Manual de Procedimientos Bacteriologia CNDR 2004 (2)

Edición 2004 Levantado de Texto: Dr. Sergio López y Sra. Xiomara Aguilar Revisión de texto: Dr. Sergio López, Lic. Victoria Calderón, TM Teresa Videa, Téc. Julissa Ávila, Lic. Javiera Mejía Cuidado de la Edición: Dr. Sergio López Diagramación: Martha Medina Ruiz Diseño de portada: Dr. Sergio López Impresión: Litografía Nicaragüense (LITONIC)

La edición 2004 del Manual de Procedimientos de Bacteriología Médica del CNDR/MINSA fue financiada por el PMSS. Componente “Modernización de Hospitales”

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MARCO LEGAL El presente documento, como Manual de Procedimientos tiene su sustento legal dentro del marco jurídico y regulatorio existente para el Sector Salud, principalmente lo dispuesto en la Constitución Política (Arto.59), Ley No.423 “Ley General de Salud”, su Reglamento y en la Ley Ejecutivo”, y su Reglamento, encaminados a garantizar el derecho a la salud de todos los nicaragüenses. La Ley No. 423 “Ley General de Salud, en su Arto.4 establece: “Corresponde al Ministerio de Salud, como ente rector del Sector, coordinar, organizar, supervisar, inspeccionar, controlar, regular, ordenar y vigilar las acciones en salud, sin perjuicio de las funciones que deba ejercer frente a las instituciones que conforman el sector salud, en concordancia con lo dispuesto en disposiciones legales especiales”. De igual manera, la Ley General de Salud, en su Arto.2 establece que este Ministerio es el órgano competente para aplicar, supervisar, controlar y evaluar el cumplimiento de la presente Ley y su Reglamento; así como elaborar, aprobar, aplicar, supervisar y evaluar normas técnicas, formular políticas, planes, programas, proyectos, manuales e instructivos que sean necesarios para su aplicación. Es responsabilidad de los representantes de establecimientos proveedores de servicios de salud, entre otras consignadas en la Ley General de Salud, y su Reglamento, independientemente de su naturaleza jurídica, garantizar el cumplimiento de los manuales relativos a la salud y estándares de calidad establecidos por el Órgano Rector de la Salud.

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REPÚBLICA DE NICARAGUA MINISTERIO DE SALUD Dr. José Antonio Alvarado Correa Ministro de Salud Lic. Margarita Gurdián Vice Ministra de Salud Dr. Enrique Alvarado Abaunza Secretario General Dr. Alcides González Mairena Director General Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia Equipo Técnico de Bacteriología del CNDR Dr. Sergio R. López Cruz Jefe de Departamento y Coordinador del Equipo de Bacteriología Lic. Victoria Calderón Analista del Departamento de Bacteriología Lic. Juan Carlos Matute Ex-analista del Departamento de Bacteriología TM Teresa Videa Analista del Departamento de Bacteriología Lic. Anielka Baltodano Ex-analista del Departamento de Bacteriología Téc. Julissa Ávila Analista del Departamento de Bacteriología Lic. Javiera Mejía Analista del Departamento de Bacteriología

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Elaborado por el Equipo Técnico Científico del Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia (CNDR) del Ministerio de Salud de Nicaragua: Dr. Sergio R. López:

Capítulos 1, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17

Lic. Victoria Calderón:

Capítulos 2, 6, 13, 17

Lic. Juan Carlos Matute:

Capítulos 3, 7, 14, 15, 16, 17

TM. Teresa Videa:

Capítulos 5, 12, 16, 17

Lic. Anielka Baltodano:

Capítulos 6, 12, 16, 17

Téc. Julissa Ávila:

Capítulos 7, 9, 11, 16, 17

Lic. Javiera Mejía:

Capítulos 6, 8, 10, 12, 17

El presente documento constituye un esfuerzo del Equipo Técnico Científico del Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia del Ministerio de Salud, reservándose dicho Ministerio, todos los derechos de autor conforme lo dispuesto en la legislación civil de la materia. El presente Manual de Procedimientos de Bacteriología Médica, edición 2004, no puede reproducirse o transmitirse por método o forma alguna, sea electrónico o mecánico, incluyendo copias fotostáticas, cintas magnetofónicas, acumulación de información con memoria ni através de ninguna otra forma, sin autorización por escrito del Ministerio de Salud de Nicaragua. www.minsa.gob.ni Complejo Nacional de Salud Dra. Concepción Palacios. PBX (505) 289-4700. Apartado Postal: 107. Managua.

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Indice Página Presentación ........................................................................................ ix Prólogo .............................................................................................................................................................. xi Capítulo 1.

Conceptos fundamentales para comprender la enfermedad infecciosa ................. 1

Capítulo 2.

Control de calidad en bacteriología ................................................................................. 5

Capítulo 3.

Procedimientos para la tinción de Gram ....................................................................... 15

Capítulo 4.

Procedimientos para la identificación de enterobacterias ....................................... 19

Capítulo 5.

Procedimientos para el aislamiento de enterobacterias y otras bacterias menos frecuentes en el urocultivo ...............................................35

Capítulo 6.

Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas ..........................................................................................................43

Capítulo 7.

Capítulo 8.

6.1

Procedimientos para la identificación de Pseudomonas aeruginosa ..................47

6.2

Procedimientos para la identificación de Acinetobacter spp ............................ 61

6.3

Procedimientos para la identificación de Staphylococcus aureus ....................73

6.4

Procedimientos para la identificación de Enterococcus spp ..............................79

Procedimientos para bacterias aisladas del líquido cefalorraquídeo .....................89 7.1

Procedimientos para la identificación de Haemophilus influenzae ...................93

7.2

Procedimientos para la identificación de Streptococcus pneumoniae ........... 107

7.3

Procedimientos para la identificación de Neisseria meningitidis .................... 115

7.4

Procedimientos para la identificación de Listeria monocytogenes ................. 123

Procedimientos para bacterias aisladas en hemocultivos ....................................... 133 8.1

Capítulo 9.

Procedimientos para la identificación de Streptococcus grupo viridans ............................................................................... 137

Procedimientos para bacterias aisladas en exudado ótico .................................... 147

Capítulo 10. Procedimientos para bacterias aisladas en exudado faríngeo .............................. 151 10.1 Procedimientos para la identificación de Streptococcus pyogenes (Grupo A) y otros ß-Hemolíticos ............................... 153 Capítulo 11. Procedimientos para la identificación de Bordetella pertussis ............................. 165 Capítulo 12. Procedimientos para bacterias aisladas en coprocultivo ......................................... 173 12.1 Procedimientos para la identificación de Shigella spp ...................................... 177 12.2 Procedimientos para la identificación de Salmonella spp ................................. 195 12.3 Procedimientos para la identificación de Eschericha coli 0157:H7 ............... 213 vii

Capítulo 13. Procedimientos para la identificación de Vibrio cholerae .................................... 225 Capítulo 14. Procedimientos para la identificación de microorganismos aislados en exudado vaginal ........................................................................................... 245 14.1 Procedimientos para la identificación de Trichomonas vaginalis .................... 249 14.2 Procedimientos para la identificación de Gardnerella vaginalis ...................... 251 14.3 Procedimientos para la identificación de Mobiluncus spp ............................... 255 14.4 Procedimientos para la identificación de Candida spp ..................................... 257 14.5 Procedimientos para la identificación de otras levaduras ............................... 259 Capítulo 15. Procedimientos para la identificación de Neisseria gonorrhoeae ........................ 263 Capítulo 16. Susceptibilidad antimicrobiana: Procedimientos para la sensibilidad por el método de difusión en Agar............................................................................. 273 16.1 Detección de betalactamasas en Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Staphylococcus spp y Enterococcus spp. Método cromogénico .............................................................................................. 283 16.2 Métodos para la detección de betalactamasas de espectro extendido (BLEE) en bacilos gramnegativos ....................................................... 287 16.3 Determinación de Cloranfenicol Acetil Transferasa (CAT) ............................ 293 16.4 Lista oficial de discos de susceptibilidad y tablas de discos con antimicrobianos que deben emplearse según bacterias ............................ 297 Capítulo 17. Fundamentos fisiológicos y bioquímicos de las pruebas......................................... 305

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REPÚBLICA DE NICARAGUA MINISTERIO DE SALUD CENTRO NACIONAL DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA

PRESENTACIÓN El propósito de esta nueva edición del Manual de Procedimientos de Bacteriología Médica sigue siendo como en las anteriores ediciones, poner a la disposición de todos los Especialistas de Laboratorio que laboran en esta área de la ciencia, los últimos conocimientos y metodologías en bacteriología en forma sencilla y didáctica, tomando en cuenta las disposiciones normadas por los organismos internacionales para este tipo de textos. No se puede hablar de Bacteriología sin recordar algo de la historia de esta disciplina científica. Si bien es cierto que la humanidad ya utilizaba los microorganismos desde épocas muy remotas para elaborar pan, cerveza, quesos y vinos, lo hacían por intuición y sin conocerlos verdaderamente. Fue necesario el desarrollo de la microscopia que se inició en el siglo XVII, para que en verdad la bacteriología emergiera como conocimiento real de los microorganismos. Sin duda, Pasteur y Koch son los padres de esta ciencia y a partir de ellos se inicia un desarrollo sostenido a lo largo de los años hasta culminar con los últimos avances alcanzados que han llegado al surgimiento de ramas cada vez más vigorosas y especializadas como la Virología, la Inmunología, la Biología Molecular con sus aplicaciones biotecnológicas no sólo médicas, sino en la agricultura, la ganadería y la industria. Han pasado varios años desde la última edición que hiciera el Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia (CNDR) del MINSA de un Manual de Procedimientos de Bacteriología y por eso el Ministerio de Salud ha apoyado al equipo de científicos del CNDR en la elaboración del presente Manual. Estos procedimientos de laboratorio están basados en las normativas de la Ley General de Salud y deben de servir para que todos los que laboran en bacteriología en el país tengan una guía clara y precisa de los procedimientos más frecuentemente utilizados. Felicitamos al equipo de trabajo del CNDR del Ministerio de Salud, que luego de varios años de esfuerzo han logrado concretar la edición de este Manual. Con la firme convicción de que este Manual servirá para mejorar la calidad de la atención a nuestros conciudadanos, les saludo.

José Antonio Alvarado C. Ministro de Salud

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Prólogo El Manual de Procedimientos de Bacteriología Médica ha tenido una transformación total en relación a la Tercera Edición. El Manual dejó de ser de Normas para transformarse en uno de Procedimientos. La razón es que esto permite una mejor utilización como herramienta de docencia sin soslayar los exhaustivos pasos para realizar los procedimientos o técnicas que se requieren en la identificación de las bacterias y su respectiva sensibilidad a los antimicrobianos. El principal eje del Manual es la identificación de bacterias que están asociadas a los problemas infecciosos bacterianos más comunes en los hospitales y la comunidad. Para ello se están siguiendo los métodos recomendados por las instituciones que funcionan como centros subregionales para el control de calidad de las subredes latinoamericanas que vigilan la resistencia a los antimicrobianos, de las cuales es miembro el CNDR/Nicaragua: Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas (INEI) de Argentina, Instituto Nacional de Salud (INS) de Colombia y National Laboratory for Enteric Pathogens (NLEP) del Canadian Science Centre for Human and Animal Health, Canadá. El formato de identificación que se incorporó fue el de las Normas ISO 17025, aunque el propósito no fue mas que acercar esta Cuarta Edición a una posible edición futura siguiendo meticulosamente los parámetros que dichas normas demandan. El capítulo 2 que aborda de manera suscinta pero profunda el control de calidad en bacteriología es nuevo. El capítulo 4, sobre los procedimientos para la identificación de enterobacterias ha sido reelaborado totalmente en base a facilitar la identificación de las mismas utilizando diagramas de flujo y no tablas. Esto requirió un largo período de prueba en el Departamento de Bacteriología hasta garantizar la certeza y facilidad de uso. El tema de los procedimientos para la sensibilidad antimicrobiana se aborda por primera vez de manera exhaustiva y profunda, incluyendo pruebas especiales como la detección de betalactamasas, betalactamasas de espectro extendido y cloranfenicol acetiltransferasas. La guía para el uso de discos de sensibilidad según bacterias fue revisada, ampliada y enriquecida con todas las notas que indican su valor predictivo, así como sus límites, según las normas NCCLS 2004. Todo esto en vista de la vigencia del grave problema de la resistencia a los antimicrobianos a nivel mundial. Por último, para poder garantizar el empleo de este Manual, fue requerido que la Lista Básica de Insumos de Bacteriología del MINSA fuera ampliada, tanto en medios de cultivo, reactivos y discos de sensibilidad, después de una exitosa coordinación con la Dirección de Normación de Insumos Médicos. Deseamos agradecer el formidable y paciente trabajo para la presente edición realizada por la señora Xiomara Aguilar, quien hizo posible una mejor presentación del Manual.

Dr. Sergio López Coordinador de la Cuarta Edición xi

CAPÍTULO 1.

Conceptos fundamentales para comprender la enfermedad infecciosa I. INFECCIÓN: Es el establecimiento de la interacción entre el huésped y el agente (microorganismo). Debido a que sólo requiere la presencia del microorganismo en el huésped, la interacción huésped-agente ocurre frecuentemente. Cuando el microorganismo entra y se instala en el huésped, su siguiente fase es la proliferación. Esto no implica necesariamente daño al huésped ni reacción del mismo.

1. COLONIZACIÓN: Es la instalación y proliferación del agente en el huésped. No implica ningún tipo de interacción. Cuando nace un niño, a las pocas horas le han colonizado varios microorganismos en su piel, intestino y garganta. A partir de ese momento se considera que existe una infección, es decir, el establecimiento de la interacción es de comensalismo y en el mismo, no hay daño o injuria contra el huésped.

II. ENFERMEDAD INFECCIOSA: Cuando hay manifestaciones clínicas como resultado de la injuria al huésped por parte de microorganismos. El carácter de la interacción ha variado: el microorganismo está produciendo daño.

III. PATOGENICIDAD: Es la capacidad de los microorganismos de producir daño. Como no todos tienen la misma capacidad, la magnitud que existe para producir ese daño es la manera de determinar si es más patógeno o menos patógeno.

IV. VIRULENCIA: Es la magnitud de patogenicidad que tienen los microorganismos. La virulencia se determina por la capacidad de invadir tejidos (invasividad) o producir toxinas (toxigenicidad).

1. INVASIVIDAD: Capacidad de expandirse y dañar tejidos. Algunos microorganismos son virulentos por su invasividad: En la faringoamigdalitis bacteriana el Streptococcus pyogenes se expande por la faringe y destruye el tejido debido principalmente a la hialuronidasa. Las manifestaciones clínicas se deben a la invasividad. Capítulo 1: Conceptos fundamentales para comprender la enfermedad infecciosa

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PROCEDIMIENTOS

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

2. TOXIGENICIDAD: Capacidad de producir sustancias que causan las manifestaciones clínicas más importantes. Algunos microorganismos son virulentos por su toxigenicidad:

2.1. Vibrio cholerae 01: Coloniza temporalmente el intestino delgado y produce una exotoxina. Las manifestaciones clínicas se deben a la toxina. En los dos ejemplos anteriores ha habido una infección, pero como los microorganismos han producido daño, se ha producido una enfermedad infecciosa. En ambos casos los microorganismos son patógenos y su virulencia la han manifestado de dos formas distintas. Algunos microorganismos son más patógenos que otros:

2.2. Shigella dysenteriae 1: Se necesita alrededor de 200 bacterias para desencadenar disentería. Hay invasión al tejido intestinal (a veces perforación). Elabora una exotoxina que produce diarrea y luego deshidratación.

2.3. Vibrio cholerae 01: Se necesitan alrededor de 100 millones de bacterias para desencadenar la diarrea. No hay invasión a los tejidos. Elabora una exotoxina que produce diarrea y luego deshidratación.

2.4. Shigella dysenteriae 1: Es más patógena que Vibrio cholerae 01 por que con menores cantidades y más mecanismos virulentos produce mayores daños a un individuo. Cualquier miembro de la microbiota local puede producir enfermedad si previamente se le abre una puerta de entrada a los tejidos, ya que ellos por sí mismos no tienen capacidad para lograrlo. El agente causal que con más frecuencia se asocia a la endocarditis bacteriana es Streptococcus viridans, un miembro de la microbiota local de boca y faringe. Esta enfermedad ocurre en personas con daño en las válvulas cardíacas, después de extracciones dentales o lavados vigorosos de dientes que abren la puerta de entrada al estreptococo. En este o cualquier otro caso, a los microorganismos de la microbiota local que producen enfermedad se les denomina OPORTUNISTAS. Un microorganismo oportunista no es patógeno en tanto es miembro de la microbiota local, pero se convierte en patógeno cuando con mecanismos ajenos a ellos penetran e invaden tejidos cercanos o lejanos. Los mecanismos o puertas que facilitan esta entrada son varios, pero he aquí algunos ejemplos: heridas, traumatismos, enfermedades sistémicas como diabetes, administración prolongada de antimicrobianos, o por infecciones virales previas.

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Capítulo 1: Conceptos fundamentales para comprender la enfermedad infecciosa

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PROCEDIMIENTOS

DE

BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

Aquí una pequeña lista de enfermedades producidas por oportunistas: a. b. c. d. e.

Sinusitis Otitis media y externa Infección urinaria Neumonía Peritonitis aguda por traumatismos

En cambio, cualquier microorganismo que no es parte de la microbiota local pero que necesita al humano como huésped para perpetuar el ciclo de la infección (ejemplos: gonococos, shigellas, estreptococos beta hemolíticos del grupo A) son patógenos estrictos ya que cuentan con mecanismos genéticos propios para desencadenar la enfermedad. Algunas veces estos microorganismos no la producen y se pueden aislar en personas sin sintomatología. A estas personas se les denomina portadores, pero de igual manera, en algunos casos se les prescriben medicamentos para erradicar a los microorganismos. Aquí una pequeña lista de enfermedades producidas por patógenos estrictos. a. b. c. d. e.

Fiebre Tifoidea Faringoamigdalitis Bacteriana Shigellosis Enfermedad de Lyme Gonorrea

ENFERMEDAD

MICROORGANISMO

OPORTUNISTA

PATÓGENO

VIRULENTO INVASIVO

Endocarditis

VIRULENTO TOXIGENICO

Streptococcus viridans

SI

SI (*)

SI

NO

Streptococcus pyogenes

NO

SI

SI

NO

Shigellosis

Shigella spp

NO

SI

SI

SI

Cólera

Vribrio cholerae 01 y 0139

NO

SI

NO

SI

SI

SI (*)

SI

NO

Faringoamigdalitis

Otitis Externa

Pseudomonas aeruginosa

* Sólo en condiciones especiales.

