ausencia del antígeno para cada uno de los reactivos siempre que se hayan cumplido correctamente la indicaciones del procedimiento. DESCRIPCION DEL PRODUCTO

Los reactivos son preparados de pool de suero humano obtenidos de donantes inmunizados. Deben almacenarse de 2-8°C, no congelar. Si se observ observaa tur turbid bidez ez no emp emplea learlo rlo,, pue puede de pre presen sentar tar con contam tamina inació ción n bacteriana bacte riana o deter deterioro ioro del produ producto, cto, tampoco usarlo después de la fecha de vencimiento. El material biológico con los que se preparó el reactivo fue sometido a pruebas de HBsAg y Anti VIH dando negativo, sin embargo, se deben manipular como si fueran material sospechosos de infección.

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MUESTRA

No se requiere preparación especial del paciente para obtener la muestra. Se puede tomar muestra venosa (usando anticoagulante) o por punción capilar en este caso si la prueba se realiza de una vez sin retrasos para evitar que la muestra se seque. Lavado de glóbulos rojos de pueden almacenar en solución preservante de 2-8°c por no más de 35 días. GOTA GRUESA

Puede hacerse con sangre con anticoagulante o de gotas obtenidas por  punción, que se obtienen de la parte lateral de la yema del dedo medio de la mano y en niños pequeños del dedo gordo del pie. Se debe limpiar la piel con alcohol, se deja secar, se punciona con lanceta desechable y se limpia la primera gota con algodón seco. Se presiona para obtener una gota pequeña. Se coloca dos gotas en una lámina portaobjetos sin tocar la piel, la cual se ha divido imaginariamen imaginariamente te en 3 parte partes, s, una para marcarla en el extremo derecho derech o y los otros dos espac espacios ios para coloc colocar ar cada gota gota.. Se extien extiende de la sangre de cada gota utilizando el ángulo y los primeros 5 mm del borde longitudinal de otro portaobjetos se extiende la gota amanera de “N” para

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  formar un rectángulo de 1,5 a 0.5 cm; se hacen 2 laminas que se dejan secar a temperatura ambiente en posición horizontal, se deben colorear  antes de 2 horas horas de tomadas empleand empleando o la coloración de Field. Limpiar con alcohol la lámina que se utilizó para las gotas gruesas con el fin de evitar la contaminación de las siguientes muestras. Es importante tener en cuenta que el exceso en el tiempo de secado, el alcohol o el calor  pueden fijar la hemoglobina, haciendo inadecuada la muestra para el diagnóstico de malaria.

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P

Primero se hace una precoloración: Se sumerge durante 1 segundo la lámina en azul de metileno fosfatado, se deja escurrir sobre una toalla de papel en posición vertical. Enjuagar con solución amortiguadora rápidamente La coloración se realiza colocando la lámina boca abajo en una superficie cóncava, allí se adiciona el colorante de Field evitando la formación de burbujas que se ha preparado previamente adicionando 3 ml de solución amortiguadora, una gota de solución A y una gota de solución B; se deja actuar por 9 minutos, luego se escurren sobre el papel absorbente y se deja secar.

La observación se realiza en 100X, examinando la gota a partir de uno de sus bordes, y mover la lámin láminaa en breves trazados horizo horizontale ntaless y verticales (zig – zag) en la que se identifica la presencia del parásito, su especie en caso de observarse y el recuento del plasmodium. También se puede hacer extendido coloreando la lámina con 2 ml Wright por 1 minuto y luego 0.5 de buffer Giordano por 6 minutos, se lava con agua de chorro, se escurre y se deja secar a temperatura ambiente en posición vertical. Para hacer el diagnóstico por la lectura de extendido se debe realizar hematocrito al paciente. LECTURA:  Con base en el número de leucocitos. En gota gruesa se cuentan los trofozoitos, esquizontes y gametocitos para P. vivax; y/o trofozoitos y/o gametocitos, aunque ocasionalmente esquizontes para P. falciparum, presentes en los campos microscópicos determinados con

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  10X y 40X donde se encuentre mayor número de leucocitos. Un buen campo microscópico es aquel en donde se encuentran de 10 a 20 leucocitos, mirando los campos hasta que estos sumen 100 leucocitos. Conociendo el número de leucocitos por mm3 se puede calcular la

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cantidad de parásitos en este volumen de sangre. De no vis visual ualiza izarr el par parási ásito, to, se deb deben en obs observ ervar ar 200 campo camposs par paraa calificar la muestra como negativa. Ejemplo: paciente con malaria con un recuento de 8.000 leuc/ul de sangre san gre.. Se est establ ablece ece la pro propor porció ción n de par parási ásitos tos en 100 leu leucoc cocito itoss encontrados: # de parásitos X 8.000 luec/ul de sangre / 100 leucocitos = # de parásitos/ul de sangre.

