Manual de Prácticas.biotecnologia Ambiental.perfecto

 FACULTAD  FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS

Ingeniero Bioquímico Ambiental

Manual de Prácticas de Laboratorio Biotecnología Ambiental Dra. Susana del Carmen de la Rosa García Modelo Basado en Competencias

2015

Como citar este manual: De la Rosa-García SC 2014. Manual de prácticas de laboratorio de Biotecnología Ambiental Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Universidad Autónoma de Campeche. México. 64 pp.

Como citar este manual: De la Rosa-García SC 2014. Manual de prácticas de laboratorio de Biotecnología Ambiental Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Universidad Autónoma de Campeche. México. 64 pp.

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CAMPECHE

Facultad de Ciencias Químico Biológicas

Ingeniero Bioquímico Ambiental Manual de Prácticas de Laboratorio Biotecnología Ambiental

Compilado por: Dra. Susana del Carmen De la Rosa García

Aprobado por Academia de IBA-LCTA. Fecha:

Validado por Consejo Técnico. Fecha:

DIRECTORIO

Lic. Gerardo Montero Pérez Rector de la Universidad Autónoma de Campeche

Lic. Manuel Sarmiento Morales Secretario General de la Universidad Autónoma de Campeche

Mtra. Angélica Soto Martínez Coordinadora General Académica de la Universidad Autónoma de Campeche

Mtra. María Guadalupe Maldonado Velázquez. Directora de la Facultad de Ciencias Químico Biológicas

M. en C. Primavera García Pérez Coordinadora de la Licenciaturas de IB A-LCTA

M en C. José Eduardo Martín Pool Gómez Presidente de la Academia de las Licenciaturas de IBQ Ambiental y LCTA

Dra. Susana del Carmen De la Rosa García Catedrática de la unidad de aprendizaje de Biotecnología Ambiental

 ÍNDICE 1. ENCUADRE DEL SISTEMA DE PRÁCTICAS .................................................. ....................1 1.1 INTRODUCCIÓN .............................................. .................................................................1 1.2 COMPETENCIA A LAS QUE CONTRIBUYE................................................. ....................2 1.3 COMPETENCIA UBICADA DENTRO DEL MAPA CURRICULAR ..................................... 3 1.4 NIVEL DEL DESEMPEÑO ................................................... ..............................................4 2. PROGRAMA DEL SISTEMA DE PRÁCTICAS................................................. ....................5 3. PRÁCTICAS GENERALES DE SEGURIDAD ................................................... ....................6 3.1 RECOMENDACIONES PARA EL ESTUDIANTE ...............................................................6 3.2 NORMAS OFICIALES MEXICANAS QUE APLICAN PARA TODAS LAS PRÁCTICAS ... 8 4. PARAMETROS DE EVALUACIÓN .....................................................................................8 4.1 SISTEMA DE RUBRICAS..................................................................................................9 4.2 CRITERIO ................................................ ..........................................................................9 4.3 PARÁMETRO ................................................... ...............................................................10 PRÁCTICA 1 .........................................................................................................................11 SELECCIÓN DE BACTERIAS PRODUCTORAS DE AMILASA .............................................11 PROPÓSITO DE LA PRÁCTICA ............................................................................................ 11 CRITERIO DEL DESEMPEÑO ..............................................................................................12 RESULTADOS ESPERADOS................................................................................................12 NORMAS DE SEGURIDAD ESPECÍFICAS EN LA PRÁCTICA ............................................. .12 INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................13 METODOLOGÍA ...................................................................................................................14 RECURSOS MATERIALES  ...................................................................................................14 TÉCNICA .............................................. .................................................................................15 PRIMERA SESIÓN ................................................................................................................15 SEGUNDA SESIÓN ..............................................................................................................15 TERCERA SESIÓN ................................................. ...............................................................16 CUESTIONARIO ...................................................................................................................17 PARAMETROS DE EVALUACIÓN .......................................................................................17 LISTA DE COTEJO................................................................................................................18 CUADRO DE DISPOSICIÓN DE DESECHOS .......................................................................18 DIAGRAMA ECOLÓGICO DE LA PRÁCTICA .......................................................................19

BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA  .................................................................................................19 PARA SABER MÁS ...............................................................................................................20 PRÁCTICA 2 .........................................................................................................................21 AISLAMIENTO DE BACTERIAS TERMOTOLERANTES ...................................................... 21 PROPÓSITO DE LA PRÁCTICA ............................................................................................ 21 CRITERIO DEL DESEMPEÑO ..............................................................................................22 RESULTADOS ESPERADOS................................................................................................22 NORMAS DE SEGURIDAD ESPECÍFICAS EN LA PRÁCTICA ............................................. .22 INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................23 METODOLOGÍA ...................................................................................................................24 RECURSOS MATERIALES  ...................................................................................................24 TÉCNICA .............................................. .................................................................................25 PRIMERA SESIÓN ................................................................................................................25 SEGUNDA SESIÓN ..............................................................................................................25 TERCERA SESIÓN ................................................. ...............................................................26 CUESTIONARIO ...................................................................................................................27 PARAMETROS DE EVALUACIÓN .......................................................................................28 LISTA DE COTEJO................................................................................................................28 CUADRO DE DISPOSICIÓN DE DESECHOS .......................................................................29 DIAGRAMA ECOLÓGICO DE LA PRÁCTICA .......................................................................29 BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA  .................................................................................................29 PARA SABER MÁS ...............................................................................................................30 PRÁCTICA 3 .........................................................................................................................31 AISLAMIENTO DE HONGOS DEGRADADORES DE CELULOSA ...................................... 31 PROPÓSITO DE LA PRÁCTICA ............................................................................................ 31 CRITERIO DEL DESEMPEÑO ..............................................................................................32 RESULTADOS ESPERADOS................................................................................................32 NORMAS DE SEGURIDAD ESPECÍFICAS EN LA PRÁCTICA ............................................. .32 INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................33 METODOLOGÍA ...................................................................................................................34 RECURSOS MATERIALES  ...................................................................................................34 TÉCNICA .............................................. .................................................................................35 PRIMERA SESIÓN ................................................................................................................35

SEGUNDA SESIÓN ..............................................................................................................35 TERCERA SESIÓN ................................................. ...............................................................36 CUESTIONARIO ...................................................................................................................37 PARAMETROS DE EVALUACIÓN .......................................................................................37 LISTA DE COTEJO................................................................................................................37 CUADRO DE DISPOSICIÓN DE DESECHOS .......................................................................38 DIAGRAMA ECOLÓGICO DE LA PRÁCTICA .......................................................................38 BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA  .................................................................................................39 PARA SABER MÁS ...............................................................................................................39 PRÁCTICA 4 .........................................................................................................................40 AISLAMIENTO DE BACTERIAS DEGRADADORES DE PETRÓLEO................................... 40 PROPÓSITO DE LA PRÁCTICA ............................................................................................ 40 CRITERIO DEL DESEMPEÑO ..............................................................................................41 RESULTADOS ESPERADOS................................................................................................41 NORMAS DE SEGURIDAD ESPECÍFICAS EN LA PRÁCTICA ............................................. .41 INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................42 METODOLOGÍA ...................................................................................................................43 RECURSOS MATERIALES  ...................................................................................................43 TÉCNICA .............................................. .................................................................................44 PRIMERA SESIÓN ................................................................................................................44 SEGUNDA SESIÓN ..............................................................................................................45 TERCERA SESIÓN ................................................. ...............................................................45 CUESTIONARIO ...................................................................................................................46 PARAMETROS DE EVALUACIÓN .......................................................................................46 LISTA DE COTEJO................................................................................................................46 CUADRO DE DISPOSICIÓN DE DESECHOS .......................................................................47 DIAGRAMA ECOLÓGICO DE LA PRÁCTICA .......................................................................47 BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA  .................................................................................................48 PARA SABER MÁS ...............................................................................................................48 PRÁCTICA 5 .........................................................................................................................49 ACTIVIDAD EMULSIFICANTE DE BACTERIAS DEGRADADORES DE PETRÓLEO........... 49 PROPÓSITO DE LA PRÁCTICA ............................................................................................ 49 CRITERIO DEL DESEMPEÑO ..............................................................................................50

RESULTADOS ESPERADOS................................................................................................50 NORMAS DE SEGURIDAD ESPECÍFICAS EN LA PRÁCTICA ............................................. .50 INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................51 METODOLOGÍA ...................................................................................................................52 RECURSOS MATERIALES  ...................................................................................................52 TÉCNICA .............................................. .................................................................................53 PRIMERA SESIÓN ................................................................................................................53 SEGUNDA SESIÓN ..............................................................................................................54 TERCERA SESIÓN ................................................. ...............................................................54 CUESTIONARIO ...................................................................................................................55 PARAMETROS DE EVALUACIÓN .......................................................................................55 LISTA DE COTEJO................................................................................................................56 CUADRO DE DISPOSICIÓN DE DESECHOS .......................................................................57 DIAGRAMA ECOLÓGICO DE LA PRÁCTICA .......................................................................57 BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA  .................................................................................................57 PARA SABER MÁS ...............................................................................................................58 ANEXO 1 (Guías descripción colonial)  .................................................................................59 ANEXO 2 (Fórmulas) ...........................................................................................................60 ANEXO 3 (Tablas ejemplo)..................................................................................................61 ANEXO 4 (Composición de Medios de cultivos) ............................................... ..................62 ANEXO 5 (Portada reporte práctica) ..................................................................................63 ANEXO 5 (Contenido del reporte de la práctica) ...............................................................64

MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOTECNOLOGÍA AMBIENTAL 2015

1. ENCUADRE DEL SISTEMA DE PRÁCTICAS 1.1 INTRODUCCIÓN La biotecnología consiste en un gradiente de tecnologías que van desde las técnicas de la biotecnología "tradicional", largamente establecidas, ampliamente conocidas y muy utilizadas (ejemplo la fermentación de alimentos, control biológico natural), hasta la biotecnología moderna, que utilizas las técnicas del DNA recombinante, los anticuerpos monoclonales y los nuevos métodos de cultivo de células y tejidos. La biotecnología se desarrolla en el marco de un enfoque multidisciplinario que involucra varias disciplinas y ciencias, por lo que utilizarás toda la información adquirida durante tu trayectoria académica, desde las materias básicas como la Química orgánica, bioquímica, Microbiología, hasta las más complejas como Bioquímica microbiana, Microbiología ambiental, y obviamente la Biología molecular. El objetivo del este manual es desarrollar tu interés para explorar y explotar la capacidad biosíntesis de microorganismos poco comunes, que jamás pensante que tendría una aplicación, como aquellos que habitan los ambientes más inhóspitos como la piedra. Ya que es innegable que el potencial y múltiples aplicaciones de los microrganismos extremófilos, han marcado un parteaguas en la biotecnología, como las enzimas termotolerantes que han cambiado el rumbo del diagnóstico e identificación molecular de muchos organismos. Pero también han abierto las puertas a nuevas tecnología para la biodegradación de diversos compuestos xenobióticos y recalcitrantes, biominería, así como en la producción de biopolímeros, enzimas, biofertilizantes, electricidad y biocombustibles. El presente manual está diseñado con el propósito mostrarte las diversas estrategias y metodología que te permitan el aislamiento de nuevos microorganismo, que puedan aplicarse usados a las estrategias de biorremediación y así modificar los procesos microbianos típicos de tratamiento de aguas, suelo y residuos, en el marco de la legalidad ética, en la constante búsqueda de mitigar el impacto ambiental regional y nacional. En cada práctica se te brinda la oportunidad de que uses tu creatividad en la elección de diferentes muestras y estrategias de aislamiento, que te permitan la recuperación de una mayor cantidad y variedad de microorganismos con potencial biotecnológico, además con el uso de metodologías dirigidas podrás demostrar su eficiencia y sus posibles aplicaciones.

QBA. Susana del Carmen De la Rosa García PhD

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1.2 COMPETENCIA A LAS QUE CONTRIBUYE Las competencias que se pretenden desarrollar en los estudiantes y que se consideran transferibles al ámbito laboral son las siguientes: Competencia Genérica: Habilidad de investigación, capacidad metodológica, capacidad emprendedora y sensibilidad para temas medioambientales.

Competencia Específica: Desarrolla sistemas de gestión ambiental integral para optimizar el uso de recursos naturales, humanos y económicos logrando una interacción adecuada entre la naturaleza, sociedad y empresa, considerando la normatividad en un marco de planeación estratégica y trabajo multidisciplinario.

Competencia del Área de conocimiento: Diseñar, desarrollar y adaptar tecnologías ambientales  para prevenir, reducir y controlar la contaminación del agua, aire, suelo mediante el uso de la legislación nacional e internacional vigente y el manejo adecuado de los recursos naturales.

