Manual de Practicas Biologia Molecular Uv

 

 

2018 

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR 

ELABORARON: DRA. NAYALI A. LÓPEZ BALDERAS DR. ROBERTO LAGUNES TORRES DRA. ROSA MARÍA TORRES HERNÁNDEZ DRA. MARTHA LETICIA ZAMUDIO AGUILAR DR. RAUL MARISCAL REYES DR. JONATHAN GARCÍA ROMÁN DR. ÁNGEL ALBERTO PUIG LAGUNES DRA. MONTSERRAT MELGAREJO GUTIÉRREZ 

Fecha de Elaboración: 2018

 

 AREA DE CIENCIAS CIENCIAS DE LA SALUD

Misión Formar Médicos Cirujanos competentes para promover la salud, prevenir, diagnosticar, tratar y rehabilitar las enfermedades que afectan a la población; a través de un programa educativo de calidad, pertinente, que fomenta la investigación, distribución del conocimiento, innovación y la sustentabilidad.

Visión En el año 2030 el programa educativo de Licenciatura de Médico Cirujano de la Universidad Veracruzana, es reconocido por formar profesionales competentes y humanistas en los ámbitos estatales, nacionales e internacionales; a través de la docencia, investigación, difusión de la cultura, y vinculación con los sectores de la sociedad, con una organización académica y administrativa moderna, innovadora y sustentable, fundamentada en la legislación universitaria.

 

 

Perfil de egreso El egresado de la licenciatura de médico cirujano de la Universidad Veracruzana, es el profesional que tiene por objeto de estudio la salud de las personas a nivel individual y colectivo; las funciones profesionales que desarrolla son promoción de la salud, prevención, diagnóstico, tratamiento y rehabilitación de enfermedades. Las necesidades sociales que atiende el médico cirujano se enfocan en el primer nivel de atención, donde se brinda prevención, primaria, secundaria y terciaria a la sociedad orientada hacia la resolución de los problemas demográficos Y epidemiológicos de la región.

Así mismo, puede desarrollar desarrollar actividades de

docencia, investigación y servicio que le permita hacer acercamientos muy puntuales con las poblaciones, diseñar las estrategias y diseñar los escenarios para derivar hacia los siguientes niveles de atención que permita una real atención integral, siendo el principal elemento de articulación de todo el sistema de salud, entonces socialmente incide en los cambios de los estilos de vida para procurar un estado de salud constante. Los espacios laborales son principalmente consultorios, clínicas y unidades hospitalarias de los ámbitos públicos, sociales y privados. En el campo de la promoción, investigación y docencia se amplían los sectores de acuerdo al abordaje de las problemáticas de salud.

Competencias genéricas El egresado de médico cirujano de la Universidad Veracruzana desarrollará seis competencias profesionales que a continuación se detallan: 1. Comunicación médico  –  paciente. Comunicarse con el paciente y/o familia, a través de un lenguaje asertivo, claro, preciso, empático, respetuoso y en un clima de confianza, con la finalidad de otorgar atención médica de calidad. 2. Educación para la salud. Educar al individuo, familia y comunidad sobre la conservación de la salud y prevención de las enfermedades, aplicando estrategias educativas para la promoción de la salud y prevención de la enfermedad, con una actitud de respeto, tolerancia, justicia, equidad, solidaridad, y responsabilidad

 

social, fundamentándose en los enfoques teóricos metodológicos de la educación para favorecer un ambiente saludable y mejorar la calidad de vida. 3. Diagnóstico médico. Diagnosticar en el paciente las condiciones de salud y/o enfermedad a partir de la elaboración e interpretación correcta del expediente clínico, considerando la integración bio-psico-social del paciente, con una actitud de disciplina, lealtad, confidencialidad, respetando la dignidad de la persona, con la finalidad de emitir su juicio médico. 4. Tratamiento del paciente. Tratar las patologías detectadas en los pacientes, aplicando los medios terapéuticos necesarios basados en evidencias científicas y con actitudes de disciplina, lealtad, confidencialidad, respeto a la dignidad de la persona para prevenir, curar, paliar las enfermedades y restablecer la salud. 5. Investigaci Investigación. ón. Investigar problemas de salud que afectan a los sujetos de una comunidad, aplicando la metodología científica en el marco de la bioética médica, asumiendo una actitud de responsabilidad, compromiso y honestidad; con la finalidad de generar nuevos conocimientos y encontrar alternativas de solución.

 Administración en salud. Administrar los recursos disponibles aplicando las etapas del proceso administrativo con honestidad, solidaridad, lealtad, equidad y disciplina, con la finalidad de ofrecer servicios de salud con calidad.

 

INTRODUCCIÓN El presente Manual de Prácticas de Laboratorio tiene como objetivo la aplicación práctica y reforzamiento de algunos de los conocimientos teóricos adquiridos durante el programa de la experiencia educativa de BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR, con la finalidad de que al término del curso el alumno obtendrá una visión general sobre la diversidad y organización celular, así como de la función de los procesos moleculares que ocurren en las células. Reconocerá los principios de algunas técnicas en la biología celular y molecular que le permitan comprender los avances en investigación y su aplicación clínica y biotecnológica. Como Objetivos secundarios podemos enunciar: I.

Comprender la composición, estructura y función de diferentes células.

II.

Visualizar la relevancia de la regulación osmótica e integridad de la membrana celular.

III. IV.

Describir el proceso y regulación del ciclo celular. Conocer las propiedades químicas y funcionales de los ácidos nucleicos.

V.

Comprender los fundamentos de las técnicas de biología molecular básicas y sus aplicaciones aplicacion es clínicas.

El presente Manual es solamente una GUIA para la realización de las prácticas seleccionadas de conformidad con los recursos de que disponemos. Se sugiere realizar una revisión de conceptos básicos para poder comprender los objetivos y metodología de cada práctica. Para su análisis, discusión y entrega de reporte deberán realizar lecturas complementarias. Los maestros y alumnos deberán consultar las fuentes de información correspondientes para poder darle una base científica a cada una de las prácticas. Este manual estará disponible de manera digital, y los alumnos podrán imprimirlo cuando lo consideren necesario El presente Manual incluye prácticas en las que puede ser necesario la colaboración con dependencias de la misma Universidad, como es el Instituto de Investigaciones y/o externas como el Lab. de Genética y Biología Molecular del Hospital e Alta Especialidad de Veracruz.

 

REGLAMENTO GENERAL DEL LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR 1. Ser puntual. Se tendrá una tolerancia máxima de 10 minutos de retardo. 2. Para entrar o permanecer en el laboratorio se deberá portar siempre una bata blanca. 3. Traer el material de trabajo necesario (pluma, lápiz, lápices de colores, y el indicado en el manual de prácticas). 4. Estudiar con la debida anticipación los temas que se van a revisar en cada práctica. 5. Es obligatorio que durante la práctica se tomen apuntes, dibujos o fotografías, pues éstas NO SE REPITEN y se anexarán en el reporte de la misma. 6. Al término de la práctica, el alumno deberá guardar correctamente su microscopio, limpiar su área de trabajo y regresar el material solicitado limpio y en buenas condiciones. En caso de daño al material, aparatos, desaparición de equipo o de piezas del equipo o daño a los inmuebles del laboratorio, el (los) alumno(s) responsable(s) deberán cubrir el costo de los desperfectos ocasionados. 7. Comportarse de acuerdo a las normas de disciplina establecidas en la Ley orgánica y su estatuto de la Universidad Autónoma Veracruzana. 8. Prohibido: Usar gorra, introducir y consumir líquidos y alimentos en los laboratorios, fumar y utilizar lenguaje altisonante e irrespetuoso, así como el uso de teléfonos celulares para actividades que no sean tomar evidencia de la práctica. 9. No correr o empujarse dentro del laboratorio. 10. Cuando sea necesario manejar muestras humanas es obligatorio el uso de guantes de látex o nitrilo 11. No pipetear ninguna solución con la boca.