V. BIBLIOGRAFÍA: 1. Hoeprich PD. Host-Parasite Relationschips and the patogenesis of infecious Disease in Infectious Diseases, Chap 4, Paul D. Hoeprich editor, Fifth edition, 1994, JB Lippicott Co, Philadelphia. 2. Patogenia de la infección bacteriana en Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. Geo F. Brooks, editor, capítulo 9, 16ª edición (de la 21a edición en inglés) 1998, editorial El Manual Moderno S.A. de C.V. México D.F. Capítulo 1: Conceptos fundamentales para comprender la enfermedad infecciosa

3

4

Capítulo 2: Control de Calidad en Bacteriología

CAPÍTULO 2.

Control de Calidad en Bacteriología En bacteriología se tiene en cuenta dos conceptos fundamentales, para medir el control de calidad.

I. EXACTITUD: Es la correspondencia entre los resultados de los análisis y los valores reales medidos a través de un control. Los controles utilizados son cepas estables con respecto a su bioquímica y sensibilidad. Estas cepas se conocen como ATCC (American Type Culture Collection)

II. PRECISIÓN: Es la dispersión de datos obtenidos, para una muestra procesada varias veces. Se debe tener en cuenta que para poder medir la precisión se realiza por medio de la Reproducibilidad, es decir una misma muestra se siembra periódicamente, los resultados deben ser iguales o similares todo el tiempo.

Capítulo 2: Control de Calidad en Bacteriología

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PROCEDIMIENTOS

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

1. MEDICIÓN DE LA EXACTITUD Y PRECISIÓN DE LA SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA: Ejemplo 1 con el antimicrobiano amicacina 30µg y la cepa de Escherichia coli ATCC 25922 (rango NCCLS de 19-26 mm). Gráfica No.1

2. EXPLICACIÓN DE CÓMO INTERPRETAR LOS VALORES DE LAS GRÁFICAS DE LOS EJEMPLOS DE EXACTITUD Y PRECISIÓN: 2.1. Las líneas rojas muestran los puntos de corte superior de 26 mm, e inferior de 19 mm (rango de referencia) de las normas NCCLS. 2.2.

Observamos que la curva azul es nuestro control de calidad, con un valor inicial que está dentro del rango de las normas NCCLS.

Gráfica No. 1. BUENA EXACTITUD Y MALA PRECISIÓN: Es notorio que en los controles semanales (curva azul) hubo buena exactitud, ya que todas las lecturas estuvieron dentro de los rangos, pero no hubo precisión ya que todos los puntos cayeron dispersos del punto inicial (23mm).

30 25

mm

20 15 10 5 0 1

2

3

4

5

6

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SEMANAS

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Capítulo 2: Control de Calidad en Bacteriología

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Ejemplo 2: con el antimicrobiano Sulfametoxazol – Trimetoprim 23.75/1.25µg y la cepa de Staphylococcus aureus ATCC 25923 (rango NCCLS de 24 - 32 mm). Gráfica No. 2.

Gráfica No. 2. BUENA PRECISIÓN Y MALA EXACTITUD: En esta segunda gráfica se observa que la lectura del primer control está dentro del rango esperado. A partir de la segunda semana se observa que los resultados están fuera de rango (mala exactitud) pero con valores muy similares (buena precisión).

35 30

mm

25 20 15 10 5 0 1

2

3

4

5

6 7 SEMANAS

8

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Capítulo 2: Control de Calidad en Bacteriología

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PROCEDIMIENTOS

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

Ejemplo 3: con el antimicrobiano ciprofloxacina 5µg, y la cepa de Staphylococcus aureus ATCC 25923 (rango NCCLS de 22 - 30 mm). Gráfica No. 3.

Gráfica No. 3. BUENA PRECISIÓN Y BUENA EXACTITUD: En esta tercera gráfica se observa que no hubo resultados fuera de rango y que los mismos tienen valores parecidos a los del punto de corte inicial (26mm), por lo tanto, en esta gráfica los resultados son exactos y precisos.

35 30

mm

25 20 15 10 5 0 1

2

3

4

5

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SEMANAS

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Capítulo 2: Control de Calidad en Bacteriología

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

Ejemplo 4: con el antimicrobiano eritromicina 15µg y la cepa de Staphylococcus aureus ATCC 25923 (rango NCCLS de 22 - 30 mm). Gráfica No. 4.

Gráfica No. 4. BUENA EXACTITUD Y MALA PRECISIÓN: En esta gráfica se observa que los resultados semanales están alejados del punto de corte inicial (27mm) pero ninguno de ellos está fuera del punto de corte (buena exactitud). Sin embargo, los valores obtenidos difieren del punto de corte inicial y entre si (mala precisión).

35 30

mm

25 20 15 10 5 0 1

2

3

4

5

6

7

8

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SEMANAS

Capítulo 2: Control de Calidad en Bacteriología

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PROCEDIMIENTOS

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

3. TIPO DE ERROR: La determinación del tipo de error se aplica tanto a los resultados de la bioquímica con los cuales se llega a la conclusión diagnóstica de género y especie, como a los resultados de la sensibilidad antimicrobiana en relación a la interpretación (sensible, intermedio, resistente).

3.1. Error menor (em): 3.1.1. En relación al género y especie: Cuando se reporta el género sin especie (información incompleta) 3.1.2. En relación a la sensibilidad antimicrobiana: Cuando el resultado obtenido es sensible en relación a una cepa control o de referencia que con valor intermedio, cuando el valor obtenido es intermedio y el de la cepa de referencia es sensible, o cuando el valor obtenido es resistente y el de la cepa de referencia es intermedio o cuando el valor obtenido es intermedio y el de la cepa de referencia es resistente.

3.2. Error mayor (ema): 3.2.1. En relación al género y especie: Cuando se reporta el género correcto con especie incorrecta 3.2.2. En relación a la sensibilidad antimicrobiana: Cuando el resultado obtenido es resistente en relación a una cepa control o de referencia que es sensible.

3.3. Error muy mayor o grave (emm): 3.3.1. En relación al género y especie: Cuando se reporta género incorrecto. En este caso, la especie no tiene ninguna trascendencia. 3.3.2. En relación a la sensibilidad antimicrobiana: Cuando el resultado obtenido es sensible en relación a una cepa control o de referencia que es resistente

III. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA FIABILIDAD Y LA REPRODUCIBILIDAD DE LOS RESULTADOS: 1. FUENTES DE ERROR:

1.1. Personal: El rendimiento del auxiliar o técnico de laboratorio depende directamente de la calidad de su formación y adiestramiento, de su experiencia personal, de sus condiciones de empleo y de la actitud que asuma frente a los obstáculos.

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Capítulo 2: Control de Calidad en Bacteriología

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PROCEDIMIENTOS

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1.2. Factores ambientales: Los resultados pueden verse afectados por la falta de espacio, iluminación o ventilación en el lugar de trabajo, las temperaturas extremas, el ruido excesivo o la inseguridad de las condiciones de trabajo.

1.3. Muestras: La procedencia de la muestra, el método de toma de la muestra y el momento de la obtención escapan a menudo al control directo del laboratorio, pero ejercen una influencia directa en la capacidad de éste para obtener resultados fiables. Otros factores que el laboratorio puede controlar y que afectan a la calidad del trabajo son el transporte, la identificación, el almacenamiento y la preparación (procesamiento) de las muestras. Por consiguiente, el laboratorio debe participar en la formación de los que las toman y transportan. Hay que dar al personal clínico y de enfermería instrucciones por escrito, que se deben revisar cada cierto tiempo con ayuda de los interesados.

1.4. Materiales de laboratorio: La calidad de los resultados puede verse afectada por la utilización de insumos de mala calidad o variaciones entre los lotes. La falta de disponibilidad de los mismos incidirá en diagnósticos incompletos o incapacidad de identificación de otros géneros bacterianos. Igual sucede con los reactivos, colorantes y medios de cultivo.

1.5. Método de prueba: Algunos métodos son más sensibles y específicos que otros. Por ejemplo, el hemocultivo para aislar neumococos en caso de neumonías bacterianas tienen una sensibilidad del 8% en relación a la punción pulmonar que es mayor del 80%. Pero esto puede ocurrir en la fase previa al diagnóstico: un pH de un Mueller Hinton tomado con un pHmetro tiene una mayor exactitud que uno tomado con una cinta y por lo tanto se pueden esperar menos errores en el primer caso.

1.6. Equipos: La falta de equipo o el empleo de instrumentos de mala calidad o el mal cuidado dará resultados poco fiables.

1.7. Examen y lectura: La lectura apresurada de los resultados o el examen de un número insuficiente de campos microscópicos pueden ocasionar errores. Por ejemplo, una lectura poco cuidadosa del Gram de un sedimento de LCR puede llevar a la conclusión de ausencia de bacterias o a la conclusión de un grupo distinto al agente causal si la tinción está mal hecha.

1.8. Notificación: La transcripción poco cuidadosa de los resultados da lugar a errores que pueden hacer que un paciente deje de recibir el tratamiento requerido o reciba uno que no es el apropiado. Los resultados de buena calidad pero notificados fuera de tiempo son tan dañinos como si el análisis no se hubiera practicado.

Capítulo 2: Control de Calidad en Bacteriología

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2. CONTROL DE CALIDAD DE LOS EQUIPOS:

2.1. Autoclave: 2.2.1. Limpiar y cambiar el agua cada mes. Utilice agua destilada. 2.2.2. Comprobar y ajustar el nivel del agua antes de cada período de trabajo. 2.2.3. Registrar el tiempo y la temperatura o presión en cada periodo de trabajo. 2.2.4. Registrar el funcionamiento con ampollas de esporas de Bacillus stearothermophilus una vez por semana.

2.2. Horno para esterilizar cristalería: 2.2.1. Limpiar el interior. 2.2.2. Registrar el tiempo y la temperatura de cada periodo de trabajo.

2.3. Incubadora: 2.3.1. Limpiar la superficie interna de las paredes y las parrillas cada mes. 2.3.2. Registrar la temperatura al comienzo de cada jornada de trabajo y al final la jornada (límite, 35oC +/- 2).

2.4. Refrigerador: 2.4.1. Limpiar y descongelar cada 2 meses y después de cualquier interrupción del suministro eléctrico. 2.4.2. Registrar la temperatura dos veces al día (2-8oC).

2.5. Microscopio: 2.5.1. Limpiar los lentes con un paño o papel especial al final de cada jornada de trabajo. 2.5.2. Limpiar y lubricar la platina mecánica cada semana. 2.5.3. Cubrirlo con la funda guardapolvo cuando no se use. 2.5.4. Comprobar cada mes la alineación del condensador.

2.6. Baño de María: 2.6.1. Limpiar la superficie interna de las paredes y cambiar el agua cada mes. 2.6.2. Verificar el nivel del agua a diario y registrar la temperatura en cada jornada de trabajo.

2.7. Centrifugadora: 2.7.1. Limpiar la superficie interna de las paredes con solución antiséptica cada semana o en caso de rotura de los tubos que contienen las muestras. Nota: Para todos los equipos se debe dar mantenimiento cada 6 meses.

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Capítulo 2: Control de Calidad en Bacteriología

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PROCEDIMIENTOS

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IV. CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: 1. ALMACENAMIENTO Y VENCIMIENTO DE LOS MEDIOS PREPARADOS: Ver en la tabla No. 1 la referencia de almacenamiento y vencimiento, para cada medio.

TABLA No. 1 MEDIOS

REFRIGERADOR 4 oc SIN BOLSA PLÁSTICA

REFRIGERADOR 4 oc CON BOLSA PLÁSTICA

Agar Sangre

15 días

50 días

Agar Chocolate

15 días

60 días

Agar MacConkey

15 días

70 días

6 días

10 días

Agar SS

2. CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS PREPARADOS:

2.1. Control del pH: Cuando el medio se prepara correctamente a partir de polvo deshidratado no es necesario comprobar sistemáticamente el pH. Si el medio se elabora con sus ingredientes básicos, habrá que dejarlo enfriar antes de hacer esta comprobación. En el caso de los medios sólidos, la comprobación deberá hacerse con un electrodo de superficie o tras maceración en agua destilada. Si el pH difiere en mas de 0,2 unidades del valor específico, ajústese con ácido o álcali o prepárese un nuevo lote.

2.2. Control de Esterilidad: Compruébese sistemáticamente la esterilidad de los medios a los que, después de pasar por el autoclave, se les agrega sangre u otros componentes. Tómese un 3-5 % de cada lote e incúbese a 35 o C durante dos dias. Refrigérese el resto. Si se observan mas de dos colonias por placa, deséchese todo el lote.

2.3. Control de crecimiento: A cada lote preparado se le debe de hacer control utilizando cepas de referencia (ATCC).

2.4. Control de Caducidad: Cada lote debe marcarse con la fecha de preparación. El límite de utilización varía de acuerdo con el tipo de medio.

Capítulo 2: Control de Calidad en Bacteriología

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MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE

BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

V. BIBLIOGRAFÍA: 1. Ferraro MJ, Wikler MA, Craig WA and others. Performance Standards for Antimicrobial Disks Susceptibility Test; Approved Standard-Eighth Edition. National Comittee for Clinical Laboratory Standards, Document M2-A8, Volumen 23 No.1, 2004. Pensylvania, USA. 2. Gabastou J.M. Sistema de Garantía de Calidad: Conceptos Generales para los Laboratorios de Salud Pública en la Región Américas. Organización Panamericana de la Salud (OPS), Organización Mundial de la Salud (OMS), (Borrador), Washington, D.C. 2001. 3. Manual de Control de Calidad del Laboratorio Clínico. Capítulos I y VII, Instituto de Salud Pública de Chile, Departamento Laboratorios de Salud, Ministerio de Salud, 1998, Santiago de Chile.

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Capítulo 2: Control de Calidad en Bacteriología

CAPÍTULO 3.

Procedimiento para la tinción de Gram I. ALCANCE: Todos los laboratorios de la Red y Centro de Referencia.

II. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS: La tinción de Gram es la prueba más simple utilizada en el laboratorio de microbiología. Es el procedimiento diferencial más comúnmente usado para el examen directo de gran variedad de géneros bacterianos. Fue concebido por Hans Christian Joachim Gram en el siglo IX y se mantiene hasta el momento sin modificaciones sustanciales. Divide a las bacterias en dos grupos: Microorganismos grampositivos que retienen el colorante primario cristal violeta y se observan de color azul oscuro o púrpura y microorganismos gramnegativos que pueden ser decolorados, esto es que pierden el colorante primario. Subsecuentemente toman el colorante de contraste safranina y aparecen de color rojo o rosa. Este espectro de coloración incluye a casi todas las bacterias y a otros géneros que incluyen hongos y parásitos. Los géneros bacterianos Treponema, y Mycobacterium no se tiñen bien y otros como Micoplasma, Chlamydia o Rickettsia son muy pequeños y requieren otros colorantes para poder ser visualizados al microscopio óptico. La tinción de Gram también es útil para la diferenciación de células epiteliales y leucocitos. No se ha dilucidado completamente el modo de acción de esta tinción, sin embargo se cree que los microorganismos grampositivos retienen el cristal violeta debido a la gran cantidad de ácido teicóico y la disminución de la permeabilidad de la pared celular para solventes orgánicos. Por el contrario, la pared celular de los gramnegativos contienen mas cantidad de lípidos y por lo tanto al ser disueltos por los solventes orgánicos (alconol-acetona o alcohol) el cristal violeta no puede ser retenido en el citoplasma, el cual escapa por los virtuales espacios dejados por los lípidos disueltos. La tinción de Gram de exudados puede dar al médico información preliminar acerca del o los microorganismos causales de la infección y servirle de base para el inicio de o los antimicrobianos apropiados en tanto obtiene el resultado del cultivo. Los problemas con la tinción de Gram generalmente resultan por errores de preparación de la lámina, frotis muy gruesos, calor excesivo cuando se fija la preparación, inapropiada decoloración e inexperiencia. Un exceso de decoloración ocasionará que las bacterias grampositivas aparezcan gramnegativas, mientras que con insuficiente decoloración ocurrirá el fenómeno inverso. La tinción de Gram puede hacerse a todo tipo de muestras clínicas que tengan indicación comprobada. Por ejemplo, no tienen ningún soporte los Gram de exudados faríngeos para la comprobación de Capítulo 3: Procedimientos para la tinción de Gram

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PROCEDIMIENTOS

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

faringoamigdalitis por Streptococcus pero sí para un exudado de herida. Por lo demás, es útil para conocer inicialmente el posible género bacteriano en las UFCs de cultivos iniciales o comprobar el crecimiento y posibles géneros bacterianos obtenidos de caldos, como el hemocultivo.

II. IDENTIFICACIÓN: 1. EQUIPOS INSTRUMENTOS Y REACTIVOS:

1.1. Equipos: 1.1.1 Microscopio con objetivo de inmersión 100x y ocular de 10x.

1.2. Materiales y reactivos 1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.2.4 1.2.5 1.2.6 1.2.7 1.2.8 1.2.9 1.2.10 1.2.11 1.2.12 1.2.13

Láminas portaobjetos Mechero tipo Bunsen Marcadores indelebles Reloj de mesa Palillos de madera Bandeja de tinción Cristal violeta Lugol. Alcohol 70 o o alcohol acetona (1:1) Safranina o fucsina acuosa Agua de chorro Aceite de inmersión Solución salina al 0.85% estéril

1.3. Cepas para control de calidad: 1.3.1 Eschericha coli ATCC 25922 1.3.2 Staphylococcus aureus ATCC 25923

III. PROCEDIMIENTO: 1. PREPARACIÓN DEL FROTIS: 1.1.

Colocar una pequeña gota de solución salina en el centro de la lámina. Si son varias muestras, divida la lámina portaobjetos en su parte posterior en 6 y o más cuadrantes y coloque una pequeña gota de solución salina en cada uno de ellos, según la cantidad de muestras que teñirá. Las gotas pequeñas hacen que el secado sea rápido. En caso de muestras obtenidas de caldos, no se requiere la solución salina.

1.2.

Tomar la muestra con asa recta (una UFC) o redonda si se trata de caldos de cultivo y mezclarla con la gota de solución salina. Al mismo tiempo que se hace la mezcla, se dispersa en un área de aproximadamente 1cm por lado. El grosor de la muestra deber ser tal que permita la lectura de letras pequeñas a través del frotis.

