Manual de Microbiología

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE QUERÉTARO

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

FACULTAD DE QUÍMICA

Laboratorio de microbiología

CLAVE

Prerequisito

ACADEMIA DE QFB

MANUAL DE PRÁCTICAS

. . .

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Introducción

Este laboratorio pretende capacitar al estudiante para la ejecución, implementación e interpretación de las técnicas microbiológicas básicas, y a la vez, proporcionar un panorama general de la forma en que se efectúa el estudio sistemático de los microorganismos.

Las practicas se han programado en forma creciente de complejidad y tanto la implementación de las diferentes técnicas, ejecución e interpretación de resultados, requieren del conocimiento y consideración de las prácticas y resultados anteriores; por lo que cada unidad tiene como antecedentes, los objetivos de la unidad previa.

Es importante recalcar que es indispensable la integración de los conocimientos y habilidades adquiridas en la teoría, con aquellos logrados en el laboratorio, para lograr un buen desempeño en ambas partes del curso.

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índice

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Introducción Contenido Temático Reglamento del Laboratorio de Microbiología Unidad I. Higiene y Seguridad en el laboratorio de Microbiología Unidad II. Microscopía y Morfología Microbiana I. El microscopio, Calibración II. Tinciones simples y húmedas III. Tinciones Diferenciales IV. Utilización de colorantes vitales. Identificación y descripción de la morfología de bacterias esporuladas y capsuladas Unidad III. Manejo de cultivos puros I. Preparación y esterilización de material de vidrio y medios de cultivo II. Selección de medios de cultivo III. Verificación de la eficacia de esterilización: Recuento de mos IV. Cultivo Puro de microorganismos V. Conservación de cultivos Puros Unidad IV. Obtención e identificación de cultivos puros I. Identificación Bacteriana

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Unidad V. Evaluación del crecimiento bacteriano I. Crecimiento Bacteriano

II. Recuento de microorganismos por Métodos Directos III. Análisis microbiológico de la leche, análisis microbiológico del agua Unidad VI. Control de microorganismos I. Determinación del efecto de agentes químicos

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CONTENIDO TEMÁTICO Unidad I. Higiene y Seguridad en el laboratorio de Microbiología Objetivo 

Explicaran y observaran las reglas básicas de higiene y seguridad para los laboratorios de microbiología, dada la importancia que estos tienen.

Actividades 1. Elaborar un reglamento sobre seguridad e higiene en el laboratorio de microbiología. 2. Elaborar guías de observación para supervisar el cumplimiento de las normas establecidas. Unidad II. Microscopía y Morfología Microbiana Objetivo   

Harán el estudio microscópico de los microorganismos procariotes y eucariotes, además los diferenciarán. Seleccionaran las tinciones adecuadas para la observación de grupos y características específicas de microorganismos. Determinarán microscópicamente, las dimensiones de los microorganismos.

Actividades 1. Realizaran tinciones simples. Identificación y descripción de morfología y agrupaciones de microorganismos. 2. Realizaran tinciones húmedas. Determinación de la movilidad de los microorganismos. Identificación y descripción de la morfología de hongos. 3. Utilización de colorantes vitales. Identificación y descripción de la morfología de bacterias esporuladas y capsuladas. 4. Realizar tinciones diferenciales. Diferenciación de bacterias por su Gram y por su ácido alcohol resistencia. 5. Realizar la calibración del microscopio y medición de microorganismos.

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Unidad III. Manejo de cultivos puros Objetivo      

Cultivaran y conservaran adecuadamente cepas puras de bacterias y hongos. Prepararan material de vidrio y medios de cultivos de uso común en el laboratorio de microbiología. Seleccionaran adecuadamente los medios de cultivo y métodos de esterilización para algunos de los casos más frecuentes en el laboratorio de microbiología. Cultivaran en diversos medios de cultivo, mediante diferentes técnicas de inoculación e incubación a las bacterias aerobias, anaerobias y hongos. Organizaran e interpretaran las características morfológicas macroscópicas y microscópicas de diversos microorganismos. Conservaran adecuadamente, por el resto del curso a algunos cultivos puros.

