Manual de Practicas de Microbiología Ambiental

Universidad Complutense FACULTAD DE FARMACIA

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA II GUIA DE PRACTICAS DE

MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA AMBIENTAL Cuarto Curso 2000/2001

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ÍNDICE CALENDARIO DE PRÁCTICAS .................................................................. 2 PRÁCTICA 1.- MICROBIOLOGÍA DEL SUELO................................................................ 5 1.1.- Preparación de la diluciones.................................................................................. 5 1.2.- Recuento de microorganismos aerobios viables................................................... 6 1.2.1.- Siembra en medio sólido ................................................................................. 6 1.3.- Ciclo del nitrógeno ................................................................................................. 6 1.3.1.- Recuento de microorganismos proteolíticos .................................................. 6 1.3.2.- Recuento de microorganismos amonificantes:............................................... 6 1.3.3.- Recuento de microorganismos nitrificantes.................................................... 7 1.4.- Ciclo del carbono:.................................................................................................. 8 1.4.1.- Recuento de microorganismos amilolíticos: .................................................... 8 1.4.2.- Recuento de microorganismos celulolíticos:................................................... 8 PRÁCTICA 2. CONTROL MICROBIOLÓGICO DEL AIRE.............................................. 11 2.1.- Métodos de recuento........................................................................................... 12 2.1.1. Método de la gravedad................................................................................... 12 2.1.1. Método de impacto. ........................................................................................ 12 2.2.- Identificación de las colonias............................................................................... 12 PRÁCTICA 3. INVESTIGACIÓN DE Pseudomonas aeruginosa EN AGUAS............. 13 3.1.Método de enriquecimiento .................................................................................... 13 3.2. Método de filtración (método alternativo)............................................................. 15 PRÁCTICA 4. INVESTIGACIÓN DE Staphylococcus aureus EN AGUAS.................. 17 4.1.- Técnica:............................................................................................................... 18 PRÁCTICA 5. INVESTIGACIÓN DE Legionella EN EL AMBIENTE.............................. 19 5.1.- Toma de muestras ............................................................................................... 19 5.1.1. Agua de abastecimiento:................................................................................ 20 5.1.2. Torres de refrigeración y depósitos: ............................................................. 20 5.2.- Tratamiento de la muestra ................................................................................... 20 5.2.1. Concentración................................................................................................ 20 5.2.2. Tratamiento..................................................................................................... 20 5.3.Técnica .................................................................................................................. 20 PRÁCTICA 6. RECUENTO DIRECTO DE MICROORGANISMOS EN AGUAS POR EPIFLUORESCENCIA...................................................................................................... 23 6.1.- Técnica:............................................................................................................... 23 6.1.1. Tratamiento de los filtros................................................................................ 23 6.1.2. Tinción............................................................................................................ 23 6.1.3. Filtración......................................................................................................... 23 6.1.4. Montaje del filtro. ............................................................................................ 23 6.1.5. Interpretación de la observación al microscopio:........................................... 23 6.2.- Lectura. ............................................................................................................... 24 1

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CALENDARIO DE PRÁCTICAS Lunes: Práctica 1.- Microbiología del suelo. - Preparación de la muestra y de las diluciones. - Recuento de microorganismos aerobios viables. Siembra en placas. - Recuento de microorganismos proteolíticos. Siembra por el NMP - Recuento de microorganismos amonificantes. Siembra por el NMP - Recuento de microorganismos nitrificantes. Siembra por el NMP - Recuento de microorganismos amilolíticos. Siembra por el NMP - Recuento de microorganismos celulolíticos. Siembra por el NMP Práctica 2.- Control m icrobiológico del aire - Método de gravedad - Método de impacto

Martes: Práctica 3.- Investigación de Pseudomonas aeruginosa en aguas - Método de enriquecimiento. Siembra en caldo lactosado - Método de filtración. Siembra en agar cetrimida Práctica 4.- Investigación de Staphylococcus aureus en aguas - Siembra en caldo triptona-soja Práctica 5.- Investigación de Legionella en el am biente - Tratamiento de la muestra - Siembrar en agar BCYE