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Capítulo 3: Procedimientos para la tinción de Gram

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE

BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

1.3.

Ponga la lámina sobre una superficie plana y espere a que se seque a temperatura ambiente.

1.4.

Rotular la lámina adecuadamente. Si tiene mas de un Gram en la misma lámina cerciórese que con la rotulación le será posible evitar equivocaciones acerca de la proveniencia de la muestra.

1.5.

Una vez que el frotis esté seco, fijar la muestra pasándola rápidamente dos veces por encima de la flama del mechero. Evite el sobrecalentamiento ya que la pared celular se destruye y las bacterias grampositivas se observarían como gramnegativas. Para saber la temperatura adecuada coloque inmediatamente la lámina flameada sobre el dorso de una mano. En estos casos, la temperatura se debe tolerar sin hacer ningún esfuerzo de resistencia al calor.

1.6.

Dejar que el frotis se enfríe.

2. TINCIÓN: 2.1.

Cubrir el frotis ya fijado y frío con cristal violeta, dejar el colorante por un minuto.

2.2.

Enjuagar, dejando resbalar el agua con un chorro suave. Escurrir muy bien.

2.3.

Cubrir con lugol y dejar por un minuto.

2.4.

Repita el numeral 2.2

2.5.

Aplicar 2 ó 3 gotas de alcohol acetona (1:1) o alcohol 70o y balancear la lámina de tal manera que se pueda observar la decolaración. El tiempo adecuado es aquel en que las partes mas gruesas han dejado de decolorar al realizar el balanceo.

2.6.

Inmediatamente repita el numeral 2.2

2.7.

Cubrir el frotis con safranina o fucsina acuosa durante 30 segundos.

2.8.

Repita el numeral 2.2

2.9.

Dejar secar a temperatura ambiente.

2.10. Examinar en el microscopio con lente de inmersión, empleando aceite de inmersión.

3. RECOMENDACIONES: 3.1.

Empezar a colorear el frotis cuando la lámina portaobjetos esté bien fría ya que si se colorea caliente se precipitan los colorantes.

3.2.

Si la muestra que se va a colorear contiene mucha sangre, el frotis debe hemolizarse con agua ya que esta destruye los eritrocitos y permite observar las bacterias. Proceda así:

3.2.1 Dejar secar el frotis, fijar con calor, cubrir el frotis completamente con agua por un minuto y luego proceder con la tinción normalmente. 3.3.

La decoloración es crucial y debe ser muy breve en frotis delgados y mas prolongada en frotis gruesos. También cuando se ocupa alcohol-acetona el tiempo de decoloración es menor que cuando se decolora con alcohol 70 o.

3.3.

El frotis puede secarse dentro de la incubadora a 35oC, flamear levemente si es urgente o secarlo con aire expulsado de un pera de hule o un secador de manos.

Capítulo 3: Procedimientos para la tinción de Gram

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PROCEDIMIENTOS

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

4. RESULTADOS: Bacterias grampositivas: Se observan al microscopio de color azul oscuro o púrpura. Bacterias gramnegativas: Se observan al microscopio de color rojo o rosado. Nota: Las células epiteliales y los leucocitos deben observarse completamente de color rojo. La presencia de partes violeta indican que la preparación del frotis estaba muy gruesa o el tiempo de decoloración ha sido muy corto. En todo caso, valore repetir la muestra.

5. CONTROL DE CALIDAD: 5.1.

Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Bacilos gramnegativos: se observan de color rojo o rosado intenso.

5.2.

Staphylococcus aureus ATCC 25923 Resultado: Cocos grampositivos: se observan de color azul a púrpura.

6. INFORME: 6.1.

Mencionar primero las bacterias observadas y la agrupación seguido de la cantidad (escasos, regular cantidad o abundantes).

6.2.

Reportar los leucocitos en la muestra, su clase y cantidad. También reportar si se observan bacterias en el citoplasma de los leucocitos.

6.3.

Indicar siempre la presencia y cantidad de levaduras con o sin seudohifas, así como la presencia de micelio de hongos.

Ejemplos: 6.3.1 Diplococos gramnegativos abundantes extra celulares e intracelulares. Polimorfonucleares regular cantidad. 6.3.2 Cocos grampositivos en cadenas cortas, abundantes. 6.3.1 Cocobacilos pleomórficos gramnegativos escasos. Polimorfonucleares escasos. 6.3.2 Levaduras con seudohifas abundantes. Polimorfonucleares abundantes.

VI. BIBLIOGRAFÍA: 1. Principios del Diagnóstico Microbiológico en Medicina en Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. Geo F. Brooks editor, 16ª edición (de la 21ª edición en inglés), capítulo 47, 1999, editorial El Manual Moderno, México, Bogotá.

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Capítulo 3: Procedimientos para la tinción de Gram

CAPÍTULO 4.

Procedimientos para la identificación de enterobacterias Rutinariamente se utilizan tablas de identificación de enterobacterias en las que todas ellas aparecen en una sola tabla o el mismo género, pero con sus diferentes especies en otras. En ambos casos, la búsqueda se hace prolongada y engorrosa. Para facilitar la rápida identificación se han diseñado 4 diagramas de flujo, tomando en consideración la totalidad de información del capítulo de enterobacteriaceae del Manual of Clinical Microbiology (Farmer III J.J. Enterobacteriaceae: Introduction and Identification en: Manual of Clinical Microbiology. Patrick R. Murray Editor. 7 th. Ed., 1999, chap. 27, American Society for Microbiology, Washington, D.C. ) Para poder hacer uso de estos diagramas es necesario tener en cuenta algunas consideraciones: 1.

Es necesario que al momento de hacer la lectura del plato donde ha sido sembrada la muestra, la UFC seleccionada para ser sembrada en TSI y LIA, sea marcada. Esto se hace trazando un círculo en la parte posterior del plato, alrededor de la UFC y agregándole un número o letra si de ese mismo plato van a identificarse otras UFC. La utilidad de este procedimiento se explica en el paso No. 3.

2.

Se requiere que la cepa que se estudia haya sido sembrada en TSI y LIA simultáneamente. Estos diagramas no tienen aplicación si la cepa sólo ha sido sembrada en TSI. El objetivo de LIA es precisamente adelantar información acerca de si las enterobacterias poseen o no descarboxilasa o desaminasa de la lisina.

3.

La bacteria no se podrá localizar en los diagramas si la cepa estudiada está contaminada con otras bacterias o si no es una enterobacteria. Esto último puede descartarse haciendo la prueba de la oxidasa. De esta manera se puede establecer la diferencia con otros bacilos gramnegativos anaerobios facultativos.

4.

Las lecturas en TSI y LIA son válidas si el período de incubación es de 18 a 24 horas. Mayores tiempos pueden dar lecturas falsas.

5.

Los diagramas de flujo han sido numeradas del 1 al 4: Diagrama de Flujo

No. 1:

Enterobacterias que desaminan la lisina.

Diagrama de Flujo

No. 2:

Enterobacterias que producen H2S

Diagramas de Flujo Nos. 3A/3B:

Enterobacterias que fermentan la lactosa.

Diagramas de Flujo Nos. 4A/4B:

Enterobacterias que no fermentan la lactosa.

Capítulo 4: Procedimientos para la identificación de enterobacterias

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PROCEDIMIENTOS

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Lo primero es seleccionar el diagrama de flujo que nos servirá para identificar la bacteria. Para eso siga minuciosamente los siguientes pasos:

PASO 1: Observe cuidadosamente los resultados de las bioquímicas tanto en TSI como en LIA. Inicialmente observe el tubo de LIA y pregúntese: La bacteria ¿desaminó la lisina? (color rojo en la parte inclinada). Si la respuesta es sí, busque el género y especie en el diagrama No. 1. Si la bacteria también produjo H2S y desaminó la lisina, la característica predominante para seleccionar el diagrama es la de haber desaminado la lisina Si la respuesta es no, siga el paso 2.

PASO 2: Observe los tubos de TSI y LIA y pregúntese: ¿Se produjo H2S? (color Negro en la parte profunda de TSI, el LIA o ambos). Si la respuesta es sí, busque el género y especie en el diagrama No. 2. Si la respuesta es no, siga el paso 3.

PASO 3: Observe el tubo de TSI y pregúntese: Fermentó la lactosa? (color amarillo en la parte inclinada).

Para responder esta pregunta hay que tomar ciertas precauciones: 1.

Recuerde que el medio de TSI tiene 3 azúcares: lactosa, sacarosa y glucosa.

2.

La glucosa se fermenta en la parte profunda.

3.

La lactosa y sacarosa se fermentan en la parte inclinada. Así que, el color amarillo en la parte inclinada puede ser por fermentación de la lactosa o de la sacarosa. ¿Cómo establecer la diferencia? Revise el plato donde sembró la muestra (McConkey, SS agar). Observe atentamente la UFC que marcó y sembró en TSI y LIA. Si la UFC es fermentadora de lactosa (rosado en McConkey y SS agar, oscura pero diferentes tonos en EMB, amarilla en Tergitol 7), el color amarillo del TSI en la parte inclinada se debe a la fermentación de la lactosa. Si la bacteria es no fermentadora (lactosa negativa), y el TSI viró amarillo en la parte inclinada, la reacción es por fermentación de la sacarosa, lo cual es una valiosa información en el caso de algunas enterobacterias. Como puede notarse, algunas enterobacterias están clasificadas tanto en el diagrama 3 como en el 4, ya que los porcentajes de fermentación de la lactosa varían entre el 45 al 80%.

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Capítulo 4: Procedimientos para la identificación de enterobacterias

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE

BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

Si la respuesta es sí, busque el género y la especie en los diagramas Nos. 3A o 3B según las variaciones de las reacciones en TSI y LIA. Si la respuesta es no, se asume que la enterobacteria es no fermentadora de la lactosa y en ese caso deben utilizarse los diagramas Nos. 4A y B.

NOTAS: Se sabe que hasta un 6% de las E. coli producen H2S en pocas cantidades. En ese caso, pueden confundirse con una Salmonella. Si usted tiene una bacteria cuyo crecimiento en TSI es A/AG+ y en LIA K/Kg+ y no pudo identificarla en la tabla 2, considere que puede tener más de una bacteria en sus tubos de TSI y LIA. En ese caso reaisle con un inóculo tomado del plato original. Algunas bacterias fermentan lentamente la lactosa o la sacarosa y la parte inclinada se observa amarilla en la porción inferior y roja en la porción superior (por ejemplo: Klebsiella spp). En este caso, la bacteria se toma como fermentadora de lactosa o de sacarosa, según el caso. Debe insistirse que el tiempo de incubación no debe exceder las 24 horas, pues con mayor tiempo las bacterias que fermentaron la lactosa van muriendo y este proceso se acompaña de alcalinización (viraje a color rojo de la parte inclinada). Una vez seleccionada el diagrama, note que en la parte inferior se anotan las posibles reacciones que se pueden obtener en el TSI y LIA. Si en el diagrama seleccionado no aparecen las reacciones que Ud. obtuvo, considere la posibilidad de contaminación. En tal caso reaisle una UFC del plato original. Si las reacciones son similares a la primera vez, envíe la cepa al CNDR. En la parte superior de la primera hoja de cada diagrama se indica toda la bioquímica que simultáneamente debe hacerse para esa cepa. Es vital que se realicen todas las bioquímicas que ahí están escritas, pues la falta de una de ellas puede ser que no le permita discriminar entre los diferentes géneros o especies. Una vez realizada la bioquímica, proceda a leer los resultados según el esquema que se presenta en cada diagrama de flujo. Esto significa que para cada diagrama, la bioquímica clave o “llave de entrada” de identificación varía: Diagrama de flujo No. 1:

La bioquímica llave es la producción de H2S en TSI o LIA.

Diagrama de flujo No. 2:

La bioquímica llave es la descarboxilación (+ o -) de lisina en LIA.

Diagrama de flujo No. 3A: La bioquímica llave es la descarboxilación de lisina en LIA. Diagrama de flujo No. 3B: La bioquímica llave es la no descarboxilación de lisina en LIA. Diagrama de flujo No. 4A: La bioquímica llave es la descarboxilación de lisina en LIA. Diagrama de flujo No. 4B: La bioquímica llave es la no descarboxilación de lisina en LIA A partir de ahí, los géneros y especies se van agrupando en dependencia de bioquímicas específicas que siguen un riguroso orden. No siempre es necesario leer todas las reacciones bioquímicas para llegar a una conclusión de género y especie. Sin embargo, sí es necesario realizarlas todas, ya que de antemano no sabrá si se requerirá de todas ellas para tener una conclusión diagnóstica.

Capítulo 4: Procedimientos para la identificación de enterobacterias

21

22

Capítulo 4: Procedimientos para la identificación de enterobacterias

K/A+

2.

Citrato Trealosa

4. 5.

R/A+

R/A

LIA 4.

3.

K/A

K/Ag+

R/A

R/Ag+

NOTA:1. La producción de gas es variable y la cantidad puede ser escasa (g) o abundante (G). 2. La producción de H2S puede ser escasa ( + ) o abundante ( = ).

K/A+

1.

Adonitol

3.

DE

TSI

Urea

2.

PROCEDIMIENTOS

Reacciones esperadas en TSI/LIA

Mio

DE

1.

Bioquímica que debe realizarse para la identificación de bacterias que Desaminan la Lisina (Lisinadesaminasas) (Diagrama de Flujo No. 1)

MANUAL BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

+

Indol –

M. morganii P. mirabilis

M. morganii

+

Ornitina –

M. morganii P. vulgaris P. mirabilis P. penneri

P. mirabilis

–

P. stuartii

P. rettgeri

P. penneri

Indol

P. vulgaris

+

P. vulgaris P. penneri

+

H2S

–

P. stuartii P. rettgeri

Ornitina + Indol –

M. morganii

t Ornitina – Indol +

M. morganii P. penneri P. stuartii P. rettgeri

Urea

P. penneri

Ornitina – Indol –

+ –

M. morganii P. penneri P. stuartii P. rettgeri P. alcalifaciens P. rustigianii

LISINA DESAMINASAS

DIAGRAMA DE FLUJO No. 1

Adonitol + –

P. alcalifaciens

P. stuartii

Adonitol + –

P. alcalifaciens P. rustigianii P. stuartii

Trealosa + –

P. rustigianii P. stuartii

P. rustigianii

24

Citrato Malonato Trealosa Ramnosa Rojo de Metilo

2. 3. 4. 5. 6.

Capítulo 4: Procedimientos para la identificación de enterobacterias

4. K/A +g

2.K/A+g K/A+

K/K+g

K/A+g

2.

La producción de H2S puede ser escasa (+) o abundante ( = ).

NOTA:1. La producción de gas es variable y la cantidad puede ser escasa (g) o abundante (G).

3. A/A +g

1.K/A+g K/A

DE

LIA

PROCEDIMIENTOS

TSI

DE

Reacciones esperadas en TSI/LIA

Mio

1.

(Diagrama de Flujo No. 2)

productoras de Sulfuro de Hidrógeno

Bioquímica que debe realizarse para la identificación de bacterias MANUAL BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

Salmonella spp

E. tarda

Ornitina + Indol +

S. Choleraesuis

Trealosa + –

S. Choleraesuis Salmonella spp

Ornitina + Indol –

E. tarda S. Choleraesuis S. Typhi Salmonella spp

S. Typhi

Ornitina – Indol –

DIAGRAMA DE FLUJO No. 2

Lisina

B. aquatica

–

L. richardii

Ornitina + Citrato +

C. freundii

L. richardii B. aquatica

Citrato + –

Lactosa Ramnosa + Rojo de Metilo + –

L. grimontii

+

PRODUCTORAS DE H 2S

S. Paratyphi A

Ornitina + Citrato –

Ornitina –

C. freundii

C. freundii S. Paratyphi A

Movilidad + Indol –

C. freundii C. diversus C. amalonaticus S. Parathyphi A L. grimontii L. richardii B. aquatica

C. diversus

Malonato + –

C. amalonaticus

C. diversus C. amalonaticus

Movilidad + Indol + Ornitina +

26

NOTA:

Urea Citrato Malonato Vogues Proskauer Dulcitol Salicina Sacarosa

2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Capítulo 4: Procedimientos para la identificación de enterobacterias

A/A

2.

K/K

K/Kg

1. La producción de gas es variable y la cantidad puede ser escasa (g) o abundante (G).

A/Ag

1.

LIA

DE

TSI

PROCEDIMIENTOS

Reacciones esperadas en TSI/LIA

Mio

DE

1.

(Diagrama de Flujo No. 3 A)

Fermentadoras de Lactosa (Lactosa Positiva)

Bioquímica que debe realizarse para la identificación de bacterias

MANUAL BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

E. gergoviiae

+

VP

–

–

E. aerogenes

S. fonticola

E. gergoviae S. fonticola

Urea

E. aerogenes S. odorifera 1

+

VP

S. odorifera 1

–

E. aerogenes S. odorifera 1 S. fonticola

Gas de glucosa + –

aerogenes gergoviae odorifera fonticola

+

E. E. S. S.

Indol – Ornitina +

K. oxytoca

Dulcitol + –

S. fonticola

Indol + Ornitina –

+

VP

–

S. odorifera 1

E. K. K. S.

K. ascorbata K. cryocrescens

S. odorifera 1 K. cryocrescens

Citrato + –

K. cryocrescens

S. odorífera 1

– –

–

S. odorifera

Sacarosa + –

S. rubidea S. odorifera 2

Urea

Enviar al CNDR

S. rubidea

+

K. pneumoniae S. rubidea S. odorífera 2

K. pneumoniae

E. coli K. cryocrescens

E. coli

Indol Ornitina

E. coli K. cryocrescens

Malonato + –

E. coli K. cryocrescens

K. cryocrescens

coli ascorbata kryocrescens odorifera bio 1

Indol + Ornitina +

Gas de Glucosa + –

Malonato + –

K. ascorbata K. cryocrescens S. odorifera 1

Kluyvera spp

Lisina +

E. coli

E. coli S. odorifera 2

-

S. odorífera 2

+

Urea

E. coli K. oxitoca S. odorifera bio 2

S. odorifera 1 S. fonticola

LACTOSA POSITIVAS

DIAGRAMA DE FLUJO No. 3 A

Salicina +

28

NOTA:

Citrato Malonato Vogues Proskauer Arginina Sorbitol Adonitol Sacarosa Arabinosa Ramnosa Determinación de pigmento amarillo en Mueller Hinton o Agar Nutritivo

2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.

Capítulo 4: Procedimientos para la identificación de enterobacterias

A/Ag

K/Ag

1. La producción de gas es variable y la cantidad puede ser escasa (g) o abundante (G).

1.