Actividades 1. Preparación y esterilización de material de vidrio y medios de cultivo; seleccionaran de medios, métodos de esterilización y verificación de la eficacia del proceso de esterilización. 2. Realizar las técnicas de inoculación para obtener cultivos puros. Cultivo de microorganismos aerobios. Descripción e identificación de características morfológicas. 3. Realizar el cultivo de microorganismos anaerobios por diversas técnicas. 4. Llevar a acabo la conservación de cultivos puros. Unidad IV. Obtención e identificación de cultivos puros Objetivos   

Aislaran e identificaran cultivos puros de bacterias y hongos. Seleccionaran técnicas y medos de cultivo adecuados para el aislamiento de algunos microorganismos. Obtendrán cultivos puros de algunos microorganismos de fácil manejo y comprobaran su pureza.

Actividades 1. Aislamiento de microorganismos por diferentes técnicas. 2. Comprobación del aislamiento mediante la observación macroscópica y microscópica. 3. Utilización de esquemas para completar la identificación del microorganismo aislado, considerando los datos obtenidos anteriormente. 4. Caracterización bioquímica del microorganismo aislado.

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Unidad V. Evaluación del crecimiento bacteriano Objetivos   

Seleccionaran y aplicaran diversas técnicas para determinar el crecimiento microbiano. Evaluaran el crecimiento bacteriano por diversos métodos. Seleccionaran métodos adecuados de evaluación del crecimiento microbiano para casos específicos.

Actividades 1. Recuento de microorganismos mediante métodos directos: Microscopio, masa celular, cámara de Breed. 2. Recuento de microorganismos viables. Cuenta en placa. 3. Otros métodos indirectos de recuento microbiano: Métodos de óxido reducción, variantes de pH, cuantificación de productos, métodos turbidimétricos. 4. Ejercicios de aplicación: Análisis microbiológico de la leche, análisis microbiológico de agua. Identificación del índice de contaminación. Unidad VI. Control de microorganismos Objetivos   

Seleccionaran y aplicaran agentes químicos y físicos para propiciar e inhibir el desarrollo bacteriano. Determinaran prácticamente el efecto de diversos agentes físicos y químicos en el crecimiento microbiano e interpretarán el efecto de dichos agentes. Aplicaran los conocimientos sobre microorganismos y sobre agentes externos en el cultivo, control y estudio de los microorganismos.

Actividades 1. Determinación del efecto de algunos agentes físicos sobre los microorganismos (temperatura, radiación, presión osmótica). 2. Determinación del efecto de algunos agentes químicos sobre los microorganismos 8fenoles, alcoholes, metales pesados, agentes oxidantes, colorantes, etc.) 3. Ejercicio de aplicación: Determinación del efecto de algunos agentes físicos y químicos sobre un microorganismo problema. Interpretación de resultados.

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REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