 

  NORMAS DE SEGURIDAD 1. Identificar los accesos en el laboratorio para salir inmediatamente inmediatamente en caso de un siniestro (incendio, sismo); hacerlo con orden, recordar que el laboratorio está en el tercer piso. 2. ACCIONES A TOMAR EN CASO DE ACCIDENTE  A. CORTADURAS: 1. En caso de heridas pequeñas dejar que sangre unos segundos, tener cuidado de no dejar partículas de vidrio en la herida y aplicar un desinfectante. 2. Las heridas de mayor importancia deberán ser atendidas por un médico, tomando medidas de hemostasia por medio de la presión. B. CHOQUES ELÉCTRICOS: Son muy raros en el laboratorio, pero no por ello deben de olvidarse las recomendaciones como son: Nunca tocar un aparato eléctrico con las manos húmedas o cuando se esta parado sobre piso mojado. Siempre apagar y desconectar los aparatos antes de cualquier manipulación. C. QUEMADURA CON CON REACTIVOS QUÍMICOS ¿?¿

 

INDICACIONES PARA LA REALIZACIÓN Y REPORTE DE LAS PRACTICAS EN EL LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR 1. Ser puntual. Se tendrá una tolerancia máxima de 10 minutos de retardo. 2. Estudiar y traer impresa la técnica de la práctica, ya que al azar el profesor puede pedir a cualquier alumno que explique los procedimientos a realizar antes de comenzar. 3. Cuando sea indicado en el manual, presentar resueltos los cuestionarios o temas previos antes de iniciar la práctica. 4. Investigar y mostrar antes de iniciar la práctica los riesgos de salud de las sustancias químicas que se manejarán en la práctica. 5.-Entregar el reporte de la práctica la sesión siguiente (Digital y/o impreso). El reporte deberá incluir:   Caratula o  Introducción (incluye los temas y cuestionarios previos) o

  Competencia

o

  Material y Método

o

  Resultados

o

  Discusión (Análisis) de Resultados (Observaciones)

o

  Conclusiones

o

  Bibliografía

o

 

  INDICE. 1.-PRÁCTICA 1: MANEJO Y CUIDADO DEL MICROSCOPIO 2.- PRÁCTICA 2: ORGANELOS CELULARES , MICROSCOPIA ELECTRÓNICA  Y DE BARRIDO . 3.-PRÁCTICA 3:

 

 

PRACTICA No 1. MANEJO Y CUIDADO DEL MICROSCOPIO NOMBRE………………………………………………… NOMBRE…………………… …………………………….FECHA……………. .FECHA…………….  GRUPO……………………………………… 

INTRODUCCIÓN Debido a que la mayoría de las células son demasiado pequeñas para ser observadas y estudiadas a simple vista, el origen y avance de la biología celular dependió de los avances tecnológicos y de la creación de un instrumento en particular, el microscopio. Los microscopios son instrumentos que producen una imagen aumentada de un objeto, su desarrollo permitió la identificación y estudio de las células, y posteriormente la explicación de fenómenos vivientes, tanto en condiciones

normales

como

patológicas.

Actualmente

ciertos

tipos

de

microscopios pueden brindar un análisis altamente detallado de las estructuras celulares. Por lo tanto, conocer los componentes y particularidades de los diferentes tipos de microscopios les permitirá a los alumnos comprender sus aplicaciones clínicas y en investigación.

COMPETENCIAS:          

Identifica los componentes del microscopio óptico. Analiza y clasifica la función de las diferentes partes del microscopio. Ejecuta los pasos para el buen uso del microscopio en el laboratorio. Identifica las principales formas de obtención de la muestra. Reconoce la importancia de la fijación

 

I- 

AUTOEVALUACIÓN

1.  Identifica y nombra cada una de las partes que forman el microscopio

2.  Completa el siguiente cuadro mencionando brevemente para que sirve cada una de las

 partes del microscopio óptico

BAS   BRAZ   CABEZA   CONDENSADOR   DIAFRAGM A    OBJETIVO OCULAR PLATINA REVÓLVER TORNILLO DE CARRO MÓVIL

 

TORNILLO CONDENSADOR TORNILLO MACROMÉTRICO TORNILLO MICROMÉTRICO 3.  Describe la forma correcta de transportar un microscopio.

2. EJERCICIO PRÁCTICO. PARTE I. Instrucciones de USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO:  1.  Conecta el microscopio, enciéndelo y regula la luz para evitar un exceso de brillo,  posteriormente ajusta los oculares (regula la distancia interpupilar, de modo en que observes un solo campo de visión). 2.  Si todo el campo vi visual sual no se observa iluminado, aj ajusta usta el condensador (subiéndolo o bajándolo mediante el tornillo del condensador) hasta lograr que todo el campo este iluminado. Si es necesario ajusta el diafragma abriendo o cerrándolo para contrastar tu preparación. 3.  Coloca la laminilla en la platina, utiliza la pinza de sujeción  metálica para sujetarla. Posteriormente, hay que centrar el tejido utilizando para esto el tornillo del carro móvil. 4.  Coloca en posición el objetivo de menor aumento (4x) , girando el revolver si es necesario. La posición correcta se logra alineando el objetivo con el orificio de la fuente de luz. 5.  Mientras observas la preparación por los oculares, mueve el tornillo macrométrico para acercar la superficie del espécimen al objetivo lo más cercano  posible. Este movimiento se realiza en forma lenta hasta empezar a observar la imagen de la preparación o sentir el tope. 6.  Utiliza el tornillo micrométrico para enfocar la imagen. 7.  Cuando se obtenga una imagen nítida de la preparación, recorre el tejido de un extremo a otro moviendo la preparación con los tornillos del carro móvil. Realiza este recorrido preferentemente en línea, para abarcar toda la preparación. Elige el sitio donde continuarás observando a mayor aumento. 8.  Para continuar la observación con los siguientes objetivos solo gira el   revolver  hacia el siguiente objetivo (10x/15x/20x) hasta que quede alineado, si se realizó correctamente el enfoque en el objetivo anterior, únicamente será necesario enfocar la imagen con el tonillo micrométrico moviéndolo muy lentamente.  9.  Para cambiar nuevamente al objetivo (40x), también llamado seco fuerte, gira el revolver a la siguiente posición y ajusta la imagen con el tornillo micrométrico.

 

SE DEBE EVITAR MANIPULAR BRUSCAMENTE EL TORNILLO MACROMÉTRICO EN OBJETIVOS MAYOR AUMENTO (EJEMPLO: OBJETIVO 40X o 100X). YA QUE PUEDES ROMPER LA PREPARACIÓN Y/O RAYAR EL OBJETIVO. 10.  Al utilizar el objetivo de inmersión (100x) se requiere del uso de aceite de inmersión. Se gira parcialmente el revolver para coloca los objetivos 40x y 100x en forma de A, permitiendo un espacio para colocar el aceite. Posteriormente se alinea el objetivo 100x al haz de luz y se ajusta el enfoque con el tornillo micrométrico. AL FINALIZAR LA OBSERVACIÓN CON EL OBJETIVO 100X, MOVER EL REVOLVER AL OBJETIVO DE MENOR AUMENTO PARA PERMITIR LA LIMPIEZA DEL ACEITE DEL OBJETIVO. 11.  Al finalizar apaga la fuente de luz, coloca el microscopio en la posición inicial:  con objetivo de menor aumento, la platina abajo centrada y hacia atrás. Retira cuidadosamente la laminilla y finalmente enreda el cable. RECUERDA LIMPIAR LA LAMINILLA EN CASO DE HABER USADO  USADO  

3. MATERIAL Microscopio de luz  Aceite de inmersión Preparaciones (las proveerá el profesor)

4. PROCEDIMIENTO. 1.

Por

equipos

identificarán

los

principales

componentes

del

microscopio 2. Iniciar la identificación de células con el objetiv objetivo o de 4X 3. Subir el condensador, utili utilizando zando el tornillo portacondensador 4. Colocar el objetivo 10X 5. Ajustar la distancia interpupilar. Enfocar una preparación 6. Cerrar el diafragma de campo completamente se observa una luz difusa

 

7. Con el tornillo porta ccondensador ondensador ajustar la altura, descender hasta observar el diafragma de campo, se ver un polígono 8. Centrar el polígono con llos os tornillos tornillos posteriores 9. Abrir el diafragma lentamente hasta que los vértices del polígono desaparezcan y el área iluminada cubra todo el campo 10. Contrastar con el diafragma de iris del de l condensador 11. Observar las preparaciones en 40X y 1 100X 00X (usando aceite de inmersión) 12. Registrar sus obs observaciones ervaciones con las diferentes preparaciones

5. RESULTADOS. Describa y esquematice las células que ha observado. Anotando el tipo de preparación, tinción y objetivo con el que se observo Tipo de preparaci ón: Método de tinci ón: Objetivo: Aumento total: Descripción:

6. ANÁLISIS DE RESULTADOS. Responda los siguientes cuestionamientos: ¿Se logró el objetivo planteado? ¿Qué es amplificación, resolución y cuál es el límite de resolución del microscopio óptico? ¿Por qué se requiere el uso del aceite de inmersión?

 

  7- Actividad Complementaria: Investigar las características de los diferentes tipos de microscopia y sus aplicaciones: Microscopio de Contraste de fases, Microscopio de Luz ultravioleta, Microscopio Electrónico de transmisión , Microscopio Electrónico de Barrido, Microscopio Confocal,

Estereomicroscopio,

Microscopio con aditamientos

especiales: filtro para luz polarizada, condensador de Nomarsky

RECUERDA: SIEMPRE AL FINALIZAR LA OBSERVACIÓN DE LAMINILLAS, REGRESAR EL MICROSCOPIO EN LAS MISMAS CONDICIONES EN QUE SE TE FUE ENTREGADO: EN SU POSICIÓN INICIAL (COLOCANDO EL OBJETIVO DE MENOR AUMENTO, PLATINA ABAJO CENTRADA Y ATRÁS) Y CABLE APROPIADAMENTE APROPIAD AMENTE ENRROLADO. Bibliografía.