Competencia de la Unidad de Aprendizaje : Identificar y modificar los procesos microbianos típicos para tratamiento de aguas, suelo y residuos en vía de utilizar nuevas estrategias de Biorremediación en el marco de la legalidad ética, que mitiguen el impacto ambiental regional y nacional.

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1.3 COMPETENCIA UBICADA DENTRO DEL MAPA CURRICULAR La materia de Biotecnología Ambiental es una materia obligatoria que se oferta en el octavo semestre. La materia ofrece una oportunidad integradora ya que esta al final de una serie de materias básicas (Biología, Ecología y Química orgánica básica), y sustantivas (Microbiología básica, Bioquímica, Bioquímica avanzada y Bioquímica Microbiana) con apoyo de otras materias integradoras como Biología Molecular básica, Impacto ambiental, Auditoría ambiental y Ecotoxicología.

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1.4 NIVEL DEL DESEMPEÑO

Nivel de Competencia:  Al finalizar tus prácticas lograrás un nivel de competencia Nivel 4  ya que obtendrás las herramientas necesarias para la toma de decisiones sobre qué tipo de muestras y metodología elegir para tener éxito en la recuperación de microorganismos con alto potencial biotecnológico, así como su eficiencia para solucionar problemas ambientales, estas habilidades te permitirán insertarse y competir en el mercado profesional. Al realizar en equipo e individualmente los diseños metodológicos, habrás adquirido las habilidades para la elaboración de futuros proyectos novedosos y viables con la capacidad de manejar personal multidisciplinarios, en la resolución de  problemas ambientales dentro del marco de la legalidad: que pueden ser sometidos antes autoridades gubernamentales, o empresas privadas para su financiamiento y ejecución.

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2. PROGRAMA DEL SISTEMA DE PRÁCTICAS Subcompetencia

I. Analizar la utilidad de la biotecnología y el manejo de las enzimas para comprender su aplicación en los procesos bioindustriales

II. Analizar los problemas ambientales y su posible control, remediación y/o eliminación mediante el uso de estrategias y microrganismos conocidos, y proponer la búsqueda de microrganismos novedosos que permitan un control más efectivo en la solución de problemas ambientales en el marco de la legalidad y ética.

Nombre de la práctica

Objetivo de la práctica

Ámbito el desarrollo

Programación

Nivel de desempeño

Semanas

Duración (hrs)

Selección de bacterias Aislar y determinar el potencial para Laboratorio productoras de amilasa producir la enzima amilasas a partir de diferentes muestras de suelos

3

6

3

Aislamiento de bacterias Uso de diferentes técnicas de aislamiento, Laboratorio termotolerantes para la recuperación de una mayor numero de bacterias termotolerantes, a partir de muestras de ambientes extremos.

3

6

3

Aislamiento de hongos Uso de diferentes técnicas de aislamiento Laboratorio degradadores de celulosa para seleccionar hongos epilíticos que proviene de ambientes extremos con alta capacidad degradante de la celulosa.

3

6

3

Aislamiento de bacterias Aislar bacterianas degradadoras de degradadoras de petróleo petróleo de muestras contaminadas con petróleo usando medios que contienen hidrocarburos como única fuente de carbono.

Laboratorio

3

6

4

Actividad emulsificante de Determinar la capacidad emulsificantes de Laboratorio bacterias degradadoras de bacterias con capacidad de crecer sobre petróleo hidrocarburos.

3

6

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3. PRÁCTICAS GENERALES DE SEGURIDAD 3.1 RECOMENDACIONES PARA EL ESTUDIANTE Las prácticas de laboratorio aquí diseñada, requieren de la manipulación de muestras biológicas y microorganismos, y aún que estos no son patógenos, es importante que trabajes de manera ordenada, respetando tu área de trabajo y la de tus compañeros, con la finalidad evitar algún accidente que ponga en riesgo tu integridad personal o tu salud. Por tal motivo es importantes que leas y observes cuidadosamente las siguientes reglas de laboratorio y que conozca las Normas Oficiales Mexicanas de seguridad que aplican en el laboratorio. Al finalizar las prácticas debes separa los residuos generados siguiendo las disposiciones generales de gestión ambiental de nuestra institución. 1-

Durante cada práctica, de manera obligatoria debes portar la bata de laboratorio de algodón bien abotonada, y calzar zapatos de piel cerrados.

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3. PRÁCTICAS GENERALES DE SEGURIDAD 3.1 RECOMENDACIONES PARA EL ESTUDIANTE Las prácticas de laboratorio aquí diseñada, requieren de la manipulación de muestras biológicas y microorganismos, y aún que estos no son patógenos, es importante que trabajes de manera ordenada, respetando tu área de trabajo y la de tus compañeros, con la finalidad evitar algún accidente que ponga en riesgo tu integridad personal o tu salud. Por tal motivo es importantes que leas y observes cuidadosamente las siguientes reglas de laboratorio y que conozca las Normas Oficiales Mexicanas de seguridad que aplican en el laboratorio. Al finalizar las prácticas debes separa los residuos generados siguiendo las disposiciones generales de gestión ambiental de nuestra institución. 1-

Durante cada práctica, de manera obligatoria debes portar la bata de laboratorio de algodón bien abotonada, y calzar zapatos de piel cerrados. 2- Antes de realizar una práctica, debes leer detenidamente el contenido de la práctica a realizar para adquirir una idea clara de su objetivo, fundamento y técnica. (Los resultados deben ser siempre anotados cuidadosamente apenas se conozcan). 3- Las pertenencias y objetos personales que no sea indispensables durante el desarrollo de la práctica de laboratorio, deberán ser colocados en el lugar que corresponda (anaqueles, armarios, etc.), de tal forma que el área de trabajo quede despejada 4- Después de 20 minutos de retraso en la hora de entrada programada, se considerará como falta. 5- Antes de iniciar cualquier práctica, debes limpiar tu lugar de trabajo con un desinfectante, dejando actuar al menos unos 5 minutos antes de iniciar y al finalizar la práctica. 6- El orden y la limpieza son esenciales en todas las experiencias de laboratorio. En consecuencia, al terminar cada práctica debes lavar cuidadosamente el material que se ha utilizado. Cada equipo será responsable de su zona de trabajo y de su material. 7- Protege cualquier herida de tus manos con curitas, guantes o cualquier otra barrera de protección. 8- No debes tocar con los guantes superficies tales como de teléfonos, teclados, carpetas, cuadernos, tu cara si estas o has estado trabajando con material biológico. 9- Debes lavarte perfectamente las manos con jabón o con un desinfectante, al inicio y al dejar el laboratorio. 10- Los accidentes personales, tales como derrame de reactivos, cortes y quemaduras, deberás comunicarlo inmediatamente. 11- Al finalizar la práctica el material debes desechar los residuos en los contenedores asignados, materia orgánica, materia inorgánica, etc.

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12- El material biológico deberá ser colocado en bolsas para su esterilización y su posterior desecho. 13- Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, en otros) deben mantenerse alejados de las llamas de los mecheros. Si se manejan mecheros de gas se debe tener mucho cuidado de cerrar las llaves de paso al apagar la llama. Cuando no se utilizan los mecheros, éstos deben guardarse y debes estar seguro que has apagado al final de cada día de práctica. 14- Antes de utilizar un compuesto hay que fijarse en la etiqueta para asegurarse de que es el que se necesita y de los posibles riesgos de su manipulación. 15- Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como lupas y microscopios, debes manejarlos con cuidado para evitar que se golpes o el forzar los mecanismos. 16- Todos los materiales de desecho que hayan entrado en contacto con microorganismos (como pipetas usadas, placas Petri o tubos), debes colocarlos en soluciones desinfectantes para posteriormente proceder posteriormente a su esterilización. 17- Nunca deben sustraerse ningún equipo, medio o cultivos de microorganismos del laboratorio. 18- Nunca introducir o ingerir cualquier tipo de alimento o bebida dentro del laboratorio. 19- No se admiten visitas personales que distraigan la atención y pongan en riesgo la seguridad en el trabajo que se realizar. 20- Al terminar la práctica, asegúrese de que las llaves de gas y agua queden cerradas. 21- Todo el material de laboratorio utilizado durante la práctica lo deberás entregarse perfectamente. NOTA: Es de suma importancia leer y cumplir con el reglamento de laboratorio vigente en la facultad.

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3.2 NORMAS OFICIALES MEXICANAS QUE APLICAN PARA TODAS LAS PRÁCTICAS Durante tu asistencia a las prácticas deberás leer y observar y las siguientes normas de seguridad. NORMA

REFERENTE A

NOM-001-STPS-2008

Edificios locales, instalaciones y áreas en centros de trabajo-condiciones de seguridad.

NOM-002-STPS-2010

Condiciones de seguridad -Prevención y protección contra incendios en los centros de trabajo.

NOM-005-STPS-1998

Relativa a las condiciones de seguridad e higiene en los centros de trabajo para el manejo, transporte y almacenamiento de sustancias químicas peligrosas.

NOM-010-STPS-1999

Condiciones de seguridad e higiene en los centros de trabajo donde se manejen, transporten, procesen o almacenen sustancias químicas capaces de generar contaminación en el medio ambiente laboral.

NOM-025-STPS-2008

Condiciones de iluminación en los centros de trabajo.

NOM-017-STPS-2008

Equipo de protección personal, uso y manejo en los centros de trabajo.

NOM-018-STPS-200O

Sistema para la identificación y comunicación de peligros y riesgos por sustancias químicas peligrosas en los centros de trabajo.

NOM-019-STPS-2011

Constitución, integración, organización y funcionamiento de las comisiones de seguridad e higiene.

NOM-026-STPS-2008

Colores y señales de seguridad e higiene, e id entificación de riesgos por fluidos conducidos en tuberías.

NOM-028-STPS-2004

Organización del trabajo - Seguridad en los procesos de sustancias químicas.

NOM-030-STPS-2009

Servicios preventivos de seguridad y salud en el trabajo- Funciones y actividades.

NOM-052-SEMARNAT-2005

Establece las características, el procedimiento de identificación, clasificación y los listados de los residuos peligrosos.

NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002

Protección ambiental-Salud Ambiental-Residuos Peligrosos BiológicosInfecciosos- Clasificación y especificaciones de manejo.

4. PARAMETROS DE EVALUACIÓN Al término de cada práctica, se evaluará tu desempeño mediante la siguiente rúbrica y en la cual se considerará el siguiente código de colores con el respectivo porcentaje para cada uno de ellos

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Evidencias a entregar por el estudiante:  Tabla de cotejo validadas por el docente  Reporte de práctica 4.1 SISTEMA DE RUBRICAS 1 2 3 4 5

Seguridad general Muestras y procesamientos Descripción de los aislamiento y actividades biológicas Lista de cotejo Reporte de la práctica

10% 40% 10% 10% 30% 100%

4.2 CRITERIO CRITERIOS Seguridad general

Parámetros cumplidos Muestras y procesamiento

Parámetros cumplidos Descripción de los aislamiento y actividades biológicas

Parámetros cumplidos Lista de cotejo Parámetros cumplidos Reporte de la práctica

EXCELENTE Realizaste la práctica de laboratorio atendiendo todos los procedimientos de seguridad.

NIVEL DEL DOMINIO BUENO Realizaste la práctica de laboratorio atendiendo algunos los procedimientos de seguridad.

DEFICIENTE Realizaste la práctica de laboratorio pero NO atendiste a todos los procedimientos de seguridad.

5/5

3/5

1/5

Demuestra dominio en el procesamiento de la muestras, considerando su origen, usando las metodología necesarias para la recuperación de microorganismos con potencial biotecnológico.

Demuestra dominio medio en el procesamiento de la muestras, considerando su origen, usando las metodología necesaria para la recuperación de microorganismos con potencial biotecnológico. 3/4 Demuestra una habilidad media para describir, evidenciar y diferenciar aislamientos con potencial biotecnológico. 3/5 Entregaste en forma pero no en tiempo la lista de cotejo. 1/2 Cumplió en forma pero no en tiempo la entrega de la práctica, ajustándose a los requisitos requeridos con las evidencias fotográficas, cuadros y gráficas de los aislamiento activos 4/5

Demuestra un dominio medio en el procesamiento de las muestras, pero no emplea la metodología necesaria para la recuperación de microorganismos con potencial biotecnológico. 2/4 Demuestra una habilidad nula para describir, evidenciar y diferenciar aislamientos con potencial biotecnológico. 1/5 No entregaste en tiempo y forma la lista de cotejo. 0/2 No Cumplió en tiempo y forma la entrega de la práctica, ajustándose a los requisitos requeridos con las evidencias fotográficas, cuadros y gráficas de los aislamiento activos 0/5

4/4 Demuestra habilidades para describir, evidenciar y diferenciar aislamientos con potencial biotecnológico. 5/5 Entrego en tiempo y forma la lista de cotejo 2/2 Cumplió en tiempo y forma la entrega de la práctica, ajustándose a los requisitos requeridos con las evidencias fotográficas, cuadros y gráficas de los aislamiento activos.