DE

LIA

PROCEDIMIENTOS

TSI

DE

Reacciones esperadas en TSI/LIA

Mio

1.

(Diagrama de Flujo No. 3 B)

Fermentadoras de Lactosa (Lactosa Positiva)

Bioquímica que debe realizarse para la identificación de bacterias MANUAL BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

E. cloacae

L. adecarboxilata

*24 horas en MH, AN o BHI

E. sakasakii

+

Adonitol

–

Arginina Sorbitol

+

P. agglomerans L. adecarboxilata

Indol + Ornitina –

E. cloacae E. sakasakii

Indol – Ornitina +

–

P. agglomerans

–

Lisina

–

+

K. cryocrescens

–

Pigmento Amarillo*

+

S. rubidea

–

Pigmento Amarillo *

P. agglomerans S. rubidea

Ornitina

Indol

– –

P. agglomerans (85%) S. plymutica

E. americana

C. lapagei

Malonato + –

E. americana C. lapagei

Arabinosa + –

P. agglomerans E. americana C. lapagei

P. agglomerans

Ramnosa + –

–

Sacarosa

P. agglomerans S. plymutica

+

P. agglomerans E. americana C. lapagei S. rubidea S. plymutica

Malonato + –

S. rubidea S. plymutica P. agglomerans

P. agglomerans

E. hermanii K. criocrescens

Citrato + –

E. hermanii K. cryocrescens

VP

E. hermanii

K. cryocrescens

E. sakasakii

+

E. sakasakii E. hermanii K. cryocrescens

Indol + Ornitina +

LACTOSA POSITIVAS

DIAGRAMA DE FLUJO No 3 B

30

NOTA:

DE

Bioquímica que debe realizarse para la identificación de bacterias (Diagrama de Flujo No. 4 A)

Indol (MIO) Ornitina (MIO) Sacarosa Citrato

2. 3. 4. 5.

Capítulo 4: Procedimientos para la identificación de enterobacterias

K/K K/Kg

2. K/Ag 3. A/Ag

1. La producción de gas es variable y la cantidad puede ser escasa (g) o abundante (G).

K/Kg

1. K/Ag

LIA

DE

TSI

PROCEDIMIENTOS

Reacciones esperadas en TSI/LIA

Arabinosa

1.

No fermentadoras de Lactosa (Lactosa Negativa)

MANUAL BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

–

Arabinosa +

marcescens liquefaciens odorifera bio 1 alvei fergusonii vulneris

S. odorifera

S. H. E. E. S.

H. alvei

+ –

Indol

liquefaciens alvei fergusonii vulneris odorifera bio 1

E. fergusonii

Sacarosa Citrato + –

E. fergusonii S. odorifera bio 1

S. marcescens

S. S. S. H. E. E.

Lisina +

Ornitina + –

Sacarosa – +

S. liquefaciens S. odorífera bio 1

E. vulneris

liquefaciens alvei vulneris odorifera bio 1

S. liquefaciens S. odorífera bio 1 H. alvei

S. H. E. S.

S. liquefaciens

S. odorifera bio 1

LACTOSA NEGATIVAS

DIAGRAMA DE FLUJO No 4 A

Citrato + –

32

NOTA:

Indol (Mio) Sacarosa Citrato Urea Ramnosa Sorbitol

2. 3. 4. 5. 6. 7.

Capítulo 4: Procedimientos para la identificación de enterobacterias

K/A A/Ag

2. 3.

K/Ag

K/A

K/Ag

1. La producción de gas es variable y la cantidad puede ser escasa (g) o abundante (G).

K/Ag

1.

LIA

DE

TSI

PROCEDIMIENTOS

Reacciones esperadas en TSI/LIA

Arabinosa

DE

1.

(Diagrama de Flujo No. 4 B)

No fermentadoras de Lactosa (Lactosa Negativa)

Bioquímica que debe realizarse para la identificación de bacterias MANUAL BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

K. rhinoscleromatis

T. ptyseos

Arabinosa + –

S. plymutica

S. plymutica K. rhinoscleromatis

Ramnosa + –

– – – – –

S. plymutica T ptyseos K. rhinoscleromatis

Movilidad Indol Ornitina Urea Citrato

–

Sacarosa Sorbitol + –

– –

S. plymutica

Ornitina + –

– Ramnosa +

+ Sacarosa

–

E. vulneris

Y. enterocolitica

Ornitina + –

Shigella spp

S. plymuthica

Serología

LACTOSA NEGATIVAS

DIAGRAMA DE FLUJO No 4 B

E. vulneris S. plymutica

Y. enterocolitica S. plymutica

Movilidad + –

E. vulneris E. hermannii Y. enterocolitica Shigella spp S. plymutica

Citrato

Urea

E. hermanii

E. hermannii E. vulneris S. plymutica

C. lapagei

C. lapagei C. neteri

Ornitina + –

plymutica davisae neteri lapagei

C. neteri

C. davisae

S. C. C. C.

Urea – Citrato +

S. plymutica Shigella spp Y. enterocolitica T. ptyseos C. davisae C. neteri C. lapagei E. hermannii E. vulneris K. rhinoscleromatis

Lisina

CAPÍTULO 5.

Procedimiento para el aislamiento de enterobacterias y otras bacterias menos frecuentes en el urocultivo I. TOMA DE LA MUESTRA: Para un cultivo de orina apropiado es esencial la recolección apropiada de la muestra. Las recomendaciones que deben cumplirse son las siguientes: El paciente no debe estar tomando, ni haber tomado antimicrobianos tres días antes de recolectar la muestra para el cultivo. Recolectar la primera orina de la mañana, como se describe a continuación: 1.

Lavar los genitales externos con abundante agua y jabón (no secarse).

2.

La muestra de orina se toma “a medio chorro”: Indicar al paciente que orine aproximadamente la mitad de lo que calcule tener en su vejiga.

3.

Parar la micción.

4.

Orinar entre 50-100 mL en un frasco estéril, teniendo cuidado de que los genitales no toquen el borde del mismo.

5.

Cerrar el frasco herméticamente.

6.

Las muestras deben refrigerarse de 4 o a 8 oC hasta el momento de realizar el cultivo. No deben procesarse muestras que no se refrigeraron y tienen media hora o más a temperatura ambiente. Si esto último sucede, la muestra debe repetirse.

7.

Si es un recién nacido, además de las instrucciones anteriores, la muestra se recogerá en bolsa estéril colectora de orina. Estas bolsas son exclusivas para tomas de muestras de orinas y se adquieren en las farmacias.

II. TRANSPORTE DE LA MUESTRA: 1. TRANSPORTE AL LABORATORIO CUANDO LA MUESTRA PROVIENE DE UN PACIENTE NO HOSPITALIZADO: Cuando el tiempo entre la toma de la muestra y el transporte al laboratorio se calcula que durará más de media hora, la muestra debe ser transportada en refrigeración. Para ello, el frasco con la muestra debe ser colocada en un contenedor plástico con tapadera y luego llenado hasta la mitad con hielo picado o con refrigerantes si fuera posible.

Capítulo 5: Procedimiento para el aislamiento de enterobacterias y otras bacterias

35

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PROCEDIMIENTOS

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

2. TRANSPORTE AL LABORATORIO CUANDO LA MUESTRA PROVIENE DE UN PACIENTE HOSPITALIZADO: En estos casos las muestras deben ser transportadas sin refrigeración.

II. PROCESAMIENTO PREVIO DE LA MUESTRA: Una vez que la muestra llega al laboratorio debe ser guardada inmediatamente en refrigeración hasta el momento de la siembra. Ninguna muestra debe quedar a temperatura ambiente. Recuerde que en el caso de las enterobacterias, se reproducen logarítmicamente aproximadamente cada 20 minutos, lo cual alterará el conteo de UFCs.

1. MEDIOS DE CULTIVO REQUERIDOS: 1.1. Agar Sangre de Carnero 1.2. Agar Mac Conkey

III. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS: 1. TOMA DE LA MUESTRA: 1.1. Equipo: Ninguno 2. MATERIALES Y REACTIVOS: 2.1. Frasco estéril, boca ancha, con tapa de rosca. 2.2. Bolsas recolectoras estériles, en casos de que la muestra sea de un infante. 3. MEDIOS DE CULTIVO: Ninguno. 4. TRANSPORTE: 4.1. Equipo: Ninguno. 4.2. Materiales y reactivos: 4.2.1 Contenedor plástico con tapa y hielo picado o refrigerantes. 4.3. Medios de cultivo: Ninguno. 5. PROCESAMIENTO: 5.1. Equipo: Ninguno. 5.2. Materiales y reactivos: Ninguno. 5.1. Medios de cultivo: 5.3.1 Agar Sangre de Carnero 5.3.2 Agar Mac Conkey

36

Capítulo 5: Procedimiento para el aislamiento de enterobacterias y otras bacterias

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V. ALCANCE Depende del nivel de complejidad de la bacteria aislada. Para determinar el alcance en relación de la identificación debe revisarse el capítulo correspondiente.

VI. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS: La orina excretada en el riñón es estéril, salvo que dicho órgano esté infectado. La orina sin contaminar de la vejiga también es normalmente estéril, sin embargo, en la uretra existe una microbiota normal, de modo que la orina expulsada en forma normal contiene una pequeña cantidad de bacterias. Debido a esto es necesario distinguir los microorganismos contaminantes de los de importancia etiológica. Sólo el examen cuantitativo de la orina puede producir resultados significativos en cuanto a esta diferencia. El urocultivo se realiza para demostrar la presencia de un número significativo de bacterias, que usualmente se limitan a unos pocos microorganismos de crecimiento rápido. Las principales bacterias que afectan el sistema urinario son las enterobacterias y dentro de ellas Escherichia coli es la más frecuente. En mujeres no embarazadas las más frecuentes son E. coli y Staphylococcus saprophyticus. Sin tomar en cuenta la edad, sexo ni patologías primarias, se pueden aislar otras enterobacterias y gramnegativos, así como otros grampositivos, sobre todo en instituciones donde las infecciones urinarias asociadas a catéter constituyen la primera causa de infecciones intrahospitalarias. El examen microscópico de la orina es una práctica previa al cultivo que puede revelar importante información a la hora de hacer una interpretación o tomar la decisión de concluir el diagnóstico, sin embargo no se describe en el presente manual debido a que en los laboratorios de bacteriología del país, este análisis le corresponde al laboratorio clínico.

VII. IDENTIFICACIÓN: 1. EQUIPO, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS PARA LA IDENTIFICACIÓN:

1.1. Equipo: 1.1.1 1.1.2 1.1.3 1.1.4

Microscopio Mechero de Bunsen Incubadora Refrigeradora

1.2. Materiales y reactivos: 1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.2.4 1.2.5 1.2.6 1.2.6 1.2.7

Asas bacteriológicas redondas y rectas Asas redondas calibradas (0.001 mL) Guantes descartables Láminas portaobjeto Láminas cubreobjeto Colorantes para tinción de Gram Reactivo de Kovac ó Erlich Reactivo de alfanaftol Capítulo 5: Procedimiento para el aislamiento de enterobacterias y otras bacterias

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1.2.8 Reactivo de KOH al 40% 1.2.9 Reactivo de cloruro férrico 1.2.10 Reactivo de ácido clorhídrico 0.1 N

1.3. Medios de cultivo: Ver procesamiento. 1.4. Pruebas para la identificación: Ver apartado correspondiente según la bacteria aislada. 2. PROCEDIMIENTO PARA LA SIEMBRA: 2.1.

Agitar manualmente el frasco de orina por unos segundos, hasta obtener una solución homogénea.

2.2.

Con el asa de platino calibrada de 0.001 ml , inocular la muestra en los medios de Agar Sangre de Carnero y Agar MacConkey, depositando el inóculo en el centro del plato, extendiéndolo hacia arriba y hacia abajo, sin esterilizar el asa. Luego estriar en tres direcciones: vertical, horizontal y transversalmente en toda la superficie del plato.

2.3.

Incubar los medios de cultivo por 24 hrs. de 35-37 0C.

3. LECTURA DE LOS PLATOS: Deben tomarse en cuenta varios parámetros. En los siguientes casos debe tomarse el urocultivo como positivo y debe hacerse la identificación del o los microorganismos y su respectivo antibiograma. 3.1.

Todo cultivo puro (un solo tipo de bacteria) con recuento mayor de 20,000 UFC x mL (unidades formadoras de colonias por mililitro de orina).

3.2.

Una muestra se manda a repetir: 3.2.1 Todo cultivo en el que el recuento sea mayor de 20,000 UFC x mL con más de una bacteria. 3.2.2 En caso que el recuento sea menor de 20,000 UFC X mL con una o más bacterias.

4. PROCEDIMIENTO PARA CALCULAR EL TOTAL DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS QUE SE VAN A REPORTAR AL MÉDICO: 4.1.

Realizar la lectura, contando el total de UFCs y multiplicarlas por el factor de dilución correspondiente con el asa utilizada (las asas de platino utilizadas están calibradas para tomar un volumen de 0.001 mL, o sea la milésima parte de 1 mL, por lo tanto el factor de dilución es 1000). Este dato es muy importante y debe ser reportado en el resultado final que se envía al médico. A continuación algunos ejemplos, utilizando asa de 0.001 mL. 4.1.1 Ejemplo 1. Si usted cuenta 50 Unidades Formadoras de Colonia (UFCs), multiplique 50 x 1,000 y esto da como resultado 50,000 UFC por mililitro de orina (mL).

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Capítulo 5: Procedimiento para el aislamiento de enterobacterias y otras bacterias

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4.1.2 Ejemplo 2. Si usted cuenta 75 UFC, multiplique 75 x 1,000 y esto da como resultado 75,000 UFC x mL de orina. 4.1.3 Ejemplo 3. Si el crecimiento es excesivo y no se puede contar, considere que hay más de 100 UFCs y reporte el recuento como mayor de 100,000 UFC x mL de orina.

5. SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS:

5.1. Antimicrobianos a utilizar por el método de Kirby y Bauer: Ver capítulo 16. 5.2. Antimicrobianos a utilizar por el método de concentración Mínima Inhibitoria (en caso de Streptococcus viridans): 5.2.1 Penicilina.

6. REPORTE:

6.1. Negativo: No hubo crecimiento bacteriano. 6.2. Positivo: 6.2.1 Todo cultivo puro (un solo tipo de bacteria) con recuento mayor de 20,000 UFC x mL debe reportarse el género y especie, con su respectivo antibiograma. Por ejemplo: 6.2.1.1. Escherichia coli, 30 mil UFC x mL de orina. 6.2.2 Cultivos con 2 o más bacterias en las que el recuento total sobrepasa los 100,000 UFC, pero individualmente cada una tiene un recuento mayor de 20,000 UFC. 6.2.2.1. Escherichia coli >100,000 UFC x mL de orina. 6.2.2.2. Enterobacter cloacae 40 mil UFC x mL de orina

6.3. Repetir muestra: 6.3.1. Todo cultivo en el que el recuento sea mayor de 20,000 UFC x mL con más de una bacteria con género o especie diferentes. Si en el segundo cultivo se aíslan las mismas bacterias y en cantidades similares al primer cultivo, se reportan los géneros y especies aisladas con sus respectivos recuentos y antibiogramas. 6.3.2. En caso que el recuento sea menor de 20,000 UFC x mL. El hecho de que haya menos de 20,000 UFC x mL (en especial de varios tipos de bacterias) como sucede a menudo, sugiere que los microorganismos provienen de la microbiota normal o son contaminantes. Si en el segundo cultivo se aísla la misma bacteria y en cantidad similar al primer cultivo, se reporta el género y especie aislado con su respectivo antibiograma.

Capítulo 5: Procedimiento para el aislamiento de enterobacterias y otras bacterias

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FLUJOGRAMA PARA REALIZAR UN UROCULTIVO

MUESTRA SIEMBRA

AGAR SANGRE DE CARNERO

Grampositivos: S. saprophyticcus, aureus, Streptococcus beta hemolíticos

AGAR Mac Conkey

COLONIAS LACTOSA (+) ó (-)

PRUEBAS PRESUNTIVAS Dependiendo de los resultados

TSI Y LIA Dependiendo de las reacciones

PRUEBAS CONFIRMATIVAS

BIOQUÍMICA COMPLEMENTARIA

ANTIBIOGRAMA

ANTIBIOGRAMA

Nota: Para realizar la identificación de grampositivos y gramnegativos, consultar en este manual los capítulos correspondientes a cada microorganismo aislado.

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Capítulo 5: Procedimiento para el aislamiento de enterobacterias y otras bacterias

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VIII. BIBLIOGRAFÍA: 1. López SR, Reyes C J, González MA, Centeno R.: Normas Técnicas para el Urocultivo en Normas Técnicas de Bacteriología, capítulo V, 3ª ed. 1996, DANIDA/MINSA, Editorial Imprimatur, Managua, Nicaragua. 2. Tórrez MF. Urocultivo en Manual Práctico de Bacteriología Médica, Cap. 3, 1ª ed., 1996, Editorial Serviprensa, C.A., Guatemala. 3. Introducción a la Microbiología en Diagnóstico Microbiológico. Texto Atlas a color, Elmer W. Koneman editor, Cap. 3, 5ª ed. 1999, Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, Argentina. 4. Principios del diagnóstico microbiológico en medicina en Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg Geo. F. Brooks editor, Cap. 47, Editorial El Manual Moderno, 16ª edición, (traducción de la 21ª edición en inglés). México D.F. 1998. 5. Principios del diagnóstico microbiológico en medina en: Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. Geo F. Brooks editor, Cap. 47, Editorial El Manual Moderno 16ª edición (traducción de la 21ª edición en inglés). México, D.F. 1998.

Capítulo 5: Procedimiento para el aislamiento de enterobacterias y otras bacterias

41

CAPÍTULO 6.

Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

I. TOMA DE LA MUESTRA: 1. RECOMENDACIONES A LOS PACIENTES: No haber recibido tratamiento local o sistémico con antimicrobianos 3 días antes de la toma de muestra.

2. TIPO DE MUESTRA: Exudados o pus obtenidos de heridas infectadas, furúnculos y abscesos de tejidos u órganos.

3. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA: 3.1.

Retirar la costra o pústulas en la piel con un bisturí y pinzas estériles, previa limpieza con agua destilada o solución salina estéril, para remover ésta con mayor facilidad.

3.2.

En heridas, primero se debe realizar una limpieza en la superficie con el propósito de remover la suciedad o tejido muerto.

3.3.