 

PRÁCTICA No. 2 ORGANELOS CELULARES Y MICROSCOPIA ELECTRÓNICA Y DE BARRIDO NOMBRE………………………………………………… NOMBRE…………………… …………………………….FECHA……………. .FECHA…………….  GRUPO……………………………………… 

INTRODUCCIÓN: Un microscopio electrónico electrónico usa electrones en lugar de fotones o luz visible para formar imágenes de objetos diminutos. Los microscopios electrónicos permiten alcanzar amplificaciones mayores antes que los mejores microscopios ópticos, debido a que la longitud de onda de los electrones es bastante menor que la de los fotones "visibles". El primer microscopio electrónico fue diseñado por Ernst Ruska y Max Knoll en 1925 y 1932, quienes se basaron en los estudios de Louis Victor de Broglie acerca de las propiedades ondulatorias de los electrones.

COMPETENCIAS:  Analiza y establece la diferencia entre estructura y ultraestructura celular, mediante el uso de microfotografías. Diferencia Organelos membranosos y no membranosos. Comprende las característica funcionales de los organelos Conoce las correlaciones clínicas de enfermedades representativas de los elementos celulares,mediante la búsqueda de información. 1. EJERCICIOS DE CORRELACIÓN

CON LA INVESTIGACIÓN DE LA PRÁCTICA 1 DESCRIBE BREVEMENTE CADA TIPO DE MICROSCOPIOS Y COLOCA UN EJEMPLO DE CADA UNO. 2.-RESPONDE EL SIGUIENTE CUESTIONARIO: 1.-Enlista las diferentes localizaciones en que podemos encontrar el núcleo celular 2.-Enliste la diferentes formas del núcleo 3.-Diferencia entre eucromatina y heterocromatina 4.-Como esta formado el nucleolo 5.-Cuantos nucléolos poseen la mayoría de las células 6.-Que diferencia existe entre el contenido del material genético que reciben las células que se dividen por meiosis y las que se dividen por mitosis 7.-Realiza un diagrama que muestre el cíclo celular.

 

  8.-Realiza un diagrama que explique como se lleva a cabo el proceso de apoptosis 2.-Identificación de microfotografías de organelos celulares: Observa las microfotografías siguientes. Describe que tipo de Microsopio se utilizo en cada imagen. Describe el nombre del organelo,con una breve descripción de su función

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

BIBLIOGRAFIA

 

PRACTICA No. 3 DIVERSIDAD CELULAR

I. COMPETENCIA: Observar y describir la estructura celular en distintos organismos unicelulares y pluricelulares

II: FUNDAMENTO Las células son estructuralmente complejas, pero es indispensable tener precisión para regular y controlar las distintas funciones celulares. A pesar de las diferencias en tamaños y formas, las células comparten similitudes en procesos básicos (información genética, síntesis de proteínas, conversión de energía y estructura de membranas), por tal motivo, aún las células de distintos organismos, las células que conforman sus tejidos y los organelos dentro de éstas muestran una estructura y apariencia común. A partir de las diferencias estructurales se identificaron dos tipos de células: procariotas y eucariotas. Las células procariotas son más pequeñas, carecen de núcleo, no tienen organelos membranosos complejos, ni los asociados con la respiración, diferente proceso de división celular, etc III. INFORMACIÓN PREVIA. Investigar las características en común y diferencias entre procariontes y eucariontes IV. MATERIAL. Microscopio Papel seda  Aceite de inmersión Colorantes: Giemsa, Acetorceina, azul de metileno, safranina, lugol Barniz de uñas transparente Solución fisiológica Gotero

 

Papel secante Hoja de bisturí Porta y cubreobjetos Material proporcionado por alumno: Cada equipo podrá traer el material para observar un tipo de célula específico:  A. Cebolla. B. Hojas de Elodea. C. Bacterias (cultivo proporcionado por el profesor) D. Organismos en gota de estanque E. Hongos F. El académico podrá proporcionar laminillas con cortes histológicos de tejidos humanos para visualizar diferentes celulares.

V. PROCEDIMIENTO.  A. Observación de células de cebolla. 1. Separar cuidadosamente la membrana de lla a cara interna de una de las capas de la cebolla. 2. Cortar con la hoja de bisturí una porción que se colocará sobre el portaobjetos 3. Añadir una o dos gotas de solución salina, colocar el cubreobjetos y absorber con papel secante el exceso de líquido. Sellar inmediatamente la preparación con barniz de uñas, dejar secar el barniz y llevar al microscopio. 4. Realizar la primera observación en objetivo 5X, después en 10X, documentar la organización celular. Posteriormente visualizar a 40 X y documentar. La observación a 100X (con aceite de inmersión), permitirá observar en algunas células movimientos de pequeñas vesículas que se mueven por debajo de la pared celular en la periferia.

 

5. Hacer una segunda preparación (repetir todos los pasos anteriores), pero en lugar de solución salina adicionar algún colorante (Azul de metileno o safranina) dejar colorante por 3min y enjuagar con agua, sellar igualmente con barniz y realizar las mismas observaciones. B. Observación de células en hoja de Elodea . 1. En un portaobjetos deposite una hoja de elodea 2. Poner una gota de safranina, colocar un cubreobjetos, observar y documentar con los objetivos de 10X y 40X.

C. Observación de células procariontes.  Conseguir un cultivo bacteriano de preferencia no patógeno (E.

coli )

y describir macroscoópicamente la

colonia. Posteriormente se preparará un frotis, se coloca una gota de agua destilada estéril en el portaobjetos, se recolecta una colonia de medio sólido y se mezcla, realizando un extendido uniforme. Se debe extender la gota sobre el portaobjetos de forma que el resultado sea una capa fina. Debe evitarse preparar un frotis demasiado grueso. Dejar secar las preparaciones (frotis) a temperatura ambiente. Cuando se haya secado el frotis pasar el portaobjetos por la llama del mechero con la capa del frotis hacia arriba, no aplicar calor en forma excesiva ya que estropearía la morfología normal y la estructura de los microorganismos que se van a teñir.

Observación A. Solución salina y colorante 1. Hacer un frotis de una colonia, colocar inmediatamente solución salina isotónica. Colocar el cubreobjetos, absorber exceso de líquido y sellar con el barniz de uñas. 2. Observar inicialmente con el objetivo 40X, se observan objet objetos os refringentes. 3. Observar con objetivo 100X con aceite aceite de inmersión, se observará la forma y tamaño celular. 4. Realizar un segundo frotis, ahora tiñendo con un colorante. Observar con los mismos aumentos y documentar.

 

  Observación B. Tinción de Gram 1. Preparar frotis fijos (con calor) a partir de cada uno de los cultivos bacterianos 2. Agregar sobre la preparación cristal violeta durante 60 segundos. 3. Lavar con agua destilada 4. Añadir lugol durante 60 segundos. 5. Lavar con agua destilada 6. Decolorar con alcohol-cetona por 5 a 10 segundos. 7. Lavar con agua destilada 8. Agregar safranina durante 60 segundos. 9. Lavar, secar y observar al microscopio con aceite de inmersión y con el objetivo de 100X

D. Organismos en una got gotaa de agua de estanque. 1. Colocar en un portaobjetos una g gota ota del agua de estanque 2. Agregar una gota de solución salina salina isotónica, retirar el exceso de líquido líquido y sellar con barniz de uñas. 3. Observar con objetivo 10X para localizar microorganismos, posteriormente cambiar al objetivo 40X y documentar, se observarán organismos en movimiento. 4. Con el objetivo 100X se pueden observar organismo con flagelos y cilios. Describir las estructuras y trayectorias de los microroganismos.

E. Observación de célul células as fúngicas. fúngicas. 1. Realice la observación macroscópica de las colonias de hongos presentes en su muestra 2. Colocar una gota (lo más pequeña posible) de lactofenol en el portaobjeto

 

3. Cortar un trozo de cinta adhesiva transparente (aprox. 2cm). Poner Poner la parte adhesiva sobre la colonia en la muestra de vegetal, pan o tortilla con hongos. 4. Colocar la cinta adhesiva sobre el colorante en el portaobjeto, esta actuará como cubreobjetos. 3. Observar y documentar con los objetivos de 10X y 40X. VI.

ANÁLISIS DE RESULTADOS Discutir sobre las diferencias en tamaño y estructuras observadas, según los tipos de organismos y objetivos utilizados. ¿Cuál es el fundamento técnico de cada uno de los reactivos utilizados en la técnica de coloración de Gram? ¿Qué importancia diagnóstica tiene la tinción de Gram? ¿Cuál es el fundamento técnico de cada uno de los colorantes utilizados en práctica?

VII.

CONCLUSIONES

VIII.

Bibliografía.

