Manual de Prácticas - Laboratorio de Biorreactores - UPIBI - IPN

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

LABORATORIO DE BIORREACTORES MANUAL DE PRÁCTICAS

M. EN C. DYNORA VÁZQUEZ GURROLA M. EN C. CARLOS OROZCO ÁLVAREZ M. EN C. LEOBARDO ORDAZ CONTRERAS DR. SERGIO GARCÍA SALAS AGOSTO, 2007.

Laboratorio de Biorreactores. Manual de Prácticas

PRESENTACIÓN La Biotecnología, concebida como la aplicación del conocimiento para la obtención de productos y servicios mediante el uso de seres vivos o enzimas, hace necesaria la participación de profesionales que posean capacidades y habilidades para la operación y control de biorreactores. En ellos es en donde los seres vivos o enzimas llevan a cabo las transformaciones de materias primas a productos.

Este manual de prácticas del Laboratorio de Biorreactores se centra en el desarrollo de habilidades de los alumnos para el manejo de equipos auxiliares e instrumentos necesarios para la operación y control de biorreactores, mediante la descripción funcional de los equipos, así como de la calibración y uso de instrumentos. También, el manual se enfoca en que el alumno reconozca las diferencias del funcionamiento de diversos tipos de biorreactores, mediante la determinación experimental y comparación de sus parámetros hidrodinámicos, de transferencia de masa y de calor. Así mismo, el manual está diseñado para que el alumno distinga el funcionamiento de cultivos en lote, lote alimentado y continuo.

Este manual consta de diez prácticas de laboratorio. Cada práctica tiene una introducción, objetivos e instrucciones paso a paso para que el alumno alcance los objetivos planteados. También, tiene instrucciones para la recopilación, análisis y discusión de los resultados obtenidos, así como para que el alumno haga un reporte escrito del trabajo práctico realizado.

La práctica 1 está diseñada para que los alumnos conozcan y distingan los diferentes tipos de biorreactores que existen en la industria biotecnológica. La práctica 2 tiene el propósito de que los alumnos manejen sistemas de medición y control de variables de

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operación de biorreactores. En la práctica 3 se revisarán los servicios auxiliares que son necesarios para la operación de biorreactores. En la práctica 4 se determinarán parámetros hidrodinámicos como el tiempo de mezclado y el tiempo de circulación en biorreactores. La práctica 5 está diseñada para que los alumnos aprendan a determinar la velocidad de transferencia de oxígeno en biorreactores. La práctica 6 servirá para que los alumnos conozcan y aseguren la operación aséptica de biorreactores. En la práctica 7 los alumnos llevarán a cabo un ciclo de esterilización de un medio de cultivo. En las prácticas 8, 9 y 10 los alumnos realizarán diferentes formas de operar un biorreactor con base en la alimentación y descarga del medio de cultivo.

La apropiación del conocimiento práctico de este curso por parte de los alumnos, les facilitará la comprensión y el análisis de los contenidos temáticos de la asignatura de Ingeniería de Biorreactores, situada un nivel adelante del Laboratorio de Biorreactores en el plan de estudios de la carrera de Ingeniería Biotecnológica.

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CONTENIDO

Práctica 1. Presentación de biorreactores diversos ......................................................... 5 Práctica 2. Instrumentación para el seguimiento y control de la biorreacción ............... 10 Práctica 3. Servicios auxiliares ...................................................................................... 26 Práctica 4. Tiempo de mezclado en biorreactores......................................................... 38 Práctica 5. Transferencia de oxígeno en biorreactores agitados y neumáticos ............. 48 Práctica 6. Mantenimiento de asepsia en biorreactores ................................................ 57 Práctica 7. Esterilización del sistema de biorreacción ................................................... 64 Práctica 8. Producción de biomasa en cultivo por lote .................................................. 75 Práctica 9. Producción de biomasa en cultivo por lote alimentado ................................ 85 Práctica 10. Producción de biomasa en cultivo continuo ............................................... 98

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PRÁCTICA 1 Práctica 1. Presentación de biorreactores diversos

Presentación de biorreactores diversos

INTRODUCCIÓN

Cualquier proceso biotecnológico de nivel industrial tuvo que haber pasado por las siguientes escalas de operación: laboratorio, planta piloto e industrial (en ese orden temporal).

Cada escala tiene sus propias características y objetivos, mismos que serán tratados en otra asignatura (Ingeniería de Bioprocesos), sin embargo, al hablar de biorreactores, habrá que hacer la distinción entre tamaños, forma de operación y configuración geométrica.

El biorreactor puede considerarse como el corazón de todo proceso biotecnológico, ya que en él se lleva a cabo la transformación de la materia prima al producto de interés y su operación deberá garantizar la maximización en la conversión, por lo que su

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funcionamiento es de vital importancia en la rentabilidad del bioproceso, sobre todo en aquellos catalogados como de “altos volúmenes de producción y bajo valor agregado”.

Entre las características que debe reunir un biorreactor se encuentran las siguientes: 1. Calidad de mezclado; incluyendo tiempo de mezcla y patrones de flujo que favorezcan tanto la distribución de la materia prima en el biorreactor como su conversión a producto. 2. Altas velocidades de transferencia de masa, momento y calor, a bajo costo o con economía aceptable. 3. Factibilidad técnica y económica en la construcción de unidades de gran volumen. 4. Bajos costos de operación y mantenimiento. 5. Operación aséptica.

Los biorreactores pueden clasificarse de la siguiente forma:

Agitado Biorreactores

Columna Propelas Circulación

Airlift Jet

A continuación se describe cada tipo de biorreactor.

Biorreactores agitados

Este tipo de biorreactor es muy empleado, en todas las escalas de producción, en laboratorios de investigación o en la industria de fermentaciones, pueden utilizarse incluso para fermentaciones de reología compleja y en procesos en los que se exigen Vázquez Gurrola, Orozco Álvarez, Ordaz Contreras, García Salas

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altas velocidades de transferencia de masa y de calor. Consisten de un cuerpo cilíndrico con tapas elipsoidales, semiesféricas o toriesféricas. Generalmente su relación altura/diámetro es menor a 3 y más comúnmente menor a 2. Cuentan con un motor al que se acopla la flecha de transmisión que contiene a su vez los impulsores que agitarán el líquido. Dependiendo del tamaño del reactor, el motor puede colocarse en la tapa superior o en la inferior, pero invariablemente se requiere de sellos mecánicos para garantizar el trabajo aséptico. Generalmente la “aireación” se realiza a través de tubos (o placas) perforados, efectuándose la dispersión del aire en las zonas cercanas a los impulsores.

A pesar de su versatilidad, sus costos de construcción, operación y mantenimiento son muy onerosos. Por limitaciones técnicas referentes a la transmisión de potencia y a los problemas de sostenimiento del conjunto “flecha de transmisión – impulsores”, no es posible construir unidades mayores a los 300 m3.

Biorreactores de columna

Este tipo de biorreactores carece de sistema de transmisión mecánica para mezclar el caldo de cultivo. El mezclado se realiza por la inyección de aire en el líquido desde el fondo del recipiente, al dispersarse el aire en burbujas y al ascender causan la turbulencia del líquido. Generalmente la relación altura/diámetro es mayor a 3. Si las columnas son grandes se pueden emplear platos perforados colocados en posiciones intermedias de las mismas para “redispersar” las burbujas de gas.

Al carecer de partes “móviles” tanto la construcción, operación y mantenimiento de este tipo de biorreactores son más económicos que cualquier otro tipo. Quizá el mayor gasto de operación sea el de compresión de aire, en razón de los altos flujos requeridos. Generalmente se emplean para fermentaciones de baja viscosidad.

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Biorreactores de circulación

La denominación de esto tipo de reactores se debe al patrón de circulación definido del líquido en el reactor. Se clasifican en dos grandes grupos: de circulación externa o interna. Externa si el líquido es inducido a circular por un brazo lateral conectado al cuerpo principal del biorreactor en su parte inferior y superior, mientras que es interna si el líquido circula en forma definida sin salir del cuerpo principal del reactor. Los primeros solo se han empleado a nivel experimental, mientras que los segundos se han llegado a utilizar a nivel industrial, generalmente en el tratamiento de aguas residuales, alcanzando volúmenes de hasta 13,600 m3.

OBJETIVOS

Dado que uno de los aspectos formativos de los alumnos de la carrera de Ingeniería Biotecnológica se relaciona con el diseño, construcción, implementación, operación y mantenimiento de biorreactores industriales, en la presente práctica se propone como objetivo que el alumno identificará y describirá los diferentes tipos de biorreactores y sus partes accesorias. Así mismo, describirá de que forma se operan, se controlan, esterilizan, cargan y descargan, etc.

PROCEDIMIENTO

Para la sesión de introducción de esta práctica el alumno deberá haber consultado en todas las fuentes posibles el tipo de biorreactores que se emplean a nivel laboratorio, planta piloto e industrial.

Se mostrarán a los alumnos los diversos tipos de biorreactores de nivel laboratorio y planta piloto de la Unidad para el estudio de sus componentes.

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También se propone visitar la planta de tratamiento “Aguas de San Juan Ixhuatepec, S. U.”, o la planta de FERMIC, ambas ubicadas en la Ciudad de México.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El alumno realizará un informe detallado de los biorreactores presentados en el que deberá reportar los siguientes puntos:

Tipo de biorreactor. Capacidad. Características geométricas (incluyendo esquema del biorreactor). Sistema de carga y descarga. Sistema de agitación del líquido de reacción. Patrones de flujo. Sistema de aireación. Sistemas de control (incluyendo el sistema de enfriamiento). Método o forma de esterilización de: medios de cultivo, reactor (incluyendo su limpieza), aire, aditivos de fermentación (ácidos, álcalis, antiespumante, etc.). Métodos de Cultivo (Lote, Lote Alimentado o Cultivo Continuo) que se lleva a cabo en el biorreactor. Producción. Dispositivo de toma de muestra y de Inoculación.

BIBLIOGRAFÍA

1. Bull, D.N., Thoma, R.W., Stinnett, T.E. 1983. Bioreactors for submerged culture. Adv. Biotech. Process. 1: 1-30. 2. Charles, M. 1985. Fermentation scale-up: problems and possibilities. Trends in Biotech. 3: 80-84. 3. Schüegerl, K. 1982. New biorreactors for aerobic processes. Int. Chem. Eng. 22: 591-610. 4. Schüegerl,

K.

1985.

Nonmechanical

agitated

biorreactor

systems.

En:

Comprehensive Biotechnology, 2: 99-118. Ed. M. Moo-Young, Pergamon Press. 5. Sitting, W. 1983. Fermentation reactors. Chem. Tech. 13: 606-613. 6. Zlokarnik, M. 1985. Tower-shaped reactors for aerobic biological waste water treatment. En: Biotechnology. 2: 537-569. Edited by Rehm, H. J. y G. Reed.

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PRÁCTICA 2

Práctica 2. Instrumentación para el seguimiento y control de la biorreacción

Instrumentación para el seguimiento y control de la biorreacción

INTRODUCCIÓN

Los biorreactores están equipados con distintos instrumentos. Estos se utilizan para facilitar el registro y análisis de variables de operación y de parámetros específicos que sirven para mantener, dentro de ciertos intervalos de valores, las condiciones de operación de la biorreacción con fines de maximizar la productividad y garantizar el éxito de la biorreacción. La instrumentación ha sido definida como “una ventana al proceso” y su objetivo es mantener al mínimo la diferencia entre el valor medido y un valor deseado. El control de un parámetro particular se lleva a cabo a través de un sistema que consta de un sensor (o electrodo), un medidor y un controlador: el sensor es un dispositivo que transforma una magnitud de una propiedad que se quiere medir, en otra que facilita su medida. El medidor recibe la medida del valor de la propiedad que emite el sensor. El controlador compara dicha medida con un valor fijo. Del resultado de la comparación, el controlador toma una decisión enviando una señal (generalmente Vázquez Gurrola, Orozco Álvarez, Ordaz Contreras, García Salas

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eléctrica) a algún dispositivo que ajustará el valor medido de la propiedad hasta el valor predeterminado o de control (“set point”). La señal implica usualmente la modificación del estado de una válvula, el encendido o apagado de una bomba dosificadora, la modificación de la velocidad de giro de un motor de algún equipo, etc. Si, por ejemplo, se hace necesario el uso de una determinada fuerza para modificar el estado de una válvula, se requerirá de un “transductor” y de un “actuador”. El transductor es un dispositivo que convierte un tipo de energía en otro tipo de energía, mientras que los actuadores son dispositivos capaces de generar una fuerza a partir de energía eléctrica, gaseosa o líquida. Existen tres tipos de actuadores: 1. Hidráulicos 2. Neumáticos 3. Eléctricos

Los actuadores eléctricos son usados pera manejar aparatos electrónicos o mecatrónicos. Los hidráulicos se usan cuando lo que se necesita es potencia, mientras que los neumáticos son simples posicionamientos.

Los sensores pueden estar conectados directamente al biorreactor (en contacto directo con la masa líquida o sólida de fermentación), en cuyo caso se dice que están “en línea”, si no están conectados directamente al biorreactor entonces se dice que están “fuera de línea”.

Debido a la naturaleza de la biorreacción, se requiere que la gran mayoría de los “sensores en línea” reúnan, entre otros, los siguientes requisitos: i) que sean capaces de resistir el proceso térmico al que se somete el caldo de cultivo en el biorreactor (esterilización con calor húmedo); ii) que sean capaces de resistir las presiones de operación; iii) que sean de fácil calibración; iv) que muestren valores estables; v) que su mantenimiento sea fácil y económico y vi) que tengan una adecuada vida media útil. Estos sensores (en línea), se utilizan, básicamente, para medir propiedades físicas o variables de operación tales com temperatura, presión, intensidad de agitación o velocidad de giro de los impulsores, velocidades de flujo de líquidos y gases, y para

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medir ciertas propiedades químicas como pH, concentración de oxígeno disuelto y gaseoso, concentración de dióxido de carbono disuelto y en el gas, concentración de azúcares disueltos, concentración de algunos productos celulares, etc.

Para conocer el estado de una variable de operación o de un parámetro específico con sensores “fuera de línea”, se deberá tomar asépticamente una muestra para que en ella se mida la propiedad.

Por los tiempos y necesidades de los Bioprocesos, es fácil concluir que los sensores en línea son mucho más adecuados para controlar el valor de una propiedad en una biorreacción.

Entre las propiedades más comunes que se miden en un biorreactor están las siguientes:

1. Temperatura 2. pH 3. Flujo de aire 4. Presión 5. Intensidad de agitación 6. Nivel o Volumen de medio de cultivo 7. Espuma 8. Concentración de oxígeno disuelto 9. Concentración celular 10.Concentración de sustrato 11.Concentración de producto

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Medición y control de pH El pH es una medida de la actividad de los iones hidronio (H+) en una disolución acuosa y está definida por la siguiente ecuación: pH = - log10 [H+]

(1)

Para la medición y control del valor de pH, se utiliza un electrodo de vidrio colocado, en forma aséptica, en el biorreactor y que está directamente en contacto con el caldo de fermentación. El electrodo, normalmente esterilizable, se conecta directamente a un medidor-controlador de pH, con el cual se puede establecer el valor de control (Set Point) o ajustar el valor de la lectura que proporcione el electrodo de medición.

Un electrodo de pH consiste de dos celdas: un elemento sensor del pH y un elemento de referencia. El elemento sensor consiste de un alambre de plata cubierto con cloruro de plata inmerso en una solución buffer (usualmente de pH 7), en un tubo sellado que termina con un fino bulbo de vidrio sensible al pH. El elemento de referencia consiste de otro alambre de plata cubierto con cloruro de plata inmerso en una solución buffer saturada de cloruro de potasio y un diafragma poroso que comunica con la sustancia a la que se medirá el pH. Dicho electrodo comúnmente se construye como una sola unidad, con el sensor de referencia construido en una parte anular del elemento sensor, tal como puede apreciarse en la figura 1.

El método se fundamenta en la existencia de una diferencia de potencial entre las dos caras de la membrana de vidrio, expuestas a disoluciones acuosas que difieren en su valor de pH. A temperatura constante, la magnitud de esta diferencia de potencial es directamente proporcional a la diferencia de pH entre dichas disoluciones.