P



Con base en el número de sangre de la gota gruesa. Se calcula que en una preparación bien hecha, 100 campos microscópicos en 100X, equivalen a 0.2 mm3 de sangre. Puede determinarse la parasitemia contando en los 100 campos, los trofozoitos y esquizontes presentes.



Con base en el número de eritrocitos. En un extendido de sangre periférica se busca el porcentaje de eritrocitos parasitados por  trofoz tro fozoit oitos os y esq esquiz uizont ontes es pre presen sentes tes en 10. 10.000 000 erit eritroc rocito itos, s, lo que equivale a 100 campos microscópicos, asumiendo que cada campo tiene tie ne igu igual al cantid cantidad ad de eri eritro trocit citos. os. Se bus busca ca cam campos pos en don donde de la distri dis tribuc bución ión de los eri eritro trocit citos os sea homog homogéne éneaa y no se encue encuentr ntren en superpuestos, hacia el segundo tercio del extendido. Ejempl Eje mplo: o: ser serían ían nec necesa esario rioss 33 cam campos pos mic micros roscóp cópico icos, s, si hay 300 eritrocitos por campo.

INFORME DE RESULTADOS:  Con base en el número de leucocitos: Para los casos de P. vivax no se debe hacer recuento ni diferenciación entre las formas sexuadas y as asex exua uada das. s. En los los ca caso soss de P. fa falc lcip iparu arum m se de debe be in info forma rmarr po por  r  separado separ ado las formas sexuada sexuadass y asexu asexuadas. adas. En las infeccion infecciones es mixt mixtas as se debe registrar primero el parásito prevalente y luego la especie subordinada. Ejemplos: •

Hemoparásitos: Negativo. 19

 

  • • •

• •

•

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

Hemoparásitos: Positivo para P. vivax. Hemoparásitos: Positivo para P. falciparum (50.000 trofozoitos/ul). Hemoparásitos: Positivo para P. falciparum (100 trofozoitos/ul y 5 gametocitos/ul). Hemoparásitos: Positivo para P. falciparum (200 gametocitos/ul). Hemoparásitos: Positivo para infección mixta: P. vivax (5.000 parásitos/ul) y P. falciparum ( 2.000 trofozoitos/ul). Hemoparásitos: Positivo aunque no se puede precisar la especie. Se sugiere nuevo examen.

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Con base en el número de sangre de la gota gruesa. El recuento semi cuan cu anti tita tati tivo vo co cons nsis iste te en info informa rmarr la espe especi ciee de Pl Plas asmo modi dium um qu quee ocasiona la infección y el número aproximado de parásitos encontrados.

1 – Así: 10 en 100 campos microscópicos 11 – 100 en 100 campos microscópicos 1 – 10 por campo microscópico mayor de 10 por campo microscópico

+ ++ +++ ++++

En las infecciones por P. falciparum, por la facilidad en el reconocimiento de los gametocitos de los trofozoitos, es posible informar  separadamente las forma sexuales de las asexuadas. Ejemplo: Hemoparásitos: Positivo para P. falciparum: trofozoitos ++ y gametocitos + Hemoparásitos Positivo para P. vivax ++. 

Con base en un extendido de sangre periférica. Para determinar el número de parásitos en 10.000 eritrocitos serian necesarios 33 campos si hay 300 eritrocitos por campo microscópico. Para un hematocrito de 40% estimamos que el paciente tienen 4.000.000 eritrocitos/ul de sangre. Ejemplo: # parás parásitos itos X # de eritro eritrocitos citos/ul /ul de sangre / 10.00 10.000 0 eritro eritrocitos citos = parásitos/ul de sangre

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  3 eritrocitos/ul = hematocrito x 100.000 reemplazando y simplificando: # de parási parásitos tos en 10.00 10.000 0 eritro eritrocitos citos parásitos/ul de sangre.

X

hemato hematocrito crito

X

10

=

#

Se indica la presencia y la cantidad de formas presentes.

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COMPARACION DE LAS ESPECIES DE PLASMODIUM EN EXTENDIDO P. vivax Agr Agranda andado dos, s, páli pálido dos. s. Punteado fino (punteado de Sc Schu huff ffne ner, r, punt puntos os peque peq ueños ños de rosa rosa a ro rojo joss que que au aum ment entan con con int inten ensi sida dad d co con n el crecimiento del parásito, numerosas). Inicialmente invade los reticulocitos, Marginale ales raras

P. falciparum No agrand agrandados ados.. Color  Color  normal, Punteado grueso (hendiduras de Maurer, puntos rojos generalment generalmentee escasos.). Invade todos los eritrocitos. *

Grande Anillos grandes (1/2 a 1/3 del diám diámet etro ro de lo loss eritrocitos) a veces con citoplasma ameboide o

Pequeño Anillos muy pequeños (1/5 del di diám ámet etro ro de lo loss hematies). Muchas veces dos gránulos o dos puntos

amorfo amor fo,, va vacu cuol olad ados os.. Generalmente un gránulo de cromatina, ocasionalmente granulaciones de Shuffner. Pigmento en los trofozoitos Partículas finas de color  en desarrollo pardo ligero ligero carmelito, carmelito, amarillento, diseminados, en el citopl citoplasm asmaa del parásito, en los esquizontes se condensan en una masa única. Trofoz Tro fozoit oitos os viejos viejos Muy pleom pleomorf orfos, os, rico rico en

de cromatina; infecciones múltiples; anillos delicados y re regu gula lare res; s; pu puede eden n adherirse a los eritrocitos.