Si en el interior de la herida hay pus, debe removerse haciendo uso de hisopos o torundas de gasa estériles. El pus no es un material apropiado para el cultivo por contener células vegetativas bacterianas muertas o predominantemente semidestruidas.

3.4.

Una vez removido el pus, la muestra debe tomarse con un hisopo estéril, frotando vigorosa pero gentilmente las paredes de la herida, o cavidad.

3.5.

Abscesos cerrados superficiales: en estos casos el médico debe drenar el absceso y eliminar el pus. La muestra para cultivo de bacterias se toma de las paredes de la cavidad, como se describe en el numeral 3.3.

3.6.

Abscesos cerrados profundos, órganos o tejidos internos, ojos (humor acuoso o vítreo), oído medio y otros: La muestra debe ser tomada exclusivamente por el médico. Si no es posible tome la muestra como en el numeral 3.3, el pus debe aspirarse por medio de una jeringa estéril de 3 o 5 mL. La cantidad de la muestra depende de la naturaleza de la lesión, pero no es necesario tomar más de 1mL.

Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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II. TRANSPORTE DE LA MUESTRA: 1.

Para los numerales 3.4 y 3.5 los hisopos deben introducirse en el medio de transporte de Stuart, teniendo cuidado que el hisopo quede completamente introducido en el medio.

2.

En el tubo o jeringa con la muestra deben anotarse el código de la muestra, fecha y hora en que fue tomada.

3.

Todas las muestras deben acompañarse con una hoja que contenga como mínimo la siguiente información: 3.1. Institución 3.2. Sala 3.3. Número de expediente 3.4. Nombre del paciente 3.5. Edad 3.6. Sexo

3.7.

Resumen de historia clínica. Si existe un Comité de Infecciones Intrahospitalarias (CIIH) que requiera información adicional sobre los casos de infección, debe elaborarse una hoja con los datos que el CIIH determine.

4.

Transportar la muestra contenida en el medio de transporte a temperatura ambiente.

5.

Si la muestra obtenida está contenida en una jeringa (numeral 3.6), debe transportarse con refrigerante. Esto tiene el propósito que las enzimas líticas y autolíticas contenidas en el pus disminuyan su acción destructiva contra las bacterias.

III. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA: 1.

Rotular un plato de Agar Sangre de Carnero (ASC) y otro con Agar Mac Conkey (MacC).

2.

Con unas pinzas previamente flameadas en el mechero, extraiga el hisopo del medio de transporte.

3.

Haga un inóculo en una de las orillas del medio de ASC y luego en MacC. El inóculo debe ser hecho friccionando el hisopo en forma circular sobre un área de aproximadamente 1 cm de diámetro. Con el mismo hisopo haga un frotis para tinción de Gram.

4.

Si la muestra fue transportada en una jeringa, deposite una gota sobre una de las orillas de los medios de ASC y MacC. Haga un frotis para tinción de Gram.

5.

Dejar los inóculos durante un tiempo aproximado de 5 minutos para que el agar absorba el exceso de líquido y luego estríe en la forma convencional.

6.

Incubar de 35 a 37 oC durante 18 a 24 horas. El ASC se incuba en atmósfera de CO 2 (método de la jarra si no tiene incubadora con CO 2).

44

Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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IV. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS: 1. TOMA DE MUESTRA: 1.1. 1.2. 1.3. 1.4. 1.5. 1.6.

Jeringa estéril 3-5 mL Bisturí estéril Agua destilada estéril Solución salina estéril Hisopo de algodón estéril Solución antiséptica

2. TRANSPORTE DE LA MUESTRA 2.1. 2.2.

Tubos conteniendo medio de transporte de Stuart. Jeringas estériles descartables de 3 ó 5mL.

3. PROCESAMIENTO:

3.1. Equipos: 3.1.1. 3.1.2. 3.1.3. 3.1.4. 3.1.5. 3.1.6. 3.1.7. 3.1.8.

Incubadora a 35-37oC Incubadora con CO 2 a 35-37 oC Refrigeradora a 6-8oC Jarra con vela de parafina blanca (si no tiene incubadora con CO 2) Refrigeradora a 6-8oC Mechero Bunsen Reloj de mesa Microscopio con objetivo de 40X y 100X.

3.2. Materiales: 3.2.1. 3.2.2. 3.2.3. 3.2.4. 3.2.5. 3.2.6.

Marcadores indelebles Asas bacteriológicas rectas y redondas Reloj de mesa Guantes descartables Gradilla Contenedores con cloro al 0.5% para desechar material contaminante

3.3. Reactivos: Colorantes y reactivos para la tinción de Gram. 3.4. Medios de Cultivo: 3.4.1. Agar Sangre de Carnero al 5% (ASC) 3.4.2. Agar MacConkey (MacC)

Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

45

6.1

I.

Procedimientos para la identificación de Pseudomonas aeruginosa

TOMA DE LA MUESTRA: ver capítulo 6.

II. TRANSPORTE DE LA MUESTRA: ver capítulo 6. III. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA: ver capítulo 6. IV. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS: ver capítulo 6. CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LOS BACILOS GRAMNEGATIVOS NO FERMENTADORES Los bacilos gram negativos no fermentadores son un grupo de bacterias aerobias no esporuladas que o bien no utilizan hidratos de carbono como fuente de energía o los degradan a través de vías metabólicas diferentes de la fermentación. Estas 1. 2. 3.

vías de degradación de la glucosa son tres: Vía de Embden- Meyerhof -Parnas (EMP) Vía de Entner- Doudoroff (ED) Vía de la hexosa monofosfato de Warburg Dickens (HMP)

La vía de EMP o vía glucolítica o anaerobia, la utilizan las bacterias anaerobias y hasta cierto punto también las anaerobias facultativas. Muchas bacterias incluidas todas las bacterias de la familia Enterobacteriaceae fermentan la glucosa a través de la vía EMP para formar ácido pirúvico, producto intermediario de la fermentación de carbohidratos. Los géneros de bacilos gramnegativos no fermentadores que se describen en este capitulo utilizan las vías de ED y HMP. La vía de ED es denominada vía aerobia debido a que necesita oxigeno para que haya glucólisis es decir, degradación de la glucosa. Los bacilos gramnegativos fermentadores oxidativos utilizan vías alternativas a la vía de EMP a través de las cuales la glucosa es oxidada. El termino oxidación significa la forma en que el ácido pirúvico transfiere sus iones hidrógeno. Al carecer de las enzimas deshidrogenasa necesarias para oxidar el ácido pirúvico a ácido láctico y otros ácidos mixtos, las bacterias oxidativas transfieren los iones hidrógeno del ácido pirúvico al ciclo de Krebs, donde se une al oxígeno para formar agua. Debido que el producto final es agua, las bacterias oxidativas no forman gas a partir de carbohidratos. Los medios bioquímicos usados para las bacterias fermentativas no pueden ser aplicados a las bacterias oxidativas, ya que Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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producen ácidos débiles insuficientes para hacer virar el indicador de pH y debido a esto, Hugh y Leifson fueron los primeros en diseñar un medio OF (oxidativo-fermentativo) que se adapta a las propiedades de los bacilos gramnegativos no fermentadores. (ver tabla 1).

TABLA No. 1: METABOLISMO DE LA GLUCOSA EN EL MEDIO DE OF METABOLISMO DE LA GLUCOSA

OXIDASA

TIPO DE REACCIÓN

FAMILIA / GÉNERO / ESPECIE

FERMENTATIVA

Negativa

Positiva

I

II

OXIDATIVA

Negativa

III

Positiva

IV

INACTIVA

48

Negativa

V

Positiva

VI

Enterobacteriaceae Chromobacterium violaceum Aeromonas (hydrophila,salmonicida) Plesiomonas shigelloides Vibrio cholerae Actinobacillus (lignieresi, suis) Chromobacterium violaceum Pasteurella (aerogenes, haemolytica, pneumotropica) Kingella kingae Acinetobacter baumannii Acinetobacter haemolyticus Stenotrophomonas maltophila Pseudomonas (luteola, oryzihabitans) Pseudomonas (aeruginosa,fluorescens, putida) Pseudomonas (stutzeri, mendocina) Burkholderia (pseudomallei, cepacia) Achromobacter xylosoxidans Chryseobacterium gleum Empedobacter brevis Acinetobacter lwoffii Acinetobacter junnii Acinetobacter johnsonii Alcaligenes faecalis Pseudomonas (alcaligenes, pseudoalcaligenes) Comamonas (acidovorans, testosteroni) Bordetella bronchiseptica Myroides odoratus Moraxella (osloensis, atlantae) Oligella urethralis Psychrobacter phenylpyruvicus

Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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La vía de HMP de Warburg Dickens es en realidad un híbrido o mezcla de las vías EMP y ED. Las bacterias no sacarolíticas como algunos géneros de bacilos no fermentadores que no utilizan hidratos de carbono, son inertes en el medio OF, el cual conserva su pH alcalino después de la incubación. Las bacterias anaerobias facultativas pueden utilizar las dos vías EMP y ED indistintamente dependiendo de las condiciones ambientales en que se desarrollen.

V. ALCANCE: Laboratorios de la Red: Numerales del 1.4.1 al 1.4.8 y del 1.4.10 al 1.4.16 con respecto a pruebas de identificación.

CNDR: Numerales del 1.4.1 al 1.4.16 con respecto a pruebas de identificación.

VI. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS: El género Pseudomonas está constituido por bacilos gram negativos aerobios que no forman esporas y son rectos o ligeramente curvos, miden de 1.5 a 5 µm de largo y 0.5 a 1.0 µm de ancho. Las Pseudomonas spp son móviles debido a la presencia de uno o más flagelos polares. Los aislamientos obtenidos de muestras clínicas son oxidasa y catalasa positiva y crecen en Agar MacConkey como UFCs no fermentadoras de lactosa. La mayoría de las especies degradan la glucosa oxidativamente y reducen nitratos a gas nitrógeno. Las colonias son usualmente extendidas y planas, tienen bordes irregulares y un brillo metálico característico, el cual es frecuentemente asociado con la autólisis de las colonias. Existen otras variantes de colonias incluyendo formas lisas, gelatinosas y mucoides. Pseudomonas aeruginosa produce varios pigmentos solubles en agua, como el pigmento verde amarillento fluorescente llamado pioverdina (también producida por P. fluorescens y P. putida). Cuando la pioverdina se combina con un pigmento azul hidrosoluble, pigmento fenazina, se produce piocianina, un color azul turqueza-verde brillante característico de P. aeruginosa. Unas pocas cepas de Pseudomonas aeruginosa pueden producir pigmentos de otros colores como piorubrina (rojo) o piomelanina ( marrón a negro). Pseudomonas aeruginosa puede ser identificada sobre la base de la prueba de oxidasa, TSI, crecimiento a 42oC y producción de pigmentos ya sea fluorescente, azul verde, rojo o café en Agar Mueller Hinton. Algunas cepas de Pseudomonas aeruginosa producen solo pioverdina (verde amarillo fluorescente) característica que comparte con P. fluorescens y P. putida pero la habilidad de P. aeruginosa de crecer a 42oC la distingue de las otras dos especies. P. fluorescens puede ser diferenciada de P. putida basándose en su habilidad de degradar la gelatina. (ver tabla No. 2).

Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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TABLA 2. BIOQUÍMICA DIFERENCIAL DEL GRUPO FLUORESCENTE

AP (pyocianina) AF (pyoverdina) Reducción de nitratos Gas de nitratos (desnitrificación) Crecimiento a 42 C o

Gelatina

Pseudomonas aeruginosa + + (65)* + (98) + (93) + (100) V (82)

Pseudomonas fluorescens –

Pseudomonas putida –

+

(96)

+

(93)

V

(19)

–

(0)

–

(3)

–

(0)

–

(0)

–

(0)

+

(100)

–

(0)

* Porcentajes. El género Pseudomonas pertenece a la familia Pseudomonadaceae. Se han creado dos esquemas para clasificarlos. Un esquema popularizado por Gilardi se basa en las características fenotípicas y las divide en los grupos:

1. GRUPO FLUORESCENTE: 1.1. Pseudomonas aeruginosa 1.2. Pseudomonas fluorescens 1.3. Pseudomonas putida 2. GRUPO STUTZERI: 2.1. Pseudomonas stutzeri 2.2. Pseudomonas mendocina 2.3. CDC grupo Vb-3 3. GRUPO ALCALÍGENES: 3.1. Pseudomonas alcaligenes 3.2. Pseudomonas pseudoalcaligenes 3.3. Pseudomonas spp. CDC Grupo I 4. HOMOLOGÍA DE ÁCIDOS NUCLEICOS DESCONOCIDA (OXIDASA NEGATIVA): 4.1. Pseudomonas luteola 4.2. Pseudomonas oryzihabitans Pseudomonas aeruginosa es la especie que con mayor frecuencia se recupera de muestras clínicas. Las infecciones se observan habitualmente en los sitios en los que tiende a acumularse humedad: quemaduras, heridas cutáneas exudativas, oído externo. También producen infecciones del tracto urinario, tracto respiratorio, fibrosis quística, infecciones oculares, endocarditis e infecciones óseas por diseminación hemática. Por otro lado, se asocian a infecciones del torrente sanguíneo asociada al empleo de dispositivos intravasculares como catéteres permanentes.

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Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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VII. IDENTIFICACION: 1. EQUIPO, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS PARA LA IDENTIFICACION:

1.1. Equipo: 1.1.1. 1.1.2. 1.1.3. 1.1.4. 1.1.5.

Incubadora de 35 oC a 37 oC Incubadora de 42oC Microscopio con objetivo de 40x Mechero tipo Bunsen Reloj de mesa

1.2. Materiales y Reactivos: Materiales: 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4. 1.2.5. 1.2.6. 1.2.7.

Guantes descartables no estériles Láminas portaobjetos Asas bacteriológicas con punta redonda y recta Contenedores con cloro al 0.5% para descarte de material pequeño Marcadores indelebles Lámpara de Wood (luz ultravioleta) de onda larga (400nm) Palillos de madera

Reactivos: 1.2.8. 1.2.9. 1.2.10. 1.2.11. 1.2.12. 1.2.13.

Solución A: Alfa naftilamina Solución B: Ácido sulfanílico Solución Salina estéril al 0.85% Polvo de Cinc Tiras de oxidasa Aceite mineral inerte estéril

1.3. Medios de Cultivo: 1.3.1 Agar MacConkey

1.4. Pruebas para Identificación: 1.4.1 1.4.2 1.4.3 1.4.4 1.4.5 1.4.6 1.4.7 1.4.8 1.4.9

TSI LIA Prueba de la oxidasa Prueba de movilidad al fresco Prueba de reducción de nitratos Prueba de producción de gas a partir de nitratos Determinacion de la piocianina en Agar P Determinacion de la pioverdina en Agar F Hidrólisis de gelatina Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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MANUAL

1.4.10 1.4.11 1.4.12 1.4.13

DE

PROCEDIMIENTOS

DE

BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

Dihidrolisis de arginina Degradación de Glucosa OF (oxidación–fermentación) Crecimiento en Agar Cetrimida Crecimiento en agar MacConkey a 42 oC

1.5. Cepas para control de calidad: 1.5.1 1.5.2 1.5.3 1.5.4

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Escherichia coli ATCC 25922 Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 Enterococcus faecalis ATCC 29212

SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS: 1.6 Antimicrobianos a utilizar por el método de Kirby y Bauer: Ver capítulo 16. 1.7 Antimicrobianos a utilizar para la Concentracion Minima Inhibitoria: Ninguno.

1.8 Pruebas Especiales: Ninguna.

2

CRECIMIENTO EN Mac CONKEY

2.1. Fundamento del medio de cultivo: ver capítulo 17. 2.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 2.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: Pseudomonas spp carece de las enzimas galactósidopermeasa y galactosidasa, por lo que no tienen la capacidad de fermentar la lactosa. Por lo tanto, las UFC aparecen incoloras o transparentes, con un brillo metálico característico, planas, de bordes irregulares, con olor característico a uvas o a tamal pizque.

2.4. Resultado: Crecimiento de colonias incoloras, transparentes, con un brillo metálico característico, planas, de bordes irregulares, con olor característico a uvas o a tamal pizque, después de 24 horas de incubación.

2.5. Control de calidad: 2.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Crecimiento de colonias incoloras o transparentes, con un brillo metálico característico, planas, de bordes irregulares, con olor característico a uvas o a tamal pizque. 2.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Crecimiento de colonias rosadas, convexas, umbilicadas con tamaños entre 2-4 mm. 52

Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

MANUAL

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE

BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

PRUEBA DE TSI (TRIPLE SUGAR IRON AGAR):

3.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 3.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 3.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: Pseudomonas spp carecen de la enzima glucosa 6 fosfatos deshidrogenasa, por lo que no tienen la capacidad de fermentar la glucosa. No poseen la enzima invertasa por lo tanto no pueden fermentar la sacarosa. No poseen la enzima hidrogenasa fórmica por lo que no producen gas a partir de la glucosa.

3.4. Resultado: Características del crecimiento: K /K (alcalino / alcalino = rojo / rojo)

3.5. Control de calidad: 3.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: No fermentan la lactosa / No fermentan la glucosa. No hay producción de gas: K/K (alcalino /alcalino = rojo / rojo). 3.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Fermentan la lactosa / Fermentan la glucosa, con producción de abundante gas: A/A G (ácido /ácido gas abundante = amarillo / amarillo, gas).

4

PRUEBA DE LIA (LISINE IRON AGAR):

4.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 4.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 4.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: Las especies de Pseudomona spp no poseen la enzima lisina descarboxilasa por lo tanto no descarboxilan la lisina. Tampoco poseen la enzima lisina desaminasa por lo que no desaminan la lisina.

4.4. Resultado: Características del crecimiento: K /K (alcalino / alcalino = violeta / violeta)

4.5. Control de calidad: 4.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: No desaminan la lisina / No descarboxilan la lisina ni fermentan la glucosa: K/K (alcalino/ alcalino = violeta / violeta). 4.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: No desaminan la lisina / Descarboxilan la lisina: K/K (alcalino alcalino = violeta / violeta).

Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE

BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

5. PRUEBA DE LA OXIDASA:

5.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 5.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 5.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: Las especies de Pseudomonas poseen la enzima citocromooxidasa (excepto luteola y orizyhabitans).

5.4. Resultado: Presencia de indofenoloxidasa positiva: Hay viraje de color a púrpura intenso en los primeros 10 segundos.

5.5. Control de calidad: 5.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Oxidasa positiva: hay viraje de color a púrpura intenso en los primeros 10 segundos. 5.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Oxidasa negativa: No hay viraje de color en los primeros 10 segundos. Se observa de color amarillo.