Miércoles: Práctica 6.- Recuento directo de m icroorganism os en aguas epifluorescencia - Resultados. Práctica 3.- Investigación de Pseudomonas aeruginosa en aguas. - Método de enriquecimiento. Siembra en agar cetrimida - Método de filtración: . Siembra en agar F y P . Tinción de Gram . Prueba de la oxidasa - Práctica 4.- Investigación de Staphylococcus aureus en aguas. - Siembra en agar Baird-Parker - Práctica 5.- Investigación de Legionella en el am biente - Siembra en agar sangre

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por

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Viernes: Práctica 1.- Microbiología del suelo. - Lectura del recuento de bacterias aerobias - Lectura del recuento de microorganismos proteolíticos - Lectura del recuento de microorganismos amonificantes - Lectura del recuento de microorganismos nitrificantes - Lectura del recuento de microorganismos amiliolíticos - Lectura del recuento de microorganismos celulolíticos - Resultados Práctica 2.- Control m icrobiológico del aire - Lectura: recuentos de bacterias y hongos - Tinción de colonias - Resultados Práctica 3.- Investigación de Pseudomonas aeruginosa - Extracción de piocianina - Resultados Práctica 4.- Investigación de Staphylococus aureus en aguas. - Lectura agar Baird-Parker - Catalasa, tinción de Gram - Aglutinación - Resultados Práctica 5.- Investigación de Legionella en el am biente - Lectura agar sangre - Resultados

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PRÁCTICA 1.- MICROBIOLOGÍA DEL SUELO Fundam ento: El suelo contiene una gran población de microorganismos, (bacterias, hongos, algas y protozoos), cuyas actividades tienen una gran importancia en la fertilidad del suelo. Intervienen en los ciclos de la materia (N2, C, S, P), mineralizando la materia orgánica convirtiéndola en nutrientes asimilables por las plantas y transformando compuestos de importancia geológica (carbón, petróleo, azufre) y ambientales (pesticidas). El estudio de los microorganismos del suelo y su actividad es complejo, nosotros exponemos un conjunto de técnicas básicas, aplicables a la mayoría de los suelos, que nos permitan conocer cuantitativamente la biodiversidad de este hábitat y algunas de las principales actividades de los diferentes grupos fisiológicos que intervienen en los ciclos del carbono y el nitrógeno. Material necesario: -

Muestra de suelo 1 matraz con 90 ml de agua destilada estéril 1 bolsa estéril con filtro 9 tubos con 9 ml de agua destilada estéril 6 tubos con agar extracto de tierra 6 placas de Petri 24 tubos con medio de gelatina 24 tubos en medio de asparragina 18 tubos con medio de sulfato amónico 24 tubos con medio de almidón 12 tubos con medio de celulosa Estufa de incubación 28 ± 2º C Pipetas de 1 ml Tubos de hemólisis Reactivo de Nessler Reactivo de difenilamina sulfúrica Lugol

1.1.- Preparación de la diluciones Pesar 10 g de suelo tamizado y homogeneizado. Añadir 90 ml de agua destilada estéril y triturar en una bolsa estéril con filtro en un “Stomacher” durante 1 minuto. Recoger el filtrado en un matraz estéril. Si fuera necesario filtrar por papel de filtro estéril.Así obtenemos la dilución 10-1. Para obtener las siguientes diluciones, agitar vigorosamente el matraz y tomar 1 ml de la 10-1 y transferirlo a un tubo con 9 ml de agua destilada estéril, completando la agitación por aspiración con ayuda de una pipeta. Así tenemos la dilución 10-2.Seguir la misma técnica cambiando la pipeta en cada paso, preparando a partir de cada dilución la siguiente hasta la 10-10.