Parámetros cumplidos

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4.3 PARÁMETRO LISTA DE COTEJO PARAMETROS 1. ¿Trajiste impresa la práctica? 2. ¿Utilizaste la bata de forma correcta? 3. ¿Colocaste adecuadamente tu zona de trabajo? 4. ¿Seguiste las normas de seguridad en el laboratorio? . Te lavaste desinfectaste las manos antes des ués de la ráctica? 1. ¿Trajiste las muestras solicitadas en el manual? 2. ¿Elaboraste el diagrama de aislamiento de acuerdo al tipo de muestra? 3. ¿Trabajaste de manera correcta en tu zona de esterilidad? 4. ¿Realizaste de manera adecuadas el procesamiento de la muestras? 1. ¿Traes la tabla para llenar las descripciones morfológicas de los aislamientos? 2. ¿Realizaste la descripción atendiendo a la guía? 1. ¿Realizaste las evidencias fotográficas de manera adecuada? 4. ¿Identificas claramente los aislamientos con actividad? 5. ¿Identificas que tipo de sustratos son mejores para la obtención de aislamientos con mayor potencial biotecnológico? 1. Tra iste im resa la ho a de cote o? 2. ¿Cumpliste con la entrega de la hoja de cotejo en el tiempo indicado? 1. ¿Entregaste a tiempo la práctica? 2. ¿Cumpliste con los requisitos de caratula, resultados, discusiones, cuestionario y bibliografía? 3. ¿Graficaste y comparaste los resultados obtenidos? 4. Tomaste las evidencias fotográficas representativas de actividad biológica 5. ¿Completaste el cuestionario, soportado las respuestas con al menos dos referencias Bibliográficas?

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EVALUACIÓN

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PRÁCTICA 1 SELECCIÓN DE BACTERIAS PRODUCTORAS DE AMILASA

Imagen Izquierda: Caja con bacterias amilolíticas revelada con iodo Cortesía de: Judith Cruz Jiménez Imagen derecha ɑ-amilasa 3.2.1.1.

Tomada de: Sundarram et al. 2014.

Número de profesionales en formación por práctica (6 Equipos con 4 0 5 integrantes)

PROPÓSITO DE LA PRÁCTICA El profesional en formación será capaz de aislar bacterias productoras de amilasas seleccionar sustratos idóneos en la búsqueda en microorganismos amilolític0s.

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CRITERIO DEL DESEMPEÑO Serás competente para determinar qué tipo de sustratos son los idóneos para el a islamiento de bacterias con potencial amilolítico, cuando:  

  

  





Lleves las muestras solicitadas de acuerdo a las especificaciones de la práctica. Realices el diseño de la metodología a seguir para el aislamiento de las bacterias productoras de la enzima amilasa considerando la muestra a procesar. Procese e inocules de manera adecuada las diferentes muestras. Realices la descripción morfológica de las bacterias aisladas con actividad amilolítica. Determines el número total de bacterias aisladas en término de UFC/ml e Identifiques las bacterias productoras de enzimas. Seas capaz de calcular el índice de actividad amilolítica. Tomes las evidencias fotográficas de la actividad amilolítica. Reconozcas que tipo de sustratos son potenciales en la recuperación de bacterias amilolíticas, considerando la cantidad y el índice de actividad de los aislados. Integres la información obtenida en forma de gráficas, para una mejor interpretación resultados. Revises al menos 3 referencia bibliográficas del tema, para comparar los resultados obtenidos.

RESULTADOS ESPERADOS 

Tabla de cotejo validada por el docente.



Cajas con bacterias productoras de la enzima amilasa.



Reporte final de la práctica con evidencias fotográficas que avalen la actividad

amilolítica, así como una y tabla que describa de la morfología colonia de los aislamientos que producen la enzima amilasa, con el cuestionario resuelto sustentado con al menos 3 referencias bibliográficas. NORMAS DE SEGURIDAD ESPECÍFICAS EN LA PRÁCTICA Tipo de peligro Quemadura con fuego.

Como evitarlo   

Maneja las sustancias flamables alejadas del mechero.  No prendas un mechero con otro mechero Los mecheros de alcohol deben estar secos por fuera.

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Como proceder en caso de    

Avisa inmediatamente al instructor. Sigue las instrucciones del uso del extinguidor en caso necesario. Utiliza el botiquín de p rimeros auxilios Colócate pomada de picrato en la quemadura si es leve.

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INTRODUCCIÓN La enzimas de tipo amilasas son ubicadas de acuerdo a la Comisión de Enzimas (de sus sigla en Inglés Enzyme Comisión) con el código EC 3.2.1, y son aquellas enzimas que hidrolizan enlaces entre oxígenos ó azufre-glucosídicos, De acuerdo al sitio de hidrólisis que efectúan sobre la molécula de almidón, glucógeno y otros polisacáridos, se clasifican como endo y exo amilasas, En el grupo de las endo amilasas las más conocidas son la α- amilasa (EC 3.2.1.1), la pululanasa (EC 3.2.1.41), la glucan 1,4- α-maltohidrolasa (EC 3.2.1.133) y a la isoamilasa (EC 3.2.1.68), (Nonaka et al., 2003). En particular las enzimas α-amilasas catalizan la hidrólisis de enlaces glucosídicos internos α-(1-4) presentes en el almidón, glucógeno y otros polisacáridos, asimismo hidrolizan enlaces glucosídicos α-(1-6) en un menor porcentaje que el α-(1-4) (Fig. 1.1) ( Vihinen y Mantsala, 1989 ). Representan el tipo de amilasas más estudiado y se encuentran ampliamente distribuidas entre plantas, animales, bacterias y hongos, sin embargo debido a su gran demanda a nivel industrial son producidas a gran escala por los dos últimos organismos ( Kilara et al., 2002).

Figura 1.1 Diferentes sitios de corte de la enzima βamilasa sobre la molécula de almidón (Tomado de http://lccbtis7.blogspot.mx/2011/06/enzimas.htlm)

Las α amilasas están conformadas en tres dominios ( Kuriki y col., 2005), el peso molecular de las α-amilasas varía entre 10 y 139kDa (Vihinen y Mantsala, 1989 ). Las amilasas son enzimas las cuales hidrolizan moléculas de almidón dando como productos dextrinas y polímeros compuestos progresivamente por unidades de glucosa. Las amilasas son producidas por diferentes microorganismos como bacterias y hongos. Estas enzimas tienen diferentes aplicaciones industriales como la alimentaria, bebidas alcohólicas, panadería, detergentes entre otras. El suelo y Figura 1.2. Estructura 3D de la β-amilasa de el estiércol de los rumiantes son los lugares idóneos para Bacillus cereus. Modificado de Protein Data  B encontrar microorganismos productores de amilasas. Por ejemplo, B. licheniformis BS1 (Vaseekaran et al., 2010 ), B. subtilis MA9, B. cereus MK8 (Fig. 1.2), (Devi et al., 2010) y diversas cepas de B. amyloliquefaciens son aisladas de estos sustratos.

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Una de las grandes ventajas en la búsqueda de la enzima amilasas, es su fácil detección, ya que solo se requiere medios agarizados, donde la única fuente de carbono es el almidón y para revelar la actividad se usa el yodo (Fig. 1.3). La utilidad de las amilasas en el sector industrial es indudable, ya que proporcionan una forma limpia de conversión o eliminación de polímeros, principalmente almidones, además tienen características bioquímicas y enzimáticas muy variadas, por lo que pueden ser añadidas en cualquiera de las distintas etapas de los procesos industriales en las que son Figura 1.3. Detección de la actividad de la enzima empleadas la constante demanda de amilasas a amilasa revelada con Yodo, (Tomado de Montor 2007) nivel mundial ha conducido a la búsqueda de amilasas con características importantes para la industria, naturalmente existen especies de microorganismos que producen amilasas alcalinas, psicrófilas, termófilas y resistentes a inhibidores.

METODOLOGÍA RECURSOS MATERIALES Muestra 

Suelo cañeros y estiércol de rumiantes.

Material           

Agua destilada Solución salina (0.85 % de NaCl) Agar nutritivo Almidón Solución de Yodo 1% Algodón Gasas Papel Aluminio Matraz Erlenmeyer de 250 ml. Tubos de ensaye de 125 x 16 mm Gradilla para tubo de ensaye de 125 x 16 mm

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    

Marcador indeleble Torunda de algodón y gasa Espátula Charola de pesado Asa de platino

Equipo de laboratorio       

Balanza Placa de calentamiento Autoclave Estufa bacteriológica Campana de flujo laminar/Mechero Sonicador Micropipeta de 200-1000 µL + puntas de 1 ml. /Pipeta de cristal de 1 ml + Propipeta

TÉCNICA PRIMERA SESIÓN 1. Prepara 500 ml de agar nutritivo (AN) siguiendo las indicaciones del proveedor de acuerdo a la marca del medio de cultivo (cantidad de agar y modo de preparación), y adiciona 5 gramos de almidón, disuelve y calienta hasta hasta que el agar cristalice. cristalice. 2. Coloca un tapón de algodón con gasa al matraz con medio y cúbrelo con papel aluminio, y esteriliza los matraces por 20 minutos a 120 °C y 15 libra de presión. 3. Deja enfriar el matraz hasta una temperatura de aproximadamente 50 °C (lo sabrás al tocar rápidamente con el antebrazo el matraz y soportar la temperatura) y vierte el agar en las cajas de Petri estériles de manera cuidadosa, de esta manera evitas la formación de burbujas en las placas. Deja enfriar sin mover las cajas para permitir que el agar se gelifique perfectamente, invierte las cajas y déjalas por 24 horas a 37 °C, para que las placas pasen prueba de esterilidad. SEGUNDA SESIÓN 1. Toma las diferentes muestras, y prepara por separado con cada una dilución 1:10 con solución salina (pesa 1 gramos de la muestra y deposítalo en un tubo con 9 ml de

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solución salina al 0.85%) y agita vigorosamente por un minuto, hasta obtener un solución homogénea. 2. Toma 1ml. de la primera dilución y continua haciendo diluciones; toma 1 ml de la dilución anterior y vierte en el siguiente tubo de ensayo que ya contiene 9 ml de solución salina (dilución =10-2), y así consecutivamente hasta una dilución 10 -6. 3. Inocula 100 µL de cada dilución en la placas de Petri que contiene el AN adicionado con almidón y con una asa extiende el inoculo por el método del pentágono. 4. Incuba las cajas a una temperatura de 35-37 ºC y checa el crecimiento bacteriano cada 24 horas.

TERCERA SESIÓN 1. Realiza la descripción morfológica de las colonias acuerdo a sus características macroscópicas como: elevación, borde, forma, además de datos como color, tamaño y pigmentación de cada una de las colonias que crecieron, usa la guía del Anexo 1, y documéntala en forma de tabla (Anexo 3). 2. Determina la concentración total bacterias aisladas en Unidades Formadoras de Colonia (UF/ml), usando la fórmula 1 (Anexo 2). 3. Con una pipeta colocar con cuidado 5 ml de solución yodo sobre la caja Petri y agita suavemente la caja hasta cubrir completamente la superficie de agar. Las zonas en las que aún quede la presencia de almidón se teñirán de un color entre azul y negro. Si las bacterias han degradado almidón, aparecerán zonas de color claro alrededor de las colonias (Fig. 1.3). 4. Determinar el índice de activad de cada aislamiento activo usando la fórmula 2 (Anexo2), y documéntala usando de guía la siguiente tabla ejemplo.

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Tabla ejemplo 1.1. Índice de actividad amilolítica por sustrato procesado Tipo de sustrato

Índice de actividad amilolítica

5. Una vez que observaste y tomes las evidencias fotográficas, debes seguir con el cuadro de disposición de desecho y el diagrama ecológico de cuadro a las normativas institucionales.

CUESTIONARIO 1. ¿Qué otra técnica se puede usar para recuperar bacteria con actividad amilolítica, argumenta los fundamentos de las técnicas seleccionadas? 2. ¿Diserte sobre todas las posibles aplicaciones biotecnológico que tienen las enzimas con actividad amilolítica? 3. ¿Documenta las fuentes ambientales donde puedes recuperar con mayor éxito bacterias con actividad amilolítica, y por qué (argumenta)?

