Manual de Normas y Procedimiento de Microbiologia - Hospital Santa Rosa -2012.PDF-1

DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA CLINICA Y ANATOMIA PATOLOGICA AREA DE MICROBIOLOGIA

MANUAL DE NORMAS Y PROCEDIMIENTOS DE MICROBIOLOGIA

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DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA CLINICA Y ANATOMIA PATOLOGICA

MANUAL DE NORMAS Y PROCEDIMIENTOS

AREA DE MICROBIOLOGIA

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MANUAL DE NORMA Y PROCEDIMIENTO DEL AREA DE MICROBIOLOGIA

ELABORADO: Dra.: SILVIA BELLING SALAS Patólogo Clínico Jefa del área de Microbiología REVISADO POR: Dra.: ISABEL CAMPOS CARPIO Patólogo Clínico Jefa del Servicio de Patología Clínica Y Anatomía Patológica

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COLABORACION EN LA ELABORACION: Blga. ZOILA AYALA BURGA

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Blgo. EDUARDO MÁLAGA DÍAZ -

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TM. MARÍA CABALLERO SEVILLA - Hospital Santa Rosa TM. EDWIN SÁNCHEZ UTANI

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Tec. ROSA CASTAÑEDA DÁVILA - Hospital Santa Rosa

AGRADECIENDO EL APOYO: Dr. CESAR BALCÁZAR BRICEÑO -

Hospital Casimiro Ulloa

Dr. ALFREDO GUILLEN O´NEGLIO - Docente UNFV - UPC

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INDICE I. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................... 7 II. OBJETIVOS ........................................................................................................................... 7 III. BASE LEGAL ......................................................................................................................... 8 IV. ALCANCE ............................................................................................................................. 8 V. NORMAS ADMINISTRATIVAS DEL SERVICIO DE MICROBIOLOGÍA ........................................... 9 VI. GLOSARIO DE TÉRMINOS .............................................................................................. 10-11 VII. PROCEDIMIENTOS GENERALES DE OBTENCIÓN DE MUESTRAS

A) Muestra para Hemocultivo ...................................................................................... 12-14 B) Muestra de Dispositivo intravascular………………………………… ........................................... 15 C) Muestra para urocultivo ............................................................................................ 16-18 D) Muestra de herida ................................................................................................... 19-20 E) Muestra de fluidos corporales ................................................................................... 21-22 F) Muestra de líquidos biológicos( peritoneal, pericárdico, pleural, articular) .................. 23-24 G) Muestras de tracto respiratorio inferior ..................................................................... 25-26 H) Muestra de Secreción Faríngea ................................................................................. 27-28 I) Muestra de secreción Vaginal ..................................................................................... 29-30 J) Muestra de secreción uretral ...................................................................................... 31-32 K) Muestra para Espermiocultivo ........................................................................................ 33 L) Muestra para coprocultivo ........................................................................................ 34-35

VIII. PROCEDIMIENTOS MEDICOS, ASISTENCIALES *Cultivo de Orina ( Urocultivo) ....................................................................................... 36-38 *Cultivo de Herida ......................................................................................................... 39-40 *Cultivo de secreción Vaginal ........................................................................................ 41-42 *Cultivo de secreción Faríngea ....................................................................................... 43-44 *Cultivo de dispositivo intravascular ............................................................................. 45-46 *Cultivo de Esputo ......................................................................................................... 47-48 *Cultivo de vías Respiratorias Bajas………………………………..……………………………….…..49-50 *cultivo de secreción Biliar ............................................................................................ 51-52 *Cultivo de Heces ( Coprocultivo) .................................................................................... 53-54 *Cultivo de Fluidos Corporales ........................................................................................ 55-56 * Examen Micológico: Directo y Cultivo ........................................................................... 57-59

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*Baciloscopía para el Diagnostico de Tuberculosis ........................................................... 60-62 * Susceptibilidad antimicrobiana por el Método Disco de Difusión ) ................................. 63-65 i) Grupos Antimicrobianos Sugeridos Para Microorganismo de Fácil Desarrollo .......... 66-69 ii) Grupos Antimicrobianos Sugeridos Para Microorganismo de Dificil Desarrollo ......... 70-72 *Tinción Gram ............................................................................................................... 73-74 *Rotavirus ..................................................................................................................... 75-76 *Investigación De Parásitos en heces .............................................................................. 77-78 *Sangre Oculta en Heces( Thevenon) .............................................................................. 79-80 *Reacción Inflamatoria ................................................................................................. 81-82 *Test de Graham............................................................................................................ 83-84 *Identificación de Plasmodium ( Gota Gruesa y Frostis) .................................................. 85-88 *Hemocultivo ................................................................................................................ 89-91 IX. PRUEBAS COMPLEMENTARIAS PARA COCOS GRAM POSITIVOS A) Identificación de Estafilococos ................................................................................... 92-93 *Prueba de la Catalasa ................................................................................................... 94 *Prueba de la Coagulasa ............................................................................................ 95-96 *Resistencia a la Novobiocina .................................................................................... 97-98 *Resistencia a la Polimixina B .................................................................................. 99-100 B) Identificación de Enterococos .......................................................................................... 101 *Prueba de la Esculina en Medio de Bilis ................................................................. 102-103 *Prueba de la Tolencancia al Cloruro de sodio ............................................................... 104 X. PRUEBAS COMPLEMENTARIAS PARA BACILOS GRAM NEGATIVOS A) Identificación de Bacilos Gram Negativos Fermentadores ............................................... 105 *Prueba del Metabolismo Bacteriano ..................................................................... 106-110 B) Identificación de Bacilos Gram Negativos Fermentadores .............................................. 111 *Prueba de Hidrolisis de la Gelatina ............................................................................... 112 XI. MEDIOS DE CULTIVO 1) Clasificación ............................................................................................................ 113-114 2) Criterios de Calidad .................................................................................................. 115-117 3) Descripción de los Medios de Cultivo a) Agar Azul de Bromotimol Lactosa Cistina ( Brolacin o CLED) .................................. 118-119 b) Agar Chocolate..................................................................................................... 120-121 c) Agar Citrato Simmons ........................................................................................... 122-123 d) Agar Lisina Hierro (LIA) ......................................................................................... 124-125

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e) Agar Mc Conkey .................................................................................................. 126-127 f) Agar Manitol Salado............................................................................................ 128-129 g) Agar Saboraud Glucosado 4% ..................................................................................... 130 h) Agar Sangre ....................................................................................................... 131-132 i) Agar Azida Sangre ............................................................................................... 133-134 j) Agar Salmonella, Shigella (SS) ........................................................................... 135-136 k) Agar Tripticasa de Soya (TSA)............................................................................... 137-138 l) Agar Triple Sugar Iron ( TSI ) ............................................................................ 139-140 m) Agar Urea según Christensen .............................................................................. 141-142 n) Caldo de Tripticasa de Soya ................................................................................ 143-144 o) Medio de Muller Hinton ...................................................................................... 145-146 p) Medio de Transporte Cary Blair .................................................................................. 147 q) Medio Sulfuro, Indol, Movilidad (SIM)……….……………………………………………….…148-149 r) Estándar de Turbidez – Escala de Mc Farland ....................................................... 150-151 XII. COLORANTES A) Coloración GRAM. ...................................................................................................... 152 B) Coloración de Kinyou .................................................................................................. 153 C) Coloración Wayson ..................................................................................................... 154 D) Coloración Azul de Metileno ....................................................................................... 154 E) Coloración para Campylobacter .................................................................................. 154 F) Coloración para Criptosporidium ................................................................................. 155 G) Coloración de Wright.. ............................................................................................... 156 H) Coloración Giemsa .................................................................................................... 157 I) Coloración directo Para Campylobacter ........................................................................ 158 J) Técnica : Leucocitos –Reacción Inflamatoria . ............................................................... 158 XIII. ANEXOS ................................................................................................................. 159-193 XIV.BIBLIOGRAFIAS .............................................................................................................. 194

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MANUAL DE NORMAS Y PROCEDIMIENTOS DEL SERVICIO DE MICROBIOLOGIA I. INTRODUCCION: El manual de normas y procedimientos del Área de Microbiología es un documento técnico normativo de gestión que permite orientar y ordenar las acciones que desarrolla el personal profesional y técnico del área. En este manual describiremos aspectos básicos de la obtención de muestra, envío y transporte para análisis, diagnóstico etiológico, investigación y control microbiológico, siendo parte de estas el aislamiento, identificación como estudio de la susceptibilidad antimicrobiana de los organismos causales de la enfermedad. Incluye también la investigación de parásitos en heces, fluxogramas de los procesos, gráficas relacionados a los temas tratados, preparación de medios de cultivos, control de calidad y las coloraciones. Los laboratorios de Microbiología trabajan con diversas muestras clínicas y métodos diagnósticos contando el Hospital Santa Rosa con equipamiento automatizado de identificación microbiana y susceptibilidad anti microbiana correspondiente orientando nuestra labor a una mejora continua en la calidad de los procedimientos que se efectúan en el servicio. Las normas de bioseguridad se aplican conforme al Manual del Departamento. II. OBJETIVOS: 1. Establecer formalmente los procedimientos que se realizan en el servicio detallando sus actividades dentro del marco de las normas establecidas. 2. Contribuir a la ejecución eficiente de los procedimientos que se llevan a cabo, siguiendo una metodología uniforme que norma este Manual y que permita control sobre los resultados de las actividades realizadas. Racionalizando los recursos asignados, tomando en cuenta el costo beneficio institucional que redundará a favor del cliente interno y externo.

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3. Mejoramiento de los procesos existentes en beneficio de los pacientes del hospital. Contribuyendo con la realización de los objetivos institucionales.

III. BASE LEGAL: Ley № 26842- Ley General de Salud. Ley № 27444- Ley de Procedimientos Administrativos. Ley № 27657- Ley del Ministerio de Salud. D.S. № 013-202- SA Aprueba el Reglamento de la Ley № 27657 D.S. № 023-023-2005-SA Reglamento de Organización y Funciones del Ministerio de Salud. Resolución Ministerial № 603-2006-SA/ Dm Aprueba Directiva №007MINSA/OGPE-V.02 “Directiva para la Formulación de Documentos Técnicos Normativos de Gestión Institucional” y su modificatoria con la Resolución Ministerial №327-2009/ MINSA. Resolución Ministerial №1022-2007/MINSA- Aprueban el Reglamento de Organización y funciones del Hospital Santa Rosa. Resolución Directoral № 0191-2011-SA-DS-HSR-OEPE/DG. Aprueba el Manual de Organización y Funciones del Departamento de Patología Clínica y Anatomía Patológica del Hospital Santa Rosa. Directiva № 007- MINSA/OGPP-V.02 “Directiva para la formulación de Documentos Técnicos Normativos de Gestión Institucional” Aprobado mediante RM. № 317- 2009/MINSA de 14 de mayo de 2009.

IV. ALCANCE: Las disposiciones contenidas en el presente manual alcanzan a todos los trabajadores que laboran directamente en el Servicio de Microbiología del 8

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Departamento de Patología Clínica y Anatomía Patológica del Hospital Santa Rosa, estableciendo sus funciones y responsabilidades.

V. NORMAS ADMINISTRATIVAS DEL SERVICIO DE MICROBIOLOGIA: 1.- DE LA ORGANIZACIÓN DEL SERVICIO: El Servicio de Microbiología está conformado por una jefatura, personal profesional operativo: médico, biólogos, tecnólogos médicos, técnicos de laboratorio.

2.- DE LA ATENCION EN EL SERVICIO DE MICROBIOLOGIA: El Servicio de Microbiología brindará apoyo diagnostico a las áreas de Consulta Externa, Hospitalización, Emergencia, Sala de Operaciones, Salas de Procedimientos y otras.

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VI. GLOSARIO DE TERMINOS:  ABSCESO: Acumulación localizada de pus en un tejido u órgano.  AEROBICO: Un organismo que requiere oxígeno o aire atmosférico para su crecimiento y reproducción.  AGLUTINACION: Reacción por la que se provoca la agrupación de partículas, bacterias y células suspendidas en un medio liquido.  AISLAMIENTO PRIMARIO: Desarrollo inicial del microorganismo.  ANTIMICROBIANO: droga que mata microorganismos o suprime su multiplicación o desarrollo.  ASEPSIA: Desinfección de un tejido vivo o piel.  BACTERIA: Microorganismo unicelular microscópico perteneciente a los procariotas que se multiplica por fisión binaria y carece de clorofila.  BACTERIA GRAM POSITIVA: aquella que retiene el colorante primario de la coloración de Gram, se tiñe de color azul púrpura.  BACTERIA GRAM NEGATIVA: Aquella que no retiene el colorante primario de la coloración de Gram y toman el colorante de contraste, se tiñe de color rojizo.  BIOSEGURIDAD: Conjunto de medidas preventivas para proteger la salud y la seguridad humana y del ambiente frente a diferentes riesgos biológicos, físicos, químicos o mecánicos.  CEPA BACTERIANA: Cultivo puro de microorganismos formada por los descendientes de un solo aislamiento original.  COLONIA: Desarrollo visible de microorganismos, originado por la multiplicación de un solo microorganismo preexistente.  CHORRO MEDIO DE ORINA: Muestra de orina obtenida después que el paciente deja discurrir cierta cantidad inicial.  DESINFECCIÓN: Destrucción de microorganismossobre objetos inanimados mediante agentes químicos .  DESINFECTANTE: Agente químico que se emplea para realizar el proceso de desinfección.  ESTERILIZACIÓN: Proceso físico o químico que destruye toda forma de vida microbiana incluidas las esporas.  HEMÓLISIS: Presencia de restos de eritrocitos lisados alrededor de una colonia desarrollada en una placa de agar sangre de carnero.

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 HEMÓLISIS ALFA: Las colonias están rodeadas por una destrucción parcial de los eritrocitos y pérdida de algo de hemoglobina en el agar lo que resulta en una coloración verde (hemólisis incompleta).  HEMÓLISIS BETA: Las colonias están rodeadas por una zona de hemólisis completa (clara, transparente) debido a una destrucción total de los eritrocitos.  INCUBACIÓN: Mantenimiento de cultivos de microorganismos en condiciones favorables para que puedan desarrollarse y multiplicarse.  INFECCIÓN: Invasión y multiplicación de microorganismos en un huésped, pudiendo progresar hacia una enfermedad.  INÓCULO: Alícuota de una muestra que es colocada en un medio de cultivo.  LIMPIEZA: Es la remoción mecánica de toda materia extraña con el objeto de disminuir el número de microorganismos por arrastre.  MEDIO DE CULTIVO: Medio artificial con sustancias nutritivas optimas que permiten el crecimiento y multiplicación de los microorganismos in vitro.  MICROAEROFÍLICO: Organismo que crece y se reproduce mejor en la presencia de una tensión del 5% de oxigeno, 10% de anhídrido carbónico y 85% de nitrógeno.  MICROORGANISMO VIABLE: Es aquel que es capaz de reproducirse.  MICROORGANISMO: organismo microscópico, los de interés médico incluyen: bacterias, hongos, virus y protozoos.  SEPSIS: Patología compleja de respuesta sistémica con compromiso multiorganico, secundaria a la invasión del organismo por alguna bacteria u hongos.  SIEMBRA PRIMARIA: Inoculación de una muestra a un medio de cultivo simple, selectivo o de enriquecimiento.  SUBCULTIVO: Pasaje de bacteria viables derivadas de otro cultivo simple, selectivo o de enriquecimiento.  UFC: Unidad Formadora de Colonia.

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VII. PROCEDIMIENTOS DE OBTENCIÓN DE MUESTRAS La colección de las muestras microbiológicas generalmente se efectúa fuera del ambiente del laboratorio por lo que es importante revisar los procesos de obtención de la muestra con los trabajadores de salud encargados. Es importante estar informados de las normas de toma y transporte de muestras. Según recomendación de las pautas establecidas para la toma de muestra brindadas a través de cursos y talleres de capacitación.

A) OBTENCION DE MUESTRA PARA HEMOCULTIVO Condiciones específicas El momento óptimo de obtención de la muestra para hemocultivo es justo antes del pico febril más alto, escalofríos y sin tratamiento antibiótico, sin embargo esta situación ideal no es frecuente. Alternativamente las muestras pueden obtenerse de acuerdo con el caso. Por ejemplo. • BACTEREMIAS CONTINUAS: En cualquier momento, ejm. Endocarditis, fistulas arterias - venosas y catéteres • BACTEREMIAS INTERMITENTES: Una hora antes del pico febril, ejm. Brucelosis, abscesos extravasculares o infecciones difusas (celulitis, peritonitis, artritis séptica) Cronología para hemocultivos   



En sepsis: Se debe tomar dos a tres muestras de lugares diferentes en un lapso de diez minutos En endocarditis aguda: Obtener tres muestras de tres lugares diferentes en un lapso de 1 a 2 horas. En endocarditis subaguda: Obtener tres muestras de tres lugares diferentes a intervalos de al menos quince minutos. Si el cultivo es negativo a las 24 horas, obtener tres muestras más. En fiebre de origen desconocido: Obtener dos o tres muestras de lugares diferentes con diferencia de 1 hora o más entre una y otra muestra. Si el cultivo es negativo a las 24 horas, obtener dos a tres muestras.

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PREPARACION DE LA BOTELLA: 1. Visualmente supervisar aquellas botellas con sospecha de contaminación o daño. 2. Remover la tapa protectora 3. Limpiar el septum de goma con Alcohol de 70° 4. Dejar secar 1 minuto. PREPARACION DE LA PIEL 1. Localizar la vena 2. Limpieza con alcohol etílico 70° (etanol), limpiar varias veces hasta que el algodón salga limpio.

3. Aplicar solución de iodo o clorhexidina gluconato por 30 segundos en círculos concéntricos de adentro hacia afuera. (Pacientes hipersensibles al iodo, limpiar con alcohol 70 ° por 60 segundos). 4. Dejar secar el lugar de venopuncion. 5. No re-palpar la vena luego de haber realizado la antisepsia de la zona. VENIPUNCION 1. Extraer el volumen recomendado de sangre. 2. Inocular las botellas directamente usando las marcas de volumen de la jeringa como guía para asignar el volumen correcto. Volumen de sangre a tomar por cada venopuntura: Obtención de muestra de sangre mediante uso de jeringa: La proporción entre el volumen de sangre obtenida y el volumen del caldo de cultivo debe estar en una relación de 1:5 - 1:10. El volumen de sangre dependerá de la edad del paciente; por cada venopuncion se recomienda:    

Neonatos: 0.5 - 1 ml De un mes a dos años tomar de 1 ml a 3 ml. De tres años a doce años tomar de 3 ml a 5 ml Adolescentes y adultos de 10 ml a 20 ml. 13

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Inoculación de la muestra de sangre al medio de cultivo  Utilizar un medio bifásico o monofásico para este procedimiento. Desinfectar el diafragma del frasco de hemocultivo con alcohol etílico de 70% o alcohol yodado.  Inocular la muestra de sangre al frasco con medio de cultivo a través del diafragma. Debe realizarse inmediatamente de obtenida la muestra para evitar que se coagule.  Mezclar el contenido del frasco inclinándolo suavemente dos o tres veces. En caso que se use el medio bifásico, bañar la fase sólida con la sangre.  Descartar la aguja y la jeringa en un contenedor resistente a las punturas. No volver a introducir la aguja en su funda.  Limpiar la tapa del frasco. Etiquetar el frasco apropiadamente indican0000000000000do además el número de hemocultivo.  Transportar el hemocultivo inmediatamente al laboratorio de acuerdo a la norma establecida. No excediendo las 2 horas. Se recomienda obtener como mínimo 2 o 3 frascos de hemocultivo por paciente. Si por alguna razón se obtiene menor volumen de sangre que el deseado, no debe descartarse. No refrigerar los frascos de hemocultivo, mantener a temperatura ambiente.

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B) OBTENCION DE MUESTRA DE DISPOSITIVOS INTRAVASCULARES Se aplica en la obtención de muestras para el diagnóstico de infecciones asociadas a dispositivos intravasculares en los que puede realizarse cultivos semi cuantitativos del torrente sanguíneo, tales como: central, Hickman, Brovac, periférico, arterial, umbilical, de nutrición parenteral total, Swan Ganz. Materiales a) Alcohol etílico 70% b) Gasa estéril c) Tijera estéril d) Tubo o frasco con tapa rosca estéril e) Guantes de látex estériles f) Refrigeradora g) Estufa de 35 – 37 °C. h) mechero Bunsen i) Contenedor de material contaminado. Procedimiento a) Limpiar la piel con alcohol de 70° alrededor de la inserción del catéter. b) Retirar el catéter en forma aséptica, cortar a 5 cm de la punta distal del catéter dejando caer directamente en un tubo o frasco vacío estéril con tapa rosca. c) Rotular y transportar la muestra inmediatamente al laboratorio de microbiología en un período NO MAYOR DE 15 MINUTOS A TEMPERATURA AMBIENTE para prevenir que se seque. d) Registrar el procedimiento. e) En el caso de no poder enviarse inmediatamente al laboratorio, la muestra debe mantenerse refrigerada a 4° C hasta por 24 horas. CRITERIO DE RECHAZOS DE MUESTRA  Envase, tubo o tapa rosca no estéril.  Muestra con periodo de tiempo de transporte mayor de 15 minutos a temperatura ambiente.  Solicitud de examen microbiológico incompleto o ilegible y discrepancia con la identificación del paciente o la muestra

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C) OBTENCION DE MUESTRA DE ORINA PARA CULTIVO El presente procedimiento se aplica en la obtención de muestras de orina de pacientes para el diagnóstico de infecciones del tracto urinario. Condiciones Generales La orina es un excelente medio de cultivo para la proliferación bacteriana, por esta razón, la muestra debe ser procesada dentro de las 2 horas después de haber sido obtenida o debe refrigerarse a 4° C (máximo 24 horas) hasta su procesamiento. Generalmente el desarrollo de dos o más tipos de colonias (en pacientes sin sonda vesical) indica que la muestra se ha contaminado por recolección incorrecta o demora en la siembra.

OBTENCIÓN DE MUESTRA DE ORINA DEL CHORRO MEDIO Obtención de muestras de orina en pacientes mujeres hospitalizadas Materiales y equipos a) Guantes descartables b) Cinco o más piezas de gasa estéril de tamaño adecuado pudiendo ser de 4”x4” c) Jabón d) Agua tibia estéril e) Frasco estéril de boca ancha para la muestra de orina Procedimiento a) Mantener la privacidad de la paciente. b) Rotular el frasco con el nombre de la paciente, fecha de obtención de la muestra, hora y el procedimiento a utilizar para la obtención de la muestra. c) Lavarse las manos con jabón y abundante agua, colocarse guantes. d) Preparar una pieza de gasa para la limpieza de los genitales externos humedeciéndola con agua y una pequeña cantidad de jabón. Preparar dos piezas más de gasa para el enjuague con agua tibia. e) Separar los labios mayores con dos dedos de una mano y limpiar el área expuesta pasando la gasa de adelante hacia atrás. f) Descartar la gasa.

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g) Con otra gasa humedecida enjuagar el área de adelante hacia atrás. Repetir el procedimiento con otra gasa. h) Finalmente secar el área de adelante hacia atrás con un trozo de gasa seca. i) Mantener separados los labios mayores mientras la paciente empieza a orinar. Luego del chorro inicial colocar el frasco estéril para colectar el chorro medio. j) Al terminar de orinar, inmediatamente tapar el frasco y limpiar la superficie del mismo. Obtención de muestra de orina en pacientes varones Materiales a) Guantes descartables b) Cinco o más piezas de Gasa estéril c) Jabón d) Agua tibia estéril e) Frasco estéril de boca ancha para la obtención de la muestra Procedimiento a) Mantener la privacidad del paciente. b) Rotular el frasco con el nombre del paciente, fecha, hora y el procedimiento a utilizar para la obtención de la muestra. c) Lavarse las manos con jabón y abundante agua. d) Preparar una pieza de gasa con agua y una pequeña cantidad de jabón. Preparar dos piezas más de gasa para el enjuague con agua tibia. e) Realizar la higiene de los genitales. Retraer el prepucio antes de lavar el glande con la gasa humedecida con jabón. Descartar la gasa. f) Enjuagar el glande, usando una gasa húmeda. Repetir el procedimiento con otra gasa. g) Secar la zona, usando uno o más piezas de gasa seca. h) Indicar al paciente que mantenga el prepucio retirado e inicie la micción directamente en un recipiente (orina para descartar). i) Después del chorro inicial colocar el frasco estéril para colectar la muestra del chorro medio. j) Obtenida la muestra, inmediatamente tapar el frasco y limpiar la superficie del mismo.