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1.2.- Recuento de m icroorganism os aerobios viables Fundamento: Sembrar las diluciones del suelo en un medio de cultivo apto para el desarrollo de la mayoría de los microorganismos.

1.2.1.- Siembra en medio sólido Medio de cultivo: Extracto de tierra solidificado con 15g de agar por litro . Repartir en tubos gruesos a razón de 20 ml por tubo. Esterilizar a 121 ºC, 15 minutos. Método: Sembrar 0,1 ml de las diluciones 10-5 a 10-7, dos placas de cada dilución. Añadir 20 ml del medio fundido y a temperatura de 50º C. Se incuban en la estufa a 28º C en ambiente húmedo. A los 5 días aparecerán colonias sobre las placas, procediéndose al recuento de las mismas. Hacer la media de cada dilución y expresar el número de microorganismos viables en ufc/g de suelo.

1.3.- Ciclo del nitrógeno 1.3.1.- Recuento de microorganismos proteolíticos Fundamento: Sembrar las diluciones del suelo en un medio que contiene gelatina como fuente de proteínas y observar su liquefacción. Medio de cultivo: Solución salina de Winogradsky Gelatina Solución de oligoelementos Agua destilada, hasta completar

50 ml 30 g 1 ml 1.000 ml

Fundir la gelatina en el medio y repartir en caliente en tubos a razón de 9 ml por tubo. Esterilizar a 110º C durante 20 minutos. Método: Sembrar de las diluciones 10-3 a 10-10 a razón de 1 ml por tubo y tres tubos para cada dilución. Se incuban a 28º C durante 15 días, observando diariamente. Como a esa temperatura la gelatina está líquida, para hacer las lecturas y poder apreciar la liquefacción, se introducen los tubos una hora en la nevera. Los tubos positivos, presentan la gelatina liquida. Determinar el Número Más Probable (NMP) por g de suelo , consultando las tablas de Mc Crady, contando para cada dilución, el número de tubos positivos.

1.3.2.- Recuento de microorganismos amonificantes: Fundamento: Sembrar las diluciones del suelo en un medio líquido que contiene asparragina como fuente de carbono y nitrógeno, detectando el amoníaco producido por la acción de las bacterias amonificantes mediante el reactivo Nessler. 6

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Medio de cultivo: Solución salina de Winogradsky Asparragina Solución de oligoelementos Agua destilada, hasta completar

50 ml 0,2 g 1,0 ml 1.000 ml

Repartir en tubos a razón de 9 ml por tubo y esterilizar a 110º Cdurante 20 minutos. Método: Sembrar las diluciones 10-2 a 10-9 poniendo 1 ml en cada tubo y tres tubos por cada dilución. Incubar en la estufa a 28º C durante 15 días. Investigación del amoníaco por el método de Nessler. El reactivo Nessler se compone de dos soluciones: Solución 1: Yoduro mercúrico Yoduro potásico

50 g 36,5 g

Se trituran en mortero, añadiendo poco a poco 1.000 ml de agua destilada. Solución 2. Hidróxido potásico puro Agua destilada q.s.p.

150 g 1.000 ml

El ensayo se hace en tubos de Kahn o hemólisis. Con una pipeta estéril se toma 1 ml de la dilución problema y a este se le añade una gota de cada solución del reactivo Nessler. Los tubos positivos dan un precipitado anaranjado y los negativos amarillos. Determinar el NMP/g de suelo.

1.3.3.- Recuento de microorganismos nitrificantes Recuento de bacterias nitrosas. Fundamento: Estas bacterias transforman los compuestos nitrogenados en nitritos. Para su estudio se siembran las diluciones del suelo en un medio que contiene sulfato amónico, que las bacterias nitrosas deben transformar en nitritos, los cuales se detectan con el reactivo de la difenilamina sulfúrica. Medio de cultivo: Solución salina de Winogradsky Sulfato amónico Carbonato cálcico Agua destilada, hasta completar

50ml 0,5 g 1 ml 1.000 ml

Repartir 9 ml en cada tubo y esterilizar a 110º C durante 20 minutos.