 

Practica 4 CONTEO CELULAR ,USO DE LA CÁMARA DE NEUBAUER. Introducción En “Biología Celular” es común trabajar en situaciones donde es necesario conocer el

número de células en un volumen dado; por ejemplo, se realizan cultivos celulares se presentes precisa saber cuántas células se encuentran en cuando un momento x (t1) con respecto al número de células que inicialmente se sembraron (t0), o cuando se requiere que un determinado número de células sean expuestas a tratamientos distintos y ver sus efecto (tratamiento in vitro). En tales casos se requiere de un instrumento que permita contar directamente, o bien, calcular la concentración celular en un medio. Una alternativa a este problema es contar directamente el número de células presentes en un volumen conocido; esto puede ser un trabajo agobiante si consideramos, por ejemplo, a las células procariontes que miden generalmente menos de 10 µm (>1X10 -6 m o 1X10-3 mm o bien 0.010 0.0 10 mm) y por lo tanto se pueden encontrar muchas en un volumen muy pequeño. No obstante, se cuenta con la cámara de Neubauer, la cual es un instrumento muy útil que permite contar células de distintos tamaños. El hemocitómetro (cámara de neubauer) tiene la apariencia de un portaobjetos grueso, que en una cara tiene una placa muy delgada de metal, la cual se encuentra grabada con un par de cuadriculas muy finas y de medidas definidas (Figura 1). Esta cámara cuenta también con un par de muescas que permiten colocar la muestra a analizar en dos compartimientos. Por último, la cámara de Neubauer se complementa con un cubreobjetos cuyo grosor es mayor, también, que el de los cubreobjetos convencionales. La altura entre el portaobjetos y el cubreobjetos se encuentra definida, así como el área de la cuadricula en el portaobjetos; por lo tanto, es posible calcular el volumen contenido en cada compartimiento de la cámara de Neubauer. De esta manera, es posible conocer el volumen de muestra celular que se coloca en la cámara, ahora solo resta conocer el número de células presentes en ese volumen[1]. Ver la Nota 1.

http://www.marienfeld-superior.com/index.php/334/articles/camaras-de-recuento.html

COMPETENCIA 

 

  Que el estudiante conozca y realice un conteo celular con el uso correcto de una



cámara de Neubauer   Que el estudiante realice los cálculos necesarios para estimar el número celular de una suspensión celular



Habilidades y destrezas Uso correcto de la cámara cdel ámara de Neubauer Calculo correcto número de células presentes en distintas diluciones de una suspensión celular Material Microscopio de campo claro Cámara de Neubauer Cubreobjetos Agua destilada Micropipeta 250 μl Método Diluir en 100 mL de agua destilada un gramo de levadura seca comercial. Agitar hasta que la muestra se vea homogénea. Pipetear 100 μl de la muestra celular con una micropipeta y colocar en una muesca de la

cámara de Neubauer y permitir que la suspensión ingrese a la cámara por capilaridad. Evitar que se formen burbujas. Colocar la cámara en la platina de un microscopio de campo claro con iluminación Kohler y utilizar el objetivo de 10X para localizar el cuadro central de la cámara. La cuadrícula que se utiliza como guía para el conteo es la e 0,2 X 0,2 mm. Tener cuidado de no contar dos veces la misma célula. Para conocer el número de células en la muestra original realizar el siguiente cálculo: A X B XC Donde A= Células en la cámara B= Factor de dilución C= Factor de corrección (proporcionado por el fabricante de la cámara) Considerar: Que el área central de la cámara es de 1mm2. Esta área está subdividida en 25 cuadrados pequeños (1/25 mm2); cada uno de los cuales está delimitado por líneas triples y con una subdivisión de 16 (1/400 mm 2). Que generalmente la cámara tiene una profundidad de 0,1 mm. El factor de corrección de 104 convierte 0,1 mm 3 a 1 mL (0,1 mm 3 = 1 mm2 X 0,1). Mecanismos de evaluación Para evaluar el desempeño del estudiante se debe considerar el uso adecuado del equipo de laboratorio, los resultados obtenidos, el respeto al reglamento de laboratorio así como la realización de las siguientes actividades: 1) Reporte escritos de la práctica

 

2) Problema: en una cámara de Neubauer se contaron 206 y 186 espermatozoides de una suspensión celular diluida 1:50. Pregunta: ¿Cuál es el número de espermatozoides/mL en la suspensión original? Nota 1. La altura entre el portaobjetos y el cubreobjetos puede cambiar en función del fabricante; por lo tanto, también puede variar el volumen de la muestra contenida en los compartimientos de la cámara.elLonúmero anteriordetiene dos presentes implicaciones: 1) los cálculosserán que deben realizar para conocer células en una muestra distintos en función del fabricante de la cámara, y 2) siempre se deberá citar al fabricante de la cámara y de ser posible también el modelo, con objeto de dar a conocer las condiciones exactas del trabajo realizado. Bibliografía Jiménez L F y Merchant H.: Biología Celular y Molecular. Prentice Hall. 2003. México

Karp G.: Biología Celular y Molecular. McGraw-Hill Interamericana. 1996. México

 

Practica 5 AISLAMIENTO DE CÉLULAS MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFÉRICA POR CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE DENSIDAD. Introducción La sangre periférica es la fuente primaria de obtención de células mononucleares (linfocitos y monocitos). El proceso de separación de células mononucleares del resto de los elementos formes de la sangre, se basa en la diferencia de densidad existente entre ambos (Fig. 1). Aislamos células mononucleares de sangre periférica o PBMCs (Peripherial Blood Mononuclear Cells), utilizando un reactivo llamado Lymphoprep  para crear un gradiente de densidad. Cuando ponemos la sangre sobre el Lymphoprep, y lo sometemos a centrifugación, se separan las distintas especies celulares en función de su densidad. Si tenemos en cuenta que los hematíes y los granulocitos (salvo los basófilos) tienen una densidad mayor a la del Lymphoprep, éstos caerán por al fondo. contrario, las mononucleares al tener menor densidad, quedarán encimaPor del el Lymphoprep. Lascélulas plaquetas tienen una densidad menor que los monocitos, por lo que flotan con el plasma, en la parte superior del tubo.

La densidad del Lymphoprep es de 1.077 g/ml, y como podemos observar en el gráfico (Fig. 1) no solo aislamos los linfocitos sino también basófilos y los monocitos, aunque la  parte más abundante es la de linfocitos que son los que nos interesan en esta práctica[2]. práctica [2].

MUESTRA Sangre total extraída por punción venosa, anticoagulada con heparina o EDTA. (1 ml aprox. por alumno ) MATERIALES - Pipetas Pasteur 3ml.

 

- Tubos 10ml. - Guantes de látex

REACTIVOS - Lymphoprep. - PBS (ó RPMI) Tiempo 1 hora MÉTODO 1. NOS PONEMOS LA BATA Y LOS GUANTES  2. Diluir la sangre en una proporción 1:1 de tal forma que cojamos 3ml de sangre y 3ml de PBS en un tubo de 10ml (o RPMI en condiciones de esterilidad). es terilidad). 3. Añadimos 3ml de Lymphoprep en un tubo de 10ml. 4. Añadimos en el tubo anterior la sangre diluida con la ayuda de una pipeta Pasteur, de modo que caiga por las paredes del tubo con un flujo continuo. Para ello dejaremos resbalar la primera gota con el tubo inclinado levemente para que sea más difícil que se mezclen las fases. 5. Centrifugamos durante 30’ a 2000 rpm (ó 900 g). La ecuación que relacione las rpm y las g es la siguiente: 2

1.

g = 11.17 x r (cm) x (rpm / 1000)  r= radio del rotor de la centrífuga Después de la centrifugación, observamos varias capas: (Fig. 2).

7. Con la ayuda de una pipeta Pasteur, recogemos la nube de mononucleares con cuidado de no mezclar las fases y de no coger Lymphoprep. OJO!!!!!!! OJO!!!!!!! Aspiramos  Aspiramos con la pipeta previamente apretada antes de introducirla en el tubo. 8. Llevamos las células a un tubo de 10ml y añadimos PBS hasta completar el tubo con el fin de lavar las células y centrifugamos durante 10’ a 1400 rpm, para lavar y eliminar las plaquetas.

9. Decantamos el sobrenadante y resuspendemos en 1ml ó 2ml, según el tamaño del “pellet” o botón celular. 10. Congelar el pellet a -20°C para su s u posterior uso. EN CASO DE USAR EL MATERIAL PARA USOS SUBSECUENTES SE DEBERA TENER EN CUENTA: En condiciones de esterilidad, esta técnica se realiza en cabina de flujo laminar, se suele utilizar medio de cultivo RPMI al hacer la dilución, y los lavados suelen ser dos y también con el medio indicado. Esto es debido a que en el medio de cultivo crecen muy bien los hongos que lo pueden contaminar (por ello suplementamos el medio con antibiótico – antifúngico).