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LACTANTES: a) Hidratar bien al bebé con leche y agua. Lavado de la zona genital con agua y jabón suave, repetir el lavado 3 veces y secar. Colocar una bolsa colectora estéril sobre los genitales para recoger la orina de la micción espontanea. b) Colocar el borde de la bolsa engomada sobre la piel, debe retirarse la bolsa tan pronto como el niño realice su micción. c) No debe estar colocada mas de 1 hora la bolsa colectora en caso contrario debe cambiarse por una nueva. CRITERIOS DE RECHAZO DE MUESTRA:  Solicitar una nueva muestra de orina cuando la muestra ha sido conservada por más de 2 horas, a temperatura ambiente.  Toda muestra que no este adecuadamente rotulada será rechazada  Rechazar orinas de 24 horas, de colección  Rechazar la orina de muestras colectoras en pacientes con sonda Foley.  Rechazar la muestra que llegan en frascos abiertos y derramados.  Rechazar muestras con solicitud de cultivo anaerobios cuando la muestra no son tomadas por punción supra púbica.  Rechazar orinas que no hayan permanecido un mínimo de 4 a 5 horas en vejiga, es decir aquellas orinas emitidas inmediatamente después de haber ingerido líquidos, debido a que el paciente ya había miccionado recientemente, ya que con toda seguridad los cultivos van a salir negativos.

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D) OBTENCION DE MUESTRA DE HERIDA En el caso de una herida con sospecha de infección, la muestra se obtiene por aspiración con aguja. Materiales a) Guantes descartables b) Solución salina estéril c) Jabón d) Gasa estéril e) Medio de transporte de Stuart, Amies con carbón o Cary Blair. f) Lámina portaobjeto g) Tubo estéril (opcional)

Obtención de muestra de absceso por aspiración con aguja: El método indicado para obtener muestras de abscesos es por aspiración con aguja. Materiales a) Guantes descartables b) Jeringa estéril c) Aguja adecuada (recomendable aguja Nº 18 a 20) d) Solución salina estéril e) Jabón f) Gasa estéril g) Tubo estéril (opcional) h) Medio de transporte de Stuart o Amies con carbón. Procedimiento a) Colocarse los guantes descartables b) Se deberá realizar una muy buena limpieza de la herida arrastrando toda la secreción por encima de la escara con solución antiséptica (alcohol 70° seguido de solución de yodo por 1-2 min.) y luego se enjuagará generosamente con solución fisiológica. c) Desinfección de la superficie será en forma concéntrica (de adentro hacia afuera)

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d) La muestra debe ser tomada por PUNCIÓN ASPIRATIVA a través de PIEL SANA (utilizando una jeringa de tipo tuberculina o similar) e) Colocar la muestra en un tubo estéril y enviar al laboratorio. f) Si el transporte de la muestra al laboratorio demora más de 20 - 30 minutos se debe mantener en medios de transporte como Stuart o Amies con carbón, Cary Blair. g) En el medio de transporte, la muestra puede permanecer a temperatura ambiente hasta 24 horas. NOTA: En quemaduras:  Limpiar y retirar el tejido muerto o quemado antes de la obtención de la muestra.  Las muestras de tejido deben llevarse al laboratorio en un envase con tapa rosca. CRITERIOS DE RECHAZO  Envase no estéril  Muestra con mas de 2 horas de colección sin refrigeración  Envase sin rotular  Solicitud de examen microbiológico incompleto o ilegible y discrepancia con la identificación del paciente o la muestra  Muestra derramada

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E) OBTENCION DE MUSTRA DE FLUIDOS CORPORALES Las muestras deben de ser procesadas inmediatamente, un examen directo es de mucha utilidad para anticipar los resultados y brinda una valiosa información. Directo: sin centrifugación Gram: del sedimento centrifugado

LIQUIDO CEFALORRAQUÍDEO LCR POR PUNCIÓN LUMBAR Es un procedimiento médico, requiere consentimiento informado MATERIAL NECESARIO.  Campos estériles.  Guantes estériles.  Gasas estériles.  Alcohol etílico al 70%.  Yodo povidona al 10%.  Jeringas de 5-10 ml.  Agujas de punción IM.  Trócares de punción lumbar de varios tamaños.  Tubos cónicos limpios y estériles con tapón de rosca. No usar frascos que hayan contenido medicamentos como por ejemplo antibióticos ya que pueden tener efecto antimicrobiano y pueden ser negativo los cultivos. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA 1. Se obtendrá antes de instaurar cualquier terapéutica antibiótica. 2. Quien realice la toma de la muestra deberá lavarse las manos previas al procedimiento, colocarse sobre túnica y guantes estériles. 3. Se localiza la zona elegida para la punción lumbar mediante palpación de los espacios intervertebrales una vez colocado el paciente en la posición adecuada. 4. Se desinfecta con alcohol al 70% una zona de uso 10 cm de diámetro en el área elegida, la aplicación del desinfectante se hace de forma concéntrica del centro a la periferia. 5. Se coloca campo estéril 6. Se repite la operación con Yodo povidona que se deja secar durante un minuto. 7. Realizar la punción entre los espacios intervertebrales L3-L4, L4-L5 o L5-S1, siguiendo las normas de la más estricta asepsia.

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8. Al llegar al espacio subaracnoideo retirar el estilete y dejar salir libremente el líquido cefalorraquídeo que se recogerá en tres tubos, sin conservantes, con tapón de rosca. 9. El primer tubo es el que debe enviarse para el estudio bioquímico, el segundo para el estudio microbiológico y el tercero para investigación de células (este suele ser el más transparente aunque la punción haya sido traumática) VOLUMEN MÍNIMO.  Para el estudio bacteriológico rutinario es suficiente 1 ml, aunque es preferible disponer de volúmenes superiores.  Para hongos o micobacterias se necesitan al menos 2 ml adicionales más por cada uno de los estudios, siendo deseable llegar a los 10 ml.  Para estudio de virus se necesita por lo menos 1 ml más. TRANSPORTE.  La muestra debe enviarse inmediatamente al laboratorio, pues alguno de los agentes etiológicos como S. pneumoniae, pueden lisarse rápidamente a partir de una hora tras su recogida. Si no es posible se mantendrá en estufa a 3537ºC y una parte se incubará en un frasco de hemocultivo. Si no se dispone de estufas se mantendrá a temperatura ambiente. Nunca deberá refrigerarse pues se puede afectar la viabilidad de N. meningitidis y H. influenzae.  En el LCR no se estudian rutinariamente anaerobios. En caso de solicitar esta investigación se enviará en un medio de transporte de líquidos para estudio de anaerobios o en frasco de hemocultivo anaerobios.  Las muestras para el estudio de virus se enviarán en hielo, si el envío se retrasa más de 24 horas, se deberá de conservar a -70ºC. OBSERVACIONES.  Como la meningitis suele surgir por un proceso bacterémico se solicitarán simultáneamente hemocultivos.  Es necesario que el médico señale claramente las investigaciones solicitadas (bacterias habituales, mico bacterias, anaerobios, hongos o virus).  Los tubos deben ser cuidadosamente rotulados en el orden que se van recolectando, como 1, 2 y 3 (muestra inicial, muestra intermedia y muestra final)

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F) OTROS LÍQUIDOS BIOLÓGICOS: PERITONEAL (ASCITIS), PERICÁRDICO, PLEURAL, ARTICULAR En este apartado trataremos de líquidos orgánicos, habitualmente estériles, salvo LCR. La toma de muestra, para la obtención de estos líquidos, es un procedimiento médico que requiere de ciertos cuidados para obtener una muestra adecuada para el examen microbiológico. MATERIAL NECESARIO.  Campos estériles.  Gasas estériles.  Guantes estériles.  Jeringas y agujas estériles. No se deben utilizar jeringas heparinizadas, pues la heparina lleva conservantes que pueden interferir la viabilidad de los microorganismos.  Yodo povidona al 10%.  Recipientes estériles con tapón de rosca.  Recipientes estériles de boca ancha (ejemplo: el frasco de urocultivo).  Sistemas de transporte de líquidos para estudio de anaerobios.  Alcohol etílico al 70%.  Frascos de hemocultivos. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA. Se requiere de consentimiento informado para la toma de muestra, salvo en casos de emergencia. Varía dependiendo del líquido corporal que se trate, pero siempre deberá seguirse una técnica rigurosamente aséptica. La muestra se obtiene por punción y se coloca en recipientes adecuados para su envío al laboratorio. 1. Realizar antisepsia de piel con alcohol, haciendo círculos concéntricos desde el centro hacia la periferia en una zona de unos 10 cm de diámetro. 2. Repetir el paso anterior con Yodo povidona al 10%, dejando secar durante un minuto. En pacientes con hipersensibilidad al yodo, realizar la desinfección con alcohol 70%, dos veces consecutivas. 3. La toma se hace por punción percutánea (toracocentesis, paracentesis, punción pericárdica o punción articular) de forma aséptica para evitar la contaminación por la flora cutánea o ambiental.

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4. Una vez realizada la toma se retira la yodo povidona de la piel con un apósito impregnado en alcohol al 70%. 5. Raramente se pueden realizar tomas de estas localizaciones en el transcurso de intervenciones quirúrgicas. En esta circunstancia debe desaconsejarse el uso de hisopos, siendo preferible también la aspiración; se utilizarán hisopos sólo si el contenido no puede ser aspirado. VOLUMEN MÍNIMO. Para el estudio bacteriano rutinario es suficiente de 1 a 10 ml. Cuando se requiera la investigación de Mycobacterium spp. u hongos se enviará un volumen superior a 10 ml. TRANSPORTE  Si es necesario evitar la coagulación de algunos de estos líquidos se usará heparina sin conservantes; otros anticoagulantes pueden tener acción antibacteriana.  Los recipientes idóneos son tubos estériles de tapón de rosca o de presión negativa sin conservantes.  Se llenarán hasta cerca del tapón, de esta forma pueden ser útiles para el estudio de anaerobios, especialmente si la muestra es purulenta.  Los viales o tubos pre-reducidos para el transporte de muestras para el estudio de anaerobios se emplearán en aquellos casos en que se sospeche este tipo de microorganismos.  Frascos de Hemocultivos: Este es un sistema adicional a los anteriores. Está particularmente indicado cuando el envío se puede retrasar o en los líquidos que pueden coagularse. Si se sospecha anaerobios emplear un medio adecuado para estas bacterias. Con su uso se ha incrementado el aislamiento bacteriano en peritonitis espontáneas o en las asociadas a diálisis peritoneal ambulatoria crónica. También se recomienda para el aislamiento de gérmenes en líquidos articulares.  En ningún caso se aceptaran hisopos embebidos en el líquido.  Las muestras deben ser enviadas inmediatamente al laboratorio. OBSERVACIONES. Cuando se utilice una anestesia local, hay que cambiar de jeringa y aguja para hacer la extracción de la muestra, ya que los anestésicos pueden inhibir el crecimiento bacteriano. 24

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G) OBTENCIÓN DE MUESTRAS DE SECRECIONES DEL TRACTO RESPIRATORIO INFERIOR Condiciones Específicas Las muestras de lavado broncoalveolar, cepillado bronquial o aspirado transtraqueal deben ser obtenidas por profesional especializado siguiendo los procedimientos normativos correspondientes. Materiales a. Recipiente estéril de boca ancha con tapa rosca.(esputo) b. Catéter de polietileno estéril o jeringa(aspirado endotraqueal) c. Tubo estéril con 1 ml. de suero fisiológico (lavado broncoalveolar, lavado bronquial y cepillado bronquial) Procedimiento ESPUTO POR EXPECTORACION:  Es recomendable que la muestra sea tomada en la mañana al levantarse  Debe supervisarse la recolección de la muestra  Indicar al paciente que se enjuague la cavidad oral con agua antes de expectorar, para removerla flora superficial oral.  Si el paciente tiene dentadura postiza indicarle que se la quite  Instruir al paciente para que tosa con fuerza, permitiendo la salida de las secreciones que provengan desde el tracto respiratorio inferior.  La muestra debe ser recolectada directamente en un envase estéril.  No debe colectarse saliva ni fluido post-nasal. ESPUTO INDUCIDO  Indicar al paciente que se enjuague la boca con agua antes de la obtención de la muestra.  Con ayuda de un nebulizador, hacer que el paciente inhale 25 ml. De solución de cloruro de sodio estéril al 3 - 10 %.  Colectar el esputo inducido en un envase estéril

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ASPIRADO ENDOTRAQUEAL  Colectar el espécimen a través de una traqueotomía o tubo endotraqueal (tubo nasotraqueal u orotraqueal), con cuidado (técnica cuidadosa y aséptica) introduzca el catéter de polietileno estéril a través de la traqueotomía o tubo endotraqueal evitando la contaminación alta.  Extraer lentamente el catéter y simultáneamente aspirar en forma intermitente el material de los bronquios principales izquierdo y derecho y de la tráquea utilizando una jeringa o un succionador intermitente.  Remueva el catéter, descarte la jeringa y Colocar en un frasco estéril.  Transportar la muestra a Laboratorio de preferencia inmediatamente. CRITERIO DE RECHAZOS DE MUESTRA a) Envase tubo o tapa rosca no estéril. b) Envase sin rotular c) Muestra derramada o rotura del envase d) Solicitud de examen microbiológico incompleto o ilegible y discrepancia con la identificación del paciente o la muestra e) Demora en enviar la muestra al laboratorio f) Otra solicitud antes de las 72 horas.

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H) TOMA DE MUESTRA PARA CULTIVO DE SECRECION FARINGEA Condiciones Específicas Es el conjunto de acciones que se realizan para la óptima recuperación de agentes Patógenos de secreción faríngea. Materiales: 1. 2. 3. 4.

Hisopos de algodón estéril en tubos de ensayo, para recolectar las muestras. Un baja lengua estéril Una mascarilla protectora Medio de transporte

Procedimiento 1. Es recomendable tomar la muestra antes de ingerir alimento 2. El paciente debe permanecer sentado en la posición más cómoda y con la mejor iluminación ( se puede usar una linterna) 3. Indicar al paciente que habrá la boca sin sacar la lengua y que diga ‘’ Ahhh… 4. Mientras el paciente dice ``Ahhhh…``bajar las 2/3 partes anteriores de la lengua con el baja lengua, empleando la mano izquierda. 5. Se deberá observar las amígdalas, el fondo de la faringe limitada por los pilares y úvula. 6. Introducir el hisopo con la mano derecha .Evitar tocar la lengua, que se encuentra cubierta de microorganismo 7. Ubicar el lugar inflamado de la garganta (amígdalas o papilares. estará enrojecida o blanca según sea el caso. 8. Frotar el hisopo con firmeza en la parte inflamadas, haciéndolo girar y si existen membranas, recógelas con el hisopo. 9. Si no se encuentra inflamación pasar el hisopo por las amígdalas, los pilares, Evitar tocar la úvula 10. Introducir el hisopo con la muestra al medio de transporte. 11. Remitir al laboratorio antes de las 24 horas de la recolección. 12. La muestra en el medio de transporte adecuado debe ser mantenida a temperatura ambiente hasta su procesamiento.

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CRITERIOS DE RECHAZO a) Envase no estéril o inadecuado b) Medio de transporte inadecuado c) Envase sin rotular d) Solicitud de examen microbiológico incompleto o ilegible y discrepancia con la identificación del paciente o la muestra e) Demora prolongada de enviar la muestra al laboratorio.

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I) OBTENCIÓN DE MUESTRAS DE SECRECIÓN VAGINAL Esta muestra se utiliza para conocer la etiología en casos de vaginitis y vaginosis. Los patógenos mas comunes son: T. Vaginalis, Cándida, Complejo Vaginosis Bacteriana (Gardnerella, Mobiluncus, etc.) Los exudados vaginales se obtienen en el Laboratorio de Microbiología. En el único caso que se aceptarán muestras realizadas fuera del Laboratorio es si la paciente se encuentra internada e imposibilitada de movilizarse. Materiales a) Camilla ginecológica b) Espéculo estéril c) Hisopos de alginato cálcico o Dracon, con medio de transporte. d) Tubo con 1 ml de suero fisiológico y pipeta descartable. Condiciones previas: La paciente debe concurrir al laboratorio habiéndose higienizado los genitales externos sólo superficialmente, no debe tomar antibióticos, óvulos ni pomadas en los días previos a la recolección de la muestra. No debe mantener relaciones sexuales 48 hs antes de la toma de muestra. En mujeres que no han tenido relaciones sexuales se puede tomar la muestra a través del orificio vaginal con un hisopo estéril. Procedimiento 1. Con la paciente en posición ginecológica se introducirá un espéculo “sin lubricante” (si fuera necesario lubricar, utilizar solo agua tibia) 2. Recoger la muestra, bajo visión directa, con un hisopo del fondo del saco vaginal posterior. 3. Repetir la operación con un segundo hisopo. 4. Recoger con la pipeta una muestra de fondo de saco y descargar en el tubo con suero fisiológico. 5. Se obtendrán dos hisopos, uno destinado al estudio microscópico y otro al cultivo. 6. La muestra en suero fisiológico se destinará al examen en fresco para investigación de Trichomonas vaginalis (test de amina).

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Transporte y conservación El envío de la muestra debe ser inmediato siempre que sea posible. Cuando la muestra no pueda procesarse antes de 15 minutos deberán emplearse hisopos con medio de transporte tipo Stuart- Amies,Cary-blair que se mantendrán a temperatura ambiente, que deberá ser antes de 3-6 horas. El examen en fresco deberá observarse inmediatamente o de lo contrario mantener en estufa a 37ºC por no más de 1 hora. OBSERVACIONES Cuando se sospeche la infección por Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis o Ureaplasma urealtycum, deberá enviarse muestra endocervical. CRITERIOS DE RECHAZO  Envase sin rotular  Solicitud de examen microbiológico incompleto o ilegible y discrepancia con la identificación del paciente o la muestra  Hisopos secos  Muestras con más de 15 min. De colección para la investigación de Trichomonas vaginalis en fresco.  Muestra sin frotis para Gram.

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J) OBTENCIÓN DE MUESTRAS DE SECRECIÓN URETRAL Esta muestra se utiliza para conocer la etiología en casos de uretritis Los patógenos más comunes son: La Chlamydia Trachomatix, el Micoplasma geniatum, el Ureaplasma, la Trichomona Vaginalis, Neisseria Gonorrhoeae. Los exudados uretrales se realizan en el Laboratorio de Microbiología. En el único caso que se aceptarán muestras realizadas fuera del Laboratorio es si la paciente se encuentra internada e imposibilitada de movilizarse. Materiales       

Hisopo estéril Guantes quirúrgicos estériles Tubos esteriles Laminas portaobjeto Agar Thayer Martin Medio de transporte de Amies( hasta 6 horas para gonococo) Stuart,Cary-blair Medios de transporte para Clamydia

Condiciones previas: La paciente debe concurrir al laboratorio habiéndose higienizado los genitales externos sólo superficialmente, no debe tomar antibióticos, ni pomadas en los días previos a la recolección de la muestra. No debe mantener relaciones sexuales 48 horas antes de la toma de muestra. Procedimiento 1. El paciente debe concurrir al laboratorio con higiene previa de los genitales (agua y jabón únicamente) y con una retención de orina de por lo menos 3 horas. 2. Es conveniente no mantener relaciones sexuales durante las 24-48 horas previas al estudio. 3. Limpiar el meato con algodón tomar la secreción que exuda de la uretra con un hisopo estéril humedecido en solución fisiológica y preparar un extendido. 4. Aplicar una ligera presión (desde atrás), de manera que salga una gota de secreción (pus) por el meato. 5. Repetir la operación con otro hisopo y colocarlo dentro de un medio de transporte adecuado (Ej. Stuart).

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6. Si no hubiera secreción, insertar un hisopo (de pequeño diámetro) 2-3 cm dentro del canal uretral y rotarlo ligeramente para obtener material. 7. Remitir la muestra DE INMEDIATO al laboratorio. Cuidado: procesar rápidamente, posibilidad de perder organismos muy lábiles. 8. Mantener a temperatura ambiente. NUNCA refrigerar. Transporte y conservación El envío de la muestra debe ser inmediato siempre que sea posible. Cuando la muestra no pueda procesarse antes de 15 minutos deberán emplearse hisopos con medio de transporte tipo Stuart- Amies,Cary-blair que se mantendrán a temperatura ambiente, que deberá ser antes de 3-6 horas. El examen en fresco deberá observarse inmediatamente o de lo contrario mantener en estufa a 37ºC por no más de 1 hora. OBSERVACIONES Para el estudio de Chlamydia trachomatis, Micoplasma hominis y Ureaplasma urealyticum, utilizar medios de transporte especiales que posibiliten la conservación de estos microorganismos CRITERIOS DE RECHAZO  Envase no estéril  Envase sin rotular  Solicitud de examen microbiológico incompleto o ilegible  Hisopo seco  Muestra con más de 15 minutos de colección para investigación de Trichomonas vaginalis en fresco.  Muestra sin frotis para Gram.  Muestra para clamydia, que no contiene células el epitelio uretral.

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K) OBTENCION DE MUESTRA PARA ESPERMOCULTIVO Tipo de muestra: semen  El paciente NO DEBE mantener relaciones sexuales 24-48 horas antes de muestra.  Higienizar cuidadosamente los genitales con agua y jabón  Realizar masturbación y recolección del semen en un frasco estéril. Transporte y conservación Remitir las muestras dentro de la primera hora de haber sido emitidas. CRITERIOS DE RECHAZO  Envase no estéril  Envase sin rotular  Solicitud de examen microbiológico incompleto o ilegible

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L) OBTENCION DE MUESTRA PARA COPROCULTIVOS Consiste en el cultivo de materia fecal. Es un método de diagnóstico microbiológico que permite identificar diferentes organismos causantes de enfermedades gastrointestinales. Los patógenos más comunes son: Salmonella y Shigella, Campylobacter, Escherichia coli Enteropatógena, enteroinvasiva, enterohemorrágica, Vibrio, Yersinia, Clostridium, etc.

Materiales:  En caso de lactantes se obtendrá la muestra en el pañal invertido para la recuperación de la muestra  Frasco boca ancha con tapa rosca estéril.  Hisopos  Medio de transporte de Cary Blair  Guantes de látex.

Procedimiento 1. El paciente debe evacuar en un recipiente de boca ancha y estéril, teniendo precaución de no orinar simultáneamente. 2. Recoger la materia fecal con hisopo estéril de la zona que observe más purulenta, sanguinolenta o mucosa (cantidad adecuada: 1 cucharadita 4 ml.) e introducirlo en un tubo estéril con medio de transporte adecuado (Cary-Blair). 3. La muestra debe remitirse al laboratorio lo antes posible. 4. Mantenerla a temperatura ambiente. 5. Es sumamente importante contar con la edad del paciente. 6. Especificar claramente en la orden si se requiere hacer la búsqueda de Campylobacter spp. (pacientes pediátricos e inmunosuprimidos) 7. La deposición debe hacerla en un recipiente limpio y seco, sin mezclar con la orina.

Transporte y conservación  La muestra se debe enviar al laboratorio antes de las dos horas, cuando se sospecha de Shigelosis antes de los 30 minutos. En caso de que el tiempo de transporte, sea mayor se debe tomar dos hisopos fecales e introducirlos en el medio de transporte de Cary Blair y mantenerlos a temperatura ambiente. 34

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 Para la reacción inflamatoria debe además enviarse la muestra emitida.  Para Vibrio spp., el medio recomendable es el agua peptonada alcalina.