6. PRUEBA DE MOVILIDAD AL FRESCO:

6.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 6.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 6.3. Fundamento fisiológico de la bacteria: Pseudomonas aeruginosa posee 1 flagelo polar que le confiere gran movilidad sin dirección fija.

6.4. Resultado: Movilidad positiva: Se observa al microscopio bacilos con movimientos en diferentes direcciones y desplazamientos repentinos a larga distancia.

6.5. Control de calidad: 6.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Movilidad positiva: Se observan bacilos con movimientos en diferentes direcciones y desplazamientos repentinos a larga distancia. 6.5.2. Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 Resultado: Movilidad negativa: Se observan bacilos sin movimientos. Existe movimiento giratorio (movimiento Browniano) que no debe confundirse con movimiento bacteriano.

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Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE

BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

7. PRUEBA DE REDUCCIÓN DE NITRATOS:

7.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 7.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 7.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: Pseudomonas aeruginosa tiene la capacidad de reducir nitratos a nitritos y de producir gas nitrógeno derivado de los nitratos. Usualmente en las bacterias que convierten los nitratos a nitritos pero no a otro productos como el gas nitrógeno, los nitritos suelen detectarse al agregar en partes iguales el reactivo A (alfa naftilamina) y B (ácido sulfanílico). Cuando los nitritos están presentes se da un viraje del caldo a un color rojo intenso en los primeros 30 minutos de la reacción. Sin embargo, en bacterias como el caso de Pseudomonas aeruginosa que convierten los nitratos a nitritos pero que también producen gas de nitrógeno en gran cantidad, la detección de los nitritos después de agregar los reactivos no es observable. Esto se puede comprobar fácilmente al agregar aproximadamente 20 mg de cinc. Cuando los nitratos no fueron convertidos a nitritos, el cinc hace la conversión y el viraje a color rojo intenso se hace presente. Sin embargo, en el caso de las Pseudomonas aeruginosa este viraje no se presenta, lo que comprueba la conversión. La producción de gas nitrógeno es detectada por la presencia de burbujas en la parte superior del tubo de Durham.

7.4. Resultado: Reducción de nitratos a nitratos positiva: Hay viraje a color rojo después de agregar los reactivos de prueba. Producción de gas nitrógeno positiva: Hay burbujas de gas en el tubo de Durham.

7.5. Control de calidad: 7.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Reducción de nitratos a nitritos positiva. No hay viraje de color, después de agregar los reactivos de prueba, ni al agregar 20 mg de polvo de cinc. Producción de gas nitrógeno a partir de nitratos positiva: se observan burbujas de gas en la parte superior del tubo de Durham invertido. 7.5.2. Enterococcus faaecalis ATCC 29212 Resultado: Reducción de nitratos a nitritos negativa. No hay viraje de color después de agregar los reactivos de prueba. Confirmación: Luego de la adición de aproximadamente 20 mg de cinc el caldo vira a color rojo después de 5 a 10 minutos. Producción de gas nitrógeno a partir de nitratos negativa: No hay burbujas de gas en el tubo de Durham. Todo el tubo aparece lleno del caldo.

Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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PROCEDIMIENTOS

DE

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8. DETERMINACION DE PIOCIANINA EN AGAR P:

8.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 8.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 8.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: Pseudomonas aeruginosa tiene la habilidad de producir el pigmento piocianina, el cual es un pigmento azul verde o azul turquesa no fluorescente bajo luz ultravioleta, soluble en agua y que se puede observar a simple vista.

8.4. Resultado: Producción del pigmento piocianina positiva: Se observa un pigmento azul-verde o azul turquesa sobre el crecimiento bacteriano.

8.5. Control de calidad: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Producción de piocianina positiva: se observa un pigmento verde azulado o azul turquesa sobre el crecimiento bacteriano. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Producción de piocianina negativa: Se observa crecimiento sin pigmento.

9. DETERMINACIÓN DE PIOVERDINA EN AGAR F:

9.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 9.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 9.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: Pseudomonas aeruginosa produce pioverdina, un pigmento orgánico luminiscente que con la luz ultravioleta de onda larga emite una fluorescencia verde amarillenta intensa.

9.4. Resultado: Resultado: Producción de pioverdina positiva: Bajo luz ultravioleta se observa fluorescencia verde amarillenta intensa en toda la zona de crecimiento.

9.5. Control de calidad: 9.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Producción de pioverdina positiva: bajo luz ultravioleta se observa fluorescencia verde amarillenta intensa en toda la zona de crecimiento. 9.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Producción de pioverdina negativa: bajo luz ultravioleta no hay fluorescencia en la zona de crecimiento. 56

Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE

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10.HIDRÓLISIS DE GELATINA:

10.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 10.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 10.3. Fundamento bioquímico de la bacteria:

El 82% de Pseudomonas aeruginosa posee enzimas gelatinolíticas (gelatinasas) que hidrolizan la gelatina provocando la licuefacción del medio sólido de gelatina.

10.4. Resultado: Hidrólisis de la gelatina variable: Puede observarse o no un halo opaco alrededor del crecimiento de la colonia.

10.5. Control de Calidad: 10.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Hidrólisis de gelatina positiva: Se observa un halo opaco alrededor del crecimiento de la colonia. 10.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Hidrólisis de gelatina negativa: Se observa crecimiento bacteriano sin halo opaco alrededor.

11.DIHIDRÓLISIS DE ARGININA:

11.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 11.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 11.3. Fundamento bioquímico de la bacteria:

Pseudomonas aeruginosa posee la enzima deshidrogenasa y por consiguiente la arginina es convertida a citrulina y ornitina para formar putrescina, la cual acentúa el pH alcalino.

11.4. Resultado: Dihidrólisis de arginina positiva: No hay viraje de color. El caldo se observa con un púrpura más acentuado.

11.5. Control de Calidad: 11.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Hidrólisis de arginina positiva: No hay viraje de color. El caldo se observa con un púrpura mas intenso. 11.5.2. Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 Resultado: Hidrólisis de arginina negativa: Hay viraje de color a amarillo por la fermentación de la glucosa.

Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE

BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

12.GLUCOSA OF (OXIDACIÓN–FERMENTACIÓN):

12.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 12.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 12.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: Pseudomonas aeruginosa oxida la glucosa, por lo que produce ácido solo en aerobiosis. Esta reacción se observa en la parte superior del tubo que no lleva aceite mineral, con viraje al color amarillo. No hay reacción en el tubo con aceite mineral (anaerobiosis).

12.4. Resultado: Oxidación de la glucosa positiva: Hay viraje de color a amarillo en la parte superior del tubo que no lleva aceite mineral (ver tabla No. 1). En el tubo con aceite mineral (reacción en anaerobiosis) no hay cambios y por lo tanto, no hay viraje de color.

12.5. Control de Calidad: 12.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Oxidación de la glucosa positiva. Se observa viraje de color al amarillo en la parte superior del tubo sin aceite mineral (reacción en aerobiosis). No hay actividad en el tubo con aceite mineral (reacción en anaerobiosis). No hay viraje de color. 12.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Oxidación de la glucosa negativa. Fermentación de la glucosa positiva. Hay viraje de color a lo largo de los dos tubos (aerobiosis y anaerobiosis).

13.CRECIMIENTO EN AGAR CETRIMIDA:

13.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 13.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 13.3. Fundamento fisiológico de la bacteria: Pseudomonas aeruginosa tiene la capacidad de crecer en presencia de cetrimida (bromuro de cetil trimetil amonio), un agente que actúa como detergente, disminuyendo la tensión superficial en el medio. Como resultado, muchas bacterias son inhibidas por esta acción a excepción de Pseudomonas aeruginosa. La presencia de cloruro de magnesio y sulfato de potasio estimulan la formación del pigmento azul verde o azul turquesa no fluorescente piocianina y el pigmento verde-amarillo fluorescente de pioverdina que puede ser detectado bajo luz ultravioleta de onda larga (400nm).

13.4. Resultado: Crecimiento en cetrimida positivo: Hay crecimiento de colonias en las que se observa pigmentación azul turquesa (piocianina) y verde amarillo fluorescente (pioverdina) detectado bajo luz ultravioleta.

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Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

13.5. Control de calidad: 13.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Crecimiento en cetrimida positivo: hay buen crecimiento con pigmento azul verdoso y verde amarillento fluorescente que detecta la fluoresceína o pioverdina en presencia de luz ultravioleta.. 13.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Crecimiento en cetrimida negativo. No hay crecimiento ni pigmentos.

14.CRECIMIENTO EN AGAR Mac CONKEY A 42ºC

14.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 14.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 14.3. Fundamento fisiológico de la bacteria: Peudomonas aeruginosa es tolerante a la temperatura de 42oC en agar Mac Conkey, lo que la distingue de las especies P. fluorescens y P. putida del grupo fluorescente.

14.4. Resultado: Crecimiento en agar MacConkey a 42 oC positivo: hay crecimiento bacteriano.

14.5. Control de calidad: 14.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Crecimiento en Mac Conkey a 42oC positivo: hay crecimiento bacteriano de UFCs características. 14.5.2. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Crecimiento en Mac Conkey a 42 oC negativo: no hay crecimiento bacteriano.

Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

P. aeruginosa

–

+ Gas de nitrógeno – Reducción de nitratos a nitritos –

+ Crecimiento a 42 o C – P. fluorescens P. putida

P. stutzeri P. mendocina

DE

+ Pigmentos verdes brillante en Cetrimida o Agar P y F – + Gelatina – + Arginina –

P. stutzeri P. mendocina P. putida

PROCEDIMIENTOS

P. aeruginosa P. fluorescens P. putida

P. aeruginosa P. fluorescens

P. pseudoalcaligenes P. alcaligenes Pseudomonas spp. CDC grupo 1

P. luteola P. orizyhabitans

DE

Glucosa OF

P. luteola P. stutzeri P. alcaligenes P. orizyhabitans P. mendocina Pseudomonas spp. CDC P. putida P. pseudoalcaligenes grupo 1

+ OXIDASA -

1. DIAGRAMA DE FLUJO PARA NO FERMENTADORES MOVILIDAD POSITIVA

MANUAL BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

6.2

Procedimientos para la identificación de Acinetobacter spp

I. ALCANCE: Laboratorios de la Red: Numerales del 1.4.1 al 1.4.11 con respecto a pruebas de identificación. CNDR: Numerales del 1.4.1 al 1.4.12 con respecto a pruebas de identificación.

II. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS: El género Acinetobacter esta constituido por cocobacilos gramnegativos frecuentemente agrupados en pares, estrictamente aerobios, que miden de 1 a 1.5 µm de largo por 1.5 a 2.5 µm de ancho. Carecen de la enzima indofenoloxidasa, inmóviles, y no poseen las enzimas para convertir los nitratos a nitritos. En fase estacionaria de crecimiento y en agares no selectivos predominan formas cocobacilares. Las colonias son lisas, opacas y ligeramente pequeñas. Muchas cepas en Agar Mac Conkey aparecen ligeramente rosadas. El género fue originalmente ubicado en la familia Neisseriaceae pero actualmente esta ubicado en la familia Moraxellaceae. Estudios basados en hibridación del DNA los han clasificado en 21 genomaespecies, de los cuales solo 7 han sido nombrados y de estos, las especies mas frecuentemente aisladas son: Acinetobacter baumannii, seguido por Acinetobacter lwoffii, Acinetobacter haemolyticus, Acinetobacater johnsonii y Acinetobacter junnii. Las especies de Acinetobacter están ampliamente distribuidas en la naturaleza y en el ambiente hospitalario. Son el segundo aislamiento más común luego de Pseudomonas aeruginosa. Son capaces de sobrevivir en la mayoría de superficies secas y húmedas y también pueden estar presentes transitoriamente en la piel humana. Acinetobacter spp son generalmente considerados como no patogénicos pero pueden causar infecciones en individuos debilitados. La mayoría de las infecciones adquiridas en los hospitales afectan el tracto respiratorio, urinario y heridas. Ya sea de estos sitios o por su crecimiento en dispositivos como catéteres, las infecciones pueden progresar a infecciones del torrente sanguíneo. La facilidad de estos microorganismos para adquirir resistencia a múltiples antimicrobianos y su alta capacidad de sobrevivir en muchas superficies ha conducido a su incremento en infecciones hospitalarias.

Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE

BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

III. IDENTIFICACION: 1. EQUIPO, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS PARA LA IDENTIFICACIÓN:

1.1. Equipo: 1.1.1. 1.1.2. 1.1.3. 1.1.4. 1.1.5.

Incubadora de 35 oC a 37 oC Incubadora de 42oC Microscopio con objetivo de 40x Mechero tipo Bunsen Reloj de mesa

1.2. Materiales y Reactivos: Materiales: 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4. 1.2.5. 1.2.6.

Guantes descartables no estériles Asas bacteriológicas con punta redonda y recta Láminas portaobjetos Contenedores con cloro al 0.5% para descarte de material pequeño Marcadores indelebles Palillos de madera

Reactivos: 1.2.7. 1.2.8. 1.2.9. 1.2.10. 1.2.11. 1.2.12.

Solución A: Alfa Naftilamina Solución B: Ácido Sulfanílico Solución Salina estéril al 0.85% Polvo de Cinc Tiras de oxidasa Aceite mineral inerte estéril

1.3. Medios de Cultivo: 1.3.1. Agar Mac Conkey

1.4. Pruebas para Identificación: 1.4.1. 1.4.2. 1.4.3. 1.4.4. 1.4.5. 1.4.6. 1.4.7. 1.4.8.

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Triple Sugar Iron Agar Lisine Iron Agar Oxidasa Movilidad Reducción de nitratos Crecimiento en agar Mac Conkey a 42 oC Glucosa OF (oxidación–fermentación) Utilización del malonato

Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE

BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

1.4.9. Dihidrolisis de arginina 1.4.10. Utilización del citrato 1.4.11. Hidrólisis de gelatina

1.5 Cepas para control de calidad: 1.5.1 1.5.2 1.5.3 1.5.4

Escherichia coli ATCC 25922 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Klebsiella pneumoniae ATCC 13883

SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS: 1.6. Antimicrobianos a utilizar por el metodo de Kirby y Bauer: ver capítulo 16. 1.7. Antimicrobianos a utilizar para la Concentracion Minima Inhibitoria: Ninguno

1.8. Pruebas Especiales: Ninguna

2. CRECIMIENTO EN AGAR Mac CONKEY:

2.1. Fundamento del medio de cultivo: ver capítulo 17. 2.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 2.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: Acinetobacter spp carecen de las enzimas galactósidopermeasa y galactosidasa, por lo que no tienen la capacidad de fermentar la lactosa y las colonias aparecen lisas, opacas y pequeñas. Algunas cepas de Acinetobacter baumannii tienen aspecto ligeramente rosado.

2.4. Resultado: Crecimiento en agar Mac Conkey: UFCs lisas, opacas, pequeñas y ligeramente rosadas después de 24 horas de incubación. Acinetobacter johnsonii crece con dificultad en agar Mac Conkey.

2.5. Control de calidad: 2.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Crecimiento de colonias incoloras o transparentes, con un brillo metálico característico, planas, de bordes irregulares, con olor característico a uvas o a tamal pizque. 2.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Crecimiento de colonias rosadas, convexas, umbilicadas con tamaños entre 2-4 mm. Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE

BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

3. PRUEBA DE TSI (TRIPLE SUGAR IRON):

3.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 3.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 3.3. Fundamento bioquimico de la bacteria: Acinetobacter spp carecen de la enzima glucosa 6 fosfato deshidrogenasa, por lo que no tienen la capacidad de fermentar la glucosa. No poseen la enzima invertasa por lo tanto no pueden fermentar la sacarosa. No poseen la enzima hidrogenasa fórmica por lo que no producen gas a partir de la glucosa.

3.4. Resultado: Características del crecimiento: K /K (alcalino / alcalino = rojo / rojo)

3.5. Control de calidad: 3.5.1. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Fermentan la lactosa / Fermentan la glucosa, con producción de abundante gas: A/A G (ácido /ácido gas abundante = amarillo / amarillo, gas) 3.5.2. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: No fermentan la lactosa / No fermentan la glucosa. No hay producción de gas: K/K (alcalino /alcalino = rojo / rojo).

4. PRUEBA DE LIA (LISINE IRON AGAR):

4.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 4.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 4.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: Acinetobacter spp no poseen la enzima lisinadescarboxilasa por lo tanto no descarboxilan la lisina. Tampoco poseen la enzima lisinadesaminasa por lo que no desaminan la lisina.

4.4. Resultado: Características del crecimiento: K /K (alcalino / alcalino = violeta / violeta)

4.5. Control de calidad: 4.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: No desaminan la lisina / No descarboxilan la lisina ni fermentan la glucosa: K/K (alcalino/ alcalino = violeta / violeta) 4.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: No desaminan la lisina / Descarboxilan la lisina: K/K (alcalino alcalino = violeta / violeta)

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Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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DE

PROCEDIMIENTOS

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

5. PRUEBA DE OXIDASA:

5.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 5.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 5.3. Fundamento bioquímica de la bacteria: Todas las especies de Acinetobacter no poseen la enzima citocromooxidasa por lo que no hay viraje de color en la tira reactiva dentro de los 10 segundos de reacción.

5.4. Resultado: Presencia de indofenoloxidasa negativa: Hay viraje de color al púrpura intenso en los primeros 10 segundos.

5.5. Control de calidad: 5.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Oxidasa positiva: hay viraje de color al púrpura intenso en los primeros 10 segundos. 5.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Oxidasa negativa: No hay viraje de color en los primeros 10 segundos. Se observa de color amarillo.

6. MOVILIDAD AL FRESCO:

6.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 6.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 6.3. Fundamento fisiológico de la bacteria: Todas las especies de Acinetobacter no poseen flagelos por lo que se observa al microscopio, cocobacilos inmóviles.

6.4. Resultado: Movilidad negativa: Se observa al microscopio cocobacilos inmóviles.

6.5. Control de calidad: 6.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Movilidad positiva: Se observan bacilos con movimientos en diferentes direcciones y desplazamientos repentinos a larga distancia. 6.5.2. Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 Resultado: Movilidad negativa: Se observan bacilos sin movimientos. Existe movimiento giratorio (movimiento Browniano) que no debe confundirse con movimiento bacteriano.

Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE

BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

7. REDUCCIÓN DE NITRATOS A NITRITOS:

7.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 7.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 7.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: Todas las especies del genero Acinetobacter carecen de la capacidad de reducir los nitratos a nitritos y a otros productos, por lo que no hay viraje de color después de agregar los reactivos de prueba ni producción de gas en el tubo de Durham.