PARAMETROS DE EVALUACIÓN Las habilidades desarrolladas durante la práctica y los conocimientos adquiridos, te serán evaluadas con el reporte de la práctica y la lista de cotejo. El reporte lo entregaras en la siguiente sesión de clase después de finalizadas las 3 sesiones de esta práctica . La lista de cotejo será validad y promediada con mi evaluación.

Seguridad general Muestras y procesamientos Descripción de los aislamiento y actividades biológicas Lista de cotejo Entrega de reporte

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10% 40% 10% 10% 30% 100%

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LISTA DE COTEJO EVALUACIÓN ESTUDIANTE

PARAMETROS 1. 2. 3. 4. 5.

¿Trajiste impresa la práctica? ¿Utilizaste la bata de forma correcta? ¿Colocaste adecuadamente tu zona de trabajo? ¿Seguiste las normas de seguridad en el laboratorio? ¿Te lavaste y desinfectaste las manos antes y después de la práctica?

1. 2. 3. 4. 1. 2. 3. 4. 5.

Tra iste las muestras solicitadas en el manual? ¿Elaboraste tu diagrama de aislamiento de acuerdo a la muestra? ¿Trabajaste de manera correcta en tu zona de esterilidad? ¿Realizaste de manera adecuada el procesamiento de la muestra? ¿Trajiste la tabla para llenar las descripciones morfológicas de los aislamientos? ¿Realizaste la descripción morfológica de los aislamientos atendiendo la guía de la práctica? ¿Realizaste las evidencias fotográficas? ¿Identificaste claramente los aislamientos con actividad amilolítica? ¿Identificaste que tipo de sustrato son mejores para la obtención de aislamientos con mayor activad amilolítica? Tra iste im resa la ho a de cote o? Cumpliste con la entrega de la hoja de cotejo en el tiempo indicado ¿Entregaste a tiempo la práctica? ¿Cumpliste con los requisitos de caratula, resultados, discusiones, cuestionario y bibliografía? ¿Mostraste las imágenes más representativas de la actividad amilolítica?

1. 2. 1. 2. 3.

4. ¿Graficaste y comparaste los resultados obtenidos? 5. ¿Completaste el cuestionario, soportado las respuestas con al menos dos referencias bibliográficas?

CUADRO DE DISPOSICIÓN DE DESECHOS Tipo de desecho

Procedimiento

Tipo de contenedor

Tubos con diluciones (R1)

Esterilizar en autoclave y dejar enfriar

Drenaje

Cultivos Microbianos (R2)

Depositar las cajas de Petri con los cultivos microbianos en bolsas de plástico, y esterilizar de acuerdo a las instrucciones de uso en la autoclave

Bolsa destinada para descartas el material biológico

Solución de Iodo con cultivo microbiano (R3)

Depositar en un contenedor de cristal con tapa, esterilizar

Drenaje

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DIAGRAMA ECOLÓGICO DE LA PRÁCTICA

Tubos con diluciones de los diferentes sustratos

R1

Placa con crecimiento microbiano

Revelar con yodo

R2

Esterilizar a 120°C a 15 libras de presión por 20 min.

R3

R1 y R2 = Drenaje R3 = Bolsa destinada para el material biológico

BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA Brock, T.D., & Madigan, M.T. (1993). Microbiología. Sexta edición. Prentice Hall Hispanoamericana S.A. Kilara, A., Desai, M., Branen, A.L., Davidson, P.M., Salminen, S.,& Thorngate, J.H. (2002). Enzymes In: Food Additives. Third Ed. Marcel Dekker Inc., New York, USA. 661 –706. Kuriki, T., Hondoh, H., & Matsuura, Y. (2005). The conclusive proof that supports the concept of the α-amylase family: structural similarity and common catalytic mechanism. Biología, Bratislava, 60(16), 13-16. Montor Antonio Juan José (2013).Caracterización de amilasas producidas por bacterias de suelos cultivados con caña de azúcar. Tesis de Licenciatura Universidad a Papaloapan. Nonaka, T., Fujihashi, M., Kita, A., Hagihara, H., Ozaki, K., Ito, S., & Miki, K. (2003). Crystal structure of calcium-free α-amylase from Bacillus sp. strain KSM-K38 (AmyK38) and its sodium ion binding sites. Journal of Biological Chemistry, 278(27), 24818-24824.

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Seeley, H.W., Jr., & VanDemark, P.J., Lee, J.J. (1991). Microbes in action: A Laboratory Manual of Microbiology. W. H. Freeman and Company New York. Fourth Edition. Sundarram, A., & Murthy, T.P.K. (2014). α-Amylase Production and Applications: A Review. Journal of Applied & Environmental Microbiology, 2(4), 166-175. Vihinen, M., & Mantsiila, P. (1989). Microbial amylolytic enzyme. Critical reviews in biochemistry and molecular biology, 24(4), 329-418. PARA SABER MÁS https://www.youtube.com/watch?v=cZyq4koUCNM http://www.scielo.org.co/pdf/vitae/v12n2/v12n2a03 http://www.redalyc.org/pdf/1930/193017723014.pdf

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PRÁCTICA 2 AISLAMIENTO DE BACTERIAS TERMOTOLERANTES

35 °C

40 °C

45 °C Imagen derecha: Microscopia electrónica de Escherichia coli  Tomada de: (http://academic.pgcc.edu/~kroberts/Lecture/Chapter%206/physical.html).

Imagen izquierda: Termotolerancia de Escherichia coli  Tomada de http://www.abc.es/

Número de profesionales en formación por práctica (6 Equipos con 4 0 5 integrantes)

PROPÓSITO DE LA PRÁCTICA El profesional en formación será capaz de aislar bacterias termotolerantes, a partir de muestras de diversos suelos y biopelículas de rocas calcáreas.

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CRITERIO DEL DESEMPEÑO Serás competente para determinar qué tipo de sustratos son los idóneos para la recuperación de bacterias termotolerantes, cuando:       





Lleves las muestras a solicitadas de acuerdo a las especificaciones de la práctica. Realices el diseño de la metodología para la recuperación de bacterias termotolerantes. Procese e inocules de manera adecuada las diferentes muestras. Determines el número total de bacterias termotolerantes aisladas en término de UFC/ml. Seas capaz de determinar el grado de termotolerancia de las bacterias aisladas. Tomes las evidencias fotográficas del grado de tolerancia. Reconozcas que tipo de sustratos son potenciales en la recuperación de bacterias termotolerantes, considerando la cantidad y el grado de termotolerancia obtenido de cada sustrato. Integres la información obtenida en forma de gráficas, para un mejor análisis de los resultados. Revises al menos 3 referencia bibliográficas del tema, para comparar los resultados obtenidos.

RESULTADOS ESPERADOS   

Tabla de cotejo validada por el docente. Cajas con microorganismos termotolerantes Reporte final de la práctica con evidencias fotográficas que avalen el grado de tolerancia de las bacterias termotolerantes, así como el cuestionario resuelto sustentado con al menos 3 referencias bibliográficas.



NORMAS DE SEGURIDAD ESPECÍFICAS EN LA PRÁCTICA Tipo de peligro Quemadura con fuego.

Como evitarlo   

Maneja las sustancias flamables alejadas del mechero.  No prendas un mechero con otro mechero Los mecheros de alcohol deben estar secos por fuera.

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Como proceder en caso de    

Avisa inmediatamente al instructor. Sigue las instrucciones del uso del extinguidor en caso necesario. Utiliza el botiquín de p rimeros auxilios Colócate pomada de picrato en la quemadura si es leve.

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INTRODUCCIÓN El término termófilo proviene de dos palabras griegas: termo (calor) y fila (amor), de acuerdo a estas raíces los microorganismos termófilos no solo toleran altas temperaturas sino que requieren altas temperaturas para sobrevivir (Robb et al. 2008; Madigan et al., 2012; Mehta y Satyanarayana, 2013 ), pero este concepto aun no es muy claro en cuanto a la delimitación entre mesófilo, termotolerante y termófilo. Los Figura 2.1 Clasificación de los microrganismos de acuerdo a su respuestas de crecimiento a diferentes temperatura. microorganismos termófilos por lo general crecen (Tomado de Madigan et al., 2012 ) sobre 50°C hasta 121°C y se clasifican en dos grupos: termófilos moderados o facultativos y termófilos obligatorios; éste último grupo se separa a su vez en termófilos extremos e hipertermófilos. Los termófilos facultativos no requieren de muy altas temperatura para vivir y sus temperaturas óptimas de crecimiento se encuentran entre 40- 60°C, en el segundo grupo los termófilos extremos tienen temperaturas de crecimiento de 60-85°C y los hipertermófilos muestran temperaturas óptimas de crecimiento mayores a 85°C (Fig. 2.1), ( Mehta y Satyanarayana, 20 13 ). Los microorganismos termotolerantes y termófilos se encuentran ampliamente distribuidos en diversos hábitats, pero los lugares volcánicos, geotérmicos (fumaloras, fuentes termales, géiseres), y profundos respiraderos hidrotermales de los océanos son los lugares donde se han encontrado una variedad de cepas termófilas pertenecientes a los géneros Brevibacillus, Thermophilus aquiaticus (Fig. 2.2) Paenibacillus, Cohnella, Anoxybacillus Moorella, Geobacillus,  etc., con temperaturas óptimas de crecimiento desde 40 Figura 2.2 Microscopia electrónica de la Bacteria a 94°C, aeróbicos y/o anaeróbicos, amplia diversidad Thermophilus aquaticus   depositada en membrana millipore. Imagen de Dianne Montpetit metabólica y producción de enzimas termoestable Tomado de Madi an et al. 2012 (Mehta y Satyanarayana, 2013 ). Además de enzimas hidrolítica en fuentes termales, entre ellas se reportan varias representantes del género Bacillus.

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METODOLOGÍA RECURSOS MATERIALES

Muestra  Muestras de diferentes suelos y raspado de biopelícula de roca calcárea Material               

Agar nutritivo Agar soya tripticaseína Agua destilada Caldo nutritivo Algodón Gasas Aluminio Matraz Erlenmeyer de 1000 ml. Tubo de ensaye de 125 x 16mm Gradilla para tubo de ensaye de 125 x 16 mm Espátulas Probeta de 250 mL. Cajas Petri Asas de platino Solución salina 0.85% (NaCl)

Equipo de laboratorio       

Balanza Placa de calentamiento Autoclave Estufa bacteriológica Baño María Sonicador Micropipeta de 200-1000 µL + puntas de 1 ml. /Pipeta de cristal de 1 ml + Propipeta

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TÉCNICA PRIMERA SESIÓN 1. Prepara 500 ml de los siguientes medios de cultivo: Agar nutritivo (AN), Agar soya tripticaseína (AST), siguiendo las indicaciones del proveedor de acuerdo a la marca del medio de cultivo (cantidad de agar y modo de preparación), y calentar hasta que el agar cristalice, coloca un tapón de algodón con gasa al matraz con medio y cubre con aluminio. 2. Prepara 250 ml caldo nutritivo (CN) de acuerdo a las indicaciones del proveedor, dispensa 7 ml del caldo nutritivo en 30 tubos de ensaye de 125x16mm. 3. Esterilizar los medios y los tubos en autoclave por 20 minutos a 120 °C y 15 libra de presión. 4. Dejar enfriar hasta aproximadamente 50 °C y verter el agar en cajas de Petri estériles de manera cuidadosa evitando la formación de burbujas. Dejar enfriar. 5. Una vez que las placas se han gelificado perfectamente, marca la caja de acuerdo al medio agregado. Invierte las cajas y déjalas por 24 horas a 37 °C, junto con los tubos con CN, para que pasen prueba de esterilidad. SEGUNDA SESIÓN 1. Tomar 1 g de la muestras (Suelo o raspado de roca calcárea), y añadir a un tubo con 9 ml de solución salina al 0.85%, agitar vigorosamente por un minuto hasta obtener un solución homogénea. 2. Toma 1ml de la primera dilución y continuar haciendo diluciones; tomando 1 ml de la dilución anterior y vertiéndola en el siguiente tubo con 9 ml de solución salina (dilución =10 -2), y así consecutivamente hasta una dilución 10-6. 3. Los tubos con las diluciones obtenidas serán calentados en baño María por 20 minutos una 50 °C.

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4. Transcurrido el tiempo, inocula 100 µL de cada solución en los medios AN y AST, y con la asa de platino extiende las muestras, usando la técnica de extinción o método del pentágono. 5. Incuba las placas en una estufa a 40 °C, revisar diariamente, y documentar el crecimiento microbiano. 6. Realiza la descripción morfológica de las colonias bacterianas acuerdo a sus características macroscópicas, usando la guía del anexo 1, y documéntala en forma de tabla (Anexo 3). 7. Determina la concentración total por grupo microbiano aislado en Unidades Formadoras de Colonia (UF/ml) usando la fórmula 1 del anexo 2. 8. Toma las evidencias fotográficas del crecimiento bacteriano en cada dilución. 9. Para determinar el grado de tolerancia a la temperatura, los aislamientos serán incubadas a diferentes temperaturas (40, 45 y 50 °C) en CN. Por lo que seleccionaras 10 aislamientos y les asignaras un número correlativo, la inicial del sustrato del cual fueron aislados, seguido de la temperatura. Para cada aislamiento tendrás que inocular 3 los tubos con CN, los coloca los tubos en una gradilla en estufas de incubación de acuerdo a su temperatura correspondiente.