OBSERVACIONES La solicitud del coprocultivo debe informar el uso y tipo de antibióticos.

CRITERIOS DE RECHAZOS Envase sin rotular Solicitud de examen microbiológico incompleto o ilegible. Muestra absorbida en pañal Muestra con más de 30 minutos de recolectada sin medio de transporte, si se sospecha de Shigellosis.  Heces formadas, en las cuales es innecesario realizar cultivo, estas solo se deben realizar en caso de investigaciones epidemiológicas y previa indicación médica.    

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VIII. PROCEDIMIENTOS MEDICOS, ASISTENCIALES. DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA CLINICA Y ANATOMIA PATOLOGICA SERVICIO DE PATOLOGIA CLINICA HOSPITAL SANTA ROSA

Titulo Objetivos

Cultivo de Orina (UROCULTIVO)

MICROBIOLOGIA Código: M4

Alcance

1. Describir el procedimiento para el cultivo de la muestra de orina. Es el conjunto de acciones que se realizan para identificar en orina la presencia de microrganismos patógenos causantes de infección y determinar su suceptibilidad antimicrobiana. Laboratorio de Microbiología.

Muestra

Muestra de orina (criterios explicados en pagina 16-18 )

Fundamento

Materiales

Equipos

Procedimiento

a) Asa Calibrada de 0.001ml (1ul), factor de dilución 1/1000. b) Guantes de látex. c) Pinza d) Medios de cultivo: placas con agar sangre de carnero (AS), placas con agar McConkey (Mck), placas con agar Mueller Hinton (MH) e) Medios y pruebas de identificación para gérmenes Gram positivos y Gram negativos. f) Discos para la prueba de susceptibilidad antimicrobiana g) Cepa de Bacillus subtilis a) Estufa a 35°C-37°C b) Microscopio Óptico. c) Mechero de Busen 1. Realizar todo el procedimiento dentro de una cabina de bioseguridad frente a un mechero de Bunsen. 2. Mezclar bien la muestra, introducir de manera vertical el asa de siembra dentro del frasco para obtener una muestra para la siembra. 3. Se inocula en el centro de una placa de Agar Sangre se extiende la muestra hacia arriba y hacia abajo, luego se

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estría mediante una serie de pases perpendiculares a la siembra original. 4. Mediante la técnica de estría por agotamiento sembrar una placa de agar Mc Conkey para conseguir colonias aisladas. Se puede usar placas descartables divididas en 2, usando una mitad con Agar Sangre y otra mitad con Agar Mc Conkey. 5. Para la determinación de agentes bacteriostático, se hará uso de una placa de Agar Mueller - Hinton la cual se inoculará con una cepa de Bacillus subtilis ATCC 6633 en una dilución de 0.5 en la escala de Mc Farland, tratando de ocupar toda la superficie de la placa. 6. Sobre la superficie de la placa de Muller - Hinton colocar discos de papel filtro de 6 mm de diámetro, sobre estos discos se debe colocar una gota de la muestra de orina. La presencia o ausencia de algún agente bacteriostático se representara con la presencia o ausencia, respectivamente de un halo de inhibición. 7. Incubar las placas inoculadas a 35-37 °C en condiciones aeróbicas por 24 horas. En caso de presencia de antibiótico se observará un halo de inhibición. 8. Centrifugar 10 ml de orina a 2500 rpm por 5 minutos, decantar el sobrenadante y realizar el estudio del sedimento urinario y anotar resultado. 9. Colocar 1µl de orina y extenderla sobre una lámina portaobjeto, dejar secar, fijar y realizar coloración Gram. 10. A las 24 horas observar el crecimiento de microorganismos, si no hay colonias incubar hasta las 48 horas. 11. Si existe crecimiento, se realiza el recuento de colonias y se multiplica por el factor de dilución para obtener el total de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) por ml. 12. Si se usa un asa de 1 µl, el número de colonias contadas se multiplica por 1000. 13. Si se usa un asa de 10 µl. el número de colonias contadas se multiplica por 100. 14. Identificación del microrganismo en medios diferenciales: sembrar por estrías empezando por el agar Citrato, urea, (en la superficie), TSI, LIA, (introduciendo el asa por el centro hasta tocar el fondo del tubo, retirar por el mismo trazo y sembrar por estría la parte inclinada). 15. Sembrar por puntura en el centro del agar SIM hasta una profundidad aproximada de 1.5 cm. 16. incubar de 35 ºC – 37 ºC de 18 -24 horas.

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17. Dar lectura ver anexo 92-112 18. Suceptibilidad Antimicrobiana del microorganismo (Antibiograma) 19. Transcribir el resultado del examen microbiológico. 20. Validación y firma de resultados. Interpretación : a) En pacientes sin sonda vesical, la cuenta significativa de bacterias en orina es la presencia de mas de 10 5 UFC/ml. De un solo germen. b) Los recuentos intermedios (103 – 104 UFC/ml. ) indica infección si el procedimiento de recolección de orina fue realizado correctamente. c) Generalmente, el aislamiento de tres o mas especies bacteriana indica que la muestra se han contaminado por recolección o demora en la siembra(dependiendo de la edad del paciente) d) En pacientes con sonda vesical, cuentas bacterianas menores de 100,000 UFC/ml. Puede tener significado, así también se puede encontrar bacteriurias polimicrobianas hasta en casi 15 % de enfermos. e) En pacientes sin catéter se puede comprobar si el procedimiento de obtención de muestra fue correctamente observado la frecuencia con la cual se informan recuentos de colonias intermedias entre 1000 y 10,000UFC/ml. En pacientes sin infecciones del tracto urinario, el recuento es nulo o se reduce a pocas colonias. f) En muestras obtenidas por punción suprapúbica, el desarrollo de una sola colonia en el medio de cultivo indica infección del tracto urinario.

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Titulo Objetivos

MICROBIOLOGIA

Cultivo de Herida

Fundamento

Código: M7 Describir los procedimientos de muestra de herida abierta y abscesos. Es el conjunto de acciones que se realizan para identificar en heridas y abscesos la presencia de microorganismos patógenos causantes de infección y determinar el diagnostico bacteriológico y suceptibilidad antimicrobiana

Alcance

Laboratorio de Microbiología

Muestra

Muestra de herida (criterios explicados en página 19-20)

Materiales a) b) c) d) e)

f)

Equipos

g) h) a) b) c)

Asa de siembra calibrada. Guantes descartables. Pinza Mascarilla Medios de cultivo: placas con agar sangre de carnero (AS), agar chocolate (ACH), agar Mc Conkey (Mck), agar Manitol Salado (MS), placas con agar Muller Hinton(MH), tubos con agar Saboraud (SAB) Medios y pruebas de identificación para gérmenes Gram positivos y Gram negativos. Discos de sensibilidad antimicrobiana Jarra de anaerobiosis Estufa a 35°C-37°C Microscopio Óptico. Mechero de Busen

Procedimiento 1. La muestra debe llegar al laboratorio en una jeringa estéril o en un medio de transporte. 2. Realizar todo el procedimiento dentro de una cabina de bioseguridad frente a un mechero de Bunsen. 3. Con asa de siembra inocular en un extremo de la placa de

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agar Sangre, agar Chocolate, agar Mac Conkey, agar Manitol y en el tubo de agar Saboraud. 4. Luego con el asa de siembra estéril realizar estriación por agotamiento en cuatro cuadrantes de la placa, con el propósito de obtener colonias aisladas. Concluida la siembra, cerrar la placa y colocarla con la parte que tiene el medio de cultivo hacia arriba. 5. Las placas de agar Sangre y Chocolate se deben incubar en una jarra de anaerobiosis CO2. La incubación para todos los medios de cultivo será de 24 horas. 6. Con el resto de la muestra realizar un frotis sobre 2 láminas portaobjetos, el cual se coloreara mediante Tinción Gram. 7. Posterior a la incubación observar el crecimiento de las colonias y realizar la identificación del patógeno. 8. Sensibilidad Antimicrobiana del microorganismo 9. Transcribir el resultado del examen microbiológico 10. Validación y firma de resultados.

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HOSPITAL SANTA ROSA Titulo Objetivos

Fundamento

Alcance Muestra Materiales

Equipos

MICROBIOLOGIA Cultivo de Secreción Vaginal Código: M5 1.-Determinar la existencia de infección vaginal. 2.-Identificar microorganismos patógenos. 3.-Determinar la sensibilidad antimicrobiana del patógeno encontrado Es el conjunto de acciones que se realizan para identificar en secreciones vaginales la presencia de microorganismos patógenos causantes de infección e inflamación y determinar su sensibilidad antimicrobiana. Laboratorio de microbiología Muestra de secreción vaginal (criterios explicados en página 2930) a) b) c) d)

Mechero de Bunsen Asa Calibrada. Hisopos (algodón o Dracon) Tubo con 1 ml. de suero fisiológico y pipeta descartable. (20ul.) e) Guantes descartables. f) Pinza g) Medio de transporte Stuart o Cary Blair h) Medios de cultivo: placas con agar sangre de carnero (AS) agar McConkey (Mck), agar Manitol Salado (MS) y tubos con agar Saboraud(SAB) y placas con agar Muller Hinton (MH) i) Medios y pruebas de identificación para gérmenes Gram positivos y Gram negativos. j) Discos de sensibilidad antimicrobiana k) Solución salina fisiológica estéril l) Tubos de tapa rosca de vidrio estéril m) Laminas para Gram. a) Estufa a 35°C-37°C b) Microscopio Óptico.

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1. Se toman 02 muestras de hisopado (una en medio de transporte y otro en un tubo estéril con tapa rosca) y frotis en 2 láminas porta objetos. 2. En el tubo estéril que no posee ningún medio, agregar solución salina fisiológica estéril. 3. Del tubo con medio de transporte, retirar el hisopo y colocar la muestra en un extremo de la placa de agar sangre de carnero. 4. Realizar el proceso de estriación por agotamiento de la muestra en los 4 cuadrantes de la placa. 5. En forma semejante sembrar en placa de agar Mc Conkey, agar Manitol Salado y tubos con agar Saboraoud. 6. Incubar las placas inoculadas a 35-37 °C en condiciones aeróbicas por 24 horas. 7. Identificación del microorganismo. 8. Sensibilidad antimicrobiana del microorganismo 9. Transcribir el resultado del examen microbiológico 10. Validación y firma de resultados.

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HOSPITAL SANTA ROSA Titulo Objetivos Fundamento

Cultivo De Secreción Faríngea

MICROBIOLOGIA

Código: M11

1.-Determinar la existencia de faringitis bacteriana. 3.-Determinar la sensibilidad antimicrobiana del patógeno encontrado En el cultivo de secreción faríngea el objetivo primordial es la determinación del agente causante de la faringitis bacteriana.

Alcance

Laboratorio de microbiología

Muestra

Muestra de secreción faríngea (criterios explicados en página 27-28 ) a) Mechero de Bunsen y cabina de Bioseguridad. b) Estufa c) Asa calibrada. d) Hisopos de algodón o Dracon e) Guantes de látex. f) Mascarilla g) Pinza h) Medios de cultivo: placas con agar sangre de carnero (AS), agar Chocolate, agar Mc Conkey (Mck), agar Manitol Salado (AM) y placas con agar Muller Hinton (MH) i) Discos de Sulfametoxazol y Trimetropim (STX) j) Discos de sensibilidad antimicrobiana a) Estufa a 35°C-37°C b) Microscopio Óptico.

Materiales

Equipos Procedimiento

1. Se toman 01 muestra de hisopado faríngeo y realizar dos frotis en las láminas porta objeto. 2. Poner una porción de la muestra, proveniente del hisopado, en un extremo de la placa de agar Sangre de

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Carnero. 3. Realizar el proceso de estriación por agotamiento de la muestra en los 4 cuadrantes de la placa. 4. Practicar cortes en el agar para ver hemolisis. 5. Repetir estos pasos en las placas o tubos de agar Chocolate, agar Mc Conkey (McC) y agar Manitol Salado (MS), agar Saboraud. 6. Colocar un disco de Sulfametoxazol y Trimetropim (STX) en la placa de Agar Sangre en la zona de mayor concentración de muestra. 7. Incubar las placas inoculadas a 35-37 °C en condiciones aeróbicas por 24 horas. 8. Colorear la lámina de frotis mediante coloración Gram. 9. Observar el crecimiento de microorganismos, si no hay colonias incubar hasta las 48 horas. 10. Identificación del microorganismo. 11. Sensibilidad antimicrobiana del microorganismo 12. Transcribir el resultado del examen microbiológico 13. Validación y firma de resultados.

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Cultivo De Dispositivo Intravascular

MICROBIOLOGIA Código: M7

Alcance

1.-Diagnosticar infecciones locales o sistémicas 2.-Identificación de microorganismos en catéteres intravasculares. 3.-Determinar su sensibilidad antimicrobiana. Es el conjunto de acciones que se realizan para identificar en dispositivos intravasculares la presencia de microorganismos patógenos causantes de infección local o del torrente sanguíneo y determinar su sensibilidad antimicrobiana. Laboratorio de microbiología

Muestra

Muestras de dispositivos intravasculares (criterios explicados en página 15)

Objetivos

Fundamento

Materiales

Equipos

Procedimiento

a) b) c) d) e) f) a) b)

Pinza estéril Mechero Bunsen o Cabina de Flujo laminar Guantes descartables Mascarila Contenedor de material contaminado Discos de sensibilidad Antimicrobiana Estufa a 35°C-37°C Microscopio Óptico.

1. La técnica que se describirá es la de Maki y colaboradores (método semicuantitativo). 2. La placa de agar sangre de carnero debe encontrarse a temperatura ambiente. 3. Flamear la pinza y dejar enfriar. 4. Colocar el segmento del catéter sobre la superficie del agar sangre de carnero, el mismo sobre agar Mac Conkey, agar Manitol Salado y agar Saboraoud dextrosa.

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5. Rodar la porción del catéter a través de la placa, cuatro veces mientras se ejerce presión hacia abajo con la pinza. 6. Con la misma pinza hacer un frotis del catéter sobre una lámina portaobjetos para su coloración GRAM. 7. Incubar la placa a 35 - 37° C por 24 horas. 8. Identificación del microorganismo. 9. Sensibilidad antimicrobiana del microorganismo 10. Transcribir el resultado del examen microbiológico 11. Validación y firma de resultados.

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Fundamento Alcance Muestra Materiales

Equipos Procedimiento

MICROBIOLOGIA Código: M7 Cultivo De Esputo 1.-Diagnóstico de infecciones del tracto respiratorio bajo. 2.-Identificación del germen causal. 3.-Determinación de sensibilidad antimicrobiana. El cultivo de las muestras de Esputo es utilizado para el diagnóstico de infecciones del tracto respiratorio inferior. Laboratorio de Microbiología Muestras de dispositivos intravasculares (criterios explicados en página 25-26) a) Estufa de 35 – 37° C b) Mechero Bunsen o Cabina de Flujo laminar c) Guantes de látex d) Mascarilla e) Agar sangre de carnero (AS) , agar Chocolate, Agar Mc Conkey (Mck). Agar Manitol salado (MS) y Agar Saboraoud dextrosa (SAB) f) Discos de sensibilidad Antimicrobiana a) Estufa a 35°C-37°C b) Microscopio Óptico. 1. Seleccionar la muestra más purulenta o que contenga sangre. 2. Utilizando el asa de siembra colocar la muestra en un extremo de la superficie de las placas con los medios de cultivo. 3. Realizar la siembra por dispersión agotamiento en cuatro cuadrantes de la placa, con el propósito de obtener colonias aisladas. 4. Incubar las placas con los medios de cultivo a 35 – 37° C por 24 a 48 horas. 5. Si no hay crecimiento a las 24 horas seguir incubando hasta por 48 horas. 6. Seleccionar una parte de la muestra más purulenta suavemente extenderla en tres láminas portaobjetos. 7. Dejar secar el frotis al aire, de preferencia dentro de una cabina de flujo laminar.

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8. Fijar con metanol y colorearlo por Gram. 9. Usar bajo aumento (10x) para examinar el frotis y la determinación de polimorfo nucleares y células escamosas. 10. En una lamina extendida colocar una gota de KOH y cubrirla con una laminilla para observar la presencia de Hongos. 11. Identificación del patógeno. 12. Sensibilidad Antimicrobiana del microorganismo 13. Transcribir el resultado del examen microbiológico 14. 13. Validación y firma de resultados.

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MICROBIOLOGIA HOSPITAL SANTA ROSA Titulo Cultivo De Secreción de Vías Código: M7 Respiratorias Bajas 1.-Diagnóstico de infecciones del tracto respiratorio bajo. Objetivos

Fundamento Alcance Muestra Materiales

Equipos Procedimiento

2.-Identificación del germen causal. 3.-Determinación de sensibilidad antimicrobiana. El cultivo de las muestras del tracto respiratorio bajo es utilizado para el diagnóstico de infecciones del tracto respiratorio. Laboratorio de Microbiología

Muestras de dispositivos intravasculares (criterios explicados en página 25-26) a) Mechero Bunsen en la Cabina de Flujo laminar b) Guantes de látex c) Mascarilla d) Contenedor de material contaminado e) Agar sangre de carnero (AS), agar Chocolate, agar Mc Conkey (Mck). Manitol salado (MS) y Saboraud (SAB) f) Discos de sensibilidad Antimicrobiana a) Estufa a 35°C-37°C b) Microscopio Óptico. 1. Seleccionar la muestra más purulenta o que contenga sangre. 2. Utilizando el asa de siembra y tomando como referencia central el inóculo de la muestra, realizar la siembra por dispersión agotamiento en cuatro cuadrantes de la placa, con el propósito de obtener colonias aisladas. 3. Incubar las placas con los medios de cultivo a 35 – 37° C por 24 a 48 horas. 4. Si no hay crecimiento a las 24 horas seguir incubando hasta por 48 horas. 5. Para realizar el frotís seleccionar la porción más purulenta de la muestra que contenga sangre.

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6. Suavemente extenderla en la lámina portaobjetos y colorearlo por Gram. 7. Identificación del patógeno 8. Sensibilidad antimicrobiana del microorganismo. 9. Transcribir el resultado del examen microbiológico 10. Validación y firma de resultados.

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MICROBIOLOGIA

Titulo

Cultivo De Muestras de Código: M7 Secreción Biliar

Objetivos

Alcance

1.-Diagnóstico de infecciones de la Vesícula Biliar. 2.-Identificación del germen causal. 3.-Determinación de sensibilidad antimicrobiana. El cultivo de las muestras de secreción biliar es utilizado para el diagnóstico de infecciones en la Vesícula Biliar. Laboratorio de Microbiología

Muestra

Muestra de secreción (Ver especificaciones página 23-24 )

Fundamento

a) b) c) d) e)

Materiales

Equipos Procedimiento

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Mechero Bunsen Guantes de látex Mascarilla Contenedor de material contaminado Agar Sangre (AS), agar Chocolate, agar Mc Conkey (Mck), caldo selenito (Sel) y Agar Salmonella – Shigella (SS), placa de Agar Muller-Hinton (MH) f) Hisopos estériles g) Discos de sensibilidad antimicrobiana a) Estufa a 35°C-37°C b) Microscopio Óptico. Tomar la muestra de la bilis con el asa de siembra estéril introduciéndola y sacándola del frasco en forma vertical Sembrar la muestra sobre las placas de agar Sangre, agar Mac Conkey, por agotamiento. Con ayuda de un hisopo estéril tomar una muestra de la bilis e inocular el caldo Selenito. Incubar ambos medios de cultivo a 35º C por 24 horas. Realizar un frotis sobre una lámina portaobjetos, para coloración Gram. Observar si hay crecimiento en el agar Mac Conkey, y tomar una muestra del caldo selenito con un asa de

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siembra y sembrarla en una placa de agar SalmonellaShigella. 7. Incubar medios de cultivo a 35º C por 24 horas. 8. Realizar la identificación bacteriana. 9. Sensibilidad Antimicrobiana del microorganismo. 10. Transcribir el resultado del examen microbiológico 11. Validación y firma de resultados.

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HOSPITAL SANTA ROSA Titulo Objetivos

Cultivo De Heces (COPROCULTIVO)

MICROBIOLOGIA

Código: M1

Alcance

1.-Diagnóstico de diarrea infecciosa. 2.-Identificar el germen causal. 3.-Determinar sensibilidad antimicrobiana. Procedimientos de cultivo para la identificación de entero patógenos en muestras de heces, pertenecientes a la Familia Enterobacteriaceae de los géneros: Salmonella, Shigella, E. Coli (entero patógena, entero invasiva, entero hemorrágica), Vibrio cholerae, Campylobacter así como determinar su sensibilidad antimicrobiana. Laboratorio de Microbiología

Muestra

Ver especificaciones página 34-35

Fundamento

Materiales

a) b) c) d) e)

Equipos

a) Cabina de flujo laminar b) Microscopio Óptico c) Estufa de 35º – 37° C

Procedimiento

Mechero Bunsen Guantes descartables. Mascarilla Contenedor de material contaminado Agar Mc Conkey (Mck), caldo selenito (Sel) y Agar Salmonella – Shigella (SS), placa de Agar Muller-Hinton (MH) f) Hisopos estériles g) Discos de sensibilidad antimicrobiana

1. Tomar la muestra de heces con el asa de siembra estéril introduciéndola y sacándola del frasco en forma vertical 2. Sembrar la muestra sobre las placas de agar Mac Conkey, por agotamiento. 3. Con ayuda de un hisopo estéril tomar una muestra de heces

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e inocular al caldo Selenito. 4. Incubar ambos medios de cultivo a 35º C por 24 horas para entero patógenos 5. Realizar un frotis sobre 2 láminas portaobjetos, para búsqueda de campylobacter y diferencial de reacción inflamatoria.(Coloraciones página….) 6. Observar si hay crecimiento en el agar Mac Conkey 7. Identificación del microrganismo ( en medios diferenciales sembrar por estrías empezando por el agar Citrato, urea, ( en la superficie ), TSI, LIA, ( introduciendo el asa por el centro hasta tocar el fondo del tubo , retirar por el mismo trazo y sembrar por estría la parte inclinada), 8. Sembrar por puntura en el centro del agar SIM hasta una profundidad aproximada de 1.5 cm. 9. incubar de 35 ºC – 37 ºC de 18 -24 horas. 10. Dar lectura ver anexo (105-112) 11. Tomar una muestra del caldo selenito con un asa de siembra y sembrarla en una placa de agar SalmonellaShigella por agotamiento 12. Incubar medios de cultivo a 35º C por 24 horas. 13. Realizar la identificación bacteriana. 14. Sensibilidad antimicrobiana del microorganismo (Antibiograma) 15. Transcribir el resultado del examen microbiológico 16. Validación y firma de resultados.

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HOSPITAL SANTA ROSA Titulo Objetivos

Fundamento

Alcance Muestra

Materiales

Equipos

Procedimiento

Cultivo de Fluidos Corporales

MICROBIOLOGIA

Código: M1

1.-Diagnóstico de infección de fluidos corporales estériles, identificar el microorganismo causal, determinar la sensibilidad antimicrobiana. Procedimientos de cultivo para la identificación de microorganismos en líquidos biológicos, así como determinación de la sensibilidad antimicrobiana. Laboratorio de Microbiología Ver especificaciones pagina 21-22 a) LCR b) Liq.Pleural c) Liq. Peritoneal d) Liq. Ascítico e) Liq. Articular (sinovial) a) Asa de siembra b) Tubos estériles c) Mechero Bunsen. d) Guantes de látex e) Mascarilla f) Medios de Cultivo: Agar sangre, agar chocolate, agar Manitol salado, agar Mac Conkey y agar Saboraud, agar Mueller-Hinton g) Tinta china h) Set de coloración Gram a) Estufa a 35°C-37°C b) Microscopio Óptico. 1. Colocar 10 ml de muestra en un tubo y centrifugar a 3500 rpm por 5 minutos. 2. Retirar el sobrenadante, dejando 0.5 ml en el tubo. Guardar sobrenadante para otros estudios.