7.4. Resultado: Reducción de nitratos a nitritos negativa: No hay viraje de color dentro de los primeros 10 minutos después de agregar los reactivos de prueba. Al agregar 20 mg de polvo de cinc hay viraje de color a rosado intenso en los primeros 5 a 10 minutos (reacción verdaderamente negativa). Producción de gas nitrógeno negativa: No hay burbujas de gas en el tubo de Durham.

7.5. Control de calidad: 7.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Reducción de nitratos a nitritos positiva. No hay viraje de color, después de agregar los reactivos de prueba, ni al agregar 20 mg de polvo de cinc. Producción de gas de nitrógeno a partir de nitratos positiva: se observan burbujas de gas en la parte superior del tubo de Durham. 7.5.2. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Reducción de Nitratos a nitritos negativa. No hay viraje de color después de agregar los reactivos de prueba. Confirmación: Luego de la adición de aproximadamente 20 mg de cinc el caldo vira a color rojo después de 5 a 10 minutos. Producción de gas nitrógeno a partir de nitratos negativa: No hay burbujas de gas en el tubo de Durham. Todo el tubo aparece lleno con el caldo.

8. CRECIMIENTO EN AGAR MacCONKEY A 42ºC:

8.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 8.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 8.3. Fundamento de la bacteria: De las dos especies de Acinetobacter más comunes en infecciones hospitalarias, Acinetobacter baumannii crece a 42º C. Acinetobacter lwoffi carece de la habilidad de crecer a 42 oC.

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Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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DE

PROCEDIMIENTOS

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

8.4. Resultado: Crecimiento a 42 oC positivo: Acinetobacter baumannii , Acinetobacter junnii. Desarrollo de colonias opacas, pequeñas y ligeramente rosadas. Crecimiento a 42o negativo: Acinetobacter lwoffii, Acinetobacter haemolyticus y Acinetobacter johnsonii

8.5. Control de calidad: 8.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Crecimiento en MacConkey a 42oC positivo: hay crecimiento bacteriano.de UFCs características. 8.5.2. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Crecimiento en MacConkey a 42 oC negativo: no hay crecimiento bacteriano.

9. GLUCOSA OF (OXIDACIÓN–FERMENTACIÓN):

9.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 9.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 9.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: La especie Acinetobacter baumannii oxida la glucosa en el medio de OF y como resultado, hay acidificación en la parte superior del tubo que no está recubierto con aceite mineral (aerobiosis). Acinetobacter junnii, A. johnsonii y A. iwoffii no son oxidativos para la glucosa, por lo que las tres especies son inactivas en este medio, tanto en el tubo con aerobiosis como en el de anaerobiosis (recubierto con aceite mineral). A. haemolyticus puede o no oxidar la glucosa.

9.4. Resultado: Oxidación de la glucosa: Viraje de color al amarillo en la parte superior del tubo incubado en aerobiosis (sin aceite mineral): Acinetobacter baumannii y A. haemolyticus. Oxidación de la glucosa variable: Puede o no haber oxidación de la glucosa: A. haemolyticus Inactivo (no hay oxidación de la glucosa): No hay viraje de color en el tubo incubado en anaerobiosis (con aceite mineral). Viraje de color al azul en la parte superior del tubo incubado en aerobiosis (sin aceite mineral): Acinetobacter junnii, A. johnsonii y A. lwoffii.

9.5. Control de calidad: 9.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Oxidación de la glucosa positiva. Se observa viraje de color a amarillo en el tercio superior del tubo incubado en aerobiosis (sin aceite mineral). En el tubo con aceite mineral (reacción en anaerobiosis) no hay cambios y por lo tanto, no hay viraje de color.

Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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PROCEDIMIENTOS

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

9.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Fermentación de la glucosa positiva en aerobiosis y anaerobiosis. Hay viraje de color al amarillo en los dos tubos.

10.UTILIZACIÓN DEL MALONATO:

10.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 10.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 10.3. Fundamento bioquímico de la bacteria:

Acinetobacter baumannii y A. johnsonii utilizan el malonato como única fuente de carbono, a diferencia de Acinetobacter haemolyticus, A. junnii y A. lwoffii que no lo utilizan.

10.4. Resultado: 10.4.1. Utilización del malonato como única fuente de carbono positiva: Hay viraje de color al azul: Acinetobacter baumannii y A. johnsonii. 10.4.2. Utilización del malonato como única fuente de carbono negativa: No hay viraje de color: Acinetobacter haemolyticus, A. junnii y A. lwoffii.

10.5. Control de calidad: 10.5.1. Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 Resultado: Malonato positivo. Hay viraje de color al azul. 10.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Malonato negativo. No hay viraje de color. El caldo se observa de color verde.

11.DIHIDRÓLISIS DE ARGININA.

11.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 11.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 11.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: Acinetobacter baumannii, A. haemolyticus y A. junnii poseen la enzima deshidrogenasa y por consiguiente la arginina es convertida a citrulina y ornitina para luego formar putrescina. Este compuesto es alcalino, lo cual intensifica el color púrpura del medio. Acinetobacter lwoffii no hidroliza la arginina y Acinetobacter johnsonii da reacciones variables.

11.4. Resultado: 11.4.1. Hidrólisis de la arginina positiva: Intensificación del color púrpura en el medio: Acinetobacter baumannii, A. haemolyticus y A. junnii.

68

Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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PROCEDIMIENTOS

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11.4.2. Hidrólisis de la arginina negativa: Viraje de color del púrpura a amarillo: Arginina: Positiva. El caldo se observa de color púrpura. 11.4.3. Hidrólisis de la arginina variable: Intensificación del color púrpura o viraje de color a amarillo: Acinetobacter johnsonii.

11.5. Control de calidad: 11.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Hidrólisis de arginina positiva. El caldo se observa turbio y de color púrpura. 11.5.2. Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 Resultado: Hidrólisis de arginina negativa: Hay viraje de color a amarillo por la fermentación de la glucosa.

12.UTILIZACIÓN DEL CITRATO:

12.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 12.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 12.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: Acinetobacter baumannii, A. haemolyticus y A. johnsonii utilizan el citrato como única fuente de carbono. Acinetobacter iwoffii no lo utiliza y Acinetobacter junnii puede o no utilizarlo.

12.4. Resultado: Utilización del citrato positiva: Hay viraje de color a azul y crecimiento en la superficie del medio: Acinetobacter baumannii, A. haemolyticus y A. johnsonii. Utilización del citrato negativa. No hay viraje de color ni crecimiento en la superficie del medio. El medio se observa de color verde: Acinetobacter iwoffii . Utilización del citrato variable: Puede o no haber viraje de color y crecimiento en la superficie del medio. El medio se puede observar de color azul o verde: Acinetobacter junnii.

12.5. Control de calidad: 12.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Utilización del citrato positivo: Hay viraje de color a azul y crecimiento en la superficie del medio. 12.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Utilización del citrato negativo. No hay viraje de color ni crecimiento en la superficie del medio. El medio se observa de color verde.

Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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13.HIDRÓLISIS DE GELATINA:

13.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 13.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 13.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: A excepción de Acinetobacter haemolyticus que hidroliza la gelatina, las especies de Acinetobacter baumannii, A. junnii, A. johnsonii y A. iwoffii no poseen la enzimas gelatinaza que hidrolizan la gelatina y por lo tanto no se producirá licuefacción del medio.

13.4. Resultado: 13.5.1. Hidrólisis de la gelatina positiva: Se observa un halo opaco alrededor del inóculo: Acinetobacter haemolyticus 13.5.2. Hidrólisis de la gelatina negativa. No se observa un halo opaco alrededor del inóculo: Acinetobacter baumannii, A. junnii, A. johnsonii y A. lwoffii:

13.5. Control de calidad: 13.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 13.5.2. Resultado: Hidrólisis de la gelatina positiva. Se observa un halo opaco alrededor del inóculo. 13.5.3. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Hidrólisis de la gelatina negativa. No se observa un halo opaco alrededor del inóculo.

Tabla No 1. Pruebas para diferenciar especies de Acinetobacter spp 37 o C Acinetobacter baumannii

42 o C

+ (100)** + (100)

Reducción de nitratos

Glucosa Arginina Gelatina OF

Citrato Malonato

–

Oxidativo (95)

+ (98)

– ( 0)

+ (100)

+ (98)

Acinetobacter haemolyticus*

+ (100)

– ( 0)

–

Variable

+ (96) (52)

+ (96)

+ (91)

– ( 0)

Acinetobacter junii

+ (100)

+ (90)

–

– ( 0)

+ (95)

– ( 0)

+ ó-(82)

– ( 0)

Acinetobacter johnsonii

– ( 0)

– ( 0)

–

– ( 0)

+ ó – (35)

– ( 0)

+(100)

+ ó – (13)

Acinetobacter iwoffii

+(100)

– ( 0)

–

– ( 6)

– ( 0)

– ( 0)

– ( 0)

– ( 0)

* A. haemolyticus: hemolisa la sangre de carnero. ** Porcentajes. 70

Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

o

o

A. junnii A. baumannii

A. baumennii

– GLUCOSA OF + – MALONATO + A. junnii

A. haemolyticus

– ARGININA + – CITRATO + – GELATINA +

A. Iwoffii A. haemolyticus

A. Iwoffi

A. johnsonnii

En MacConkey

– CRECIMIENTO A 37 C +

en MacConkey

– CRECIMIENTO A 42 C +

A. johnsonii, A. Iwoffii A. haemolyticus

B. gladioli

F. oryzihabitans B. gladioli

–

F. oryzihabitans

MALTOSA OF +

P. luteola

– ESCULINA +

– REDUCCION NITRATOS A NITRITOS+

–

DNAsa + + MANITOL OF

C. luteola S. maltophila

S. maltophila

–

DE

Group NO-1

Pseudomonas luteola Flaviomonas oryzihabitans Stenotrophomonas maltophila Burkholderia gladioli

Acinetobacter baumannii A. lwoffii, A. haemolyticus A. junii, A. johnsonni Group NO-1

PROCEDIMIENTOS

A. baumennii, A. Iwoffii A. haemolyticus, A. junnii, A. johnsonnii

POSITIVA

DE

NEGATIVA

MOTILIDAD

OXIDASA NEGATIVA

DIAGRAMA DE FLUJO PARA LA IDENTIFICACION DE NO FERMENTADORES OXIDASA NEGATIVA MANUAL BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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IV. BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA: 1. Kiska DL and Gilligan PH. Pseudomonas in Manual of Clinical Microbiology, Patrick R. Murray editor in chief. Chap 33, 7th edition, ASM, Washington, 1999. 2. Schereckenberger PC and Von Graevenitz A. Acinetobacter in Manual of Clinical Microbiology, Patrick R. Murray editor in chief. Chap 35, 7th edition, ASM, Washington, 1999. 3. Bacilos Gramnegativos No Fermentadores en: Diagnóstico Microbiológico. Elmer W. Koneman, Stephen D. Allen, William M. Janda, Paul C. Schereckenberger y Washington C. Winn, Capítulo 5. 5ª Edición, 1996. Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, Argentina. 4. Pseudomonas, Acinetobacter en Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. Geo F. Brooks editor, 16ª edición (de la 21ª edición en inglés), capítulo 17, 1999, Editorial El Manual Moderno, México, Bogotá. 5. Pseudomonas y Acinetobacter en Manual de Procedimientos para el diagnóstico de bacilos gramnegativos no fermentadores. Servicio de Bacteriología Especial del Departamento de Bacteriología del Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas. Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud. Ministerio de Salud, Argentina / Organización Panamericana de la Salud, Organización Mundial de la Salud. Sin fecha. 6. Le Minor L, Claude R. Milieux de Culture , Reactifs, Milieux de Diagnostic en Méthodes de laboratoire pour l’identification des enterobactéries. Deuxieme partie: Notes techniques. Editeur: Institut Pasteur. 1ª ed. 1993. Paris, France. 7. Dehydrated Culture Media and Reagents for Microbiology in Difco Manual. Difco Laboratories. Tenth edition, 1984, Detroit, Michigan, USA. 8. Manual of BBL Products and Laboratory Procedures. Power David editor. Sixth edition. 1998. Cockeysville, Maryland.

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Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

6.3 Procedimientos para la identificación de Staphylococcus aureus

I. TOMA DE LA MUESTRA: Ver toma de muestra de exudado de heridas. II. TRANSPORTE DE LA MUESTRA: Ver transporte de exudado de heridas. III. PROCESAMIENTO PREVIO DE LA MUESTRA: Ninguno. IV. EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS: Ver equipo, materiales y reactivos en exudado de heridas.

V. ALCANCE: Laboratorios de la Red: numerales del 1.4.1 al 1.4.4 con respecto a pruebas de identificación. CNDR: numerales del 1.4.1 al 1.4.4 con respecto a pruebas de identificación

VI. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS: Los estafilococos son células esféricas de alrededor de 1µm de diámetro, gram positivas generalmente agrupadas en racimos. En cultivos líquidos se observan además cocos aislados, en pares, tétradas y cadenas. Son microorganismos no móviles y no forman esporas. Los estafilococos crecen con facilidad en la mayor parte de los medios de cultivos y son activos desde el punto de vista metabólico, fermentan muchos carbohidratos y producen pigmentos que varían desde el color blanco hasta el amarillo intenso bajo condiciones aerobias o microaerófilas. Crecen con mayor rapidez a 37oC, pero forman mejor el pigmento a temperatura entre 20o-25oC. Las colonias desarrolladas en medios sólidos son redondas, lisas, elevadas y resplandecientes. S. aureus forma colonias de color gris a amarillo dorado intenso. Las colonias de S. epidermidis tienen tonos de grises a blancas. Los estafilococos producen catalasa , lo que los distingue de los estreptococos. Los estafilococos patógenos generalmente son hemolíticos y coagulan el plasma. Algunos son miembros de la microbiota normal de la piel y mucosas de los humanos, en tanto que otros producen supuración, formación de abscesos, diversas infecciones piógenas e incluso septicemia mortal. Un tipo común de envenenamiento por alimentos es causado por una enterotoxina termoestable producida por algunas cepas de estafilococo. El género Staphylococcus tiene por lo menos 20 especies. Staphylococcus aureus es un microorganismo patógeno de gran importancia para el ser humano por ser el causante de muchas infecciones graves. Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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Entre el 20 al 40 % de los adultos suelen portarlo en las narinas, también se le encuentra en otros sitios como pliegues cutáneos, periné, axilas y vagina. Aunque este microorganismo suele formar parte de la microbiota humana normal, puede producir infecciones oportunistas en huéspedes susceptibles. Los estafilococos coagulasa negativos también constituyen parte de la microbiota humana normal. Staphylococcus epidermidis es el microorganismo recuperado con mayor frecuencia: entre el 50% y 80% de los aislamientos de esta especie se incluyen, endocarditis originada en válvulas cardiacas naturales y protésicas, infecciones producidas por catéteres intravenosos, infecciones de sistemas para derivaciones del LCR, peritonitis asociada con catéteres para diálisis peritoneal, bacteriemia, osteomielitis, infecciones de heridas, infecciones de injertos vasculares, infecciones de prótesis articulares e infecciones de las vías urinarias. Staphylococcus saprophyticus es la segunda causa de infección del tracto urinario en mujeres jóvenes no embarazadas.

VII. IDENTIFICACIÓN: 1. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS PARA LA IDENTIFICACIÓN:

1.1. Equipos: 1.1.1. 1.1.2. 1.1.3. 1.1.4.

Incubadora Microscopio con objetivo de 100 X y 10 X Mechero tipo Bunsen Reloj de mesa

1.2. Materiales y Reactivos: 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4. 1.2.5. 1.2.6. 1.2.7. 1.2.8. 1.2.9.

Guantes descartables no estériles Marcadores indelebles Asas bacteriológicas con punta redonda y recta Tubos de ensayo de vidrio 12 x 75 y de plástico 15 x 100 Contenedores con cloro al 0.5 % para descarte de materiales no reusables Láminas portaobjetos. Solución salina al 0.85 % Peroxido de Hidrógeno al 3 % (H2O2) Colorantes para tinción de Gram: Cristal violeta, Lugol, Safranina y Alcohol etílico al 95% (o Alcohol-Acetona 1:1)

1.2.10. Plasma diluido con solución salina 1:5

1.3. Medios de cultivo: Ver medios de cultivo en exudados de heridas. 1.4. Pruebas para Identificación: 1.4.1. 1.4.2. 1.4.3. 1.4.4. 74

Presencia de b-hemólisis y características macroscópicas Gram Catalasa Coagulasa Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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1.5. Cepas para control de calidad: 1.5.1 Escherichia coli ATCC 25922 1.5.2 Staphylococcus aureus ATCC 25923 1.5.3 Streptococcus pyogenes ATCC 19615

SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS: 1.6. Antimicrobianos a utilizar por el metodo de Kirby y Bauer: ver capítulo 16. 1.7. Antimicrobianos a utilizar para la Concentración Mínima inhibitoria: Antimicrobianos en polvo (de preferencia altamente purificados) 1.7.1 Vancomicina 1.7.2 Penicilina

1.8. Pruebas Especiales: Ninguna. 2. CARACTERÍSTICAS DE LAS UFC EN AGAR SANGRE DE CARNERO: Staphylococcus aureus posee la enzima hemolisina, por lo tanto hemolisa la sangre en el medio de Agar Sangre de Carnero. El cultivo en ASC presenta colonias de color gris a amarillo dorado intenso de 1 a 2 mm de diámetro con zonas de b-hemólisis alrededor de la colonia.

3. COLORACIÓN DE GRAM DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS A PARTIR DEL AGAR SANGRE DE CARNERO: Permite observar la tinción, agrupación y morfología microscópica característica.

3.1. Procedimiento para la preparación del frotis: ver capítulo 3. 3.2. Procedimiento para la tinción del frotis de Gram: ver capítulo 3. 3.3. Resultado: Cocos grampositivos en racimos predominantemente, diplos, tétradas y cadenas cortas.

3.4. Control de Calidad a la Prueba de Gram: 3.4.1. Staphylococcus aureus ATCC 25923 Resultado: Predominantemente cocos grampositivos en racimos, diplococos, tétradas y cadenas cortas. 3.4.2. Escherichia coli ATCC 25922. Resultado: Bacilos gramnegativos

4. PRUEBA DE CATALASA:

4.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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4.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 4.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Staphylococcus aureus posee la enzima catalasa, por lo tanto da reacción positiva que se caracteriza por la formación inmediata e intensa de burbujas al aplicar peróxido de hidrógeno al 3%.