 

Practica 6 EXTRACCIÓN DE DNA GENÓMICO CON FENOL/CLOROFORMO Y PRECIPITACIÓN CON ALCOHOL. Introducción Es uno de los métodos más comúnmente usados y útiles para el aislamiento y concentración de ADN y ARN a partir de soluciones acuosas, la extracción con fenol/cloroformo es seguida por la precipitación con etanol. El fenol usado en este protocolo es amortiguado  para evitar que los productos oxidados del fenol dañen a los ácidos nucleicos. Se debe tener cuidado ya que el fenol puede producir severas es cancerígeno, también puede provocar quemaduras en la piel y puede dañar la ropa. En el método presentado se recomienda la solución fenol/cloroformo (50/50%) para la extracción. En la mayoría de los casos, esta mezcla provee una buena desnaturalización de las proteínas y una fuerte interfase entre la fase acuosa y la fase orgánica. Si existe problema por la presencia de una gran cantidad de espuma durante la extracción, se puede agregar alcohol isoamílico para obtener la siguiente  proporción fenol/cloroformo (50/49%) y alcohol isoamílico (1%). Durante la precipitación con etanol, las sales y otros solutos como residuos de fenol y cloroformo se mantienen en solución mientras que los ácidos nucleicos forman un  precipitado blanco quela puede ser fácilmente por ser centrifugación. una eficiente precipitación, concentración del ácido colectado nucleico debe de al menos 10Para µg/mL. Concentraciones menores pueden ser precipitadas, pero la cantidad recuperada será muy  baja. Para facilitar la precipitación de concentraciones bajas de ácidos nucleicos, se puede incubar el precipitado a -20°C por 4 horas o por toda la noche y centrifugar por 30 min[3, 4].

Obtención de ADN de hígado de células mononucleares de sangre periférica Métodos Obtención y lisis del órgano 1. Las células fueron obtenidas en prácticas anteriores. 2. Retirar el sobrenadante del pellet de células mononucleares. 3. Añadir al tubo de células mononucleares (1.5 ml); 400 µL de buffer de lisis (NaCl 150 mM, EDTA 100 mM, SDS 0.5 %) 4. Vortexear por 30 seg, o agitar fuertemente por 1 min. Extracción de ADN con Fenol/Cloroformo 5. Agregar un volumen de fenol/cloroformo (50:50) igual al volumen inicial de la solución (0.4 ml). Mezclar las fases con movimientos repetidos de inversión durante 10 seg. 6. Separar las fases en la microcentrífuga (12,000 rpm) por 2 min. La fase orgánica es la que se ubica en la parte inferior del tubo debido a su mayor densidad, además de su característico color amarillo. 7. En la parte superior se va a encontrar la fase acuosa. Con una micropipeta recuperar con mucho cuidado esta fase acuosa, teniendo mucho cuidado de no tocar la interfase.  Nota: si es posible no recupere toda la fase acuosa con tal de no contaminar la fase acuosa con la  fase orgánica.

 

8. Transferir la fase acuosa a un tubo eppendorf-1.5 mL limpio. Evitar arrastrar parte de la interfase y sobre todo no transferir nada de la fase orgánica. Si se aprecia un precipitado blanco en la interfase se deben repetir los pasos 5-8 sobre la  fase acuosa recuperada.

Precipitación con isopropanol/etanol 9. Agregar un volumen de isopropanol igual del de la fase acuosa. Agitar brevemente por inversión. 10. Centrifugar a max vel. 14,000 y después drenar el sobrenadante. 11. Agregar 1 volumen de etanol al 70% en agua, enfriado previamente en el congelador o en hielo. Mezclar con vortex o por inversiones repetidas. Incubar en hielo por 10 min. 12. Precipitar el ácido nucleico por centrifugación a 14,000 rpm por 10 min. Si la muestra es mayor a 10 µg, el precipitado puede ser visto como un pequeño punto blanco a un lado de la parte más baja del tubo. 13. Con una micropipeta, drenar todo el líquido del tubo. 14. Para secar el precipitado, colocar los tubos bocabajo y abiertos sobre un papel secante hasta que la totalidad del etanol se haya evaporado (15 min aprox). 15. Agregar 100 µL de agua bidestilada estéril y disolver el ADN mediante pipeteo suave. Grandes cantidades de ácidos nucleicos son difíciles de resuspender, asegurarse de que el ADN está completamente continuar. 16. Congelar el extracto dedisuelto ADN a antes -20°Cdepara su posterior uso. C omenta ntarr i o

Si la concentración del ácido nucleico es muy alta (más de 300 µg/mL) se puede formar un  precipitado visible sin necesidad de enfriar enf riar la muestra. Una vez que se forma un precipitado visible, no es necesario enfriar la muestra, ni esperar para colectar este precipitado por centrifugación[3, 4].

SOLUCIONES STOCK ó MADRE NaCl 5 M  NaCl 29.225 g Agua, cbp 100 Autoclavear enml un frasco de vidrio de 100 mL con tapón flojo. Almacenar a TA. Estable indefinidamente

EDTA 0.5 M pH 8 Ácido etilendiaminotetracético, disódico 18.61 g Agua 80 ml Ajustar a pH 8 Agua, cbp. 100 ml Autoclavear en un frasco de vidrio de 100 mL con tapón flojo. Estable indefinidamente a TA. SDS al 10% SDS 10 g Agua, cbp 100 ml

 

Disolver lentamente el SDS (grado electroforético) en 70 ml de agua, evitando la formación de espuma y aforar. Autoclavear en un frasco de vidrio de 100 mL con tapón flojo. Almacenar a TA. Estable indefinidamente. No es necesario filtrar

SOLUCIONES DE TRABAJO Buffer de lisis (NaCl 150 mM , EDTA 100 mM , SDS al 0.5%)  NaCl 5 M 3 ml EDTA 0.5 M pH 8 20 ml SDS al 10% 5 ml Agua cbp 100 ml Guardar en un frasco de vidrio de 100 mL. Estable indefinidamente.

 

Practica 7 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE DNA POR ESPECTROFOTOMETRÍA Introducción Cuando se trabaja con DNA es crucial saber exactamente cuánto DNA está presente en una solución. Afortunadamente las concentraciones de DNA pueden ser medidas de forma eficiente a través de espectrofotometría de absorbancia ultravioleta. La cantidad de radiación UV absorbida por una solución de DNA es directamente proporcional a la cantidad de DNA en la muestra. Usualmente la absorbancia es medida a 260 nm, a esta longitud de onda una absorbancia (A260) de 1 corresponde a 50 mg de DNA de doble cadena por ml. Mediciones de al menos 1 fl de una solución de DNA pueden ser llevadas a cabo en espectrofotómetros diseñados especialmente para este propósito. La absorbancia ultravioleta también puede ser usada para verificar la pureza de la  preparación de DNA. Con una muestra pura de DNA, el cociente de absorbancias a 260 y 280 nm (A260/A280) es 1.8. Cocientes menores a 1.8 indican que la preparación está contaminada, ya sea con proteínas o con fenol [5].

Metodología  1. Hacer una dilución 1:50 con el ADN obtenido. Esto es; poner 4 µl de la muestra de ADN en 196 µl de agua bidestilada estéril. Mezclar por pipeteo suave. Trasferir a la cubeta de cuarzo ó añadir directamente 1 µl si se cuenta con un nanodrop. 2. Obtener la lectura de la solución blanco (100 µl de agua bidestilada ó 1µl si se cuenta con nanodrop). 3. Colocar la cubeta de cuarzo con la muestra en el espectrofotómetro y leer la densidad óptica a una longitud de onda de 260 nm ó 1 µl si se cuenta con un nanodrop. 4. Para calcular la concentración se debe considerar que 1 UA260 = 50 µg/µl de ADN. Hacer los cálculos correspondientes para la lectura obtenida. 5. Si se desea evaluar la pureza de la muestra, tomar una segunda lectura a 280 nm. Determinar la razón de las lecturas obtenidas a 260/280 nm. Si esta proporción es mayor a 1.75, la absorción probablemente debida a ácidos (residuos nucleicos.deSi estau  proporción es menor meno r aobservada 1.6, puedeeshaber proteína pr oteína u otros contaminantes fenol otros componentes orgánicos) en la muestra. En este caso, se recomienda la reextracción con fenol/cloroformo y la precipitación con etanol.

 

TABLA DE MANIPULACIONES M1. Diluciones para espectrofotometría  Equipo  1 2 3 4

DNA (µl)  4 4 2

agua(µl)  196 196 98

Dilución  1:50 1:50 1:50 1:50

TABLA DE RESULTADOS R1. Lecturas en el espectrofotómetro y concentración del ADN DNA A260 A280 A260/A280 Concentración (µg/ml) (diln 1:50)  1:50)  Lectura F Dilución Valor real Equipo 1 50 Equipo 2 50 Equipo 3 50 Equipo 4 50

Referencias 1. Vega-Castillo LF. Manual de Practicas de Biología Celular: Universidad Autonoma del Estado de México; 2013. 18 p. 2. Moreno R. LYMPHOPREP: Aislamiento de células mononucleares en sangre periférica por centrifugación en gradiente de densidad. 2004. 3. MOLINA NB. Comparación de métodos de lisis y extracción de ADN de trofozoítos de Giardia lamblia. Parasitología Latinoamericana. 2006;61. 4. Soto-Zárate CI. Manual de Practicas de Biología Molecular Universidad Nacional Autonoma de México; 41 p. 5. Brown TA. Gene2016. Cloning and DNA Analysis an Introduction: Wiley-Blackwell; 2010. 320 p.