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Figura 1. Esquema de un electrodo de pH

Debido a que el electrodo de vidrio y los electrodos de referencia comerciales tienen un comportamiento imperfecto, es preciso calibrar el dispositivo de determinación del pH con dos disoluciones patrón antes de usarlos en los biorreactores. Para ello, se sumergen los electrodos sucesivamente en dos disoluciones patrón con valor conocido denominados P1 y P2, a la misma temperatura que la disolución problema y seleccionadas de forma que el valor de pH de la disolución problema esté comprendida entre los valores de pH P1 y P2.

Como el valor del pH del caldo de fermentación puede cambiar después de ser esterilizado, por causas del drástico tratamiento térmico, se recomienda recalibrar el electrodo. Para esto, se hace necesario tomar asépticamente una muestra del caldo de fermentación y medirle, con un medidor y un electrodo “fuera de línea”, su valor de pH. En caso de que el valor que muestre el electrodo “en línea” sea distinto del que marca el “fuera de línea”, se ajustará el valor de aquél con el equipo de medición empleado en el biorreactor. Vázquez Gurrola, Orozco Álvarez, Ordaz Contreras, García Salas

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Una vez realizado todo lo anterior, se está en posibilidades de medir y controlar el valor del pH de una biorreacción en un biorreactor. Si el valor medido del pH es diferente al valor del Set Point, entonces el controlador emitirá una señal eléctrica con la cual se podrá activar alguna bomba para adicionar “ácido” o “álcali”, dependiendo de la diferencia entre el valor medido y el Set Point.

En la figura 2 se puede observar la disposición de un sistema de medición y control del valor de una variable cualquiera de un caldo de cultivo contenido en un biorreactor.

ELEMENTO DE CONTROL

E = VM -VSP VSP

CONTROLADOR

COMPARADOR

BIORREACTOR MEDICION

VM

V

Figura 2. Diagrama de bloques de un sistema de control

Medición y control de temperatura

Aunque no existe un consenso para establecer cual de todas las variables de operación es la más importante de mantener y controlar en una biorreacción, la temperatura se cuenta entre las más importantes. El control, la medición precisa y adecuada de la temperatura resultan esenciales para la biorreacción. Un sistema de medición de la

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temperatura debe presentar una precisión menor a los 0.5 °C respecto a la temperatura de medición y en muchos casos, una variación de 1 a 1.5 °C durante la biorreacción, puede dar lugar a grandes pérdidas económicas en el bioproceso, por lo que se recomienda que la diferencia entre el valor medido y el de control se encuentre entre 0.5 y 1.5 °C. Generalmente, la temperatura en un bioproceso se mide con sensores RTD (resistance temperature devices) ya que estos son los que presentan las mejores características antes mencionadas. Consta de un elemento metálico cuya resistencia eléctrica cambia con la temperatura, hecho en el que se basa la medición de la misma. Generalmente se utiliza platino por sus mejores características lineales de cambio respecto a la temperatura, aunque también se utiliza níquel, cobre y aleaciones de níquel. Una desventaja es su precio moderamente alto.

La resistencia es medida con un dispositivo y convertida por un transductor a valores de temperatura (en °C o K). El valor medido de la temperatura es comparado con el de control y de la diferencia entre los valores, el controlador emitirá una señal que servirá para realizar una acción de control de la misma.

La acción puede consistir en hacer pasar agua de enfriamiento o vapor, a través de un serpentín inmerso en el caldo de biorreacción o a través de la “chaqueta” del biorreactor, para ajustar la temperatura al punto de control.

Para sensores RTD la relación entre la temperatura y la resistencia está descrita por la siguiente ecuación:

RT

R0

⎡ ⎛ T ⎞⎛ T ⎞⎤ = 1 + α ⎢T − σ ⎜ − 1⎟⎜ ⎟⎥ ⎝ 100 ⎠⎝ 100 ⎠⎦ ⎣

(2)

Ecuación en la que: RT = resistencia a la temperatura T [=] Ω

R0 = resistencia a 0°C [=] Ω

α = una constante (0.00382 – 0.00393 para Platino) Vázquez Gurrola, Orozco Álvarez, Ordaz Contreras, García Salas

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T = temperatura [=] °C σ = una constante (1.48 – 1.51 para Platino)

Dicha ecuación aplica para intervalos de temperatura comprendidos entre 0 y 630 °C.

Medición y control del oxígeno disuelto

El oxígeno disuelto es muy importante para el desarrollo de una biorreacción aeróbica, por lo que su medición y control es un parámetro importante para el desarrollo y producción económicamente rentable de bioproductos.

El oxígeno disuelto generalmente proviene del aire que es introducido en el fondo del caldo de biorreacción. Una parte del oxígeno contenido en el aire se disuelve en el caldo y otra parte sale tal cual con el aire agotado. El oxígeno disuelto es el que utilizarán los microorganismos para vivir y para realizar el proceso de transformación de la materia prima a producto. Por esta razón es importante distinguir entre “oxígeno disuelto” y “oxígeno en el gas”.

La medición del oxígeno disuelto se realiza de forma “amperométrica”, por la reducción del oxígeno en la superficie del cátodo y la formación de cloruro de plata en el ánodo. Una solución electrolítica une al ánodo estableciéndose un voltaje de polarización entre ellos. Cuando un fluido que contiene oxígeno disuelto se pone en contacto con el electrodo,

el

oxígeno

difunde

a

través

de

una

membrana

semipermeable

estableciéndose la siguiente reacción:

Cátodo:

O2 + 2H2O + 4e-

4OH-

Ánodo:

4Ag + 4Cl-

4AgCl + 4e-

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El resultado es una corriente eléctrica que es proporcional a la actividad del oxígeno disuelto o presión parcial de oxígeno disuelto.

En el comercio especializado existen distintos tipos de electrodos y de medidores controladores de oxígeno disuelto que los usuarios podrán elegir.

El control del oxígeno disuelto en una biorreacción ocurre a través de la modificación del flujo de gas (aire u oxígeno puro) o de la intensidad de agitación del caldo de cultivo.

Medición y control de espuma

Cuando en el caldo de cultivo existen compuestos orgánicos, como por ejemplo proteínas y carbohidratos, generalmente se forma espuma. Esto se favorece a altos flujos de aire y alta intensidad de agitación.

La formación de espuma es crítica en los biorreactores por muchas razones, las más destacadas son las siguientes:

1. Disminución del volumen del líquido en el interior del biorreactor si la espuma sale por el venteo o salida del gas agotado. 2. Contaminación microbiológica del bioproceso si la espuma alcanza a salir por el venteo o salida del gas agotado. 3. Disminución de la actividad biológica del bioproducto si posee propiedades tensoactivas y es sensible a fuerzas de torsión.

Por las razones anteriores, la medición y control de la espuma es imprescindible en los Bioprocesos.

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El control del volumen de la espuma se logra a través de un “rompedor mecánico” o mediante la adición controlada de un “antiespumante”. El rompedor de espuma es un impulsor, colocado generalmente por encima del caldo de cultivo, que gira a altas velocidades que al girar y estar en contacto con la espuma actúa en forma semejante a una centrífuga, impulsando a la fase pesada al fondo y dejando pasar la fase ligera (el gas). El antiespumante rompe la espuma cambiando la tensión superficial del caldo de cultivo.

La selección del sistema de control de espuma ocurrirá después de evaluar las características técnicas y económicas de ambos sistemas. Un rompedor mecánico requiere de energía adicional y de acciones costosas de mantenimiento preventivo y correctivo, mientras que los antiespumantes, son compuestos químicos extraños al sistema biológico de la biorreacción que potencialmente pueden llegar a contaminar el producto final, a pesar de que existan antiespumantes aprobados por instituciones internacionales.

A pesar de lo anterior, el sistema más comúnmente empleado para controlar la formación de espuma es usando antiespumantes. El control de espuma se basa en la conductividad eléctrica que presentan los medios de cultivo. Cuando la espuma asciende y hace contacto con el sensor, que es una varilla metálica colocada en la parte superior del biorreactor, cierra un circuito eléctrico que envía una señal a un controlador que acciona la bomba de adición de antiespumante. Una vez que la espuma se ha destruido, deja de hacer contacto con el sensor y la bomba deja de adicionar antiespumante.

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OBJETIVO

El alumno manejará los sistemas de medición y control de variables de operación de biorreactores de tanques agitados, a través de las determinaciones en línea de la temperatura, pH, oxígeno disuelto y espuma.

MATERIALES Y MÉTODOS

Equipo: Biorreactor tipo tanque agitado

Instrumentación. Sistema de medición y control de temperatura Sistema de medición y control de pH Sistema de medición y control de oxígeno disuelto Sistema de medición y control de espuma

El sistema de medición y control de temperatura consta de: 1. Sensor RTD 2. Cables 3. Medidor 4. Controlador 5. Recipiente de agua de enfriamiento con una resistencia eléctrica de inmersión 6. Bomba de agua de enfriamiento

El sistema de medición y control de pH consta de: 1. Electrodo de pH con su camisa presurizable y conectores para el biorreactor 2. Cables 3. Medidor

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4. Controlador 5. Bombas de adición de ácido o álcali

El sistema de medición y control de oxígeno disuelto consta de: 1. Electrodo polarográfico 2. Cables 3. Medidor 4. Controlador

El sistema de medición y control de espuma consta de: 1. Electrodo 2. Medidor 3. Controlador 4. Bomba de adición de antiespumante

Materiales

Tanque de nitrógeno puro con válvula de control de presión y de flujo. Vasos de precipitados de 250 mL, 500 mL y de 2000 mL. Probetas de 1000 mL. Mangueras de silicón para bombas peristálticas

Reactivos

Solución de NaOH 0.5N Solución de HCl 0.5N Antiespumante Mazu al 10% v/v en agua Solución proteica o un detergente

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PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Actividades previas 1. Medir las dimensiones de todas las partes del biorreactor. 2. Consultar los manuales de operación tanto del biorreactor como de los equipos de medición y control que se utilizarán. 3. Identificar, en el biorreactor, los sistemas de medición y control de temperatura, pH, oxígeno disuelto y espuma. 4. Llenar el biorreactor con agua de la llave o con una solución protéica o de detergente (su profesor se lo indicará). 5. Calibrar los electrodos de temperatura, pH y oxígeno disuelto. 6. Establecer las condiciones de operación (Todo lo anterior auxiliado por sus instructores).

Medición y control del pH

Establecer una velocidad de agitación del biorreactor siguiendo las indicaciones establecidas en el manual de operación del equipo. Encender el equipo de medición y control y verificar que el valor de pH que registra el mismo sea igual que el de la muestra tomada del biorreactor y medida fuera de línea. De no ser así, ajustar el equipo de acuerdo a las indicaciones del manual.

Ajustar el pH a un valor de 5 con una disolución de ácido clorhídrico 0.5 N. y establecer en el equipo un valor de Set Point de 5 (Consultar el manual del equipo).

El equipo de medición y control debe tener acoplado el sistema de adición de álcali que consta de una bomba peristáltica capaz de agregar al biorreactor una disolución de NaOH 0.5 N, de acuerdo a la señal del controlador.

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Agregar al biorreactor 10 mL de una disolución de ácido clorhídrico 0.5 N con objeto de simular una biorreacción acidogénica (disminuye el valor del pH conforme pasa el tiempo). Observe como el controlador enviará una señal a la bomba peristáltica para adicionar el álcali. La bomba dejará de funcionar (de adicionar álcali) cuando el pH alcance o sobrepase el valor del Set Point.

Repita el procedimiento hasta que quede comprendido el sistema de medición y control.

Medición y control de la temperatura

Agregue al biorreactor 10 litros de agua a temperatura ambiente (25°C) y establezca una velocidad de agitación de 300 rpm, ayudados por su instructor. Verifique que las válvulas del circuito de circulación del agua de enfriamiento a través de la chaqueta estén abiertas y encienda el equipo de medición y control de la temperatura que consta de los elementos ya descritos. Establezca en el controlador de temperatura un valor de Set Point de 33°C (ayudados por su instructor). Encienda la bomba de circulación del agua y espere hasta que la temperatura en el interior del biorreactor alcance la temperatura del Set Point.

Medición del oxígeno disuelto

Agregue al biorreactor 10 litros de agua a temperatura ambiente (25°C) y establezca una velocidad de agitación de 300 rpm, ayudados por su instructor. Establezca un flujo de aire a un valor de 0.5 vvm (verifíquelo en el rotámetro). Encienda el equipo de medición de oxígeno disuelto y espere unos 15 minutos hasta que la lectura permanezca estable. Con este valor, establezca en el equipo el 100% del valor de saturación.

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Ayudados por sus instructores, conecte un tanque de nitrógeno puro al sistema de introducción de aire del biorreactor y haga pasar un valor de flujo de nitrógeno tal que no sobrepase los 0.75 vvm totales (verifíquelo en el rotámetro), con objeto de disminuir la presión parcial de oxígeno en el aire. Esto provocará que la concentración de oxígeno disuelto sea menor que cuando se burbujea aire solamente.

Observe como el oxígeno disuelto baja en el equipo de medición.

Ahora cierre completamente el flujo de nitrógeno y observe como el valor de oxígeno disuelto volverá a su valor normal (100% del de saturación).

Medición y control de la espuma

Agregue al biorreactor 10 litros de agua con un 2% de detergente (o de ser posible una disolución protéica) a temperatura ambiente (25°C) y establezca una velocidad de agitación de 250 rpm, ayudados por su instructor y un flujo de aire de 0.15 vvm (verifíquelo en el rotámetro).

A esta velocidad observe si se forma espuma. Incremente la velocidad de agitación en intervalos de 50 rpm, hasta llegar a 400. Mantenga las diferentes velocidades durante 10 minutos y observe lo que ocurre con la formación de espuma (debe incrementarse su velocidad de formación) y anote sus observaciones. Estando a 400 rpm, incremente el flujo de aire hasta un valor de 0.75 vvm, observe y anote lo que pasa con la formación de espuma.

Conecte el sistema de control de espuma. La bomba peristáltica de adición de antiespumante debe estar conectada y la manguera debe estar inmersa en una solución de antiespumante Mazu al 10% en agua.

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Elija una velocidad de agitación y un flujo de aire que tengan la más alta formación de espuma, con objeto de que el controlador envíe la señal de adición de antiespumante. Anote y discuta sus observaciones.

RESULTADOS Y MANEJO DE DATOS

Elabore diagramas (en autocad) en los que se observen los sistemas de medición y control de pH, temperatura, oxígeno disuelto y espuma en un biorreactor.

Elabore un reporte por equipo en los que establezca sus conclusiones respecto a las necesidades de instrumentación y control en las biorreacciones.

BIBLIOGRAFÍA

1. Aiba, S., Humphrey, A.E., Millis N.F. 1973. Biochemical engineering, 2nd. Edition Academic. 2. Harper, E.H. 2000. El ABC de la instrumentación en el control de procesos industriales. Limusa. 1ª Edición. México. 3. Lydersen, B.K., D'Elia N. A., Kim, L. N. 1994. Bioprocess engineering: systems, equipment and facilities. John Wiley and Sons, Inc., USA. 4. Wang, D.I.C., Cooney, C.L., Demain, A.L., Dunill, P., Humphrey, A.E., Lilly, M.D. 1978. Fermentation and enzyme technology. John Wiley and Sons.

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PRÁCTICA 3

Práctica 3. Servicios Auxiliares

Servicios Auxiliares

INTRODUCCIÓN

Los servicios auxiliares necesarios en la operación de un biorreactor incluyen aire comprimido, diversos gases comprimidos (nitrógeno, oxígeno, etc.), agua de enfriamiento (agua helada y agua de torre), agua para servicios varios, vapor de planta y energía eléctrica.

Aire:

El aire tiene varios usos en un biorreactor, entre ellos por orden de importancia mencionaremos: 1. Proveer oxígeno al medio de cultivo. 2. Como fuerza motriz para la transferencia de momento y masa. 3. Como fuerza motriz para transferir líquidos de un recipiente a otro. Vázquez Gurrola, Orozco Álvarez, Ordaz Contreras, García Salas

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4. Para accionar instrumentación de control de tipo neumático. 5. Como medio de enfriamiento para los recipientes después de la esterilización.