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Método: Sembrar de las diluciones 10-1 a 10-6 con 1 ml en cada tubo y tres tubos por dilución. Se incuban a 28º C, durante 15 días. La producción de nitritos se investiga con el reactivo de la difenilamina sulfúrica. Preparación del reactivo: Difenilamina 1g Ácido sulfúrico 100 ml Disolver la difenilamina en el ácido sulfúrico y verter la mezcla sobre 20 ml de agua destilada. Se hace una única lectura a los 16 días de cultivo. Para ello a cada tubo se le incorporan 10 gotas de ácido sulfúrico y otras 10 gotas del reactivo. La presencia de nitritos viene dada por una intensa coloración azul. Determinar el NMP/g de suelo.

1.4.- Ciclo del carbono: 1.4.1.- Recuento de microorganismos amilolíticos: Fundamento: Detectar la presencia de microorganismos que degradan el almidón sembrando las diluciones del suelo en un medio liquido que lo contenga como fuente de carbono, demostrando su degradación por el reactivo yodo-yodurado (Lugol).

Medio de cultivo: Solución salina de Winogradsky Extracto de tierra Almidón Nitrato amónico Solución de oligoelementos Agua destilada, hasta completa

50 ml 10 ml 1,5 g 1g 1 ml 1.000 ml

Repartir 9 ml por tubo y esterilizar 20 minutos a 110º C. Método: Sembrar 1 ml de las diluciones 10-3a 10-10 y tres tubos para cada dilución. Incubar a 28º C, durante 15 días. La hidrólisis del almidón se investiga, tomando con una pipeta estéril 1 ml de cada tubo y añadiendo a esta muestra una gota del reactivo. El color violeta indica resultado negativo. Los tubos positivos toman el color del reactivo (ligeramente amarillo).Determinar el NMP/g de suelo. 1.4.2.- Recuento de microorganismos celulolíticos: Medio de cultivo: Solución salina de Winogradsky Extracto de tierra Nitrato amónico Carbonato cálcico Agua destilada, hasta completar

50 ml 20 ml 1g 3g 1.000 ml

Se reparte en tubos a razón de 9 ml por tubo. Se pone una tira de papel de filtro en cada tubo y se esterilizan a 110º C durante 20 minutos. 8

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Método: Sembrar con las diluciones del suelo los tubos a razón de 1 ml por tubo empleando de 10-1 a 10-4 y 3 tubos por cada dilución. Incubar a 28º C durante 15 días. Los tubos positivos presentan envejecimiento, manchas y destrucción del papel. Determinar el NMP/g de suelo. TABLA DE Mc CRADY. (3 tubos por dilución ) Número característico

Número de microbios

Número caracteristico

Número de microbios

Número característico

Número de microbios

000 001 010 011 020 100 101 102 110 111 120 121 130 200

0,0 0,3 0,3 0,6 0,6 0,4 0,7 1,1 0,7 1,1 1,1 1,5 1,6 0,9

201 202 210 211 212 220 221 222 223 230 231 232 300 301

1,4 2,0 1,5 2,0 3,0 2,0 3,0 3,5 4,0 3,0 3,5 4,0 2,5 4,0

302 310 311 312 313 320 321 322 323 330 331 332 333

6,5 4,5 7,5 11,5 16,0 9,5 15,0 20,0 30,0 25,0 45,0 110,0 140,0

RESULTADOS Recuentos de microorganismos: Aerobios variables:

ufc/g

Proteolíticos:

NMP/g

Amonificantes:

NMP/g

Nitrificantes:

NMP/g

Amilolíticos:

