Manual de Prácticas Microbiologia Industrial_IQ

UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA

Manual de Prácticas de Microbiología Industrial

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Práctica I Bioseguridad La bioseguridad es una doctrina de comportamiento encaminada a lograr actitudes y conductas que disminuyen el riesgo del trabajador. Es un conjunto de medidas preventivas, destinadas a mantener el control de factores de riesgo laboral, procedente de agentes biológicos, físicos o químicos, logrando la prevención de impactos nocivos, asegurando que el desarrollo o producto final de los procedimientos no atenten contra la salud y seguridad de trabajadores, visitantes y medio ambiente. El conocimiento y la aplicación adecuada de normas de bioseguridad

así como la importancia de estas normas antes, durante y después de cada

práctica es un deber de cada estudiante en el laboratorio donde se esté desenvolviendo.

Todos los establecimientos laborales, incluyendo los laboratorios de análisis, investigación y demás, necesitan tener una serie de normas para llevar un desempeño seguro y garantizar resultados exitosos. Las normas generales son: 

El acceso al laboratorio estará limitado solo al personal autorizado.



El personal que trabaje en el laboratorio debe cumplir a cabalidad las normas de bioseguridad.



Toda área debe estar marcada con la respectiva señal de riesgo biológico y su nivel de contención.



Al ingresar al laboratorio se debe tener en cuenta el debido porte de la bata manga larga, abotonada y limpia, así mismo una vez se ingrese se debe colocar los abrigos libros y demás objetos, en sitios adecuados para evitar un posible accidente y nunca sobre los bancos o mesas.



Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas durante la sesión de laboratorio para evitar la contaminación por corrientes de aire.



Al inicio y término de una práctica se debe limpiar la superficie de trabajo con una solución desinfectante.



El laboratorio debe permanecer limpio y ordenado, durante el trabajo o el término del mismo.



Se deben lavar las manos al inicio y al término de cada sesión de trabajo, secándolas posteriormente con toallas de papel.



Se deberán usar todos los implementos necesarios para la protección según el nivel de riesgo biológico.



Durante la práctica no se deben guardar ni consumir alimentos y bebidas.

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

Se debe colocar un calzado adecuado para las prácticas en el laboratorio, así como mantener las uñas cortas, limpias y sin esmalte.



Utilizar los equipos según las instrucciones o los procedimientos operativos estandarizados.



Realizar el trasporte de materiales o de muestras de manera tal que en caso de caídas no se produzca salpicadura.



Todo personal debe poner especial cuidado en evitar el contacto con materiales potencialmente infecciosos sin la debida protección.



Los derrames y accidentes deben ser informados inmediatamente el supervisor de laboratorio.



Utilizar máscaras faciales si existe el riesgo de salpicaduras o aerosoles.



Apagar los instrumentos eléctricos antes de manipular las conexiones.

Figura 1.1. Algunos símbolos de bioseguridad presentes en el laboratorio y su significado.

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1. Principios básicos de bioseguridad El término contención se utiliza para describir métodos seguros para manejar materiales infecciosos en el ambiente de laboratorio donde son manipulados o conservados. El objetivo de la contención es reducir o eliminar la exposición de quienes trabajan en laboratorios, de otras personas y del medio ambiente externo a agentes potencialmente peligrosos.

1.1 Niveles de contención El elemento más importante de la contención es el cumplimiento estricto de las prácticas y técnicas microbiológicas de procesamiento de las muestras de laboratorio. Cuando las prácticas de laboratorio no son suficientes para controlar los riesgos asociados a un agente o un procedimiento de laboratorio en particular, es necesario aplicar medidas adicionales. Estas medidas adicionales corresponden a los equipos de seguridad diseñados para la protección del personal y las prácticas de manejo (barrera primaria), así como el diseño de instalación y características de ingeniería adecuados (barrera secundaria). 1.2 Barreras primarias Constituyen la primera línea de defensa cuando se manipulan materiales biológicos, químicos o físicos. Se considera que las barreras de protección primaria son: equipos de protección personal (guantes, mascarillas, mandiles); cabinas de seguridad biológica (con barreras de aire, que permiten que éste fluya en una sola dirección y a una velocidad constante originando el flujo de aire laminar o flujo con ausencia de turbulencias y con filtros, que atrapan las partículas contenidas en el flujo de aire); normas de higiene personal; inmunización (vacunación); desinfección (alcohol, compuestos fenólicos, hipocloritos) y esterilización (calor húmedo, calor seco) de instrumentos y superficies. Principalmente se busca la protección del personal presente en un ambiente frente a los agentes infecciosos o productos químicos de riesgo. Seguridad. 1.3 Barreras secundarias El diseño y construcción de un laboratorio se conoce como contención o barrera secundaria, contribuye a la protección del personal del laboratorio así como el que se localiza fuera del laboratorio y personas de la comunidad en general,

frente a posibles escapes

accidentales de agentes infecciosos. Se incluye la localización del laboratorio fuera del área de tránsito, acceso restringido al personal autorizado con puerta cerrada con llave ( nivel 2) o doble puerta ( nivel 3), presencia de lavamanos, duchas de emergencia, mesas de trabajo resistentes al calor moderado, ácidos y álcalis, áreas con la señal de riesgo biológico y su nivel de contención, tratamiento de residuos o transporte en envases sellados, servicios auxiliares de gas, aire y eléctrico de fácil acceso.

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2. Clasificación de los agentes biológicos por grupo de riesgo 2.1 Agentes biológicos del grupo 1 Es poco probable que causen enfermedad en los humanos, no se les conoce factores de virulencia y pueden tener susceptibilidad conocida y estable a los antimicrobianos. Ejemplo: Escherichia coli K12, Saccharomyces cerevisiae, microorganismos que se utilizan en la elaboración de quesos, embutidos, entre otros.

2.2 Agentes biológicos del grupo 2 Pueden causar enfermedad en el hombre, es poco probable que se propaguen a la colectividad y generalmente existe profilaxis o tratamiento eficaz. Algunos de estos agentes pertenecen a la biota habitual del hombre, siendo capaces de originar una patología infecciosa de gravedad moderada o limitada. Ejemplo: Staphylococcus epidermidis, Salmonella spp., entre otros. 2.3 Agentes biológicos del grupo 3 Pueden causar una enfermedad grave en el hombre y presentan un serio peligro para los trabajadores, con riesgo de que se propaguen a la colectividad; sin embargo, existe generalmente profilaxis o tratamiento eficaz.

Implican patología grave, de difícil y largo

tratamiento, pueden curar con secuelas y ocasionalmente producen la muerte. El mayor y más frecuente peligro es la infección adquirida a través de aerosoles y por fluidos biológicos. Ejemplo: Mycobacterium. tuberculosis, Brucella sp., Coxiella burneti, entre otros. 2.4 Agentes biológicos del grupo 4 Son aquéllos que causan una enfermedad grave en el hombre y suponen un serio peligro para los trabajadores, con muchas probabilidades de que se propaguen a la colectividad y sin que exista generalmente

profilaxis o tratamiento eficaz. Normalmente son

microorganismos de dosis infectiva baja y alta contagiosidad. Ejemplo: virus Ebola, Hantavirus, etc.

3. Niveles de bioseguridad para los laboratorios Se consideran cuatro niveles de contención o de seguridad biológica, que consisten en la combinación, en menor o mayor grado, de los tres elementos de seguridad biológica descritos: técnicas de laboratorio, equipos de seguridad y diseño arquitectónico de las instalaciones del laboratorio. Cada combinación está específicamente dirigida al tipo de actividades que se realizan, las vías de transmisión de los agentes infecciosos y la función o actividad el laboratorio. De forma general, los cuatro niveles de bioseguridad definen la contención necesaria para proteger al personal y al ambiente.

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3.1 Nivel de bioseguridad 1 Es el nivel de seguridad requerido para trabajar con agentes biológicos del grupo de riesgo 1. Es utilizado habitualmente en los laboratorios de prácticas de universidades o centros de enseñanza donde se emplean microorganismos no patógenos. 3.2 Nivel de bioseguridad 2 Es el nivel obligado para trabajar con agentes del grupo de riesgo 2. Considera personal especializado para el manejo de éstos microorganismos y corresponde a algunos laboratorios de microbiología clínica y de control de calidad sanitaria (técnicos de laboratorio, especialistas en microbiología). 3.3 Nivel de bioseguridad 3 Debe utilizarse cuando se manipulan agentes biológicos del grupo de riesgo 3. El material biológico sólo puede ser procesado por personal calificado y en una zona con infraestructura apropiada para el nivel de contención 3, es decir, con aire acondicionado independiente, sin recirculación de aire, con gradiente de presión, cabinas de bioseguridad, entre otras características; correspondiendo a algunos laboratorios de microbiología clínica, de producción de biológicos y de control de calidad sanitaria. 3.4 Nivel de bioseguridad 4 Nivel requerido cuando se procesa con certeza o se sospecha de un agente biológico de riesgo 4, especialmente patógeno infecto – contagioso, exótico o no, que produce alta mortalidad y para el que no existe tratamiento o es poco fiable. Este nivel también puede utilizarse para trabajar con animales de experimentación infectados por microorganismos del grupo de riesgo 4.

4. Referencias bibliográficas -

Granados, E. & Villaverde C. (1977). Microbiología. España: Editorial Paraninfo.

-

Instituto Nacional de Salud. (2002). Manual de bioseguridad para los laboratorios. Serie de Normas Tècnicas Nº 18 (2 º ed.). Perú

-

Perú, Ministerio de Salud. (2001). Buenas Prácticas de Laboratorio. Seminario Taller, Lambayeque, Perú.

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Práctica II Material y equipo de laboratorio 1.

Introducción

Las tres fuentes del conocimiento son la observación, la experimentación y el razonamiento. La experimentación exige menos esfuerzo mental pero más tiempo, es decir más presencia; por consiguiente se necesita equilibrar la enseñanza con más horas de laboratorio para un buen aprendizaje. Una buena enseñanza experimental debe fomentar la capacidad de distinguir entre observar un fenómeno o una reacción, y el poder interpretarlo. La correcta observación le dará el domino real sobre la materia. La capacidad de interpretación le proporcionará además la preparación técnico-científica necesaria para ser un buen investigador. Es de vital importancia el conocimiento y buen manejo del material y equipo de laboratorio, sólo así se logrará obtener buenas lecturas lo que permitirá una buena interpretación de los resultados.

2.

Objetivos

2.1

Reconocer el material y equipo utilizados en el laboratorio de Microbiología.

2.2

Aprender a utilizar los equipos en el laboratorio de Microbiología.

2.3

Aprender a esterilizar el material en el laboratorio de Microbiología.

3.

Procedimiento

3.1

Reconocimiento de material y equipo utilizados en el laboratorio de Microbiología

3.1.1

Tubos de ensayo

Existe una gran variedad de tubos, pero se prefieren los de vidrio neutro, paredes gruesas y sin rebordes para facilitar el taponamiento. Para estudios bioquímicos se usan tubos de 13 X 100 mm. y para diluciones tubos de 16 X 150 mm y de 15 X 125 mm. 3.1.2

Placas de Petri

Están compuestas por dos cristalizadores, de los cuales el más grande hace de tapa. Se emplean para el aislamiento y cultivo de microorganismos. 3.1.3

Tubos de Smith

Son utilizados para cuantificar el gas producido en los procesos de fermentación. 3.1.4

Campanas de Durham

Son tubos de vidrio huecos con uno de sus extremos cerrado y dilatado y permiten detectar la producción de gas en los procesos de fermentación.

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3.1.5

Pipetas serológicas o de medida

Presentan subdivisiones de su capacidad total y se calibran en mL a 20°C. Las marcas más conocidas son PYREX, NORMAX y CORNING. Las pipetas NORMAX se usan para trabajos de precisión, son contrastadas individualmente por la Oficina Nacional de Patrones en Norteamérica y tienen las siglas NBS y el año de control. Por ejemplo, una pipeta NORMAX serológica de 1 mL de capacidad tiene un error tolerable (ET) de 0,01 (1%), mientras que una pipeta PIREX del mismo volumen tiene un ET de 0.02 (2%). Las pipetas serológicas son terminales y con capacidad de 0,1 a 25 mL. Las de mayor uso son: Pipetas de 10 mL

0,1 mL

Pipetas de 5 mL.

0,1 mL

Pipetas de 1 ml.

0,1 y 0,01 mL

Pipetas de 0.1 mL.

0,1 y 0,001 mL

Pipetas de Dhan de 0,125

0,0125 mL

Pipetas de Dhan de 0,250

0,0250 mL

Pipetas de Bang de 0,2

0,08 y 0,005 ml

Las pipetas graduadas pueden ser terminales, cuando el vaciado del líquido se realiza hasta la punta de la pipeta y pipetas no terminales cuando el vaciado del líquido se realiza hasta la última línea de graduación. 3.1.6

Pipetas Pasteur

Son confeccionadas de varillas de vidrio de diámetro de 4 X 20 mm. y de 30 ó 40 cm. de longitud. La calidad del vidrio debe facilitar el reblandecimiento a la acción directa de la llama del mechero, para conseguir un estiramiento a la capilaridad deseada. Se emplean para la toma de pequeños inóculos de siembra. Modo de emplear la pipeta Pasteur -

La pipeta se sujeta con el pulgar y el dedo medio. Se coloca la punta de la pipeta en el

líquido por medir, bastante profundo, para que se pueda aspirar el volumen necesario sin aire. Con aspiración suave, se llena el líquido por encima de la marca de calibración. Se cierra la pieza de la boca con el dedo índice. -

Se seca el exceso del líquido en el exterior de la pipeta con un paño o un papel limpio,

y colocando la punta de la pipeta contra el recipiente, se deja que el nivel del líquido baje hasta la marca de calibración moviendo con suavidad el índice sobre la pieza de boca. El dedo no debe retirarse. -

Ahora la pipeta se pasa al recipiente de recepción, colocando su punta contra la pared.

-

Se levanta el dedo de la pieza de boca y se deja que la pipeta se vacíe durante el tiempo

necesario. No se debe soplar para hacer salir la última gota al emplear una pipeta volumétrica o cualquier pipeta calibrada. Es importante que la pipeta se mantenga vertical para que el vaciamiento sea correcto. 8

3.1.7

Buretas

Son tubos largos de vidrio con una llave de descarga en uno de sus extremos o bien con un tubo corto de jebe que termina en un pico de vidrio. Las más comunes son de 50 mL y están graduadas al décimo de mL. Las buretas se emplean para descargar distintas cantidades de líquidos o soluciones y se las usa mayormente en las titulaciones volumétricas. Modo de usar la bureta -

La bureta limpia y vacía se mantiene en posición vertical mediante un soporte adecuado.

-

Se enjuaga la bureta con el mismo líquido que se va a descargar.

-

Se llena la bureta con el líquido hasta un poco más arriba de la graduación y se descarga

el líquido de modo que la parte inferior del menisco coincida con el comienzo de la graduación y el pico de la bureta debe quedar completamente lleno de solución. -

Al efectuar las lecturas con la bureta, el ojo debe estar al nivel del menisco para evitar

errores. -

Después de su uso las pipetas se deben lavar con agua destilada y cubrir con un tubo de

ensayo corto, invertido para preservarlas del polvo, o también pueden colocarse en el soporte con las puntas hacia arriba. -

Las llaves de vidrio de las buretas se lubrican con grasa, vaselina pura o mezclada con

cera y resina. La lubricación adecuada de la llave evita que se pegue o endurezca. 3.1.8

Matraces

Son recipientes volumétricos muy útiles en la preparación y almacenamiento de soluciones, colorantes, reactivos, medios de cultivo, etc. Su forma y tamaño son muy variables. -

Matraces cónicos (Erlenmeyers): Se utilizan para hervir soluciones cuando hay que

reducir a un mínimo la evaporación; son útiles para las titulaciones. En Microbiología sirven para la preparación de medios de cultivo. Es necesario emplear una tela de asbesto o una tela de alambre cuando se realiza el calentamiento evitando así el contacto directo entre el matraz y la llama. -

Matraces de fondo redondo: Estos matraces soportan mejor el calor directo sobre el

mechero. Para calentar solventes orgánicos, o para manipulaciones muy prolongadas, es preferible emplear matraces con cuello esmerilado que pueden recibir los condensadores correspondientes y permiten un cierre mucho más hermético que los tapones de caucho o de corcho. -

Matraces aforados o fiolas: Idénticos a los matraces erlenmeyer. Están calibrados a

medidas exactas mediante un aforo en la parte media del cuello del recipiente en el que se indica la medida. Se emplean para la preparación de reactivos y de soluciones buffer. -

Matraces kitasato: Son matraces que además de la boca tienen una tabulación corta

lateral para hacer vacío. Se utilizan como complemento del equipo de filtración (esterilización en frío). 9

3.1.9

Espátulas de Drigalsky

Se confeccionan a partir de las pipetas Pasteur. La fracción recta y horizontal facilita la siembra y aislamiento de bacterias por diseminación. 3.1.10 Probetas Recipientes cilíndricos con base para la estabilidad. Pueden estar graduadas y tener capacidad de 10 mL hasta 2 000 mL. Las más utilizadas son las de 100, 250, 500 y 1000 mL. 3.1.11 Beacker o vasos de precipitación Recipientes cilíndricos y cortos, con una depresión en el margen de la boca. El vidrio debe ser necesariamente resistente al calor. Existen desde 1 mL hasta 4 000 mL de capacidad. 3.1.12 Varillas de vidrio macizo Fragmentos de 30 a 60 cm, que sirven para la confección de agitadores o baguetas. Las varillas cortas de 20 cm pueden utilizarse como mangos para las asas de siembra. 3.1.13 Frascos reactivos Frascos de vidrio de paredes gruesas, transparentes o de color ámbar. Son cilíndricos, tienen cuello estrecho y tapones de cristal esmerilado (algunos con tapas especiales para facilitar su vaciado y su tamaño varía de 25 mL a 1000 mL).En los frascos pequeños se pueden almacenar HCl, H2SO4, CCl4, etc. En los frascos grandes se pueden almacenar reactivos desinfectantes u otros reactivos. 3.1.14 Frascos goteros Tienen una capacidad de 50 mL, pueden ser de vidrio claro o ámbar, y sus tapones son ranurados para que su contenido salga gota a gota cuando se inclinan. Se pueden utilizar para colorantes o para indicadores. 3.1.15 Picetas Son botellas plásticas de color blanco con una especie de caño que al presionar el frasco permite que el líquido salga con fuerza. Se utilizan para lavar láminas portaobjetos con tinciones. 3.1.16 Portaobjetos y cubreobjetos Los portaobjetos son láminas de vidrio transparente de forma rectangular y de mínimo grosor. Los cubreobjetos son finísimas laminillas de mucho menor tamaño que los portaobjetos y pueden ser de forma rectangular, cuadrada o circular. Ambos son material indispensable para la observación microscópica de las bacterias u otros organismos. 3.1.17 Jarra de Brewer Denominada también campana de anaerobiosis, está constituida por una tapa de baquelita en cuya parte inferior presenta una canastilla conteniendo granos de paladio. El cuerpo es un cilindro de vidrio en cuyo interior se colocan los tubos o placas de Petri. La jarra es cerrada herméticamente mediante una abrazadera de metal.

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3.1.18 Asas de siembra Con mango de vidrio o de metal aislante del calor y un alambre o aguja de micrón resistente a elevadas temperaturas. Se usan en la siembra y trasplante de bacterias y hongos. 3.1.19 Mangos de Kolle Vástagos de metal con una cubierta aislante del calor y en el extremo proximal, una tuerca para insertar el alambre de platino o micrón en el asa de siembra. Pueden ser reemplazados por mangos de vidrio. 3.1.20 Alambres de platino en aro y en punta Pueden ser acoplados a los mangos de Kolle. 3.1.21 Canastillas o cestos de metal Las mejores son de aluminio. Favorecen el almacenamiento de tubos de prueba en medidas conocidas, sin riesgo de roturas. 3.1.22 Gradillas Permiten una mayor estabilidad a los tubos de ensayo, evitando accidentes. 3.1.23 Soportes universales Con tenazas y aros de metal, para asegurar cuellos y bases de matraces, beackers, etc. Son de metal

de preferencia de fierro y son

muy buenos soportes de recipientes sometidos al

calentamiento. 3.1.24 Trípodes Son de metal, de preferencia de fierro. Muy buenos soportes de recipientes sometidos al calentamiento. De variada altura y diámetro. 3.1.25 Rejilla o malla metálica Malla de alambre galvanizado, resistente a la corrosión a elevadas temperaturas. Se coloca sobre el trípode. 3.1.26 Mecheros -

Mechero de alcohol: Constituido de un recipiente de vidrio borosilicato y una tapa de

metal por donde se introduce la mecha. -

Mechero Bunsen: Funciona a gas. Es uno de los instrumentos más útiles en el

laboratorio. Fue inventado por el alemán Robert Bunsen en 1866. Existen diferentes tipos de mecheros, algunos tienen regulación de gas y otros no. Los que se usan en laboratorio son simples, no regulan el gas, y queman gas propano. 3.1.27 Autoclave Consta de una caldera de acero o de cobre batido estañado interiormente, protegida por una camisa metálica de cobre; quedando formado de paredes dobles. En su base está instalada la fuente calórica (gas o electricidad). A una distancia del fondo del recipiente, está la placa cribosa para apoyo del material y para la salida del vapor; en la parte superior se halla la tapa que es pesada (de bronce fundido) en cuyo borde interno está adaptado un arandel de caucho 11

para el cierre hermético del aparato. Los tornillos o bulones en el margen superior refuerzan el cierre, evitándose el escape del vapor. Presenta además, un manómetro (que marca las libras de presión), una válvula de seguridad, un termómetro y una llave o espita (para la salida del aire y vapor al empezar a hervir el agua). El vapor de agua se aplica en una cámara cerrada en la que existe un generador de vapor; cuando éste se produce, desplaza el aire, que sale por un orificio que se cierra en el momento en que ya sale vapor. Posteriormente se consigue la presión deseada, teniendo en cuenta que el vapor a 1 atm. de presión corresponde a 121°C de temperatura. Esta temperatura, aplicada durante 15 o 20 minutos, ó una temperatura de 134 °C durante 7 minutos destruye todas las formas vegetativas y esporuladas. El autoclave requiere de indicadores, que comprueben que en el interior del recipiente se han dado las condiciones deseadas de temperatura y tiempo. Los indicadores de esterilización más usados son productos químicos (que cambian de color según los niveles alcanzados) y esporas de ciertas bacterias. 3.1.28 Horno Pasteur Es un aparato muy utilizado en la esterilización por calor seco. Es cilíndrico, de metal, de triple pared; la intermedia más corta que las otras dos, quedando formada por dos cajas paralelas (concéntricas) que se comunican por la parte superior. La parte inferior del cilindro hace fondo. Las paredes son metálicas y revestidas de planchas de asbesto al igual que la puerta. Por los lados o al fondo, entre las paredes media y externa se halla un colector de mechero múltiple o juego de resistencia (fuente calorífica). 3.1.29 Espectrofotómetro Es un instrumento que permite medir la intensidad de la luz transmitida y se utiliza mucho en análisis bioquímicos. Las sustancias disueltas tienen determinados colores porque absorben ciertas longitudes de onda de luz y dejan pasar otras. Ejemplo: La hemoglobina tiene color rojo porque absorbe los colores complementarios del rojo, es decir las longitudes de onda más cortas del azul y el verde. 3.1.30 Potenciómetro Es un aparato utilizado para medir el pH de soluciones buffer, fluidos biológicos, medios de cultivo, etc. 3.1.31 Contador de colonias Lo más difícil en la determinación de una colonia es el conteo en las placas de Petri. El contador de colonias soluciona este problema convirtiéndose en un auxiliar indispensable para todo laboratorio microbiológico y además no ocasiona problemas con su mecanismo de conteo.