TERCERA SESIÓN 1. Observa la presencia o ausencia de crecimiento microbiano en los tubos incubados las diferentes temperaturas, y documéntalos en la tabla 2.1. 2. Toma las evidencias fotográficas de grado de termotolerancia de los diferentes aislamientos. 3. Una vez que observaste y tomes las evidencias fotográficas, debes seguir con el cuadro de disposición de desecho y el diagrama ecológico de cuadro a las normativas institucionales.

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Tabla 2.1 Grado de termotolerancia de bacterias aisladas No de aislamiento

Crecimiento (Si/No) 40 °C

45 °C

50 °C

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

CUESTIONARIO 1. ¿Por qué se calientas las muestras para el aislamiento? 2. ¿Cómo desmostarías experimentalmente si un microorganismo es extremófilos o extremotolerante? 3. ¿Cómo desmostarías experimentalmente si un microorganismo es poliextrermófilo? 4. ¿Por qué realizaste los ensayos de tolerancia a las diferentes temperaturas, en medio líquido y no en medio de cultivo? 5. Que aplicaciones biotecnológicas pueden tener los microorganismos term otolerantes?

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PARAMETROS DE EVALUACIÓN Las habilidades desarrolladas durante la práctica y los conocimientos adquiridos, te serán evaluadas con el reporte de la práctica y la lista de cotejo. El reporte lo entregaras en la siguiente sesión de clase después de finalizadas las 3 sesiones de esta práctica . La lista de cotejo será validad y promediada con mi evaluación. Seguridad general Muestras y procesamientos Descripción de los aislamiento y actividades biológicas Lista de cotejo Entrega de reporte

10% 40% 10% 10% 30% 100%

LISTA DE COTEJO EVALUACIÓN ESTUDIANTE

PARAMETROS 1. Tra iste im resa la ráctica? 2. ¿Utilizaste la bata de forma correcta? 3. ¿Colocaste adecuadamente tu zona de trabajo? 4. ¿Seguiste las normas de seguridad en el laboratorio? 5. ¿Te lavaste y desinfectaste las manos antes y después de la práctica? 1. Tra iste las muestras solicitadas en el manual? 2. ¿Elaboraste tu diagrama de aislamiento de acuerdo a la muestra? 3. ¿Trabajaste de manera correcta en tu zona de esterilidad? 4. ¿Realizaste de manera adecuada el procesamiento de la muestra? 1. ¿Trajiste la tabla para llenar las descripciones morfológicas de los aislamientos? 2. ¿Realizaste la descripción morfológica de los aislamientos atendiendo la guía de la práctica? 3. ¿Realizaste las evidencias fotográficas? . Identificaste el rado de termotolerancia de los aislamientos? 5. ¿Identificaste que tipo de sustrato son mejores para la obtención de aislamientos con mayor capacidad termotolerante? 1. Tra iste im resa la ho a de cote o? 2. Cumpliste con la entrega de la hoja de cotejo en el tiempo indicado 1. ¿Entregaste a tiempo la práctica? 2. ¿Cumpliste con los requisitos de caratula, resultados, discusiones, cuestionario y bibliografía? 3. ¿Mostraste las imágenes más representativas del grado de termotolerancia? 4. ¿Graficaste y comparaste los resultados obtenidos? 5. ¿Completaste el cuestionario, soportado las respuestas con al menos dos referencias bibliográficas?

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CUADRO DE DISPOSICIÓN DE DESECHOS Tipo de desecho

Procedimiento

Tipo de contenedor

Tubos con muestras (R1)

Esterilizar en autoclave y dejar enfriar

Drenaje

Cultivos Microbianos (R2)

Depositar las cajas de Petri con los cultivos microbianos en bolsas de plástico, y esterilizar de acuerdo a las instrucciones de uso en la autoclave

Bolsa destinada para descartas el material biológico

Tubos con cultivos Microbianos (R3)

Esterilizar en autoclave y dejar enfriar

Drenaje

DIAGRAMA ECOLÓGICO DE LA PRÁCTICA

Tubos con diluciones de los diferentes sustratos Placa con crecimiento microbiano

R1

Tubos con crecimiento microbiano

R2

Esterilizar a 120°C a 15 libras de presión por 20 min.

R3

R1 y R2 = Drenaje R3 Bolsa destinada para el material biológico

BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA Brock, T.D., & Madigan, M.T. (2012). Microbiología. Sexta edición. Prentice Hall Hispanoamericana S.A.

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Mehta D.; Satyanarayana T. (2013) Diversity of Hot Environments and Thermophilic Microbes. In: Thermophilic Microbes in Environmental and Industrial Biotechnology: Biotechnology of Thermophiles ed. Satyanarayana, T., Littlechild, J. and Kawarabayasi, Y. pp. 3-60. Dordrecht: Springer. Robb F.T; Antranikian G.; Grogan D.W.; Driessen A.J.M. (2008). Introducction. En Thermophiles: biology and technology at high temperatures ed. Robb F. T; Antranikian G.; Grogan D. W.; Driessen A. J. M. pp. 3-6 CRC Press. Tamariz Ángeles Carmen del Rosario (2014). Diversidad de bacterias termotolerantes celulolíticas y xilanolíticas aisladas de fuentes termales del Callejón de Huaylas. Tesis de Licenciatura Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Perú PARA SABER MÁS https://www.youtube.com/watch?v=wWpLnPcBhw0 https://www.youtube.com/watch?v=f7L2GkepVQw

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PRÁCTICA 3 AISLAMIENTO DE HONGOS DEGRADADORES DE CELULOSA

Degradación de carboximetilcelulosa por diversos hongos epilíticos, revelados con rojo Congo. Cortesía: Edward Cazán-DEMAB

Número de profesionales en formación por práctica (6 Equipos con 4 0 5 integrantes)

PROPÓSITO DE LA PRÁCTICA El profesional en formación será capaz de aislar hongos con actividad celulolítica, a partir de muestras de diverso sustratos.

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CRITERIO DEL DESEMPEÑO Serás competente para la recuperación de hongos celulolíticos de diferentes sustratos, cuando:  

   









Lleves las muestras a solicitadas de acuerdo a las especificaciones de la práctica. Realices el diseño de la metodología para la recuperación selectiva de hongos con actividad celulolítica. Procese e inocules de manera adecuada las diferentes muestras. Determines el número total de los hongos celulolíticos en término de UFC/ml. Seas capaz de determinar el índice de actividad celulolítica de los hongos aislados. Tomes las evidencias fotográficas de la actividad y el índice celulolítico de los hongos aislados. Reconozcas que tipo de sustratos son potenciales en la recuperación de hongos celulolítico, considerando la cantidad y el grado de termotolerancia obtenido de cada sustrato. Integres la información obtenida en forma de gráficas, para un mejor análisis de los resultados. Revises al menos 3 referencia bibliográficas del tema, para comparar los resultados obtenidos. Visualices el potencial que pueden tener los hongos celulolítico en la aplicación industrial.

RESULTADOS ESPERADOS   

Tabla de cotejo validada por el docente. Cajas con hongos celulolíticos. Reporte final de la práctica con evidencias fotográficas que avalen el grado de tolerancia de las bacterias termotolerantes, así como el cuestionario resuelto sustentado con al menos 3 referencias bibliográficas.

NORMAS DE SEGURIDAD ESPECÍFICAS EN LA PRÁCTICA Tipo de peligro Quemadura con fuego.

Como evitarlo   

Maneja las sustancias flamables alejadas del mechero.  No prendas un mechero con otro mechero Los mecheros de alcohol deben estar secos por fuera.

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Como proceder en caso de    

Avisa inmediatamente al instructor. Sigue las instrucciones del uso del extinguidor en caso necesario. Utiliza el botiquín de p rimeros auxilios Colócate pomada de picrato en la quemadura si es leve.

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INTRODUCCIÓN La celulosa es el compuesto orgánico más abundante en el planeta (Fig. 3.1), un gran número de microorganismos son capaces de degradar la celulosa, pero sólo algunos producen cantidades significativas de celulasas para hidrolizarla completamente. El mecanismo ampliamente aceptado para explicar la hidrólisis enzimática de la celulosa involucra la acción de tres enzimas la endo β1,4 glucanasa ( β-1,4 glucano gluconohidrolasa), la endo β-1,4 celobiohidrolsa y la β-1,4 glucosidasa

Figura 3.1 Estructura de la celulosa

(Lymar, et el 1995, Zhang et al., 2006).

Particularmente, las endoglucanasas actúan al azar sobre los enlaces β-1,4 glucosídicos y se puede medir fácilmente su actividad, usando medios con celulosa soluble con alta grado de polimerización como es la carboximetilcelulosa (CMC). La reacción se hace evidente gracias a la adicción de colorantes como el Rojo Congo, debido a que estos son absorbido solo por la cadenas largas de polisacáridos ( Moreno el al., 2011). Los microorganismos degradadores de celulosa incluyen bacterias, pero sobre todo hongos que habitan una gran variedad de hábitat, pero son los intestino de temitas una de las fuente de elección para la búsqueda de estos degradadores de celulosa. Entre los hongos celulolíticos (Fig. 3.2) destacan Trichoderma reesei , Trichoderma koningii Phanerochaete chrysosporium, Fusarium solani , Penicillium funiculosum (Lynd at al., 2002 ). Los hongos son por excelencia agentes de descomposición de sustratos celulósicos, este atributo es altamente apreciado en la industria, de los alimentos, bebidas, textiles, ropa, papel, tratamiento de aguas residuales, formulación para una gran variedad de detergentes, bioconversión de la biomasa fúngica lignocelulosica en biocombustibles entre otros. Los hongos epilíticos se encuentran adheridos a diversos sustratos rocosos y son capaces de soportar condiciones ambientales extremas, por lo son también una buena opción en la búsqueda de hongos con Figura 3.2 Hongos degradadores de celulosa (Tomado de Vera et al., 2012) potencial celulolítico ( Cazán et al., 2014 ).

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METODOLOGÍA RECURSOS MATERIALES Muestra 

Suelo cañeros, estiércol de rumiantes, termitas, .raspado de biopelículas calcáreas.

de rocas

Material  Agua destilada  Solución salina (0.85% de NaCl)  Carboximetil celulosa  Agar bacteriológico  (NH4)2 SO4  NaNO3  K2HPO4  MgSO4.7H2O  KCl  CaCl2  FeSO4.7H2O  CuSO4  MnSO4.4H2O  Rojo Congo              

ZnSO4.7H2O Solución salina Almidón Algodón Gasas Papel Aluminio Matraz Erlenmeyer de 250 ml. Tubos de ensaye de 125 x 16 mm Gradilla para tubo de ensaye de 125 x 16 mm Marcador indeleble Torunda de algodón y gasa Espátula Charola de pesado Asa de platino

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Equipo de laboratorio       

Balanza Placa de calentamiento Autoclave Estufa bacteriológica Campana de flujo laminar/Mechero Sonicador Micropipeta de 200-1000 µL + puntas de 1 ml. /Pipeta de cristal de 1 ml + Propipeta

TÉCNICA PRIMERA SESIÓN 1. Preparar 500 ml de medio Carboximetilcelulosa (ACMC) (Formulación 1 del Anexo 4), agrega la carboximetil-celulosa (CMC) primero disuelve poco a poco y muy lentamente, agrega el resto de reactivos, y al final el antibiótico (cloranfenicol) disuelve y calienta hasta que el agar cristalice. 2. Coloca un tapón de algodón con gasa al matraz con medio y cúbrelo con papel aluminio, y esteriliza los matraces por 20 minutos a 120 °C y 15 libra de presión. 3. Deja enfriar el matraz hasta una temperatura de aproximadamente 50 °C y vierte el agar en las cajas de Petri estériles de manera cuidadosa. Deja enfriar sin mover las cajas para permitir que el agar se gelifique perfectamente, invierte las cajas y déjalas por 24 horas a 37 °C, para que las placas pasen prueba de esterilidad. SEGUNDA SESIÓN 1. Toma las diferentes muestras, y prepara por separado con cada una dilución 1:10 con solución salina (pesa 1 gramos de la muestra y deposítalo en un tubo con 9 ml de solución salina al 0.85%) y agita vigorosamente por un minuto, hasta obtener un solución homogénea. 2. Toma 1 ml. de la primera dilución y continua haciendo diluciones; toma 1 ml de la dilución anterior y vierte en el siguiente tubo de ensayo que ya contiene 9 ml de solución salina (dilución =10-2), y así consecutivamente hasta una dilución 10 -6.