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3. Resuspender el sedimento, agitando el tubo, y sembrar en agar Chocolate, agar Sangre, agar Manitol salado, agar Mac Conkey y agar Saboraud. 4. Colocar 1 gota (50 µl del sedimento en lámina portaobjetos y dejar secar, fijar con una gota de metanol y colorear con Gram. 5. Observar al microscopio con lente de inmersión 100x 6. Otra gota del sedimento (de LCR), se coloca en una lámina y se agrega una gota de Tinta China, cubrir con laminilla y observar al microscopio con objetivo de 40x. 7. Realizar la identificación del patógeno. 8. Sensibilidad antimicrobiana del microorganismo. 9. Transcribir el resultado del examen microbiológico Validación y firma de resultados.

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Fundamento

Examen Micológico, Directo Y Cultivo

MICROBIOLOGIA

Código: M6

1.-Determinar la etiología micótica de una infección. 2.-Orientar el tratamiento adecuado. 3.- Control evolutivo de la infección. Es el conjunto de procedimientos que se realizan para la determinación de estructuras micóticas causantes de infección.

Alcance

Laboratorio de Microbiología

Muestra

Obtención de diversos tipos de muestras a fin de detectar la presencia de hongos. 15 días antes no aplicarse medicamentos antimicóticos.

Materiales

a) b) c) d) e) f) g) h) i) j)

Láminas y laminillas Mechero Bunsen Asa de siembra Placas Petri Envase estéril. Pinza y Tijera Guantes de latex. Mascarilla Agar Saboraud+ Antibióticos, Medios Cromogènicos (Chromoagar Càndida), Hidroxido de Potasio (KOH) al 40%, Coloración de Gram y Giemsa, tinta China, Azul de Lactofenol , agar Sangre (Dimórficos)

Equipos

a) Estufa a 35°C-37°C b) Microscopio Óptico.

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HOSPITAL SANTA ROSA Procedimiento

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EXAMEN CON KOH: 1. Con la ayuda de un asa de siembra o con una pinza estéril tomar la muestra y colocarlo sobre una lámina porta objetos. 2. Agregar una gota de solución de Hidróxido de Potasio KOH o hidróxido de sodio – NAOH al 10%, cubrir con una laminilla y observar al microscopio con objetivo de 40X. 3. Coloración Gram, para el género Cándida. (Chromoagar Cándida) 4. Coloración Giemsa, para Histoplasma y Pneumocystis jirovecii. 5. Tinta China, para Criptococcus. CULTIVO Para realizar el cultivo de los hongos debemos tomar la muestra y colocarlo por punción o de manera de estriación sobre el medio de cultivo (Agar Saboraud con Cloranfenicol) incubar a 30°C, hasta por 15 días. 1. Dermatofitos: Cuando desarrollan las colonias realizar un directo con KOH y observar esporulación, Chromoagar si es Levaduras, pruebas complementarias se puede utilizar el Test de Ureasa. 2. Levaduras: observar la morfología, para precisar la cápsula y seudohifas. 3. Tubo Germinativo: en 0.5 ml de suero humano inocular una colonia e incubar por 2 horas a 35 °C, luego observar la presencia de prolongaciones como hifas iniciales cortas. 4. Sembrar una porción de las colonias levaduriformes en Chromoagar para la identificación. a) Hongos dimórficos: producen hifas a 25°C y se convierten en levaduras en los tejidos o medios de cultivo a 35°C. Son de crecimiento lento, incubar a 37°C por 7 días con humedad. b) Hyphomicetos oportunistas: son ambientales, debe demostrarse repetidas veces y observarse en los

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tejidos. No usar Cicloheximida, puede usarse Cloranfenicol y Gentamicina. c) Agentes de Zygomicosis: la muestra no debe refrigerarse y debe sembrarse en bloque (no picarse). No usar Cicloheximida. La mayoría desarrollan a las 2448 horas. d) Agentes de Micetomas Eumicóticos: la pus o biopsia debe ser examinada para encontrar la presencia de gránulos debiendo anotarse el tamaño color, textura y forma. Los gránulos deben lavarse con suero fisiológico para cultivarse, incubar 6 semanas. 5. Transcribir el resultado del examen microbiológico. 6. Validación y firma de resultados.

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HOSPITAL SANTA ROSA Titulo

Objetivos

Baciloscopía Para Diagnóstico de Tuberculosis

MICROBIOLOGIA

Código:

Alcance

1.-Diagnóstico de infección de microorganismos Acido Alcohol Resistentes 2.-Identificar el microorganismo causal de la Tuberculosis. Procedimientos para la determinación directa de Bacilos Alcohol Acido Resistentes. (BAAR) a través de la coloración diferencial de Ziehl-Neelsen que permite la tinción de los microrganismos que poseen elevado contenido de lípidos como es el caso del genero Mycobacterium. Laboratorio de Microbiología

Muestra

Esputo ( Ver especificaciones página 25-26 )

Fundamento

Materiales

a) b) c) d) e) f) g) h) i) j)

Aplicador de madera Tubos estériles Mechero de bunsen Guantes descartables Mascarillas N95 Laminas portaobjetos nuevas Fenol al 5% Lápiz marcador de cera o de diamante Mechero de alcohol Dos varillas de vidrio unidas por los extremos por un tubo de goma. k) Encendedor l) Cuaderno de registro Reactivos para coloración a) Fucsina básica Fenicada b) Azul de metileno c) Fenol de cristales(al 5%)

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Equipos

d) e) f) a) b) c) d)

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Ácido clorhídrico (alcohol acido) Alcohol de 95 º Agua destilada Cabina de flujo laminar ( Bioseguridad) Estufa a 35°C-37°C Microscopio Óptico. Centrifuga

Procedimiento 1. Antes de empezar a trabajar debemos verificar todos los materiales a utilizar, encender la cabina de flujo laminar 10’ antes de trabajar y 10’ después de trabajar. 2. Con ayuda del aplicador de madera tomar una muestra significativa de la región más purulenta de la muestra de esputo. Una alternativa es usar un gotero descartable, con la cual se coge la parte grumosa aproximadamente 100 µl., con lo cual se hace el frotis. 3. Aplicarla sobre la lámina portaobjetos previamente rotulada con el código del paciente. 4. Frente al mechero y dentro de una cabina de flujo laminar, realizar un frotis de manera circular, flameándolo para que se vaya secando. 5. Dejar que termine de secar la lámina dentro de la cabina de flujo laminar. 6. Cuando trabajamos con muestras de orina u otro tipo de líquido corporal, es recomendable que se centrifugue la muestra a 3500 RPM por 5 minutos. 7. Una vez centrifugada descartar el sobrenadante y colocar el sedimento sobre la lámina portaobjetos, cumpliendo todas las medidas de bioseguridad. 8. Realizar un frotis como anteriormente lo explicamos. 9. Una vez haya secado la lámina con orina o líquidos corporales, esta se debe fijar con alcohol de 96º por 5’ y luego dejar secar. 10. Cuando hemos conseguido que las láminas estén secas en su totalidad, realizaremos la Coloración de Ziehl Neelsen. 11. Colocar Fucsina básica fenicada al 5 % sobre la lámina. 12. Calentar suavemente con la llama del mechero de alcohol por debajo de cada lámina porta objeto, hasta la emisión de

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vapores, repetir el procedimiento tres veces. No debe hervir la preparación, si el volumen del colorante disminuye por evaporización agregar más colorantes hasta cubrir el extendido y dejar enfriar el tiempo mínimo es de 5 minutos. 13. Enjuagar la lámina con agua corriente, dejar caer a baja presión sobre la parte que no tiene el extendido. 14. Cubrir la totalidad de la superficie con la solución del alcohol acido durante 2 minutos hasta obtener una coloración rosa pálido, de ser necesario de colocar nuevamente y dejar reposar por 1 minuto. 15. Lavar nuevamente la lámina con agua corriente a baja presión cuidado de no desprender el extendido. 16. Cubrir la superficie del extendido con el colorante azul de metileno durante 30 segundos a 1 minuto, eliminar el azul de metileno y lavar cada lamina con agua a baja presión, por ambos caras de la lámina porta objeto. 17. Colocar en orden numérico y dejar secar al medio ambiente. 18. Realizar la lectura de las láminas (determinar la presencia o ausencia )y hacer el recuento de los Bacilos Acido Alcohol Resistentes. 19. Transcribir el resultado del examen microbiológico siguiendo los patrones del PCT. 20. Validación y firma de resultados.

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HOSPITAL SANTA ROSA Titulo

Objetivos Fundamento

Alcance Muestra Materiales

Susceptibilidad antimicrobiana por el método de Disco Difusión.

MICROBIOLOGIA

Código:

1.-Determinar in vitro la susceptibilidad de un microorganismo a diversos antimicrobianos. 2.-Orientar al médico tratante en la terapéutica Es el conjunto de acciones que se realizan para determinar in vitro la susceptibilidad de un microorganismo identificado a diversos antimicrobianos. El recomendado es el de KirbyBauer con el que se ha logrado uniformizar los conceptos de concentración mínima inhibitoria (MIC) y de la concentración en sangre de las drogas frecuentemente usadas Laboratorio de microbiología Se trabajaran con cepas que se cultivaron de las muestras de estudio. a. Discos de sensibilidad impregnados con diferentes antibióticos y quimioterápicos. b. Tubos estériles c. Mechero de bunsen d. Guantes de látex e. Pinzas estériles f. Solución Salina Fisiológica g. Escala de Mac Farland de 0.5 h. Placas con Agar Mueller -Hinton i. Para el control de calidad: E. Coli ATCC 25922, S. Aureus 25923, P. Aeruginosa ATCC 27853, E. Coli ATCC 35218, Enterococcus faecalis ATCC 29212

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j. Hisopos esteriles k. Asa de siembra

Procedimiento

1. En un tubo de vidrio estéril agregar solución salina Estéril. 2. Agregar con un asa estéril una muestra de la bacteria a probar. 3. Suspender la muestra bacteriana hasta obtener una turbidez comparada con la nivel 0.5 de la escala de Mac Farland, por comparación visual con el estándar para realizar este paso usar una luz apropiada y mirar contra un fondo blanco con líneas negras como contraste. 4. Dejar reposar la dilución por un periodo máximo de 5 minutos. 5. Embeber un hisopo estéril en la suspensión, rotar el hisopo varias veces presionando firmemente sobre la pared interior del tubo por encima del nivel del líquido para remover el exceso del inoculo 6. Inocular la superficie seca de la placa Mueller Hinton, estriando con el hisopo en tres direcciones para asegurar un distribución uniforme del inoculo. ante de colocar los discos dejar secar la placa a temperatura de ambiente entre 3 - 5 minutos para que cualquier exceso de humedad superficial sea absorbida. 7. Proceder a colocar los discos de los diferentes antibióticos de manera circular y ordenada, respetando una distancia 25mm aprox. entre disco y disco. (el diámetro de los discos según la norma del OMS debe ser de 6 mm.) no debe de colocarse no más de 12 discos en la placa de 150mm. , ni más de 6 en la placa de 100mm de diámetro interno, para evitar la superposición en la zona de agar debido a que algunos antibióticos se difunden rápidamente. 8. Incubar las placas en posición invertida a 35º - 37 º C de los 15 minutos posteriores de la aplicación de los discos por 18 a 24 horas. 9. Después del tiempo recomendado de incubación examinar la placa y medir los diámetros de los halos de inhibición alrededor de cada disco.

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10. Para determinar la susceptibilidad de la cepa bacteriana es necesario medir el tamaño del halo, de esta manera podremos determinar si la cepa es Resistente, Intermedia o Sensible frente a un determinado antibiótico. 11. Transcribir el resultado del examen microbiológico 12. Validación y firma de resultados.

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COMENTARIOS IMPORTANTES Adaptado de: NCCLS 2001 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing: Eleventh Informational Supplement. M100- S11 Vol 21 N°1 NCCLS, Wayne, Pa. La elección de que antimicrobianos deben probarse y reportarse es decisión del laboratorio de microbiología en coordinación con el comité de control de infecciones, farmacia, e infectología, considerando la prevalencia de resistencia, eficacia clínica, prevención de la resistencia, recomendaciones de consenso y el costo.

i) Grupos de Antimicrobianos Sugeridos para Microorganismos de Fácil Desarrollo (no exigentes): Grupo A: considerados para un reporte rutinario. Enterobacteriaceae P. aeruginosa y Staphylococcus spp Acinetobacter spp. Ampicilina Ceftazidime Oxacilina

Enterococcus spp

Cefazolina o Cefalotina Gentamicina

Penicilina o Ampicilina

Gentamicina Mezlocilina

Grupo B: incluye agentes infecciones nosocomiales. Enterobacteriaceae Amikacina Amoxicilina/ Ac. Clavulánico Cefuroxime Cefepime Cefoxitina Cefotaxime o ceftriaxona

Penicilina

importantes

principalmente

P. aeruginosa y Staphylococcus spp Acinetobacter spp. Amikacina Eritromicina o azitromicina Aztreonam Clindamicina

Cefepime Ciprofloxacina Imipenem o meropenem

Sulfametoxazol trimetoprim Vancomicina

para

Enterococcus spp Quinupristin/ Dalfopristin Vancomicina

/

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Tobramicina

Grupo C: comprende agentes alternativos que pueden ser necesarios probar cuando existan cepas resistentes Enterobacteriaceae P. aeruginosa y Staphylococcus Acinetobacter spp. spp. Aztreonam Cefotaxime o Cloranfenicol Ceftazidime Ceftriaxona Cloranfenicol

Cloranfenicol

Ciprofloxacina o levofloxacina

Tetraciclina

Sulfametoxazol /trimetoprim

Quinupristin/ Dalfopristin

Tobramicina

Enterococcus spp. Gentamicina (despistaje para resistencia de alto nivel) Estreptomicina (despistaje para resistencia de alto nivel) Cloranfenicol Eritromicina Tetraciclina Rifampicina (Estos agentes pueden ser probados para Enterococo resistente a la vancomicina. VRE)

Gentamicina Rifampicina Tetraciclina

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Grupo D: comprende los agentes antimicrobianos que se usan únicamente o primariamente para el tratamiento de infecciones urinarias. Enterobacteriaceae P. aeruginosa y Staphylococcus Acinetobacter spp. spp. Carbenicilina Carbenicilina Lomefloxacina norfloxacina Lomefloxacina o norfloxacina Loracarbef Nitrofurantoina Sulfisoxazol Trimetoprim

Levofloxacina o lomefloxacina o norfloxacina Sulfisoxazol Tetraciclina

Nitrofurantoina Sulfisoxazol Trimetoprim

Enterococcus spp. o Ciprofloxacina Levofloxacina Norfloxacina Nitrofurantoina Tetraciclina

1.- Para aislamientos de Salmonella y Shigella spp. : Ampicilina, una Quinolona y Sulfametoxazol/ Trimetoprim, deben ser probados rutinariamente. Adicionalmente, Cloranfenicol y una Cefalosporina de 3era. Generación deberían ser probados en los casos de aislamiento extraintestinal de Salmonella spp. Cefalotina puede ser usada para representar a Cefalotina, Cefradina, Cefalexina, Cefaclor y Cefradoxil. Cefazolina, cefuroxime, Cefpodoxime, Cefprozil y Loracarbef (aislamientos urinarios) pueden ser probados individualmente, porque algunos aislamientos pueden ser susceptibles a estos agentes cuando es resistente a Cefalotina.

3.-Staphylococcus.- Los estafilococos Penicilino sensibles son también sensibles a otras penicilinas, Cefepems y Carbapenems. Las cepas Penicilino resistentes pero Oxacilino sensibles, son resistentes a las penicilinas lábiles a beta Lactamasa pero sensibles a otras penicilinas estables a la beta Lactamasa, combinaciones de inhibidor de Betalactamasa, Cefepems relevantes y Carbapenems. Los estafilococos Oxacilino resistentes son resistentes a todos los antibióticos Betalactámicos disponibles. De esta manera la sensibilidad o resistencia de un amplio grupo de antibióticos beta lactámiCos puede ser deducida al probar únicamente penicilina y Oxacilina. El ensayo rutinario de otras penicilinas, combinaciones de inhibidores de beta Lactamasa, Cefepems y Carbepenems no es recomendado.

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Históricamente, la resistencia de las penicilinas Antiestafilococicas estables a la Betalactamasa han sido referidas como “resistencia a la Meticilina”, por eso las siglas MRSA (S. Aureus Meticilino resistente) también se usan al referirse a la resistencia a la Oxacilina.

4.- Enterococcus: Para Enterococcus spp. Ceflosporinas, Aminoglicosidos (excepto para despistaje de resistencia de alto nivel), Clindamicina, y Sulfametoxazol / Trimetoprim pueden aparecer activos in vitro pero no son efectivos clínicamente y los aislamientos no deberían ser reportados como susceptibles. a) Susceptibilidad a la penicilina puede ser usada para predecir la susceptibilidad a Ampicilina, Amoxicilina, Ampicilina / Sulbactam, amoxicilina / ac. CLAVULÁNICO, Piperacilina y Piperacilina/ Tazobactam para Enterococos no productores de Betalactamasa. Sinergia entre Ampicilina, Penicilina, o Vancomicina y un Aminoglicosido puede predecirse utilizando una prueba de despistaje de alto nivel de Aminoglicósido (Gentamicina y estreptomicina). Una terapia combinada de Penicilina o Ampicilina más un Aminoglicósido es usualmente indicada para infecciones serias por enterococos como la endocarditis bacteriana. b) Debe reportarse en los casos de Enterococcus faecium resistente a vancomicina c) Tetraciclina es la representativa para todas las tetraciclinas, y los resultados pueden aplicarse para doxiciclina y - minociclina. Doxiciclina y minociclina pueden ser probadas en lugar de, o además de, tetraciclina. Sin embargo ciertos microorganismos pueden ser más susceptibles a minociclina y doxiciclina que a tetraciclina. 5.- En otras No Enterobacteriaceae que no sean P. aeruginosa y Acinetobacter spp. Debería ser utilizando el método de dilución.

P. aruginosa puede desarrollar resistencia durante terapia prolongada con todos los antibióticos. Por lo tanto aislamientos que son inicialmente susceptibles pueden llegar a ser resistentes después de tres a cuatro dias de iniciada la terapia. Se justifica realizar pruebas de susceptibilidad en los aislamientos sucesivos. 6.- Enterobacter, Citrobacter y Serratia pueden desarrollar resistencia durante terapia prolongada con cefalosporinas de tercera generación. Por lo tanto aislamientos que son inicialmente susceptibles pueden tornarse resistentes después de tres a cuatro días de iniciada la terapia. Pruebas de susceptibilidad de los aislamientos sucesivos pueden ser justificadas.

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ii.- Grupos de Antimicrobianos Sugeridos para Microorganismos de Difícil Desarrollo: Grupo A: considerados para un reporte rutinario. Haemophilus spp.

Neisseria gonorrhoeae

Ampiclina Sulfametoxazol/ trimetoprim

Eritromicina Penicilina (disco de oxacilina) Sulfametoxazol / trimetoprim

Grupo B: incluye agentes infecciones nosocomiales Haemophilus spp.

Streptococcus pneumoniae

Neisseria gonorrhoeae

Cefotaxime o ceftazidime o ceftriaxona Cefuroxime sódico (parenteral) Cloranfenicol Meropenem

importantes

Streptococcus spp.otros diferentes a Pneumoniae Eritromicina Penicilina ampicilina

principalmente

Streptococcus pneumoniae Clindamicina Gatifloxacina levofloxacina Tetraciclina Vancomicina

S.

o

para

Streptococcus spp.otros diferentes a Pneumoniae Cloranfenicol

S.

o Clindamicina Vancomicina

Grupo C: comprende agentes alternativos que pueden ser necesarios probar cuando existan cepas resistentes. Haemophilus spp.

Azitromicina

Neisseria gonorrhoeae

Streptococcus pneumoniae

Cefotaxime o ceftriaxona

Cloranfenicol

Streptococcus spp.otros diferentes a Pneumoniae Cefotaxime o ceftriaxona Cefepime 70

S.

HOSPITAL SANTA ROSA Aztreonam

Cefoxitina Cefuroxima Cefaclor o loracarbef Ciprofloxacina o Cefpodoxime gatifloxacina Cefuroxime axetil Penicilina (oral) Ciprofloxacina o Spectinomicina levofloxacina Imipenem Tetraciclina Rifampicina Tetraciclina

2012 Rifampicina

Levofloxacina Ofloxacina Quinupristin/ Dalfopristin

1.- Únicamente los resultados de probar con Ampicilina, una Cefalosporina de tercera generación, cloranfenicol y meropenem deberían ser reportados rutinariamente en todos los aislamientos de H. Influenzae de sangre y LCR provenientes de pacientes con infecciones graves como meningitis, bacteremia, epiglotitis y celulitis facial. 2.-Los resultados de las pruebas de susceptibilidad a la ampicilina deberían ser usados para predecir la actividad de la amoxicilina .La mayoría de los H. Influenzae que son resistentes a la ampicilina y amoxicilina producen beta lactamasa tipo TEM . En la mayoría de los casos una prueba de beta lactamasa directa puede detectar rápidamente resistencia a ampicilina y amoxicilina. 3.- Amoxicilina, ampicilina, cefepime, cefotaxime, ceftriaxona, cefuroxime, imipenem y meropenem pueden ser usados para tratar infecciones neumocòcicas; sin embargo pruebas de difusión de disco confiables aún no existen. Sus actividades in vitro son mejor determinadas usando un método de concentración inhibitoria mínima. 4.- Susceptibilidad y resistencia a azitromicina, claritromicina y diritromicina puede predecirse probando con eritromicina. 5.- Los Estreptococos viridans aislados de sangre y lugares normalmente estériles (sangre, LCR, hueso, etc.) deberán ser probados para susceptibilidad a la penicilina usando un método MIC. 6.- Pruebas de susceptibilidad para penicilinas y otros beta lactámicos, para tratamiento de Streptococcus pyogenes o S agalactie, no es necesario para propósitos clínicos y no necesita realizarse rutinariamente, así como para vancomicina, ya que no se han descrito cepas resistentes a estos antimicrobianos. 7.- Penicilina, cefotaxime o ceftriaxona y meropenem deberán ser probados por un método MIC y reportados rutinariamente en aislamientos de S. pneumoniae de sangre o LCR. Estos aislamientos deben también ser probados para vancomicina usando métodos MIC o de disco. En aislamientos de otros sitios, la prueba de despistaje con

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disco de oxacilina puede ser usado. Si el tamaño de la zona de oxacilina es igual o menor de 19 mm, debe realizarse MIC para penicilina, cefotaxime y ceftriaxona. 8.- Amoxiclina/ ac.clavulánico, azitromicina, claritromicina, cefaclor, loracarbef, cefpodoxime, y cefuroxime axetil son agentes orales que pueden ser usados como terapia empírica para infecciones respiratorias debidas a Haemophilus spp. Los resultados de pruebas de susceptibilidad con estos agentes a menudo no son útiles para el manejo de pacientes individuales, sin embargo sí pueden ser apropiadas para encuestas o estudios epidemiológicos.

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HOSPITAL SANTA ROSA Titulo Código: TINCION DE GRAM Clasificar las bacterias en dos grupos: Gram positivos y Gram Objetivos negativos.

Fundamento

Alcance Muestra Materiales

Equipos Procedimiento

La coloración Gram se basa en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas.  Bacterias Gram positivas, que se tiñen de azul violáceo oscuro.  Bacterias Gram negativas, que se tiñen de rojo, grosella o rosado Laboratorio de Microbiología. Lamina con la muestra en frotis para microscopio con el objetivo de 100X. a) b) c) d) e) a) b)

estudio en el

Solución de Cristal Violeta al 1% Solución de safranina. Solución de Lugol Alcohol acetona Agua corriente Estufa a 35°C-37°C Microscopio Óptico.