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3.1.32 Refrigeradoras y congeladoras Son incubadoras de temperaturas frías. Se requieren para almacenar medios de cultivo, sueros y reactivos especiales. Las congeladoras se requieren para almacenamiento más prolongado de sueros, enzimas, etc. Deben localizarse lejos de los hornos de aire caliente, de radiadores de tuberías de agua caliente. 3.1.33 Estufas de cultivo Sirven para realizar el proceso de incubación, que brinda una temperatura adecuada para que los microorganismos permanezcan viables y se desarrollen. Existen dos métodos de incubación: 

Incubación por calor seco: Se realiza en incubadoras

e incluso en hornos. Las

incubadoras y los hornos se basan en los mismos principios y la diferencia entre éstos radica en la temperatura que puede obtenerse en su interior. Usualmente se denomina horno al aparato que es capaz de soportar temperaturas de 100 °C ó más. El más conocido es el horno Pasteur. 

Incubación por calor húmedo (baño María): El llamado baño María presenta un

dispositivo enrollable que es sumergido en el agua y la calienta. La fuente de calor es por medio de una corriente de convección, lo que permite que el agua se caliente en forma más uniforme. 3.1.34 Microscopio óptico La Microbiología se ha podido desarrollar a partir de la aparición y progreso del microscopio. Podemos encontrar un microscopio simple que no es más que una lente biconvexa, o un microscopio compuesto, que emplea dos sistemas de lentes separadas, consiguiendo con ello mayor aumento. Los microscopios se clasifican básicamente en dos grupos en función del tipo de luz utilizada y amplificación: microscopio de luz óptica y microscopio electrónico. El microscopio mediante el cual la amplificación de la imagen se obtiene por un sistema de lentes ópticas, corresponde a los microscopios de luz. El microscopio mediante el cual la amplificación de la imagen se hace a través de un haz de electrones en lugar de ondas luminosas corresponde al microscopio electrónico. Los diversos componentes del microscopio óptico pueden ser agrupados en cuatro sistemas:

a)

Sistema de soporte: Pie, bastidor, revólver portaobjetivos, platina.

b)

Sistema de aumento : Objetivos, oculares

c)

Sistema de iluminación: Fuente luminosa, espejo, condensador, diafragma, filtros.

d)

Sistema de ajuste: Tornillo macrométrico, tornillo micrométrico, condensador,

elevador del diafragma iris, reguladores de la platina mecánica, tornillos para centrar el condensador.

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Sistema de aumento La amplificación de la imagen en un microscopio óptico se obtiene mediante dos sistemas de lentes convergentes. Un primer sistema de lentes situados en el extremo inferior del tubo del microscopio, justo por encima de la muestra que se halla sobre la platina, se denominan objetivos y forman la imagen real del objeto que se está observando. El poder de aumento de cada uno de ellos es indicado por un número grabado ejemplo: 40 indica un aumento del objetivo de 40 veces. El segundo sistema de lentes que se sitúa en el extremo superior del tubo del microscopio, está más alejado de la muestra y más próximo al ojo humano. Son los oculares y se encargan de ampliar la imagen real formada por el objetivo originando una imagen virtual que es la que percibe el ojo humano. La amplificación del ocular suele venir indicada en la parte superior del lente ocular o en la lateral. Poder de aumento del microscopio Se calcula multiplicando el aumento del objetivo por el del ocular. Por ejemplo si se emplea un objetivo que tiene 45 de aumento y un ocular con 10 de aumento, el poder de aumento del microscopio será de 450. Poder de resolución del microscopio Es la distancia entre dos estructuras de un espécimen en la cual todavía se pueden observar como estructuras separadas en la imagen amplificada. La resolución se define como el espacio de máxima aproximación entre dos puntos en el que aún se pueden observar con claridad como dos entidades independientes y si se les acerca un poco más, ya no se distinguen, y se les ve como un solo punto. El poder de resolución está sujeto a la longitud de onda (λ) del espectro de luz visible y a la propiedad de las lentes conocidas como la abertura numérica (AN). El límite del poder de resolución de un microscopio es aproximadamente igual a 0.61 λ/AN que para un microscopio óptico es alrededor de 200 nm. A menor longitud de onda de luz y mayor la AN de las lentes, será mejor el poder de resolución del microscopio

Abertura numérica de un objetivo Depende del índice de refracción (N) del medio que llena el espacio entre el espécimen y la parte frontal del objetivo, y del ángulo (μ) de los rayos de luz mas oblicuos que pueden entrar al objetivo. Usando una lente con mayor abertura numérica, se obtiene mayor poder de resolución. AN = N x Sen μ/2 El aire tiene un índice de refracción de 1, que limita la resolución que se puede obtener, pero se puede incrementar la abertura numérica colocando aceite de inmersión entre el especímen y el objetivo, aumentando así el poder de resolución del microscopio.

14

Aceite de inmersión Sobre el preparado que se va a observar se coloca una gotita de aceite de cedro y luego se desciende el objetivo hasta tocar la gota, de tal manera que el medio entre el objetivo y el punto objeto es el aceite. Este tiene un índice de refraccción de 1,5, lo que aumenta considerablemente la abertura numérica. La observación de algas, hongos y protozoos se puede hacer con los objetivos secos, en los que el aire ocupa el espacio entre el espécimen y el objetivo, pero para observar las bacterias con suficiente detalle se requiere el uso de un objetivo de inmersión de aceite. Iluminación La iluminación es esencial para aprovechar adecuadamente los aumentos y la resolución de un microscopio. La luz procederá de la fuente de iluminación que se situará en la parte más baja del microscopio. Dicha luz penetrará en el condensador y éste llegará al objetivo que lo amplificará, así pues deberá llegar un cono de luz muy grande para que su amplificación sea mayor. Este tamaño de cono de luz que llega al objetivo se podrá controlar con el diafragma situado inmediatamente debajo del dispositivo condensador. Si, por ejemplo, el diafragma estuviera completamente abierto, se perdería contraste y nitidez. Si se utiliza el objetivo de inmersión, la distancia de trabajo es muy pequeña y, en estos casos, hay que abrir más el diafragma para facilitar una mayor amplificación que aumente el máximo poder de resolución.

3.2

Manejo de los equipos en el laboratorio de Microbiología

.3.2.1 Microscopio - Obtener una muestra de sarro dentario con asa bacteriológica estéril. - Homogenizar la muestra en solución salina fisiológica estéril (1 gota) sobre una lámina porta – objetos. - Cubrir el preparado con laminilla. Tiene Ud. un preparado en fresco para examen directo. - Enfoque y observe al microscopio con objetivos de: 3,5 X, 10 X y 40X. 3.2.2

Horno Pasteur

-

Colocar en el horno el material a esterilizar debidamente acondicionado.

-

Cerrar la puerta y encender la fuente calorífica.

-

Graduar la temperatura del horno a 180 °C y mantener el material por espacio de 2 horas. Precauciones en el manejo



No abrir la puerta del horno mientras la temperatura en su interior se mantenga elevada. Un cambio brusco de la temperatura puede causar destrozos del material de vidrio.



Cuidar de no elevar excesivamente la temperatura; de ésta manera se evitará la carbonización del papel y tapones de algodón.

15



No colocar materiales que pueden ser destruidos por la temperatura como delantales, guantes de goma, etc.

3.2.3

Autoclave

-

Depositar agua en la caldera hasta unos centímetros de la parrilla.

-

Colocar el material a esterilizar en la canastilla.

-

Cerrar la tapa y asegurar el cierre ajustando los tornillos o mariposas tomando de dos en dos tornillos diagonalmente opuestos.

-

Dejar abierta la espita.

-

Encender la fuente de calor.

-

Cerrar la espita cuando se produzca un flujo de vapor continuo.

-

Observar el manómetro y mantener la presión en 15 libras mediante el control de la temperatura (121 °C) durante 15 a 20 minutos.

-

Iniciar la cuenta del tiempo en el momento que se consigue la temperatura y la presión deseada.

-

Apagar el sistema de calefacción, después del tiempo de esterilización.

-

Dejar enfriar hasta que el manómetro marque cero.

-

Abrir la espita para que salga el exceso de vapor de agua.

-

Aflojar los tornillos y levantar la tapa poniéndose detrás del aparato para evitar que los vapores lleguen a la cara del operador.

Precauciones en el manejo:  Para evitar la pérdida de material por ebullición se recomienda no llenar los recipientes.  No colocar los materiales muy juntos. Es preferible dejar espacios libres para favorecer la

circulación del vapor.  No bajar la presión abriendo la espita. Esta medida puede ocasionar pérdida de material

y ruptura de los recipientes de vidrio por el cambio brusco de la presión. 3.2.4

Estufa - Colocar en la estufa el material a incubar: placas de Petri o tubos de ensayo con el medio de cultivo inoculado. - Cerrar la puerta y encender la fuente calorífica. - Graduar la temperatura deseada y mantener el material en incubación durante 24, 48 horas o más tiempo si es requerido.

3.2.5 Baño María - Colocar la cantidad de agua suficiente en la canastilla del equipo. - Encender la fuente calorífica. - Graduar la temperatura deseada. - Colocar dentro del agua el material a calentar y mantenerlo durante el tiempo deseado. 16

3.3

Esterilización del material de uso en el laboratorio de Microbiología

3..3.1 Placas de Petri  Empaquetar las placas de Petri conteniendo material contaminado o

de descarte y

esterilizar en autoclave a 121 ° C durante 20 minutos.  Eliminar los restos de agar y lavar las placas de Petri con detergente, enjuagar y

dejar secar.  Envolver con papel y asegurar con pabilo.  Esterilizar en el horno a 180° C durante 2 horas.

3.3.2

Tubos de ensayo  En una canastilla o un depósito que los sostenga depositar los tubos que contengan

material contaminado o de descarte.  Esterilizar en el autoclave a l21 °C durante 20 minutos.  Eliminar los restos de agar y lavar los tubos de ensayo con detergente, enjuagar y

dejar secar.  Taponar los tubos con algodón no graso, de modo que el tapón ajuste perfectamente

y facilite su uso posterior.  Envolver con papel. De preferencia formar grupos

de

seis tubos, envolver y

asegurar con pabilo.  Esterilizar en el horno a 180° C durante 2 horas.

3.3.3

Matraces  Esterilizar en autoclave los matraces que contienen medios de cultivo recién

preparados o cultivos de descarte.  Eliminar los restos de agar, lavar con detergente, enjuagar y dejar secar.  Colocar tapones de algodón no graso, de modo que el tapón ajuste perfectamente y

facilite su uso posterior.  Esterilizar en el horno a 180° C durante 2 horas.

3.3.4

Pipetas  Colocar un tapón de algodón ligeramente ajustado en el orificio superior de las

pipetas.  Envolver con tiras de papel de 3 cm, de modo que cubran totalmente las pipetas.  Esterilizar en el horno a 180 ºC durante 2 horas.

17

4

Anexo

a

b

c

d

Figura 2.1 Equipos de uso en microbiología, a. Autoclave, b. Estufa c. Horno, d. Espectrofotómetro

18

a

b

c d

e

f

Figura 2.2 Equipos de uso en Microbiología, a. Potenciómetro, b. Refrigeradora, c. Microscopio binocular, d. Contador de colonias, e. Microscopio monocular, f. Baño maría.

19

5. Referencias bibliográficas -

Granados, E. & Villaverde C. (1997). Microbiología. España: Editorial Paraninfo.

-

Mendo, M. (1999).Instrumentación de Laboratorio. Lima, Perú: Editorial Científica

Mundi E.I.R.L.

20

Práctica III Observación de bacterias 1. Introducción Leewenhoek realizó

observaciones de microorganismos hacia fines del siglo XVII; hasta

entonces sólo se podía especular de la existencia de agentes infecciosos más pequeños que lo que el ojo humano podía distinguir. Desde ese momento el microscopio óptico se ha transformado en una herramienta muy importante en la determinación y clasificación microbiana. Muchos agentes microbianos pueden ser identificados en forma confiable con sólo unas pocas coloraciones y un microscopio básico. La coloración de Gram aún es el método individual más eficiente y económico para el diagnóstico rápido y precoz de un tipo bacteriano.

2. Objetivos a.

Reconocer la morfología de las bacterias.

b.

Adquirir destreza en la obtención de un frotis.

c.

Describir las técnicas de coloración simple y compuesta.

d.

Adquirir destreza en la tinción de Gram

3. Procedimiento a.

Obtención de un frotis

El frotis constituye la extensión y fijación de la muestra sobre una lámina portaobjetos limpia y desengrasada. 

Extensión: Se coloca en el centro de una lámina portaobjetos una gota del cultivo

líquido. Si el cultivo fuera sólido, se coloca previamente una gota de solución salina o agua destilada sobre la lámina portaobjetos y sobre ella se emulsiona una pequeña porción de una colonia tomada con el asa de Kolle. En ambos casos se extiende la muestra formando una capa delgada y uniforme procurando no llegar al borde o extremo de la lámina. 

Fijación: Tiene por objeto adherir el extendido al portaobjeto y evitar que sea

arrastrado durante el lavado. Se puede fijar el frotis por el calor suave del mechero.

21

A

c

b D

Figura 3.1 Tecnica para la obtención de un frotis .a) flamear el ansa microbiologica. b) colocar una gota de solucion salina esteril en una lámina portaobjetos c) tomar una colonia de la placa de Petri. c), d) realizar una emulsión , luego extender la muestra sobre la lamina y

fijar la

muestra al calor .

b.

Coloración simple

Es aquella en la cual se usa un solo colorante. Ejemplo: azul de metileno, fucsina, safranina, etc. Procedimiento: 

En una lámina portaobjetos realizar el frotis de la muestra.



Agregar al frotis unas gotas de colorante azul de metileno y dejar actuar durante 3 a 5

minutos. 

Lavar el frotis a chorro de agua.



Secar el frotis a temperatura ambiente o al calor suave del mechero.



Observar al microscopio y esquematizar.

c.

Coloración compuesta: Técnica de Gram

Coloración compuesta es aquella que utiliza más de un colorante. La más común es la tinción de Gram, donde las bacterias se tiñen con cristal violeta de genciana, que al mezclarse con el lugol forma un complejo que es retenido y no es eliminado

por el alcohol acetona en las

bacterias Gram positivas, sucediendo lo contrario en las Gram negativas.

22

Procedimiento: 

En una lámina portaobjetos limpia colocar una gota de cultivo o muestra y realizar el

frotis. 

Cubrir el frotis con violeta de genciana y dejar actuar durante 3 minutos.



Lavar a chorro de agua, cubrir luego con lugol y dejar actuar durante 1 minuto.



Lavar a chorro de agua y decolorar rápidamente con alcohol acetona.



Lavar y cubrir el extendido con safranina y dejar actuar durante 30 a 60 segundos.



Lavar a chorro de agua y secar a temperatura ambiente o al calor suave del mechero.



Observar al microscopio utilizando objetivo de inmersión.



Comparar y esquematizar.

23

4. Anexo

Reactivos para la tinción de Gram

A)

Violeta de Genciana de Hucker Violeta de Genciana ......................................................................... 2,0 g

Soluc. A Soluc. B

Alcohol etílico ............................................................................... 20,0 mL Oxalato de amonio ......................................................................... 0,8 g Agua destilada ............................................................................... 80,0 mL

B)

Solución de safranina

Safranina ...................................................................................... 0,25 g Alcohol etílico .............................................................................. 10,0 mL Agua destilada ............................................................................. 100,0 mL

C)

Solución de lugol

Yodo .............................................................................................. 1,0 g Yoduro de potasio ......................................................................... 2,0 g Agua destilada.............................................................................. 300,0 mL

D)

Alcohol acetona

Alcohol de 95° ............................................................................... 70,0 mL. Acetona .......................................................................................... 30,0 mL

5. Referencias bibliográficas -

Granados, E. y Villaverde C. (1998). Microbiología. España: Editorial Paraninfo.

-

Madigan, M., Martinko, J. y Parker, J. (2004). Brock. Biología de los Microorganismos (10ª ed.) Madrid, España: Parson Educación, S.A.

24

Práctica IV Medios de cultivo 1. Introducción Medio de cultivo es un sustrato que permite el desarrollo y multiplicación de los microorganismos por un tiempo prudencial y a una temperatura adecuada. Todo medio de cultivo debe contener una fuente de carbono y de nitrógeno, debe presentar un equilibrio ácido – base (pH) y debe estar libre de microorganismos contaminantes (esterilizado en autoclave a 121 °C, 15 libras de presión, por 15 a 20 minutos.

1.1 Clases de medios de cultivo según su naturaleza 1.1.1

Naturales

a.

Origen animal: Leche, huevos.

b.

Origen vegetal: Papas.

1.1.2

Artificiales: Son aquellos que tienen una composición química conocida y constante ejemplo Agar Tripticasa soya.

1.2 Clases de medios de cultivo según su utilidad 1.2.1

Medios comunes: Permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos. Entre ellos están el caldo común, agar común, caldo nutritivo y agar nutritivo.

Caldo común (g/L) Peptona NaCl

10,0 5,0

Agua destilada csp

1000 mL

pH

7,0

Agar común (g/L) Peptona

10,0

NaCl

5,0

Agar

15,0

Agua destilada csp

1000 mL

pH

7.0

25

Caldo nutritivo (g/L) Peptona

10,0

NaCl

5 ,0

Extracto de carne

3,0

Agua destilada csp

1000 mL

pH

7,0

Agar nutritivo (g/L) Peptona

10,0

NaCl

5,0

Agar

15,0

Extracto de carne

3,0

Agua destilada csp

1000 mL

pH

1.2.2

7,0

Medios especiales

a. Medios mejorados o enriquecidos: Son aquellos a los que se les agrega fluidos orgánicos como sangre, yema de huevo, suero, etc. Agar sangre Agar común fluidificado y enfriado a 45 °C

95 mL

Sangre citratada

5 mL

b. Medios selectivos o de aislamiento: Facilitan el desarrollo de un determinado grupo de microorganismos e inhiben a otros acompañantes. Ejemplo: agar Chapman, agar azida de sodio. Agar Chapman (g/L) Peptona

10,0

Extracto de carne

1,0

NaCl

75,0

Manitol

10,0

Agar

15,0

Agua destilada csp

1000 mL

Rojo de fenol

2,5 ml (pH 6.8 amarillo, pH 8.4 rojo)

pH

7,4

26

c. Medios selectivos diferenciales: Son semejantes a los de aislamiento pero contienen un sustrato definido y un indicador de pH. Permiten el desarrollo de un determinado grupo de microorganismos y a la vez los diferencian según la utilización del sustrato. Ejemplo: Agar Mac Conkey, Agar SS.

Agar Mac Conkey (g/L) Peptona Peptona proteosa Lactosa

17,0 3,0 10,0

Sales biliares

1,5

Cristal violeta

0,001

NaCl

5,0

Agar

15,0

Agua destilada csp

1000 mL

Rojo neutro

0,03 (pH 6.8 rojo, pH 8 incoloro)

pH

7,1

d. Medios diferenciales: Permiten poner de manifiesto alguna propiedad bioquímica de los microorganismos. Tienen un sustrato definido y un indicador de pH. Ejemplo: Agar TSI, Agar LIA.

Agar LIA (Agar lisina hierro) (g/L) Peptona

5,0

Extracto de Levadura

3,0

Dextrosa

1,0

Lisina

10,0

Cítrato amónico férrico

0, 5

Tiosulfato de sodio

0, 04

Púrpura de bromocresol

0, 02

Agar

15 g

Agua

1 000 mL

pH

6,7

27

1.3 Clases de medios según su consistencia 1.3.1

Líquidos

1.3.2

Sólidos: Son aquellos que tienen un solidificante llamado agar que es un polisacárido extraído de las algas marinas pardas y tiene la propiedad de licuarse a 80 – 100 °C y de solidificarse a 40 °C. Así mismo, el agar no es degradado por las bacterias.

1.3.3

Semisólidos: Son aquellos que contienen entre 0,3 a 0,5 % de agar.

2. Objetivos 2.1 Diferenciar los medios de cultivo de mayor uso en el laboratorio de Microbiología. 2.2 Adquirir destreza en la preparación y esterilización de medios de cultivo.

3. Procedimiento 3.1 Preparación y esterilización de medios de cultivo a. Pesar cada uno de los componentes del medio de cultivo, llevarlos hacia un matraz y adicionar la cantidad de agua destilada requerida. b. Disolver en Baño María. c. Enfriar y ajustar el pH según convenga. d. Colocar un tapón de algodón en el extremo superior del matraz, cubrirlo con papel y asegurar con pabilo. e. Esterilizar en autoclave a 121 °C, 15 libras de presión durante 15 minutos.

3.2 Metodología para servir medios de cultivo a. Fluidificar los medios sólidos al calor, enfriar a 50 °C y frente a la llama del mechero servir en placas de Petri, en tubos o en viales previamente esterilizados. Dejar solidificar. En el caso de los tubos y viales, colocar sobre una superficie inclinada. b. Servir los medios líquidos en tubos o en viales previamente esterilizados.

3.3 Control de esterilidad de los medios de cultivo servidos a. Acondicionar los medios de cultivo servidos e incubar durante 24 horas a 30 °C. b. Observar y descartar los medios que presenten (contaminante).

28

desarrollo de algún microorganismo

Adicionar los ingredientes en el matraz.

Agua destilada

Llevar el medio a autoclave

Llevar el medio de cultivo a control de esterilidad.

Servir los medios a placas

Llevar a control de esterilidad

Adicionar los ingredientes en el matraz.

Agua destilada

Homogenizar el medio de cultivo

Los tubos son colocados en una gradia y son taponados con algodón

Servir el medio de cultivo

Los tubos son llevados a autoclave

Los tubos son inclinados y llevados a control de esterilidad.

Figura 4.1 Metodología para preparar, esterilizar, servir y controlar medios de cultivo sólidos y líquidos

4. Referencias bibliográficas -

Granados, E. y Villaverde C. (1998). Microbiología. España: Editorial Paraninfo.