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3. Inocula 100 µL de cada dilución en las placas de Petri con ACMC con antibiótico, este bajara al mínimo las bacterias presentes en las muestras. Con una asa extiende el inoculo por el método del pentágono. 4. Incuba las cajas a una temperatura de 25-28 ºC y checa el crecimiento fúngico cada 24 horas. TERCERA SESIÓN 1. Realiza la descripción morfológica de las colonias acuerdo a sus características macroscópicas como color, tamaño y pigmentación ver guía (Anexo1) y documéntala en forma de tabla (Anexo 3). 2. Determina la concentración total de hongos aislados en Unidades Formadoras de Colonia (UF/ml) usando la fórmula 1 del Anexo 2 3. Con una pipeta colocar con cuidado 3 ml de solución de Rojo Congo sobre cada caja Petri y agita suavemente la caja hasta cubrir completamente la superficie de agar, deja por 15 minuto, retira el exceso y adiciona 5 ml solución salina (0.85%), y deja reposar por 15 min, retira toda la solución, observa documenta y fotografía la actividad. Las zonas en las que aún quede la presencia de CMC se teñirán de un color rojo. Si las bacterias han degradado la CMC, aparecerán zonas de color claro alrededor de las colonias (portada práctica). 4. Determinar el índice de activad para degradar la CMC usando la siguiente fórmula 2 del anexo 2, y documéntala en la siguiente tabla. Tabla ejemplo 1.2. Índice de actividad amilolítica por sustrato procesado Tipo de sustrato

Índice de actividad celulolítica

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5. Una vez que observaste y tomes las evidencias fotográficas, debes seguir con el cuadro de disposición de desecho y el diagrama ecológico de cuadro a las normativas institucionales.

CUESTIONARIO 1. ¿Qué otros sustratos puedes usarse para demostrar la presencia de hongos con actividad celulolítica? 2. ¿Qué ensayo extra utilizarías para demostrar que cada uno los hongos aislados presentan actividad celulolítica? 3.

¿De qué manare se pueda cuantificar la actividad celulolítica de un hongo?

4. ¿Documenta un proceso biotecnológico donde se puedan aplicar la capacidad celulolítica de un hongo? PARAMETROS DE EVALUACIÓN Las habilidades desarrolladas durante la práctica y los conocimientos adquiridos, te serán evaluadas con el reporte de la práctica y la lista de cotejo. El reporte lo entregaras en la siguiente sesión de clase después de finalizadas las 3 sesiones de esta práctica . La lista de cotejo será validad y promediada con mi evaluación. Seguridad general Muestras y procesamientos Descripción de los aislamiento y actividades biológicas Lista de cotejo Entrega de reporte

10% 40% 10% 10% 30% 100%

LISTA DE COTEJO PARAMETROS

EVALUACIÓN ESTUDIANTE

1. ¿Trajiste impresa la práctica? 2. ¿Utilizaste la bata de forma correcta? 3. ¿Colocaste adecuadamente tu zona de trabajo? 4. ¿Seguiste las normas de seguridad en el laboratorio? 5. ¿Te lavaste y desinfectaste las manos antes y después de la práctica?

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1. ¿Trajiste las muestras solicitadas en el manual? 2. Elaboraste tu dia rama de aislamiento de acuerdo a la muestra? 3. ¿Trabajaste de manera correcta en tu zona de esterilidad? 4. ¿Realizaste de manera adecuada el procesamiento de la muestra? 1. ¿Trajiste la tabla para llenar las descripciones morfológicas de los aislamientos? 2. ¿Realizaste la descripción morfológica de los aislamientos atendiendo la guía de la práctica? 3. ¿Realizaste las evidencias fotográficas? . Determinaste el índice de actividad celulolítica de los aislamientos? 5. ¿Identificaste que tipo de sustrato son mejores para la obtención de aislamientos con actividad celulolítica? 1. Tra iste im resa la ho a de cote o? 2. Cumpliste con la entrega de la hoja de cotejo en el tiempo indicado 1. ¿Entregaste a tiempo la práctica? 2. ¿Cumpliste con los requisitos de caratula, resultados, discusiones, cuestionario y bibliografía? 3. ¿Mostraste las imágenes más representativas del grado de termotolerancia? 4. ¿Graficaste y comparaste los resultados obtenidos? 5. ¿Completaste el cuestionario, soportado las respuestas con al menos dos referencias bibliográficas?

CUADRO DE DISPOSICIÓN DE DESECHOS Tipo de desecho

Procedimiento

Tipo de contenedor

Tubos con diluciones (R1)

Esterilizar en autoclave y dejar enfriar

Drenaje

Cultivos Microbianos (R2)

Depositar las cajas de Petri con los cultivos microbianos en bolsas de plástico, y esterilizar de acuerdo a las instrucciones de uso en la autoclave

Bolsa destinada para descartas el material biológico

Solución de rojo Congo con cultivo microbiano (R3)

Depositar en un contenedor de cristal con ta pa, esterilizar

Drenaje

DIAGRAMA ECOLÓGICO DE LA PRÁCTICA Tubos con diluciones de los diferentes sustratos Placa con crecimiento microbiano

Revelar con Rojo

Esterilizar a 120°C a 15 libras de resión or 20 min.

R1 y R2 = Drenaje R3 = Bolsa destinada para el material biológico

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BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA Edward M. Cazán-Noz, Sergio A. Gómez-Cornelio, Susana C. De la Rosa-García, Benjamín Otto Ortega-Morales Actividad Celulolítica (2014). De Hongos Aislados de Roca Calcárea. VIII Congreso Latinoamericano de Micología. Lymar, E. S., Li, B., & Renganathan, V. (1995). Purification and Characterization of a CelluloseBinding (beta)-Glucosidase from Cellulose-Degrading Cultures of Phanerochaete chrysosporium. Applied and environmental microbiology, 61(8), 2976-2980. Lynd, L. R., Weimer, P. J., Van Zyl, W. H., & Pretorius, I. S. (2002). Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology. Microbiology and molecular biology reviews, 66(3), 506-577. Malmström, E., & Carlmark, A. (2012). Controlled grafting of cellulose fibres –an outlook beyond paper and cardboard. Polymer Chemistry, 3(7), 1702-1713. Moreno, M. L. O., & Uribe-Vélez, D. (2011). Nuevo método para la cuantificación de la actividad endoglucanasa basado en el complejo celulosa-rojo Congo. Orinoquia, 15(1), 7-15. Vera, X. C., Escobar, J. P., Montoya, M. M., & Pérez, M. D. S. Y. (2012). Hongos Nativos con Potencial Degradador de Tintes Industriales en el Valle de Aburrá, Colombia. Rev. Fac. Nal. Agr. Medellín, 65(2), 6811-6821. PARA SABER MÁS https://www.youtube.com/watch?v=wWpLnPcBhw0 https://www.youtube.com/watch?v=f7L2GkepVQw

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PRÁCTICA 4 AISLAMIENTO DE BACTERIAS DEGRADADORES DE PETRÓLEO

Imagen derecha: Microscopía electrónica de Pseudomonas usadas en la degradación de hidrocarburos. Tomada por Nancy López, y copyright © 2007 Environmental Microbiology Laboratory, Inc. Imagen izquierda Derrame petrolero en el golfo de México Tomada de: http://elblogverde.com/

Número de profesionales en formación por práctica (6 Equipos con 4 0 5 integrantes)

PROPÓSITO DE LA PRÁCTICA El profesional en formación será capaz de aislar bacterianas degradadoras de petróleo de muestras contaminadas con petróleo usando medios que contienen hidrocarburos como única fuente de carbono.

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CRITERIO DEL DESEMPEÑO Serás competente para la recuperación de bacterias degradadoras de hidrocarburos, cuando:  





 





Lleves las muestras a solicitadas de acuerdo a las especificaciones de la práctica. Realices el diseño de la metodología para la recuperación selectiva de bacterias degradadoras de hidrocarburos Determines el número total de bacterias degradadoras de hidrocarburos término de UFC/ml. Analices y determines que cepas son las mejores para degradar los diferentes hidrocarburos. Tomes las evidencias fotográficas de la capacidad degradad ora de hidrocarburos. Integres la información obtenida en forma de gráficas, para un mejor análisis de los resultados. Revises al menos 3 referencia bibliográficas del tema, para comparar los resultados obtenidos. Visualices las diversas aplicaciones de las bacterias degradadoras de hidrocarburos en la industrial.

RESULTADOS ESPERADOS   

Tabla de cotejo validada por el docente. Cajas con bacterias degradadoras de petróleo. Reporte final de la práctica con evidencias fotográficas que avalen el aislamiento de bacterias que crecer en medios que tienen como única fuente de carbono hidrocarburos, así como el cuestionario resuelto sustentado con al menos 3 referencias bibliográficas.

NORMAS DE SEGURIDAD ESPECÍFICAS EN LA PRÁCTICA Tipo de peligro Quemadura con fuego.

Como evitarlo   

Maneja las sustancias flamables alejadas del mechero.  No prendas un mechero con otro mechero Los mecheros de alcohol deben estar secos por fuera.

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Como proceder en caso de    

Avisa inmediatamente al instructor. Sigue las instrucciones del uso del extinguidor en caso necesario. Utiliza el botiquín de p rimeros auxilios Colócate pomada de picrato en la quemadura si es leve.

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INTRODUCCIÓN La industria petroquímica es importante en la sociedad moderna, no obstante la falta de programas de protección al ambiente, hace que el medio ambiente se contamine al producirse derrames de petróleo (Fig. 4.1), principalmente por el deterioro de los oleoductos, descargas de efluentes contaminados, a la producción, transporte y almacenamiento de este recurso natural (Shanidul y Tanaka, 2004 ). Los hidrocarburos de petróleo pueden ser divididos en cuatro clases: los saturados, los aromáticos, los asfaltenos Figura 4.1 derrame petrolero en Coatzacoalcos Foto: Cortesía Greenpeace/Prometeo Lucero). (fenoles, ácidos grasos, cetonas, esteres y porfirinas) y las resinas (piridinas, quinolonas, carbazoles, sulfóxidos y a midas). En general al capacidad de degradación por los microorganismos es mayor para los hidrocarburos saturados, le siguen los aromáticos ligeros, y finalmente los más difíciles de degradar que son los aromáticos de alto peso molecular y los compuestos polares. Los hidrocarburos se han clasificado en un orden de susceptibilidad al ataque microbiano en forma decreciente así: n-alcanos, alcanos ramificados, aromáticos de bajo peso molecular y alcanos cíclicos ( Leahy y Colwell, 1990). Los género más utilizado son las Pseudomonas (Van Hamme et al., 2003). Esta puede degradar grupos aromáticos mediante la conversión del núcleo aromático en catecol mediante la acción de dioxigenasas., y luego la conversión acetaldehído y piruvato vía rompimiento orto o meta del catecol,y Figura 4.2 Hidrocarburos aromáticos policíclicos finalmente formando acetil-CoA, los cuales son incorporados en el ciclo del ácido cítrico. En el metabolismo de hidrocarburos han identificado que los genes implicados en la degradación están codificados en su mayoría en plásmidos. Bacterias, cianobacterias, algas y hongos, son capaces de degradar hidrocarburos policíclicos de bajo (dos o tres anillos), (Fig.4.2) o alto peso molecular (cuatro o más anillos) como naftaleno, acenafteno, antraceno, fluoranteno, pireno y criseno y usarlos como única fuente de carbono (Leahy y Collwel, 1990; Van Hamme et al., 2003 ).

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METODOLOGÍA RECURSOS MATERIALES Muestra 

100 gramos de suelo contaminado con petróleo.