NMP/g

Celulolíticos: NMP/g

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PRÁCTICA 2. CONTROL MICROBIOLÓGICO DEL AIRE. Fundam ento: El examen microbiológico del aire es del gran interés en el ambiente exterior y en los recintos cerrados como locales públicos, hospitales y en determinadas zonas de las industrias alimentarias y farmacéuticas. La presencia en el aire de microorganimso patógenos y saprofitos puede causar infecciones en la población y contaminar diversos productos originando su alteración. Material necesario: -

Placa Petri con agar caseína-soja Placa Petri con agar Sabouraud Aparato muestreador Biotest Tiras con agar triptona-soja Estufas de incubación a 30º C y 22º C

Medios de cultivo: - Agar caseína-soja: Digerido pancreático de caseína Digerido papaínico de harina de soja Cloruro sódico Agar Agua destilada

15 g 5g 5g 15 g 1000 ml

Disolver todos los componentes con ayuda del calor. Ajustar el pH a 7± 0,2. Esterilizar en autoclave a 121º C durante 20 minutos.

- Agar Sabouraud: Glucosa Peptona Agar Agua destilada

40 g 10 g 15 g 1000 ml

Disolver todos los componentes con calor. Ajustar el pH a 5,6 ± 0,2. Esterilizar a 121º C durante 20 minutos.

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2.1.- Métodos de recuento 2.1.1. Método de la gravedad 2.1.1. Método de impacto. 2.2.- Identificación de las colonias.

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PRÁCTICA 3. INVESTIGACIÓN DE Pseudomonas aeruginosa EN AGUAS. Fundam ento: Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista que cuando encuentra condiciones favorables puede ocasionar infecciones graves. Su hábitat es el suelo, aguas, plantas y también se puede encontrar en las heces. Es un microorganismo extraordinariamente adaptable porque puede utilizar un gran número de compuestos orgánicos diferentes y además es resistente a muchos de los agentes antimicrobianos. Su presencia en las aguas de bebida envasadas se considera un índice de contaminación. También se investiga en las aguas de recreo como índice de calidad, por su resistencia al cloro.

3.1.Método de enriquecim iento Material necesario: - Muestra de agua. - 1 matraz con 100 ml de caldo lactosado con magnesio a concentración doble. - 1 placa de agar cetrimida. - 1 placa de agar F. - 1 placa de agar P. - Reactivo de la oxidasa - Cloroformo - Estufas de incubación a 37ºC y 42 ºC. Medios de cultivo: - Caldo lactosado con magnesio: Extracto de carne Peptona Lactosa Sulfato magnésico Agua destilada

6g 10 g 10 g 1g 1.000 ml

Ajustar el pH a 6,9-72. Envasar asépticamente en matraces a razón de 100 ml. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. - Agar cetrimida: Peptona Cloruro magnésico Sulfato potásico Cetrimida Agar Agua Añadir

20 g 1,4 g 10 g 0,5 g 14 g 1.000 ml 10 ml de glicerol.

Ajustar el pH a 7. Envasar en tubos a razón de 15 ml (para placas). Esterilizar a 121ºC durante 15 minutos 13

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- Agar F: (medio King A) Peptona Glicerol Fosfato potásico Sulfato magnésico Agar Agua destilada

20 g 10 g 1,5 g 1,5 g 15 g 1.000 ml

Disolver los componentes. Ajustar el pH a 7,2. Esterilizar a 121º C durante 15 minutos. Tender placas. - Agar P: (medio King B) Peptona Glicerol Sulfato potásico Agar Agua destilada

20 g 10 g 1,4 g 15 g 1.000 ml

Disolver los componentes. Ajustar el pH a 7,2. Esterilizar a 121 º C durante 15 minutos. Tender placas.