G. G.R R para parasi sittad ados os

Forma especiales del parásito Tamaño del parásito Fase de anillo de los trofozoitos (T. Jóvenes)

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En “i”, “”, cand ndeelabr bro o.

Grumos burdos de color  negro negr o o carmel carmelit ito o oscuro oscuro,, escasos, dispersos en el citoplasma del parásito. En lo loss es esqu quio iozo zont ntes es se condensa en una masa única. Comp Compact actos os y red redonde ondeado ados, s,

 

  Esquizontes maduros (segmentados)

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Gametocitos

Distribución en sangre periférica Parasi Par asitem temia ia habitua habituall

citoplasma muy ameboide, vacuola vacu olado, do, aument aumentaa el tamaño del eritrocito. Ocupa generalmente todo el glóbulo rojo. De 12 a 24 merozoitos merozo itos.. Posee una masa ma sa de pigm pigmen entto malárico, malár ico, granulacione granulacioness Shuffner. Redondos u ovales, grandes, ocupa por lo general gene ral todo todo el eritr eritroci ocito, to, cromatina abundante laxa puede pue de se clar claram amen ente te distinguible (mac (m acro roga game meto toci cito to feme femeni nino no)) o di difu fusa sa

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presencia de granulaciones de Maurer * De 2 a 4 merozoitos. Muy raros rar os en sangre sangre perifé periféric ricaa pero puede llegar a tener de 8 y 40merozoitos.. *

Semilunares o salchicha. Masa de cromatina central rodeada rod eada por pigmen pigmento to malárico en forma de bastones.

(microgametocitomasculino) Todas las formas.

Solamente anillos y semilunas (gametocitos). * Hasta Hasta 30.000 30.000 /ul de sangre sangre.. Hasta Hasta más más de de 200.00 200.000 0 / ul. Comúnmente 50.000 / ul

* Ordinariamente solo se observan etapas de anillo o gametocitos en sangre periférica con P. falciparum; las etapas consecutivas a la fase de anillo hacen adherentes a los eritrocitos y tienden a ser retenidos en los lechos capilares profundos en infecciones masivas. CARACTERISTICAS DEL PLASMODIUM EN GOTA GRUESA PARASITO Tr Trof ofoz ozoi oito toss jóve jóvenes nes

P. VIVAX Form Formas as de anill anillo o pe pequ queño eño,, aveces abierto mostrando un citoplasma regular o ameboide.

Tr Trof ofoz ozoi oito to madur maduro o

Gr Gran ande de con con vari varied edad ad de form formas as ameb ameboi oide des. s. Vacu Va cuol olaa pres presen entte. Pigmento malárico, color  carmelito. Granulaciones de Shuffner  22

P. FALCIPARUM Anillos muy pequeños, fi fino noss y de deli lica cado dos, s, regulares. regula res. A veces abierto fo form rman ando do fi figu gura ra de i, “” “”,, candelabro. Compact Com pacto o con aspect aspecto o sólido, vacuola pequeña, us usual ualme ment ntee co cont ntie iene ne pi pigm gmen ento to.. Raro Raro de encontrar.

 

  Esquizonte

Gam Ga met etoc ocit itos os

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Grandes, redondos. Gránul Grá nulos os de pigmen pigmento to marrón o negro esparcidos por el citoplasma. De 12 a 14 merozoitos distribuidos irregularmente. Granulaciones de Shuffner  a manera de halo rosado. Redo Redond ndos os oval ovalad ados os con con una ún únic icaa cr crom omat atin inaa grande, pigmento malárico dis distribuido en el citoplasma, granulaciones de Shuffner como halo rosado.

P

Pequeños, Pequeño s, red redond ondos os y co comp mpac acto tos. s. Con Con 2 o má máss merozoitos, una sola masa de pigmen pigmento to malári malárico. co. En in infe fecc ccio ione ness se seve vera rass acompañado de un gran número de trofozoitos. Forma crecie Forma creciente nte de media media lunaa o salchi lun salchicha cha,, tambié también n pu pued eden en de demo most stra rase se redondeados. redonde ados. Cromatina Cromatina ce cent ntra rall ro rode dead adaa de pigmento malárico de color  ne negr gro o a mane manera ra de ba bast ston ones es.. Se pued puedee diferenciar el femenino del masculino.

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