-

Madigan, M., Martinko, J. y Parker, J. (2004). Brock. Biología de los Microorganismos (10ª ed.) Madrid, España: Parson Educación, S.A.

29

Práctica V Siembra y aislamiento de bacterias 1. Introducción Sembrar es la acción de poner una bacteria en contacto con un medio adecuado o sustrato que permita el desarrollo de colonias. Los objetivos de la siembra pueden ser para aislamiento y para trasplante. La siembra para aislamiento se realiza cuando se desea estudiar la muestra. Por lo común ésta presenta una mezcla de bacterias por lo que es preciso separar (aislar) los microorganismos. Generalmente se utiliza la técnica de agotamiento en superficie sólida o aislamiento en estría simple. Cuando se desea contar el número de bacterias se utiliza la técnica de placa vertida. La siembra para trasplante ocurre cuando el material motivo de estudio contiene una sola especie microbiana (cepa). También se denomina “repique”. El objetivo es el mantenimiento del microorganismo conocido cambiándolo a un nuevo medio de cultivo. La siembra por trasplante puede ser: 

De un medio sólido a otro medio sólido



De un medio sólido a un medio líquido



De un medio líquido a otro medio líquido



De un medio líquido a un medio sólido

2. Objetivos - Realizar una siembra por agotamiento en superficie sólida o aislamiento en estría simple. - Realizar una siembra por difusión en placa o placa vertida - Obtener un cultivo puro de bacterias

3. Procedimiento 3.1 Siembra por agotamiento en superficie sólida o aislamiento en estría simple Se realiza para obtener colonias individuales de bacterias a partir de una muestra biológica. 

Tomar una alícuota de la muestra (inóculo) y depositarla en uno de los extremos

superiores de la placa de Petri que contiene medio de cultivo agar nutritivo previamente servido y controlado. 

Realizar movimientos en zig – zag (estrías) muy juntos en el primer tercio de la placa

para agotar el inóculo. Posteriormente realizar estrías muy separadas de un extremo a otro lado de la placa no tomando nuevo inóculo ni levantando el asa hasta concluida la siembra en toda la placa. 

Incubar a 37 ºC (o la temperatura requerida por la bacteria) durante 24 horas. 30

Figura 5.1 Siembra por la tecnica de agotamiento y estria.

3.2 Siembra por difusión en placa o placa vertida Se utiliza para realizar el recuento total de bacterias de una muestra biológica. 

Depositar 0,1 mL (0,5 mL, 1 mL)) de la muestra sobre la superficie de una placa de Petri estéril y vacía.



Agregar 10 mL de agar nutritivo licuado y enfriado a 45 – 50 °C.



Homogenizar por movimientos de rotación de la placa de Petri para la dispersión de microorganismos en forma más o menos homogénea, hasta la solidificación.



Incubar a 37 ºC durante 24 horas.



Realizar el recuento de colonias.

3.3

Obtención de un cultivo puro de bacterias

a.

Tratamiento de la muestra

Para estudiar las bacterias se necesita poder cultivarlas en condiciones de laboratorio y por lo tanto inicialmente deben ser aisladas. Por ello, se debe disponer de muestras biológicas que pueden ser de varios tipos: a.1 Muestras que contienen abundante número y tipo de microorganismos en las

que

previamente se deben realizar diluciones en solución salina fisiológica estéril. Ejemplo suelo. a.2 Muestras que no contienen suficiente cantidad del microorganismo que se desea investigar, por lo que previamente se deben enriquecer para incrementar el número del microorganismo requerido y disminuir el de los contaminantes. Ejemplo leche. a.3 Muestras que naturalmente no presentan

bacterias (incluyendo el microorganismo

investigado y los contaminantes) y que se siembran sin ningún pre-tratamiento. Ejemplos sangre,

31

b.

Aislamiento primario

Una vez que la muestra ha recibido o no tratamiento se procede al aislamiento primario a través de la siembra en placa de Petri mediante la técnica de estría en la superficie de medios enriquecidos (agar sangre), medios selectivos (agar Chapman) o medios selectivos diferenciales (agar Mac Conkey). Después de un periodo de incubación de 24 horas (puede variar en función del microorganismo), se observarán las colonias de bacterias (masas constituidas por millones de bacterias que se aprecian a simple vista y que han sido originadas a partir de una célula). Se observará el tamaño y el aspecto de cada colonia que generalmente son constantes para cada género y especie bacteriana, por lo que se les utiliza como característica diferencial. A continuación se realizará una tinción de Gram para determinar la morfología y reacción tintorial de las bacterias constituyentes de la colonia.

Figura 5.2 Aislamiento primario: observe las colonias bacterianas debidamente aisladas sobre el medio de cultivo.

32

c.

Aislamiento secundario

En caso que la morfología y reacción a la tinción de Gram de las células bacterianas coincidan con el microorganismo que se desea investigar se realiza el aislamiento secundario a través de una siembra para trasplante o transferencia de una pequeña porción de la colonia hacia un tubo con medio de cultivo inclinado que permitirá el desarrollo bacteriano o cultivo puro bacteriano (población de bacterias que procede de una célula) y que a su vez puede ser mantenido e identificado merced a sus propiedades culturales y fisiológicas.

4. Referencias bibliográficas -

Perú, Ministerio de Salud (2001). Manual de análisis Microbiológico de alimentos. Lima, Perú: Dirección General de Salud Ambiental

-

Madigan, M., Martinko, J. & Parker, J. (2004). Brock. Biología de los Microorganismos (10ª ed.) Madrid, España: Pearson Educación, S.A.

33

Práctica VI IDENTIFICACION DE BACTERIAS 1. Introducción Una vez obtenido un cultivo puro de una bacteria se debe realizar la identificación del género y en el mejor de los casos de la especie. Las pruebas de identificación comienzan con el estudio morfológico de la colonia, estudio morfológico de las células, motilidad, prueba de catalasa, citocromo oxidasa, prueba de oxidación fermentación, metabolismo de carbohidratos, metabolismo de compuestos nitrogenados, y muchas otras pruebas según la bacteria que va a ser identificada.

2. Objetivos 2.1 Caracterizar morfológicamente las colonias bacterianas. 2.2 Caracterizar morfológicamente las células bacterianas. 2.3 Realizar e interpretar la prueba de catalasa. 2.4 Realizar e interpretar la prueba de oxidación-fermentación 2.5 Realizar e interpretar pruebas para investigar el metabolismo de los carbohidratos y compuestos nitrogenados

3. Procedimiento

3.1 Estudio morfológico de las colonias bacterianas Determinar el tamaño, forma, borde, elevación, consistencia, aspecto y color de la colonia bacteriana. a) Tamaño: Pequeño, mediano, grande y muy grande o extendida en forma de velo, invadiendo toda la superficie del medio. b) Forma: Puntiforme, circular, rizoide, filamentosa, irregular, fusiforme. c) Bordes: Enteros, ondulados, filamentosos, rizoides, lobulados, espiculados. d) Elevación: Plana, convexa, umbilicada, acuminada, plano-convexa, papilada. e) Aspecto: Pulverulenta, granulosa, acuosa, brillante, transparente. f) Color: Pigmentada, no pigmentada.

34

Forma

Elevación

Figura 6.1 Distintas formas, bordes y elevación de colonias bacterianas.

3.2 Prueba de catalasa La catalasa es una enzima que cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. Se encuentra presente en la mayoría de los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos excluyendo a los estreptococos. Técnica del porta objetos: En una lámina portaobjetos depositar una colonia bacteriana procedente de un cultivo joven y añadir dos gotas de agua oxigenada de 30 volúmenes. Interpretación: La prueba se considera positiva cuando se produce una efervescencia rápida con desprendimiento de burbujas. La enzima catalasa convierte el peróxido de hidrógeno en agua y oxigeno molecular. 2 H202 = 2 H20 + 02

35

Figura 6.1 Reacción positiva en la prueba de la catalasa.

Tabla 6.1 Prueba de catalasa en algunas bacterias Gram positivas Reacción Morfología

Cocos

Bacilos esporulados Bacilos no esporulados

Catalasa

Gram

Staphylacoccus

+

+

Micrococcus

+

+

Streptococcus

-

+

Enterococcus

-

+

Bacillus

+

+

Clostridium

-

+

Listeria

+

+

Corynebacterium

+

+

Erysipelotrix

-

+

3.3 Estudio morfológico de las células bacterianas Realizar un frotis de una pequeña porción de la colonia y una tinción de Gram para determinar la morfología celular y reacción a la tinción de Gram de las células bacterianas.

36

3.4 Prueba de oxidación fermentación Determina el tipo de metabolismo, oxidativo o fermentativo, que utilizan las bacterias al desarrollar sobre un hidrato de carbono. En la vía oxidativa, el aceptor final de electrones es el oxígeno, por consiguiente el proceso es aerobio y produce poca acidez. Es la vía fermentativa, el aceptor final de electrones es un compuesto orgánico procedente de la misma vía, por consiguiente el proceso es anaerobio y se origina mucha acidez. La acidez se detecta por la presencia de un indicador de pH. Las bacterias oxidativas producen ácido en la zona de contacto con el aire pero no en profundidad, las bacterias fermentativas producen mucho ácido en todo el tubo. Técnica: Sembrar por picadura en dos tubos con medio Hugh-Leifson (0/F). Cubrir uno de los tubos con vaselina o aceite de parafina estéril. Incubar a 37 ª C por 24 horas, aunque a veces es necesario una incubación de hasta 14 días. Interpretación: Si la vía es oxidativa, sólo el tubo que no tiene vaselina vira ligeramente en la parte superior al amarillo y más tarde se extenderá por todo el tubo, pero nunca con producción de gas. Si la vía es fermentativa, se observará un viraje intenso al amarillo que se inicia en la parte inferior de los dos tubos con o sin producción de gas. Utilización: Se usa para diferenciar Staphylococcus O (+) F (+) de Micrococcus O (+) F (-).

3.5 Metabolismo de carbohidratos Investigar la fermentación de lactosa, sacarosa y glucosa (agar TSI), formación de acidez (medio RMVP), utilización del citrato como fuente de carbono y energía (medio citrato de Simmons) e hidrólisis del almidón (agar almidón).

3.6 Metabolismo de compuestos nitrogenados Investigar la descarboxilación de la lisina (agar LIA) y formación de indol (caldo peptonado)

37

AGAR TSI (Agar triple azúcar de hierro) – (color del medio: anaranjado-rojizo)

1. Composición Extracto de carne

3,0 g

Extracto de levadura

3,0 g

Peptona

15 g

Peptona proteasa

5,0 g

Lactosa

10 g

Sacarosa

10 g

Glucosa

1,0 g

Sulfato ferroso (FeSO4)

0.2 g

Cloruro de sodio

5,0 g

Tiosulfato de sodio (Na2S2O3)

0,3 g

Agar

15 g

Rojo de fenol

0.024 (indicador:6.8 amarillo;7,4 rojo)

Agua csp

1 litro

pH

7,4

2. Fundamento Este medio se utiliza para la identificación de enterobacterias según su capacidad para metabolizar o no los carbohidratos, con o sin formación de sulfuro de hidrógeno (H2S) y gas. Cuando el microorganismo metaboliza los carbohidratos produce acidez que hace virar el indicador rojo de fenol a un color amarillo. La fermentación de la glucosa se lee al fondo del tubo (amarillo), la fermentación de la sacarosa en la parte intermedia del tubo (amarillo) y la fermentación de la lactosa se lee en la parte superior del tubo (amarillo). Cuando el microorganismo no metaboliza los carbohidratos, utiliza las proteínas que alcalinizan el medio por la formación de aminas y el indicador rojo de fenol vira a un color rojo acentuado, debido a que la pequeña cantidad de glucosa (0.1%) se consume rápidamente en la superficie y luego se realcaliniza por el ataque de la peptona (lactosa negativo). En la producción de sulfuro de hidrógeno, el microorganismo reduce el tiosulfato de sodio hasta hidrógeno sulfurado (o sulfuro de hidrógeno) y éste se une al fierro (del FeSO4) formando un compuesto negro: sulfuro de fierro. Se observa entonces un precipitado negro en cualquier parte del tubo, especialmente en el fondo. En la formación de CO2 e H2 durante la fermentación de los carbohidratos: el agar se rompe o se forman cavidades con aire en el medio de cultivo. 38

3. Técnica 

Sembrar por puntura y estría en la superficie de un tubo conteniendo medio TSI.



Incubar a 37 °C durante 24 horas.



Realizar la lectura correspondiente.

4. Lectura

rojo

rojo

amarillo

negro amarillo

amarillo

A/A

K/A

K/A

amarillo todo el tubo

amarillo en el fondo del tubo y rojo en la parte superior

amarillo en el fondo del tubo y rojo en la parte superior

Gas (+) H2S (-) glucosa (+) lactosa (+) sacarosa (+)

Gas (-) H2S (-) glucosa (+) lactosa (-) sacarosa (-)

Gas (-) H2S (+) glucosa (+) lactosa (-) sacarosa (-)

amarillo

A

C

B

39

Medio MRVP (Rojo de Metilo – Voges Proskauer)

1. Composición (g/L) Polipeptona

7,0

Glucosa

5,0

Fosfato dipotásico

5,0

Agua csp

1000 mL

Indicador rojo de metilo

pH 4,5 = Rojo pH 6,3 = Amarillo

pH

6,9

2. Fundamento Este medio permite realizar la prueba del Rojo de Metilo y de Voges Proskauer. La prueba de rojo de metilo detecta la formación de ácidos (láctico, acético, fórmico) por fermentación ácido mixto de la glucosa. Dado que son muchas las especies de enterobacterias que pueden producir cantidades suficientes de ácidos detectables con el indicador rojo de metilo durante las fases iniciales de la incubación, sólo se consideran rojo de metilo positivos aquellos organismos que pueden mantener el pH bajo después de una incubación prolongada de 48 horas. 3. Técnica  Inocular un tubo conteniendo caldo MRVP.  Incubar a 37 ° C durante 48 horas.  Adicionar cinco gotas del reactivo rojo de metilo y mezclar.

4. Lectura El desarrollo de un color rojo estable indica que la producción de ácido es suficiente como para bajar el pH a menos de 4.4 y es una prueba positiva. Dado que otros organismos pueden producir cantidades menores de ácido es posible el desarrollo de un color naranja intermedio entre el amarillo y el rojo. Ésta es una prueba negativa al igual que cuando el tubo se torna amarillo.

40

MEDIO CITRATO DE SIMMONS

1. Composición (g/L) Fosfato amónico

1,0

Citrato sódico

2,0

Cloruro sódico

5,0

Fosfato bipotásico

1,0

Indicador azul de bromotimol

0,08

pH 6 = amarillo, pH  7.6 = azul Sulfato magnésico

0.20

Agar

15

Agua csp

1000 mL

pH

6.9

2. Fundamento Este medio permite investigar si el microorganismo es capaz de utilizar el citrato como fuente de carbono y energía. En caso positivo el citrato es oxidado y se forman carbonatos y bicarbonatos (C02 se junta con el sodio). Simultáneamente los microorganismos utilizan el fosfato amónico como fuente de nitrógeno y liberan amoníaco. La presencia de carbonatos, bicarbonatos y amoníaco alcaliniza el medio y el indicador azul de bromotimol vira al azul. 3. Técnica  Sembrar por el método de estría un tubo conteniendo agar citrato inclinado.  Incubar a 37 ° C durante 24 horas.  Observar el cambio de coloración del medio de cultivo y/o el crecimiento de la bacteria.

4. Lectura En caso positivo se observará el medio de cultivo de color azul. Algunas veces la bacteria utiliza el citrato pero no produce alcalinidad suficiente como para hacer virar el indicador, observándose crecimiento de la bacteria pero no cambio del color del medio de cultivo. Se recomienda incubar 24 horas adicionales. En caso negativo no se observará crecimiento de la bacteria y el medio permanecerá de color verde.

MEDIO AGAR ALMIDÓN

1. Composición (g/L) Agar nutritivo

100 mL

Almidón

1.0

2. Fundamento El almidón es un polímero complejo que reacciona con el lugol (yodo) formando un complejo de color azul. Cuando las bacterias hidrolizan el almidón a moléculas más simples como la maltosa y glucosa, éstas ya no reaccionan con el lugol y no se forma una coloración azul.

3. Técnica 

Sembrar por el método de estría un tubo conteniendo agar almidón inclinado.



Incubar a 37 ° C durante 24 horas.



Adicionar dos gotas de lugol.



Observar la presencia o no de una coloración azul.

4. Lectura En una hidrólisis positiva del almidón, después de adicionar el lugol no se observará coloración alguna. Por el contrario, en una hidrólisis negativa después de adicionar el lugol se observará una coloración azul.

AGAR LIA (Agar Lisina Hierro)

1. Composición (g/L) Peptona

5,0

Extracto de levadura

3,0

Dextrosa

1,0

Lisina

10,0

Cítrato amónico férrico

0, 5

Tiosulfato de sodio

0,04

Púrpura de bromocresol

0,02

Agar

15,0

Agua

1 litro

pH

6.7

2. Fundamento Este medio permite evidenciar la descarboxilación de la lisina y la formación de ácido sulfhidrico (H2S). 

Para que se lleve a cabo la descarboxilación tiene que existir acidez (pH inferior a 6,0)

por lo que es necesario que el microorganismo primero fermente la glucosa (solo

debe

utilizarse este medio para fermentadores de la glucosa). Posteriormente la lisina es descarboxilada hasta la amina cadaverina que produce un viraje del indicador hacia el color violeta (K / K). 

La producción de H2S se evidencia por la coloración negra debido al sulfuro de fierro

formado. 

Algunos microorganismos no descarboxilan la lisina pero si la desaniman hasta un

cetoácido el cual da un color anaranjado en presencia de las sales férricas y un color rojizo bajo la influencia del oxígeno en la parte inclinada superficial del medio de cultivo (R / A). 

Los microorganismos que no descarboxilan la lisina pero fermentan la glucosa

producen un viraje al amarillo de la totalidad del medio de cultivo (A / A).

3. Técnica 

Sembrar por puntura y estría en superficie en un tubo conteniendo medio LIA



Incubar a 37 °C durante 24 horas.



Realizar la lectura correspondiente.

4. Lectura

Negro Violeta Rojo Amarillo

Violeta

Amarillo

Amarillo

K/K

R/A

K/A

LIA (-)

LIA (+)

A/A

MEDIO CALDO PEPTONADO 1. Composición (g/L) Peptona

10,0

Na Cl

3,0

H2O csp

1000

pH

7,0

Reactivo de Kovac :

Alcohol amílico o isoamílico puro

150

p – dimetilaminobenzaldehido

10

HCl concentrado

50

2. Fundamento Este medio permite investigar la presencia de indol como producto de la hidrólisis del aminoacido triptófano presente en la peptona. Los microorganismos que producen la enzima triptofanasa hidrolizan y desaniman el triptófano con producción de indol, ácido pirúvico y amoniaco. El indol forma un complejo de color rojo cuando reacciona con el grupo aldehido del p – dimetilaminobenzaldehido (Reactivo de Kovac) 3. Técnica 

Inocular el caldo peptonado con el microorganismo en estudio.



Incubar a 37 °C durante 24 horas.



Agregar por la pared del tubo cinco gotas del reactivo Kovac.

4. Lectura Observar la formación de un anillo coloreado en la zona de reacción (color rojo) = Indol (+)

Tabla 6.2. Reacción a ciertas pruebas bioquímicas claves para la diferenciación de bacterias entéricas Lisina Géneros

H2S

Indol

Rojo de

Gas (glucosa)

descarb.

Citrato

Lactosa

metilo Escherichia

-

+

+

d

-

+

+

Enterobacter

-

-

+

+

+

+

+

Shigella

-

+/-

+

-

-

-

-

Salmonella

+

-

+

+

+/-

+

-

Klebsiella

-

-

-

+

+

+

+

Citrobacter

+/-

-

+

-

+

+

d

Proteus

+/-

+/-

+

-

D

+/-

-

4. Referencias bibliográficas -

Carreño, C. (2010). Manual de Prácticas de Microbiología Industrial. Lambayeque, Perú.

-

MERCK (2005). Curso Taller de Actualización teórico-prácrtico. Técnicas Microbiológicas de Análisis de Aguas y Alimentos. Piura, Perú.

-

Perú, Ministerio de Salud (2001). Manual de análisis Microbiológico de alimentos. Lima, Perú: Dirección General de Salud Ambiental

-

Doyle, M., Beuchat, L. & Montville T. (1997). Microbiología de los alimentos. Fundamentos y Fronteras. España: Editorial Acribia, S.A.

-

Madigan, M., Martinko, J. & Parker, J. (2004). Brock. Biología de los Microorganismos (10ª ed.) Madrid, España: Pearson Educación, S.A.

PRÁCTICA VII RECONOCIMIENTO DE LAS ETAPAS DE UN PROCESO DE FERMENTACIÓN INDUSTRIAL Un proceso de fermentación típico es aquel que se lleva a cabo en un recipiente llamado fermentador o biorreactor, en el que determinados sustratos que componen el medio de cultivo son transformados por acción microbiana en metabolitos y biomasa (producto). En el esquema general de un proceso de fermentación existen cuatro etapas diferenciadas: propagación de cultivos, fermentación, operaciones y procesos de separación y purificación de los productos (recuperación de producto) y tratamiento de los residuos.

1.

Propagación de cultivos La propagación de cultivos se realiza en laboratorio y comienza con un tubo de ensayo que

contiene un cultivo reciente de un microorganismo o un tubo liofilizado o congelado, donde se conserva el microorganismo de interés obtenido comercialmente. En ambos casos el proceso, comprende aislamiento, selección, mantenimiento y mejoramiento de los microorganismos de interés industrial.

Los microorganismos que se utilizan en un proceso, pueden ser obtenidos por aislamiento a partir de fuentes naturales o de una colección de cultivos .La fuente de todos los microorganismos industriales es el ambiente natural (suelo, agua), animales y plantas enfermas, alimentos de fermentaciones naturales (vino, pan, queso) y materiales en descomposición. A nivel industrial, en general, cada firma posee su propia colección de organismos, muchos de los cuales han sido mejorados a través de técnicas clásicas de mutación o de ingeniería genética En el mundo existe un gran número de colecciones depositarias de cultivos como American Type Culture Collection (ATCC), USA y la Colecciòn Española de cultivos tipo (CECT) las cuales mantienen bacterias, levaduras, algas, actinomycetos, mohos, protozoos, virus y líneas celulares.

Elegida la fuente de aislamiento, las posibilidades de éxito dependen de la técnica utilizada, siendo las alternativas: a) aislamiento directo b) enriquecimiento de la muestra con o sin pretratamiento. Una vez efectuado el aislamiento de los microorganismos se procede al “screening” primario que es una selección cualitativa para detectar si el microorganismo produce o no un compuesto. Por ejemplo, seleccionar microorganismos productores de ácidos orgánicos, enzimas, antibióticos por la presencia de

halos transparentes o de

zonas de

inhibición de crecimiento, respetivamente. Se prosigue con el “screening" secundario, que es una selección cuantitativa para valorar la producción y productividad industrial. Por ejemplo, determinar el espectro antimicrobiano, la concentración de ácidos orgánicos o de enzimas producidas.