Técnica: - Cultivo y aislamiento: - Sembrar 100 ml del agua problema en un matraz que contiene 100 ml de caldo lactosado con magnesio a concentración doble. Incubar a 37º C durante 24-48 horas. - Después de la incubación se examina el crecimiento del medio que se manifiesta como un enturbiamiento. Sembrar de este cultivo, con asa, una placa de agar cetrimida. Incubar a 42 º C durante 24 horas. Si las colonias desarrolladas en este medio son verdosas y fluorescentes se procede a su identificación. - Identificación: Sembrar una placa de agar F y otra de agar P (haciendo rayas paralelas), a partir de una colonia de agar cetrimida. Incubar a 42º C durante 24 horas. - Morfología y tinción: A partir de una colonia de los medios agar F o agar P, hacer un frotis sobre un portaobjetos y teñir por tinción de Gram. Observar al microscopio con objetivo de inmersión, bacilos finos Gram negativos (0,3 X 3 micras). - Prueba de la Oxidasa: Se trazan rayas con una varilla de vidrio cargada de bacterias sobre tiras de papel impregnadas en solución acuosa al 1% de tetrametil-para fenilenodiamina. En caso positivo las colonias cambian de color, pasando a púrpura y negro.

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- Producción de los pigm entos fluoresceina y piocianina: La presencia de P. aeruginosa sobre la placa de agar F se manifiesta por la aparición de un pigmento amarillo fluorescente (fluoresceina) difusible en el medio, y sobre la placa de agar P aparece un pigmento azul (piocianina). A partir de la placa de agar P, añadir unos milílitros de cloroformo para extraer el pigmento piocianina y recoger en un tubo. En caso positivo el cloroformo tomará color azul. P. fluorescens solo tiene el pigmento fluoresceina.

3.2. Método de filtración (m étodo alternativo) Fundam ento: Investigar la presencia de P. aeruginosa mediante filtración a través de membrana de un volumen de agua y posteriormente incubar el filtro sobre medio de cultivo selectivo. Material necesario: Aparato de filtración estéril Filtros de membrana de 0,45 µm estériles Pinzas Bomba de vacío 1 placa con agar cetrimida 1 matraz con 30 ml de agua destilada estéril

Técnica: Colocar el filtro sobre el soporte de filtración con las pinzas estériles. Adaptar el embudo. Filtrar 100 ml ó 250 ml del agua; previamente homogenizada, efectuando el vacío. Lavar el filtro con agua destilada estéril. Mediante las pinzas estériles transferir el filtro sobre el medio agar cetrimida de modo que la superficie de filtración quede hacia arriba. Incubar a 42ºC durante 24 horas. Con una colonia característica proceder a su identificación como en el método de preenriquecimiento con caldo lactosado

RESULTADOS

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PRÁCTICA 4. INVESTIGACIÓN DE Staphylococcus aureus EN AGUAS Fundam ento S. aureus es un microorganismo patógeno capaz de producir una gran diversidad de síndromes clínicos. Posee enzimas que hidrolizan un amplio espectro de sustratos y produce diversas toxinas: hemolisinas, exfoliatina y enterotoxinas. La presencia de cepas toxigénicas en aguas envasadas y de recreo puede ser causa de infecciones.

Material necesario -

1 matraz con 100 ml de caseína-soja a concentración doble 1 placa de agar Baird - Parker Agua oxigenada de 30 volúmenes Reactivos para técnica de aglutinación

Medios de cultivo - Caldo caseína-soja Digerido pancreático de caseína17 g Digerido papaínico de harina de soja Cloruro sódico Fosfato dipotásico Glucosa monohidrato Agua destilada

3g 5g 2,5 g 2,5 g 1000 ml

Disolver los componentes con ayuda del calor.Ajustar el pH a 7 y esterilizar a 121ºC durante 20 min. -Agar Baird-Parker Digerido pancreático de caseína Extracto de carne Extracto de levadura Cloruro de litio Agar Glicina Piruvato sódico Agua destilada

10 g 5g 1g 5g 20 g 12 g 10 g 1000 ml

Disolver los componentes con ayuda del calor. Ajustar el pH a 6,8 y esterilizar a 121ºC durante 20 min. Enfriar a 45-50º C y añadir 50 ml de emulsión de yema de huevo y 10 ml de solución estéril de telurito potásico (1 %). Mezclar y verter en placas.