4.4. Resultado: Prueba de catalasa positiva: producción inmediata e intensa de burbujas.

4.5. Control de calidad: 4.5.1. Staphylococcus aureus ATCC 25923 Resultado: Producción inmediata e intensa de burbujas. 4.5.2. Streptococcus pyogenes ATCC 19615 Resultado: No hay producción de burbujas.

PRUEBAS CONFIRMATIVAS 5. PRUEBA DE COAGULASA:

5.1. Fundamento de la prueba: Es una sustancia similar a la trombina presente en los cultivos capaz de convertir el fibrinógeno en fibrina, lo que da como resultado la formación de un coágulo visible.

5.2. Preparación del plasma diluido 1:5 En un tubo estéril de plástico 15 x 100 se agrega 1mL de plasma oxalatado o citratado y 4 mL de solución salina 0.85 %. Este plasma diluido al 1:5 se mantiene en congelación en viales estériles de 1mL en pequeños lotes listos para su uso a 4oC.

5.3. Procedimiento: En un tubo de 10 x 75 se agrega 0.5 – 1mL de plasma diluido. Se inocula de 1 a 2 UFC sospechosas de Staphylococcus aureus. Se incuba a una temperatura de 35 – 37 oC por un tiempo de 1 a 4 horas.

5.4. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Staphylococcus aureus produce coagulasa, proteina de tipo enzimático que coagula el plasma oxalatado o citratado en presencia de un factor contenido en muchos sueros.

5.5. Resultado: Positivo: Formación de coágulo.

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5.6. Control de calidad: 5.6.1. Staphylococcus aureus ATCC 25923 Resultado: Formación de coágulo en menos de 4 horas. 5.6.2. Streptococcus pyogenes ATCC 19615 Resultado: No hay formación de coágulo en 4 horas. En la tabla No. 1 se presentan la pruebas requeridas para diferenciar Staphylococcus epidermidis y saprophyticus de otros estafilococos coagulasa negativos, dos de los estafilococos mas frecuentes aislados en los cultivos. La identificación de otras especies es compleja y poco útil, a menos que se trate de infecciones intrahospitalarias. Por tal razón, a parte de las especies aureus, epidermidis y saprophyticus, los otros estafilococos deben informarse como Staphylococcus spp. o Staphylococcus coagulasa negativa.

Tabla No. 2 Pruebas bioquímicas para diferenciar Staphylococcus epidermidis de otras especies Especies

Catalasa

Ornitina

Urea

Manosa

Xilosa

Sacarosa

Trealosa

Maltosa

Lactosa Reducción e

Nitratos

S. epidermidis

+

v1

+

+1

–

+

–

+

v

+

S. saprophyticus

+

–

+

–

v

+

+

+

v

–

S. warneri

+

–

+

–

–

+

+

+1

v

v

S. hominis

+

–

+

–

–

+1

v

+

v

v

S. simulans

+

–

+

v

–

+

v

+1

+

+

S. xylosus

+

–

+

+

+

+

+

+

v

v

S. lugdunensis

+

+

v

+

–

+

+

+

+

+

v1, 11 – 89 % de las cepas son positivas, con reacción lenta; +1, > 90% de las positivas con reacción lenta; v, 11– 89 % cepas positivas.

6. INFORME: Resultado positivo:

Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus spp o coagulasa negativa

Resultado negativo: No hubo crecimiento bacteriano.

Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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VIII. BIBLIOGRAFÍA: 1. Estafilococos en Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. George F. Brooks editor, Cap. 14, 16ª edición (de la 21 edición en inglés), 1998, Editorial El Manual Moderno S.A. de C.V. México D.F. 2. Identificación de Staphylococcus aureus en: Diagnóstico Microbiológico. Elmer W. Koneman, Stephen D. Allen, William M. Janda, Paul C. Schereckenberger y Washington C. Winn, Cap. 11. 5ª ed., 1996, Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, Argentina. 3. Kloos WE and Bannerman TL. Staphylococcus and Micrococcus in Manual of Clinical Microbiology, Patrick R. Murray ed in chief, chap16, ASM Press, 7 th ed., 1999,Washington D.C.

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Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

6.4 Procedimientos para la identificación de Enterococcus spp

I. TOMA DE LA MUESTRA: Ver toma de muestra en heridas y abscesos. II. TRANSPORTE DE LA MUESTRA: Ver Transporte de la muestra en heridas y abscesos. III. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA: Ver Procesamiento de la muestra en heridas y abscesos. IV. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS: Ver equipos, instrumentos y reactivos en heridas y abscesos. V. ALCANCE: Laboratorios de la Red: numerales del 1.4.1 al 1.4.3 con respecto a pruebas de identificación. CNDR: numerales del 1.4.1 al 1.4.6.2 con respecto a pruebas de identificación.

VI. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS: El género Enterococcus spp incluye los Enterococcus clasificados previamente dentro de los estreptococos del grupo D. Son cocos son grampositivos esféricos u ovoides y se disponen en cadenas, las colonias miden de 0.5 a 1mm de diámetro, son lisas, de bordes definidos y producen hemólisis alfa o ninguna. Existen 18 especies de enterococos ordenadas en 4 grupos (I, II, III, IV). Enterococcus faecalis (pertenece al grupo II) es la especie más común, y causa del 85 al 90% de las infecciones enterococicas, mientras que Enterococcus faecium (pertenece al grupo II) causa del 5 al 10% de las infecciones. Estas dos especies son las mas frecuentemente aisladas. Estos microorganismos son parte de la microbiota del sistema gastrointestinal, vagina y uretra. Los Enterococcus se asocian a las causas más frecuentes de infecciones nosocomiales, en particular en unidades de cuidados intensivos. Suelen transmitirse de un paciente a otro a través de las manos del personal hospitalario. En los pacientes, los sitios más comunes de infección son las vías urinarias, heridas, vías biliares y sangre, han sido asociados a cistitis, pielonefritis, prostatitis, abscesos perinefríticos y endocarditis. En neonatos están asociados a meningitis y bacteremias. Son agentes cada vez más importantes como causa de enfermedad humana, principalmente debido a su resistencia a agentes antimicrobianos a los cuales son en general sensible los estreptococos. Enterococcus faecium suele ser mucho más resistentes a los antimicrobianos que Enterococcus faecalis.

Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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Pruebas realizadas in vitro con Enterococcus spp han demostrado que estos microorganismos presentan CIM para Penicilina 10 a 100 veces mayores que los demás estreptococos. Debido a su resistencia a la penicilina y cefalosporinas de diversas generaciones, a la adquisición de resistencia de alto nivel a los aminoglucosidos y, en la actualidad, a la reciente aparición de resistencia a la vancomicina, estas bacterias con frecuencia están involucradas en sobreinfecciones graves en pacientes que están en tratamiento con estos antimicrobianos. Los Enterococcus spp se diferencian de los estreptococos por su capacidad de desarrollarse a 10 oC y 45oC, crecer en concentraciones de cloruro de sodio al 6,5%, por su tolerancia a altas concentraciones de bilis y por producir la enzima pirrolidonil arilamidasa ( pirrolidonasa o PYR por sus siglas en inglés). Mas del 90% de las cepas poseen el antígeno para el grupo D de Lancefield.

VII. IDENTIFICACIÓN: 1. EQUIPOS, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS PARA LA IDENTIFICACIÓN:

1.1. Equipos: Ver equipos en heridas y abscesos. 1.2. Materiales y reactivos: 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4 1.2.5. 1.2.6. 1.2.7. 1.2.8. 1.2.9. 1.2.10. 1.2.11. 1.2.12. 1.2.13. 1.2.14. 1.2.15. 1.2.16. 1.2.17. 1.2.18. 1.2.19. 1.2.20.

Guantes descartables Gradillas Rotador Contenedores con cloro del 5 al 10% para desechar material contaminante Marcadores indelebles Asas bacteriológicas rectas y redondas Palillos de madera Tubos para coagulasa de 13 x 75 Pinzas estériles Láminas portaobjetos Solución salina al 0.85% Colorantes para tinción de Gram Peroxido de hidrógeno (H2O2)al 30% Discos de optoquina de 6mm Desoxicolato de Sodio al 10% Discos de bilis esculina Láminas (dispositivos) comerciales para prueba de PYR. Caldo nutritivo con 6.5% de NaCl Arabinosa Sorbitol

1.3. Medios de cultivo:

Ver medios de cultivo en heridas y absceso. 80

Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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PROCEDIMIENTOS

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1.4.

Pruebas para la identificación:

1.4.1. 1.4.2. 1.4.3.

Coloración de Gram de las colonias. Prueba de catalasa Pruebas para diferenciar Streptococcus pneumoniae de Enterococcus spp y Streptococcus grupo viridans: Prueba de optoquina Prueba de solubilidad en bilis Pruebas para diferenciar Enterococcus spp de Streptococcus grupo viridans: Prueba de bilis esculina. Prueba de PYR. Prueba de crecimiento en caldo nutritivo al 6.5%. Serología con antisuero Grupo D. Prueba para diferenciar la especies de Enterocococcus spp. Prueba de fermentación de la arabinosa. Prueba de fermentación del sorbitol.

1.4.3.1. 1.4.3.2. 1.4.4. 1.4.4.1. 1.4.4.2. 1.4.4.3. 1.4.5. 1.4.6. 1.4.6.1. 1.4.6.2.

1.5. Cepas para control de calidad: 1.5.1 1.5.2 1.5.3 1.5.4

Escherichia coli ATCC 25922 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 Streptococcus viridans INS 003

SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS: 1.6. Antimicrobianos a utilizar por el método de Kirby y Bauer: Ver capítulo 16. 1.7. Antimicrobianos a utilizar por el método de Concentración Inhibitoria Mínima (CIM/MIC): Ninguno. 1.8. Pruebas especiales para sensibilidad a los antimicrobianos: Ninguna. 2. CRECIMIENTO EN AGAR SANGRE DE CARNERO (ASC):

2.1. Fundamento del medio: ver capítulo 17. 2.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 2.3. Fundamentos fisiológicos de la bacteria ante el medio: Las dos especies que más frecuentemente se aíslan de muestras clínicas carecen o tienen hemolisinas S, las cuales son responsables de la hemólisis alfa de los eritrocitos, al realizar una estría profunda en el medio, observándose un color verde musgo dentro de esta. Las UFCs miden entre 0,5 a 1mm de diámetro, lisas, bordes definidos, ligeramente convexas, grisáceas. Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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2.4. Resultado: Colonias 0.5-1mm de diámetro, grisáceas, bordes definidos, ligeramente convexas, con zona de alfa hemólisis en estría profunda.

2.5. Control de calidad: Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Crecimiento en el medio y no se observa hemólisis verde alrededor de la colonia únicamente en la estría profunda .

3. COLORACIÓN DE GRAM DE LAS UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (UFCs):

3.1. Fundamento de la tinción: ver capítulo de tinción de Gram. 3.2. Procedimiento: ver capítulo de tinción de Gram. 3.3. Fundamentos fisiológicos de la bacteria: Los Enterococcus spp son cocos redondos o ligeramente elongados que se agrupan predominantemente en cadenas y se observan como grampositivos.

3.4. Resultado: Se observa cocos gram positivos esféricos u ovoides dispuestos en cadenas.

3.5. Control de calidad: Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Se observa cocos grampositivos esféricos u ovoides dispuestos en cadenas.

4. PRUEBA DE CATALASA:

4.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 4.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 4.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Los Enterococcus spp carecen de la enzima catalasa, por lo tanto no catalizan el H2O2 en oxígeno y agua. Eventualmente se observan cepas que dan reacciones débiles

4.4. Resultado: Negativo: No hay producción de burbujas.

4.5. Control de Calidad de la prueba: Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Negativo: No hay producción de burbujas. Pruebas para diferenciar Streptococcus pneumoniae de Enterococcus spp y Streptococcus grupo viridans (Ver diagrama de flujo después de la prueba de arabinosa): 82

Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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5. PRUEBA DE OPTOQUINA:

5.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 5.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 5.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: La sensibilidad a la optoquina (clorhidrato de etil hidrocupreína) se utiliza para diferenciar Streptococcus pneumoniae, Streptococcus grupo viridans y Enterococcus spp. Los Enterococcus spp son resistentes a la optoquina. Cuando se colocan discos de optoquina de 6mm, el diámetro del halo de inhibición del crecimiento es menor de 14 mm.

5.4. Resultado: Negativo: El halo de inhibición con discos de 6mm es menor de 14mm.

5.5. Control de Calidad de la prueba: 5.5.1. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Negativo. El halo de inhibición con discos de 6mm es menor de 14mm. 5.5.2. Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 Resultado: Positivo. El halo de inhibición con discos de 6mm es mayor de 14 mm.

6. PRUEBA DE SOLUBILIDAD EN BILIS:

6.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 6.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 6.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Los Enterococcus spp carecen de las enzimas autolíticas (autolisinas) que son las que actúan con el reactivo para acelerar la reacción lítica natural. Por lo tanto, al agregarle el reactivo desoxicololato de Sodio al 0.5% no se activa la autólisis.

6.4. Resultado: Negativo: Se observa turbidez en el tubo.

6.5. Control de Calidad de la prueba: 6.5.1. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Negativo. Se observa turbidez en el tubo. 6.5.2. Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 Resultado: Positivo. El tubo se observa transparente. Pruebas para diferenciar Enterococcus spp del Streptococcus grupo viridans (Ver diagrama de flujo después de la prueba de arabinosa). Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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7. PRUEBA DE BILIS ESCULINA:

7.1. Fundamento de la Prueba: ver capítulo 17. 7.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 7.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Los Enterococcus spp son tolerantes a las altas concentraciones de bilis, por lo tanto hidrolizan la esculina presente en el disco.

7.4. Resultado: Positiva: Se observa ennegrecimiento del disco.

7.5. Control de calidad: 7.5.1. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Positiva. Se observa ennegrecimiento del disco. 7.5.2. Streptococcus grupo viridans INS 003 Resultado: Negativa: Se observa el disco color amarillo.

8. PRUEBA DE TOLERANCIA A LA SAL: La prueba de tolerancia a la sal en concentraciones de 6.5% de NaCl diferencia las especies de Enterococcus spp de los Streptococcus del grupo D no enterococos (Streptococcus bovis).

8.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 8.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 8.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Los Enterococccus spp son halo tolerantes a concentraciones de cloruro de sodio al al 6.5%.

8.4. Resultado: Positivo: Turbidez en el caldo por crecimiento de la bacteria.

8.5. Control de calidad: 8.5.1. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Positivo.Turbidez en el caldo por crecimiento de la bacteria. 8.5.2. Streptococcus grupo viridans INS 003 Resultado: Negativo. No se observa turbidez en el caldo por ausencia de crecimiento de la bacteria.

9. PRUEBA DE PYR (DETERMINACIÓN DE LA ENZIMA PIRROLIDONIL ARILAMIDASA):

9.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 9.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 84

Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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9.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria:

Los Enterococcus spp poseen la enzima pirrolidonilopeptidasa, por lo tanto hidroliza el sustrato y libera la b-naftilamida.

9.4. Resultado: Positivo: Desarrollo de un color rojo cereza oscuro

9.5. Control de calidad: 9.5.1. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Positivo. Desarrollo de un color rojo cereza oscuro 9.5.2. Streptococcus grupo viridans INS 003 Resultado: Negativo. Se observa un color amarillo o naranja (color del reactivo).

10.SEROLOGÍA:

10.1. Fundamento de la Prueba: ver capítulo 10.1. 10.2. Fundamentos inmunológicos de la prueba: ver capítulo 10.1 10.3. Procedimiento: Ver descripción del método como se describe en el capítulo de Streptococcus β hemolíticos numerales 7.3.1.1 al 7.3.1.8 y 7.3.2.1 al 7.3.2.8

10.4. Fundamentos inmunológicos de la bacteria: A diferencia de los demás estreptococos cuyos antígenos están constituidos por polisacáridos (en base a un carbohidrato específico), el Grupo D es la única excepción pues su antígeno está constituido por ácido glicerolteicóico.

10.5. Resultado: Positivo: Se observa aglutinación.

DIFERENCIACIÓN DE LAS ESPECIES DE ENTEROCOCCUS SPP. 11.FERMENTACIÓN DE ARABINOSA:

11.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 11.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 11.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Las cepas de Enterococcus faecium fermentan la arabinosa. Las cepas de Enterococcus faecalis no la fermentan.

Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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11.4. Resultado: Positiva. Viraje del color del medio de violeta a amarillo (Enterococcus faecium). Negativo. No hay viraje del color, se observa violeta (Enterococcus faecalis).

11.5. Control de calidad: 11.5.1. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Negativa. No hay viraje de color. El medio se observa de color violeta. 11.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Positiva. Hay viraje de color del violeta al amarillo.

12.FERMENTACIÓN DE SORBITOL:

12.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 12.2. 12.2 Procedimiento: ver capítulo 17. 12.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Las cepas de Enterococcus faecalis fermentan el sorbitol. Las cepas de Enterococcus faecium no lo fermentan.

12.4. Resultado: Positiva. Viraje del color del medio de violeta a amarillo (Enterococcus faecalis). Negativo. No hay viraje del color, el medio se observa violeta (Enterococcus faecium).

12.5. Control de calidad: Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Positiva. Viraje del color del medio de violeta a amarillo.

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FLUJOGRAMA PARA LA IDENTIFICACIÓN DE STREPTOCOCCUS

Y

ENTEROCOCCUS

ASC Alfa hemolíticas Gram: Cocos Gram + en cadenas Catalasa: negativa

OPTOQUINA Discos 6 mm: ≥ 14mm Discos 10 mm: ≥ 16mm

POSITIVO

RESULTADO DUDOSO

S. pneumoniae

SOLUBILIDAD EN BILIS (Desoxicolato de Na al 10%)

NEGATIVA

BILIS ESCULINA CALDO NUTRITIVO 6,5% NaCl PYR

BILIS ESCULINA + PYR: – CALDO NUTRITIVO 6,5% NaCl:

POSITIVO

NEGATIVO

Enterococcus spp

Streptococcus grupo viridans

Arabinosa + Sorbitol –

Arabinosa – Sorbitol +

Enterococcus faecium

Enterococcus faecalis

POSITIVA

–

S. pneumoniae

Streptococcus bovis

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TABLA DE DIFERENCIACIÓN DE LAS ESPECIES DE Enterococcus spp Pruebas

Enterococcus faecalis

Enterococcus faecium

Frecuencia en humanos

90%

5-10%

Hemólisis*

alfa

alfa

Desarrollo NaCl 6.5%

+

+

Bilis esculina

+

+

PYR

+

+

Sorbitol

+

–

Arabinosa

–

+

+ : >90% son positivos – :