Después de la selección de

microorganismos industriales es preciso mantenerlos y

conservarlos. El mantenimiento es por cortos períodos de tiempo (días) y la conservación por largos períodos de tiempo (años), a través de diferentes técnicas que corresponden a la desecación, congelación y liofilización. En general los organismos aislados de la naturaleza producen

metabolitos de interés

industrial en concentraciones muy bajas, por lo tanto se hace necesario incrementar estos rendimientos, para lograr una mayor rentabilidad de los procesos. Una forma de mejorar el rendimiento es mediante la optimización del medio de cultivo y de las condiciones de operación, pero está limitado por la capacidad de síntesis máxima del producto deseado que tiene el organismo. La otra posibilidad es el mejoramiento genético de la cepa por selección natural de variantes, mutación inducida y recombinación genética. La productividad potencial de un organismo es controlada por su genoma, pudiendo ser modificado para incrementar los rendimientos. Con el organismo modificado se reexaminan las condiciones de cultivo para lograr nuevamente la máxima productividad.

Finalmente, se procede a la propagación de los cultivos o inóculos, teniendo como material de partida los microorganismos seleccionados y en el mejor de los casos mejorados, debiendo aumentar la cantidad de los mismos mediante sucesivos pasajes en frascos de volúmenes crecientes, que son generalmente operados en agitadores (5 a 100 mL y entre 100 a 10 000 mL respectivamente)

2.

Fermentación Un proceso típico de fermentación comienza con la formulación y esterilización del medio

de cultivo así como la esterilización del equipo (tanque de inóculo o prefermentador y fermentador de producción). El inóculo propagado sucesivamente en matraces se siembra en el tanque de inóculo o prefermentador que puede tener un volumen de 10 L a

1 000 L, según la

escala industrial posterior. Del tanque de inóculo se siembra al fermentador industrial o de producción cuyo volumen varía de acuerdo al producto a obtener y a su concentración y está comprendido entre 1000 a 100 000 L. En algunos casos especiales, como la producción de proteína microbiana, los tanques de fermentación pueden llegar hasta 1 000 000 L.

El tamaño de inóculo generalmente es de 1 a 10 % del volumen total del medio. Si es inferior a esta proporción se puede prolongar el periodo de latencia, lo que incrementará el periodo de fermentación. Se considera 5 a 10 % para hongos y actinomicetos y 0,1 a 3,0 % para bacterias, a excepción de los actinomicetos.

3.

Operaciones y procesos de separación y purificación de los productos Estas etapas comprenden en forma general y sucesivamente: a) separación de insolubles

por filtración, centrifugación o decantación; b) separaciones primarias por extracción, absorción, adsorción, ultrafiltración; c) purificación por extracción líquido – líquido o extracción a dos fases acuosas, o cromatografía de afinidad, y finalmente

d) aislamiento

del producto.

4.

Tratamiento de residuos Si bien no tiene una relación directa con el producto, que es la razón de ser la industria de

fermentación, representa una etapa imprescindible, porque es fundamental controlar la calidad y cantidad de residuos que salen de la fábrica y que son enviados generalmente a un curso de agua, sea un canal, arroyo, un río o al mar.

Procesos y Propagación

Fermentación

de los cultivos

operaciones de

Tratamiento

separación y

de residuos

purificación

Separación

Residuos

Esterilización

Purificación

Tratamiento

Preparación de medios

Producto

Materias primas



Aislamiento



Selección



Mantenimiento



Mejoramiento



Propagación multiplicación

o de

cultivos

Figura 1. Esquema general de un proceso de fermentación o bioproceso.

5. Referencias bibliográficas

Dorán, P. (1995). Principios de Ingeniería de los Bioprocesos. España: Editorial Acribia.

Ertola, R., Yantorn, O. & Mignon, C. (1994). Microbiología Industrial. Argentina.

Madigan M., Martinko, J. & Parker, J. (2004). Brock. Biología de los Microorganismos. 10 a ed. Madrid: Pearson Educación, S.A.

PRÁCTICA VIII AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y MANTENIMIENTO DE CULTIVOS LÁCTICOS TERMÓFILOS: Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus 1. Introducción Los cultivos lácticos iniciadores, fermentos o starters son microorganismos seleccionados que se emplean en la industria de alimentos fermentados. Según la temperatura óptima de crecimiento, los cultivos lácticos comerciales pueden ser termófilos y mesófilos y según su composición pueden ser fermentos de cepa única, múltiples y mixtos. Los cultivos lácticos termófilos contienen bacterias cuya temperatura óptima de crecimiento está entre 40 a 45 ºC. Son utilizados para la elaboración de yogurt y quesos duros y están constituidos por Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helveticus y L. lactis. El yogurt es un producto lácteo fermentado que resulta del crecimiento de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus en leche concentrada (por evaporación o por adición de sólidos). Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus es un bacilo Gram positivo, largo, no móvil, que produce ácido D (-) láctico. Fermenta fructosa, galactosa, glucosa y lactosa, pero no maltosa y sacarosa. Requiere 11 a 15 aminoácidos, según las cepas y acidifica la leche más lentamente que los estreptococos, pero generalmente más intensamente gracias a una mayor resistencia al pH ácido (hasta pH 3,5) y a una concentración más elevada de ácido láctico (máximo 27 g/L). Streptococcus thermophilus es un coco Gram positivo, esférico, agrupado en pares o en cadenas, homofermentativo y produce ácido L (+) láctico a partir de glucosa, fructosa, lactosa y sacarosa. Se distingue básicamente por su crecimiento termófilo con un óptimo de 42 a 43 ºC y termorresistencia a 60 ºC durante 30 minutos. Los estreptococos y lactobacilos transforman 20 a 30 % de la lactosa de la leche en ácido láctico. La lactosa es hidrolizada a través de una B – D – galactosidasa en D – glucosa y B – D galactosa. A continuación, la D – glucosa es trasformada en ácido pirúvico y después en ácido láctico, mientras que la galactosa es excretada y se acumula progresivamente en la leche, porque no es utilizada por los microorganismos del yogurt. Durante la fermentación del yogurt (42 a 45 ºC) se mantiene un equilibrio entre la población de estreptococos y lactobacilos y un favorable efecto sinérgico entre los dos gérmenes, ya que su crecimiento conjunto es más rápido que el crecimiento en un cultivo puro de cada uno de ellos. El estreptococo utiliza péptidos y aminoácidos (valina) liberados a partir

de las proteínas de la leche por los lactobacilos y a su vez, el crecimiento de éstos es estimulado por compuestos producidos por los estreptococos como ácido fórmico, anhídrido carbónico y ácido pirúvico. Los criterios de caracterización y selección de las bacterias lácticas termófilas utilizadas en la elaboración del yogurt se basan en cuatro propiedades que se determinan después de su cultivo en leche: acidificación a temperatura elevada, acidificación a baja temperatura, producción de acetaldehído y viscosidad del medio de cultivo. La medida de la producción de ácido láctico a 44 ºC, durante la fase de crecimiento exponencial, caracteriza la actividad acidificante en la fermentación del yogurt. El control de la producción de ácido láctico a temperaturas entre 4 a 12 ºC después del crecimiento exponencial, durante 24 días, permite predecir los fenómenos de post – acidificación, durante la comercialización del producto. La cantidad de acetaldehído producido representa una buena forma de apreciar el efecto de una bacteria sobre el aroma del yogurt, ya que el acetaldehído es el componente mayoritario en este aroma. Finalmente, la medida de la viscosidad de la leche por determinación de las fuerzas de cizallamiento, permite conocer directamente la contribución de una bacteria a la viscosidad del producto final. La elaboración de yogurt a pequeña escala permite comprobar las propiedades tecnológicas de las mezclas de bacterias previamente seleccionadas en laboratorio. El análisis organoléptico de los productos obtenidos a escala industrial aporta información suplementaria sobre las aptitudes de las mezclas de cepas, en lo que respecta a su contribución al aroma y viscosidad del producto final. Una vez seleccionadas las bacterias lácticas, éstas son conservadas y comercializadas en diversas formas, cada una de las cuales presenta ventajas y desventajas.

a) Cultivos líquidos frescos o estárter líquidos Para su obtención se requiere de leche en polvo desnatada, reconstituida (10 a 12 % extracto seco magro, E.S.M.), esterilizada en autoclave a 15 libras de presión durante 10 a 15 minutos e incubada a 30 ºC durante 1 semana para comprobar su esterilidad. Tras la inoculación (1 a 2 %) la leche es incubada a 30 ºC durante 16 a 18 horas o a 42 ºC durante 3 horas a 4 horas. Después, el cultivo coagulado es refrigerado y cuando la acidez del cultivo refrigerado es de aproximadamente 0,85 % de ácido láctico se tiene la garantía que durante 1 semana se mantendrá su actividad y la relación cocos: bacilos (1:1), recomendándose realizar como máximo 15 a 20 resiembras. Este tipo de estárter se conoce en la industria láctica como cultivos de reserva de trabajo. Su principal desventaja consiste en su corto periodo de conservación, debido al posterior desarrollo de acidez y contacto de las células con el medio ácido, lo que resta actividad al cultivo.

Se puede conseguir una conservación más prolongada de cultivos líquidos utilizando leche Litmus esterilizada en autoclave e incubada durante 1 semana para comprobar su esterilidad. Después de la siembra se incuba a 42 ºC durante 12 horas y se almacena en refrigeración. Estos cultivos solo tienen que ser reactivados una vez cada 3 semanas y son conocidos como cultivos de reserva.

b) Cultivos liofilizados (no concentrados) El estárter se cultiva en leche en polvo desnatada, reconstituida, esterilizada en autoclave con un porcentaje de inoculación de 2 % y se incuba a 42 ºC durante 4 horas. Después, se mantiene a 5 ºC durante 18 horas y posteriormente se distribuye en alícuotas de 2 a 3 mL en viales de vidrio estériles. Los viales se congelan a – 40 ºC durante 2 a 3 horas, después son liofilizados durante 36 horas, cerrados al vacío, sellados y se mantienen a 5 ºC hasta su utilización. Para la activación de los cultivos liofilizados se vierte el contenido del vial en

250

mL de leche en polvo desnatada, reconstituida, esterilizada en autoclave y se incuba a 42 ºC durante 12 a 15 horas. Para lograr una actividad total se realizan una a dos siembras en el mismo medio con una tasa de inoculación de 2 % y una incubaciòn a 42 ºC durante 4 horas. Como desventaja, los cultivos liofilizados presentan largas fases de latencia, siendo preciso la resiembra como mínimo dos veces para lograr cultivos líquidos activos, de allí que para la producción de los cultivos finales se utilice el sistema de Siembra a gran escala (sistema 1), ya que de otro modo se precisa una gran cantidad de cultivo deshidratado y largos periodos de incubación.

c) Cultivos congelados (no concentrados) El estárter es congelado en forma rápida a temperaturas de – 40 a – 45 ºC, pudiendo mantenerse así por 3 a 8 meses. Las unidades deben ser descongeladas y propagadas una vez previa a su utilización a nivel industrial. Como desventaja se puede señalar que las posibilidades de transporte a bajas temperaturas se ven limitadas desde el punto de vista económico.

d) Cultivos congelados o liofilizados concentrados de inoculación directa En el mercado existen cultivos congelados o liofilizados concentrados, fácilmente utilizables para la inoculación directa de los cultivos estarter definitvos (sistema 2) o alternativamente, para la inoculación directa de la leche en el caso de fábricas de yogurt a pequeña escala, En ambos casos, aunque el tiempo de producción puede verse incrementado en 1 o 2 horas, se consigue un importante ahorro, al eliminar la necesidad de personal especializado en el manejo de cultivos estarter.

Los cultivos congelados o liofilizados concentrados vienen en presentaciones listas para su uso que no necesitan activación previa y que son destinadas para volúmenes desde 10 hasta miles de litros. Además de contener

proporciones determinadas de Lactobacillus

delbrueckii ssp. bulgaricus y S. thermophilus se suplementan con otros microorganismos como Lactobacillus acidophilus.

Cuadro 1. Recuento de microorganismos viables en algunos cultivos estárter del yogurt

Tipo de cultivo o método de

Recuento de microorganismos

conservación

viables

Líquido

3 – 5 x 108/mL

Liofilizado

2 – 3 x 109/g

Concentrado liofilizado

4 – 6 x 1010/g

Congelado en nitrógeno líquido

2 x 109/mL

Fuente: Tamine & Robinson, 1991

2. Objetivos 2.1 Aislar e identificar

Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus

thermophilus. 2.2 Caracterizar y seleccionar Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus según la acidificación de la leche a 44 ºC. 2.3 Mantener Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus como cultivos de reserva de trabajo. 2.4 Obtener y mantener adecuadamente un cultivo estárter líquido (cultivo de reserva de trabajo) de yogurt.

3. Procedimiento 3.1 Aislamiento e identificación de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus a. Muestra Leche fresca, yogurt natural. b. Pretratamiento de la muestra Para el aislamiento de S. thermophilus calentar la leche a 60 ºC, durante 30 minutos.

c. Enriquecimiento 

Homogenizar la muestra de leche.



Sembrar 1 mL de cada una de las muestras en tubos con 9 mL de caldo MRS.



Incubar los tubos a 30 °C en una atmósfera de 5 a 8 % de CO 2 durante 24 horas (Jarra de Brewer).

d. Aislamiento  Tomar una asada de la muestra de leche enriquecida y sembrar mediante la

técnica de agotamiento y estría sobre agar Rogosa (placas de Petri).  Incubar en jarra de Brewer a 30 °C, por 24 horas.  Seleccionar las colonias brillantes, convexas, de 1 a 2 mm de diámetro

(Lactobacilos) y las colonias puntiformes (Estreptococos). Realizar tinción de Gram para observar la morfología bacteriana y reacción a la tinción de Gram.  Subcultivar

en viales conteniendo agar Rogosa inclinado, para obtener

cultivos puros y proceder a su identificación.

e. Identificación  Prueba de catalasa.  Crecimiento a 45 °C (caldo MRS).  Crecimiento a 10 ºC (caldo MRS).  Crecimiento en 2 y 4 % NaCl (caldo MRS- NaCl).  Acidez a partir de maltosa, sacarosa, manitol, glucosa, lactosa (tubos con

caldo MRS - carbohidrato).  Termoresistencia (caldo MRS).

Cuadro 2. Características diferenciales de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus Termófilos

Termófilo

bulgaricus helveticus

lactis

plantarum

casei

acidophilus

fermentii

+

(+)(-)

(+)(-

+

+

45 ºC

+

+

Mesófilos

Termófilos

) NaCl 2 %

-

-

+

+

+

+

+

60 ºC x

-

+

+

-

-

-

-

Maltosa

-

+

+

+

+

+

+

Sacarosa

-

-

+

+

+

+

-

Manitol

-

-

-

+

+

-

-

90´

Fuente: Holt et al. (1994) Cuadro 3. Características diferenciales de Streptococcus thermophilus S. termophilus

L. lactis ssp. lactis

45 ºC

+

(+)(-)

10 ºC

-

+

NaCl 2 %

(+)(-)

+

NaCl 4 %

-

+

Glucosa (acidez)

+

Lactosa (acidez)

+

Sacarosa (acidez)

+

Maltosa (acidez)

-

+

60 ºC x 30´

+

-

+

Fuente: Holt et al. (1994)

3.2 Caracterización y selección de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus según la acidificación de la leche a 44 ºC 

Obtener una suspensión de células en solución salina estéril de cada una de las bacterias aisladas e identificadas y cultivadas en agar Rogosa durante 24 horas. Estandarizar la concentración celular con el tubo 3 del Nefelómetro de Mc Farland. Tambièn se puede sembrar cada bacteria en caldo MRS, a 30 ºC por 24 horas



Sembrar 2 mL de cada suspensión celular o de caldo MRS cultivado, en un matraz conteniendo 98 mL de leche en polvo desnatada, reconstituida (10 – 12 % ESM),

esterilizada en autoclave a 15 libras durante 10 minutos e incubada a 30 ºC durante 24 horas para comprobar su esterilidad (leche tratada). 

Incubar los matraces a 44 °C durante 6 horas.



Determinar el porcentaje de acidez expresada en ácido láctico, utilizando el método Acidimétrico de Mann, a las 0 y 6 horas después de la inoculación. Tomar 10 mL del contenido de cada matraz, agregar tres gotas de una solución alcohólica de fenoltaleína 1 % y titular con NaOH 0,1N, hasta que aparezca un color ligeramente rosado persistente. Cada mililitro de NaOH 0,1N gastado en la titulación equivale a 0,009 de ácido láctico. Ejemplo de cálculo de porcentaje de acidez: Suponer que para titular 50 mL de caldo fermentado se gastaron 10 mL de NaOH 0,1N



Seleccionar las bacterias que presentan el mayor porcentaje de acidez titulable. S. thermophilus produce en la leche 0,7 a 0,8 % de ácido láctico. Algunas cepas llegan hasta 1,0 %. Por su parte, L. delbrueckii ssp. bulgaricus produce hasta 1,7 % de ácido láctico en leche.

3.3 Mantenimiento de L. delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus como cultivos de reserva de trabajo

Independientemente, obtener una suspensión de L. delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus y estandarizar su concentración celular con el tubo 3 del nefelómetro de Mc Farland. A continuación, tomar 2 mL de cada una de las suspensiones e inocularlos independientemente en matraces con 100 mL de leche tratada. Incubar a 42 ºC durante 4 horas. Mantener en refrigeración a 8 ºC y subcultivar semanalmente.

3.4 Obtención y mantenimiento de un cultivo iniciador líquido de yogurt (cultivo de reserva de trabajo) 

Sembrar 1,0 mL de Streptococcus thermophilus y 1,0 mL de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus (proporción 1:1), haciendo un total de 2 mL, en un matraz con 100 mL de leche tratada.



Incubar a 42 ºC durante 4 horas.



Determinar el porcentaje de acidez titulable (debe ser de 0,85 %).



Mantener en refrigeración y resembrar semanalmente.

1 mL

Lactobacilos

Calentar la leche a 60 °C durante 30 minutos

9 mL caldo MRS

Pretratamiento de la muestra para estreptococos 1 mL

30 ºC con 5 a 8 % de CO2, 24 horas

Muestra: Leche fresca

ENRIQUECIMIENTO

9 mL caldo MRS

Estreptococos

Figura 1. Pretratamiento y enriquecimiento de la muestra.

Lactobacilos

Lactobacilos

AISLAMIENTO

Incubar en jarra de Brewer a 30 °C por 24 horas

Tinción de Gram

Tomar una asada y sembrar en agar Rogosa.

Estreptococos

Estreptococos

Figura 2. Aislamiento de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus.

Subcultivar en Agar Rogosa

Lactobacilos

L. delbrueckii ssp. bulgaricus

IDENTIFICACIÓN

Resultados Maltosa

-

45 °C

-

NaCl 2 %

-

Maltosa - 45 °C – NaCl 2 %

Resultados Maltosa

-

45 °C

+

NaCl 4 %

-

Maltosa - 45 °C – NaCl 4 %

S. thermophilus

Estreptococos

Figura 3. Identificación de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus.

2 mL

5 mL

L. delbrueckii ssp. bulgaricus Suspensión

Tubo 3 del nefelómetro

98 mL de leche tratada: 44 °C por 6 horas

% de acidez: 3 gotas de fenolftaleína y titular con NaOH 0.1N

5 mL

S. thermophilus 2 mL

Figura 4. Caracterización y selección de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus.

2 mL

L. delbrueckii ssp. bulgaricus Suspensión

Tubo 3 del nefelómetro

98 mL de leche tratada: 42 °C por 4 horas

CRT L. delbrueckii ssp. bulgaricus

S. thermophilus 2 mL

CRT S. thermophilus

Figura 5. Obtención de cultivos de reserva de trabajo (CRT).

CRT L. delbrueckii ssp. bulgaricus

1 mL

Incubar a 42 °C por 4 horas

Cultivo iniciador líquido de yogurt

(CRT mixto) 1 mL CRT S. thermophilus

Figura 6. Obtención y mantenimiento de un cultivo iniciador líquido de yogurt (CRT mixto).

4. Anexos

4.1

Agar Rogosa (g/L)

Peptona

l0,0

Extracto de levadura

5,0

Glucosa

20,0

K H2 PO4

6,0

Citrato amónico

2,0

Tween 80*

1,0

Acetato de sodio**

15,0

Sulfato de manganeso*

0,120

Sulfato de hierro*

0,034

Sulfato de magnesio*

0,575

Agar agar

15,0

Agua destilada csp

1L

pH

5,5**

No autoclavar **Selectividad para Lactobacillus *Factores de crecimiento para Lactobacillus

4.2

Caldo MRS: Man, Rogosa, Sharpe (g/L)

Peptona

10,0

Estracto de levadura

5,0

Extracto de carne

10,0

Glucosa

20,0

K H2 PO4

2,0

Tween 80*

1,0

Citrato biamónico

2,0

Acetato de sodio*

5,0

Sulfato de manganeso*

0,05

Sulfato de magnesio*

0,02

Agua destilada csp

1000 mL

pH

6,5

*Factores de crecimiento para Lactobacillus

Cuadro 4. Características de algunas especies de Lactobacillus

Especie

ADN (%)

Peptidoglicano

Acido

Hábitat

láctico

L. delbrueckii ssp. delbrueckii

49-51

Lys –Asp

D

vegetales

L. delbrueckii ssp. bulgaricus

49-51

Lys –Asp

D

yogur, queso

L. delbrueckii ssp. lactis

49-51

Lys –Asp

D

queso

L. acidophilus

34-37

Lys –Asp

DL

boca, vagina

L. gasseri

33-35

Lys –Asp

DL

boca, vagina

L. helveticus

38-40

Lys –Asp

DL

queso

L. casei ssp. casei

45-47

Lys –Asp

L

rumen

L. casei ssp. pseudoplantarun

45-47

Lys –Asp

DL

queso, forraje

L. casei ssp. tolerans

45-47

Lys –Asp

L

boca, vagina

II L. casei ssp. rhamnousus

45-47

Lys –Asp

L

tracto intestinal

L. sake, Lb. curvatus

42-44

Lys –Asp

DL

vegetales

L. bavaricus

42-44

Lys –Asp

L

vegetales

L. plantarum

44-46

meso – DAP

DL

vegetales, queso

L. bifermentans

44-46

Lys –Asp

DL

queso

L. brevis

45-47

Lys –Asp

DL

vegetales, queso

L. buchneri

44-46

Lys –Asp

DL

vegetales, queso

L. kefir

40-42

Lys –Asp

DL

kefir

40-42

Lys –Asp

DL

tracto intestinal

L. fermentii

52-54

Orn – D Asp

DL

vegetales, queso

L. confusus

45-47

Lys –Ala

DL

vegetales

L. viridescens

45-47

Lys – Ala – Ser

DL

productos cárnicos

L. Sanfrancisco

36-38

Lys – Ala

DL

pan, panettone

I

III L. reuteri

Fuente: Leveau y Bouix (2000)

a.