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4.1.- Técnica: - Cultivo y aislamiento En el matraz con 100 ml de caldo caseína-soja se siembran 100 ml del agua. Incubar a 35-37ºC durante 24-48 horas. Después de la incubación se observa el crecimiento por la turbidez. Para confirmar la presencia de S. aureus sembrar con el cultivo anterior las placas de agar Baird-Parker sobre la superficie con el asa bacteriológica. Incubar a 37ºC durante 24-48 horas. Las colonias de S. aureus son muy típicas, negras brillantes, rodeadas de un halo opaco. Con las colonias que presentan estas características realiza las pruebas de identificación. - Identificación - Morfología y tinción: A partir de una colonia característica hacer un frotis sobre un portaobjetos y teñir por tinción de Gram. Observar al microscopio con objetivo de inmersión, cocos Gram positivos agrupados en parejas y masas semejantes a racimos. - Catalasa: Poner en un portaobjetos una gota de agua oxigenada de 30 volúmenes e introducir el asa con las bacterias. En caso positivo se desprenden burbujas. - Identificación por aglutinación: Poner en un portaobjetos limpio una gota de suspensión de hematíes de cordero sensibilizados con fibrinógeno y estabilizados y una gota de suspensión de hematíes testigo. En cada una de las gotas dispersar con cuidado una o dos colonias sospechosas con pipeta Pasteur o con asa de platino. Dar al portaobjetos un ligero movimiento de rotación. Una aglutinación masiva que aparezca en 15 segundos en la suspensión de hematíes sensibilizados indica que la cepa problema pertenece a la especie S. aureus. Una aglutinación con los hematíes testigos hace que la reacción sea no interpretable. RESULTADOS:

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PRÁCTICA 5. INVESTIGACIÓN DE Legionella EN EL AMBIENTE Fundam ento Legionella es una bacteria que se encuentra en ambientes acuáticos naturales y desde ellos puede acceder a instalaciones como los sistemas de agua de abastecimiento, piscinas, riego y climatización, donde se multiplica hasta concentraciones infectantes para el hombre. A partir de esos lugares, la bacteria puede alcanzar aparatos productores de aerosoles (duchas, torres de refrigeración) que puedan penetrar por vía respiratoria produciendo la legionelosis o “enfermedad del legionario”. Legionella pneumophila es la especie que produce la mayoría de los casos de legionelosis y la que se aísla con mayor frecuencia en muestras ambientales. Su investigación en este tipo de muestras es fundamental para determinar el origen de un brote epidémico y poder controlarlo. Material necesario: -

Muestra de agua Centrifuga a 4.000 rv Baño de agua a 58º ± 2ºC Tampón pH 2,2 2 placas de Agar BCYEα 1 placa de agar sangre Estufa de incubación a 35º ± 2ºC

Medio de cultivo: Agar BCYEα = (buffered - charcoal - yeast extract - α-ketoglutarate) Tampón ACES 10 g Hidróxido potásico 2,8 g Carbón activado 1,5 g Extracto de levadura 10 g Agar 17 g α - cetoglutarato monopotasico 1g Agua 1l Esterilizar a 120º C, 20 minutos. Enfriar a 50º C. Añadir 10 ml de una solución esterilizada por filtración de cloruro de L-cisteina (4%) y 10 ml de pirofosfato férrico (2,5%). Repartir en placas de Petri.

5.1.- Tom a de m uestras Las muestras deben recogerse en frascos estériles con cierrre hermético y transportados a temperaturas de refrigeración.