Material                            

Agua destilada Agar bacteriológico (Tubos de ensaye de 125 x 16 mm NH4)2 SO4 NaNO3 K2HPO4 MgSO4.7H2O KCl CaCl2 FeSO4.7H2O CuSO4 Cajas de Petri de cristal MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O Hexano Heptano N-octano Bolsa de polietileno Algodón Gasas Papel Aluminio Matraz Erlenmeyer de 250 ml. Gradilla para tubo de ensaye de 125 x 16 mm Marcador indeleble Torunda de algodón y gasa Espátula Charola de pesado Asa de platino

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Equipo de laboratorio       

Balanza Placa de calentamiento Autoclave Estufa bacteriológica Campana de flujo laminar/Mechero Sonicador Micropipeta de 200-1000 µL + puntas de 1 ml. /Pipeta de cristal de 1 ml + Propipeta

TÉCNICA PRIMERA SESIÓN 1. Prepara 750 ml de Medio Básico (Formulación 2 en el Anexo 4). 2. Toma 600 ml y agregar 9 g de agar bacteriológico, calentar hasta que el medio cristalice, separa volumen en tres matraces colocando de 200 ml en cada uno. 3. Agrega a un matraz 4 ml de hexano, a otro 4 ml de hexano y otro con 4 ml de heptano. 4. Toma los 150 ml de medio básico que quedo y repártelo en 6 matraces en volúmenes de 25 ml y agregar a dos matraces 0.5 ml de hexano, a otros dos 0.5 ml heptano y otros dos con 0.5 ml n-octano (medio líquido de pre-enriquecimiento). 5. Prepara 25 ml de solución salina al 0.85% (pesa 0.2125 g de NaCl y disuélvela en 25 ml de agua destilada) 6. Coloca un tapón de algodón con gasa cada matraz con medio y cúbrelo con papel aluminio, y esterilízalos por 20 minutos a 120 °C y 15 libra de presión. 7. Deja enfriar el matraz hasta una temperatura de aproximadamente 50 °C y vierte el agar en las cajas de Petri estériles de manera cuidadosa. Deja enfriar sin mover las cajas para permitir que el agar se gelifique perfectamente, invierte las cajas y déjalas por 24 horas a 37 °C, para que las placas pasen prueba de esterilidad. 8. Toma 5 gramos de muestra de suelo y deposítalo en el matraz de 250 ml con 50 ml de solución) mezcla perfectamente.

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9. Deposita 2 ml de la suspensión a cada uno de los medios líquidos de pre-enriquecimiento (Medio básico suplementado con los hidrocarburos de hexano, heptano y n-octano) y deja incubar a 30ºC con agitación constante a 150 rpm hasta la próxima sección. SEGUNDA SESIÓN 1. Toma 100 l de cada pre-cultivo y depositar sobre las cajas de medio básico suplementado con los diferentes hidrocarburos: hexano, heptano y n-octadecano). Extiende las muestras por el método del extinción o pentágono con ayuda de un asa de platino. 2. Incuba las cajas a una temperatura de 25-28 ºC y checa el crecimiento fúngico cada 24 horas.

TERCERA SESIÓN 1. Realiza la descripción morfológica de las colonias acuerdo a sus características macroscópicas como color, tamaño y pigmentación siguiendo la guía del Anexo 1 y documéntala en forma de tabla (Anexo3). 2. Determina la concentración de Unidades Formadoras de Colonia (UF/ml), recuperado por hidrocarburo, usa la fórmula 1 del anexo 2. 3. documenta los aislamientos recuperados por hidrocarburo, en la siguiente tabla. Tabla ejemplo 4.1 Aislamiento por fuente de hidrocarburo.

Morfología colonial

Fuente de carbono (Crecimiento)

Descripción

Hexano

heptano

n-octadecano

Numero de aislamientos

4. Una vez que observaste y tomes las evidencias fotográficas, debes seguir con el cuadro de disposición de desecho y el diagrama ecológico de cuadro a las normativas institucionales.

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CUESTIONARIO 1. ¿Qué tipo de géneros bacterianos pueden crecer en medio con hidrocarburos como única fuente de carbono? 2. ¿Qué técnica otra técnica se puede utilizar para el aislamiento de bacterias degradadoras de petróleo? 3. ¿Qué estrategia metodológica seguirías para la recuperación de bacterias degradadoras de hidrocarburos de una ambiente marino? PARAMETROS DE EVALUACIÓN Las habilidades desarrolladas durante la práctica y los conocimientos adquiridos, te serán evaluadas con el reporte de la práctica y la lista de cotejo. El reporte lo entregaras en la siguiente sesión de clase después de finalizadas las 3 sesiones de esta práctica . La lista de cotejo será validad y promediada con mi evaluación. Seguridad general Muestras y procesamientos Descripción de los aislamiento y actividades biológicas Lista de cotejo Entrega de reporte

10% 40% 10% 10% 30% 100%

LISTA DE COTEJO PARAMETROS

EVALUACIÓN ESTUDIANTE

1. ¿Trajiste impresa la práctica? 2. Utilizaste la bata de forma correcta? 3. ¿Colocaste adecuadamente tu zona de trabajo? 4. ¿Seguiste las normas de seguridad en el laboratorio? 5. ¿Te lavaste y desinfectaste las manos antes y después de la práctica? 1. ¿Trajiste las muestras solicitadas en el manual? 2. ¿Elaboraste tu diagrama de aislamiento de acuerdo a la muestra? 3. ¿Trabajaste de manera correcta en tu zona de esterilidad? 4. ¿Realizaste de manera adecuada el procesamiento de la muestra? 1. Tra iste la tabla ara llenar las descri ciones morfoló icas de los aislamientos? 2. ¿Realizaste la descripción morfológica de los aislamientos atendiendo la guía de la práctica? 3. ¿Realizaste las evidencias fotográficas? 4. ¿Describiste la morfología colonial de los aislamientos de acuerdo al hidrocarburo usado? 5. ¿Identificaste que tipo de hidrocarburo es mejor para la obtención de aislamientos con actividad?

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1. Tra iste im resa la ho a de cote o? 2. Cumpliste con la entrega de la hoja de cotejo en el tiempo indicado 1. ¿Entregaste a tiempo la práctica? 2. ¿Cumpliste con los requisitos de caratula, resultados, discusiones, cuestionario y bibliografía? 3. ¿Mostraste las imágenes más representativas del grado de termotolerancia? 4. ¿Graficaste y comparaste los resultados obtenidos? 5. ¿Completaste el cuestionario, soportado las respuestas con al menos dos referencias bibliográficas?

CUADRO DE DISPOSICIÓN DE DESECHOS Tipo de desecho

Procedimiento

Tipo de contenedor

Pre-cultivo con hidrocarburos (R1)

Esterilizar en autoclave y dejar enfriar

Contendedor para desechos de hidrocarburos

Cultivos Microbianos con hidrocarburos (R2)

Depositar las cajas de Petri con los cultivos microbianos en bolsas de plástico, y esterilizar de acuerdo a las instrucciones de uso en la autoclave

Bolsa destinada para descartas el material biológico

DIAGRAMA ECOLÓGICO DE LA PRÁCTICA

Matraces concultivo microbiano y hidrocarburos

R1

Placa con crecimiento microbiano con hidrocarburos

Esterilizar a 120°C a 15 libras de presión por 20 min.

R2 R1 = Contenedor para reactivos inflamables R3 = Bolsa destinada para el material biológico

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BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA Leahy, J., y Colwell, R., 1990. Microbial degradation of hydrocarbons in the environment. Microbiol Rev, 54:305-315. Habib Fernando Yanine (2010) Evaluación de la diversidad de bacterias degradadoras de hidrocarburos aisladas de suelos de las cuencas de los ríos Otún y la Vieja. Tesis de Maestría Universidad Nacional De Colombia, Bogotá. Van Hamme, J.; Singh, A. y Ward, O. Recent advances in petroleum microbiology. Microbiol. Mol Biol Rev, 2003; 67:503 –549.

PARA SABER MÁS dialnet.unirioja.es/descarga/articulo/2986556.pdf https://www.youtube.com/watch?v=f7L2GkepVQw

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PRÁCTICA 5 ACTIVIDAD EMULSIFICANTE DE BACTERIAS DEGRADADORES DE PETRÓLEO

Imagen: Diversidad de la actividad emulsificante del hexadecano por bacterias marinas. Cortesía: Tomas López Gutiérrez

Número de profesionales en formación por práctica (6 Equipos con 4 0 5 integrantes)

PROPÓSITO DE LA PRÁCTICA El profesional en formación será capaz de determinar la capacidad emulsificante de diferentes tipos de aceites, incluso de motor de bacterianas degradadoras con potencial para degradar hidrocarburos.

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CRITERIO DEL DESEMPEÑO Serás competente para la determinar la capacidad emulsificantes de bacterias degradadoras de hidrocarburos, cuando:   

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Lleves las muestras a solicitadas de acuerdo a las especificaciones de la práctica. Determines correctamente el índice de emulsificación de cada bacteria. Analices y determines que aislamientos son los mejores para emulsificar a más de un aceite o hidrocarburo con respeto a un control de emulsificación. Tomes las evidencias fotográficas de la capacidad degradadora de hidrocarburos. Integres la información obtenida en forma de gráficas, para un mejor análisis de los resultados. Revises al menos 3 referencia bibliográficas del tema, para comparar los resultados obtenidos. Visualices las diversas aplicaciones de las bacterias degradadoras de hidrocarburos en la industrial.

RESULTADOS ESPERADOS  



Tabla de cotejo validada por el docente. Índice de emulsificación frente a diferentes aceites y hidrocarburos de las bacterias degradadoras de hidrocarburos. Reporte final de la práctica con evidencias fotográficas que avalen las mejores cepas con actividad emulsificante frente a diferentes aceites e hidrocarburos, así como el cuestionario resuelto sustentado con al menos 3 referencias bibliográficas.

NORMAS DE SEGURIDAD ESPECÍFICAS EN LA PRÁCTICA Tipo de peligro Quemadura con fuego.

Como evitarlo   

Maneja las sustancias flamables alejadas del mechero.  No prendas un mechero con otro mechero Los mecheros de alcohol deben estar secos por fuera.

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Como proceder en caso de    

Avisa inmediatamente al instructor. Sigue las instrucciones del uso del extinguidor en caso necesario. Utiliza el botiquín de p rimeros auxilios Colócate pomada de picrato en la quemadura si es leve.

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INTRODUCCIÓN Los biosurfactantes (BS) son compuestos con una porción hidrofílicas y otra hidrofóbicas que son producidos principalmente por hongos y bacterias. Estas moléculas tienen propiedades emulsificantes y dispersantes, por lo que, disminuyen la tensión superficial del agua. Los microorganismos tienden a sintetizan BS cuando su fuente de carbono es parcialmente soluble o insoluble en agua, ya que así se ven obligados a sintetizar estas moléculas con propiedades tensoactivas que favorecen la biodegradación de los muchos sustratos que insolubles ( Supaphol et al., 2011). Por ésta razón, los sitio contaminados con residuos de baja solubilidad, son lugares excelentes para el aislamiento de microorganismos con capacidad BS, transcienden en los procesos de biorremediación de sitios contaminados con metales pesados, plaguicidas organofosforados, hidrocarburos totales del petróleo y aceites sintéticos, ya los BS  juegan papeles importantes al incrementan la biodisponibilidad y biodegradabilidad (Fig. 5.1), ( Banat et al., 2000; Yañez-Ocampo et al., 2011 ). Adicionalmente los BS son apreciados en la industria gracias a su Figura 5.1 Emulsificación del keroseno por amplia variedad de aplicaciones en procesos Pseudomonas aeruginosa. Tomado de: da Silva (2011). alimenticios, industriales, cosméticos entre otros ( Singh et al., 2007).

Los BS microbianos mejor estudiados son los glucolípidos (ramnolípidos, trehalolípidos y soforolípidos); A particularmente bacterias del género B Pseudomonas sp. (Yañez-Ocampo y Wong et al., 2013). La efectividad de un BS se puede establecerse en base a distintos C parámetros, pero el más importantes Figura 5.2 Estructura de A) Ramnolipidos, B)Trehalolípidos, C)Soforolípidos es la Concentración Micelar Critica Tomado de http://lipidlibrary.aocs.org/Lipids/rhamno/index.html (CMC), y la disminución de la tensión superficial (TS) e interfacial (TI). La CMC es la concentración mínima de un agente biosurfactante capaz de formar micelas (Fig. 5.2). Estas micelas se producen cuando la parte hidrofóbica del BS al ser incapaz de formar puentes de hidrógeno con las moléculas de agua, produce un aumento de la energía libre del sistema. Una manera de aliviar este aumento, es aislar la región hidrofóbica interaccionando con otras superficies, asociándose a otros compuestos hidrofóbicos o formando vesículas (micelas) en las que la región lipofílica se sitúa UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CAMPECHE

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en el centro y la hidrofílica hacia fuera, formando los puentes de hidrógeno con las moléculas de agua. Cuanto menor sea la CMC, más eficiente es el surfactante en cuestión. La formación de micelas mixtas entre surfactantes y otros compuestos hidrofóbicos como los hidrocarburos favorecen la dispersión del mismo en medio acuoso aumentando la biodisponibilidad y por consiguiente la posibilidad de degradación ( Raiger-Lustman y López, 2009 ).

METODOLOGÍA RECURSOS MATERIALES Muestra 

Bacterias degradadoras de petróleo de la práctica no 4.