Homofermentativos obligatorios  Fermentación de pentosas y gluconato (-).  Células largas, rectas,a menudo en empalizadas.  Hasta 18 g/litro ácido D (–) láctico .

b.

Homofermentativos facultativos  Fermentación de pentosas y gluconato (+) (heterofermentativa).  Células cortas a menudo ordenadas en filamentos.  Poco ácido láctico 3 a 13 g/L (DL ó L+).

c.

Heterofermentativos  Fermentación de pentosas: ácido láctico y acético.  Células cortas y separadas.  Débil producción ácido láctico 5 g/L (DL).

Cuadro 5. Bacterias àcido – lácticas y especies predominantes utilizadas en los productos lácteos fermentados. Productos Mantequilla fermentada

Especies utilizadas* L. lactis lactis, L. lactis cremoris, L. lactis lactis var. diacetylactis,

Tradicional

Leuconostoc cremoris

Recombinante

L. helveticus

Yogurt Tradicional

S. thermophilus, L. delbrueckii ssp. bulgaricus

Bioyogurt

S. thermophilus, L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. acidophilus

Biogarde

S. thermophilus, L. acidophilus, Bifidobacterium bifidum

Yakult

L. casei

Leche acidófila

L. lactis lactis, L. lactis cremoris, L. lactis lactis var. diacetylactis, Leuconostoc., L. acidophilus

Kéfir

L. lactis lactis, L. lactis cremoris, L. casei, L. caucasicus, Sach. kefir

Koumis

L. acidophilus, L. delbrueckii ssp. bulgaricus, levaduras

Leben

Lactococcus, Lactobacillus

Queso fresco Quark

L. lactis lactis, L. lactis cremoris

Cottage

L. lactis lactis, L. lactis cremoris

Camembert y Brie

L. lactis lactis, L. lactis cremoris, P. camemberii

Roquefort o azul

Cultivo láctico, P. roqueforii o caseicolum

Queso semicurado Muenster

L. lactis lactis, L. lactis cremoris

Stilton

L. lactis lactis, L. lactis cremoris, Leuconostoc ssp.

Queso madurado Cheddar

L. lactis lactis, L. lactis cremoris

Gouda/Edam

L. lactis lactis, L. lactis cremoris, L. lactis lactis var. diacetylactis, Leuconostoc ssp.

Emmenthal

S. thermophilus, L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. helveticus, Propionibacterium spp.

Parmesano

L. lactis lactis, L. lactis cremoris, S. thermophilus, L. delbrueckii ssp. bulgaricus

Mozzarella Fuente: Lee, 1996

L. lactis lactis, S. thermophilus, L. delbrueckii ssp. bulgaricus

5. Referencias bibliográficas

Fonseca, L. & Larrea, C. (2006). Efecto de la concentración de melaza e inóculo mixto de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus en la elaboración de ensilado de jurel (Trachurus picturatus murphyi). Tesis de Licenciatura. Lambayeque, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Leveau, J. & Bouix, M. (2000). Microbiología Industrial. Los microorganismos de interés industrial. España: Editorial Acribia, S.A. Marguet, E. & Vallejo, M. (2007). Curso Internacional:Biotecnología de Bacterias AcidoLácticas. Su importancia en procesos Industriales. Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 23 al 28 de abril de 2007, Lima Servicio Nacional de Adiestamiento en Trabjo Industrial, SENATI, (1999) Elaboración de yogurt Líquido, Batido y Aflanado. Lima: Artes Gráficas del IPACE. Tamine, A. & Robinson, R. (1991). Yogurt: Ciencia y Tecnología. España: Editorial Acribia S.A.

PRACTICA IX RECUPERACIÓN DE PRODUCTO EXTRACELULAR: Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides PRODUCTOR DE EXOPOLISACARIDO DEXTRANO 1.

Introducción El término recuperación (dowstream processing) es un término colectivo, para todos las

etapas que se requieren para recuperar (separar, extraer y purificar) productos útiles de un proceso industrial. En muchos casos la primera etapa del final de una fermentación, es la separación de los sólidos del líquido, que casi siempre es acuoso. El propio microorganismo puede ser el producto final deseado; sin embargo, en la mayor parte de los procesos a gran escala el producto deseado es un metabolito que está presente intracelularmente (ácidos nucleicos, vitaminas) o extracelularmente (aminoácidos, ácido cítrico, alcohol, antibióticos).

Para la separación de las partículas o separación de la biomasa celular y los componentes solubles del sobrenadante del cultivo existen varios métodos que incluyen la floculación, flotación, filtración y centrifugación. Si el metabolito que se va a aislar es intracelular, éste debe ser liberado de las células antes de proceder a la siguiente etapa. Para la desintegración de los microorganismos se pueden utilizar métodos químicos (uso de álcalis, solventes orgánicos, detergentes, cloruro de sodio), métodos biológicos (lisis enzimática) y métodos físicos (ultrasonido, congelación y descongelación, acción mecánica). Una vez que el metabolito ha sido separado de las células, la selección de etapas adicionales de purificación dependerá del producto deseado. Los métodos de aislamiento permiten separar y en su caso purificar el producto de interés e incluyen la cromatografía, extracción, cristalización, precipitación y desecación.

Leuconostoc mesenteroides es una bacteria Gram positiva, con un porcentaje de

G+C

en su ADN, que se encuentra entre 37 a 41 %. Son cocos dispuestos en pares o en cadenas más o menos cortas, heterofermentativos con producción de ácido D (-) láctico, etanol y CO2, son mesófilos con desarrollo óptimo a 28 °C. Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides se caracteriza

porque utiliza citrato

acetoína ni diacetilo.

y sintetiza el polisacárido

dextrano, pero no produce

El dextrano es una goma soluble en agua que se utiliza ampliamente como espesante, gelificante, agente de suspensión y coloide protector en distintos productos de consumo humano. Este polisacárido muestra características propias aplicables en productos alimenticios como estabilizador de jarabes azucarados, helados, dulces y clínicamente como expansor del plasma sanguíneo. Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides es una bacteria constituyente de la microbiota del jugo de la caña de azúcar que procede de la molienda en las empresas azucareras y es la subespecie de mayor interés industrial como productor de dextrano.

2. Objetivos 2.1 Aislar e identificar Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides. 2.2 Recuperar el dextrano producido. 2.3 Seleccionar

Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides según

el dextrano

producido. 2.4 Mantener adecuadamente Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides productor de dextrano.

3. Procedimiento 3.1 Aislamiento e identificación de Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides a. Muestra Jugo Crusher o jugo primario de la molienda de caña de azúcar (también se puede utilizar jugo mezclado y jugo residual).

b. Procesamiento de la muestra Realizar diluciones de la muestra en solución salina estéril hasta 10-2.

c. Aislamiento de Leuconostoc 

Tomar una alícuota de la dilución 10-2 y sembrarla mediante la técnica de agotamiento y estría sobre agar hipersacarosado (placas de Petri)



Incubar en aerobiosis a 30 °C durante 48 horas.



Seleccionar cuatro colonias puntiformes que al estar rodeadas de dextrano presentan tamaño grande (0,5 a 3,0 cm de diámetro), forma circular, bordes enteros, elevación convexa, consistencia gomosa, aspecto opaco, y son incoloras.



Cultivar las colonias seleccionadas hacia

una placa conteniendo agar

hipersacarosado modificado. Incubar en aerobiosis a 30 ºC por 24 horas.

d. Identificación de Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides Para identificar la especie y subespecie, utilizar las colonias desarrolladas sobre agar hipersacarosado modificado y tomar en cuenta la morfología y fisiología celular. Para determinar la morfología observar las colonias características sin dextrano: puntiformes, 0.5 a 1 mm de diámetro, bordes enteros, lisas, brillantes, incoloras. Realizar una tinción de Gram y reconocer la morfología celular: cocos Gram positivos, dispuestos en pares y en cadenas cortas sin formas esporuladas. Para determinar la fisiología realizar las pruebas de catalasa (negativo), la fermentación de carbohidratos (Glucosa: acidez +, gas +; Arabinosa (acidez +); Fructosa, sucrosa o trehalosa (acidez +) y formación de dextrano a partir de sacarosa (+). Subcultivar la especie identificada en dos viales, uno conteniendo agar hipersacarosado y otro con agar hipersacarosado modificado.

Cuadro 1. Características diferenciales de Leuconostoc mesenteroides

Leuconostoc mesenteroides ssp.

ssp.

ssp.

cremoris

dextranicum

mesenteroides

Arabinosa

-

-

+

Fructosa, sucrosa o trehalosa

-

+

+

Formación de Dextrano a partir de sucrosa

-

+

+

Fuente: Holt et al. (1994) 3.1 Selección de Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides según el

dextrano

producido a. Obtención de inóculo 

Tomar una asada

de las colonias de Leuconostoc mesenteroides ssp.

mesenteroides desasrrolladas en agar hipersacarosado y sembrarla mediante la técnica de agotamiento y estría sobre agar hipersacarosado (placas de Petri) 

Incubar a 30 °C durante 48 horas.



Seleccionar las tres colonias con dextrano que presenten el mayor diámetro.

b. Producción de dextrano 

Transferir

las tres colonias seleccionadas hacia un matraz de 250 mL

conteniendo 40 mL de caldo hipersacarosado. Para lograrlo, con

el asa

micológica cortar el disco de agar de aproximadamente 0,5 cm de diámetro que contiene integramente a cada una de las colonias seleccionadas. 

Incubar a 30 °C durante 72 horas para permitir la producción y acumulación de dextrano.

c. Recuperación del producto dextrano 

Verter el caldo hipersacarosado fermentado en un vaso de precipitación y adicionar lentamente 30 mL de metanol absoluto, agitando constantemente con movimientos rotatorios.



Dejar en reposo 5 horas o centrifugar a 2 000 rpm durante 5 minutos.



Filtrar el caldo fermentado y llevar el dextrano precipitado a estufa a

40 °C

durante 48 hasta alcanzar peso constante. 

Seleccionar la cepa de L. mesenteroides ssp. mesenteroides que alcanze el mayor peso en dextrano seco.

3.2 Mantenimiento de Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides productoras de dextrano Cultivar Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides en viales con agar hipersacarosado e hipersacarosado modificado. Incubar a refrigeración.

30 °C y mantener en

Diluciones hasta 10-2

De la dilución 10-2 sembrar por técnica de agotamiento y estría

10-1

Jugo crusher

10-2

Agar Hipersacarosado (AH)

30 ºC/48 horas en aerobiosis

Tinción de Gram

Subcultivar 30 ºC/48 horas en aerobiosis

Agar hipersacarosado modificado (AHM)

(AHM)

Seleccionar colonias que al estar rodeadas de dextrano presentan tamaño grande

(AH)

30ºC / 24 horas

Caldo Arabinosa

Arabinosa

+

L. mesenteroides ssp. mesenteroides

Figura 1. Aislamiento e identificación de Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides.

Subcultivar por agotamiento y estría 30 ºC/48 horas

L. mesenteroides

PRODUCCIÓN DE DEXTRANO

OBTENCIÓN DE INÓCULO

(AH)

Agar hipersacarosado

30 ºC/72 h

RECUPERACIÓN DEL DEXRRANO

Sembrar en 40 mL de caldo hipersacarosado

Cortar tres discos de agar con colonias

Agregar 30 mL de metanol absoluto

Filtrar

Reposar 5 horas

Llevar el dextrano precipitado a estufa a 40 ºC (peso constante)

Figura 2. Obtención de inóculo, producción y recuperación de dextrano.

Pesar el dextrano

Figura 3. Dextrano producido por diferentes cepas de L. mesenteroides ssp. mesenteroides.

4.

Anexo

4.1 Agar hipersacarosado (g/L) Extracto de levadura

5,0

Triptona

10,0

Citrato sódico

1,0

Glucosa

5,0

Gelatina

2,5

Sacarosa

100,0

Agar

15,0

Agua destilada csp

1L

pH

7

A 100 mL de agar hipersacarosado adicionar asépticamente 0,75 mL de una solución estéril al 1 % de azida de sodio.

4.2 Agar hipersacarosado modificado (g/L) Extracto de levadura

5,0

Triptona

10,0

Citrato sódico

1,0

Glucosa

5,0

Gelatina

2,5

Agar

15,0

Agua destilada csp

1L

pH

7

4.3 Caldo hipersacarosado (g/L) Extracto de levadura

5,0

Triptona

10,0

Citrato sódico

1,0

Glucosa

5,0

Gelatina

2,5

Sacarosa

100,0

Agua destilada csp

1L

pH

7

5. Referencias bibliográficas

Gastelo, E. & Ortiz, J. (2005). Niveles de contaminación por Leuconostoc mesenteroides y Leuconostoc dextranicum en el proceso de elaboración del azúcar de caña. Empresa agroindustrial Tumán, S.A. 2002. Tesis de Licenciatura. Lambayeque, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. León, E. & Soplapuco, C. (2007). Efecto de la concentración de sacarosa contenida en el extracto de vainas de algarrobo (Prosopis pallida) en la producción de exopolímeros por cepas nativas de Xanthomonas campestris y Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides. Tesis de Licenciatura. Lambayeque, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Velásquez, M. (2005). Leuconostoc mesenteroides productores de dextrano aisladas del jugo de caña de cooperativas de producción azucarera. Chiclayo. Enero, Marzo.2002. Tesis de Licenciatura. Lambayeque, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.

PRÁCTICA X BACTERIAS ACÉTICAS PRODUCTORAS DEL VINAGRE: ACETOBACTER Y GLUCONOBACTER 1. Introducción La actividad metabólica microbiana no tiene siempre como consecuencia la proliferación

celular. Si se considera la actividad metabólica de un cultivo microbiano a lo largo de toda la curva de crecimiento se diferencian aquellos procesos metabólicos asociados al crecimiento celular (metabolismo primario), de aquellos que tienen lugar en la fase estacionaria, una vez que ha cesado el crecimiento de la biomasa (metabolismo secundario). Como resultado, se producen diferentes tipos de compuestos, metabolitos primarios y secundarios. Los metabolitos primarios son moléculas de bajo peso molecular que intervienen bien como productos finales o intermediarios en las distintas rutas anabólicas y catabólicas y se forman durante la fase primaria del crecimiento microbiano. Los más importantes desde el punto de vista industrial son alcoholes (etanol), aminoácidos (ácido glutámico, lisina, treonina), ácidos orgánicos (láctico, acético, propiónico, succínico, fumárico, málico, tartárico, cítrico, glucorónico), polioles (glicerol, manitol), polisacáridos (xantano, dextrano), azúcares (fructosa, sorbosa) y vitaminas (riboflavina B2, cianocobalamina B12). Las bacterias acéticas son microorganismos bacilares o pleomórficos Gram negativos (Gram positivos en cultivos viejos) y estrictamente aerobios. Se distribuyen en los géneros Acetobacter y Gluconobacter según tengan o no capacidad de oxidar el acetato (presencia del ciclo de Krebs funcional). Los integrantes de ambos grupos pueden diferenciarse cultivándolos en agar sólido que contenga alcohol y una suspensión de cal. Como consecuencia de la formación de ácido acético por oxidación del alcohol primero se formará alrededor de las colonias de ambos grupos un halo claro en el agar que tiene aspecto opaco y turbio porque el ácido acético transforma la cal en acetato de cal soluble. En las del grupo Gluconobacter esta zona se mantiene y aumenta lentamente. Por el contrario en Acetobacter el acetato cálcico se precipita como CaCO3 que se degradará a CO2 y H2O con lo que la zona clara en torno a las colonias se enturbiará otra vez si se siguen incubando las placas. La característica metabólica que define al grupo de las bacterias acéticas es la capacidad de utilizar una gran diversidad de sustratos y la incapacidad de oxidarlos completamente. A pesar de tratarse de microorganismos aerobios, acumulan en el medio que crecen una gran cantidad de catabolitos diferentes. Son responsables de la “fermentación acética” a partir del etanol y también de la formación de ácido glucorónico a partir de la glucosa, sorbosa del sorbitol, dihidroxiacetona de la glicerina y 5 – cetogluconato de la glucosa. Las bacterias del ácido

acético, además de muchos alcoholes, oxidan ácidos orgánicos como el pirúvico y el láctico y algunos de ellos producen celulosa. Gluconobacter es siempre catalasa positivo, pero en las especies del género Acetobacter la prueba de catalasa puede dar una reacción débil e incluso nula (A. peroxydans). Las bacterias acéticas pueden aislarse fácilmente de vinagre y también del vino, cerveza o de zumos de frutas agriadas. A su vez, el género Acetobacter inicialmente fue dividido en tres grupos: peroxydans (A. peroxydans y A. paradoxum); oxydans levanicux,

A. ascendens

y

(A. pasteurianus,

A. rauceus) y mesoxydans (A. aceti, A. xylinum

A.

y A.

mesoxydans). Actualmente se aceptan solo tres especies: A. aceti, A. pasteurianus y A. peroxydans, las demás serían subespecies.

2. Objetivos 2.1 Aislar e identificar bacterias acéticas. 2.2 Seleccionar bacterias acéticas según su producción de acidez. 2.3 Mantener adecuadamente bacterias acéticas productoras de acidez. 3. Procedimiento

3.1 Aislamiento e identificación de bacterias acéticas

Muestra Frutas ácidas: limón, naranja, lima, uva. Enriquecimiento de la muestra 

Depositar 20 mL de cerveza en frascos de boca ancha.



Sumergir por 15 minutos y en frascos separados uva, manzana, limón y naranja.



Retirar los frutos.



Cubrir los frascos con gasa o malla para evitar la entrada de insectos.



Mantener a temperatura ambiente hasta por 4 días.



Observar el crecimiento bacteriano en forma de un velo o película blanquecina sobre la superficie.



Realizar una tinción de Gram para determinar la presencia de bacilos cortos Gram negativos.

Aislamiento 

Tomar una pequeña porción de la

película bacteriana desarrollada en las

muestras enriquecidas y sembrarla mediante la técnica de agotamiento y estría sobre agar Lee. 

Incubar en aerobiosis a 30 °C durante 24 horas.



Seleccionar las colonias amarillas.



Realizar tinción de Gram.



Repicar a viales conteniendo Agar Manitol o un frasco con 25 mL de cerveza.

Identificación 

Catalasa: Positiva para Acetobacter y Gluconobacter.



Crecimiento a pH 4.5: Positivo en caldo levadura glucosa pH 4,5.



Oxidación del etanol a CO2: Cultivar en tubos conteniendo Agar Lee. A las 24 horas el medio de cultivo las colonias que produjeron ácido acético se observarán de color amarillo. A las 48 o 72 horas el medio de cultivo y las colonias que oxidan el etanol a CO2 retornan al color inicial del medio de cultivo.

3.2 Selección de bacterias acéticas según su producción de acidez Tomar 2,5 mL de una suspensión en solución salina de cada una de las bacterias acéticas (agar manitol) o 2,5 mL de cerveza culivada y sembarlos en matraces conteniendo 50 mL de cerveza. Incubar a 30 °C durante 48 horas. Determinar la acidez titulable a través del método acidimétrico de Mann (Factor para ácido acético = 0, 006005) Realizar los cálculos correspondientes.

Cuadro 1.

Características diferenciales de los géneros Gluconobacter, Acetobacter y Pseudomonas

Características

Gluconobacter Polar o

Flagelación Crecimiento a pH 4.5

ninguna +

Oxidación de: Etanol a ácido acético a CO2

+ (M)

Ácido acético a CO2

-

Lactato a CO2

-

Glucosa a gluconato

+

Aminoácidos por células en reposo Ciclo de Krebs

-

Producción de 5 – cetogluconato

-

Cetogénesis

+

Quinonas Q10

+

Quinonas Q9

+

Hidrólisis de:

-

Lactosa y almidón Gelatina Pigmentos verdosos y/o fluorescentes

-/D -

Acetobacter Peritrica o ninguna +

+ (F) + + d

+ + d d -

Pseudomonas Polar

-

d + d

+ + -

+

-

d d d

M: marcado, F: fuerte, d: variable Fuente: Parés y Juárez, 1997

3.3 Mantenimiento de bacterias acéticas Cultivar las bacterias acéticas en tubos tapa rosca con medio Estándar GYC, incubar a 30 ºC y mantener en refrigeración. Subcultivar mensualmente. Las bacterias acéticas también se pueden mantener en cerveza, renovándola semanalmente.

Frutas ácidas

20 mL de cerveza

Frutas ácidas en cerveza por 15 minutos

Retirar los frutos

Cubrir los frascos con gasa para evitar la entrada de insectos

Mantener a temperatura ambiente hasta por 4 días

Observar crecimiento bacteriano en forma de película superficial

Figura 1. Enriquecimiento de la muestra para aislamiento de bacterias acéticas.

Tinción de Gram: bacilos cortos Gram negativos

Alícuota de la película

Aerobiosis a 30 ºC/24 horas Muestra enriquecida

Agar Lee

Cultivar

Gluconobacter

Incubar a 30 ºC / 48 horas

Tinción de Gram

Incubar a 30ºC/ 24 horas

Agar Lee Bacilos Gram negativos Acetobacter

Figura 2. Aislamiento de bacterias acéticas.

Sembrar 2,5 mL de la suspensión

Incubar en aerobiosis a 30 ºC/48 horas

Determinar la acidez

50 mL de cerveza Suspensión de bacterias acéticas en cerveza Sembrar 2,5 mL de la suspensión

Mantenimiento 50 mL de cerveza

Renovar cerveza semanalmente

Figura 3. Selección y mantenimiento de bacterias acéticas según su producción de acidez. 4. Anexo 4.1 Medio de enriquecimiento: Cerveza Colocar asépticamente en frascos de boca ancha 20 mL de cerveza.

4.2 Medio Lee (g/L) CaCO3

2,0

KH2PO4

0,1

K2HPO4

0,2

Peptona

10,0

Casaaminoácidos

1,0

Extracto de levadura

10,0

Glucosa

10,0

Agar

agar

16,0

Agua destilada csp

1L

pH

7,0

Indicador

Azul de bromotimol

Disolver y esterilizar a 121 °C x 15 minutos. Antes de su uso incorporar 5 mL de etanol.