La elección del tipo de aire a utilizar dependerá del uso que se haga de él. El aire debe ser seco y libre de aceite. Además, cuando se requiera que el proceso o producto no se afecte por la introducción de microorganismos ajenos, contenidos en la corriente de aire, será necesario que éste sea estéril.

En la actualidad, para la esterilización del aire que se introducirá al biorreactor se utilizan prefiltros y filtros absolutos. Los prefiltros son casi obligatorios para compresores lubricados con aceite, para eliminar partículas de este lubricante, sin embargo, actualmente los compresores libres de aceite van ganando terreno, por lo que en estos casos los prefiltros sirven para aumentar la eficiencia y la vida media de servicio de los filtros absolutos. Estos últimos deberán tener un 100% de retención de partículas de hasta 0.01 µm en el aire de servicio. Los filtros constan de dos elementos principales: el cartucho que contiene el elemento filtrante y la camisa en la que se coloca el cartucho. En el comercio especializado, se encuentran varios tipos de filtros absolutos. Algunos de los materiales utilizados para los cartuchos son: ésteres de celulosa, polisulfonas, fluoruro de polivinilo y politetrafluoroetileno, mientras que el material más utilizado para la camisa es el acero inoxidable (304, 316 o 316L) con mecanismos de sellado rápido y hermético. El diámetro de los cartuchos es de 2½” a 2¾”, con longitudes variables que van desde 10” (0.25 m) hasta 40” (1m). Se recomienda que los filtros a emplear en los biorreactores sean del tipo de membrana hidrofóbica. La naturaleza hidrofóbica (que repele el agua) de estas membranas pueden alcanzar 100% de remoción de bacterias y bacteriófagos en condiciones de operación húmedas o secas. La esterilización de los filtros se realiza con vapor saturado que circula en el sentido de la introducción del aire al biorreactor.

Los sistemas de compresión de aire constan de los siguientes componentes: compresor, filtro de admisión de aire, sistema de enfriamiento (si lo tiene), depósito de

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almacenamiento y sistema de control de presión. En varios puntos del sistema de distribución se deben colocar trampas o purgas para eliminar condensados.

Los compresores de aire para plantas biotecnológicas son generalmente de dos tipos: rotatorios y reciprocantes de accionamiento positivo. También existen los compresores de tipo centrífugo para grandes volúmenes de aire a bajas presiones. El aire es tomado directamente de la atmósfera. Independientemente del tipo, preferentemente deberán ser especificados como libres de aceite.

La tubería de distribución puede ser especificada en diferentes materiales dependiendo del servicio: desde acero al carbón para aire de equipos y motores hasta acero inoxidable 304 ó 316 acabado sanitario para el aire proveniente del filtro absoluto hacia el punto de suministro al biorreactor o para líneas de distribución instaladas en un cuarto limpio.

Además del aire comprimido algunos gases comprimidos también tienen aplicaciones en biorreactores. Los más comunes son nitrógeno y oxígeno puros: el nitrógeno para la formación de atmósferas inertes, mientras que el oxígeno se usa para enriquecer el aire y alcanzar una mayor velocidad de transferencia de oxígeno en el biorreactor. Estos gases son generalmente suministrados en cilindros a una presión mayor que la atmosférica de tal manera que se pueden transportar al lugar de uso. La tubería de distribución y suministro debe cumplir con las mismas características que la del aire.

Vapor:

El vapor de planta es utilizado como el medio principal de calentamiento en miles de industrias, y para la generación de energía eléctrica como uso secundario. Además, el vapor limpio o puro se utiliza en el procesamiento de alimentos y medicinas, en la esterilización de productos y equipos, etc.

Su uso generalizado se debe a las

siguientes razones:

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1. La generación de vapor es una de las formas más económicas de generación de energía. 2. El vapor puede controlarse de manera relativamente sencilla debido a que circula de una zona de alta presión a una de menor presión sin necesidad de otro equipo. 3. El vapor es fácil de producir ya que se obtiene del agua que además puede ser reutilizable.

Un generador de vapor o caldera es aquel equipo que transforma el agua en vapor aprovechando el calor generado por la combustión de un material combustible, teniendo como característica principal que es un recipiente cerrado sujeto a una presión mayor a la atmosférica.

Existen dos tipos de generadores de vapor:

1. Generadores de Tubos de Agua.- En éstos el agua circula al interior de una serie de tubos (serpentín), mientras que el calor se transfiere de la cámara de combustión hacia el interior de los tubos, así el agua contenida dentro de los tubos comienza a elevar su temperatura hasta evaporarse. Este es el tipo más común y con el que cuenta la UPIBI. 2. Generadores de Tubos de Humo.- En forma totalmente opuesta, en este tipo de generadores los gases de combustión circulan por los tubos, mientras que el agua se encuentra almacenada en la cámara exterior. Así el calor se transfiere del interior de los tubos hacia el agua almacenada alrededor de éstos.

La capacidad de un generador de vapor se mide bajo un estándar internacional llamado Caballo Caldera el cual es equivalente a generar 15.65 kg/h de vapor con una temperatura de 100 ºC a presión atmosférica y que es alimentado con agua a 100 ºC. Otra definición nos dice que con estos 15.65 kg/h de vapor es posible obtener 8,430 kcal/h de calor aprovechable en un proceso. Así un generador de vapor que tenga una capacidad de 100 caballos caldera será capaz de generar 1565 kg/h de vapor.

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Las calderas generalmente vienen como paquetes en tamaños estandarizados que incluyen: 1. El tanque de condensados que se instala generalmente 2 m arriba de la bomba de alimentación de agua al generador. 2. La bomba de agua que envía el agua a presión hacia el serpentín del generador. 3. El generador de vapor de tubos de agua por donde circulan en sentido contrario el agua y los gases de combustión, de tal manera que a medida que el agua avanza en su recorrido encuentra temperaturas más altas, por lo que incrementa su temperatura hasta convertirse en vapor. Los componentes básicos del generador son: o Serpentín o Quemador-ventilador o Cámara de combustión 4. El separador de vapor en donde por medios mecánicos se provoca el desprendimiento de pequeñas partículas de agua (humedad) que arrastra el vapor. 5. La trampa de vapor que desaloja los condensados removidos del vapor y los envía de regreso al tanque de condensados para repetir nuevamente el ciclo. 6. Sistema de control y de seguridad, entre los que destacan: válvulas de alivio y de seguridad, manómetros, control principal de temperatura con termopar, interruptores del termostato, interruptor de presión de vapor e interruptor del nivel de aceite.

El agua que entra a una caldera requiere de un acondicionamiento previo (ver tabla 1) para proteger los equipos contra la incrustación, la corrosión y otras complicaciones. Por eso es necesario acoplar a ésta un sistema de acondicionamiento previo del agua que generalmente incluye un suavizador y un tanque de salmuera.

El suavizador consiste en una columna empacada con una resina catiónica depositada sobre un lecho de grava que le sirve de soporte y a la vez de filtro. En la resina se lleva a cabo el intercambio de los iones calcio y magnesio que son los responsables de la dureza del agua por iones sodio que contiene la resina. El tanque de salmuera tiene

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como función regenerar la resina a fin de que recupere su capacidad de intercambio iónico.

Tabla 1. Características del agua de alimentación a una caldera. Dureza

cero

Oxígeno disuelto, CO2

cero

Sulfitos

50 – 100 ppm

pH

10.5 a 11.5

Sólidos en suspensión

cero

Sólidos disueltos

< 6000 ppm

El sistema de distribución de vapor se realiza por medio de tuberías, generalmente de acero al carbón cédula 40, cuidando que las velocidades y caídas de presión estén comprendidas en los intervalos recomendados para el dimensionamiento de las mismas. El vapor puro requerirá de tuberías de acero inoxidable con acabado sanitario.

En adición al sistema de distribución de vapor deberán preverse los sistemas de manejo de condensados, ya que éstos pueden reutilizarse con un importante ahorro en el acondicionamiento del agua de alimentación a la caldera y en la energía requerida para el calentamiento de la misma hasta el punto de ebullición.

Agua de enfriamiento:

El agua como servicio auxiliar se utiliza como fluido de enfriamiento para el control de la temperatura del caldo de fermentación en los biorreactores. Esta agua, a diferencia del agua de proceso, nunca entra en contacto con las materias primas o productos de la Vázquez Gurrola, Orozco Álvarez, Ordaz Contreras, García Salas

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biorreacción, ni con las superficies en contacto con éstos; sino que circula a través de las chaquetas o serpentines según el diseño del biorreactor.

En la práctica el agua es un servicio escaso y es necesario recircularla, enfriarla y reutilizarla. Dependiendo de la temperatura requerida para el agua de enfriamiento ésta puede ser: o Agua de torre.- Con una temperatura de entre 10 °C y 25 °C dependiendo del diseño de la torre y de las condiciones ambientales del lugar. Los equipos más utilizados en la industria biotecnológica por su tamaño compacto son las torres de enfriamiento por evaporación. Otros sistemas para mayores capacidades son las torres atmosféricas y los estanques de enfriamiento, los cuales requieren grandes espacios para su instalación. El agua de torre es susceptible de degradación debido al crecimiento de organismos o bien al aumento en

la

concentración de sales que favorecen la incrustación. Por lo tanto las torres de enfriamiento requieren un mantenimiento constante que implica: tratamiento con algunos químicos para impedir la incrustación de sales, cloración para impedir la formación de microorganismos y purgas frecuentes para impedir la acumulación de sólidos.

o Agua helada.- Con una temperatura de entre 5°C y 10 °C: Los componentes principales de un sistema de agua helada son los mismos que los de un ciclo de refrigeración: el compresor, el condensador, la válvula de expansión, el evaporador, la bomba de recirculación, y el tanque de expansión. El evaporador es simplemente un intercambiador de calor donde el refrigerante se vaporiza a expensas de la energía que toma del agua, que como resultado de este proceso se enfría. Esta agua helada se dirige a los puntos donde se necesita y de ahí se retorna al evaporador por medio de la bomba de recirculación. Por otro lado el gas refrigerante se comprime, se enfría en el condensador y se dirige nuevamente al evaporador pasando por una válvula de expansión donde se vaporiza parcialmente disminuyendo aún más su temperatura.

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Para dimensionar un sistema de enfriamiento será necesario conocer la demanda de agua (flujo) y el intervalo de temperaturas entre el agua que sale hacia el proceso y la que regresa al sistema. Las tuberías de transporte y suministro del agua de enfriamiento son por lo general de acero al carbón y cobre en un diámetro adecuado para los flujos que se manejen.

Agua para servicios varios:

Este tipo de agua se utiliza para las operaciones de lavado y limpieza del biorreactor y del área de proceso. Esta agua puede ser potable, debe estar libre de sedimentos, pero no requiere ningún tratamiento adicional.

Energía eléctrica:

La instalación eléctrica tiene como propósito proporcionar la energía para accionar bombas, compresores, motores eléctricos y otros equipos mecánicos, instrumentos, tableros de control y alumbrado. El sistema se debe adecuar para entregar en el punto que se requiera la energía necesaria sin causar sobrecalentamiento o cambios de voltaje innecesarios.

Esto se logra a través de líneas de alambrado que unen el generador con el punto donde se necesita la energía conectando todos los componentes y que se dividen en secciones según el servicio y el área dando lugar a los circuitos.

El sistema eléctrico básico está constituido por la fuente, el equipo de transformación, los dispositivos de protección, las líneas de distribución y los puntos de uso.

Voltajes de distribución.- La energía comprada o generada se suministra a voltajes muy altos y para usarse en la planta debe ser reducida al voltaje de utilización, para

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esto se requiere el uso de subestaciones reductoras o transformadores. El voltaje de operación recomendado por los fabricantes de motores y demás equipo eléctrico aparece en la placa o en las instrucciones de operación de dicho equipo. La especificación

típica

para

motores

eléctricos

y

demás

equipos

accionados

eléctricamente es de 120 V, 240 V y en algunos casos hasta 480 V, los instrumentos generalmente necesitan voltajes de 12-24 V.

Corriente.- La corriente puede ser de dos tipos: la corriente alterna (AC) que es periódica con pequeñas oscilaciones, desde un valor máximo en un sentido hasta el mismo valor pero en sentido contrario, de tal manera que su intensidad media es nula; y la corriente continua o directa (DC ó CC) que proporciona un valor constante todo el tiempo, como la producida por dínamos, pilas y acumuladores.

Dispositivos de Protección.- Los circuitos y equipos deben ser protegidos por dispositivos que abran los circuitos para que la corriente no fluya en condiciones de sobrecarga o falla. Esto se hace por medio de interruptores. Mediante los transformadores se obtienen voltajes reducidos que alimentan los diferentes circuitos, cada uno de los cuales debe tener su interruptor de desconexión.

Equipo eléctrico para áreas peligrosas.- Cuando las materias primas o productos de la biorreacción son potencialmente peligrosos, es decir que emiten a la atmósfera grandes cantidades de partículas muy pequeñas que pueden penetrar hacia los circuitos eléctricos e iniciar una chispa (p.ej. polvos, solventes, etc), tanto el equipo eléctrico como los transformadores, mecanismos de distribución y motores deben ser especificados a prueba de explosión.

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Conductores.- Del punto de suministro al punto de utilización (equipo, compresores, bombas, etc.) la corriente eléctrica se distribuye por medio de conductores que pueden ser alambres, cordones o cables, los cuales pueden ser vistos como las arterias y venas por donde viaja la corriente. o Hilo o alambre: Es un conductor constituido por un único alambre macizo, generalmente de cobre. o Cordón: Es un conductor constituido por varios hilos unidos eléctricamente enrrollados helicoidalmente alrededor de uno o varios hilos centrales. o Cable: Es un conductor formado por uno o varios hilos o cordones aislados eléctricamente entre sí. Según el número hilos o cordones que lleva un cable se denomina unipolar, bipolar, tripolar, etc. Los cables son canalizados en las instalaciones dentro de tuberías metálicas o canales para protegerlos de agentes externos como la humedad, la corrosión los golpes, etc., que se sujetan al techo o paredes por medio de soportes. En algunos lugares se entierran dichas tuberías bajo el piso, aunque esto lo hace de difícil acceso y mantenimiento.

OBJETIVOS

El alumno identificará los servicios auxiliares necesarios para la operación de un biorreactor, describirá sus componentes y explicará su funcionamiento.

PROCEDIMIENTO

Para la sesión de introducción de esta práctica el alumno buscará, en todas las fuentes posibles, información sobre los tipos de sistemas de compresión de aire, generación de

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vapor y agua de enfriamiento que se emplean en la industria biotecnológica. También investigará los elementos básicos de una instalación eléctrica industrial.

Para la sesión experimental: 1.

Se mostrará a los alumnos el cuarto de calderas, se les pedirá que identifiquen todos sus componentes y que elaboren el diagrama de flujo de este sistema.

2.

Se mostrará a los alumnos los diversos compresores con que cuenta la planta piloto y los laboratorios, se les pedirá que identifiquen y describan sus componentes y los clasifiquen de acuerdo con los tipos encontrados en la literatura.

3.

El profesor y el técnico a cargo describirán los procedimientos de arranque y paro de la caldera y los compresores, así como una breve descripción de su funcionamiento.

4.

Los alumnos identificarán las líneas de agua, vapor, aire y electricidad de la planta piloto, observando su ruta y registrando sus características: (materiales, aislamiento, diámetros, color, etc.), se hará lo mismo en el laboratorio de biorreactores indicando la clasificación de colores en caso que la haya.

Los

alumnos realizarán un esquema tipo lay-out de la planta piloto indicando las rutas de estos servicios hasta los biorreactores que se utilizarán en prácticas posteriores. 5.

Se mostrará a los alumnos el biorreactor New Brunswick Scientific para que identifiquen en éste las líneas de suministro de agua, aire, vapor y condensados, así como sus accesorios (filtros, trampas de vapor, reguladores de presión, válvulas, etc.). Se hará especial énfasis en los filtros para aire y vapor, y en el sistema de esterilización para las líneas de agua y aire. Los alumnos observarán el cambio de materiales en las tuberías de entrada al biorreactor.

En cada actividad los alumnos deberán anotar sus observaciones en la bitácora, acompañándolas de esquemas, dibujos, etc.