 

Práctica 8 AMPLIFICACIÓN DE UN GEN A TRAVÉS DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Introducción En esta práctica, la PCR será usada para amplificar una región corta del cromosoma 17, la cual corresponde a un gen muy importante en el control de calidad del DNA, el gen BRCA 1. Mutaciones en el gen BRCA 1 (Breast Cancer 1) se han asociado con un incremento en el riego de desarrollar cáncer de mama [6]. Las proteínas BRCA 1 y 2 juegan un papel muy importante en la reparación del DNA, específicamente en el Sistema de Reparación de Recombinación Homóloga (HRR por sus siglas en inglés). Se ha encontrado que en células deficientes de estos genes, el sistema de HRR esta defectuoso, lo que hace que sistemas de reparación del DNA, de menos fidelidad se activen, lo se considera que promueve en parte la carcinogénesis [6]. Esta es la parte de la secuencia del gen BRCA 1 (incluye el primer exón, son 3077 pb):  ATGGATTTATCTGCTCTTCGCGTTGAAGAAGTACAA  ATGGATTTATCTGCTCT TCGCGTTGAAGAAGTACAAAATGTCATTAATGCT AATGTCATTAATGCTATGCAGAAAATCTTA ATGCAGAAAATCTTAGAGTGTCCCATCTGGTAAGTCAGCA GAGTGTCCCATCTGGTAAGTCAGCAC C  AAGAGTGTATTAATTT GGGATTCCTATGATTATCTCCTATGCAAATGAACAGAAT  AAGAGTGTATTAATTTGGGATTCCTATGATTAT CTCCTATGCAAATGAACAGAATTGACCTTACATACTA TGACCTTACATACTAGGGAAGAAAAGACATGTCTA GGGAAGAAAAGACATGTCTAGT GT  AAGATTAGGCTATTGTAATTGCTGATTTT  AAGATTAGGCTATTGT AATTGCTGATTTTCTTAACTGAAGAACTT CTTAACTGAAGAACTTTAAAAATATAGAAAA TAAAAATATAGAAAATGATTCCTTGTTCTCCATCCA TGATTCCTTGTTCTCCATCCACTCTGCCTCTCC CTCTGCCTCTCC CACTCCTCTCCTTTTCAACACAAATCCTGTGGTCCGGGAAAGACAGGGACTCTGTCTTGATTGGTTCTGCACTGGGGCAGGAATCTAGTTT  AGATTAACTGGCATTTT  AGATTAACTGGCATTTTGGCTTTTCTTCCAGCTCT GGCTTTTCTTCCAGCTCTAAAACAAGCTCCATCACT AAAACAAGCTCCATCACTTGAAATGGCAAAATAA TGAAATGGCAAAATAAAATCATGGATGAGGCCGAGGGC AATCATGGATGAGGCCGAGGGC GGTGGCTTATGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCAAGGTGGTAGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCCTGGCCAACATG GTGAAACCCCCTCTCCACTAAAAATACAAAAATTAGCTGGGCGTAGTGGCATGTGCCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGG  AGAATCACTTGAACCAGGAGGCAG ATGTTGCTGTGAGCCAAT ATGTTGCTGTGAGCCAATATGGCACCACTGAACTCCAGCGACA ATGGCACCACTGAACTCCAGCGACAGAGCTAAACTCCATCT GAGCTAAACTCCATCTCAAAAA CAAAAAA A  AAAAAAAAAAAAAAAAAAACATGGATGATCGGTGTC  AAAAAAAAAAAA AAAAAAACATGGATGATCGGTGTC GTTGAGAGGATAGGTATTTGGAAGAACCTTTGTT GTTGAGAGGATAGGTAT TTGGAAGAACCTTTGTTTGAAACTGGCTCTGTACAT TGAAACTGGCTCTGTACATACA ACA  ATGAAATTACATACTTATTTACATACAATGAAA  ATGAAATTACATACT TATTTACATACAATGAAATGCAGAGGTTTTTTT TGCAGAGGTTTTTTTTTTATATAGGATCTCT TTTATATAGGATCTCTGTCGAGAGGCTGGAGTGCAGTGGTGCTAT GTCGAGAGGCTGGAGTGCAGTGGTGCTAT CACAGCTCACTGCAGCCTCAACCTCGTCAGGCTCAAGCAATCCTCCCACCTCAGCCTCCAGAGTAGCAGGGACGATAGGTGTGCACCAC CATGCCCAGCTAATTTTTGTATTTTTTTTTCTTTTTTTGAGATGGAGTCTTGCTCTGTTGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCGCGATCTCAGC TCACTGCAAACTCTGCCTCCCGGGTTCATGCCATTCTTCTGCCTGAGCCTCCTGAATAGCTGGGACTACAAGCACCCACTACCACGCCCG GCTAATTTTTTGTATTTTTTTTTCTTTTTTAGTAGAGGCGGGATTTCACCGTGTTAGCCAGGATAGTCTTGATCTCCTGACCTTGTGATCCAC CCGCCTGGGCCTCCCAAAGTGCTAGGATTACAGGCATAAGCCACTGCGTCCAGCCATTCTTGTATTTTTCTGTTGTAGAGATAGGGTTTTG CTATGTTGGCCATGCTGGTCTCAAACTCCTGACCTCAAGTGATCTACCCTCCCTTGGCCTCTCAAGGTGCTGGGATTACAGGCCTGAGCC  ATTGCACCCAGCCATGGTCTAAAAATCTTGATT  ATTGCACCCAGCCATGGTCT AAAAATCTTGATTGAAATACCACCTTTT GAAATACCACCTTTTCATTTCCAGACACCCCTAT CATTTCCAGACACCCCTATTTAAAATTACCACACCCCCA TTAAAATTACCACACCCCCAGCACA GCACA CACTTTATCTTCTATTCCTGCTGCTTCTCCATAACACTGATTACTAGCTGACATTCTATGTAATGTATCCATTTTTTATCTCTAGTCCCACAGA  ATGTAAACTCCAGGATGGGATTTTTGTTTTGT  ATGTAAACTCCAGGATGGGAT TTTTGTTTTGTTTACATACATCTGTAT TTACATACATCTGTATGTTCAGTAGTTAGAACGGTACT GTTCAGTAGTTAGAACGGTACTTGGGACCTAGTTGCCACTCA TGGGACCTAGTTGCCACTCAAT AT  AAACATTTGTCAAATAAATAATAAACTAAA  AAACATTTGTCAA ATAAATAATAAACTAAACTAAATTAGTTCTTT CTAAATTAGTTCTTTAATTTTTTTAAATA AATTTTTTTAAATATGGTGATGGTTAGTAGTGAGTAA TGGTGATGGTTAGTAGTGAGTAACATTCAAAAAATA CATTCAAAAAATA  AGTTGAAAAGTTGTACC ATTGCCTCTTACCCACAA ATTGCCTCTTACCCACAATAAAAAAGGGTAAATTCT TAAAAAAGGGTAAATTCTTTTCTGCTTTATGAA TTTCTGCTTTATGAAAGTTGTTTTTCATATT AGTTGTTTTTCATATTTGAAGTCAA TGAAGTCAA GTTAATCAGATTAAGGAAAATGTATGTTGTGTTTTCAGAGCGATACAAGATTTATAAATAACCATCCTCTCCCTTGCCCTTCAACATTATAGC TAAACAAAAATAAGAGGAAAACAGGATTCACAATTTATCAATTTATTGAAAATCAGAGCCAGAGAAGCAGGAAATGACATTGTAGGAAAAAA CTGCTTTTGAAAAAGCACAAAACTTACTCATGACAATCAGTGATCAGGAAAATCCTCAATAGTGTGGCATTTGGATACATTTATGTTTCATTT CCATGGGAGAGAGTCATAAAAATAGGATGTTCTTTCTCATTCTGGCAAATTAAACCATCAATTAAAAACTCAGATACATAAAAATTAAAGATG TAAGAATGAAAATGCTAAATTGTTATTTTCAATCAACTATTATGTTTTCTAGCTTTTCATTGCTTTTTTCTGTTTCCTGTTAAGATTAATTTCTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGACAGACTTTGGCTCTTGTTGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTCGGCTCACTACAACCTCCAC CTCCCGGGTTCAAGCAATTCTGCTGCCTCAGCCTCCGGAGTACCTGGGATTGCAGGCATGTGCCATCACACCAGCTAATTTTGTATTTTTA GTAGAGACAGGGTTTCTCCATATTGGTCAGGTTGGTCTCGAACTCCTGACCTCAGGTGATCCTCCTGCCTTGGCCTCCGAAAGTGCTGGG  ATTACAGGCGTGAGCCACCGCTCCCAGACTTTTT  ATTACAGGCGTGAGCCACCGCT CCCAGACTTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGT GTTTTGTTTTGTTTTGTTTTTTTGAGACACGGTCTCGCT TTTTTTGAGACACGGTCTCGCTCTGCTGCCTAGGCTGGAGT CTGCTGCCTAGGCTGGAGT GCAGTGGCACGATCTTGGCTCACTGCCAGCTCCGCCTCCCGGGTTCAGGCCATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTAGCTGGGACTACA GGCGCCCACCACTATGCCCGGCTAATTTTTTGTATTTTTAGTAGAGACGGGGTTTCACCATGTTAGCCAAGATGGTCTCGATCTCCTGACC TTGTGATCCACCCGCCTCAGCCTTCCAAAGTGCTGGGATTACAGTCCTGAGCCACTGCGCCCGGCCTGGACCTTTTTTTTTCGGGGTGGG GGGTTGGAGTCTGGCTCTGTCGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCGCCATCT

En esta práctica, utilizaremos 2 pares de primers o cebadores, el primer par flanquea una región de 176 pb (pares de bases), y el segundo una región de 209 bp, dichos fragmentos de DNA serán distinguidos después de realizar la electroforesis en gel de agarosa (en la siguiente practica).