4.3 Medio estándar, GYC (g/L) Extracto de malta

3,0

Extracto de levadura

10,0

D – glucosa

50,0 g

Agar

25,0 g

agar

Agua csp

1L

Mantener en frascos con tapa rosca

4.4 Medio agar manitol (g/L) Extracto de levadura

5,0

Peptona

3,0

Manitol

25,0

Agar agar

15,0

H2O csp

1L

pH

7,0

Mantener en frascos con tapa rosca

5. Referencias bibliográficas Alva, R. & Romero, J. (2001). Obtención de vino y vinagre a partir de la banana. Tesis Ingeniero Químico .Lambayeque, Perú, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Castillo, M. & Chavarri, N. (2004).Optimización de la concentración de inóculo, sustrato y tiempo de incubación en la obtención de vinagre utilizando Acetobacter aceti CECT 298T a partir de licor de maíz en biorreactor Airlift. Tesis de Licenciatura. Lambayeque, Perú. Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Parés, R. & Juárez, A. (1997). Bioquímica de los Microorganismos. México: Editorial Reverté.

PRÁCTICA XI

ACTINOMICETOS PRODUCTORES DE ANTIBIÓTICOS 1.

Introducción Los metabolitos secundarios como los antibióticos son moléculas sintetizadas por

determinados microorganismos normalmente en una fase tardía del ciclo de crecimiento. Son compuestos que no son necesarios para la biosíntesis celular, no tienen por lo tanto un papel directo en el metabolismo energético y, en consecuencia no se conoce con claridad la razón de su existencia. La biosíntesis de los metabolitos secundarios está estrechamente relacionada con el metabolismo primario de las células que los producen, ya que usualmente sus precursores son metabolitos primarios normales o modificados como ácidos orgánicos, unidades de isopropano, aminoácidos alifáticos y aromáticos, bases purinas o pirimídicas.

De todos los productos tradicionales obtenidos por fermentación los más importantes para la salud humana son los metabolitos secundarios entre los que se incluyen, además de los antibióticos, ciertas toxinas de hongos, alcaloides, insecticidas, factores de crecimiento vegetal (giberelinas), pigmentos y tensioactivos.

Los actinomicetos comprenden bacterias en su mayoría aerobias y algunas anaerobias encontradas en animales y el hombre. Generalmente son Gram positivos, presentan una diversidad morfológica considerable desde formas bacilares hasta formas filamentosas ramificadas a modo de esporulación compleja con un pocentaje de G + C en su ADN superior al 55 %. Su crecimiento es lento y las colonias desarrollan sobre la superficie de los medios sólidos con una consistencia firme y adheridas firmemente al sustrato solidificado. Están constituidas por micelio vegetativo (inmerso en el medio de cultivo sólido) y micelio aéreo en cuyos extremos se encuentran las conidias (esporas asexuadas) que brindan a la colonia su pigmentación y su apariecia polvorienta; sin embargo algunos actinomicetos sólo producen micelio vegetativo.

Los actinomicetos son microorganismos muy ubicuos y aunque las primeras cepas fueron aisladas de fuentes humanas y animales, el suelo constituye su reservorio más rico y a partir del cual estos microorganismos pueden invadir numerosos biotopos.

2.

Objetivos 2.1 Aislar actinomicetos de suelo agrícola. 2.2 Seleccionar actinomicetos productores de antibióticos. 2.3 Identificar actinomicetos productores de antibióticos. 2.4 Mantener adecuadamente actinomicetos productores de antibióticos.

3.

Procedimiento

3.1 Aislamiento de actinomicetos de suelo

a.

Muestra 100 g de suelo agrícola

b.

Tratamiento de la muestra 

Si la muestra de suelo se encuentra húmeda, dejarla secar bajo sombra.A continuación, triturarla con rodillo y posteriormente tamizarla (malla de 1,6 mm )



Realizar diluciones de la muestra en solución salina

hasta 10-2. Para la

primera dilución tomar una submuestra de 25 g del tamizado y depositarlos en un matraz conteniendo 225 mL de solución salina estéril

(10-1). Agitar

vigorosamente durante 20 minutos. Para la dilución 10-2 tomar 1 mL de la dilución anterior y trasvasar a un tubo con 9 mL de solución salina estéril. c.

Aislamiento 

Tomar una alícuota de la dilución 10-2 y sembrarla mediante la técnica de agotamiento y estría sobre agar Jensen al que se le ha incorporado Nistatina más Ciclohexamida (50 µg/ mL.) para inhibir el desarrollo de mohos y y Polimixina B (5µg/ mL) y Penicilina (1µg/ mL) para limitar el crecimiento de otras bacterias.



Incubar en aerobiosis a temperatura ambiente (30 °C) hasta por 5 días.



Seleccionar las colonias características de actinomicetos: pequeñas, adheridas fuertemente al sustrato, compactas, secas, pulverulentas, mayormente pigmentadas, con olor a tierra húmeda.



Realizar tinción de Gram de cada una de las colonias. Observar la morfología celular, disposición de conidias, esporas y presencia o ausencia de fragmentación en el micelio.



Cultivar en viales conteniendo agar Jensen inclinado.

3.2 Selección de actinomicetos productores de antibióticos (Test de antibiosis) 

Sembrar cada uno de los actinomicetos, agotando completamente sobre la tercera parte de una placa de Petri con agar Waksman e incubar en aerobiosis, a 30 °C durante 4 días.



Sembrar por estría y en forma perpendicular al actinomiceto (a 2 mm) cada una de las cinco

bacterias prueba: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Bacillus

anthracis, Staphylococcus aureus y B. subtilis. Incubar a 37 °C durante 24 horas. 

Observar y medir la zona de inhibición del crecimiento de las bacterias prueba.

3.3 Identificación morfológica de actinomicetos productores de antibióticos Tomar en cuenta las características macroscópicas de las colonias y microscópicas de las células. En cuanto a las colonias la forma es circular, tamaño pequeño, mayormente pigmentadas, de textura coriácea, fuertemente adheridas al sustrato, compactas, de aspecto polvoriento y con olor a tierra húmeda. Para determinar las caracteristicas microscópicas de las células realizar el microcultivo de cada una de los actinomicetos e investigar la presencia de conidias y disposición (aisladas, en pares, cadenas cortas, cadenas largas, espirales, rectas) o la presencia de esporangios (con esporas móviles o no móviles). Realizar una tinción de Gram y observar células Gram positivas y formación de filamentos ramificados con o sin fragmentación y presencia de conidias con diferente disposición.

Microcultivo (Método de Riddell) Utilizar una cámara húmeda que consiste en una placa de Petri con un triángulo de vidrio como soporte de una lámina portaobjetos y un algodón ligeramente humedecido. Colocar en la parte central de la lámina portaobjetos un pequeño bloque cuadrado de agar Jensen y sembrar cada actinomiceto en la periferia del agar. Posteriormente cubrir el bloque de agar con una laminilla cubre objetos estéril e incubar durante 3 días a temperatura ambiente.

3.4 Mantenimiento de actinomicetos productores de antibióticos 

Sembrar cada uno de los actinomicetos productores de antibióticos en caldo glicerinado 20 %.



Incubar a 30 °C durante 3 días.



Mantener en refrigeración.

Tamizar la muestra

Muestra: 100 g de suelo agrícola

Pesar 25 g de la muestra

Sembrar por agotamiento y estría

Agar Jensen

Dilución 10-2

Dilución 10-1

Incubar a 30 ºC/hasta por 5 días Cultivar

Agar Jensen

Seleccionar colonia de actinomiceto

Tinción de Gram

Figura 1. Aislamiento de actinomicetos de suelos agrícolas.

30 ºC/ 4 días

Cultivo puro de actinomiceto

Sembrar el actinomiceto agotando completamente sobre la tercera parte de la placa con Agar Waksman

Sembrar por estría y en forma perpendicular al actinomiceto cada una de las cinco bacterias prueba

37 ºC / 24horas

Bacter ias pr ueba 1) Escherichia coli 2) Klebsiella pneumoniae 3) Bacillus anthracis 4) Staphylococcus aureus 5) Bacillus subtilis

Observar y medir la zona de inhibición del crecimiento de las bacterias prueba

Figura 2. Selección de actinomicetos productores de antibióticos (Test de antibiosis).

4.

Anexo

4.1 Agar Jensen (g/L) Sacarosa

2,0

Caseína hidrolizada

0,25

Sulfato de magnesio

0,20

Cloruro férrico

0,10

Agar

agar

20,0

Agua destilada csp

1L

pH

7,0

4.2 Medio Waksman para la producción de antibióticos (g/L) Extracto de carne

5,0

Peptona

5,0

Cloruro de sodio

5,0

Glucosa

10,0

Agar

agar

15,0

Agua destilada csp

1L

pH

7,0

4.3 Caldo glicerinado Cloruro de sodio

0,5

Peptona

1,0

Glicerina

20 mL

Agua destilada

80 mL

pH

7,0

5.

Referencias bibliográficas

Hernández, A. & Mondragón, A. (2002). Actinomicetos aislados de suelos agrícolas para el control de Epinotia aporema “barrenador de brotes” en Medicago sativa “alfalfa” Ferreñafe, Lambayeque, Marzo – diciembre.2001. Tesis de Licenciatura .Lambayeque, Perú, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Huaman, S. & Lupuche, J. (2002). Evaluación de la actividad insecticida de los actinomicetos aislados de suelos agrícolas del distrito San José, frente a Spodoptera frugiperda “cogollero del maíz”. Lambayeque, Febrero-Octubre, 2001. Tesis de Licenciatura. Lambayeque, Perú. Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Sandoval, M. &

Vásquez, J. (2001).

Actinomicetos mesofílicos aerobios con actividad

antimicrobiana, aislados de suelos degradados en la provincia de Lambayeque, Febrero- setiembre, 2000.

Tesis

Licenciatura .Lambayeque, Perú, Universidad

Nacional Pedro Ruiz Gallo. Sialer, C. & Horna, D. (2002). Efecto de sustancias secretadas por Streptomyces spp. aislados de “hormigas” (tribu Attini) sobre dermatofitos. Tesis de Licenciatura. Lambayeque, Perú. Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.

PRÁCTICA XII

Aspergillus niger PRODUCTOR DE ÁCIDO CÍTRICO

1. Introducción

Los ácidos orgánicos producidos por microorganismos se obtienen en fermentaciones clásicas o anaerobias (ácido láctico, ácido propiónico) y en las fermentaciones oxidativas u oxidaciones incompletas (ácido acético, ácido glucónico, ácido fumárico, ácido cítrico, ácido glutámico, cetoácidos, oxoácidos).

Los microorganismos productores de ácidos pueden ser detectados cuando son cultivados en medio con agar y carbonato de calcio. Los carbonatos insolubles como el CaCO3 finamente pulverizado son muy útiles, porque debido a su insolubilidad no crean en el medio de cultivo condiciones fuertemente alcalinas, especialmente si se usan con otros amortiguadores; sin embargo, cuando el pH disminuye

por debajo de 7,0 el carbonato se descompone con

desprendimiento de CO2. Las colonias microbianas productoras de ácidos disuelven la caliza precipitada o insoluble observándose fácilmente zonas claras sobre el fondo opaco del medio de cultivo.

Muchos ácidos se obtienen a escala industrial en procesos con hongos. La ventaja de su utilización se basa sobre todo en la fácil recuperación de los organismos a partir del caldo de cultivo. Entre los principales ácidos producidos por hongos se encuentran el láctico (Rhizopus), fumárico (Mucor, Cunninghamella, Circinella, Rhizopus), glucónico y cítrico (Aspergillus, Penicillium).

El ácido cítrico se produce en su totalidad por fermentación. El descubrimiento de la capacidad de algunos hongos filamentosos de producir ácido cítrico se remonta a 1893, gracias a los estudios de Wehmer. En 1917 Currie demostró que especies de Aspergillus niger acumulaban ácido cítrico a la par con ácido oxálico. Posteriormente se definieron las condiciones que reducían la producción del ácido oxálico contaminante. A partir de entonces, variedades de Aspergillus niger han dominado la producción industrial, fundamentalmente porque su fisiología es más conocida que la de otros hongos y porque utilizan materias primas de bajo costo como melazas de caña.

2. Objetivos

2.1 Aislar e identificar Aspergillus niger. 2.2 Detectar y seleccionar cepas de A. niger productores de ácidos orgánicos. 2.3 Mantener adecuadamente A. niger productores de ácidos orgánicos.

3. Procedimiento

3.1 Aislamiento e identificación de A. niger

1- Muestra 100 g de suelo agrícola 2- Procesamiento de la muestra 

Tamizar la muestra de suelo (tamiz con malla de 1,6 mm) y del material obtenido tomar 10 g y llevarlos a un matraz con 90 mL de solución salina estéril (10-1).



Homogenizar durante 20 minutos.



Realizar una dilución en solución salina hasta 10-2.

3- Aislamiento e identificación de Aspergillus niger 

Tomar un alícuota de la dilución 10-2 y y sembrarla por agotamiento y estría sobre agar Sabouraud Dextrosa (placas de Petri)



Incubar las placas a temperatura ambiente (30 ºC) hasta por 5 días.



Seleccionar las colonias características de Aspergillus niger, tomando en cuenta las características macroscópicas y microscópicas.



Repicar las colonias seleccionadas a tubos conteniendo agar Sabouraud Dextrosa inclinado.

4- Características macroscópicas de la colonia de Aspergillus niger La colonia es inicialmente blanca o amarilla y rápidamente desarrolla un efecto de pimienta negra sobre la superficie a medida que se forman las conidias (que pueden volverse densas) de tal manera que la colonia se vuelve negra con el reverso de color crema. El aspecto de la colonia es pulvurulenta y uniforme.

5- Características microscópicas de la colonia de Aspergillus niger  Hifas vegetativas: Hifas tabicadas que forman micelio filamentoso irregular, ramificado, tabicado y de pared gruesa.

 Conidióforo (Esporóforo de sostén): Hifas fértiles que emergen o parten de una célula alargada del micelio vegetativo denominada célula pie (foot cell) y terminan en una porción ensanchada o vesícula. Son incoloras, o amarillo pardo, lisas, no tabicadas y de paredes gruesas.  Vesícula o cabeza esporifera: Vesícula esférica de la cual emergen estructuras de forma de botella denominados fialides, cuyos extremos son puntos de crecimiento, de donde las conidas

continuamente se están formando. La

conidia más joven es la que está más cerca de la fiálide y la más vieja es la que está más lejos, al final de la cadena (Basipetalmente). Según algunos autores las fialides se presentan en dos series: primarias y secundarias. Según otros autores las estructuras que salen directamente de la vesícula se denominan métulas y están adosadas en paquetes cubriendo la vesícula (forma radial) y sobre ellos están las fialides que son más pequeñas, con distribución más uniforme y es a partir de ellas de donde emergen las conidias.  Conidias: Se ubican sobre las fiálides formando cadenas (catenuladas) y al madurar presentan una pared gruesa y rugosa debido a una sustancia negra (aspergilina) que se deposita sobre su superficie y por tanto oscurecen la superficie de la vesícula. 3.2

Detección y selección de A. niger productor de ácidos orgánicos b. Detección (screening primario) 

Tomar un pequeño fragmento de colonia de cada una de las cepas de A. niger y colocarlo en el centro de placas de Petri servidas con agar carbonato de calcio.



Incubar a temperatura ambiente (30 ºC) por 4 días. A continuación mantener las placas de Petri en refrigeración por 48 horas.



Reconocer la producción de acidez por la formación de un halo traslúcido alrededor y por debajo de la colonia.

c. Selección (screening secundario) 

Sembrar un fragmento de 1 cm de la colonia de A. niger productora de acidez en un matraz con 50 mL de medio de fermentación.



Determinar la acidez inicial (método acidimétrico de Mann).



Incubar a températura ambiente (30 °C) durante 5 días.



Determinar la acidez final (método acidimétrico de Mann).



Factor para ácido cítrico: 0,007005

Cálculo de acidez

Volumen titulado Gasto de NaoH

: 5 mL : 7,5 mL

Factor para ácido cítrico

: 0,007005

% acidez

:

acidez

: 1,05075 % de acidez expresada como ácido cítrico

3.3 Mantenimiento de A. niger productor de ácidos orgánicos Sembrar A. niger productor de acidez

en tubos conteniendo agar papa dextrosa

(PDA). Incubar a 30° durante 5 días. Mantener en refrigeración.

Pesar 10 g de la muestra

Tamizar la muestra

Muestra: 100 g de suelo agrícola

Sembrar por agotamiento y estría

Agar Sabouraud Dextrosa

Dilución 10-2

Agregar 10 g de la muestra en 90 mL de SSE (10-1)

Incubar a 30 ºC/ hasta por 5 días

Cultivar

Agar Sabouraud Dextrosa

Figura 1. Aislamiento e identificación de Aspergillus niger.

Aspergillus niger

Tomar un fragmento

30 ºC / 4 días y luego refrigerar

Aspergillus niger Halo alrededor de la colonia

Agar Carbonato de Calcio

Figura 2. Detección y selección de Aspergillus niger productor de ácidos orgánicos.

Incubar a 30 ºC por 5 dias

Aspergillus niger

50 mL de medio de fermentación

Tomar 5 mL del cultivo y titular con NaOH 0.1N

Figura 3. Detección y selección de Aspergillus niger productor de ácidos orgánicos.

Subcultivar en agar papa Dextrosa

Aspergillus niger

Incubar a 30 ºC hasta por 5 días

Mantener en refrigeración

Figura 4. Mantenimiento de Aspergillus niger productor de ácidos orgánicos.

4. Anexo

4.1 Agar Papa Dextrosa (g/L) Infusión de papa

500 mL

Dextrosa

20,0

Agar

20,0

agar

H2O destilada csp

1L

pH

5,6

Para obtener la infusión de papa hervir 200 g de papa pelada y picada en 500 mL. de agua destilada. Después de 15 minutos completar a 500 mL con agua destilada, enfriar, filtrar y completar nuevamente.

4.2 Agar Sabouraud Dextrosa (g/L) Dextrosa

20,0

Peptona

10,0

Agar agar

20 ,0

H2O destilada csp

1L

pH

5,6

Para inhibir el desarrollo bacteriano agregar cloramfenicol al 0,05 % (disolver una cápsula de cloramfenicol de 250 mg en 10 mL de metanol). Agregar 2 mL del antibiótico en 1 L de agar Sabouraud Dextrosa estéril y enfriado a a 45 – 50 °C.

4.3 Medio agar carbonato de calcio (g/L) Extracto de levadura NaCl

10,0 5,0

Glucosa

30,0

Peptona

5,0

Na2HPO4.12H2O

1,0

Agar

15,0

Carbonato de calcio (CaCO3)

10,0

H2O destilada csp

1L

pH

6,5

4.4 Caldo sacarosado para producción de ácidos orgánicos: Medio de fermentación (g/L) Sacarosa

190 ,0

MgSO4.7H2O

0,3

(NH4)NO3

2,3

CaCO3

5,0

KH2PO4

1,0

H2O destilada csp

1L

pH

3 (ajustar con HCl 2M)

5. Referencias bibliográficas

Aldana, W. & Espinoza, M. (2001). Estudio paramétrico de la producción de ácido cítrico a partir de Ipomoea batata (camote) variedad morado con Aspergillus. Tesis Ingeniero Químico .Lambayeque, Perú, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Claudio, E. &

Zegarra, L. (1998). Aislamiento y selección de mohos productores de ácido

cítrico a partir de sacarosa. Tesis de Licenciatura. Lambayeque, Perú. Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Felipe, G. & Minchán, H. (2000). Optimización de la concentración de sustrato, pH y tiempo de incubación en la producción de ácido cítrico por A. niger en cultivo sumergido. Tesis de Licenciatura. Lambayeque, Perú. Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Torres, P. & Uriarte, M. (2002). Efectos del metanol en la producción de ácido cítrico por Aspergillus niger en un medio de glucosa. Tesis Ingeniero Químico. Lambayeque, Perú. Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Parés, R. & Juárez, A. Reverté.

(1997). Bioquímica de los Microorganismos. México: Editorial

PRÁCTICA XIII SELECCIÓN DE UNA CEPA ENOLÓGICA DE Saccharomyces cerevisiae I. Introducción En el mercado existen levaduras enológicas como Saccharomyces cerevisiae Montrachet y Pasteur Champagne; sin embargo, se prefiere el uso de cepas levaduriformes que procedan de la zona vinícola donde se van a utilizar. Estas levaduras nativas o levaduras locales seleccionadas, están adaptadas a las condiciones climáticas de la zona, a la materia prima, es decir al mosto a fermentar y son responsables, al menos parcialmente de las características únicas de los vinos obtenidos. 1.1 Aislamiento de levaduras El primer paso para seleccionar una levadura nativa, es conocer la biota autóctona a través de un estudio ecológico en el que se realizan aislamientos de fermentaciones espontáneas en la zona a estudiar, durante varias campañas. De esta manera, además de tener un número mayor de cepas, el aislamiento de una misma cepa durante años consecutivos puede ser un buen indicador de que se trata de una cepa bien adaptada a las condiciones de la zona. 1.2 Identificación de cepas de levaduras La primera diferenciación que se debe realizar a las colonias de levaduras aisladas es a nivel de especie, mediante medios selectivos, concretamente el medio lisina en donde Saccharomyces cerevisiae no crece (porque la única fuente de nitrógeno es la lisina), pero si desarrollan otras levaduras. La segunda diferenciación, para la cual se eligen 40 a 50 colonias de S. cerevisiae aleatoriamente, permite la identificación a nivel de cepa utilizando técnicas de biología molecular (análisis de los perfiles de restricción del ADN mitocondrial: RFLPs). 1.3 Proceso de selección en laboratorio Los criterios utilizados para la selección de cepas de S. cerevisiae consistían en una sucesión de pruebas para determinar la ausencia o presencia de ciertos caracteres importantes en cepas vínicas como presencia de factor killer, tiempo de fermentación, capacidad fermentativa en mostos con elevada concentración de azúcar, formación de sulfuro de hidrógeno; sin embargo, el ir probando cada una de las cepas en fermentaciones individuales y caracterizar todos los productos finales es una labor muy tediosa, por lo que es preferible realizar la selección de cepas en fermentaciones masivas por competencia. Se elige un número definido de cepas de S. cerevisiae, se inoculan en un mismo fermentador y se hace un seguimiento de su crecimiento durante la fermentación. La población inicial de las cepas debe ser la misma para que todas tengan las mismas posibilidades de imposición (1 x 105 UFC/ mL). El número de cepas a analizar dependerá de las cepas aisladas, pero no sería aconsejable utilizar un número superior a 20 (población final de 2 x 107 UFC / mL).Si se tiene un número superior a 20 cepas, es recomendable descartar algunas. Un criterio a seguir puede ser tomar como referencia las fermentaciones espontáneas y elegir aquellas cepas que hayan tenido una presencia relevante a lo largo de éstas. De hecho, se pueden dar casos de cepas, que se hayan aislado en porcentajes muy bajos en un momento determinado de la fermentación y en un solo año y que por tanto, no puedan considerarse levaduras representativas de la zona, ya que probablemente se trate de cepas poco resistentes al etanol y a las condiciones existentes, y que por tanto, no se impondrían en un fermentación competitiva.