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RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El alumno realizará un informe de las actividades desarrolladas que deberá contener los siguientes puntos: Introducción, objetivo, tipo y descripción de caldera, tipo y descripción de compresores, diagrama de flujo de servicios, diagrama de ruta de servicios, observaciones sobre cada una de las actividades realizadas, conclusiones generales sobre el desarrollo de la práctica y bibliografía.

BIBLIOGRAFÍA

1. Clayton, A. 2000. Curso de operación y mantenimiento preventivo a generadores de vapor. 2. Lydersen, B.K., D'Elia N. A., Kim, L. N. 1994. Bioprocess engineering: systems, equipment and facilities. John Wiley and Sons, Inc., USA. 3. Perry, R.H., Green, D.W. 2004. Manual del Ingeniero Químico. McGraw-Hill. 4. Rase, H.F., Barrow, M.H. 1981. Ingeniería de proyectos para plantas de proceso. CECSA.

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PRÁCTICA 4

Práctica 4. Tiempo de mezclado en biorreactores

Tiempo de mezclado en biorreactores

INTRODUCCIÓN

Tanque agitado

La agitación y aireación en un biorreactor se realiza para alcanzar los siguientes propósitos: 1. Suministrar el oxígeno necesario a los microorganismos para que se realicen apropiadamente sus actividades metabólicas. 2. Mantener en suspensión a los microorganismos.

En los biorreactores de tanque agitado, la agitación del caldo de cultivo se lleva a cabo mediante las dos formas siguientes: 1. Por el movimiento de dispositivos mecánicos tales como impulsores de tipo turbina o de propelas.

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2. Por el movimiento ascendente de burbujas de aire.

Por lo tanto, la intensidad de agitación depende de la velocidad de movimiento de los impulsores y de la velocidad de aireación.

La agitación puede describirse mediante el tiempo de mezclado, el cual se define como el tiempo que transcurre después de la adición de un

trazador para alcanzar un

determinado grado de homogeneidad, generalmente del 95%, del líquido contenido en el biorreactor.

Un mezclado insuficiente puede causar regiones en las que haya altas concentraciones de inhibidores de crecimiento, deficiencia de oxígeno o de algún otro nutriente, gradientes importantes de temperatura y pH, que se pueden reflejar en lo obtención de bajas productividades y bajos rendimientos. Por ello, es importante estudiar el efecto de las variables de operación sobre el grado de mezclado que se pueda alcanzar en el biorreactor.

Columna

En los biorreactores de columna la agitación del caldo de cultivo se lleva a cabo mediante el movimiento ascendente de las burbujas de aire. El número y tamaño de las burbujas de aire dependen de la velocidad de aireación, de las propiedades físicas del caldo de cultivo, del tipo de dispersor, de la altura de la columna y de la presencia de dispersores colocados a lo largo de la columna. Un aumento en la velocidad de aireación, aumentará la fracción de gas retenido y las velocidades locales del líquido. Junto con esto, se hacen más pronunciados los perfiles parabólicos de la fracción de gas retenido a través de la sección transversal de la columna con su máximo en el centro.

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El elemento estructural a través del cual tiene lugar la dispersión del gas se llama dispositivo de dispersión primaria. El gas dispersado inicialmente puede ser redispersado. Esto se lleva a cabo por dispositivos de dispersión secundaria. En las columnas de burbujas de una etapa y en las columnas de burbujas multietapa, el aire se introduce a través de dispositivo de dispersión primaria, tal como un tubo perforado, un plato perforado o un plato sinterizado, en donde es dispersado finamente. También, las burbujas de aire que aumentan de tamaño debido a la coalescencia pueden ser redispersadas al pasar a través de dispositivos de dispersión secundaria, tales como mallas o bandejas perforadas colocados a lo largo de la columna. En los biorreactores de columna de burbujas multietapa, la dispersión de aire se lleva a cabo predominantemente en los dispositivos de dispersión primaria

Airlift

Los biorreactores airlift tienen forma de columna o torre, en su interior tienen al menos dos zonas, una de flujo ascendente y otra de flujo descendente. El movimiento del líquido se debe a que en dichas zonas la densidad de la dispersión gas-líquido es diferente porque hay mayor cantidad de aire en la zona de flujo ascendente que en la de flujo descendente. La diferencia de las fracciones de gas retenido, es una medida de la diferencia de densidades entre las dispersiones gas-líquido en dichas zonas, la cual es la fuerza motriz para la circulación del líquido en el biorreactor.

Debido al movimiento del líquido, las burbujas de gas en la zona de flujo ascendente subirán más rápido, disminuyendo la fracción de gas retenido y la diferencia de presión hidrostática. En contraste con las condiciones de una columna de burbujas, los biorreactores airlift se caracterizan por tener fracciones de gas retenido menores y por una distribución más uniforme de la fase gaseosa a través de la sección transversal de la zona de flujo ascendente, con un máximo de la fracción de gas retenido local cerca de la pared de la zona de flujo ascendente. También, en contraste con las columnas de burbujas, los airlift muestran velocidades de líquido mucho más altas. La velocidad del

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líquido afecta decisivamente todos los parámetros que caracterizan el desempeño del biorreactor, tales como la fracción de gas retenido, el tiempo de mezclado y el desempeño en cuanto a transferencia de masa y calor. En general, la velocidad del líquido en los biorreactores airlift se determina por la velocidad de aireación, la geometría del biorreactor y las propiedades físicas de la fase líquida.

El mezclado del líquido es predominantemente producido por la circulación del líquido y en menor grado por la dispersión axial debida al ascenso de las burbujas de aire. El mezclado ocurre predominantemente en las zonas de deflexión superior e inferior, debido a las diferencias de velocidad ahí existentes. Para una geometría definida, la rapidez del mezclado puede expresarse en términos del tiempo de circulación, el cual se define como el tiempo requerido para que el líquido circule una vez dentro del biorreactor. Por ello, el conocimiento del tiempo de circulación y de los factores que lo afectan es necesario para el diseño, modelado y operación de un biorreactor airlift.

OBJETIVOS

Tanque agitado El alumno determinará el tiempo de mezclado en un biorreactor de tanque agitado bajo diferentes condiciones de aireación y agitación.

Columna El alumno determinará el tiempo de mezclado en un biorreactor de columna de burbujas bajo diferentes condiciones de aireación, utilizando dos diferentes tipos de dispersores.

Airlift El alumno determinará el tiempo de circulación, el tiempo de mezclado y las fracciones de gas retenido global, en la zona de flujo ascendente y en la zona de flujo descendente en un biorreactor airlift bajo diferentes condiciones de aireación.

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MATERIALES Y MÉTODOS

Biorreactores 1. Biorreactor de tanque agitado. 2. Biorreactor de columna de burbujas 3. Biorreactor airlift

Instrumentacion 1. Cronómetros. 2. Rotámetros. 3. Manómetros. 4. Termómetros. 5. Medidor de pH con adquisición de datos en línea. 6. Computadora y software para la adquisición de datos en línea.

Reactivos 1. Solución de NaOH 6N. 2. Solución de HCl 6N. 3. Solución de azul de bromocresol. 4. Soluciones reguladoras de pH, de 4 y 9.

Determinación del tiempo de mezclado en los biorreactores:

Tanque agitado y columna El método que se utilizará es del de adición de trazadores tales como ácidos y bases.

Airlift a) Determinación del tiempo de circulación y del tiempo de mezcla

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El método que se utilizará es el de adición de trazadores tales como ácidos y bases. b) Determinación de la fracción de gas retenido local Utilizando el método manométrico. c) Determinación de la fracción de gas retenido global Midiendo el volumen del líquido aireado y el volumen del líquido sin airear.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Actividades previas 1. Medir las dimensiones de todas las partes del biorreactor. 2. Llenar el biorreactor con agua de la llave. 3. Agregar al biorreactor 0.2 ml de la solución de indicador. 4. Una vez conectado el sistema de medición de pH a la computadora, calibrar el electrodo y colocarlo en el biorreactor.

Condiciones de operación

Tanque agitado o Las velocidades de agitación serán: 300, 500 y 700 rpm. o Para cada velocidad de agitación, se probarán las siguientes velocidades de aireación: 0.3, 0.6, 1.0, 1.3, 1.6 vvm.

Columna o Velocidades de aireación: 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 y 2.5 vvm o Tipos de dispersores: tubo perforado y plato poroso.

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Airlift o Velocidades de aireación: 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 y 2.5 vvm o Tipos de tubos de arrastre: 2 diámetros diferentes.

Medición del tiempo de mezclado Método de adición de pulsos. 1. La adición de pulsos se realizará a través de la boquilla inferior de los biorreactores. 2. Al momento de adicionar un pulso de ácido o base, registrar el tiempo que transcurre hasta lo obtención de la homogenización del color del líquido en el biorreactor. Simultáneamente a la adición del pulso, ejecutar el programa de adquisición de datos de pH de manera que registre el valor de pH cada 0.16 seg. 3. Ajustar el pH a un valor entre 8.5 y 9.0. 4. Adicionar 1 mL de la solución de HCl 6N, el indicador virará a azul. 5. Adicionar 1 mL de la solución de NaOH 6N, el indicador virará a amarillo. 6. Medir el nivel del líquido aireado. 7. Cambiar las condiciones de operación y una vez alcanzado el estado estacionario, de nuevo agregar pulsos y medir el nivel del líquido aireado.

Medición de la fracción de gas retenido local para el biorreactor airlift

1. Medir la diferencia de alturas del agua contenida en los manómetros de presión diferencial de cada zona del biorreactor. 2. Medir la distancia entre las tomas de presión estática de la zona de flujo ascendente y las de la zona de flujo descendente.

Medición de la fracción de gas retenido global 1. Medir el nivel del líquido sin airear en el biorreactor. 2. Medir el nivel del líquido aireado para cada condición de operación.

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RESULTADOS Y MANEJO DE DATOS

Tanque agitado 1. Elaborar gráficas de pH en función del tiempo. 2. Calcular el tiempo de mezclado. 3. Construir gráficas del tiempo de mezcla en función de la velocidad de aireación (expresada como vvm y vs). 4. Calcular la potencia de agitación sin aireación y con aireación. 5. Calcular la potencia de aireación. 6. Obtener las correlaciones matemáticas de las relaciones del tiempo de mezclado con las variables de operación empleadas.

Columna 1. Elaborar gráficas de pH en función del tiempo. 2. Calcular el tiempo de mezclado. 3. Construir gráficas del tiempo de mezcla en función de la velocidad de aireación (expresada como vvm y vs). 4. Calcular la potencia de aireación. 5. Obtener las correlaciones matemáticas de las relaciones del tiempo de mezclado con la velocidad de aireación (expresada como vvm y vs).

Airlift 1. Elaborar gráficas de pH en función del tiempo. 2. Calcular el tiempo de circulación y el tiempo de mezclado. 3. Construir gráficas del tiempo de circulación en función de la velocidad de aireación (expresada como vvm y vs) y del 4. Elaborar gráficas de tiempo de mezclado en función de la velocidad de aireación (expresada como vvm y vs) para cada tipo de tubo de arrastre. 5. Calcular las fracciones de gas retenido en la zona de flujo ascendente y en la zona de flujo descendente. 6. Calcular la fracción de gas retenido global.

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7. Calcular la potencia de aireación. 8. Construir gráficas del tiempo de circulación en función de las fracciones de gas retenido y del tiempo de mezclado en función de las fracciones de gas retenido. 9. Obtener las correlaciones matemáticas de las relaciones del tiempo de mezclado con la velocidad de aireación (expresada como vvm y vs).

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

Tanque agitado y columna La discusión deberá incluir al menos lo siguiente: 1. Comparación de los tiempos de mezclado obtenidos en cada condición de operación. 2. Comparación de las potencias de aireación y de agitación. 3. Comentarios sobre el aspecto de la dispersión gas-líquido.

Airlift La discusión deberá incluir al menos lo siguiente: 1. Comparación de los tiempos de circulación y de mezclado obtenidos en cada velocidad de aireación. 2. Comparación de las fracciones de gas retenido. 3. Comentarios sobre el aspecto de la dispersión gas-líquido. 4. Investigación sobre la relación de diámetros entre el tubo de arrastre y el del biorreactor que ofrece la mínima resistencia al flujo.

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BIBLIOGRAFÍA

Tanque agitado 1. Aiba, S., Humphrey A.E., Millis, N.F. 1973. Biochemical engineering, 2nd. Edition Academic. 2. Hicks, R.W., Gates, L.E. 1976. How to select turbine agitators for dispersing gas into liquids. Chem. Eng. July 19: 141-148. 3. Moser, A. 1988. Bioprocess technology. Kinetics and reactors. Ed. Springer - Verlag. 4. Wang, D.I. C., Cooney, C L., Demain, A.L., Dunill, P., Humphrey, A.E., Lilly, M.D. 1978. Fermentation and enzyme technology. John Wiley and Sons.

Columna 1. Miyahara, T., Matsuba, Y., Takahashi, T. 1983. The size of bubbles generated from perforated plates. Int. Chem. Engng. 23. 3: 517-523. 2. Schüegerl, K. 1982. New bioreactors for aerobic processes. Int. Chem. Engng. 22. 4: 591-610. 3. Schüegerl, K., Lucke, J., Oels, U. 1980. Bubble column biorreactors. Adv. In Biochem. Engng. 45. 7: 1-84.

Airlift 1. Blenke, H. 1985. Biochemical loop reactors. Biotechnology 2, Ed. by Rehm, H. J., y G. Reed. 2. Joep, J.M. 1988. Gas hold up measurements in bioreactors. Trends in Biotechnology. 6: 19-22. 3. Weiland, P., Onken, V. 1981. Differences in the behaviour of bubble columns and airlift loop reactors. Ger. Chem. Eng. 4: 174-181.

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PRÁCTICA 5

Práctica 5. Transferencia de oxígeno en biorreactores agitados y neumáticos

Transferencia de oxígeno en biorreactores agitados y neumáticos

INTRODUCCIÓN

Tanque agitado

Las conversiones microbianas aeróbicas son reacciones de oxidación que requieren oxígeno molecular disuelto. Una gran diferencia del oxígeno con respecto a otros nutrientes, es su extremadamente baja solubilidad en agua. Consecuentemente, la transferencia de oxígeno puede llegar a ser uno de los principales factores limitantes de la productividad celular y/o de metabolitos, debido a la influencia de la concentración del oxígeno disuelto sobre las actividades metabólicas de las células.

La velocidad de transferencia de oxígeno de un biorreactor de tanque agitado depende de las condiciones de aireación y agitación y de las propiedades físicas del caldo de cultivo. La ecuación que describe la velocidad de transferencia de oxígeno (VTO) es:

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VTO = k L a (C * − C )

(1)

donde:

kLa : coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno, h-1. C* - C : fuerza impulsora de la transferencia de oxígeno, mMoles/L.

El kLa es un parámetro que sirve para conocer la rapidez con la que se transfiere oxígeno del aire al líquido contenido en un biorreactor. Existen diferentes métodos para determinar la velocidad de transferencia de oxígeno. En esta práctica se combinan dos de ellos, el de balance de oxígeno o medida directa con el del sulfito. Por lo tanto, se empleará un sistema físico aire-agua y no uno biológico. Un balance de oxígeno del aire considerando la entrada y la salida del biorreactor es:

7.32 x 10 5 VL

VTO =

⎡⎛ Qi Pi y i ⎞ ⎛ Qo Po y o ⎞⎤ ⎟⎟ − ⎜⎜ ⎟⎟⎥ ⎢⎜⎜ T T 0 i ⎝ ⎠ ⎝ ⎠⎦ ⎣

(2)

donde:

VL : volumen de líquido en el biorreactor, litros. Q : flujo volumétrico de aire, litros/min. P : presión total absoluta, atm. T : temperatura del aire, 0K. y : fracción mol de oxígeno. 7.32 x 105 : factor de conversión.

i = a la entrada del biorreactor. o = a la salida del biorreactor.