Material                       

Agua destilada Agar bacteriológico (Tubos de ensaye de 125 x 16 mm NH4)2 SO4 NaNO3 K2HPO4 MgSO4.7H2O KCl CaCl2 FeSO4.7H2O CuSO4 Cajas de Petri de cristal MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O Hexano Heptano N-octano Petróleo crudo Aceite de motor quemado Aceite de girasol Dodecil sulfato de sodio (SDS) Tritón 100 Bolsa de polietileno

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         

Algodón Gasas Papel Aluminio Matraz Erlenmeyer de 250 ml. Gradilla para tubo de ensaye de 100 x 15 mm Marcador indeleble Torunda de algodón y gasa Espátula Charola de pesado Asa de platino

Equipo de laboratorio        

Balanza Placa de calentamiento Autoclave Estufa bacteriológica Campana de flujo laminar/Mechero Centrifuga refrigerada Sonicador Micropipeta de 200-1000 µL + puntas de 1 ml. /Pipeta de cristal de 1 ml + Propipeta

TÉCNICA PRIMERA SESIÓN 1. Prepara 500 ml de Medio Básico (Formulación 2 en el Anexo 4), y adicionar 25 ml. de hexano. 2. Prepara 10 matraces de 150 ml con 50 ml de medio básico-hexano y colócale todos los matraces, tapones de algodón con gasa y cúbrelos con aluminio. Esteriliza en autoclave por 20 minutos a 120 °C a 15 libra de presión. 3. Inocula los matraces con una asada de las 5 aislamientos con 5 de las mejor cepas capacidad degradadoras de petróleo, en base a los resultados de la práctica 4. 4. Incuba los matraces a 28 °C en agitación y luz contante a 120 rpm por 72 a 96 hrs.

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SEGUNDA SESIÓN 1. Selecciona los matraces que presente buen crecimiento microbiano, el contenido de los matraces, deposítalos en tubos cónicos de 50 ml. y centrifugar a 10, 000 rpm por 20 minutos, en una centrifuga refrigerada. 2. Por cada bacteria, toma el sobrenadante cuidadosamente (24 ml) sin mover el paquete celular y distribuya 4 ml en 6 tubos de ensaye rotular con una clave que simbolice el número de la bacteria utilizada y el sustrato a probar (HE=hexano, HP =Heptadecano, OC=n-octadecano, PC=petróleo crudo, AM=aceite de motor quemado, AG=aceite de girasol. 3. Depositar 4 ml para cada tubo, de los sustratos. HE, HP, OC, PC, AM, y AG. Repite este mismo procedimiento para los otros 4 sobrenadantes obtenidos de las diferentes cepas. 4. Agitar vigorosamente cada tubo, hasta formar una emulsión homogénea y deja reposar por 24 hrs. al abrigo al abrigo de la luz. 5. Preparar los controles positivos de emulsificación colocando por duplicado tubos con 4 mL de hexano, petróleo crudo, aceite de motor y aceite de girasol. A la mitad de los tubos agrégale 4 ml de solución de SDS al 1%, y a la otra mitad Tritón 100 al 1%, agita vigorosamente cada tubo hasta formar una emulsión. 6. Prepara lo controles negativos de emulsificación colocando por duplicado tubos 4 mL de hexano, petróleo crudo, aceite de motor y aceite de girasol. A la mitad de los tubos agrégale 4 ml de medio de cultivo sin inocular y agita vigorosamente cada tubo hasta formar una emulsión. 7. depositar todo tubos en una gradilla y guardar una caja de cartón para dejarlos reposar por 24 hrs. al abrigo de la luz. TERCERA SESIÓN 1. Medir con una regla la distancia de emulsificación presente en cada muestra y los controles, realizar los cálculos correspondientes, para determinar el valor del índice de emulsificación (Fórmula 3 Anexo 2), para los hidrocarburos y aceites, y los controles positivos y negativos. 2. Documenta los resultados en la tabla siguiente.

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Tabla 4.1 Índice de emulsificación de bacterias degradadoras de petróleo

Sobrenadante Aislamiento no.

Índice de emulsificación (%) HE

HP

OC

AM PC

AM

AG

1 2 3 4 5 Control (+) SDS Control (+) Tritón 100

Control (-) medio sin inocular HE=hexano, HP =Heptadecano, OC=n-octadecano, PC=petróleo crudo, AM=aceite de motor quemado, AG=aceite de girasol, SDS= dodecilsulfato de sodio. 3.

Una vez que observaste y tomes las evidencias fotográficas, debes seguir con el cuadro de

disposición de desecho y el diagrama ecológico de cuadro a las normativas institucionales. CUESTIONARIO 1. ¡Por qué existen diferencias entre los índice de emulsificación de la misma aislamiento en los diferentes fuentes de hidrocarburos? 2. ¿Qué otras técnicas se pueden usar para permite determinar la capacidad emulsificantes de microorganismo? 3. ¿Por qué? los tubos se tiene que dejar reposar por 24 hrs. Al abrigo de la luz. PARAMETROS DE EVALUACIÓN Las habilidades desarrolladas durante la práctica y los conocimientos adquiridos, te serán evaluadas con el reporte de la práctica y la lista de cotejo. El reporte lo entregaras en la siguiente sesión de clase después de finalizadas las 3 sesiones de esta práctica . La lista de cotejo será validad y promediada con mi evaluación.

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Seguridad general Muestras y procesamientos Obtención del índice de emulsificación Lista de cotejo Entrega de reporte

10% 40% 10% 10% 30% 100%

LISTA DE COTEJO EVALUACIÓN ESTUDIANTE

PARAMETROS 1. ¿Trajiste impresa la práctica? 2. ¿Utilizaste la bata de forma correcta? 3. ¿Colocaste adecuadamente tu zona de trabajo? 4. ¿Seguiste las normas de seguridad en el laboratorio? 5. ¿Te lavaste y desinfectaste las manos antes y después de la práctica? 1. ¿Trajiste las muestras solicitadas en el manual? 2. Ele iste de manara correcta los aislamientos ara los ensa os de emulsificación? 3. ¿Obtuviste de manera correcta el sobrenadante de cultivo obtenido? 4. ¿Obtuviste la emulsificación adecuada para cada muestra procesada? 1. ¿Realizaste de manera correcta las mediciones de emulsificación para cada tubo? 2. ¿Completaste de manera correcta las tablas de registro con los índices de emulsificación? . Realizaste las evidencias foto ráficas? 4. ¿Realizaste de manera correcta los cálculos para determinar el índice de emulsificación? 5. ¿Identificaste que aislamiento tiene la mayor capacidad emulsificante en relación a su capacidad de emulsificar a más de hidrocarburo y aceite? 1. Tra iste im resa la ho a de cote o? 2. Cumpliste con la entrega de la hoja de cotejo en el tiempo indicado 1. ¿Entregaste a tiempo la práctica? 2. ¿Cumpliste con los requisitos de caratula, resultados, discusiones, cuestionario y bibliografía? 3. ¿Mostraste las imágenes más representativas de la capacidad emulsificantes? 4. ¿Graficaste y comparaste los resultados obtenidos? 5. ¿Completaste el cuestionario, soportado las respuestas con al menos dos referencias bibliográficas?

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CUADRO DE DISPOSICIÓN DE DESECHOS Tipo de desecho

Procedimiento

Tipo de contenedor

Cultivo con hidrocarburos (R1)

Esterilizar en autoclave y dejar enfriar

Contendedor para desechos de hidrocarburos

Tubos con hidrocarburos emulsificados (R2)

Esterilizar en autoclave y dejar enfriar

Contendedor para desechos de hidrocarburos

DIAGRAMA ECOLÓGICO DE LA PRÁCTICA Matraces con cultivo microbiano e hidrocarburos

R1

Tubos con hidrocarburos emulsificados

Esterilizar a 120°C a 15 libras de presión por 20 min. R2 R1 y R2 = Contenedor para desechos de hidrocarburos

BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA Banat, I.M., Makkar, R.S., Cameotra, S.S. (2000). Potential commercial applications of microbial surfactants. Applied Microbiology and Biotechnology, 53(5): 495-508 . da Silva, Lima., T.M. (2011). Oil recovery from fuel oil storage tank sludge using biosurfactants. Journal of Bioremediation and Biodegradation. Giraldo, J.D., Gutiérrez, S., Merino, F. (2014). Actividad emulsificante y de remoción de metales pesados del ramnolípido producido por Pseudomonas aeruginosa PB 25. Revista de la Sociedad Química del Perú, 80(1), 35-44.

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Raiger-Lustman, L.J., López, N.I. (2009) Los biosurfactantes y la industria petrolera. Química Viva 8(3): 1-6. Singh, A., Van Hamme, J.D., Ward, O.P. (2007). Surfactants in microbiology and biotechnology: Part 2. Application Aspects Biotechnology Advances, 25(1): 99-121. Supaphol, S., Jenkins, S.N., Intomo, P., Waite, I.S., O’Donnell, A.G. (2011). Microbial community dynamics in mesophilic anaerobic co-digestion of mixed waste. Bioresource Technology, 102(5): 4021-4027. Yáñez-Ocampo, G., Sánchez-Salinas, E., Ortiz-Hernández, M.L. (2011). Removal of methyl parathion and tetrachlorvinphos by a bacterial consortium immobilized on tezontle-packed upflow reactor. Biodegradation, 22(6):1203-1213. Yáñez-Ocampo, G., Wong-Villarreal, A. (2013). Biosurfactantes microbianos, producción potencial con residuos agroindustriales de Chiapas, 17(3):12-28. PARA SABER MÁS ww.europapress.es/euskadi/noticia-gaiker-ik4-ab-laboratorios-guserbiot-desarrollan detergentes-origen-microbiano-respetuosos-medio-ambiente-20140709203400.html Toribio-Jiménez, J., Aradillas, J. C. V., Ramírez, Y. R., Barrera, M. Á. R., González, J. D. C., Luna, J. G., Noyola, J. L. A. (2014). Pseudomonas sp productoras de biosurfactantes. http://posgradoeinvestigacion.uagro.mx/tlamati/t52/t529.pdf González García, Y., Contreras, M., Carlos, J., González Reynoso, O., Córdova López, J. A. (2013). Síntesis y biodegradación de polihidroxialcanoatos: plásticos de origen microbiano. Revista Internacional de Contaminación Ambiental, 29(1): 77-115. http://www.scielo.org.mx/pdf/rica/v29n1/v29n1a7.pdf

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ANEXO 1 (Guías descripción colonial) Guía para la descripción de la morfología colonial macroscópica de las colonias

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ANEXO 2 (Fórmulas) FÓRMULA 1

/ =

No. de colonias × (volumen inoculado) × 1000 Dilución

FÓRMULA 2

() Í   =

Diámetro externo (halo) Diámetro colonia

FÓRMULA 3

() Í  ó =

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Altura de la capa de emulsión  × 100 Altura total

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ANEXO 3 (Tablas ejemplo) Tabla ejemplo 1.1. Para la descripción morfológica de todos los aislamientos Tipo de

Temperatura

sustrato

50/70 °C

Tamaño

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Color

Pigmentación

Elevación

Borde

Forma

Actividad Si/No

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ANEXO 4 (Composición de Medios de cultivos) Formulación 1. Agar Carboximetilcelulosa con antibiótico Carboximetil-celulosa

10 g.

KCl

0.5 g

Extracto de levadura

0.5 g

CaCl2

50 mg

(NH4)2 SO4

1.0 g

FeSO4.7H2O

10 mg

NaNO3

2.0 g

CuSO4

10 mg

K2HPO4

1.0 g

MnSO4.4H2O

5.0 mg

MgSO4.7H2O

0.5 g

ZnSO 4.7H2O

1.0 mg

Cloranfenicol

200 mg

Agar

15 g

Agua

1,000 ml

Formulación 2. Medio básico Extracto de levadura

0.5 g

KCl

0.5 g

(NH4)2 SO4

1.0 g

CaCl2.

50 mg

NaNO3

2.0 g

FeSO4.7H 2O

10 mg

K2HPO4

1.0 g

CuSO4

10 mg

MgSO4.7H2O

0.5 g

MnSO4.4H2O

5.0 mg

Agar

15 g

ZnSO 4.7H2O

1.0 mg

Agua

1,000 ml

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ANEXO 5 (Portada reporte práctica)

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FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS Ingeniero Bioquímico Ambiental

Reporte de Práctica de Laboratorio Biotecnología Ambiental

Práctica: Número y título de la Práctica Docente: Dra. Susana del Carmen De la Rosa García Alumnos: ________________________________________________ _________________________________________________ _________________________________________________ _________________________________________________ _________________________________________________ ____________________________________________

Fecha de entrega del Reporte: _______________

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