Las fermentaciones se hacen a escala de laboratorio, es decir, en pequeños fermentadores (botellas de 500 mL de capacidad). Es importante intentar simular las condiciones de fermentación que posteriormente se utilizarán en bodega. Para ello, lo ideal es utilizar mosto concentrado diluido (450 mL con una concentración final de azúcar de 200 g/L, una acidez de 6 y un pH inicial de 3.3), ya que tiene todos los nutrientes necesarios para una correcta fermentación. Además, al utilizar este mosto concentrado se puede regular la concentración de azúcares, lo cual ya supone una característica adicional de selección al poderse fijar unas condiciones más o menos restrictivas de fermentación (por ejemplo, altos contenidos en azúcar condicionarán altos grados alcohólicos). Aparte de la propia competencia entre cepas, se puede aplicar algún otro criterio de selección que pueda resultar interesante y así acelerar el proceso de selección. Este criterio dependerá del tipo de fermentación al que se dirija la selección (Cuadro 9). El seguimiento de las cepas se realiza por RFLPs del ADN mitocondrial seleccionando las cepas que se imponen en la fermentación.

Cuadro 1. Características deseables y no deseables en la selección de una cepa enológica de Saccharomyces cerevisiae. Características deseables  Alta tolerancia al etanol  Total degradación de azúcares fermentables  Resistencia al SO2  Capacidad fermentativa a bajas temperaturas  Máxima reducción de fase de latencia  Degradación de ácido málico  Capacidad fermentativa a altas presiones  Producción de glicerol  Producción de B – glucosidasa  Fenotipo Killer Fuente: Torija, 2002

      

Características no deseables Producción de SO2 Producción de H2S Producción de acidez volátil Producción de acetaldehído y piruvato Producción de espuma Formación de precursores del carbamato de etilo Producción de polifenol oxidasas

1.4 Fermentaciones industriales en laboratorio (bodega experimental) Cada una de las cepas de S. cerevisiae seleccionadas se inocula de forma individual en un fermentador con mosto concentrado diluido y se monitorea durante la fermentación. Aunque parezca de poca importancia, se trata de un paso básico, ya que el hecho de una cepa se haya impuesto en una fermentación masiva no garantiza que pueda realizar una fermentación completa por ella sola. Además, se deben analizar las características organolépticas del vino obtenido con cada cepa, análisis que hasta ahora no se había podido hacer porque al ser un conjunto de cepas no se podía saber cual era la que proporcionaba las diferentes características, favorables o desfavorables. Después de las pruebas en el laboratorio que permiten determinar qué cepas presentan buena capacidad fermentativa (estudio de la velocidad y duración de la fermentación), resistencia a elevadas concentraciones de azúcares (debido a las características particulares de la zona de selección), resistencia a elevadas concentraciones de etanol, producción de glicerol, ésteres, alcoholes superiores, baja acidez volátil y resistencia a SO2, se realiza una cata y se eligen las cepas que además de fermentar correctamente, tienen el mejor perfil cromático, aromático y gustativo.

1.5 Fermentaciones industriales (bodega industrial) Las levaduras elegidas se inoculan de forma independiente en un depósito a escala industrial. Se hace el seguimiento de la fermentación, controlando la imposición de la cepa estudiada sobre la biota autóctona de la zona mediante RFLPs del ADN mitocondrial. En caso de imposición, se realiza una analítica completa de los vinos obtenidos, tal y como se ha explicado en las fermentaciones en laboratorio, con la posterior cata realizada por especialistas. Las cepas que cumplan todos éstos requisitos estarán aptas para ser seleccionadas. Si se tienen varias, en la elección de una u otra se deberán valorar, principalmente, las características organolépticas, es decir, aquellas que proporcionen un vino de mayor calidad. 1.6 Deshidratación Si las cepas levaduriformes seleccionadas son de interés comercial, queda un último paso por investigar que es su deshidratación. No todas las cepas resisten bien ni mantienen sus características tras el secado y la posterior rehidratación y por tanto, aunque se trate de una cepa de características extraordinarias, sino se puede deshidratar, no será una buena levadura para uso industrial. La producción de levaduras secas activas (LSA) es un proceso muy importante, ya que se realiza en aerobiosis (es decir, en presencia de oxígeno), para conseguir una elevada biomasa y una reserva de ácidos grasos insaturados y esteroles muy necesarios durante el proceso fermentativo (en semianaerobiosis) donde la síntesis de estos compuestos está inhibida. Este proceso hace que las levaduras estén metabólicamente activas cuando se rehidratan y por tanto, su imposición sea más rápida. Por este motivo, no es necesario hacer un pie de cuba antes de inocular estas LSA. De hecho, el hacer demasiadas réplicas al preparar el pie de cuba antes de inocular, puede restarle efectividad a las LSA. Una vez que la levadura ha superado todas estas fases, aún se hace necesario el análisis de su estabilidad genética. Es conocida una cierta inestabilidad que hace que después de muchas generaciones (como en la producción industrial de LSA), el porcentaje de mutaciones de las cepas levaduriformes sea elevada, por lo que dicho análisis es un requisito imprescindible. 1.7 Proceso de selección en bodega Una vez superadas las diferentes fases del proceso de selección y de producción industrial (incluido el secado), queda la última fase y definitiva: su uso industrial en bodega y su aceptación final, que es la auténtica prueba de fuego de todo el proceso. 2

Objetivos 2.1 Aislar e identificar S. cerevisiae de mosto fermentado. 2.2 Seleccionar S. cerevisiae según el tiempo de duración de la fermentación y grado alcohólico alcanzado. 2.3 Mantener adecuadamente S. cerevisiae seleccionada.

3

Procedimiento 3.1 Aislamiento e identificación de S. cerevisiae a partir de mosto fermentado 3.1.1. Obtención de mosto fermentado a) Adquirir 0,5 kg de uva dulce tinta (pulpa y hollejo púrpura) o tintórea (hollejo púrpura). b) Proceder al desgranado: Manualmente separar los granos del raspón en cada racimo y colocarlos en un depósito limpio. En simultáneo eliminar los frutos deteriorados. c) Realizar el estrujado: Triturar los granos de uva, lo suficiente para lograr la separación total de hollejo y la pulpa pero no para deteriorar las pepas.

d) Depositar el material resultante o mosto en un matraz de fermentación previamente esterilizado. Tapar con algodón e incubar a 30 ºC durante 24 horas. Cambiar el algodón por una tapa hermética de goma que presenta un agujero en el centro para permitir la salida de CO2 a través de una cánula que desemboca en un frasco conteniendo una solución de NaCl al 20 %. Incubar a 30 ºC durante 72 horas. 3.1.2 Aislamiento de levaduras b) Tomar una alícuota del mosto fermentado y sembrar mediante la técnica de agotamiento y estría sobre agar Sabouraud glucosado con antibiótico (placas de Petri). c) Incubar a 30 ºC durante 24 a 48 horas. d) Seleccionar las colonias redondas, blancas o cremosas, convexas, con bordes enteros, de consistencia mantecosa, con un diámetro aproximado de hasta 5 mm y realizar una tinción simple con azul de metileno para verificar la presencia de levaduras. e) Subcultivar las colonias levaduriformes en viales conteniendo conteniendo agar Sabouraud glucosado inclinado e incubar a 30 ºC durante 24 horas. 3.2 Identificación de S. cerevisiae a) Para identificar el género Saccharomyces inducir la formación de la fase sexual (facultad esporulante), cultivando cada una de las cepas levaduriformes en agar Sabouraud glucosado durante 24 horas y sembrándolas por dos veces consecutivas en medio de preesporulación agar nutritivo enriquecido contenido en tubos de prueba. Después de incubar a 30 ºC durante 48 horas en cada una de las resiembras, sembrar en el medio de esporulación agar acetato contenido en tubos de prueba. Incubar a 30 ºC y examinar los cultivos semanalmente hasta por 20 días mediante extensiones coloreadas con la tinción de Schimwell modificada por Mc Chung para investigar la presencia de ascas con ascosporas. El método de coloración consiste en:  Tomar una pequeña muestra del cultivo examinado y mezclar con una gota de agua sobre una lámina portaobjetos. Fijar en la llama del mechero muy lentamente y cubrir con verde de malaquita 5 % durante 30 a 60 segundos.  Calentar por tres veces hasta la emisión de vapores. Enjuagar con agua tibia durante 30 segundos. Cubrir con una solución acuosa de safranina 0,5% durante 30 segundos.  Lavar, secar y observar con objetivo de inmersión.  Anotar la presencia de ascosporas coloreadas de verde y el resto de material color rojo. Contar su número y la forma de las mismas en el interior del asca.  Las ascosporas de S. cerevisiae se forman en número de una a cuatro en un asca. Son redondas y lisas con un diámetro aproximado de 3.5 µm. Con frecuencia se forma una cuña protoplasmática entre las ascosporas. b)

Para identificar la especie S. cerevisiae realizar la prueba de fermentación de carbohidratos. Obtener una suspensión de células (de cada una de las cepas de levaduras cultivadas en agar Sabouraud glucosado durante 24 horas) en solución salina estérilizada e inocular 0,1 mL en tubos de 16 x 160 mm (con campana de Durham) conteniendo 9 mL de medio base de fermentación más carbohidratos al 2 %: glucosa, galactosa, sacarosa, maltosa, lactosa y 4 % de rafinosa. Incubar por 48 horas (hasta por 15 días) a 30 °C. No ajustar herméticamente el tapón de los tubos. La fermentación es positiva cuando en las campanas de Durham se observa la presencia de gas. Un color amarillo indica la utilización del carbohidrato más no la fermentación de éste.

c)

Para determinar las características morfológicas de las levaduras, sembrar 0.1 mL de la suspensión de células en tubos conteniendo 9 mL de caldo extracto de malta. Incubar a 30 °C durante 2 a 10 días. A partir del tercer día de incubación tomar una gota del cultivo, realizar un frotis y una tinción con azul de metileno. Determinar la forma de las células, dimensiones y reproducción vegetativa. S. cerevisiae puede tener forma elíptica y redondeada siendo la forma de la mayor parte de las células jóvenes redondeada u oval. Miden de 3 a 7 µm de ancho por 4 a 14 µm de longitud (la relación entre la longitud y ancho por lo general es menor que 2). Su reproducción vegetativa es por gemación multilateral. A partir del quinto al décimo día de incubación observar que el crecimiento de S. cerevisiae en medio líquido se caracteriza por un desprendimiento gaseoso más o menos abundante. El líquido se encuentra en un principio alterado apareciendo posteriormente un depósito cuando el líquido se clarifica. Observar cuidadosamente el aspecto de la espuma y luego del depósito o la película.

3.3 Selección de S. cerevisiae según el tiempo de duración de la fermentación y concentración de alcohol alcanzado 3.3.1

Obtencion del mosto Adquirir 1 kg de uvas dulces, lavarlas con agua potable y obtener mosto de manera similar a lo explicado en el item 3.1.1. Filtrar el mosto, determinar su volumen y proceder a su acondicionamiento (corrección del azúcar, acidez y primer sulfitado). Para la corrección del azúcar, homogenizar el mosto con una paleta de madera y determinar los grados Brix. Para iniciar el proceso de fermentación el mosto debe tener un máximo de 24 ºBrix. Si el valor es menor agregar azúcar blanca en una cantidad determinada a través del siguiente cálculo:

(Peso de la muestra de mosto)( Brix deseado - Brix inicial ) 100  Brix deseado Ejemplo: Suponer que se toma una muestra de 750 g de mosto con 15 ºBrix.

(0,750)(24  15)  0,088Kg 100  24 Se deben agregar 88 g de azúcar para alcanzar 24 ºBrix. En caso de no tener Brixómetro, agregar 120 g de azúcar blanca por litro del volumen total del mosto a fermentar. Para la correción de la acidez del mosto, medir con la cinta de pH y ajustar a 3,3 con ácido tartárico. A continuación realizar el primer sulfitado agregando 0,1 g de metabisulfito de sodio por litro de mosto. Homogenizar con la paleta de madera.

3.3.2

Fermentación en laboratorio Depositar 285 mL de mostopreviamente acondicionado en matraces de 500 mL de capacidad e inocularlos con 15 mL de una suspensión de levaduras cultivadas en agar Sabouraud glucosado a 30 ºC por 24 horas. Determinar el número de células viables. La población final de levaduras deberá ser de aproximadamente 2 x 107 UFC / mL. Tapar con algodón e incubar a 30 ºC durante 24 horas. Cambiar el algodón por una tapa hermética de goma que presenta un agujero en el centro para permitir la salida de CO2 a través de una cánula que desemboca en un frasco conteniendo una solución de NaCl al 20 %. y en donde se observará el burbujeo del CO2 eliminado durante el proceso Incubar a 25 ºC durante 72 horas.

La finalización del burbujeo determinará el final de la fermentación, momento en el cual se medirán los grados de alcohol alcanzados (método de destilación o con el vinómetro). En caso de no tener el equipo necesario la capacidad productiva de alcohol también se puede determinar indirectamente pesando diariamente cada uno de los matraces previa agitación a fin de eliminar el anhídrido carbónico. La determinación del peso se debe realizar hasta que éste muestre un valor constante lo que indica que la fermentación ha concluído.

3.4 Mantenimiento de cepa enológica de S. cerevisiae seleccionada Sembrar la cepa de S. cerevisiae seleccionada en caldo Sabouraud Glucosado, incubar a 25 ºC durante 24 horas y mantener en refrigeración.

0.5 Kg de uva

Estrujado

Desgranado

Cambiar el algodón por una tapa hermética

30 °C por 72 horas.

Figura 1. Obtención de mosto fermentado.

30 °C / 24horas

Sembrar sobre ASG con antibiótico

Incubar a 30 °C por 24-48 horas

Tomar una alícuota del mosto fermentado Selecciónar colonias

Tinción simple

Incubar a 30 °C durante 24 horas Cultivo puro de levaduras

Figura 2. Aislamiento de levaduras.

Subcultivar en ASG

30 °C/48h.

Cultivo puro levaduriforme

30 °C/48h.

Incubar a 30 °C y examinar los cultivos semanalmente hasta por 20 días Agar nutritivo enriquecido Agar Acetato

Tinción de Schimwell modificada

Figura 2. Identificación del género Saccharomyces.

Inocular 0,1 mL

Saccharomyces sp. Suspensión de Sacchromyces sp.

Gl

La

30 ºC/2-15 días

(+)

Figura 3. Identificación de Sacharomyces cerevisiae.

Sa Ma

Carbohidratos: glucosa, galactosa, sacarosa, maltosa, lactosa

Gl

Saccharomyces cerevisiae

Ga

Ga

(+)

Sa

Ma

La

(+)

(+)

( )

-

La fermentación se evidencia por la presencia de gas en las campanas de Durham

1 kg de uva

Lavar

Desgranar

Determinar su volumen

Filtrar

600 mL de mosto

Estrujar

Agregar la cantidad necesaria de azúcar blanca para obtener el 24 ºBrix

Medir el Brix

Figura 4. Obtención del mosto corregido.

Mosto corregido

30 ºC /24 horas

Depositar 300 mL de mosto en frascos de 500 mL

Inocular 6 mL de la suspensión de S. cereviseae

Colocar tapa hermética

30 ºC/72 horas (hasta finalización del burbujeo)

Medir con el vinometro los grados de alcohol alcanzados

Figura 5. Fermentación en laboratorio.

Mosto fermentado

3

Anexo 4.1Agar Sabouraud glucosado (g/L) Peptona Glucosa Agar agar Agua csp pH

10,0 20,0 20,0 1L 5,6

4.2 Agar nutritivo enriquecido (g/L) Glucosa Extracto de levadura Caldo nutritivo Agar agar Agua destilada csp pH

50,0 10,0 30,0 20,0 1L 5,6

4.3 Medio Agar acetato (g/L) Acetato de potasio Glucosa Extracto de levadura Agar Agua csp pH

9,8 1,0 2,5 20,0 1L 6  0.5

4.4 Medio base para fermentación de carbohidratos (g/L) Peptona 50,0 Extracto de carne 1,0 NaCl 5,0 Agua csp 1L pH 7.0 Una vez que se ha medido el pH agregar el indicador rojo de fenol 0,02 g por l L. Luego agregar el carbohidrato según corresponda (2 o 4 %).

4.5 Caldo extracto de malta Pesar 1,5 g de extracto de malta para 100 mL de agua destilada.

4.6 Medio base para fermentación de carbohidratos (g/L) Verde de malaquita 0,01 g Agua destilada 100 mL

4.7 Solución safranina Safranina Agua

0,25 mL 100 mL

4.8 Recuento de células viables El recuento de células puede ser realizado en cámaras de contaje o hematocímetros (diseñados para contar glóbulos de sangre) que consisten en una lámina de cristal de una dimensión aproximada a la de una lámina portaobjetos, pero de mayor grosor. Tienen ranuras en forma de H, con rieles a cada lado que sostienen un cubreobjeto grueso especial a una distancia de 0,1 mm por encima de las dos porciones interiores de la H, que forman dos cámaras entre éstas y el cubreobjeto. El cubreobjeto es grueso para impedir que se hunda en el centro en su parte no sostenida, lo cual reduciría el volumen de las cámaras. El fondo de cada una de las cámaras tiene un rayado “Neubauer” de 9 mm2 (3 mm por lado) dividido en nueve cuadrados principales (C.P.) de 1 mm por lado, en los que se cuenta arbitrariamente el contenido de cinco: los cuatro de las esquinas y el central (A, B, C, D y E) para calcular la concentración de propágulos cuando éstos son relativamente grandes. Como el volumen sobre cada C.P. es 0,1 mm3, para calcular la concentración por cc (10 000 veces mayor), se procede en la forma siguiente: SUMA de 5 C.P. x 2 000 = número / cc Cuando los propágulos son pequeños se usa el C.P. central que está dividido en 25 cuadrados secundarios (C.S.) de 32 mm por lado y a su vez cada uno está dividido en 16 cuadrados menores de 0.05 mm por lado. Entonces la concentración se calcula así: NÚMERO en el C.P. CENTRAL x 10 000 = número / cc Se pueden conseguir resultados similares representativos haciendo contadas en una fracción del C.P. central, con la consiguiente reducción de la labor. Se cuentan lo propágulos en un número reducido de los C.S. Por ejemplo, si se observan los cuatro C.S. esquinados y el central, entonces: SUMA de 5 C.S. x 50 000 = número / cc Si se observan los cuatro C.S. esquinados y cuatro que rodean al central, entonces: SUMA de 8 C.S. x 31 250 = número / cc 4.1.1 Procedimiento para realizar el recuento de células levaduriformes viables - Realizar una suspensión acuosa del cultivo de S. cerevisiae. - Llevar 0,5 mL de la suspensión de levaduras hacia un tubo y adicionar 0,5 mL de azul de metileno (proporción 1/1). - Homogenizar y hacer recuento en la cámara de Neubauer en los cinco cuadrados principales o primarios. - Las células viables se observan refringentes, incoloras y las células no viables de color azulado u opacas. - Realizar los cálculos correspondientes y multiplicar por el factor de dilución. Factor de dilución = Volumen total diluido/Volumen de la muestra. 1/0.5 = 2

5. Referencias bibliográficas Alvarado, X. & Muro, J. (2007). Concentración de inóculo y tiempo de fermentación en la elaboración de chicha de jora con Saccharomyces cerevisiae nativa.Tesis Licenciatura. Lambayeque, Perú, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Chirre, C. & Farroñay, D. (2007). Concentración de inóculo y tiempo de fermentación en la elaboración de cerveza Lager en el Centro de Producción-Investigación de la Cervecería Industrial “La Otra”. Lambayeque.Tesis Licenciatura. Lambayeque, Perú, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Zamora, D., (2006). Concentración de inóculo y tiempo de fermentación en la elaboración de vino semiseco por Saccharomyces cerevisiae nativa a partir de Vitis vinífera “uva”.Tesis Licenciatura. Lambayeque, Perú, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Reaño, A .& Sierra, Z. (2008). Estudio técnico para la elaboración de cerveza tipo Ale con adición de zumo de piña como un sucedáneo no amiláceo. Tesis Ingeniero en Industrias Alimentarias. Lambayeque, Perú, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Torija, J., (2002). Ecología de levaduras: Selección y adaptación a fermentación vínica. Tesis Doctorado. España, Universidad Rovira y Virgili.

PRÁCTICA XIV BIOINSECTICIDAS: Bacillus sp. COMO LARVICIDA DE Anopheles sp. 1. Introducción

La malaria o paludismo es una enfermedad caracterizada porque en los glóbulos rojos se encuentran protozoos del género Plasmodium, transmitidos por la picadura de la hembra del mosquito Anopheles ó vector de esta enfermedad endémica en el Perú. Anopheles es un díptero que se desarrolla en climas tropicales, como el de la Amazonía y la Costa Norte Peruana, donde su diseminación es amplia. Los compuestos químicos constituyen una excelente arma de lucha antivectorial, pero afectan a los seres vivos, contaminan el ambiente e inducen resistencia en el insecto vector. Como alternativa se han establecido programas de Control Vectorial Integrado basados en la combinación racional de los métodos de control disponibles químicos, físicos, biológicos, especialmente los microbiológicos. En el control microbiológico se utilizan insecticidas elaborados con entomopatógenos como las bacterias del género Bacillus, específicamente Bacillus thuringiensis y Bacillus sphaericus, que producen sustancias tóxicas con alto grado de especificidad para larvas de dípteros hematófagos. Actualmente, existen en el mercado biolarvicidas como Vertobac y Gresleaf elaborados con estos microorganismos y sus productos; sin embargo, a pesar de su eficacia larvicida presentan desventajas en cuanto a su efecto residual, debido a una poca adaptación de estas cepas a las condiciones ambientales de cada región, por lo que, en diversas áreas malarígenas se han desarrollado líneas de investigación tendientes a buscar nuevas cepas de bacterias con capacidad larvicida, que puedan ser utilizadas eficientemente como controladores de insectos. 2. Objetivos 2.1 Aislar Bacillus spp. 2.2 Seleccionar Bacillus spp. segùn su potencial biocida frente a larvas de Anopheles sp. 2.3 Identificar la especie de Bacillus controlador de larvas de Anopheles sp. 2.4 Mantener decuadamente Bacillus sp. controlador de Anopheles sp. 3. Procedimiento 3.1 Aislamiento de Bacillus sp. Muestra: 10 g de fango del fondo de criaderos de Anopheles sp. (totoral, arrozal, filtración, dren)  Pesar 2 g de la muestra de fango y realizar diluciones seriadas en solución salina estéril hasta 10-3 .  Llevar la dilución 10-3 a tratamiento térmico de 80 ºC durante 10 minutos (baño maría) y luego someter a enfriamiento rápido.  De la dilución 10-3 tomar una alícuota y sembrarla mediante la técnica de agotamiento y estría sobre la superficie de agar nutritivo (Placas de Petri).  Incubar en aerobiosis a 30 ºC, durante 24 horas.  Seleccionar las colonias desarrolladas y realizar una tinción de Gram para verificar la presencia de bacilos.  Cultivar las colonias seleccionadas en viales con agar Tripticasa Soya (TSA), para obtener cultivos puros.