1. Fijar el frotis por calor suave y dejarlo enfriar. 2. Cubrir el frotis con cristal violeta al 1%, dejando que el colorante actué por 1 minuto. 3. Enjuagar suavemente la preparación con agua corriente y dejarla escurrir. 4. Cubrir el frotis con solución de lugol dejando actuar por 2 minutos. 5. Enjuagar suavemente la preparación con agua corriente. 6. Cubrir el frotis con alcohol acetona por 1 minuto. 7. Enjuagar suavemente con agua corriente.

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8. Cubrir el frotis con safranina, por 30 segundos. 9. Enjuagar suavemente con agua corriente y dejar secar la preparación al aire libre.

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ROTAVIRUS

Titulo Objetivos

Fundamento

Alcance Muestra

Materiales

Equipos

Procedimiento

MICROBIOLOGIA

Código:

Identificar el agente infeccioso de la diarrea por rotavirus. El diagnostico de laboratorio de las infecciones por rotavirus desempeña un importante papel en el tratamiento de los pacientes, y permite tratar y contener de manera eficaz los brotes. Los rotavirus son virus de ARN desnudos de simetría icosaédrica que consisten en un núcleo interior esférico y dos cápsides exteriores. Se han identificado 7 grupos principales de rotavirus, denominados con las letras de la “A” a la “G”, siendo los grupos A, B y C los que infectan a los seres humanos, siendo el grupo A, el más importante. Laboratorio de Microbiología  Muestra fecal adecuada (5-10mL de heces)  Las muestras se pueden almacenar a una temperatura de 2-8°C hasta por 5 días.  Durante el transporte de las muestras se debe usar bolsas de hielo para mantenerlas a temperatura de 2-8°C. a) b) c) d) e) a) b)

Recipiente para el desecho de residuos Micro pipetas y puntas desechables. Temporizador Lector de micro placas. Kit de Rotavirus Lector de micro placas Temporizador Proceder de acuerdo a las instrucciones del kit de Rotavirus vigente. Prueba ELISA Es válida para identificar antígenos del virus en muestras de materia fecal.. Se enfrenta la muestra

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diluida con los anticuerpos VP6 (Proteínas de la cápside) que se encuentran fijados en los pocillos de la micro placa. Si la muestra contiene antígenos virales de rotavirus., estas se unirán al Ac y al aplicar el conjugado se formara un complejo Ac/Ag/Ac marcado que posteriormente será revelado con una solución substrato/cromógeno desarrollando un color azul. Al agregar la solución de parada cambia a color amarillo siendo la intensidad proporcional a la cantidad de antígenos virales presentes en la muestra. La lectura se realiza en un espectrofotómetro para determinar la Densidad Óptica de la muestra.

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Fundamento Alcance Muestra

Materiales

Equipos Procedimiento

Investigación de parásitos en heces

MICROBIOLOGIA

Código: P1 - 2

1.- Determinar la existencia de enfermedad parasitaria. 2.- Identificar huevos, quistes, formas vegetativas o especímenes adultos de enteroparásitos. Realizar el diagnostico parasitológico de las infecciones y/o enfermedades producidas por los parásitos intestinales. Laboratorio de Microbiología La recolección debe hacerse en un recipiente limpio y seco, con tapa, sin mezclarla con orina. Cada muestra debe contener por lo menos 4ml. Entregar la muestra al laboratorio en un tiempo no mayor de dos horas, en caso contrario refrigerarla (no congelarla) por un tiempo máximo de 8 horas. a) Guantes b) Laminas portaobjetos y cubreobjetos c) Bajalenguas de madera d) Lugol e) Solución salina fisiológica f) Éter etílico g) Gasa h) Tubos de centrifuga graduados. a) Microscopio Óptico. Método Directo 1. Mezclar la muestra y colocar una gota en ambos extremos de una lámina portaobjeto 2. Adicionar una gota de solución salina fisiológica a un extremo y lugol al otro, homogenizar. 3. Cubrir con laminillas respectivamente. 4. Examinar al microscopio con objetivos de 10X y 40X.

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Método de Concentración 1. Diluir aproximadamente 2g de heces en 10 ml de agua destilada, homogenizar con bagueta. 2. Filtrar a través de gasa doble, en tubos de centrífuga graduados de 15 ml. 3. Centrifugar a 1500-2000 RPM por 2 minutos. 4. Decantar el sobrenadante y suspender el sedimento con agua destilada. 5. Centrifugar a 1500-2000 RPM por 2 minutos y decantar 6. Adicionar suero fisiológico hasta completar 9ml. 7. Ajustar bien la tapa de los tubos y agitarlos enérgicamente. 8. Centrifugar a 1500-2000 rpm por 2 minutos y decantar. 9. Con una pipeta Pasteur aspirar el sedimento colocar una gota en una lámina, y agregar una gota de lugol 10. Examinar al microscopio, utilizando objetivos de 10X y 40X. Parásitos más frecuentes: Giardia lamblia, Entamoeba coli, Blastocystis hominis. Investigación de Coccidios (Ziehl- Neelsen modificado) 1. Utilizar muestras frescas o preservadas en formol, hacer método de concentración y del sedimento hacer frotices para colorear. 2. Dejar secar el frotis al aire. 3. Aplicar el colorante de Ziehl-Neelsen, calentar y dejar por 3 minutos 4. Decolorar con ácido sulfúrico al 1% por 2 minutos 5. Contrastar con azul de metileno por 2 minutos. 6. Observar con objetivo de 40X y 100X. 7. Transcribir el resultado del examen microbiológico al Sistema de Gestión Hospitalaria o mecanografiar el resultado. 8. Validación y firma de resultados.

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HOSPITAL SANTA ROSA Titulo Objetivos Fundamento

Alcance Muestra

Materiales

Equipos

Procedimiento

SANGRE OCULTA EN HECES (THEVENON)

MICROBIOLOGIA

Código:

Encontrar la sangre en materia fecal. Cuando la hemoglobina de la sangre se pone en contacto con peróxido de hidrogeno se libera oxigeno. Este oxigeno liberado reacciona con aminofenazona y se forma una coloración azul. Laboratorio de Microbiología La recolección debe hacerla en un recipiente limpio y seco, con tapa, sin mezclarla con orina. Cada muestra debe contener por lo menos 4ml Entregar la muestra al laboratorio en tiempo no mayor de dos horas, en caso contrario refrigerarla (no congelarla) por un tiempo máximo de 8 horas. a) b) c) d) e) f) g) h) a)

Tubos cónicos para centrifugación Aplicadores Una probeta de 20 ml Tubos de ensayo. Acido acético al 10% Peróxido de hidrogeno, de 10 vol. Etanol al 95% Aminofenazona cristalina Una centrifuga

1. Inmediatamente antes de llevar a cabo el ensayo preparar una solución de aminofenazona. 2. Colocar una porción de la muestra de heces de 4ml (4cm3) para un tubo de centrifugación. 3. Agregar 7ml de agua destilada y mezclarla completamente.

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4. Centrifugar a baja velocidad aprox. Durante 5 minutos, o hasta que se precipiten los solidos. 5. Decantar el líquido flotante en otro tubo de ensayo y conservarlo. 6. Añadir al tubo que contiene el liquido flotante, sin mezclar: - 10 gotas de ácido acético al 10% - 5ml de la solución de aminofenazona. 7. Agregar 10 gotas de solución de peróxido de hidrogeno. No mezclar dejar reposar 1 minuto. REACCION POSITIVA  Azul pálido = Reacción positiva  Azul oscuro = Reacción positiva intensa  Azul negro = Reacción positiva muy intensa

+ ++ +++

REACCION NEGATIVA No ocurre cambio alguno en el color

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HOSPITAL SANTA ROSA Titulo Objetivos

Fundamento

Alcance Muestra

Materiales

Reacción inflamatoria

MICROBIOLOGIA

Código: P3

1.- Determinar la presencia de leucocitos en heces diarreicas. 2.- Cuantificar la cantidad de leucocitos en heces diarreica. 3.- Determinar la diferenciación entre polimorfonucleares y mononucleares y el porcentaje de cada uno El concepto de reacción inflamatoria, radica principalmente en la presencia o ausencia de leucocitos en heces, que son células que generalmente aparecen cuando el microorganismo causante de la infección es una bacteria. Laboratorio de Microbiología. La recoleccion debe hacerla en un recipiente limpio y seco, con tapa, sin mezclarla con orina. Cada muestra debe contener por lo menos 4ml Entregar la muestra al laboratorio en tiempo no mayor de dos horas, en caso contrario refrigerarla (no congelarla) por un tiempo máximo de 8 horas. a) Guantes b) Laminas porta objetos y cubre objetos c) Bajalenguas de madera d) Azul de Metileno e) Lugol

Equipos

a) Microscopio Óptico.

Procedimiento

1. Sobre un extremo de una lámina porta objetos agregar una gota de Azul de Metileno y en otro extremo una gota de lugol. 2. Con un bajalenguas de madera agregar una pequeña porción de la muestra de heces sobre cada gota en la lámina porta objetos. 3. Observar al microscopio para la determinación de enteroparásitos y leucocitos.

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4. En el espacio que posee Azul de Metileno se puede realizar la cuantificación de leucocitos y haciendo un porcentaje entre Polimorfonucleares y mononucleares. 5. Transcribir el resultado del examen microbiológico al Sistema de Gestión Hospitalaria o mecanografiar el resultado. Validación y firma de resultados

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Test de Graham

Titulo Objetivos

Fundamento Alcance Muestra

Materiales

Equipos Procedimiento

MICROBIOLOGIA

Código: P4

Determinar la presencia de los huevos de los parásitos causantes de la Oxiuriasis y cuantificar la cantidad de huevos del parasito. Técnica utilizada para el hallazgo de huevos de Enterobius vermicularis, mediante un examen directo. Laboratorio de Microbiología Pegar la cinta adhesiva en la lámina portaobjeto, adhiriendo una porción pequeña a ambos extremos, dejando un lengüeta al poner la cinta de la lámina porta objeto cuando se va a tomar la muestra. La obtención de la muestra se realiza en la noche 2 a 3 horas después que el paciente (generalmente niños) está dormido o a la mañana siguientes adhiere la cinta haciendo toques en la región perianal en sentido horario o anti horario. Concluida la aplicación, extender la cinta adhesiva i volver a pegar en la lámina porta objeto. a. b. c. d. a)

Guantes Laminas porta objetos y cubre objetos Bajalenguas de madera Cinta adhesiva Microscopio Óptico

1. El paciente recibe información y pautas que deberá tener en cuenta para tomar la muestra. 2. Cuando llega la muestra al servicio de microbiología del hospital debe estar envuelta en una hoja de papel para evitar la propagación de los huevos del Enterobius vermicularis en el medio ambiente. 3. Se aplica 1 ò 2 gotas de solución salina, solución de

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6. 7.

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tolueno, hidróxido de sodio. En ocasiones se puede observar huevos de otros helmintos. Se procede a la lectura de la lámina conteniendo la cinta adhesiva en un microscopio óptico a 40x de aumento. Se realiza un recorrido total de la cinta y se hace un recuento de los huevos de parasito hallados. Transcribir el resultado del examen microbiológico al Sistema de Gestión Hospitalaria o mecanografiar el resultado. Validación y firma de resultados.

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HOSPITAL SANTA ROSA IDENTIFICACION DE Titulo

PLASMODIUM GOTA GRUESA Y FROTIS

Objetivos

Fundamento

MICROBIOLOGIA

Código: P3

Detectar la presencia de PLASMODIUM la especie y la densidad parasitaria El Plasmodiun es un parasito causante de la Malaria o Paludismo que se adquieren la infección en las zonas endémicas Hacemos uso para la gota gruesa y el extendido la coloración GIEMSA. GOTA GRUESA: Este procedimiento, comprende la eliminación de la hemoglobina (que retiene el colorante) a través de la deshemoglobinización que facilitara la detección de los parásitos que pudieran estar presentes en el interior de algunas células sanguíneas, principalmente cuando se tratan de densidades parasitarias bajas. La gota gruesa, es también un procedimiento que sirve para la cuantificación de la densidad parasitaria. FROTIS O EXTENDIDO SANGUÍNEO. Es un procedimiento técnico con el que se separan los elementos formes de la sangre en una capa delgada de células separadas entre sí, las cuales una vez coloreadas facilitaran la observación de las características morfológicas ( tamaño glóbulo rojo, su forma y color , gránulos de Schuffner se pueden ver como un moteado en lo glóbulos rojos, el pigmento malarico) de los parásitos presentes en el interior de los glóbulos rojos, sobre todo permitirá identificar la especie del parásito y otras características relacionadas con los estadios y especie de los mismos.

Alcance

Laboratorio de Microbiología

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HOSPITAL SANTA ROSA Requisitos

Materiales

Procedimiento

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Solicitud del examen parasitológico debidamente llenado y registrado. Muestra adecuada, la recolección de la sangre se debe hacer en el momento que se presenta la fiebre y antes que se administre medicamento antipalúdico. a) Probeta de 10, 50 y 100 ml. b) Beaker o vaso plástico de trabajo c) Un agitador de vidrio d) Una gradilla para portaobjeto e) Un cronometro o reloj con segundero f) Un frasco gotero con metanol g) Colorante GIEMSA ( solución madre) h) Agua amortiguadora tampón. 1. Se utiliza la probeta de vidrio para preparar el colorante de GIEMSA diluido al 5 % con agua amortiguadora de pH7.2( en la proporción 1 gota/ 1 gota) 2. Mezclar suavemente con una varilla de vidrio. 3. Si se colorea dos laminas, se necesita 3 gotas de solución GIEMSA (solución madre) por cada 3 ml. De agua amortiguador. 4. Verificar si las claves de la lámina coinciden con las solicitudes de investigación. 5. Cubrir suavemente con el colorante GIEMSA diluido. Nunca echar el colorante muy alejado de las láminas porque puede formar espuma. 6. Dejar reposar las lamina con el colorante por 10 MINUTOS. 7. Lavar suavemente el colorante añadiendo un chorro suave de agua limpia. 8. Colocar en una gradilla las láminas con el lado de sangre teñida hacia abajo para eliminar el exceso de agua y facilitar el secado.

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HOSPITAL SANTA ROSA EXAMEN MICROSCOPICO DEL Código: P3 Titulo PLASMODIUM

Procedimiento

Durante el examen microscópico se debe anotar las características de los estadios del plasmodium según especie, observando los glóbulos rojos, aspecto general y características de :  Trofozoito joven (anillos)  Trofozoito mediano  Trofozoito adulto o maduro.  Esquizonte pre segmentado  Esquizonte segmentado  Gametocito. El examen de frotis es recomendable: Cuando no es posible examinar la gota gruesa por ser muy pequeña. Cuando es necesario la identificación de la especie. LAMINAS TEÑIDAS La cromatina (núcleo del parasito) es redonda y se colorea de un rojo intenso. El citoplasma del parasito toma diferentes formas, desde una forma de anillo a una totalmente irregular.. Se colorea siempre azul, aunque la tonalidad puede variar entre las diferentes especies de Plasmodium. EL EXAMEN DE GOTA GRUESA:  Es mejor para detectar la presencia de parásitos  Debe ser examinada primero  Los glóbulos rojos han desaparecido  Los gránulos de Schûffner se pueden observar alrededor del parasito.

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Lectura: Se debe leer 100 campos, si se encuentra el parasito, se debe identificar la especie. Las características diferenciales entre especie y estadios del plasmodium en la gota gruesa (Trofozoitos), Esquizonte y gametocito de Plasmodium Vivax, Falciparum y Malarie.

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HOSPITAL SANTA ROSA Titulo HEMOCULTIVO

MICROBIOLOGIA

Código: M2

Objetivos

Confirmar la etiología infecciosa en la sangre Identificar el microrganismo patógeno y su antibiograma.

Fundamento

Prueba analítica para aislar en la sangre la presencia de microrganismos patógenos causantes de infecciones (bacterias y hongos) Los frascos que presenten hemólisis, turbidez, presión excesiva de gas, sensores amarillos o signos de crecimiento deben considerarse positivo. Los frascos de hemocultivos son analizados dependiendo la existencia de microrganismos presentes en la muestra. El CO2 producto del metabolismo de estos, produce cambios de pH del medio el cual se indicará por medio del sensor colorimétrico ubicado en el fondo de la botella. El color del sensor permeable a gas cambia de azul-verdoso al amarillo dependiendo la producción de CO2 del microrganismo.

Alcance Muestra

El equipo automatizado monitoriza y registra la reflectancia del frasco cada 10 minutos en fondo de la botella y analizará cada cambio de color evidenciando estos cambios en una curva de crecimiento. Laboratorio de Microbiología. 1. Solicitud del examen debidamente llenado y registrado. 2. Muestra adecuadas: De preferencia el paciente no debe estar recibiendo antimicrobianos. Rigurosa asepsia en el lugar de la venopuncion, evitar contaminar con la flora de la piel.

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3. Se requiere un mínimo de tres hemocultivos seriados por paciente. 4. Muestra de orina (criterios explicados en pagina 12-14 ) Materiales

Equipos

Procedimiento

a) Frascos para hemocultivos de adultos y pediátricos ( según edad del paciente) b) Jeringa con aguja hipodérmica estéril c) Yodopovidona en líquido. d) Alcohol etílico al 70 % e) Algodón f) Guantes de látex. g) Mechero de bunsen h) Jarra con sobre generador de CO2 al 5% i) Medios de cultivo: Agar sangre de carnero,, Agar chocolate, Agar Mac Conkey a) Estufa 35 °C-37 °C b) Microscopio Óptico 1. Recepción y registro: Observar la integridad de los frascos y el volumen de sangre adecuado. Incubación 35°C- 37°C, sino se puede llevar inmediatamente a la estufa debe mantenerse a temperatura ambiente (20°-23 °C) un tiempo no superior a 2 horas. En ningún caso se colocara en la heladera. El número de muestras no será menor de tres para tener mayor posibilidad de recuperación del microrganismo causal. 2. Observación del hemocultivo: Debe visualizar el cultivo después de 24 hrs. de incubación. La presencia de turbidez, cambio de color o lisis indica crecimiento bacteriano, entonces se realiza un Gram y un subcultivo. En caso contrario continuar la observación diaria de los frascos hasta por 7 días. Ante sospecha o evidencia de desarrollo en cualquier frasco debe realizarse coloración Gram y subcultivo.

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Se desinfecta la tapa del frasco con alcohol de 70° Extraer con jeringa estéril a través del tapón de la muestra del frasco. Inocular una gota de la muestra en placa de agar Chocolate, agar Sangre, agar Manitol salado y agar Mac Conkey, agar Saboraud se siembra por dispersión agotamiento y otra gota en láminas para Gram. Incubar la placa de A Chocolate. a 35°-37°C en CO2 por 2448 horas. Observar el GRAM. Si no hay crecimiento hasta el 7° día se cultiva nuevamente para identificación del microorganismo Interpretación de resultados

El desarrollo de un microorganismo de flora de piel debe obtenerse en por lo menos dos hemocultivos para que tenga significación clínica.

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IX) PRUEBAS COMPLEMENTARIAS PARA IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS: Staphylococcus y Enterococcus CONDICIONES GENERALES

Morfología microscópica Para la misma se debe realizar un frotis, de preferencia a partir de medio líquido, realizando luego la tinción de Gram lo que nos permitirá apreciar la forma, agrupación y comportamiento al Gram de la cepa en estudio. En este grupo encontramos 2 géneros los Staphylococcus y los Streptococcus que presentan una disposición en racimo y en cadena respectivamente.

Morfología macroscópica Existe morfología macroscópica en medio líquida y en medio sólida. En medio líquido debemos observar la turbidez que se desarrolla luego de incubar 18-24 horas. En medio sólido debemos contar con un aislamiento de la cepa a estudiar en una placa Petri. El aislamiento nos permitirá observar las características de las colonias, que son las estructuras macroscópicas que forman las bacterias cuando crecen en medios sólidos. Así mismo debemos observar la hemolisis que presentan cada cepa sobre las placas de Agar Sangre.

A) IDENTIFICACIÓN DE ESTAFILOCOCOS Lectura de Cultivos en Agar sangre

a)Morfología de las colonias Las colonias de la mayoría de Staphylococcus son lisas, enteras, algo elevadas. Miden aproximadamente de 1 a 3mm. De diámetro a las 24 horas. Si las placas se siguen incubando tres días a 34 - 37°C las colonias pueden medir de 3 - 8 mm. Dependiendo de las especies. Las colonias de Staphylococcus aureus normalmente son grandes, estas siguen desarrollando si se deja en incubación por unos días más. Son de borde entero, de

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superficie lisa, la mayoría de ellas presentan un pigmento que va desde el amarillo crema hasta el naranja. Las colonias de Staphylococcus epidermidis son algo más pequeñas dependiendo de las cepas, usualmente no se detecta pigmentos. Las colonias de Staphylococcus saprofhyticus son más grandes que Staphylococcus epidermidis, son lustrosas y más convexas que otras colonias de estafilococos. Un 50% de las cepas son pigmentadas.

b)Coloración Gram Hacer una coloración Gram de las colonias sospechosas y observar al microscopio: Si se observan cocos Gram positivos en racimos, realizar la prueba de catalasa. (Ver Coloraciones) c)Prueba de

la catalasa

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HOSPITAL SANTA ROSA Titulo

Prueba de la catalasa

MICROBIOLOGIA

Código:

Objetivos

Separar la Familia Micrococacceae (catalasa +) de los Géneros Streptococcus y Enterococcus (catalasa -).

Fundamento

Alcance

La enzima catalasa descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua y oxígeno bajo la Fórmula 2 H2O2----2 H2O + O2. De esta manera las bacterias se protegen del efecto tóxico del H2O2, que es un producto final del metabolismo aerobio de los azúcares. Laboratorio de Microbiología.

Muestra

Una asada de la cepa problema

Materiales

a) b) c) d) e)

Reactivo: Peróxido de hidrógeno 3% Guantes de látex Asa de siembra Lamina portaobjetos Gotero o pipeta Pasteur.

Procedimiento 1. Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18 a 24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio. 2. Agregar una gota de H2O2 al 3% usando un gotero o una pipeta Pasteur. 3. No es necesario mezclar el cultivo con el H2O2 4. Observar una inmediata efervescencia (formación de burbujas) lo que indica una prueba positiva, de lo contrario se considera una prueba negativa. 5. Desechar el portaobjetos colocándolo en un desinfectante 6. Realizar este procedimiento en forma paralela con cepas controles I. Control positivo: Staphylococcus aureus II. Control negativo: Streptococcus sp.

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NOTA: Al coger la colonia con el asa de siembra tener cuidado de no llevar algo del medio de agar sangre debido a que la catalasa presente en los eritrocitos, puede dar resultados falsos positivos. No invertir el orden del método porque pueden producirse resultados de falsos positivos. Si son catalasa positivas primeramente determinar si el organismo es o no Staphylococcus aureus para ello se realiza la prueba de coagulasa.

d)Prueba de la coagulasa Se realiza para comprobar la facultad de la bacteria de coagular el plasma por acción de la enzima coagulasa, la cual aumenta la velocidad de coagulación del plasma. El resultado final es la formación de un coágulo de fibrina. Prueba en tubo (detecta coagulasa libre y ligada) La prueba de coagulasa en tubo es definitiva para el Diagnostico de Staphylococcus aureus. DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA CLINICA Y ANATOMIA PATOLOGICA SERVICIO DE PATOLOGIA CLINICA

HOSPITAL SANTA ROSA Titulo

MICROBIOLOGIA

Prueba de la coagulasa Código:

Objetivos

1.- Permite separar S. aureus, que posee coagulasa, de las otras especies de estafilococos que genéricamente se denominan coagulasa negativos.

Fundamento

a. Una endocoagulasa o coagulasa ligada o "clumping factor" que está unida a la pared celular. Esta actúa directamente sobre el fibrinógeno provocando la formación de coágulos o grumos cuando se mezcla una suspensión bacteriana con plasma citratado (test en lámina). b. Una exocoagulasa o coagulasa libre que actúa mediante la activación de un factor (CRF), formándose un complejo coagulasa-CRF, el cual reacciona con el fibrinógeno produciéndose un coágulo de fibrina (test en tubo).

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HOSPITAL SANTA ROSA Alcance

Laboratorio de microbiología.