En esta práctica para que haya una transferencia neta de oxígeno debe haber consumo del mismo, por lo que como “consumidor” de oxígeno se emplea sulfito de sodio. En este caso la reacción de oxidación es tan rápida que la concentración de oxígeno disuelto en el líquido es cero. La reacción que se efectúa es: Vázquez Gurrola, Orozco Álvarez, Ordaz Contreras, García Salas

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2 Na2SO3 + O2

Cu2+

2Na2SO4

Otro parámetro importante que determina la velocidad de transferencia de oxígeno de un biorreactor es la fracción de gas retenido o "gas holdup", definido como la fracción de la unidad de volumen de la mezcla gas-líquido que es ocupada por la fase gaseosa. Cuando el tamaño promedio de las burbujas es constante, una mayor fracción de gas retenido, implica una mayor área interfacial gas-líquido y en consecuencia una mayor transferencia de oxígeno.

Columna

La velocidad de transferencia de oxígeno es determinada de manera importante por el área superficial de las burbujas de aire, de aquí que el aire se disperse en forma de burbujas pequeñas para proveer una gran área de contacto entre las fases líquida y gaseosa. Sin embargo, en algunos caldos de fermentación, las burbujas pequeñas tienden a unirse formando burbujas más grandes. Así que aún con una dispersión primaria muy fina y dependiendo de las propiedades físicas del caldo de cultivo y de la intensidad de la turbulencia dentro del biorreactor, las burbujas pueden crecer hasta aproximadamente 6 mm de diámetro después de dejar la zona de dispersión.

Este fenómeno conocido como coalescencia de las burbujas, es causado por el hecho de que una película líquida entre dos burbujas de aire adyacentes se hace cada vez más delgada hasta que eventualmente se rompe.

En una dispersión gas-líquido cuyo comportamiento es 100% coalescente, el líquido es un líquido puro. Al ir aumentando la concentración de electrolitos disueltos en dicho líquido, se va inhibiendo la coalescencia de las burbujas. También la presencia de proteínas, alcoholes y substancias surfactantes, afecta el grado de coalescencia de las burbujas.

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La coalescencia de las burbujas afecta entonces el diámetro de las burbujas. Éste junto con la fracción de gas retenido determinan el área superficial de contacto entre las fases líquida y gaseosa, de acuerdo a la siguiente ecuación:

a=

6ε d b ((1 − ε ))

(3)

donde:

a: área interfacial gas-líquido.

ε : fracción de gas retenido. d b : diámetro de las burbujas.

Airlift

Si el oxígeno molecular no fuera continuamente transferido del aire al caldo de cultivo de microorganismos, el oxígeno disuelto sería consumido en pocos segundos bajo condiciones normales de fermentación, debido a la baja solubilidad del oxígeno en los caldos de cultivo. El suministro del oxígeno al caldo de cultivo de microorganismos, es por lo tanto, un aspecto muy importante en el diseño de biorreactores para procesos aeróbicos. En el transporte de oxígeno de la fase gaseosa al caldo de cultivo de microorganismos, la resistencia de la película líquida en la interfase gas-líquido es, en la mayoría de los casos, el paso limitante de la velocidad de suministro de oxígeno.

El kLa es un parámetro que sirve para conocer la rapidez con la que se transfiere oxígeno del aire al líquido contenido en un biorreactor. Este coeficiente depende del grado de coalescencia de las burbujas. Por ejemplo, el kLa empleando una solución acuosa con una fuerza iónica de I=0.4, es más grande, por un factor de seis, que el obtenido con agua. Esto es debido a un aumento del área interfacial.

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Un efecto importante de la circulación del líquido es que disminuye la frecuencia de la coalescencia al aumentar la velocidad del líquido. Esto es resultado de que las distancias entre las burbujas de gas son más grandes debido a que las fracciones de gas retenido son menores y a que la distribución de gas es más uniforme. Además, porque disminuye el movimiento transversal de las burbujas de gas.

En general, en los biorreactores de columna de burbujas se obtienen fracciones de gas retenido más grandes, mientras que el los biorreactores airlift, la fracción de gas retenido disminuye al aumentar la velocidad de circulación del líquido. La velocidad del líquido representa por lo tanto, un parámetro muy importante para adaptar la fracción de gas retenido y el tiempo de residencia promedio de las burbujas a los requerimientos de proceso.

En los biorreactores airlift de gran altura, la velocidad de transferencia de masa cambia a lo largo de la ruta de flujo de una manera complicada, debido a que el área interfacial y la diferencia de concentración de oxígeno cambian de un punto a otro debido a la expansión o compresión, al consumo de oxígeno y a cambios en la presión hidrostática y en la velocidad local del líquido.

OBJETIVO

El alumno determinará la velocidad de transferencia de oxígeno, el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno y la fracción de gas retenido global en diferentes tipos de biorreactores

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MATERIALES Y MÉTODOS

Biorreactor 1. Biorreactor de tanque agitado. 2. Biorreactor de columna de burbujeo. 3. Biorreactor airlift

Instrumentos 1. Rotámetros. 2. Analizador de oxígeno en fase gaseosa. 3. Manómetros. 4. Termómetros. 5. Medidor de pH.

Reactivos 1. Na2SO3 2. Almidón en solución al 1%. 3. HCL 3N 4. NaOH 3N 5. Soluciones reguladoras de pH, de 4 y 9.

Métodos o Determinación de la velocidad de transferencia de oxígeno: mediante el método combinado del balance de oxígeno con el del sulfito. o Determinación del kLa usando la siguiente ecuación:

kLa = VTO / C* o C* se calcula con la ecuación de la ley de Henry. o Determinación de la fracción de gas retenido global: método de expansión de gas.

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PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Actividades previas 1. Preparar en el biorreactor una solución de Na2SO3 0.6N. 2. Adicionar Cu2SO4 a la solución de sulfito, para tener una concentración final de 0.25 g/L. 3. Ajustar el pH a 7.6 y mantenerlo constante durante la experimentación.

Condiciones de operación

Tanque agitado o Las velocidades de agitación serán: 300, 500 y 700 rpm. o Para cada velocidad de agitación, se probarán las siguientes velocidades de aireación: 0.3, 0.6, 1.0, 1.3, 1.6 vvm.

Columna o Velocidad de aireación: 0.3, 0.6, 1.0, 1.3, 1.6 vvm.

Airlift o Velocidad de aireación: 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 y 2.5 vvm. o Tipos de tubos de arrastre: de 2 diámetros diferentes.

Medición de la concentración de oxígeno gaseoso. 1. Una vez establecidas las condiciones de operación, medir la concentración del oxígeno del aire que sale del biorreactor, utilizando el analizador de oxígeno previamente calibrado.

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Medición de la fracción de gas retenido global.

Tanque agitado y columna 1. Medir el nivel del líquido sin airear y el nivel del líquido aireado para cada condición de operación.

Airlift 1. Medir la diferencia de alturas del agua contenida en los manómetros de presión diferencial de cada zona del biorreactor, 2. Medir la distancia entre las tomas de presión estática de la zona de flujo ascendente y entre las de la zona de flujo descendente.

RESULTADOS

1. Calcular la VTO, el kLa y la fracción de gas retenido global, para cada condición de operación. 2. Calcular C*. 3. Obtener la correlación del kLa con la velocidad de aireación, ésta expresada en vvm y en m/s. 4. Obtener la correlación del kLa con la fracción de gas retenido.

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

La discusión deberá contener al menos la siguiente información: 1. Comparación de las diferentes condiciones de operación y fracciones de gas retenido con respecto a los valores del kLa. 2. Comparación de los valores de kLa que obtuvo para cada uno de los biorreactores empleados y explique el porqué de las diferencias.

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3. Cuál es el aspecto de la dispersión gas-líquido para cada condición de operación. 4. Explicación de los valores de kLa de los líquidos que promueven la coalescencia y de los líquidos que la inhiben.

BIBLIOGRAFÍA

Tanque agitado y columna 1. Aiba, S., Humphrey, A. E., Millis, N. F. 1973. Biochemical engineering. Academic Press. 2. Van´t Riet, K. 1991. Basic bioreactor design. Mercel Dekker, Inc. USA. 3. Wang, D .I .C., Cooney, C. L, Demain, A. D., Dunill, P., Humphrey, A. E., Lilly, M. D. 1978. Fermentation and enzyme technology. John Wiley and Sons.

Airlift 1. Chisti, M. Y. 1989. Airlift bioreactors. Elsevier Applied Science. England. 2. Merchuk, J. C. 1990. Why use airlift reactors. TiBTech. 8. 66-71. 3. Vant Riet, K. 1991. Basic bioreactor design. Mercel Dekker, Inc. USA. 4. Weiland, P., Onken, U. 1981.Differences in the behaviour of bubble columns and airlift loop reactors. Ger. Chem. Eng. 4: 174-181.

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PRÁCTICA 6

Práctica 6. Mantenimiento de asepsia en biorreactores

Mantenimiento de asepsia en biorreactores

INTRODUCCIÓN

En esta práctica la asepsia se considera como el conjunto de procedimientos destinados a eliminar o retirar microorganismos de un biorreactor y de todas las tuberías conectadas a él, con el propósito de asegurar que únicamente estén presentes el o los biocatalizadores, microorganismos o enzimas, responsables de efectuar la bioconversión de materias primas a un producto especificado. En consecuencia, la asepsia del biorreactor y de las tuberías asociadas a él, garantizan que los procesos de bioconversión se lleven a cabo sin contaminaciones por microorganismos extraños.

Los microorganismos contaminantes pueden competir con el microorganismo cultivado por el substrato o pueden desplazarlo al tener una velocidad de crecimiento mayor, incluso pueden producir substancias que dañen al microorganismo cultivado o inactiven a las enzimas. Por lo tanto, la presencia de microorganismos contaminantes ocasionan

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que los rendimientos y productividades de producción establecidos no se puedan alcanzar, ocasionando pérdidas económicas.

Para poder lograr la asepsia del biorreactor y de las tuberías asociadas a él, se deben proponer desde la etapa de diseño, una geometría interna y arreglos de tuberías, que eviten la acumulación de substancias al llevar a cabo el vaciado de ellos. Las substancias acumuladas pueden propiciar una contaminación. También, la asepsia se facilita mediante una limpieza efectiva del biorreactor y tuberías, lo que se alcanza al especificar materiales de construcción con un acabado que evite el atrapamiento de partículas sólidas con microorganismos. Las partículas sólidas eventualmente limitan la transferencia de calor, evitando el calentamiento de los microorganismos a la temperatura de esterilización y por lo tanto, dejándolos viables para generar una contaminación.

Una vez lavado el biorreactor y las tuberías, el biorreactor se llena con medio de cultivo para proceder a la esterilización. Después de la esterilización, el biorreactor debe operar asépticamente. Para lograrlo, es necesario el buen funcionamiento del sello mecánico para mantener una presión positiva que evite la entrada de microorganismos. También, se requiere el más alto aseguramiento posible de la integridad y eficiencia de remoción del filtro para la esterilización del aire.

Existen diferentes métodos para probar la integridad de filtros. Uno de ellos es la prueba de la intrusión del agua. Es una prueba práctica y validada, que se puede considerar para probar la integridad in situ de los filtros hidrofóbicos para la esterilización del aire. Otra prueba es la de mantenimiento de la presión.

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OBJETIVO

El alumno aplicará las pruebas de intrusión de agua y de mantenimiento de la presión para probar la integridad de filtros de aire, con los que se garantice la operación aséptica en biorreactores.

MATERIALES Y MÉTODOS

Biorreactor. 1. Biorreactor agitado de 30 L, equipado con prefiltros y filtros hidrofóbicos para la esterilización de aire.

Instrumentación. 1. Cronómetro. 2. Rotámetro. 3. Manómetro. 4. Termómetro.

Reactivos 1. Agua desionizada 2. Isopropanol

Prueba de intrusión de agua

El principio de esta prueba es que si el lado corriente arriba de un filtro hidrofóbico seco se llena de agua y se presuriza, la naturaleza hidrofóbica de la membrana porosa prevendrá el flujo del líquido a través del filtro hasta que se alcanza la presión de la intrusión. A presiones por debajo de la presión de intrusión ocurre un flujo pequeño pero

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medible del agua a través de la membrana. La presencia de poros más grandes en el filtro será detectada por un flujo creciente debido al agua que atraviesa estos poros. La figura 1 muestra el principio de esta prueba.

Presión Membrana hidrofóbica

Aire

Aire

Agua

Agua Filtro: Membrana hidrofóbica

Poro B Poro A

Carcasa Unidad de filtración

Figura 1. Principio de la prueba de intrusión de agua. Si el tamaño de los poros es como el tamaño del poro B, el flujo de agua será menor que el flujo correspondiente a poros del tamaño del poro A.

La tabla 1 muestra el resultado de una prueba de intrusión de agua para un filtro de membrana de la marca Pall. Los parámetros de la prueba son específicos para cada filtro y deben ser proporcionados por el fabricante.

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Tabla 1. Parámetros de la prueba de intrusión de agua para un filtro de cartucho EMFLON PFR de Pall. Número de catalogo

AB1PFR7PVH4

Presión de prueba Flujo máximo permisible

2500 mbar 0.33 mL/min

Usando agua desionizada a una temperatura de 20° ± 2°C.

Prueba de mantenimiento de la presión

La prueba de mantenimiento de la presión es una forma modificada de una prueba de flujo difusivo, que es la prueba de flujo hacia delante corriente arriba del filtro. Ésta puede llevarse a cabo después de la esterilización del filtro, antes de la filtración y después de la filtración estéril, puesto que las conexiones estériles corriente abajo no se desconectan. Una ventaja de la prueba de mantenimiento de la presión es que también confirma la integridad de la unidad de filtración, incluyendo los sellos de la carcasa.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Prueba de intrusión de agua

1. Instalar el filtro seco. 2. Llenar con agua desionizada el lado corriente arriba del filtro. 3. Aplicar una presión predeterminada, utilizando aire. Esto causa una disminución del nivel de agua dentro de la carcasa del filtro, debido a la compresión de los pliegues del filtro y al paso de aire atrapado a través de la membrana. Es importante que los cambios de volumen corriente arriba del filtro debido a estos

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efectos se haya estabilizado, para que se puedan medir los flujos de agua muy pequeños que pasan a través de la membrana. 4. Dejar pasar 10 minutos para que ocurra la estabilización tanto del flujo como de la temperatura. 5. Después de la estabilización, medir el flujo de agua. Esto se puede hacer, determinando el flujo de aire corriente arriba que es requerido para mantener la presión constante. 6. Al terminar la prueba, drenar el agua del filtro y de las tubería. 7. Secar el filtro y la tubería. 8. Comparar los resultados de la prueba con los límites especificados. 9. Si los resultados están dentro de los límites especificados, entonces el filtro está listo para usarse.

Prueba de mantenimiento de la presión

1. Mojar la membrana del filtro con una mezcla de isopropanol agua 60:40 (v/v). 2. Instalar el filtro en la carcasa. 3. Presurizar la unidad de filtración a una determinada presión. 4. Aislar la unidad de filtración de la fuente de presión y de la tubería corriente bajo. 5. La difusión del gas a través de la membrana mojada se mide cuantitativamente como un descenso de la presión después de un periodo de tiempo especificado. 6. Medir el volumen corriente abajo de la carcasa. 7. Mantener constante la temperatura en el volumen corriente abajo de la carcasa. 8. Verificar que no haya fugas en el sistema de tuberías corriente abajo. 9. Comparar los resultados con los valores publicados de la disminución de la presión, los cuales se basan en carcasas estándares con válvulas corriente arriba localizadas tan cerca como sea posible de la carcasa del filtro. 10. Si los resultados están dentro de los límites especificados, entonces el filtro está listo para usarse.

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RESULTADOS

1. Elabore el isométrico de tuberías que muestre la instalación del filtro. 2. Dibuje un diagrama de bloques de los procedimientos experimentales realizados en esta práctica. 3. Construya una grafica del flujo de agua en función del tiempo. 4. Realice una grafica de la presión en función del tiempo.

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

La discusión versará al menos sobre lo siguiente: 1. Las especificaciones de los líquidos que se requieren para mojar la membrana de filtros hidrofóbicos en las pruebas de integridad de flujo difusivo. 2. La razón de que las pruebas de integridad de filtros deban ser correlacionados con la prueba de la carga bacteriana líquida, la cual es un indicador del desempeño de los filtros. 3. Tres pruebas que se han utilizado comúnmente en filtros para la esterilización de gas, así como sus ventajas y desventajas.