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5.1.1. Agua de abastecimiento: Tomar el agua caliente, abriendo el grifo o ducha suavemente y recogiendo los primeros 100 ml. Rascar el interior del grifo o la alcachofa de la ducha con una torunda de algodón y arrastrar los residuos con una pequeña cantidad de agua. 5.1.2. Torres de refrigeración y depósitos: Tomar la muestra de la parte baja junto con restos de lodo, rascando posibles incrustaciones de la pared. Recoger un litro. 5.2.- Tratam iento de la m uestra 5.2.1. Concentración. Concentrar la muestra 100 veces centrifugando a 4.000 rv durante 10 minutos, o filtrando a través de filtros de 0,22 µm. Resuspender el concentrado en 1 - 2 ml del agua en estudio. 5.2.2. Tratamiento. - Por calor: Incubar 1 ml del concentrado a 60º C, durante 3 minutos o, a 58º C durante 5 minutos en un baño de agua. - Con ácido: Mezclar 0,1 ml del concentrado con 0,9 ml de tampón HCI / KCI (pH = 2,2), durante 5 minutos.

5.3.Técnica Cultivo y aislamiento Sembrar por estría 0,1 ml de la muestra concentrada y tratada tanto por calor como por ácido en placas de Petri con medio BCYEα. Incubar a 35ºC hasta 10 días. Las colonias aparecen a las 48 horas, pero para considerar un cultivo negativo debe mantenerse 15 días. Las colonias son de borde entero, brillantes de color gris azulado con aspecto opalino. Identificación Legionella pneumophila es un bacilo Gram negativo, móvil oxidasa posiitvo. Se tiñe mal por la tinción de Gram por lo que se emplean otras tinciones (Gimenez, fluorescencia). Para una identificación presuntiva sembrar las colonias típicas obtenida en BCYEα. en agar sangre. Incubar a 35 ºC, 48 horas. No debe obtenerse crecimiento, ya que esta bacteria no crece en agar sangre. La prueba confirmativa se realiza por inmunofluorescencia o aglutinación empleando anticuerpos específicos.

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RESULTADOS:

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PRÁCTICA 6. RECUENTO DIRECTO DE MICROORGANISMOS EN AGUAS POR EPIFLUORESCENCIA Material necesario: - Muestra de agua - Microscopio con lámpara de epifluorescencia - Solución de Irgalan Black al 0,2% en ácido acético al 2% - Filtros Nucleopore de 0,20µm - Aceite de vaselina - Agua estéril - Porta y cubreobjetos - Pipetas estériles - Pinzas - Aceite de inmersión 6.1.- Técnica: 6.1.1. Tratamiento de los filtros. Para evitar la autófluorescencia y aumentar el contraste, se tiñen los filtros durante varias horas (24 h) con un colorante negro (Irgalan Black); antes de su utilización se lavan dos veces con agua destilada estéril. 6.1.2. Tinción. - Se toman 2 ml del agua problema y se tiñen con el colorante fluorescente naranja de acridina (0,2 ml) durante 5 minutos. 6.1.3. Filtración. - Se filtra a través de filtros Nucleopore de 0,20 µm de poro y de 25 mm de diámetro. - Lavar 2 veces con 2 ml de agua destilada estéril y filtrada. 6.1.4. Montaje del filtro. Se coloca el filtro en un portaobjetos y encima se deposita una gota de aceite de vaselina, se coloca el cubreobjetos, se pone el aceite de inmersión y se observa al microscopio de epifluorescencia. 6.1.5. Interpretación de la observación al microscopio: Los microorganismos activos se observan con una coloración rojo-naranja, las células lisadas y detritus en naranja y los micoorganismos vivos inactivos en verde.

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6.2.- Lectura. Contar las bacterias fluorescentes presentes en 25-50 campos elegidos al azar. Calcular la media aritmética (X) y expresar por ml de muestra, multiplicando por un factor F, según la superficie del filtro y la cantidad filtrada. •

F = para filtros de 25 mm de diámetro

F=

Nº de campos en el filtro 25.511,19 = Nº de ml filtrados 2

RESULTADOS

Número de microorganismos por ml = X × F

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