Muestra

Una asada de la cepa problema

Materiales

Procedimiento

a) b) c) d) e) f)

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Guantes Tubo de vidrio estériles Asa de siembra Mechero de bunsen Pipeta Pasteur Reactivo: Plasma de conejo deshidratado (reconstituir de acuerdo a las instrucciones del fabricante)

1. Transferir una colonia aislada del agar sangre de carnero a 0.5 ml. de plasma reconstituido (en un tubo de vidrio estéril de 13x100). 2. Girar el tubo suavemente para lograr la suspensión del organismo. No agitar. 3. Incubar la mezcla a 35-37°C (en baño maría de preferencia) por 4 horas; observar si hay formación de coágulo inclinando lentamente el tubo. 4. Observar cuidadosamente si hay formación de coágulo inclinado lentamente el tubo (sin agitar) en intervalos, hasta 4 horas. Cualquier grado de coagulación es una prueba positiva. 5. La mayoría de los S. aureus formarán coágulo dentro de una hora. 6. Si es negativa a las 4 horas, seguir incubando el día siguiente a temperatura ambiente. Esto es recomendado porque un pequeño número de cepas de Estafolococos . pueden requerir más de cuatro horas para la formación del coágulo. Considerar que Staphylococcus produce fibrinolisina, la cual puede lisar el coágulo. 7. Realizar el control de calidad del reactivo utilizando controles positivos y negativos. Si es coagulasa positiva se identifica como Staphylococcus aureus. 8. Si son estafilococos coagulasa negativos, realizar las pruebas de resistencia a la polimixina B y novobiocina (disco de 5ug) para tener una identificación presuntiva. S. saprophyticus es resistente a la novobiocinay S. epidermidis es resistente a la polimixina B.

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e) Resistencia a la Novobiocina Varias especies del genero Staphylococcus son resistentes a la novobiocina (disco de 5 µg). DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA CLINICA Y ANATOMIA PATOLOGICA SERVICIO DE PATOLOGIA CLINICA

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Resistencia a la Novobiocina

Titulo

MICROBIOLOGIA

Código:

Objetivos

Separar Staphylococcus saprophyticus (resistente a la novobiocina) de los demás estafilococos de importancia clínica.

Fundamento

Muchas especies del género de los Staphylococcus poseen resistencia a la novobiocina.

Alcanse

Laboratorio de Microbiología.

Muestra

Una asada de la cepa problema

Materiales

Procedimiento

a) b) c) d) e) f)

TSA con sangre de carnero o Agar Mueller Hinton Suero fisiológico o caldo tripticasa soya Discos de novobiocina (5 ug por disco) Escala 0.5 de Mc Farland. Incubadora a 35-37°C Vernier o regla.

1. A partir de colonias aisladas y cultivadas por 24 horas hacer una suspensión equivalente a la escala 0.5 de Mc Farland. 2. Sumergir un hisopo estéril dentro de la suspensión ajustada y rotarlo varias veces presionando sobre la pared interior del tubo por encima del nivel del líquido. Esto removerá el exceso de inóculo del hisopo. 3. Inocular sobre la superficie seca de una placa con agar sangre de carnero estriando homogéneamente con el

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4. 5. 6. 7. 8.

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hisopo sobre la superficie del agar. Repetir el procedimiento dos veces más rotando la placa 90°. Dejar de 3 a 5 minutos a temperatura ambiente para que cualquier exceso de humedad superficial sea absorbido. Colocar el disco de novobiocina y presionar suavemente con una pinza estéril. Incubar a 35- 37 ° toda C la noche o 24 horas. Medir el halo de inhibición. Un halo menor o igual 16 mm es resistente a la novobiocina, si es mayor es sensible. La resistencia a Novobiocina es intrínseca en S. saprophyticus.

INTERPRETACION Medir el halo de inhibición. Un halo menor o igual a 16 mm. Es resistente a la novobiocina, y si es mayor es sensible. La resistencia a Novobiocina es intrínseca a Staphylococcus saprophyticus.

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a la Polimixina B DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA CLINICA Y ANATOMIA PATOLOGICA SERVICIO DE PATOLOGIA CLINICA

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MICROBIOLOGIA

Titulo

Resistencia a la polimixina B

Objetivos

Separar Staphylococcus saprophyticus de los demás estafilococos coagulasa negativos.

Fundamento

Muchas especies del género de los Staphylococcus poseen resistencia a la polimixina B.

Alcance

Laboratorio de microbiología.

Muestra

Una asada de la cepa problema

Materiales

Procedimiento

a) b) c) d) e)

Código:

TSA con sangre de carnero Suero fisiológico o caldo tripticasa soya Discos de polimixina B (300 U. Por disco) Escala 0.5 de Mc Farland. Vernier o regla

1. A partir de colonias aisladas y cultivadas por 24 horas hacer una suspensión equivalente a la escala 0.5 de Mc Farland. 2. Sumergir un hisopo estéril dentro de la suspensión ajustada y rotarlo varias veces presionando sobre la pared interior del tubo por encima del nivel del líquido. Esto removerá el exceso de inóculo del hisopo. 3. Inocular sobre la superficie seca de una placa con agar sangre de carnero estriando homogéneamente con el hisopo sobre la superficie del agar. Repetir el procedimiento dos veces más rotando la placa 90°. 4. Dejar de 3 a 5 minutos a temperatura ambiente para que cualquier exceso de humedad superficial sea absorbido. 5. Colocar el disco de Polimixina B y presionar suavemente

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con una pinza esteril. 6. Incubar a 35- 37 ° toda C la noche o 24 horas. 7. Medir el halo de inhibición. Un halo menor o igual 16 mm es resistente a la polimixina B, si es mayor es sensible. INTERPRETACION La resistencia a la polimixina B se define por una zona de inhibición menor de 10 mm S. aureus y S. epidermidis son usualmente resistentes. COMPARAR LOS RESULTDAOS CON LA TABLA ADJUNTA

Pigmento de Colonia S. aureus S. epidermidis S. saprophyticu s    

+ _ d

Hemolisi na

TABLA Coagula Resistenci sa aa Novobioci na

+ (d)

+ _

_

_

_

Resistenci aa Polimixina B

Acidez De manitol

_

+ +

+ _

+

_

d

+ : 90% o más especies o cepas positivas _ : 90% o más especies o cepas negativas d : 11 a 89% de especies o cepas positivas (d): No hay hemólisis o es retardada

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B) IDENTIFICACIÓN DE ENTEROCOCOS Los enterococos pueden presentarse como células únicas, en pares o en cadenas cortas. Se ven de forma cocobacilar cuando la coloración de Gram se realiza de una placa de agar y pueden verse en cadenas cuando se prepara la coloración de Gram a partir de caldo Tioglicolato. Son anaerobios facultativos y su crecimiento óptimo es a 35 °C. Muchas cepas crecen a 10 y 45 °C. Lectura de cultivos en agar sangre de carnero y agar Columbia CNA

a) Apariencia de las colonias Usualmente son alfa hemolíticas o no hemolíticas en agar sangre de carnero 5% aunque también pueden haber especies beta hemolíticas como algunas cepas de Enterococcus durans.

b) Coloración Gram Si se observan cocos Gram positivos y se presentan solos, en pares o en cadenas cortas, algunas veces cocobacilares realizar la prueba de la Optoquina. (Ver coloraciones) c) Prueba de la Catalasa Seguir los procedimientos descritos en la identificación de Staphylococcus Enterocuccus es catalasa negativo. NOTA: Algunas veces se produce una seudocatalasa y se puede observar una débil efervescencia. Esto ocurre cuando E. faecalis desarrolla en medios que contienen sangre, en este caso sub cultivo la colonia en estudio en TSA o agar Muller Hinton y repetir la prueba.

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Prueba de la esculina en medio con bilis

MICROBIOLOGIA

Código:

Objetivos

Identificar Enterococos

Fundamento

La prueba de la bilis-esculina está basada en la capacidad de ciertas bacterias, particularmente los estreptococos del grupo D, de hidrolizar la esculina en presencia de bilis al 1 o 4%. La esculina es, químicamente, un derivado de la cumarina (6-bglucósido-7-hidroxicumarina), que por su estructura pertenece a los glucósidos Las bacterias capaces de desarrollar en bilis y también hidrolizar esculina, producen glucosa y esculetina (7,7 dihidroxicumarina) y ésta puede visualizarse en un medio con una sal de hierro, por formación de un complejo marrón oscuro o negro.

Alcance Muestra

Materiales

Procedimiento

Laboratorio de Microbiologia. Una asada de la cepa problema a) b) c) d)

guantes de látex asa de siembra placa de agar bilis esculina mechero de bunsen

1. Inocular el cultivo en estudio haciendo estrías sobre la superficie del pico de flauta o de la placa de agar bilis esculina. 2. Incubar a 35-35 °C hasta 72 horas. 3. Se puede controlar periódicamente y esperar hasta las 72 horas antes de informar como negativo. 4. Lectura I. Positivo:

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a) En tubo: ennegrecimiento difuso en agar inclinado b) En placa: se observa un halo negro o marrón alrededor de las colonias en la placa. II. Negativo: No se produce ennegrecimiento o ennegrecimiento en menos de la mitad del tubo después de 72 horas de incubación, III. Controlesa) Control negativo: Stafilococcus aureus b) Control positivo: Enterococcus spp. Interpretación La esculetina difunde hacia el medio de agar por ser hidrosoluble. La reacción es positiva si se observa un ennegrecimiento difuso del tubo o un halo marrón oscuro o negro alrededor de las colonias en placa. Controles I. II.

Positivo: estreptococo del grupo D Negativo: estreptococo no del grupo D

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Tolerancia al cloruro de sodio.

MICROBIOLOGIA

Código:

Objetivos

1. Identificar Enterococos

Fundamento Alcance

Determinar la facultad de un organismo de desarrollar en presencia de una concentración de 6.5% de cloruro de sodio. Laboratorio de Microbiología.

Muestra

Cepa bacteriana

Materiales

Procedimiento

a) b) c) d)

caldo tripticasa soya con cloruro de sodio. asa de siembra mechero de bunsen guantes de látex

1. Inocular un caldo tripticasa soya con cloruro de sodio un cultivo de 18 a 24 hrs. De incubación. 2. Incubar a 35°C por 24 horas 3. Se puede controlar periódicamente y esperar hasta 72 horas. 4. Lectura: a) Positivo: Presencia de desarrollo bacteriano b) Negativo: no se objetiva crecimiento en el caldo 5. Controles: a) Control negativo: E. coli b) Control positivo: S. aureus INTERPRETACION El 95% de los enterococos son esculina positivos y crecen en medio de 6.5% de NaCl. Cinco al diez % de Estreptococos del grupo viridans son bilis esculina positivos.

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X) PRUEBA COMPLEMENTARIA PARA BACILOS GRAM NEGATIVOS A) IDENTIFICACION FERMENTADORES

DE

BACILOS

GRAM

NEGATIVOS

Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Enterobacter Lectura de cultivos en Agar Mac Conkey  En agar Mc Conkey, Escherichia coli lactosa positiva son colonias de borde entero, de color fucsia, opaco, de 2 mm - 3 mm de diámetro, usualmente rodeadas de una zona opaca alrededor de la colonia (bilis precipitada). Las cepas de E. coli que son lactosa negativas dan colonias incoloras de 3 - 4 mm.  En agar Mc Conkey, K. pneumoniae son colonias de borde entero, de color rosado a rosado oscuro, de 3 - 4 mm de diámetro y mucoide.  En agar Mc Conkey Enterobacter spp. Son colonias de borde entero, de color rosado de 2 – 4 mm de diámetro, no tan mucoides como K. Pneumonia. Las colonias con estas características son subcultivadas en medios diferenciales.

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MICROBIOLOGIA

Titulo

Pruebas de metabolismo Código: Bacteriano

Objetivos

Reconocer, diferenciar e identificar las Enterobacterias. (Bacilos Gram negativos fermentadores )

Fundamento

Alcance

Los microrganismos durante la actividad metabólica realizan una serie de actividades bioquímicas, de las diferentes reacciones se obtienen la energía que se consume en síntesis, crecimiento y otras actividades. Los productos formados por microorganismos durante su metabolismo: ácidos, productos de putrefacción, toxinas, enzimas, etc. Se busca demostrar mediante medios de cultivo la utilización de lactosa, utilización de glucosa, producción de gas de glucosa, descarboxilación de lisina, producción de ácido sulfhídrico, utilización del citrato, producción de ureasa, prueba MR- VP, Motilidad Producción de indol. Laboratorio de microbiología

Muestra

Cepa bacteriana

Materiales

Procedimiento

a) Asa de siembra en punta b) Medios de cultivo: TSI, LIA, SIM, Citrato de Simmons, urea, caldo indol y MR-VP c) Mechero de bunsen d) Guantes de látex 1. Identificar la colonia sospechosa que se encuentra en la placa de agar Mac Conkey. 2. Esterilizar al rojo vivo el asa de siembra recta en un mechero de Bunsen. 3. Enfriar el asa.

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4. Obtener la colonia seleccionada con el asa recta, tratando de no tocar el fondo del medio de cultivo ni otra colonia vecina. 5. Sembrar por estría en los medios diferenciales empezando por el agar citrato, urea (en la superficie), TSI, LIA (introduciendo el asa por el centro hasta tocar el fondo del tubo, retirar por el mismo trazo y sembrar en estría la parte inclinada), caldo para la prueba de indol, MRVP. 6. Sembrar por puntura en el centro del agar movilidad hasta una profundidad aproximada de 1.5cm. 7. Incubar a 35 – 37° C de 18 a 24 horas.

Agar TSI En estos medios se determina la capacidad de la bacteria de utilizar la lactosa, glucosa y sacarosa (en TSI), con producción o no de gas y la producción de ácido sulfhídrico. Lectura Es importante hacer la lectura entre las 18 - 24 horas para no obtener resultados erróneos. Se hace sobre la base de tres características: Utilización de hidratos de carbono, producción de gas y producción de ácido sulfhídrico. Utilización de hidratos de carbono: Utilización de lactosa: Reacción ácida en el pico de flauta (color amarillo) Abreviatura: (A). Utilización de glucosa: Reacción ácida en la columna del medio (color amarillo) Abreviatura: (A). No hay utilización del carbohidrato: Se puede observar una reacción alcalina (color rojo) o que no hay cambio de color (permanece del mismo color que el medio no inoculado) Abreviaturas: (K) o (N) respectivamente. La producción de gas de glucosa es positiva con la presencia de una sola burbuja de gas o desplazamiento completo del fondo del tubo. La producción de Acido sulfihidrico (H2S) se manifiesta por un color negro distribuido por toda la columna del medio. En ambos casos la lectura es por cruces (+)

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Controles: Superficie  E. coli (lactosa positiva)  Shigella  Salmonella

Fondo amarillo/gas amarillo/rojo amarillo/negro/gas/rojo

Agar Lisina Hierro En este medio se determina simultáneamente la producción de lisina descarboxilasa y de la formación de ácido sulfhídrico Lectura Es importante hacer la lectura entre las 18 - 24 horas; si la lectura se realiza antes podemos obtener resultados falsos positivos, así como falsos negativos si se lee después de las 24horas. Realizar la lectura en la columna y en la superficie inclinada y observar la formación de ácido sulfhídrico el cual se evidencia por una coloración negra. Controles: Superficie  E. coli  Proteus mirabilis

Fondo amarillo/violeta amarillo/negro/rojo parduzco

Utilización de citrato Algunas bacterias pueden obtener energía por vía distinta de fermentación de hidratos de carbono utilizando el citrato como única fuente de carbono para su metabolismo. La prueba de utilización del citrato (el medio de citrato Simmons) es positiva si hay viraje del medio hacia el color azul o si se nota desarrollo aunque no haya viraje de color.

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Hidrólisis de la urea (producción de ureasa) Es útil para determinar la capacidad de un organismo de degradar la urea, formando dos moléculas de amoniaco por acción de la enzima ureasa. Este efecto se manifiesta debido a la presencia de un indicador de pH que es el rojo de fenol. Una reacción positiva confiere reacción alcalina al medio, virando el indicador a rosado; si no ha habido metabolismo de la urea, el medio se queda amarillento.

Rojo de metilo Permite comprobar la capacidad del microorganismo para producir y mantener estables los productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa determinando cualitativamente el pH del medio. Incubar 48 hrs. El desarrollo de un color rojo estable en la superficie del medio indica que la producción del acido es suficiente como para bajar el ph a 4.4.    

Prueba Positiva: Color Rojo Prueba Negativa: Color amarillo o naranja Control Positivo: E. Coli Control Negativo: Klebsiella

Voges Proskauer Es útil para determinar la capacidad de algunos microorganismos de degradar la glucosa hasta acetilmetilcarbinol (acetoína) a través de un proceso de fermentación.  Prueba positiva : Color Rojo  Prueba negativa: Ausencia de color.  Control Positivo: Klebsiella

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 Control Negativo: E. Coli

Motilidad (Medios SIM, o MIO o agar movilidad) Para determinar si un organismo es móvil o inmóvil. Es positivo cuando migra de la línea de siembra provocando turbidez y negativo cuando se observa un crecimiento a lo largo de la línea de siembra.  Control Positivo: E. Coli  Control Negativo: Klebsiella

Prueba de indol Es útil para determinar la capacidad de un microorganismo de producir indol a partir del aminoácido triptófano ( presente en la peptona) El indol se detecta en el medio observándose el desarrollo del color rojo (en forma de anillo) luego de añadir un reactivo que contiene p-dimetilamino benzaldehído (reactivo de kovac).

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B) IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTADORES CONDICIONES GENERALES Los bacilos Gram negativos no fermentadores de glucosas más comunes aislados en nuestro medio son Pseudomonas, Acinetobacter y Alcaligenes, se les debe realizar una prueba de oxidasa y pasarlos al equipo automatizado para su identificación y sensibilidad. Pseudomona aeruginosa es fácilmente reconocida en medios de aislamiento primario por sus características: Morfología de las colonias, algo extendidas, bordes aserrados y presencia de brillo metálico . Pigmento difusible, que puede faltar. Olor característico. En las líneas que siguen se tratará sobre la identificación de P. aeruginosa Detectada la colonia sospechosa. Realizar las siguientes pruebas: a) Utilización de lactosa b) Utilización de glucosa c) Prueba de oxidasa d) Crecimiento a 42º C e) Utilización de citrato f) Reducción de nitrato g) Hidrólisis de la gelatina Para esto se hará uso de las pruebas antes descritas para enterobacterias.

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Prueba de hidrólisis de la gelatina

MICROBIOLOGIA

Código:

Objetivos

Identificar Bacilos Gram Negativos No Fermentadores

Fundamento

Alcance

Determina la capacidad de un microorganismo de producir gelatinasas (enzimas de tipo proteolítico) que licúan la gelatina Laboratorio de microbiología

Muestra

Cepa bacteriana

Materiales

a) Gelatina nutritiva pH 6,8 b) Asa de siembra c) Mechero de bunsen d) Guantes de látex 1. Utilizando una asa de siembra en punta y a partir de un cultivo puro de 18 a 24 horas coger un inóculo abundante y hacer una punción en el centro y en forma vertical en el medio de gelatina hasta una profundidad de 1.5 a 2.5 cm. 2. Utilizar un tubo con medio de gelatina sin inocular como control de la prueba. 3. Incubar los cultivos en estudio y de control a 22 – 25º C por 24 - 48 horas y hacer la lectura. 4. Evaluar diariamente el cultivo durante 14 días. 5. Al término de cada período de 24 horas colocar el tubo control y el de estudio en el refrigerador o en un recipiente con hielo durante 2 horas aproximadamente para determinar si se ha producido o no la digestión de la gelatina (licuefacción). Controles  Positivo: Serratia marcescens  Negativo: E.coli Resultados  Positivo: medio de cultivo semilíquido  Negativo: medio de cultivo sólido

Procedimiento

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X) MEDIOS DE CULTIVO Son sustancias nutritivas líquidas y sólidas que se utilizan para el crecimiento de los microorganismos. Sus componentes básicos deben satisfacer las mínimas exigencias nutricionales para el desarrollo microbiano y varía según el tipo de bacterias. Básicamente los nutrientes de muchos medios de cultivos son: Extractos de carne, carbohidratos, sales inorgánicas, productos de degradación protéica (gelatina, albuminosas, peptonas, proteosas), aminoacidos y otras fuentes de nitrógeno como creatina, carnosina, anserina, purinas. También contienen sales (KCl, H2PO4 y Na Cl). Factores de crecimiento (tiamina, ácido nicotínico, riboflavina, piridoxina, ácido pantoténico). El Agar es el agente solidificante; este se prepara a partir de una variedad de algas (gelididium, euchema, pterocladia) en estado seco por procesamiento con agua caliente, se compone de un polisacarido de cadena larga, también sales inorgánicas, pequeña cantidad de proteínas, trazas de ácidos grasos y minerales como Mg. y Ca.

1) Clasificación Los medios de cultivo pueden ser clasificados en: 1. 1 Por su estado físico en: a) Sólidos cuando contiene entre 1,2 a 1,5% de agar b) Semisólidos, que tienen entre 0,3 a 0,8% de agar c) Líquidos, llamados caldos, cuya concentración de agar es 0 a 0,1%

2.1 De acuerdo a su aplicación en: a) Medios comunes o simples: que permiten el desarrollo de la mayoría de las bacterias sobre todo las no exigentes, como el caldo peptonado, el caldo nutritivo o el agar nutritivo. b) Medios especiales: que se forman a partir de un medio simple y se les añade diversas sustancias de acuerdo a la finalidad deseada.

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c) Medios de enriquecimiento: permiten el crecimiento de un mayor número de bacterias, se utiliza cuando el inóculo o muestra tiene un número reducido de ellas, ej. caldo tripticasa soya, caldo selenito, medio de hemocultivo. d) Medios enriquecidos: cuando se les adiciona sustancias de mayor contenidos nutritivo como sangre de carnero, sangre de conejo, sangre de caballo, huevo, extracto de levadura, etc., permitiendo cultivar bacterias que son exigentes en sus necesidades nutricionales, Ejs.: Agar sangre de carnero para el desarrollo de Streptococcus; Medio de Ogawa para el aislamiento de Mycobacterium tuberculosis; Agar chocolate para el crecimiento de Neisseria. e) Medios selectivos: tienen la finalidad de favorecer el desarrollo de un tipo de bacterias y al mismo tiempo inhibir el crecimiento de otras. Para esto se les añade al medio de cultivo sustancias llamadas inhibidores, como pueden ser las sales biliares, colorantes, sustancias químicas e inclusive antibióticos. Ejemplos con el agar SS para el aislamiento de Salmonella y Shigella, Agar TCBS para el cultivo de Vibrio cholerae, y el agar Mac Conkey donde solo crecen enterobacterias. f) Medios diferenciales: son los que permiten identificar y/o clasificar a las bacterias, observando la actividad del microorganismo frente a uno o más substratos y observando su actividad viendo el crecimiento, o el cambio de un indicador de pH. Ejemplos son el agar Triple Sugar Iron (TSI), el Lysine Iron agar (LIA) y el agar Citrato de Simmons, que se utilizan en la identificación de enterobacterias. g) Medio de Transporte: se utiliza para trasladar las muestras desde el sitio de obtención de la muestra hasta el laboratorio para ser procesado. Ejemplos: Medio de Amies con Carbón y el medio de Cary y Blair. En muchas veces, se combinan las características de cada uno de estos tipos de medios y tener uno que puede ser, por ejemplo, enriquecido y selectivo a la vez como el Medio de Thayer Martin, que es un agar chocolate al cual se añadido un suplemento de antibióticos que permite aislar Neisseria gonorrhoeae y evitar la flora bacteriana acompañante.

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2) CRITERIOS DE CALIDAD DE LOS MEDIOS PREPARADOS Como cualquier reactivo o procedimiento de laboratorio, los medios de cultivo deben pasar controles de calidad para asegurar que en la preparación o conservación de los medios se han seguido los pasos necesarios para que el producto no sea alterado y evitar resultados que pueden conducirnos hacia un diagnóstico errado. Para eso se debe utilizar medios de casas comerciales que cumplan normas de calidad, buenas prácticas de manufactura y una adecuada distribución que garantice sus productos. En el laboratorio se debe contar con un programa de control de calidad que es parte del sistema de aseguramiento de la calidad del laboratorio.