BIBLIOGRAFÍA

1. Lydersen B.K., D´elia N.A., Nelson, K.M.L. 1994. Bioprocess engineering: systems, equipment and facilities. John Wiley and Sons, Inc. New York. 2. Johnston P.R. 2004. Fluid sterilization by filtration. Interpharm, CRC Press LLC. 3. Jornitz. M.W. 2006. Sterile filtration. Springer-Verlag, Berlin.

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PRÁCTICA 7

Práctica 7. Esterilización del sistema de biorreacción

Esterilización del sistema de biorreacción

INTRODUCCIÓN

Una esterilización adecuada del medio de cultivo es importante para garantizar el éxito de muchas fermentaciones industriales. Para lograr este propósito, se emplea cualquier método capaz de destruir o separar a los microorganismos contaminantes indeseables. La técnica más común es la destrucción de los microorganismos contaminantes. El término destrucción, en este caso, significa la pérdida de viabilidad del microorganismo.

La destrucción de microorganismos se puede llevar a cabo por varios métodos: 1. Calor, ya sea seco o húmedo 2. Agentes químicos 3. Radiaciones 4. Vibraciones sónicas

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El método más comúnmente utilizado para medios líquidos es el de calor húmedo ya que es simple, confiable y económico.

Cinética de muerte térmica de microorganismos

Generalmente se clasifica la velocidad de muerte de los microorganismos en: velocidad de muerte logarítmica y velocidad de muerte no logarítmica.

Velocidad de muerte logarítmica

La velocidad de muerte logarítmica se puede expresar matemáticamente mediante la ecuación:

-

dN = kN dt

(1)

Separando variables e integrando.

N = − kt No

(2)

N = exp(− kt ) No

(3)

ln

La ecuación (3) describe apropiadamente la cinética de muerte térmica de células vegetativas.

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Velocidad de muerte no logarítmica

Este tipo de comportamiento de muerte térmica se encuentra a menudo en esporas bacterianas. Se proponen varias explicaciones para esta conducta: germinación de esporas, técnicas experimentales deficientes, impactos múltiples para la inactivación y eventos secuenciales en la inducción de muerte.

El modelo de eventos secuenciales propone que la muerte ocurre de la siguiente manera: kR kS N R ⎯⎯ → N S ⎯⎯ → ND

(4)

Se propone que una espora resistente NR sufre inactivación o muerte a un estado final ND a través de un intermediario sensible NS. Se establecen las ecuaciones diferenciales:

dN R = − kR N R dt

(5)

dN S = kR N R − kS N S dt

(6)

La solución a estas ecuaciones diferenciales simultáneas es: ⎤⎡ k ⎤ N ⎡ kR exp(k S t )⎥ ⎢ S exp(− k R t )⎥ =⎢ N0 ⎣ kR − kS ⎦ ⎦⎣ k R

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(7)

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Efecto de la temperatura sobre la cinética de muerte Considerando la muerte térmica de los microorganismos de manera similar a las reacciones químicas, la relación entre las constantes cinéticas y la temperatura presenta un comportamiento análogo. La teoría más frecuentemente empleada es la teoría de Arrhenius.

Esta relación se expresa matemáticamente como:

⎛ −E ⎞ k = A exp⎜ ⎟ ⎝ RT ⎠

(8)

Esterilización por lote

En el proceso de esterilización por lote, el medio se coloca en el fermentador y el contenido se calienta a la temperatura de esterilización asignada. Para establecer la relación entre tiempo y temperatura se puede utilizar la ecuación (1). Sin embargo, k durante la esterilización por lote no es constante ya que la temperatura durante el calentamiento y enfriamiento varían. Incorporando el efecto de la temperatura establecido por la ecuación de Arrhenius la ecuación queda:

No ⎛ −E ⎞ = A∫ exp⎜ ⎟ dt ⎝ ⎠ N RT 0 t

∇ TOTAL = ln

(9)

El símbolo ∇ representa el grado de destrucción en todo el proceso. El ciclo de esterilización está formado por tres períodos: 1. Elevación de temperatura o calentamiento. Vázquez Gurrola, Orozco Álvarez, Ordaz Contreras, García Salas

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2. Mantenimiento de temperatura 3. Descenso de temperatura o enfriamiento. El perfil temperatura - tiempo durante la fase de calentamiento es función de varios factores, por ejemplo: la forma en que se lleva a cabo el calentamiento, ya sea inyección directa de vapor, calentamiento indirecto a la chaqueta, mediante serpentines o eléctricamente. La tabla 1 muestra las relaciones tiempo – temperatura de acuerdo a la forma de transferencia de calor.

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TIPO DE

RELACION

TRANSFERENCIA DE

TEMPERATURA-

CALOR

TIEMPO

Adición de vapor al

at ⎞ ⎛ T = To⎜ 1 + ⎟ ⎝ 1 + bt ⎠

medio

(Hiperbólica )

Calentamiento con

ayb

a=

hs MToC

b=

T =To(1 + at )

a=

dispositivo eléctrico

s M

q MToC

( lineal )

Calentamiento con vapor

(

T = TH 1 + be− at

)

a=

(intercambiador de calor) ( exponencial )

b= Enfriamiento

(

T = T∞ 1 + be− at

(Intercambiador de calor)

)

Ua ′ MC

To − TH TH

− Ua ′ ⎞ WC′ ⎛ a= ⎜ 1 − e MC ′ ⎟ MC ⎝ ⎠

b=

To − T∞ T∞

Tabla 1. Relaciones tiempo – temperatura de acuerdo a la forma de transferencia de calor

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OBJETIVO

El alumno diseñará el ciclo de esterilización para un medio de cultivo en un biorreactor.

DESARROLLO EXPERIMENTAL

Material y equipo 1. Fermentador de 12 litros. 2. Cronómetro 3. Cajas de Petri estériles. 4. Pipetas estériles. 5. Frascos de dilución con agua estéril. 6. Agar nutritivo 7. Mechero. 8. Esporas de Bacillus subtilis.

Trabajo experimental 1. Una vez montado el vaso conteniendo 12 litros de agua inocular con esporas de Bacillus subtilis. 2. Establecer la temperatura de esterilización. 3. Anotar los datos de tiempo y temperatura durante todo el ciclo de esterilización, en intervalos de un minuto. 4. Tomar cuatro muestras a diferentes tiempos: al principio del ciclo de esterilización (No), al final del período de calentamiento (N1), al final del período de mantenimiento (N2), y al final del período de enfriamiento (N3). 5. De cada una de las muestras tomadas, se hace una dilución y se siembran por duplicado en cajas de Petri utilizando la técnica de vaciado en placas.

Se

incuban a 30 ºC, hacer cuenta de colonias cada 24 h, durante tres días. Vázquez Gurrola, Orozco Álvarez, Ordaz Contreras, García Salas

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MUESTRA

DILUCIÓN

NO

10-1

10-5

N1

10-1

10-5

N2

10-1

10-3

N3

10-1

10-2

INFORME

1. Presentar en un cuadro los valores de temperatura y tiempo para el ciclo de esterilización.

Graficar

los

perfiles

para

las

etapas

de

calentamiento,

mantenimiento y enfriamiento.

2. Determinar los valores de (a) y (b) de las ecuaciones de temperatura en función del tiempo para las etapas de calentamiento y enfriamiento.

3. Calcular el coeficiente global de transferencia de calor (UiD) para las etapas de calentamiento y enfriamiento.

4. Con los valores de No, N1, N2 y N3 determinará el grado de destrucción para el calentamiento, mantenimiento, enfriamiento y el ∇ciclo de esterilización .

5. En el período de mantenimiento determinará el valor de la energía de activación conociendo el valor de la constante de Arrhenius:

A

= 7.49 X 1038 min-1 .

6. Elaborar un cuadro de valores de (k) en función del tiempo y trazará la gráfica correspondiente. Obtendrá el grado de destrucción para calentamiento,

Vázquez Gurrola, Orozco Álvarez, Ordaz Contreras, García Salas

71

Laboratorio de Biorreactores. Manual de Prácticas

mantenimiento, enfriamiento y total por integración gráfica en la curva anterior y por algún método numérico.

7. En el caso de que la esterilización haya sido deficiente, recalcular el tiempo de mantenimiento, suponiendo los criterios de diseño de calentamiento y enfriamiento constantes y una población final de microorganismos viables de 10-3 ( probabilidad de que en mil lotes de esterilización, uno resulte contaminado).

8. Realizar el escalamiento de las etapas de calentamiento, mantenimiento y enfriamiento para un volumen de 10,000 litros de medio de cultivo. Graficar los perfiles de temperatura vs. Tiempo para ambas escalas. El escalamiento se efectuará con base al criterio de (P/V).

9. Discutir los perfiles obtenidos en ambas escalas

con base en las siguientes

variables: volumen de trabajo, área de transferencia de calor, coeficiente global de transferencia de calor, flujo de vapor y flujo de agua de enfriamiento.

10.Calcular los tiempos del ciclo de esterilización para ambas escalas cuando se usa una temperatura de mantenimiento de 121 ºC, No = 106 UFC/mL y N = 10-3 . Discutir estos resultados.

11. Exponer sus conclusiones.

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Laboratorio de Biorreactores. Manual de Prácticas

NOMENCLATURA

a’ - Área de transferencia de calor: calcularla experimentalmente A - Constante de Arrhenius, min-1. C - Calor específico del medio de cultivo, kcal/ kg C C’ - Calor específico del elemento enfriador, kcal / kg C E - Energía de activación, cal / g mol, kcal / kg mol h

- Entalpía relativa al medio. kcal / kg (entalpía del vapor a la temperatura del medio

de cultivo). k - Constante específica de velocidad de muerte, min. -1 kR - Constante específica de inactivación de esporas resistentes. ks - Constante específica de intermediarios sensibles. M - Masa inicial del medio, kg. N - Concentración de microorganismos en el tiempo t No - Concentración de microorganismos to N1 - Concentración de microorganismos t1 N2 - Concentración de microorganismos t2 N3 - Concentración de microorganismos t3 ND -Concentración de esporas inactivas. NR -Concentración de esporas resistentes. NS - Concentración de esporas sensibles q

- Velocidad de transferencia de calor, kcal / s

R

- Constante Universal de los gases, 1.98 cal / g Mol ºK

s

- Gasto masa de vapor, kg / s, kg / h, kg / min.

t

- Tiempo, min, h.

T

- Temperatura absoluta ºK

T0 - Temperatura inicial del medio ºK TH - Temperatura de la fuente de calentamiento ºK T∞ - Temperatura de la fuente de enfriamiento, 293 ºK U

- Coeficiente global de transferencia de calor, kcal / m2 h ºC

W - Gasto masa del elemento enfriador: calcularla experimentalmente Vázquez Gurrola, Orozco Álvarez, Ordaz Contreras, García Salas

73

Laboratorio de Biorreactores. Manual de Prácticas

BIBLIOGRAFÍA

1. Abbot, F.J., Clamen, A., 1973. Biotechnol. Bioeng. 15:117-127. 2. Bailey, J.E., Ollis, D.F. 1977. Biochemical engineering fundamentals. McGraw-Hill, Inc. 3. Deindoerfer, F.H. y Humphrey, A.E., 1959. Appl. Microbiol. 7: 256-264. 4. Richards, J.W., 1961. Progress in Ind. Microbiol. 5: 143-173. 5. Wang, I.C.D., y col. 1979. Fermentation and Enzyme Technology. John Wiley, N. Y.

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Laboratorio de Biorreactores. Manual de Prácticas

PRÁCTICA 8

Práctica 8. Producción de biomasa en cultivo por lote

Producción de biomasa en Cultivo por lote

INTRODUCCIÓN

Los sistemas fermentativos se clasifican en tres grupos: cerrados, abiertos y sistemas semicerrados. Al primer grupo pertenece el cultivo por lote empleado tradicionalmente desde el siglo antepasado en el cual una vez iniciada la fermentación ya no existe entrada ni salida de materiales.

Hasta la fecha la gran mayoría de las fermentaciones a nivel industrial se llevan a cabo en cultivo por lote. Este consiste en agregar al fermentador un medio de cultivo que contiene los nutrientes necesarios para el crecimiento del microorganismo y/o para la producción de un metabolito. El medio después de ser esterilizado y enfriado a la temperatura de fermentación, se inoculará con el microorganismo para permitir su desarrollo y producción del metabolito, hasta un tiempo en el cual ocurre el agotamiento de uno o más nutrientes del medio de cultivo. Terminada la fermentación, se cosecha la totalidad del volumen de mosto o medio agotado para recuperar el producto.

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75

Laboratorio de Biorreactores. Manual de Prácticas

Ya vacío el fermentador se limpia y lava perfectamente para permitir la siguiente fermentación. La determinación de los parámetros cinéticos de un cultivo por lote tiene la finalidad de conocer, predecir y controlar la fermentación misma. El cultivo por lote tiene la particularidad de que todos los parámetros cinéticos varían con el tiempo de fermentación. Los valores obtenidos de estos parámetros son lo suficientemente confiables si las determinaciones se realizan adecuadamente durante el proceso de fermentación.

OBJETIVO

El alumno determinará los parámetros cinéticos de la levadura Candida utilis creciendo en condiciones óptimas en un cultivo por lote.

MATERIALES Y MÉTODOS

Equipo 1. Autoclave (15 L de capacidad). 2. Incubadora rotatoria de temperatura controlada. 3. Fermentador con ambiente controlado (de 2 litros). 4. Electrodo de pH esterilizable. 5. Medidor controlador de pH. 6. Bombas peristáltica (0 a 2 L/h). 7. Placas de calentamiento y agitación. 8. Espectrofotómetro (rango: visible y UV). 9. Centrífuga clínica (0 a 5000 rpm). 10. Balanza analítica (0 a 200 g de capacidad.). 11. Estufa. 12.Equipo de filtración con vacío.

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Laboratorio de Biorreactores. Manual de Prácticas

Microorganismo Candida utilis La cepa empleada se conserva en tubos con medio inclinado de PDA (papa-dextrosaagar) a una temperatura de 40C.

Medios de Cultivo Cuadro 1. Medios de cultivo COMPONENTE

MEDIO PARA EL

MEDIO PARA EL

INOCULO

CULTIVO POR LOTE

(g/L)

(g/L)

Glucosa

15.0

15.0

(NH4)2SO4

2.73

1.365

NaH2PO4

1.2637

1.2637

Extracto de levadura

0.990

0.990

* FeSO4 7H2O * CuSO4 5H2O * ZnSO4 H2O * Na2MoO4 2H2O * MnSO4 H2O

Emplear agua de la llave

(*) Todas las sales ya están disueltas en una solución concentrada, el volumen (en mL) a emplear se calcula mediante la siguiente relación: Vsales (mL) = 0.05 x conc. de glucosa (g/L) x volumen medio (L) Todos los medios se ajustan a un pH=4.0 (excepto el medio para el inóculo).

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Laboratorio de Biorreactores. Manual de Prácticas

Métodos analíticos

Determinación de la concentración celular (x)

Procedimiento: A las membranas puestas previamente a peso constante y colocadas sobre el dispositivo de filtración se les adiciona 5mL de suspensión celular y se filtra al vacío. Se separa el filtrado, y el paquete celular se lava con 5mL de agua destilada y se filtra nuevamente (este segundo filtrado no debe mezclarse con el primero). El paquete celular lavado se coloca en una estufa a 600C durante 24 horas. La concentración celular se estima por diferencia de pesos. (todas las pesadas deben hacerse en balanza analítica).

Determinación de azúcares reductores por DNS

Reactivos:

1g de ácido 3,5- dinitrosalicílico se disuelve en 20ml de NaOH 2N, se agregan después 50ml de agua, y luego 30 g de tartrato de sodio y potasio. Todo se lleva a un volumen de 100ml.

Procedimiento:

A 1mL del filtrado se le adiciona 1mL del reactivo DNS, se coloca en baño maría a ebullición durante 5min. Posteriormente se deja enfriar y se adicionan 5mL de agua destilada. Se leen los tubos a 540nm. Se emplean 2 controles de concentraciones de 0.4 y 0.8 g/L de glucosa, y con el blanco de reactivos se ajusta a cero el espectofotómetro.

Curva tipo de glucosa. Elaborar una curva tipo de glucosa con volúmenes de 0.1 a 1mL de solución patrón de 1.0 g/Lde glucosa.