 

  Primers a utilizar: Nombre el producto BRCA1-176pb BRCA1-209pb

Primer derecho

Primer izquierdo

TTGCCATTTCAAGTGATGGA

CTCCATCCACTCTGCCTCTC

CAGCCTCTCGACAGAGATCC

CACTGAACTCCAGCGACAGA

Tamaño del producto de PCR 176 pb 209 pb

La muestra de DNA provendrá de varios de las células polimorfonucleares extraídas en la práctica 3 cuyo DNA fue extraído en la practica 4 y cuantificado en la practica 5. Para comparar las dos bandas amplificadas se correrán los productos amplificados en un gel de agarosa, junto con un control negativo (control no amplificado), en la siguiente práctica. El control no amplificado no deberá presentar banda.

Reactivos   Mezcla de reacción de PCR (kit) o  dDNTp o  DNA pol o  Buffer de reacción o  MgCl2    Agua para biología molecular 



Materiales y Equipo Micropipeta de 1000 µl Micropipeta de 200 µl Micropipeta de 10 µl Puntas azules, amarillas y blancas Tubos eppendorf de 1.5 ml Tubos Falcon de 15 ml Tubos para PCR Termociclador

Punto de inicio: Utilizar el DNA cuantificado en la práctica pasada, el cual quedo guardado a -20°C. 2. Reacción de PCR 1. Identificar los tubos para PCR que se van a utilizar. 2. En un tubo eppendorf de 1.5 ml, se prepara una mezcla de reacción común para todas las reacciones que se van a realizar en un momento determinado. Usar la siguiente tabla como un “checklist” al momento de agregar los reactivos. Usa una

punta nueva para cada reactivo. Componente Buffer 10X

Concentración final 1X

51 tubo (µl)

2.5 tubos (µl) 12.5

 

MgCl2 25 mM 4 dNTPs 5 mM Primer derecho derecho BRCA BRCA1-176pb 1-176pb (50 ng/µl) Primer izquierdo izquierdo BRCA1BRCA1-176pb 176pb (50 ng/µl) Primer derecho derecho BRCA BRCA1-209pb 1-209pb (50

1.25 mM 250 µM 1 ng/µl

2.5 2.5 2

6.25 6.25 5

1 ng/µl

2

5

1 ng/µl

2

5

2

5

0.5 1µl

1.25 Solo se añadirá DNA a un tubo, el otro se considera control negativo 86.25 343

ng/µl) Primer izquierdo izquierdo BRCA1BRCA1-209pb 209pb (50 1 ng/µl ng/µl) Taq polimerasa (5 U/µl) 2.5 U/50 µl DNA genómico proveniente de --células polimorfonucleares

Agua Volumen total

-----

34.5 49

Nota: los volúmenes dependen de las instrucciones de cada kit de PCR, ajustar de ser necesario. 3. Cerrar firmemente cada uno de los tubos y colocarlos en el termociclador. Rechecar el programa de amplificación y entonces presionar “Start”.  Nota:: la programación depen Nota depende de de cada termiciclador termiciclador,, preguntar al encargado, cual programa debe ser utilizado.

Programa del Termociclador Ciclos 1 30

1 Mantener

Temperatura 95°C 95°C (desnaturalización) 58°C (Temp de alineamiento) 72°C (temp. extension) 72°C 4°C

Tiempo 5 min 30 seg 30 seg 1 min 5 min Indefinido

4. los productos de PCR se guardaran a -20°C hasta correrlos en un gel de agarosa.

 

 

 

Práctica 9 RESOLUCIÓN DE FRAGMENTOS DE DNA GEL DE AGAROSA Introducción

El dede unaDNA, reacción de PCR odedelos unacuales reacción de digestión de DNA un número de resultado fragmentos los tamaños depende de la reacción deesPCR o de la  posición de corte de la enzima de restricción. Una forma de determinar fácilmente el número y el tamaño de los fragmentos es la electroforesis en un gel de agarosa. El hecho de que una molécula de DNA fue cortada o no, puede sr determinado como se mencionó por medio de electroforesis, ésta técnica fue desarrollada en la primera parte de la década de los 70´s [5]. La electroforesis, es una técnica que utiliza diferencias en la carga eléctrica para separar moléculas en una mezcla. Las moléculas de DNA tienen carga negativa (debido a los grupos fosfato), así que cuando son colocadas en un campo eléctrico migran hacia el electrodo positivo llamado cátodo. La velocidad de migración de una molécula depende de dos factores, su forma y su relación masa/carga. Desafortunadamente, la mayoría de las moléculas de DNA son de la misma forma y todas tienen relaciones masa/carga similares. Fragmentos de diferentes tamaños no pueden ser separados por electroforesis estándar. El tamaño de las moléculas de DNA, si se vuelven un factor si la electroforesis se realiza en un gel. Un gel que es usualmente hecho de agarosa, poliacrilamida o una mezcla de ambas, la cual comprende una red compleja de poros, a través de la cual las moléculas de DNA deben viajar para alcanzar el electrodo positivo. Las moléculas de DNA más pequeñas son las más rápidas. Por lo tanto, el electroforesis en gel, separa moléculas de DNA de acuerdo a su tamaño [5]. En la práctica la composición del gel determina los tamaños de las moléculas de DNA que  pueden separarse. Un grosor de 0.5 cm de 0.5% de agarosa, el cual tiene poros relativamente largos, se usaría para moléculas en un rango de tamaño de 1 a 30 kb,  permitiendo, por ejemplo, moléculas de 10 a 12 kb ser claramente distinguibles. Al otro extremo de la escala, un bloque muy delgado (0.3 mm) de 40% de un gel de poliacrilamida, con poros extremadamente pequeños, seria usado para separar moléculas de DNA mucho más pequeñas, en un rango de 1 a 300 pb, y podría distinguir moléculas que difieran en largo de un solo nucleótido [5]. La migración del ADN a través del gel de agarosa depende sobre todo del voltaje; a un mayor voltaje hay una tasa más rápida de migración. Sin embargo, los voltajes altos acentúan las imperfecciones en el gel, tales como diferencias en la densidad y grosor entre las diferentes partes del gel. Efectos comunes incluyen bandas inclinadas o en forma de U (“se sonríen”). El efecto inclinado ocurre más frecuentemente en los bordes del gel, donde el gel líquido se adhiere al molde para formar un menisco, haciendo los bordes del gel más gruesos que en el centro. La resistencia está disminuida en los bordes más gruesos de los carriles externos, permitiendo que las moléculas de ADN de estos carriles migren más rápido que moléculas de ADN de tamaños similares de carriles internos. También el calor generado por voltajes altos puede fundir el gel y cambiar sus propiedades de tamizado. Por estas razones se deben evitar los voltajes superiores a 125 v en un sistema de minigel [4].