1. Control de calidad de los medios preparados El laboratorio de microbiología deber realizar el control de calidad para comprobar si las características del medio están dentro de la especificación y si la metodología de preparación del medio resulta satisfactoria. Cada lote de medio debería someterse a un programa mínimo de ensayo que asegure su aceptación: a) pH: Comprobar el pH del medio preparado al final cuando este alcance la temperatura ambiente (25°C), que debe coincidir con lo señalado en la etiqueta. b) Esterilidad: Se toma una muestra representativa de cada lote, que es incubado de 2 a 5 días. Después de la incubación no debe haber desarrollo microbiano. Las muestras deben ser descartadas. c) Capacidad de crecimiento y presencia de reacciones típicas: sembrar el medio con cepas conocidas o cepas de referencia como las ATCC. d) Estabilidad: el medio preparado debe mantener por un tiempo razonable (dependiendo del tipo de medio) sus características siempre que se guarde de una manera apropiada. Si el medio no reúne las condiciones deseadas, se debe anotar la naturaleza del problema, el método de preparación, el número de lote y la fecha de recepción y comunicarse con el departamento de Servicio Técnico del proveedor.

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2. Control de calidad de la conservación de medios preparados Los medios preparados deben descartarse cuando se observen cualquiera de estas características. Es importante investigar porque se han producido pues en algunos casos se puede remediar en la preparación de los siguientes lotes. a) Rajadura de las placas: se han colocado demasiadas placas una encima de otra o se ha ejercido un aumento de peso sobre ellas. b) Rajadura en la superficie del medio: medio se ha conservado demasiado tiempo o ha estado en algún lugar con una temperatura alta. c) Variaciones en el volumen del medio: el medio se ha secado. d) Hemólisis: tiempo de conservación muy prolongado.

e) Cristales en el medio. f) Presencia de burbujas: contaminación. g) Presencia de coágulos de agar: temperatura de plaqueo muy baja. h) Cambio de color normal. i) Contaminación. j) Falla en la inhibición de microorganismos saprofitos . 3. Fallas y causas en la preparación de medios de cultivo: a) Valor de pH incorrecto:  Medir el pH por encima de los 25°C.  Sobrecalentamiento en la esterilización, vuelta a fundir o calentamiento prolongado a50°C.  Solución incompleta del medio.  Mala calidad del agua.  Recipiente mal lavado o con residuos químicos.  Mala conservación del medio deshidratado o vencido. b) Turbidez o precipitación:  Mala calidad del agua.  Sobrecalentamiento.  pH incorrecto.

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 Solución incompleta. c) Oscurecimiento:  Sobrecalentamiento.  Solución incompleta.  Alteración del pH.

Foto. Se observa dos tubos de agar lisina hierro de diferentes marcas, una de ellas es de color violeta mientras que el otro presenta un color rojizo que dificulta la observación de las reacciones bioquímicas.

d) Gel blando:     

Bajo porcentaje de agar en el medio. Errores en la pesada del medio deshidratado o en los suplementos. Sobrecalentamiento. Mala homogenización del medio. Exceso de agua.

e) Crecimiento bacteriano pobre:  Exceso de calentamiento.  Substancias inhibidoras en el agua o en el recipiente.  Alteración en el Ph.

FOTO: Conservación de medios diferenciales en tubos de vidrio con tapón de jebe

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3) DESCRIPCION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO a) AGAR AZUL DE BROMOTIMOL LACTOSA CISTINA (BROLACIN O CLED) 1) Aplicación Es un medio con lactosa y cistina, deficiente en electrolitos. Se utiliza para el aislamiento, identificación presuntiva y recuento del número de bacterias en orina; favorece el crecimiento de todos los MO existentes en orina y proporciona una buena diferenciación morfológica de las distintas colonias.

2) Fórmula Extracto de 2 gr carne L-cistina 0.28g Lactosa 10 Agar 12g pH final = 7.3 aprox. a 25 °C

Peptona

7g

Estracto de levadura Azul de bromotimol

2g 0.03g

3) Preparación 1. Se suspenden 33g en un litro de agua destilada y se hierve hasta disolver el medio completamente. 2. Se esteriliza en la autoclave a 121°C durante 15 minutos. Se mezcla bien antes de verter en placas. 3. Las placas con medio son de color azul verdoso y claras. 4. Marcar las placas con BR o CLED

4) Fundamento El medio favorece el crecimiento de las bacterias existentes en orina por no contener sustancia sin hibidoras y por los nutrientes que contiene. La lactosa permite diferenciar organismos fermentadores de lactosa, que al degradarla viran el indicador de azul verdoso a amarillo; las lactosa

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Negativas alcalinizan el medio produciendo un viraje a verde o azul intenso. La deficiencia de electrolitos del medio evita el crecimiento en velo o "swarming" de especies de Proteus. El crecimiento de Streptococcus se puede visualizar si se añade suero o plasma al medio.

5) Interpretación: Se realiza a las 18 a 24 h. de incubación a 37 °C. Teniendo en cuenta que las bacterias lactosa positivas dan colonias amarillas y las lactosa negativas son azules; los estreptococos yStaphylococcus dan colonias amarillas pequeñas.

6) Control de calidad Cepas de Ensayo Escherichia coli Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus

% de recuperación >70% >40% >70% >70%

Viraje Amarillo Azul Azul Amarillo

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b) AGAR CHOCOLATE 1) Aplicación Para el aislamiento de microorganismos exigentes. Es efectivo para el aislamiento de Neisseria y con adicionamiento de ciertos suplementos (por ej. Suplemento B ver Medio de Thayer-Martin y/o agar Columbia) para el crecimiento de Haemophilus influenzae.

2) Fórmula Se utiliza como base cualquier agar nutritivo sin inhibidores: por ej. Agar tripticasa soya, Agar Columbia base, Medio GC base, Agar Brucella, etc. al cual se le adiciona 5% de sangre desfibrinada estéril.

3) Preparación 1. Disolver y esterilizar el medio base según sea el caso. 2. Enfriar hasta 50 a 60°C y agregar 5-10% de sangre desfibrinada estéril de carnero. 3. Colocar en un baño María a 75 a 80°C y mantener a esta temperatura por 10 a 20 minutos agitando constantemente. 4. El medio va a cambiar a un tono pardo (chocolate). 5. Enfriar hasta 50°C. 6. Repartir en placas o tubos según se desee. 7. Marcar los tubos o placas con CHOC

4) Fundamento El medio base no tiene inhibidores por lo que permite el crecimiento de cualquier microorganismo. Para lograr el crecimiento de microrganismos que necesitan factor X (hematina) y factor V (NAD) se hace hemolizar a los eritrocitos por acción del calor, para que se libere estos factores al medio. La adición de suplementos o aditivos enriquecen más aún el medio, de acuerdo al fin buscado. Opcionalmente, la adición de suplementos antibióticos inhibe la flora acompañante no deseada. La temperatura del baño maría no debe exceder los 80 °C porque si no el agar pierde los factores nutricionales.

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5) Control de calidad Cepas de Ensayo

Recuperación del agente

Neisseria Gonorrhoeae

Buena

Neisseria meningitidis

Buena

Haemophilus influenzae

Buena

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c) AGAR CITRATO DE SIMMONS 1) Aplicación Para la diferenciación e identificación de Enterobacteriaceas sobre las bases de utilización del Citrato como única fuente de Carbono.

2) Formula Sulfato de magnesio

0,2 g

Fosfato de amonio 0,2 g dihidrato Cloruro de sodio 5g Agar 15 g pH final: 6.8

Fosfato amónico de sodio Citrato de sodio, tribásico Azul de Bromotimol

0,8 g 2g 0,08 g

3) Preparación 1. Se suspende 23 g en 1 L de agua destilada 2. Hervir hasta disolver el medio por completo. 3. Distribuir 2.5 ml. en tubos de 12 x 75 con tapón de algodón. 4. Esterilizar en la autoclave a 121°C durante 15 minutos y 15 lb de presión. 5. Dejar enfriar los tubos en forma inclinada de tal manera que se obtenga un buen plano inclinado y poco fondo. 6. Cambiar los tapones de algodón por tapones de jebe. 7. El medio preparado es verde. 8. Marcar los tubos con CIT

4) Fundamento Organismos que son capaces de utilizar el citrato (como única fuente carbonada) pueden crecer en este medio. La degradación del Citrato da lugar a la alcalinización del medio de cultivo el medio, el cual vira a un color azul oscuro por el indicador Azul de Bromo timol.

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5) Control de calidad Cepas de ensayo Enterobacter aerogenes Escherichia coli Shigella flexneri

Color del medio Azul

Recuperación Bueno

Verde Verde

Crecimiento Inhibido Crecimiento Inhibido

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d) AGAR LISINA HIERRO (LIA) 1) Aplicación Este medio, basado en la decarboxilación y desaminación oxidativa de la lisina, la fermentación de la glucosa y la formación de sulfuros, se usa para diferenciar las especies de Salmonella y Shigella de especies de Citrobacter.

2) Fórmula (en gramos por litro) Peptona de gelatina

5g

Extracto de levadura

3g

Glucosa

1g

Lisina

10 g

Tiosulfato de sodio

0,04 g

Agar

13 g

Citrato de hierro y 0,5 g amonio Púrpura de bromocresol 0,02 g pH final: 6.7 ± 0.2 3) Instrucciones

1. Suspender 35 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Dejar embeber unos 15 minutos. 2. Calentar cuidadosamente, agitando con frecuencia y hervir durante un minuto hasta la disolución completa. 3. Distribuir 2,5 ml en tubos de 13 x 100 con tapa rosca. 4. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos con las tapas parcialmente abiertas. 5. Enfriar en pico de flauta dejando un fondo vertical apto para la punción. 6. Marcar los tubos con LIA

4) Fundamento La lisina presente en el medio es decarboxilada a cadaverina y dióxido de carbono; en el proceso interviene la lisina decarboxilasa y el medio aumenta de pH haciendo virar el indicador hacia el púrpura, en la totalidad del tubo. En aquellas cepas en que el proceso es de desaminación (Proteus, Providencia, Morganella spp.) se produce un

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color rojo sobre el pico de flauta, por el uso de las peptonas. Los organismos que no decarboxilan la lisina, producen una zona alcalina en la zona inclinada y una zona ácida en el fondo del tubo. El hidrógeno sulfurado producido ennegrece el medio. Siembra Por punción profunda con aguja de inoculación. Incubación 24 horas a 35°C.

5) Control de calidad BACTERIA

REACCIOON

Shigella flexneri Salmonella paratyphi B Proteus mirabilis Escherichia coli

K/A K/K R/A K/K

INDOL +

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e) AGAR MAC CONKEY 1) Aplicación Para aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos y diferenciación entre enterobacterias fermentadoras y no fermentadoras de la lactosa. Se usa también para el recuento de coliformes y para aislamiento de bacterias patógenas en agua, aguas residuales, productos alimenticios, etc.

2) Fórmula Peptona Lactosa Cloruro de Sodio Cristal Violeta pH final = 7.1

17 g 10 g 5g 0.001 g

Proteosa peptona Sales Biliares Rojo Neutro Agar

3g 1.5 g 0,03 g 13,5 g

3) Preparación 1. Se suspende 50 g en 1 L de agua destilada. 2. Se hierve hasta disolver por completo. 3. Se esteriliza en autoclave a 121°C durante 15 minutos y 15 lb de presión. 4. Se deja enfriar hasta 50 a 55 °C y se distribuye en placas. 5. La superficie de las placas debe estar seca antes de sembrar. 6. El medio preparado es claro y de color rojo parduzco. 7. Marcar los tubos o placas con MC

4) Fundamento Las colonias que fermentan la lactosa producen una acidificación del medio, lo cual hace que el indicador Rojo Neutro actúe impartiendo un color rojo a la colonia. Las que no fermentan la lactosano varían de color y por lo tanto las colonias se apreciarán incoloras. Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el crecimiento de bacterias Gram positivas.

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5) Control de calidad Cepas de ensayo Escherichia coli ATCC 25922 Shigella sonnei Staphylococcus aureus ATCC 25923

Color colonias Rojas Incoloras

de Recuperación Buena Buena Nula

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f) AGAR MANITOL SALADO 1) Aplicación Es un medio selectivo recomendado por Chapman para el aislamiento de estafilococos presuntamente patógeno a partir de alimentos y muestras clínicas. En muchos laboratorios es llamado también como Medio Hipertónico o Agar manitol sal rojo de fenol.

2) Fórmula Extracto de carne d-Manitol Agar pH final: 7.4 ± 0.2

1g 10 g 15 g

Peptona Cloruro de sodio Rojo de fenol

10 g 75 g 0.025 g

3) Preparación 1. Suspender 111 g de polvo por litro de agua destilada. 2. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos. 3. Distribuir y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. 4. Distribuir en placas o en tubos anchos (18 x 150 o mayores) 5. Marcar como MS.

4) Fundamento Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentración salina. Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio; las colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona roja o púrpura. Las colonias sospechosas, se repicarán en un medio sin exceso de cloruro de sodio para efectuarles, posteriormente, la prueba de la coagulasa.

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5) Control de calidad Cepas de ensayo

Color colonias Staphylococcus aureus Amarillas Staphylococcus epidermidis Rojas Escherichia coli -Vibrio parahaemolyticus Amarillas

de

Recuperación Exelente Escaso-bueno No crece Exelente

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g) AGAR SABOURAUD GLUCOSA 4% 1) Aplicación Medio utilizado para el cultivo y diferenciación de hongos, proporciona un medio favorable en pH y contenido de glucosa, los hongos crecen fidedignamente manteniendo sus estados culturales descritos por Sabouraud.

2) Fórmula Neopeptona

10 g

Agar pH final= 5.6 aprox .

15 g

Dextrosa

40 g

3) Preparación 1. Se suspende 65 gramos en 1 litro de agua destilada 2. Se hierve hasta disolver el medio por completo. 3. Se esteriliza en autoclave a 121°C durante 15 minutos y 15 libras de presión. 4. Se distribuye en placas o tubos 5. El medio preparado es ámbar ligeramente opalescente. 6. Marcar los tubos o placas con SAB

4) Fundamento Para el aislamiento primario utilizado en micología, el contenido de glucosa y el pH que ofrece el medio son favorables para el crecimiento de los diferentes hongos, levaduras y mohos.

5) Control de calidad Cepas Aspergillus niger Candida albicans Lactobacillus casei Saccharomyces cerevisiae

Recuperación Bueno a excelente Bueno a excelente Bueno a excelente Bueno a excelente

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h) AGAR SANGRE 1) Aplicación Es un medio no selectivo, para fines generales, especialmente el aislamiento de organismos exigentes; la adición de sangre permite determinar si el organismo es hemolítico o no.

2) Fórmula Agar tripticasa soya, agar Columbia, o base de agar sangre

1L

Sangre desfibrinada de carnero

50 -100 mL

pH final: 6.8 aprox. 3) Preparación 1. Disolver agar en cantidad suficiente para un litro de agua destilada 2. Calentar hasta disolver completamente 3. Esterilizar en autoclave por 15 min. a 121 °C y 15 lbs. De presión. 4. Enfriar hasta 45 o 50 °C 5. Añadir 5 a 10 % de sangre de carnero desfibrinada estéril, mezclar bien. 6. Verter en placas. 7. El medio con sangre es del color de la misma y no hemolizado. 8. Marcar las placas con AS

4) Fundamento Es un medio sin inhibidores por lo que puede crecer cualquier microorganismo, la adición de sangre lo hace un medio enriquecido para el crecimiento de microorganismos exigentes y para la determinación de hemólisis. El pH ligeramente ácido favorece la conservación de los eritrocitos, las reacciones hemolíticas y el crecimiento de ciertos microorganismos como estreptococos y neumococos. El medio no debe tener glucosa porque esta inhibe el desarrollo de hemólisis.

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5) Control de calidad Cepa de ensayo Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae

Recuperación Buena Buena Buena

Hemolisis Variable Beta Alfa

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i) AGAR SANGRE AZIDA 1) Aplicación El medio es utilizado para el aislamiento de estreptococos y estafilococos. El medio se puede utilizar con o sin sangre.

2) Fórmula Agar Triptosa Cloruro de sodio pH final: 7.2

15 g 10 g 5g

Extracto de carne Azida de sodio

3g 0.2 g

3) Preparación 1. Se suspende 33 gramos en un litro de agua destilada. 2. Se hierve hasta disolver completamente. 3. Se esteriliza en autoclave a 121°C por 15 minutos y a 15 libras de presión. 4. Si se desea añadir sangre, se enfría el medio a 50°C y se añade sangre desfibrinada de carnero a una concentración final del 5%. 5. El medio preparado es de color rojo cereza. 6. Marcar las placas con AZ o en el caso de usar sangre con AS Az 7. Si se cuenta con azida de sodio, se puede pesar 0,2 g y colocarlo en tubos para añadirlos a un litro de agar tripticasa soya, obteniéndose un medio similar. La azida de sodio es tóxica, por lo que debe manejarse con cuidado siguiendo las indicaciones de la hoja MSDS.

4) Fundamento Este medio permite el crecimiento de microorganismos exigentes. La azida inhibe a la flora Gram negativa, en tanto que la flora Gram-positiva se desarrolla más o menos indemne. La adición de sangre al medio favorece la interpretación de hemólisis.

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5) Control de calidad Cepa de ensayo Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae Enterococcus faecalis Staphylococcus epidermidis Escherichia coli ATCC 25922

Crecimiento Excelente Excelente

Hemolisis Beta Alfa

Excelente Excelente

Alfa/Gama Gama

Nulo

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j) AGAR SS (SALMONELLA SHIGELLA) 1) Aplicación Es un medio diferencial y selectivo para aislamiento de Salmonella y Shigella a partir de heces, alimentos y otros.

2) Fórmula Extracto de carne Lactosa Citrato sódico Citrato férrico

5g 10 g 8.5 g 1g

Proteosa peptona Sales biliares Tiosulfato sódico Verde brillante

Rojo neutro

0.025g Agar

5g 8.5 g 8.5 g 0.33 g 13.5 g

pH final: 7.0 3) Preparación 1 Suspender 60 g en 1 L de agua destilada 2 Calentar hasta disolver. 3 NO SE DEBE AUTOCLAVAR. 4 Verter a placas. 5 Las placas con medio son color rojo cereza. 6 Marcar las placas con SS

4) Fundamento La bilis de buey, el verde brillante y la elevada concentración de tiosulfato y citrato inhiben la flora acompañante (Gram + y algunos coliformes) permitiendo el crecimiento de Salmonella y Shigella. Con el tiosulfato e iones de hierro se evidencia la formación de H2S con el consecuente ennegrecimiento de la colonia. Los coliformes que fermentan la lactosa viran el pH a ácido y por el indicador rojo neutro se aprecian colonias rojas. Shigella, Salmonella y otros no fermentadores de lactosa producen colonias transparentes. Las colonias lactosa negativas son incoloras y las lactosa positivas son rosadas hasta rojas.

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5) Control de calidad Cepas de ensayo

Color colonias Escherichia coli Rojo Shiguella flexneri Incoloras Salmonella enteritidis Incoloras Salmonella typhi Incoloras Salmonella paratyphi A Incoloras Staphylococcus aureus Incoloras

de Centro negro No No Si Si No

Recuperación Mala Buena Buena Buena Buena Ausente

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k) AGAR TRIPTICASA SOYA (TSA) 1) Aplicación Es un medio de uso frecuente y general, utilizado como base frecuente del agar sangre. La bondad del medio es que pueden crecer tanto aerobios como anaerobios, el medio carece de inhibidores, por eso se utiliza para el cultivo de una gran variedad de microorganismos.

2) Fórmula Triptona

15 g

Peptona de Soya

5g

Cloruro de sodio pH final = 7.3

5g

Agar

15 g

3) Fundamento El medio carece de inhibidores, el contenido de peptonas favorece el crecimiento de una gran variedad de microorganismos

4) Preparación 1. Se suspenden 40 gramos en 1 litro de agua destilada 2. Se hierve hasta disolver el medio por completo. 3. Se esteriliza en la autoclave a 121 ° C por 15 minutos. 4. Distribuir en placas o tubos 5. Marcar los medios con TSA 6. El medio preparado es de color blanquecino nacarado.

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5) Control de Calidad Cepas de ensayo

Neisseria meningitidis Staphylococcus aureus Streptoccoccus pneumoniae Streptococcus pyogenes

Crecimiento sin sangre Excelente

Crecimiento con Hemólisis 5% sangre de carnero Excelente Ninguna

Excelente

Excelente

Beta

Regular

Excelente

Alfa

Regular

Excelente

Beta

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l) AGAR TSI (TRIPLE SUGAR IRON) 1) Aplicación Medio empleado para la clasificación de enterobacterias que permite investigar la capacidad de fermentar glucosa, lactosa, sacarosa y detectar la presencia de hidrógeno sulfurado.

2) Formula Extracto de carne Cloruro de sodio

3g

Peptona

20 g

5g

Glucosa

1g

Lactosa Sulfato de hierro y amonio Rojo de fenol pH final: 7,3 ± 0.2

10 g 0.2 g

Sacarosa Tiosulfato de sodio Agua destilada

10 g 0.2 g

0.025 g

1L

3) Instrucciones 1. Suspender 62,5 g del polvo en un litro de agua destilada. 2. Calentar a ebullición hasta completa disolución. 3. Distribuir en tubos 13 x 100 con tapa rosca o con tapón de algodón 4. Esterilizar en la autoclave por 15 minutos a 121°C. 5. Enfriar dejando un fondo de 2 cm con un plano inclinado corto. 6. El medio es de color rojo 7. Marcar los tubos con las iniciales TSI

4) Fundamento La fermentación de los azúcares da lugar a una producción de ácido, que se detecta por medio del indicador rojo de fenol, los cambios de color al amarillo por una acidificación y a rojo por una alcalinización. La menor concentración de glucosa (0,1%) hace que el cambio sea leve y solo se produzca el cambio en el fondo del tubo, mientras que al estar la lactosa y la sacarosa en mayor concentración el cambio a

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acidez se ve en fondo y en el plano inclinado. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro.

5) Control de calidad Cepas de ensayo Escherichia coli Shigella flexneri Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa

Fondo

Plano

Gas

H2S

A

inclinado

2+

-

K

A

-

-

K

A

-

-

K

A

-

-

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m) AGAR UREA SEGÚN CHRISTENSEN 1) Aplicación Para la diferenciación de bacterias productores de ureasa (degradadores de urea).

2) Fórmula Peptona

1g

Dextrosa

1g

Cloruro de Sodio Rojo de fenol Agar pH final: 6,8

5g

Fosfato monopotásico Urea

2g

0.012g 15 g

15 g

3) Preparación del medio: 1. Se disuelve 29 g de la base de agar urea (que tiene todos los componentes de la fórmula menos el agar) en 100 ml de agua destilada 2. Se esteriliza por filtración. 3. Aparte, se disuelve 15 g de agar en 900 ml de agua destilada estéril. 4. Se esteriliza el agar en autoclave por 15' a 121°C. 5. Se enfría a 50-55°C y asépticamente se le agrega los 100 ml de concentrado de la base de agar urea. 6. Se mezcla bien y se distribuye 1,5 a 2 ml. en tubos estériles 12 x 75. 7. Se inclina los tubos en pico de flauta (aprox. 0,5 cm de profundidad y 1cm de pendiente). 8. El medio de cultivo es claro y de color amarillo-naranja. 9. Se marcan los tubos con AU 10. Se taponan los tubos y se guardan en refrigeración.