3.2 Selección de Bacillus segùn su potencial biocida frente a larvas de Anopheles sp. 3.2.1

Obtención de larvas de Anopheles sp.  Seleccionar criaderos soleados con agua limpia y vegetación herbácea emergente.  Realizar la recolección de larvas de Anopheles sp. mediante el “Método de Cucharón”, utilizando un cucharón blanco de mango largo que se sumerge con movimiento firme y en ángulo de 45º respecto a la superficie de agua, para posteriormente extraerlo sin que rebose el agua. Con un gotero plástico de boca ancha recolectar los estadíos larvales de Anopheles sp. y transferirlos a recipientes con agua del mismo criadero.  En el laboratorio mantener las larvas en fuentes de fierro enlozado con agua del mismo criadero de origen hasta su empleo en los ensayos de patogenecidad.

Cuadro 11. Características de anofelinos a nivel del campo Características Posición en la superficie del agua Sifón respiratorio

Anofelinos Paralela

Culicinos Perpendicular (en ángulo)

Ausente

Cabeza y tórax

Cabeza mas estrecha que tórax

Presente, Tamaño variable Cabeza distinguible del tórax

Anopheles: Larvas con poca fotofobia, movimiento rápido en forma de látigo, respiran en posición horizontal a la superficie. Aedes: Larvas con fotofobia y timidez, movimiento en forma de víbora, respiran en posición perpendicular a la superficie. Culex: Larvas sin fotofobia movimiento en forma de látigo, respiran en posición inclinada. 3.2.2 Pruebas de patogenecidad de Bacillus sp. a. Obtención de la suspensión bacteriana (esporas y cristales de Bacillus sp.)  Cultivar Bacillus sp. sobre la superficie inclinada de agar Tripticasa Soya e incubar en aerobiosis a 30 º C durante 5 días.  Verificar la esporulación a través de una tinción de Gram.  Realizar una suspensión celular en solución salina y estandarizar la concentración con el tubo 6 del nefelómetro de Mc Farland (1,8 x 10 9 esporas y cristales/ mL). b.

Efecto de Bacillus sp. sobre larvas de Anopheles sp.  Depositar 10 mL de cada una de las suspensiones bacterianas previamente estandarizadas sobre 90 mL de agua destilada estéril contenida en recipientes plásticos de primer uso y con una capacidad de 250 mL. En cada recipiente se tendrá una concentración final de aproximadamente 1.8 x 108 esporas y cristales/mL.  Colocar diez larvas de Anopheles sp. (de preferencia III estadío).  Acondicionar un control positivo con el insecticida Griselef (Bacillus sphaericus cepa 2362) y un control negativo con 100 mL de agua destilada estéril y diez larvas de Anopheles sp.  Alimentar las larvas con comida para peces (para evitar el canibalismo).



Determinar la sobrevivencia de las larvas de Anopheles sp. después de 24, 48 y 72 horas de entrar en contacto con la suspensión de Bacillus sp. Considerar como larvas muertas aquellas que no reaccionan al ser tocadas en la región cefálica. En caso de que el control negativo presente una mortalidad comprendida entre 5 a 20 % corregir los porcentajes de mortalidad mediante la fórmula de Abbott.

% Mortalidad Corregida  3.2.3

% mortalidad expuestas - % mortalidad del control negativo  100 100 - % mortalidad del control negativo

Recuperación de Bacillus sp.  Colectar las larvas muertas en el ensayo de de Bacillus sp. que presente la mayor mortalidad.  Depositarlas en un frasco estéril, desinfectarlas con hipoclorito de sodio al 0,1 % durante 1 minuto, enjuagarlas con agua destilada estéril durante 1 minuto y triturarlas con 2 mL de solución salina estéril.  Tomar una alícuota del triturado de larvas y sembrar mediante la técnica de agotamiento y estría sobre la superficie de agar nutritivo.  Incubar en aerobiosis a 30 ºC durante 24 horas.  Realizar una coloración de Gram para determinar morfología y reacción tintorial.  Obtener un cultivo puro en agar tripticasa soya.

3.2.4

Confirmación del efecto Biocida de Bacillus sp.  Con Bacillus sp. recuperado y cultivado en agar Tripticasa Soya durante 5 días obtener una suspensión bacteriana (esporas y cristales), estandarizar la concentración en el tubo 6 del nefelómetro de Mc Farland y realizar un bioensayo con larvas de Anopheles sp. 3.3 Identificación de las especies de Bacillus  Caracterización macroscópica de colonia: Color, tamaño, bordes, forma, elevación.  Caracterización microscópica de células: Forma, reacción tintorial, presencia de espora y cristal. Para observar las esporas y cristales realizar la coloración de verde de malaquita modificada (realizar un frotis, cubrirlo con verde de malaquita al 6 %, calentar en el mechero por debajo de la lámina hasta que exista desprendimiento de vapores blancos por tres veces, dejando enfriar cada vez, enjuagar con agua corriente, cubrir el frotis con carbol fucsina al 0,1 % durante 1 minuto, eliminar el exceso de colorante, enjuagar y dejar secar a medio ambiente)  Pruebas de motilidad, hemólisis, hidrólisis de la gelatina, Voges Proskauer, rojo de metilo, indol, hidrólisis del almidón, utilización de carbohidratos glucosa, arabinosa, manitol.

3.4 Mantenimiento de Bacillus sp. Sembrar Bacillus sp. controlador de Anopheles sp. en viales conteniendo agar tripticasa soya, incubar a 30 ºC durante 24 horas y mantener en refrigeración.

4. Anexo 4.1 Verde de Malaquita al 6 % Verde de malaquita Agua destilada csp

6g 100 mL

Disolver en caliente, homogenizar y guardar en frasco oscuro

4.2 Carbol fucsina al 1 % Fúcsina básica 10 g Etanol absoluto 100 mL Fenol al 5 % 1 000 mL Mezclar y guardar en frasco oscuro

5. Referencias bibliográficas Novoa, N. y Pacherres, A. (2003) Cepas nativas de Bacillus spp. como potenciales conroladoresde larvas de Anopheles pseudopunctipennis. Sullana, enerosetiembre 2001. Tesis Licenciatura. Lambayeque, Perú, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.

PRACTICA XV BACTERIAS DEGRADADORAS DE PETRÓLEO DIESEL

1.

INTRODUCCIÓN La utilización masiva de

combustibles fósiles genera anualmente 2 800 millones de

toneladas de dióxido de carbono de los 76 000 millones de toneladas existentes en la atmósfera. El dióxido de carbono junto con otros gases como el dióxido nitroso,

metano,

clorofluorocarbonados, compuestos halogenados y vapor de agua constituyen el grupo de gases invernadero que absorven la radiación reflejada provocando el calentamiento global de la atmósfera y cambiando dramáticamente el clima del planeta. Adicionalmente a los cambios climáticos globales el uso masivo del petróleo como fuente de energía y como materia prima ha generado la contaminación ambiental que ocasiona el deterioro progresivo de la calidad del ambiente y constituye una amenaza real a la salud pública así como es responsable de la extinción de gran cantidad de especies animales y vegetales. El principal origen del crudo y productos del petróleo tales como benceno, tolueno, xileno (BTX) e hidrocarburos aromáticos polinucleares (PAHs) liberados al ambiente son las pérdidas de los tanques de almacenamiento, los vertidos y accidentes durante su transporte. Una de las herramientas para combatir la contaminación ambiental generada por derrames de petróleo es la biodegradación del petróleo o ruptura de los compuestos complejos a compuestos simples y menos tóxicos. Durante los últimos años el interés por la búsqueda de microorganismos con capacidad degradativa de petróleo como bacterias, mohos y levaduras se ha incrementado con miras a utilizarlos en la

recuperación microbiana de los suelos y

cuerpos de agua

contaminados con petróleo. La biorremediación o utilización de microorganismos como las bacterias que metabolizan petróleo como fuente de carbono y energía, constituye una alternativa saludable frente al deterioro progresivo de la calidad del ambiente por el derramamiento de crudos, permitiendo la biodegradación de los hidrocarburos y recuperación de los suelos contaminados.

2.

OBJETIVOS 2.1. Aislar bacterias degradadoras de petróleo Diesel a partir de suelo contaminado. 2.2. Cuantificar el petróleo Diesel degradado por contaminados.

3.

METODOLOGÍA 3.1 Muestra 100 g de suelo contaminado con petróleo

bacterias aisladas de suelos

3.2 Aislamiento de bacterias heterótrofas Para favorecer el aislamiento de bacterias heterótrofas pesar 10 g de cada muestra de suelo contaminado y enriquecerlas en 90 mL de caldo Bushnell Haas, a

30 °C,

durante 24 horas. Después, tomar una alícuota de 0,1 mL y sembrarla mediante la técnica de agotamiento y estría sobre agar nutritivo, King B y Mac Conkey. Incubar a 30 °C durante 24 horas. A

continuación, en el agar nutritivo agrupar las colonias desarrolladas, según sus

características morfológicas y seleccionar una representante de cada grupo. De igual manera en el agar King B seleccionar las colonias formadoras de fluorescencia y en el agar Mac Conkey las colonias lactosa negativas. Realizar una tinción de Gram y después cultivar en agar Tripticasa Soya (TSA) y Bushnell Haas con 4 % de petróleo Diesel, constituyendo los cultivos puros, que serán guardados en refrigeración a 8 °C. 3.3 Tiempo requerido para la utilización del petróleo como fuente de carbono y energía Para la obtención del inóculo, cultivar cada bacteria nativa en 10 mL de caldo nutritivo, a 30 °C durante 24 horas. Posteriormente, centrifugar el caldo nutritivo (3500 rpm) durante 10 minutos, eliminar el sobrenadante, lavar el sedimento

con solución salina

esterilizada (0,87 %, p/v) y estandarizar la concentración celular con el tubo 3 del nefelómetro de Mc Farland (9 x 108 cel mL-1). A continuación, de cada una de las suspensiones bacterianas previamente estandarizadas tomar 1 mL e inocularlo por triplicado en tubos de prueba de 16 x 150 mm con 10 mL de caldo Bushnell Haas con indicador púrpura de bromocresol y 0,1 mL de petróleo Diesel. Considerar un tubo con caldo de cultivo no inoculado como testigo. Incubar a 30 °C hasta por 10 días, con agitación manual, diariamente por 10 minutos y en simultáneo investigar el viraje del indicador del lila al amarillo, que se interpretará como positivo para la utilización del petróleo como fuente de carbono y energía. 3.4 Cuantificación de las Unidades de Actividad Emulsificante (UAE) De cada uno de los inóculos bacterianos previamente estandarizados tomar 1 mL e inocular por triplicado en tubos de prueba de 16 x 150 mm con 10 mL de caldo extracto de levadura más 0,2 mL de etanol. Considerar un tubo con caldo de cultivo no inoculado como testigo. Incubar a 30 °C, durante 3 días con agitación manual, diaria por 10 minutos y en simultáneo investigar la presencia de burbujas y turbidez del medio de cultivo. A continuación, verter el caldo cultivado en tubos y centrifugarlos (3500 rpm) durante 10 minutos. Después, tomar 1 mL de cada sobrenadante y llevar a tubos de prueba con 9 mL de caldo extracto de levadura etanol más 0,2 mL de petróleo Diesel. Tapar herméticamente (tapa rosca) y agitar manualmente durante 1 minuto hasta lograr una emulsión. Posteriormente, con un tubo “blanco” conteniendo caldo extracto de levadura etanol más 0,2 mL de petróleo Diesel (testigo) calibrar a cero el espectrofotómetro digital de luz visible, 335 - 1000 nm,

y leer la absorbancia de cada una de las muestras a 540 nm.

Después, realizar la conversión de la absorbancia a unidades de actividad emulsificante por

mililitro, considerando 0,826 de absorbancia como una Unidad de Actividad Emulsificante por mililitro, UAE mL-1. 3.5 Eficiencia de la biorremediación de suelo contaminado con petróleo por tres bacterias nativas seleccionadas Inocular las tres bacterias en terrarios con suelo contaminado con petróleo, donde se determinará la eficiencia de la biorremediación usando las tecnologías de bioestimulación y bioaumentación. a. Recolección y acondicionamiento de suelo contaminado Colectar

suelo contaminado con petróleo, homogenizar sobre una manta de

polietileno y tamizar a través de una malla metálica de 15 mm de diámetro . b. Cálculo y aplicación de nutrientes para la bioestimulación Realizar la bioestimulación o aplicación de los nutrientes nitrógeno y fósforo hasta alcanzar la relación C:N:P de 100:10:1, para lo cual se agregarán 0,235 g de urea (46 % N) y 0,024 de fosfato diamónico (18 % N y 46 % P) por terrario. c. Propagación de bacterias para la bioaumentación Obtener el inóculo de cada bacteria nativa por el método de siembra a gran escala, trabajando con un inóculo madre, intermedio y definitivo. Cultivar las bacterias nativas seleccionadas en 3 mL de caldo nutritivo, a 30 ˚C durante 24 horas. A continuación, obtener un paquete celular y estandarizar su concentración con el tubo 3 del nefelómetro de Mc Farland , obteniendo una suspensión bacteriana con 9,0 x108 cel mL-1 Por ejemplo para la propagación, inocular 0,6 mL de la suspensión bacteriana en 5,4 mL de caldo Bushnell Haas con 5 % de petróleo Diesel, incubándolos a 30 °C por 24 horas, constituyendo el inóculo madre. Inocular éste en 54 mL de caldo Bushnell Haas con petróleo Diesel incubándose a 30 °C por 24 horas para constituir el inóculo intermedio e inocular a su vez, éste en 540 mL del mismo caldo Bushnell Haas, incubado en las mismas condiciones y constituyendo el inóculo definitivo en una cantidad de 600 mL. para 30 bandejas. Luego tomar una muestra representativa de 1 kg de suelo para determinar el contenido de Hidrocarburos Totales de Petróleo (TPH) y realizar la caracterización físico – química en el laboratorio de suelos A continuación, distribuir el suelo contaminado en bandejas de plástico o terrarios, de 40 x 28 cm con un área de 0,11 m2, a razón de 4 kg por unidad.. d. Inoculación de bacterias nativas degradadoras de petróleo Para determinar la eficiencia de la biorremediación de un suelo contaminado con petróleo se realizó un ensayo con quince tratamientos diez de ellos correspondieron a la inoculación independiente de cada una de las bacterias seleccionadas, tres tratamientos fueron consorcios de bacterias y dos tratamientos fueron testigos con nitrógeno - fósforo, suplementado y absoluto. En cada tratamiento se tuvieron dos repeticiones, totalizando 30 unidades experimentales. En los tratamientos correspondientes a la inoculación, independiente de las

bacterias nativas (T1 a T10) en cada terrario con 4 kg de suelo contaminado se añadieron 400 mL (10 %) del inóculo, previamente obtenido. En los consorcios se inocularon 80 mL de cada una de las cinco bacterias seleccionadas por requerir el menor tiempo en la utilización del petróleo (T11), 80 mL de cada una de las cinco bacterias con el mayor número de UAE (T12) y 40 mL de cada una de las diez bacterias nativas seleccionadas (T13). El testigo con nitrógeno y fósforo no fue inoculado y a su vez el testigo absoluto no fue ni bioestimulado ni bioaumentado. Inmediatamente después de la inoculación, el contenido de los terrarios se mezcló durante 5 minutos y a continuación éstos se ubicaron bajo un área techada de 5 x 6 m . Se realizaron riegos (Figura 44), interdiarios con agua de pozo, durante los primeros 60 días y dos veces por semana los últimos 30 días y después de cada riego el contenido de los terrarios fue removido durante 5 minutos. Monitorización del proceso: análisis físico – químico

e.

Inmediatamente después de la inoculación bacteriana y después de 30,60 y 90 días, tomar una muestra representativa de 30 g en cada tratamiento y llevar al laboratorio donde se tomarán tres submuestras de 10, 5 y 10 g para investigar el pH, humedad y bacterias, respectivamente. Para medir el pH depositar 10 g de suelo en un frasco con 25 mL de agua destilada (1: 2,5) y agitar durante 90 segundos antes de la medición. Para la determinación de la humedad obtener el peso de un crisol limpio y seco (Pb), pesar en éste 5 g de suelo (Pshb), y después secarlos en horno a 105 °C hasta obtener peso constante. Finalmente pesar el crisol con la muestra de suelo seco (Pssb). Determinar la humedad al inicio del ensayo y después del riego correspondiente, interdiario durante los 60 primeros días y dos veces por semana durante los últimos 30 días. Calcular el contenido de agua con la siguiente fórmula: % Ɵg = (Pshb - Pssb) x 100 (Pssb - Pb)

f.

Monitorización del proceso: análisis biológico

Realizar el análisis microbiológico y un bioensayo de fitotoxicidad en Latuca sativa L. “lechuga”. -

Análisis microbiológico Inmediatamente después de la inoculación y mensualmente contar las bacterias

heterótrofas e hidrocarbonoclásticas. Para el recuento de bacterias heterótrofas utilizar

el

método de placa fluida o vertido en placa, para lo cual se deben pesar 10 g de suelo con los que se obtendrá una suspensión en 90 mL de agua destilada esterilizada, que a la vez constituirá la dilución 10-1. A continuación, realizar diluciones decimales entre 10-4 a 10-7 , y de las tres

últimas diluciones tomar 1 mL por duplicado y depositarlos en placas de Petri esterilizada Inmediatamente después, agregar el agar Plate Count, licuado y enfriado entre 44 - 46 °C y homogenizar, el contenido durante 30 segundos. Incubar a 30 °C durante 48 horas y después contar en las placas que presentaron entre 30 a 300 colonias. Cuando no se observen colonias en las placas considerar como un número menor de 1 dividido por el correspondiente volumen inoculado en la placa de Petri. Obtener la media del conteo de las placas correspondientes y expresar los resultados como Unidades Formadoras de Colonias por gramo de suelo (UFC g-1).

UFC/g suelo = N°colonias x Volumen dilución x mL dilución

factor dilución

1 g suelo

Para el recuento de bacterias hidrocarbonoclásticas utilizar la técnica del Número Más Probable, o Método de Tubos Múltiples, empleando el caldo

Bushnell Haas (5

mL), con el indicador púrpura de bromocresol y 0,025 mL de petróleo Diesel, como fuente de carbono. Para el recuento, inocular 1 mL de las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3 de la muestra de suelo por duplicado en tubos con caldo, Bushnell Haas – petróleo Diesel e incubar a 30°C hasta por 5 días.Considerar como positivo el viraje del indicador púrpura de bromocresol del lila al amarillo y realizar el cálculo correspondiente. -

Bioensayo de fitotoxicidad Para determinar el efecto de las sustancias presentes en los suelos

biorremediados sobre el índice de germinación, realizar un bioensayo de fitotoxicidad. De cada tratamiento tomar una muestra representativa de 10 g de suelo y realizar una dilución 1/5, tomando 10 g de suelo con 50 mL de agua destilada esterilizada. A continuación, colocar 20 semillas de lechuga var. GREAT LAKES, distribuidas por duplicado sobre un papel filtro circular depositado sobre la base de placas de Petri previamente esterilizadas y verter sobre ellas 6 mL de la dilución de suelo biorremediado. Tapar las placas de Petri

y cubrir con papel kraft durante

120 horas, a

temperatura ambiente. Incluir un control negativo, donde las diluciones de suelo serán reemplazadas por agua destilada esterilizada y dos controles positivos, en donde se depositarán las diluciones de suelo de los tratamientos testigo con N - P y testigo absoluto. Después de 120 horas contar las semillas germinadas y medir la longitud de las radículas emergidas. Calcular el porcentaje de germinación relativo, (PGR), el crecimiento relativo de radícula (CRR) y el índice de germinación (IG).

g. Eficiencia de la biorremediación de suelos contaminados por petróleo Para determinar la eficiencia de la biorremediación de suelo contaminado con petróleo expresado en porcentaje, realizar el análisis de Hidrocarburos Totales de Petróleo (TPH), al finalizar el proceso (90 días) en los tratamientos que presenten el mayor índice de germinación y en los testigos nitrógeno – fósforo y absoluto.

E = Si – Sf x 100 Si

Donde: E = Eficiencia de degradación de petróleo (%) Si = Concentración inicial de TPH Sf = Concentración final TPH

h. Identificación y conservación de bacterias nativas degradadoras de petróleo Realizar las pruebas correspondientes para determinar el género y especie de las bacterias degradadoras de petróleo.

4.

ANEXO 4.1 Caldo Bushnell Haas (g/L) KH2P04

1,0

K2HP04

1,0

(NH4)2S04

1,0

MgSO4

0,20

Cl2Ca

0,02

FeCl3

0,005

Agus destilada csp

1000 mL

pH

7,0

4.2 Caldo Extracto de levadura etanol (g/L) KH2 P04

18,0

K2HP04

6,0

MgS04

0,2

(NH4)2SO4

4,0

Extracto de levadura

3,0

Etanol

20,0 mL

Agus destilada csp

1000 mL

pH

7,0

4.3 Cálculo de las concentraciones de urea y fosfato diamónico requeridos para alcanzar una relación C:N:P de 100:10:1 (en Carreño, 2008)

a) Cálculo de FDA (18%N – 46%) 100 kg FDA 46 U/P x 1 U/P x = 2,174 kg FDA.Ha-1 x = 0,217g FDA. m2 Adición por terrario: 0,217g FDA 1 m2 x 0,112 m2 x = 0,024 g FDA 100 kg FDA 0,000024 kg FDA x = 0,000024 kg N x = 0,004 g N FDA

18 U/N x

b) Cálculo de Urea (46% N) 100 kg urea

46 U/N

x

10 U/N

x = 21,739 kg urea. Ha-1 x = 2,1739 g urea. m2 Adición por terrario: 2,174 g urea 1 m2 x 0,112 m2 x = 0,239 g N 0,239 g N (urea) - 0,004 g N (FDA) x = 0,235 g urea

5.

BIBLIOGRAFIA

Llanos, C. (2012). Eficiencia de la biorremediación de suelos contaminados con petróleo por bacterias nativas en el distrito de Pimentel, departamento de Lambayeque, 2011. Tesis de Licenciatura. Lambayeque, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Ramírez, N., (2005) Degradación de petróleo Disesel a diferentes concentraciones de nitrógeno y fósforo por cepas nativas de Pseudomonas sp. Lambayeque, 2005. Tesis de Maestría. Lambayeque, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Tapia, I., (2002) Capacidad degradativa del petróleo de hongos aislados de agua de marLitoral del Puerto Eten. Enero-Mayo, 2002. Tesis de Licenciatura. Lambayeque, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.