Vázquez Gurrola, Orozco Álvarez, Ordaz Contreras, García Salas

78

Laboratorio de Biorreactores. Manual de Prácticas

DESARROLLO EXPERIMENTAL

Preparación del inóculo Se preparan 180 mL de medio de cultivo para desarrollo del inóculo, los cuales se reparten en dos matraces (de 500ml) con 90 mL de medio cada uno. Se esterilizan a 15 lb/in2 durante 15 min. Se enfría. Se inoculan con 5mL del mismo medio sobre la cepa en tubo inclinado, en condiciones asépticas. Se dejan incubando en una agitadora (110 golpes/minuto) a una temperatura de 350C durante 18 horas.

Cultivo por lote

A) Se preparan 1620 mL de medio de cultivo para el cultivo por lote y se ajusta el pH a 4.0. El medio se carga en el fermentador, previamente preparado, y se esteriliza en el autoclave a 15 lb/in2, 15 min. También se esterilizan, conjuntamente, los recipientes que contienen el antiespumante y el álcali.

B) El fermentador con el medio de cultivo se coloca en el sistema de agitación, venteo, agua de enfriamiento, etc. y después se inocula con los dos matraces del inóculo, en condiciones asépticas: El cultivo por lote operará bajo las siguientes condiciones: velocidad de agitación

:

500 rpm

aireación

:

1 vvm

temperatura

:

35 ºC

pH (con NH4OH 2N)

:

3.8

antiespumante (PPG-10%):

“de acuerdo a la formación de espuma”

C) Se tomarán muestras cada hora para la determinación de la concentración celular por peso seco y turbidimetría, y azúcares residuales por el método del DNS. Las determinaciones se harán por duplicado. El cultivo por lote durará aprox. 10 horas durante las cuales el pH será controlado con NH4OH 2N.

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79

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D) Procesamiento de muestras. Las muestras se tratarán bajo el esquema de la figura 1.

(10mL)

Determinación de conc. celular por turbidez

MUESTRA

(5mL)

(5mL)

Filtración al vacío

Filtrado

Paquete celular

Adicionar 5 mL de agua destilada y filtrar de nuevo

Determinación de glucosa residual

Determinación de la conc. celular por peso seco

Figura 1. Procesamiento de las muestras.

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80

Laboratorio de Biorreactores. Manual de Prácticas

INFORME

1. Presentar los resultados en el cuadro 2. 2. Presentar las curvas tipo de concentración celular y de glucosa. 3. Elaborar los siguientes gráficos: a) Concentración celular (x) vs. Tiempo (identificar las fases del crecimiento). b) Concentración residual de glucosa (s) vs. Tiempo c) Logaritmo natural de la concentración celular vs. Tiempo (solo para la fase exponencial) 4. Determinar los siguientes conceptos: a) Velocidad específica de crecimiento (μ) a cada tiempo de cultivo. b) Velocidad específica de consumo de sustrato (qs) a cada tiempo de cultivo. c)

Velocidad específica de crecimiento máxima (μmax).

d) Rendimiento celular con base al consumo de sustrato (Yxs) a cada tiempo de cultivo. e) Rendimiento celular global con base al consumo de sustrato (Yxs(global)). f) Constante de afinidad por le sustrato (Ks). g)

Productividad celular global (Rx global).

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

El alumno discutirá los resultados obtenidos en la práctica.

RESUMEN

El alumno elaborará un resumen de la práctica.

Vázquez Gurrola, Orozco Álvarez, Ordaz Contreras, García Salas

81

Laboratorio de Biorreactores. Manual de Prácticas

BIBLIOGRAFÍA

1. Dunn, I.J., Mor, J.R. 1975. Variable-volumen continuous cultivation. Biotechnol. Bioeng. 17: 1805-1822. 2. Pirt, S.J. 1975. Principles of microbial and cell cultivation. Black Well Scientific Publications, London. 3. Whitaker, A. 1980. Fed-batch culture. Process Biochem. 15:10-15. 4. Yamané, T., Hirano, S. 1977. Semibatch culture of microorganism with constant feed of substrate: A mathematical simulation. J. Ferment Technol. 55:156-165.

Vázquez Gurrola, Orozco Álvarez, Ordaz Contreras, García Salas

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Cuadro 2. Resultados del cultivo por lote. Concentración celular (por

Concentración celular

turbidimetría)

(por peso seco)

TIEMPO DE HORA

CULTIVO

(h)

No.

Dilución.

Lectura

g/L

No.

pms

de

de

tubo

tubo

pmcs

Glucosa residual

g/L

tubo

Lectura

Dilución

g/L

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 pms : peso membrana seca pmcs: peso membrana más células Reunir todas las muestras y aplicar la secas Curva tipo de biomasa

técnica de DNS, empleando 2 controles de 0.4 y 0.8 g/L de glucosa

pendiente (m) = ordenada (b) =

0.4 g/L _________ 0.8 g/L _________

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Laboratorio de Biorreactores. Manual de Prácticas

Cultivo por lote

Actividades

1. Membranas a peso constante (20 membranas).

2. Curva tipo de glucosa.

3. Curva tipo de concentración celular

4. Preparación del medio de cultivo para el inóculo /esterilización /enfriamiento / inoculación de los matraces con la cepa en tubo inclinado/ incubación durante 18 horas.

5. Preparación del medio de cultivo para el cultivo por lote / preparación del fermentador / esterilización del fermentador con medio de cultivo y esterilización del álcali y el antiespumante / enfriamiento / inoculación con los matraces a el fermentador / arranque de la fermentación.

6. Toma de muestra cada hora del cultivo por lote/procesamiento de las muestras.

7. Descarga y lavado del fermentador.

84

Laboratorio de Biorreactores. Manual de Prácticas

PRÁCTICA 9

Práctica 9. Producción de biomasa en cultivo por lote alimentado

Producción de biomasa en Cultivo por lote alimentado

INTRODUCCIÓN

Generalmente los sistemas fermentativos se clasifican en tres grupos: Sistemas cerrados, Sistemas abiertos y Sistemas semicerrados. Al primer grupo pertenece el cultivo por lote empleado tradicionalmente desde el siglo XIX, en el cual una vez iniciada la fermentación ya no hay entrada ni salida de nutrientes.

Los cultivos continuos (simple etapa; con recirculación; y múltiple etapa; principalmente) pertenecen al segundo grupo, en donde existe entrada (nutrientes) y salida de materiales (nutrientes no consumidos, biomasa y metabolitos).

En los sistemas semicerrados sólo ocurre entrada de nutrientes, pero no salida de materiales, por lo que también se les conoce como sistemas de volumen variable. También a este tipo de sistemas se les denomina genéricamente como cultivos Fedbatch (término introducido por Yoshida en 1973) porque operativamente inician con

85

Laboratorio de Biorreactores. Manual de Prácticas

un cultivo por lote, y al finalizar éste, se inicia la alimentación

de nutrientes al

biorreactor. A su vez, por la forma de suministro de los nutrientes, pueden clasificarse en cultivos con alimentación a flujo variable ó flujo constante. A este último pertenece el cultivo objeto de esta práctica: cultivo por lote alimentado a flujo cte. (ó Fedbatch Lineal).

Hasta antes de la década de los setentas, el cultivo Fedbatch Lineal venía empleándose empíricamente, pero diseñado, en principio, para ser más productivo que el cultivo por lote. Fue en 1975 cuando Pirt(2) reportó un tratamiento matemático de este sistema, el cual consiste en el conjunto de ecuaciones diferenciales del sistema que describen a las velocidades volumétricas de acumulación de materiales en el biorreactor, es decir, la aplicación de la ecuación general de balance para biomasa, sustrato y producto (Acumulación = Entrada - Salida + Generación).

Como toda resolución de sistemas de ecuaciones, la resolución del sistema de ecuaciones diferenciales que describen este cultivo, nos dará las funciones (x, s, p) = f(t), es decir, podremos conocer, a cualquier tiempo del cultivo, los valores de la concentración de biomasa, sustrato residual y del metabolito de interés. Dado que todas las variables son dependientes del tiempo, no existe solución analítica al sistema de ecuaciones diferenciales, por lo que debe resolverse utilizando algún método numérico (el más usual es el de Runge-Kutta de cuarto orden).

Sin embargo, pueden encontrarse dos soluciones particulares a este sistema bajo las siguientes condiciones:

1. El suministro del sustrato limitante es mayor que lo demandado por el microorganismo.

2. El suministro del sustrato limitante es menor que lo demandado por el microorganismo.

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Laboratorio de Biorreactores. Manual de Prácticas

En el primer caso puede existir acumulación y desacumulación de la concentración del sustrato residual, durante el tiempo necesario para alcanzar el volumen final del biorreactor, y dependiendo de los valores del flujo de alimentación y de la concentración del sustrato limitante, pueden calcularse las concentraciones celular y de producto a cualquier tiempo. Debido a este exceso en el suministro del sustrato limitante el microorganismo crecerá a su máxima velocidad de crecimiento.

Para el segundo caso, como la demanda es mayor que el suministro, todo (o casi todo) el sustrato limitante suministrado es completamente consumido por el microorganismo, por lo que la concentración del sustrato residual durante el cultivo es muy baja. Bajo esta condición el microorganismo ajusta su maquinaria metabólica al bajo suministro del sustrato, ocasionando limitación en su crecimiento que se ve reflejado en una baja velocidad de crecimiento.

También, el cálculo de la concentración celular y de producto podrán determinarse resolviendo el sistema de ecuaciones bajo las condiciones de este segundo caso, y cuyos resultados dependerán de los valores del flujo de alimentación y concentración del sustrato limitante.

OBJETIVO

El alumno conocerá y realizará un cultivo por lote con alimentación constante empleando Candida utilis, y comprobará que este sistema fermentativo es de mayor productividad y rendimiento que el cultivo por lote.

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Laboratorio de Biorreactores. Manual de Prácticas

MATERIALES Y MÉTODOS

Equipo 1. Autoclave (15 L de capacidad). 2. Incubadora rotatoria de temperatura controlada. 3. Fermentador con ambiente controlado (de 2 ó 6 litros). 4. Electrodo de pH esterilizable. 5. Medidor controlador de pH. 6. Electrodo de oxígeno disuelto. 7. Medidor de oxígeno disuelto. 8. 2 Bombas peristáltica (0 a 2 L/h). 9. 2 Placas de calentamiento y agitación. 10. Espectrofotómetro (intervalo: visible y UV). 11.Centrífuga clínica (0 a 5000 rpm). 12. Balanza analítica (0 a 200 g de capacidad). 13. Estufa con vacío. 14.Equipo de filtración con vacío.

Microorganismo utilizado: Candida utilis.

La cepa empleada se conserva en tubos con medio inclinado de PDA (papa-dextrosaagar) a una temperatura de 40C.

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Laboratorio de Biorreactores. Manual de Prácticas

Medios de Cultivo

Cuadro 1. Medios de cultivo COMPONENTE

MEDIO PARA EL

MEDIO PARA EL

MEDIO PARA LA

INOCULO

CULTIVO POR LOTE

ALIMENTACION

(g/L)

(g/L)

(g/L)

Glucosa

15.0

15.0

40.0

(NH4)2SO4

2.73

1.365

3.64

NaH2PO4

1.2637

1.2637

3.37

Extracto de levadura

0.990

0.990

2.64

* FeSO4 7H2O * CuSO4 5H2O * ZnSO4 H2O * Na2MoO4 2H2O * MnSO4 H2O Emplear agua de la llave

(*) Todas las sales ya están disueltas en una solución concentrada, el volumen (en mL) a emplear se calcula mediante la siguiente relación: Vsales (mL) = 0.05 x conc. de glucosa (g/L) x volumen medio (L) Todos los medios se ajustan a un pH=4.0 (excepto el medio para el inóculo).

Métodos Analíticos

Determinación de la concentración celular (x)

Procedimiento: A las membranas puestas previamente a peso constante y colocadas sobre el dispositivo de filtración se les adiciona 5mL de suspensión celular y se filtra al vacío. Se separa el filtrado, y el paquete celular se lava con 5mL de agua destilada y se filtra nuevamente (este segundo filtrado no debe mezclarse con el primero). El paquete celular lavado se coloca en una estufa a 600C durante 24 horas. La concentración

89

Laboratorio de Biorreactores. Manual de Prácticas

celular se estima por diferencia de pesos. (todas las pesadas deben hacerse en balanza analítica).

Determinación de azúcares reductores

Reactivos:

1g de ácido 3,5- dinitrosalicílico se disuelve en 20mL de NaOH 2N, se agregan después 50mL de agua, y luego 30 g de tartrato de sodio y potasio. Todo se lleva a un volumen de 100mL.

Procedimiento:

A 1mL del filtrado se le adiciona1mL del reactivo DNS, se coloca en baño maría a ebullición durante 5min. Posteriormente se deja enfriar y se adicionan 5mL de agua destilada. Se leen los tubos a 540nm. Se emplean 2 controles de concentraciones de 0.4 y 0.8 g/L de glucosa, y con el blanco de reactivos se ajusta a cero el espectrofotómetro.

Curva tipo de glucosa. Elaborar una curva tipo de glucosa con volúmenes de 0.1 a 1mL de solución patrón de 1.0 g/L de glucosa.

90

Laboratorio de Biorreactores. Manual de Prácticas

DESARROLLO EXPERIMENTAL

Preparación del inóculo

Se preparan 180 mL de medio de cultivo para desarrollo del inóculo, los cuales se reparten en dos matraces (de 500mL) con 90 mL de medio cada uno. Se esterilizan a 15 lb/in2 durante 15 min. Se enfría. Se inoculan con 5ml del mismo medio sobre la cepa en tubo inclinado, en condiciones asépticas. Se dejan incubando en una agitadora (110 golpes/minuto) a una temperatura de 350C durante 18 horas.

Cultivo por lote

A) Se preparan 810 mL de medio de cultivo para el cultivo por lote y se ajusta el pH a 4.0. El medio se carga en el fermentador, previamente preparado, y se esteriliza en el autoclave a 15 lb/in2, 15 min. También se esterilizan, conjuntamente, los recipientes que contienen el antiespumante y el álcali.

B) El fermentador con el medio de cultivo se coloca en el sistema de agitación, venteo, agua de enfriamiento, etc. y después se inocula con un matraz del inóculo, en condiciones asépticas: El cultivo por lote operará bajo las siguientes condiciones:

velocidad de agitación

:

500 rpm

aireación

:

1 vvm

temperatura

:

35 ºC

pH (con NH4OH 2N)

:

3.8

antiespumante (PPG-10%):

“de acuerdo a la formación de espuma”

91

Laboratorio de Biorreactores. Manual de Prácticas

Se tomarán muestras sólo al inicio y al final del cultivo por lote el cual durará 12 horas. A las muestras se les determinará concentración celular por peso seco (y turbiedad) y glucosa residual por el método del DNS.

Cultivo por lote alimentado constantemente (Feed-batch Lineal)

A) Se preparan 900 mL de medio de cultivo para el cultivo Fed Batch Lineal y se ajusta el pH a 4.0. El medio se prepara en un matraz de 2 litros, y se esteriliza junto con la manguera de adición y el "medidor" de flujo (pipeta), a 15 lb/in2 durante 15 min.

B) Se calibra la bomba peristáltica, previamente al paso anterior, a un flujo de 180 mL/h, que será el flujo de adición para el cultivo alimentado.

C) Una hora antes de finalizar el cultivo por lote se conecta la manguera del matraz que contiene el medio estéril a la bomba peristáltica y a la entrada del fermentador en condiciones asépticas. Al finalizar el cultivo por lote se inicia la alimentación del medio de cultivo. Esta adición terminará cuando se agoten los 900 mL de medio de cultivo.

Este cultivo operará bajos las mismas condiciones de operación del cultivo por lote: velocidad de agitación, aireación, T, pH, etc.

Se tomarán muestras cada hora, las cuales serán procesadas de acuerdo a la siguiente figura.

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Laboratorio de Biorreactores. Manual de Prácticas (10mL)

Determinación de conc. celular por turbidez

MUESTRA

(5mL)

(5mL)

Filtración al vacío

Filtrado

Paquete celular

Adicionar 5 mL de agua destilada y filtrar de nuevo

Determinación de glucosa residual

Fig. 1. Procesamiento de las muestras.