 

Tinción con bromuro de etidio y manejo responsable El bromuro de etidio es el reactivo más rápido, sensible y reproducible para teñir DNA. Sin embargo, tiene actividad mutagénica y carcinogénica. Así la tinción debe desarrollarse en un área controlada y específica. El manejo responsable de la solución diluida de bromuro de etidio (1 mg/ml) para teñir geles minimiza los riesgos inherentes. Observación de geles teñidos Los geles ya teñidos son observados en un transiluminador, el cual consiste de una lámpara de luz ultravioleta que emite luz en el rango óptimo (260-360 nm) para iluminar a los geles teñidos con bromuro de etidio. La transiluminación (i.e.; el paso de la luz a través del gel) permite la mejor observación posible de las bandas de ADN. Precaución: La luz ultravioleta (UV) puede dañar la retina de los ojos, por ello nunca se debe Precaución: mirar directamente a la luz UV sino con la protección adecuada. Práctica de electroforesis en geles de agarosa Preparación del gel

1. En un vaso de precipitado de 100 mL, pesar 450 mg de agarosa, posteriormente agregar 30 mL de TBE y permitir que se hidrate por 1 min. Nota Nota:: la cantidad de agarosa a preparar dependerá de la cámara de electroforesis horizontal con la que contemos. 2. Calentar por 1 min en el horno de microondas (microondas usado exclusivamente para el laboratorio). Se debe cuidar de que no se derrame de tal manera que debemos detener el proceso antes de que suceda, dejar enfriar un poco, agitar con movimientos circulares y continuar hasta completar el minuto. 3. Dejar enfriar sobre la mesa hasta que alcance unos 55°C (hasta que se aguante tocar el matraz con la piel). Mientras tanto, preparar el molde de la cámara (si no se tiene un buen sistema prefabricado, sellar los extremos del molde con cinta masking-tape). Una vez fría, vaciar la agarosa fundida sobre el molde y colocar el peine en la posición correcta. Dejar que la agarosa gelifique, lo cual se evidencia por que toma una tonalidad blanca opaca. 4. Retirar el peine y la cinta masking-tape, colocar el molde y el gel en la cámara de electroforesis y llenar con TBE (400 mL aprox). Se debe verificar que el nivel alcanzado por el TBE se encuentre aproximadam aproximadamente ente 1 mm por arriba del gel. Colocación de las muestras

5. Sobre un pedazo de Parafilm depositar 2 µl del buffer de carga-10X por cada una de las muestras que se vayan a analizar (si no se tiene parafilm, usar un tubo de PCR por muestra). Posteriormente Posteriorme nte colocar 5 µl de la muestra. 6. Mediante pipeteo suave mezclar la muestra con el amortiguador de carga. Tomar la totalidad del volumen y con mucho cuidado depositarlo en el pozo correspondiente. Proceder de la misma manera con las muestras restantes. Tomar registro del orden en el cual fueron colocadas las muestra. De ser el caso colocar el marcador de peso molecular para DNA. Condiciones de Electroforesis

7. Colocar la tapa de la cámara de electroforesis. Tomar en cuenta que las muestras corren del polo negativo (negro) hacia el positivo (rojo), de tal manera que se debe corroborar que el gel

 

esté bien orientado. Asimismo, cerciorarse de que dichos colores coincidan entre los cables y las terminales de la fuente de poder al conectarlos. Encender la fuente de poder, seleccionar 90 voltios y presionar el botón para iniciar la corrida. Permitir que corra por el tiempo adecuado para que el frente de corrida (banda azul) llegue al borde del gel, para una separación máxima, sin que se nos salgan las muestras.

Visualización del gel

8. Después de que transcurra el tiempo de corrida, sumergir el gel por 20 min en una solución de Bromuro de Etidio. Nota: Al realizar este paso tomar la precaución de usar guantes de látex ya que este reactivo tiene propiedades mutagénicas. 9. Con mucho cuidado regresar el bromuro de etidio al frasco. Enjuagar con agua corriente y llevar al transiluminador. Nota Nota:: si no se tiene transiluminador usar una lámpara UV. 10. Si es posible tomar una fotografía para documentar la corrida. 11. Al final, realizar la limpieza del transilu transiluminador minador con etanol. SOLUCIONES DE TRABAJO TBE Solución stock 5X (en nuestro caso se comprara ya preparado, con una concentrac concentración ión 10X): Tris base 54.0 g Ácido bórico 27.5 g EDTA dihidratada 3.72 g Agua destilada, cbp. 1000 ml Punto de Paro: El gel se puede guardar en una bolsa de plástico, sumergido en buffer y a 4° C, así permanecerá en buenas condiciones por varios días.

Referencias 1. Vega-Castillo LF. Manual de Practicas de Biología Celular: Universidad Autonoma del Estado de México; 2013. 18 p. 2. Moreno R. LYMPHOPREP: Aislamiento de células mononucleares en sangre periférica por centrifugación en gradiente de densidad. 2004.

 

3. MOLINA NB. Comparación de métodos de lisis y extracción de ADN de trofozoítos de Giardia lamblia. Parasitología Latinoamericana. 2006;61. 4. Soto-Zárate CI. Manual de Practicas de Biología Molecular Universidad Nacional Autonoma de México; 2016. 41 p. 5. Brown TA. Gene Cloning and DNA Analysis an Introduction: Wiley-Blackwell; 2010. 320 p. 6. Burgess M, Puhalla S. BRCA 1/2-Mutation Related and Sporadic Breast and Ovarian Cancers: More Alike than Different. Front Oncol. 2014;4:19. Epub 2014/03/01. 2014/0 3/01. doi: 10.3389/fonc.2014.00019. PubMed PMID: 24579064; PubMed Central PMCID: PMCPMC3936197.

 

PRACTICA No. 10 CICLO CELULAR: MITOSIS

I. OBJETIVOS: Comprender los cambios que ocurren durante el ciclo celular y observar las diferentes etapas del proceso de división celular (mitosis) en células de cebolla y observar los cromosomas humanos en laminillas con cortes histológicos.

II: FUNDAMENTO Dentro de los procesos fundamentales que realiza una célula se encuentra el de la reproducción, función que le permitirá preservar su información genética en nuevas generaciones. Durante este proceso, la molécula que almacena la información que define ese organismo, el ADN; debe ser duplicado y asegurándose que los dos núcleos reciban la información exacta. Esta serie de eventos, se agrupan en el proceso denominado ciclo celular, y comprende 5 fases: la fase S (duplicación del ADN) y que se reparta exactamente en los dos núcleos (mitosis) en la fase M (re arreglo estructural del citoplasma y nuclear), la fase G1 y G2 anteceden a la replicación del DNA y mitosis respectivamente, y ocurren procesos reguladores del ciclo celular y procesos metabólicos, y finalmente la citocinesis.

III. INFORMACIÓN PREVIA. Investigar los cambios moleculares y estructurales que se presentan durante el ciclo celular. ¿Cuál es el mecanismo de acción de la colchicina? Investigar los tipos y numero de cromosomas que tienen las células humanas

 

  IV. MATERIAL Microscopio Papel seda  Aceite de inmersión 4 vidrios de reloj 1 mechero 1 pinza de disección 1 aguja de disección 2 pipetas graduadas de 5 ml 3 ml de colchicina al 0.1% 40 ml de acetorceína. Navaja o bisturí Cubreobjetos y portaobjetos Indispensable que el alumno traiga lo siguiente: 2 cebollas con raicillas nuevas y frescas. Para lo cual deberá colocar la base rugosa de la cebolla en un frasco o vaso de agua hasta sumergirla, cambiando el agua cada 24hrs. Sin maltratar las raicillas.

V. PROCEDIMIENTO. 1.Sacar la cebolla del agua, cortar aproximadamente 2 mm de la punta de las raicillas (área más obscura), dividirla en dos partes en vidrios de reloj. 2.En uno de los vidrios de reloj, agregar 3 ml de la solución de colchicina al 0.1%, y mantenerlas ahí durante 1 hora. 3.En el otro vidrio de reloj adicionar agua destilada por el mismo tiempo. 4.Al finalizar el tiempo poner las raíces en vidrios de reloj limpios, procurando etiquetar adecuadamente para no confundirlos, adicionar 4ml de acetorceina, calentar con el mechero a flama suave (se observa color

 

azul) hasta que comience a salir un poco de vapor, evitar quemar las raicillas adicionando más colorante, dejar enfriar y repetir dos veces más, adicionando 4ml de colorante cada vez. 5.Tomar una de las raíces y colocarla en un cubreobjetos limpio, agregar una gota de acetorceina, colocar el cubreobjetos, presionar con la goma de un lápiz girando el cubreobjetos sin romperlo. 6.Limpiar el exceso de colorante con un papel absorbente. 7.Observar con el objetivo 40X y determinar el índice mitótico en las raíces con y sin colchicina* *El índice mitótico se calcula revisando 100 células, y determinando la proporción de estas que este en mitosis. 1.Tratar de observar células en las diferentes fases de la mitosis, y contar cromosomas si es posible. 2.Observar las laminillas de cromosomas humanos (proporcionada por el profesor) a 10X, identificar metafases, observar con el objetivo 100X con aceite de inmersión. Tratar de contarlos.

VI. ANÁLISIS DE RESULTADOS Responder lo siguiente: ¿Cuál fue el índice mitótico y número de células en mitosis en las raicillas con y sin colchicina? Realizar esquemas de las fases de mitosis observadas. ¿Qué es un agente mitógeno y un mitostático? ¿cuál es el mecanismo de acción de un agente mitógeno y de uno mitostático? ¿Cuál es la diferencia entre la mitosis y meiosis? ¿Cuál es la relevancia del estudio de cariotipo en células humanas?

 

  VII. CONCLUSIONES

VIII. BIBLIOGRAFÍA. Bilogía Celular y Molecular Conceptos y experimentos. Gerald Karp. 5ta Ed.2009, McGraw-Hill Manual de prácticas de laboratorio Biología Celular. Yvonne Ducolomb y cols. Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Iztapalapa. Biología Celular y Molecular. Luis Felipe Jiménez García y Horacio Merchant Larios. Pearson Education