4) Fundamento La urea es desdoblada por la enzima ureasa producida por ciertos microorganismos, formando dióxido de carbono y amoniaco, este último alcaliniza el medio lo que se

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comprueba por el viraje de amarillo a rojo-púrpura por el indicador rojo de fenol. El agar urea (según Christensen) es menos tamponado a comparación del caldo úrea (fuertemente tamponado) por lo que puede detectar no sólo microorganismos potentes formadores de ureasa (como Proteus) sino también los formadores débiles como Klebsiella, Enterobacter, ciertos micrococos, etc.

5) Control de calidad Cepas de ensayo Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Proteus vulgaris

Hidrólisis de la urea No - Amarillo Si – Rojo lento

Crecimiento Bueno Bueno

Si – Rojo rápido

Bueno

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n) CALDO TRIPTICASA SOYA (TSB) 1) Aplicación El medio es utilizado como caldo de enriquecimiento por la gama de nutrientes que posee; es muy utilizado para recuperar aquellos microorganismos que se tengan poco inóculo.

2) Fórmula Triptona (digerido 17 g pancreático de caseina) Cloruro de sodio

5g

Dextrosa

2.5 g

Soytona (digerido 3 g papaico de soya)

Fosfato de potasio dibásico

2.5 g

pH final: 7.3 3) Preparación 1. Se añade 30 gramos a 1 litro de agua destilada. 2. Se mezcla bien y se distribuye en los recipientes definitivos. 3. Se puede colocar 2,5 ml. en tubos 12 x 75 con tapón de algodón 4. Se esteriliza en la autoclave a 121°C durante 15 minutos. 5. Se marcan los tubos con TSB

4) Fundamento El medio contiene una muy buena gama de nutrientes lo que lo hace un buen enriquecedor y recuperador de bacterias que se encuentran en pocas cantidades como es en el caso de los hemocultivos. El caldo presenta una buena base para la adición de diferentes agregados para la recuperación de bacterias aerobias como anaerobias de diferentes tipos de muestras.

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5) Control de calidad Cepas de ensayo Neisseria meningitidis Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Staphylococcus epidermidis

Recuperación Bueno Bueno Bueno Exelente

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o) MEDIO DE MUELLER HINTON 1) Aplicación Es un medio que no posee inhibidores, por lo cual crece todo tipo de bacterias. El medio es utilizado en los antibiogramas y para el aislamiento de especies patógenas de Neisseria.

2) Fórmula

Infusión de carne

300 g

Casamino ácidos

17.5 g

pH final: 7.4 3) Preparación del medio: 1. Se suspenden 38 g en 1 L de agua destilada y se hierve hasta disolver el medio por completo. 2. Se esteriliza por autoclave a 121°C durante 15 minutos. 3. Se distribuye en placas en cantidad suficiente para que de una profundidad de aproximadamente 4 mm. 4. El medio preparado es ámbar claro ligeramente opalescente. 5. Marcar las placas con pH.

4) Fundamento El medio no posee inhibidores, la inclusión de almidón asegura que los factores tóxicos que se encuentran durante el crecimiento sean absorbidos, siendo su presencia a menudo esencial para que se establezca el crecimiento a partir de inóculos muy pequeños. Se debe utilizar el mismo tipo de placas y determinar la cantidad de medio necesario para obtener la profundidad de medio necesaria.

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5) Control de calidad Cepas de ensayo Escherichia coli ATCC Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Neisseria meningitidis

Crecimiento Excelente Excelente Excelente Excelente

Por las características del uso de este medio necesita pruebas adicionales en el control de calidad

pH Medir la profundidad del agar Evaluar el nivel de timidina disco de SXT Evaluar concentración de Ca y Mg

Utilizar un potenciometro, 7,4 ± 0,1 Debe ser de 4 ± 0,5 mm Crecimiento de E. faecalis ATCC 29212 con Crecimiento de P. aeruginosa ATCC 27853 con

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p) MEDIO DE TRANSPORTE DE CARY Y BLAIR 1) Aplicación El medio de Cary-Blair es un medio de transporte semisólido para muestras clínicas, sobre todo cuando se tenga que transportar hisopos rectales a un laboratorio de diagnóstico. Para recoger la muestra se usan hisopos de madera con punta de algodón, se toma la muestra y se introduce el hisopo en el tercio inferior del medio, se rompe la varilla de manera que cuando se apriete el tapón de rosca el hisopo se encuentre en el fondo del medio; luego se cierra fuertemente el tapón del frasco.

2) Fórmula Fosfato disódico

1.1 g

Cloruro de sodio Agar pH final: 8.4

5g

Tioglicolato de sodio Cloruro de calcio

1.5 g 0.09 g

6g

3) Preparación del medio: 1. Se suspenden 12.7 g en 1 L de agua destilada y se calienta hasta disolver el medio completamente. 2. Se distribuye 5 mL en tubos 13 x 100 con tapa rosca. 3. Se esterilizan en autoclave a 121°C por 15'. 4. Se deja que enfríen y se aprietan los tapones de rosca para impedir la desecación. Se puede utilizar también viales con tapa de jebe. 5. Se marcan los tubos con CB.

4) Fundamento El bajo contenido nutritivo del medio y el uso de fosfato como buffer en el medio impide el sobre crecimiento de las enterobacterias. El bajo potencial de oxidoreducción del medio asegura una supervivencia bacteriana durante buen tiempo. Existen diversas modificaciones, esta es la que utiliza la marca DIFCO, que puede ser esterilizada en la autoclave, mientras que otras formulas son más difíciles de preparar y solo se calientan en Baño María, lo que no garantiza una esterilización adecuada.

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q) MEDIO SIM (SULFURO, INDOL, MOVILIDAD) 1) Aplicación Este medio sirve para ver la producción de sulfuro de hidrógeno, la movilidad y la producción de indol a partir de triptófano.

2) Fórmula Peptona

20 g

Citrato de amonio y hierro (II) Agar pH final: 7,3

0.2 g

Extracto de carne Tiosulfato de sodio

3g 0.2 g

3g

3) Preparación 1. Se suspenden 26,4 g en 1 L de agua destilada y se hierve hasta disolver el medio por completo. 2. Se distribuye en 3 ml. en tubos 12 x 75 3. Se esteriliza en la autoclave a 121 ° C durante 15 min. y 15 lbs. de presión. 4. El medio preparado es claro y de color amarillo. 5. Se marcan los tubos con SIM.

4) Fundamento El medio combina tres tipos de prueba: movilidad, para ello utiliza un medio semisólido con un poco concentración de agar; la producción de sulfuro de hidrógeno a partir de la degradación del sulfato, lo que da lugar a sulfuro ferroso (al combinarse con el hierro) que se forma a lo largo del inoculo, o en partes del medio donde se ha movilizado la bacteria (color negro); la producción de indol a partir del triptofano (de la peptona) del medio, da como resultado un color rojo al adicionar reactivo de Kovacs, de Ehrlich o de Gilles.

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5) Control de calidad Cepas de ensayo H2S

Movilidad

Indol

Escherichia coli -

+

+

Klebsiella pneumoniae Proteus mirabilis Proteus vulgaris

-

-

-

+

+

-

+

+

+

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r) ESTANDAR DE TURBIDEZ - ESCALA DE Mc FARLAND 1) Aplicación Este es un patrón de turbidez muy utilizado en la pruebas de susceptibilidad antibiótica (tubo 0,5), en algunas pruebas de identificación semiautomatizada y en la preparación de antígenos para inoculación de animales.

2) Reactivos 1. Solución de cloruro de bario 0,048 M p/v: Pesar 1,175 g de BaCl2.2H2O, Colocar en una fiola de 100 ml y añadir agua destilada c.s.p. 100 ml. 2. Solución de ácido sulfúrico 0,18 M v/v: Medir 1 ml de ácido sulfúrico Q.P., Colocar en una fiola de 100 ml y añadir agua destilada c.s.p. 100 ml.

3) Preparación 1. Añadir las cantidades que se indican en la tabla para conseguir el patrón que se necesita:

Tubo

Cloruro barrio

de Acido Sulfúrico 1%

Equivalente Densidad de millones óptica a 625 de bacterias nm. X ml.

0.5

0.05

9.95

150

0,08 - 0,1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0,1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9,0

300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400 2700 3000

0,16 - 0,2 0,32 - 0,4 0,48 - 0,6 0,64 - 0,8 0,8 - 1

150

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2. Si solo se va a preparar el estándar 0,5: Retirar con una pipeta 50 μl de 10 ml. de la solución de ácido sulfúrico, añadir 50 μl de la solución de cloruro de bario y mezclar bien. 3. Si se cuenta con un espectrofotómetro, verificar la densidad correcta del estándar, cuya absorbancia a 625 nm debe ser la indicada en la tabla. 4. Colocar la solución preparada en los tubos que se van a utilizar para comparación, sellarlos y etiquetarlos indicando el tipo de solución, la fecha de preparación y la fecha de expiración (6 meses). 5. Guardar los tubos en oscuridad a temperatura ambiente. 6. El tubo de uso rutinario se debe utilizar durante un mes para luego descartarlo y usar otro del stock. 7. Existen estándares preparados comerciales que están compuestos por agua ultra pura que contiene microesferas de styrene di-vinyl benzene en tubos de borosilicato.

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XI) COLORACIONES A ) Método rápido: GRAM Reactivos.1. Cristal violeta Cristal violeta

_ 10 gr.

Alcohol metílico absoluto _ 500 ml. 2. Solución Yodo Cristales de Yodo

_ 6 gr.

Yoduro potasio

_ 12 gr.

Agua destilada

_ 1,800 ml.

Acetona

_ 400 ml.

Alcohol etílico

_ 1,200 ml.

Safranina

_ 10 gr.

Agua destilada

_ 1000 ml.

3. Alcohol – Acetona

4. Safranina

Técnica: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Preparar un frotis delgado. Fijar la lámina con el mechero. Cubrir la lámina con cristal violeta. 10 segundos. Lavar. Cubrir con Yodo. 10 segundos. Lavar. Decolorar con alcohol-acetona. Lavar INMEDIATAMENTE. Cubrir con saframina. 10 segundos. Lavar. Secar. Examinar la lámina con aceite de inmersión 100x.

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B) Coloración de Kinyou, para bacilos Alcohol-Acido-Resistentes: Fundamento: Los gérmenes que se tiñen con fucsina y resisten a decolorantes potentes como el alcohol - ácido, se denominan alcohol - ácido resistentes, mientras que otros se decoloran y se tiñen posteriormente con el colorante de contraste azul metileno.

Reactivos: 1. Kinyou Fucsina básica

_ 40 gr.

Cristales de fenol

_ 80 gr.

Alcohol etílico 95º

_ 200 ml.

H2O destilada csp.

_ 1000 ml.

Ácido clorhídrico qp.

_ 30 ml.

Alcohol corriente csp.

_ 1000 ml.

Filtrar antes de usar. 2. Alcohol ácido

3. Azul metileno Solución madre: Disolver aproximadamente 50 gr. de colorante en 1000 ml. de alcohol sódico de 95º, hasta que se sature la solución. Solución trabajo: Solución madre _ 100 ml. H2O destilada 1000 ml. Filtrar antes de usar.

Técnica: 1. Calentar la lámina y aplicar el colorante de Kinyou x 5 min. 2. Lavar con agua. 3. Decolorar con alcohol ácido (hasta que no quede colorante Kinyou). 4. Añadir al frotis Azul metileno x 5 min. 5. Lavar. 6. Observar con aceite de inmersión.

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2012

C) Coloración Wayson (morfología) Fucsina básica

_ 0,2 gr.

Azul metileno

_ 0,75 gr.

Alcohol etílico

_ 20,9 ml.

Fenol 5% en agua

_ 200 ml.

Teñir el frotis x 15 seg.

D) Coloración de azul de metileno (morfología) Es excelente para la observación de la morfología de las bacterias particularmente gonococos, bacilos deftéricos y el examen de líquido céfalo raquídeo. Reactivo: Azul de Metileno 3g Agua destilada _ 1000 ml. Teñir el frotis x 5 min.

E) Coloración para Campylobacter: Reactivos: 1. Safranina Safranina

_ 0,5 gr.

Agua destilada

_ 100 ml.

2. Violeta de genciana I. Violeta de genciana Agua destilada

_ 10 gr. _ 1000 ml.

Filtrar antes de usar. II. Sol. Saturada de Violeta de genciana Violeta de genciana Alcohol absoluto

_ 10 gr. _ 100 ml.

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2012 _ 1000 ml.

Solución trabajo: Solución saturada _ 100 ml. Agua destilada csp _ 1000 ml.

Técnica: 1. Fijar con el mechero (frotis delgado) 2. Colorear con: a) Safranina _ 2 min. Lavar b) Violeta genciana _ 3 min. Alternativa: Fucsina 1% - 10 seg. Observar al microscopio con lente de inmersión.

F) Coloración para Criptosporidium Reactivos: 1. Metanol 2. Hidróxido de sodio Hildroxido de sodio 1N 40 gr. _ 1000 ml. de agua destilada. 3. Colorante Ziehl Neelsen Fucsna básica

_ 0,3 gr.

Alcohol etílico

_ 10 ml.

Fenol

_ 5 gr.

Agua destilada

_ 95 ml.

4. Azul metileno

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Técnica: Frotis ligeramente grueso 1. Fijar con metanol _ 1 min. 2. Lavar. 3. Solución Hidroxido Na 1N _ 1min. 4. Lavar 5. Ziehl Neelsen (flamear 3 veces con el mechero x 5 min.) 6. Lavar 7. Decolorar con alcohol ácido 8. Lavar 9. Azul metileno 5 min. 10. Lavar 11. Observar con lente de inmersión.

G) Coloración de Wright Principio: Coloración diferencial de material basófilo y acidófilo. Reactivos: Wright

_ 2 gr.

Alcohol metílico

_ 1000 ml.

Agua temperada aproximadamente pH 7

Preparación: Disolver el colorante en un mortero, echando el alcohol a pocos, triturar bien por 2030 minutos, hasta verter todo el alcohol. Guardar por un día en frasco oscuro; filtrar antes de usar, almacenar siempre en frasco oscuro.

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Técnica: (L.C.R.) 1. Wright _ 1min. 2. Agua tamponada _ 3 min. Lavar. Dejar secar. 3. Lectura con aceite de inmersión.

H) Coloración Giemsa Aplicación: Detección de parásitos en sangre, viral , inclusiones en Chlamydias, Pneumocystis carinii. Reactivos: Giemsa polvo

_ 600 mg.

Metano (libre de acetona) _ 50 ml. Glicerina neutra

_ 50 ml.

Preparación: En un mortero pulverizar porciones del colorante añadiendo glicerina e ir vertiendo en un matraz de 100 ml., hasta disolver todo el colorante. Tapar el matraz con algodón y papel. Colocar en baño maría de agua 60ºC x 2 hrs. Agitando cada 20 min. Enfriar y añadir el metanol, guardar en frasco oscuro. Dejar madurar por 2 semanas y filtrar antes de usar.

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I) Coloración Directa para Campylobacter Técnica: 1. Fijar con el mechero (frotis delgado del moco preferentemente) 2. Colorear con: a) Safranina _ 2 min. Lavar b) Violeta genciana _ 3 min. Alternativa: Fucsina 1% - 10 seg. Lavar y dejar secar 3.- Observar al microscopio con lente de inmersión, objetivo de 100x Informar: se observan bacilos de morfotipo compatible con Campylobacter spp.

J) Técnica: (Leucocitos - reacción inflamatoria) 1. Wright _ 5 min. 2. Agua tamponada _ 10 min. Lavar. Dejar secar. Alternativa Azul de Metileno 4 minutos Lavar y dejar secar 3,- Lectura con objetivo de 40x Informar: número de leucocitos por campo

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ANEXO

FLUJOGRAMA DE TRABAJO PARA UROCULTIVO Recepción de la muestra

Centrifugar, leer sedimento y coloración GRAM

Siembra en agar Sangre y Mc Conkey

Incubación por 24 horas a 35 – 37 °C

Determinación de agente bacteriostático

Validación y reporte de los resultados

Identificación del patógeno Suceptibilidad antimicrobiana

Validación y reporte de los resultados

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FLUJOGRAMA DE TRABAJO PARA CULTIVO DE HERIDA

Recepción de la muestra

Frotis y coloración GRAM

Siembra en AS, Mck, MS, ACH,Sab..

Incubación por 24 horas a 35 – 37 °C

Validación y reporte de los resultados

Identificación del patógeno

Suceptibilidad antimicrobiana

Validación y reporte de los resultados

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FLUJOGRAMA DE TRABAJO PARA CULTIVO DE SECRECION VAGINAL

Recepción de la muestra

Siembra en AS, Mck, MS, ACH,Sab.

Incubación por 24 horas a 35 – 37 °C

Coloración GRAM y lecturas de lámina

Examen directo: Determinar presencia de Hongos y Trichomonas

Validación y reporte de los resultados

Identificación del patógeno

Suceptibilidad antimicrobiana

Validación y reporte de los resultados

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FLUJOGRAMA DE TRABAJO PARA CULTIVO DE SECRECION FARINGEA

Recepción de la muestra

Coloración GRAM y lecturas de lámina

Siembra en AS, Mck, MS, ACH, Sab.

Incubación por 24 horas a 35 – 37 °C

Validación y reporte de los resultados

Identificación del patógeno Suceptibilidad antimicrobiana

Validación y reporte de los resultados

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FLUJOGRAMA DE TRABAJO PARA CULTIVO DE DISPOSITIVO INTRAVASCULAR

Recepción de la muestra

Frotis y coloración GRAM

Siembra en AS, Mck ,MS,ACH,Sab.

Incubación por 24 horas a 35 – 37 °C

Validación y reporte de los resultados

Identificación del patógeno

Suceptibilidad antimicrobiana

Validación y reporte de los resultados

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FLUJOGRAMA DE TRABAJO PARA CULTIVO DE ESPUTO

Recepción de la muestra

Frotis y coloración GRAM

Siembra en AS, Mck,MS,ACH,Sab.

Incubación por 24 horas a 35 – 37 °C

Validación y reporte de los resultados

Identificación del patógeno

Suceptibilidad antimicrobiana

Validación y reporte de los resultados

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2012

FLUJOGRAMA DE TRABAJO PARA CULTIVO DE MUESTRAS DEL TRACTO RESPIRATORIO BAJO Recepción de la muestra

Frotis y coloración GRAM

Siembra en AS, Mck,MS,ACH,Sab .

Incubación por 24 horas a 35 – 37 °C

Validación y reporte de los resultados

Identificación del patógeno

Suceptibilidad antimicrobiana

Validación y reporte de los resultados

165

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2012

FLUJOGRAMA DE TRABAJO PARA CULTIVO DE SECRECION BILIAR

Recepción de la muestra

Frotis y coloración GRAM

Siembra en AS, Mck,MS,ACH,Sab,Sel..

Incubación por 24 horas a 35 – 37 °C

Sembrar del Sel. al SS

Validación y reporte de los resultados

Identificación del patógeno

Suceptibilidad antimicrobiana

Validación y reporte de los resultados

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2012

FLUJOGRAMA DE TRABAJO PARA COPROCULTIVOS

Recepción de la muestra

Frotis y coloración GRAM

Siembra en, Mck, Sel.

Incubación por 24 horas a 35 – 37 °C

Sembrar del Sel. al SS

Validación y reporte de los resultados

Identificación del patógeno

Suceptibilidad antimicrobiana

Validación y reporte de los resultados

167

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2012

FLUJOGRAMA DE TRABAJO PARA CULTIVO DE LIQUIDOS BIOLOGICOS

Recepción de la muestra

Frotis y coloración GRAM

Centrifugar la muestra a 3,8000 rpm. Por 20 minutos

Siembra en AS, Mck, MS, ACH,Sab.(multibiotico)

Incubación por 24 horas a 35 – 37 °C

Validación y reporte de los resultados

Identificación del patógeno

Suceptibilidad antimicrobiana

Validación y reporte de los resultados 168

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2012

FLUJOGRAMA DE TRABAJO PARA CULTIVO DE LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO

Recepción de la muestra

Frotis y coloración GRAM y tinta China

Centrifugar la muestra a 3,8000 rpm. Por 20 minutos

Siembra en AS, Mck, MS, ACH,Sab (glucosado)

Incubación por 24 horas a 35 – 37 °C

Validación y reporte de los resultados

Identificación del patógeno

Suceptibilidad antimicrobiana

Validación y reporte de los resultados

169

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2012

FLUJOGRAMA DE TRABAJO EXAMEN MICOLOGICO, DIRECTO Y CULTIVO

Recepción de la muestra

Coloración GRAM, Giemsa,

Siembra en Sab. (multibiotico)

Incubación por 1 – 15 días a temperatura ambiente.

Examen directo con KOH

Validación y reporte de los resultados

Identificación del Hongo Validación y reporte de los resultados

170

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2012

FLUJOGRMA DE TRABAJO PARASITOLOGICO DIRECTO

Recepción de la muestra

Examen directo con SSF y Lugol

Validación y reporte de los resultados

171

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2012

FLUJOGRAMA DE TRABAJO PARASITOLOGICO CONCENTRADO Recepción de la muestra

Diluir la muestra en agua destilada

Filtrar En tubos cónicos con triple filtro

Centrifugar a 1,500-2,000 RPM por 2 minutos

Decantar el sobrenadante

Resuspender sedimento con solución formolada al 5 %

1 gota de sed. + 1 gota de lugol en la lámina

Validación y reporte de los resultados

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2012

FLUJOGRAMA DE TRABAJO BACILOSCOPIA

Recepción de la muestra

Orina o Liq. Corporales

Esputo

Centrifugar 3,500 RPM por 5 minutos Realizar el frotis sobre una lámina portaobjeto

Realizar el frotis sobre una lámina portaobjeto Secar

Secar

Coloración Ziehl - Neelsen

LECTURA

Validación y reporte de los resultados

173

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2012

METODO DE SIEMBRA ESTRIA POR AGOTAMIENTO

174

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2012

METABOLISMO BACTERIANO

E. coli

Klebsiella oxytoca

175

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2012

Shigella sp.

Proteus mirabilis

176

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2012

BACTERIAS MÁS FRECUENTES EN UN COPROCULTIVOS

Agar Mac Conkey Shigella

Salmonella

Plesiomonas Aeromonas

177

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2012

Agar XLD

Shigella

Salmonella

Aeromonas

Plesiomonas

178

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2012

TOMA DE MUESTRA DE HONGOS

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2012 PARASITOS

Trofozoito de Blastocystis hominis

Quiste de Entamoeba hystolitica

Quiste en Entamoeba coli

Quiste de Iodamoeba butchlii

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2012

THEVENON

POSITIVO 1+

POS 2+

POS 3+

181

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2012

182

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2012

PRUEBA DE COAGULASA EN TUBO

PRUEBA DE CATALASA

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2012

REACCIONES BIOQUÍMICA AGAR TSI.

AGAR LIA

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2012 AGAR CITRATO

PRODUCCIÓN DE UREASA

185

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2012

PRUEBA DEL ROJO DE METILO

PRUEBA DE VOGES PROSKAUER.

186

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2012 PRUEBA DE MOVILIDAD

PRUEBA DE INDOL

187

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2012

PRUEBA DE LA OXIDASA

188

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2012 MEDIO CHROMOAGAR

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2012 HEMOPARASITOS

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2012

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2012 HEMOCULTIVO

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2012

XIV . BIBLIOGRAFIA

 Instituto Nacional de Salud. Manual de procedimientos de laboratorio para el diagnóstico de infecciones respiratorias agudas. Curso Teórico Práctico. En: Diagnóstico de laboratorio de infecciones respiratorias agudas y enterovirus. Lima. 1999.  Koneman E, Allen S, Dowell V, Sommers H. Diagnóstico microbiológico. 3a ed Buenos Aires. Editorial Médica Panamericana. 1992.  Miller J. Michael, Holmes H. Specimen collection, transport and storage. En: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC. Yolken RH. Manual of Clinical Microbiology. 7a ed. Washington DC: American Society for Microbiology; 1999. pp 33 – 63.  OMS Manual for the National Surveillance of Antimicrobial Resistance of S. pneumoniae and H. influenzae: Epidemiological and Microbiological methods. Programme for the Control of Acute Respiratory Infections. Atlanta.1994.

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