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Determinación de la conc. celular por peso seco

Laboratorio de Biorreactores. Manual de Prácticas

INFORME 1. Determinar μmax, Yx/s (global) y Rx (global) de Candida utilis en el cultivo por lote.

2. Para el cultivo alimentado elaborar las siguientes gráficas (teóricas y experimentales):

a) Concentración celular (x) vs. tiempo b) Volumen de medio de cultivo alimentado (V) vs. tiempo c) Biomasa total (X) vs. tiempo ; donde X = xV d) Glucosa residual (s) vs. tiempo e) Velocidad específica de crecimiento (μ) vs. tiempo

3. Estimar los valores de la productividad celular global (Rx

global)

y el rendimiento

celular global con base al consumo de sustrato (Yx/s global) en el cultivo por lote alimentado constantemente.

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

El alumno discutirá los resultados obtenidos en la práctica.

RESUMEN

El alumno elaborará un resumen de la práctica.

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Laboratorio de Biorreactores. Manual de Prácticas

BIBLIOGRAFÍA

1. Dunn, I. J., Mor, J.R. 1975. Variable-volumen continuous cultivation. Biotechnol. Bioeng. 17: 1805-1822. 2. Pirt, S.J. 1975. Principles of microbial and cell cultivation. Black Well Scientific Publications, London. 3. Whitaker, A. 1980. Fed-batch culture. Process Biochem. 15:10-15. 4. Yamané, T., Hirano, S. 1977. Semibatch culture of microorganism with constant feed of substrate: A mathematical simulation. J. Ferment Technol. 55:156-165.

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Laboratorio de Biorreactores. Manual de Prácticas

Cuadro 2. Resultados del cultivo por lote alimentado constantemente.

HORA

TIEMPO DE CULTIVO (h)

Concentración celular (por turbidez) No. dilu- lec g/L de ción. tutubo ra

Concentración celular (por peso seco) No. pms de tubo

pmcs

g/L

Glucosa residual

tubo lectura

Metabolito de interés

dilu- g/L ción

Cultivo por lote alimentado constantemente Flujo = 180 mL / hora Condiciones de Fermentación: Agitación: 500 rpm Aireación: 1 vvm Temperatura: 35 ºC pH : 3.8 Vop = __________

pms : peso membrana seca pmcs: peso membrana más células secas Curva tipo de biomasa pendiente (m) = ordenada (b) =

96

Reunir todas las muestras y aplicar la técnica de DNS, empleando 2 controles de 0.4 y 0.8 g/l de glucosa 0.4 g/L _________ 0.8 g/L _________

Laboratorio de Biorreactores. Manual de Prácticas

Fed Batch Lineal

Actividades:

1. Membranas a peso constante (20 membranas). 2. Preparación del medio de cultivo para el inóculo /esterilización /enfriamiento / inoculación de los matraces con la cepa en tubo inclinado. 3. Preparación del medio de cultivo para el cultivo por lote / preparación del fermentador / esterilización del fermentador con medio de cultivo / enfriamiento / inoculación con los matraces a el fermentador / desarrollo del cultivo por lote / muestreo: inicio y al final. 4. Preparación del medio de cultivo para la alimentación / esterilización en matraz junto con las tuberías y medidor (pipeta) de flujo / enfriamiento / alimentación constante (a un flujo previamente determinado) del medio al fermentador. 5. Toma de muestras (cada hora) del cultivo alimentado / determinación de absorbancia / determinación de peso seco / determinación de glucosa residual. 6. Calibración, previa, de la bomba peristáltica para el flujo determinado (preparación de las mangueras, conexiones, pinzas, pipeta graduada, etc.)

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Laboratorio de Biorreactores. Manual de Prácticas

PRÁCTICA 10

Práctica 10. Producción de biomasa en cultivo continuo

Producción de biomasa en Cultivo continuo

INTRODUCCIÓN

El cultivo continuo simple etapa pertenece al grupo denominado Sistemas Fermentativos Abiertos. En este sistema hay una entrada y salida de materiales: suministro continuo de nutrientes, y salida continua de biomasa, sustrato residual y producto. Operativamente el flujo de entrada es igual al flujo de salida por lo que el volumen de operación del biorreactor permanece constante durante todo el cultivo.

Fue en la década de los sesentas cuando se iniciaron los primeros estudios experimentales y teóricos acerca del cultivo continuo. En estos estudios se propuso la Teoría del Quimiostato, la cual a grandes rasgos, establece que al trabajar un volumen constante en cultivo continuo, y después de un determinado tiempo (el necesario para realizar

dos o tres recambios del volumen de trabajo), éste alcanza un estado de

equilibrio dinámico donde las concentraciones de biomasa, sustrato residual y producto

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permanecerán constantes en el tiempo. Esta teoría también predice que cuando se cambien los flujos de alimentación y remoción de caldo (los cuales a su vez deben ser iguales entre sí para mantener la condición de volumen constante)

el sistema se

alterará y finalmente alcanzará un nuevo equilibrio dinámico donde las concentraciones de biomasa, sustrato residual y producto ya no variarán en el tiempo pero sus valores serán

más o menos los mismos independientemente de los flujos. Sin embargo,

también predice que cuando los flujos de trabajo son más elevados que el valor de la velocidad específica máxima de crecimiento, el sistema se quedará sin células, condición conocida como lavado del fermentador, debido a que se ha rebasado la capacidad del microorganismo para metabolizar los nutrientes que le son suministrados a altas velocidades.

En un quimiostato (biorreactor de laboratorio operando en continuo) una vez que se ha alcanzado el estado de equilibrio, se crean ambientes constantes que permiten mantener indefinidamente un determinado estado fisiológico del microorganismo. Y en este estado la velocidad específica de crecimiento es constante y por ende lo son también el resto de las velocidades específicas de consumo de sustrato, de producción del metabolito, de consumo de oxígeno, y de generación de calor.

Así, uno de los principales usos del quimiostato es el de la caracterización cinética de la producción de metabolitos empleando un determinado microorganismo, en un determinado medio de cultivo y en determinadas condiciones de cultivo.

Con todo lo anterior, en un cultivo continuo puede controlarse y mantenerse aquella velocidad específica de crecimiento donde el microorganismo produzca la mayor cantidad de aquel metabolito que se desea obtener, siendo ésta la principal característica por la que fueron diseñados los sistemas de fermentación continuos.

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OBJETIVO

El alumno determinará los parámetros cinéticos de

Candida utilis creciendo en

condiciones óptimas en un cultivo continuo.

MATERIALES Y MÉTODOS

Equipo

1. Autoclave (15 litros de capacidad). 2. Baño metabólico de Temperatura controlada. 3. Fermentador con panel de control (2 ó 6 litros). 4. Electrodo de pH esterilizable. 5. Electrodo de oxígeno disuelto. 6. 3 Bombas peristálticas (0 a 2 L/h). 7. 2 Placas de calentamiento y agitación. 8. Espectrofotómetro (intervalo: 200 a 700 nm). 9. Centrífuga clínica (0 a 5000 rpm). 10.Balanza analítica (0 a 200 g de capac.). 11. Estufa con vacío. 12.Equipo de filtración con vacío.

Microorganismo utilizado: Candida utilis.

La cepa empleada se conserva en tubos en medio inclinado de PDA (papa-dextrosaagar) a una temperatura de 40C.

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Preparación de medios de cultivo

Cuadro 1. Medios de cultivo COMPONENTE

MEDIO PARA

MEDIO PARA

MEDIO PARA

EL INOCULO

EL CULTIVO

EL CULTIVO

POR LOTE (g/L)

CONTINUO

(g/L)

(g/L)

Glucosa

15.0

15.0

20.0

(NH4)2SO4

2.73

2.73

1.82

NaH2PO4

1.2637

1.2637

1.685

Extracto de levadura

0.990

0.990

1.32

* FeSO4 7H2O * CuSO4 5H2O * ZnSO4 H2O * Na2MoO4 2H2O * MnSO4 H2O Emplear agua de la llave

(*) Todas las sales están disueltas en una solución concentrada, el volumen (en mL) a emplear se calcula mediante la siguiente relación: Vsales (mL) = 0.05 [ conc. de glucosa (g/L) ] [ volumen medio (L) ] Todos los medios se ajustan a un pH=4.0 (excepto el medio para el inóculo).

Métodos Analíticos

Determinación de la concentración celular Procedimiento: el mismo de la práctica 8.

Determinación de azúcares reductores (DNS) Reactivos: los mismos de la práctica 8. Procedimiento: el mismo de la práctica 8. Curva tipo de glucosa: la misma de la práctica 8.

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DESARROLLO EXPERIMENTAL

Preparación del inóculo Se preparan 200 mL de medio de cultivo para desarrollo del inóculo, los cuales se reparten en dos matraces (de 500ml) con 100 mL de medio cada uno. Se esterilizan a 15 lb/in2 durante 15 min. Se enfría. Se inoculan con 5mL del mismo medio sobre la cepa en tubo de medio inclinado en condiciones asépticas. Se dejan incubando en una agitadora (110 golpes/minuto) a 350C durante 18 horas.

Cultivo por lote A) Se preparan 900mL de medio de cultivo para el cultivo por lote y se ajusta el pH a 4.0. El medio preparado se pasa al fermentador (previamente preparado este último) y se esteriliza en el autoclave a 15 lb/in2, 15 min. También se esterilizan los recipientes que contienen el álcali y el antiespumante.

B) El fermentador cargado con el medio estéril, se coloca en el sistema de agitación, venteo, agua de enfriamiento, etc. y después se inocula con un matraz del inóculo, en condiciones asépticas: El cultivo por lote operará bajo las condiciones descritas en el cuadro 2.

Cuadro 2. Condiciones de cultivo PARAMETROS

CONDICIONES

Velocidad de agitación

500 rpm

Aireación

1 vvm

Temperatura

35 ºC

pH (con NH4OH 2N)

3.8

Antiespumante

Polipropilenglicol al 10%

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Se tomarán muestras al inicio y al final del cultivo por lote y éste durará 12 horas. A las muestras se les debe determinar concentración celular por peso seco (por filtración) y sustrato residual por el método del DNS.

Cultivo continuo

A) Se preparan 3.0 litros de medio de cultivo para el cultivo continuo y se ajusta el pH a 3.8. El medio se prepara en un recipiente que lo contenga totalmente, y se esteriliza junto con mangueras y conexiones a 15 lb/in2 durante 15 min. Esta misma cantidad de medio de cultivo se prepara y esteriliza para cada velocidad de dilución.

B) Previamente al paso anterior se calibra la bomba peristáltica, que adicionará el medio de cultivo, a un flujo de 0.1 L/h para la 1ª velocidad de dilución. Para las restantes velocidades de dilución (D) la bomba se calibrará a los siguientes flujos: D (h-1) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 F (L/h) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

C) Media hora antes de finalizar el cultivo por lote se conecta la manguera del recipiente que contiene el medio estéril a la bomba y al puerto de suministro del fermentador, en condiciones asépticas.

Al terminar el cultivo por lote se inicia el suministro continuo del medio de cultivo al fermentador. El fluido de salida se recibe en otro recipiente el cual es marcado con la hora a la cual se inició el suministro de medio (el fluido de salida sale a través del tubo capilar colocado previamente en el fermentador).

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El cultivo continuo operará en todas las velocidades de dilución bajo las mismas condiciones de agitación (500 rpm), aireación (1 vvm), temperatura (35 ºC), pH (3.8) y control de la espuma.

D) Se recomienda que cinco minutos antes de terminar la adición de todo el medio de cultivo para la 1ª velocidad de dilución, se tome muestra para la determinación de concentración celular y glucosa residual.

Esto mismo se repite para cada una de las velocidades de dilución restantes. También se deben tomar 2 mL del medio alimentado para determinar la concentración de glucosa.

E) Al finalizar la adición de todo el medio del cultivo para la 1ª velocidad de dilución, se inicia inmediatamente la adición del siguiente medio de cultivo (preparado y esterilizado previamente) para la segunda velocidad de dilución y al segundo flujo de adición. Esto mismo se repite para las velocidades de dilución restantes.

F) En cada velocidad de dilución tomar una pequeña muestra para observarla al microscopio y detectar cualquier contaminación. Si esto ocurre, detener la fermentación y repetir la velocidad de dilución que se estaba trabajando.

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INFORME

1. Determinar Yx/s (global) y Rx (global) de Candida utilis en el cultivo por lote. 2. Para el cultivo continuo elaborar lo siguiente: a) Tabular los valores de concentración celular (x), glucosa residual (s), rendimiento celular en base al consumo de sustrato (Yx/s), velocidad específica de consumo de sustrato (qs ) y la productividad celular (Rx ) en función de la velocidad de dilución (D). b) Gráfica de la concentración celular (x) v.s. velocidad de dilución (D). c) Gráfica de la concentración de glucosa residual (s) v.s. velocidad de dilución (D). d) Gráfica de la productividad celular (Rx ) v.s. velocidad de dilución (D). e) Gráfica de la velocidad específica de consumo de sustrato (qs ) v.s. velocidad de dilución (D). e.1) Obtención de los valores de (m) y (Yg). f) Gráfica de la velocidad específica de consumo de oxígeno (qo2 ) v.s. velocidad de dilución (D). f.1) Determinación de (mos) y (Yog). si ΔHglucosa = 3.74 kcal/g

;

ΔHcelulas = 5.61 kcal/g

g) Gráfica de la velocidad específica de genración de calor (qk) v.s. velocidad de dilución (D). g.1) Determinación de (mk) y (Ykg). DISCUSIÓN DE RESULTADOS El alumno discutirá los resultados obtenidos en la presente práctica.

RESUMEN El alumno elaborará un resumen de la presente práctica.

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BIBLIOGRAFÍA

1. Wang, D.I.C., Cooney, C.L., Demain, A.L., Dunill, P., Humphrey, A.E., Lilly, M.D. 1978. Fermentation and enzyme technology. John Wiley and Sons. 2. Tempert, D.W. 1970. The continuous cultivation of micro-organisms. I. Theory of the Chemostat. Methods in Microbiology. Vol. 2. Academic. Press. 3. Herbert, A., Elsworth, F., Telling, H. 1956. The continuous culture of bacteria; a theoretical and experimental study. Journal of Microbiology 14, 601-622.

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HORA

TIEMPO DE CULTIVO (h)

CONCENTRACION CELULAR (por turbidez) No. dilu- lec g/L de ción tu tubo ra

CONCENTRACION CELULAR (por peso seco) No. pms pmcs g/L de Mta

GLUCOSA RESIDUAL

METABOLITO DE INTERES

No. dilu- lectu g/L de ción ra tubo

Cultivo continuo de una etapa HORA to tf

Vr D (L) (h-1) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

F SF (L/h) g/L

[x]

[s] Condiciones de Fermentación: Agitación: 500 rpm Aireación: 1 vvm Temperatura: 35 ºC pH : 3.8

M : membrana Reunir todas las muestras pms : peso membrana seca y aplicar la pmcs: peso membrana mas células secas. técnica de DNS, empleando 2 testigos de 0.4 y 0.8 g/L de glucosa 0.4 g/L _________ 0.8 g/L _________

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Cultivo continuo

Actividades:

1. Membranas a peso constante (20 membranas). 2. Preparación del medio de cultivo para el inóculo /esterilización /enfriamiento / inoculación de los matraces con la cepa en tubo inclinado. 3. Preparación del medio de cultivo para el cultivo por lote / preparación del fermentador / esterilización del fermentador con medio de cultivo / enfriamiento / inoculación con los matraces a el fermentador / desarrollo del cultivo por lote / muestreo: inicio y al final. 4. Preparación del medio de cultivo para cada VELOCIDAD DE DILUCIÓN / esterilización en matraz junto con las tuberías y medidor (pipeta) de flujo / enfriamiento / alimentación (a un flujo previamente determinado) del medio al fermentador. 5. Toma de muestras, 10 minutos antes de terminar la correspondiente VELOCIDAD DE DILUCIÓN/ determinación de absorbancia / determinación de peso seco / determinación de glucosa residual. 6. Calibración, previa, de la bomba peristáltica para el flujo determinado para cada VELOCIDAD DE DILUCIÓN

(preparación de las mangueras,

conexiones, pinzas, pipeta graduada, etc.).

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