1. Se deberá llegar puntual a cada una de las sesiones impartidas a lo largo de todo el semestre, sólo se contemplarán 15 minutos de tolerancia. 2. Es de carácter obligatorio el portar la bata de laboratorio la cual deberá contar con manga larga, y cubrir al menos hasta la rodilla. 3. Se portarán, siempre, zapatos cerrados. 4. Antes de comenzar a realizar cualquier procedimiento y antes de retirarse del laboratorio se deberán limpiar las mesas de trabajo. 5. Queda estrictamente prohibido el consumir alimentos, bebidas o fumar dentro del laboratorio de microbiología. 6. Se ingresará al laboratorio sólo si se encuentra acompañado al menos de un compañero, está prohibido trabajar experimentalmente sólo. 7. En caso de contar con cabello largo, siempre se recogerá, nunca se deberá de trabajar con el cabello suelto. 8. No está permitido, bajo ninguna circunstancia, que los cultivos realizados en el laboratorio salgan de las instalaciones del mismo. 9. Para evitar cualquier peligro de contaminación con los microorganismos manejados durante el trabajo de laboratorio se recomienda tener uñas cortas o en su defecto procurar extrema limpieza. 10. Es de obligación por equipo de trabajo, contar con los materiales básicos necesarios para la limpieza del área y material de trabajo, como lo son: jabón, fibra, alcohol, y franela. 11. Antes y después de realizar cualquier trabajo experimental, se deberán lavar las manos, para evitar contaminaciones (personales y del medio). 12. Durante el proceso de sembrado de cultivos microbiológicos se deberá guardar compostura, es decir no se deberá de hablar y no se deberá de caminar y/o correr alrededor de las mesas de trabajo. 13. En aquellos casos en los que los microorganismos a manipular sean de carácter nocivo, así como en el caso de manejar reactivos peligrosos; se deberá, estrictamente, maniobrar a dichos microorganismos y/o reactivos en campana de extracción o flujo laminar. Se sugiere que para prácticas experimentales en las que se utilice el microscopio, por mantenimiento de lentes de los oculares, no se use rímel o algún otro cosmético en los ojos y/o pestañas.

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Nombre de la práctica:

Higiene y seguridad en el laboratorio de microbiología Realizó: Revisó: Q.B. Sergio Pacheco Hernández Fecha: marzo 2008

Fecha:

Práctica

1

CLAVE 591 Páginas 8

Autorizó: Fecha:

Prerequisito 724

Páginas de la 1a8

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Contenido

I. INTRODUCCIÓN

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II. CONOCIMIENTOS PREVIOS

6

IV. METODOLOGIA

7

III. OBJETIVO

IV. 1. Materiales.

IV. 2. Requerimientos de seguridad. IV. 3. Disposición de residuos

6

7 7 7

V. RESULTADOS.

7

VI. DISCUSION.

8

VII. CONCLUSIONES.

VIII. BIBLIOGRAFIA

8

8

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INTRODUCCIÓN

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El manejo sin riesgos de un laboratorio es responsabilidad del encargado. Esta

responsabilidad puede delegarse, reasignarse, abandonarse o ignorarse, pero cuando se produce un accidente vuelve siempre sin excepción a recaer en el encargado del laboratorio.

Este último debe desarrollar y aplicar un programa de seguridad operativa que minimice con eficacia los riesgos francos inherentes al laboratorio para todos los que están expuestos

directa o indirectamente a ellos. Los riesgos potenciales del laboratorio pueden referirse a materiales infecciosos, químicos programa

de

seguridad

para

y a las instalaciones físicas de la institución. Un buen un

laboratorio

debe

abarcar

consideraciones

de

almacenamiento, uso y eliminación de materiales riesgosos químicos y radiactivos, operación y mantenimiento de las instalaciones, capacitación del personal y vigilancia médica.

Debemos destacar que los riesgos de exposición a los agentes infecciosos no se limitan al personal del laboratorio microbiológico.

Aun aquellos laboratorios que no están relacionados con el cultivo e identificación de los organismos patógenos, hay cierto riesgo de infección accidental como consecuencia de que tales bacterias pueden crecer ocasionalmente en sustancias distintas a las patológicas. Los

procedimientos técnicos normales para mantener cultivos estériles o puros e impedir la contaminación de los productos de laboratorio, contribuyen de forma importante a la seguridad de las personas y la mayor parte de los investigadores guardan

normas

razonablemente altas de higiene personal y se lavan las manos después de manejar cultivos

de cualquier clase y antes de tocar el resto de su persona, de manipular sus alimentos o fumar (Collins,1980).

ANTECEDENTES Y CONOCIMIENTOS PREVIOS Clasificación de los agentes biológicos por grupos de riesgo Agente biológico del grupo 1. Aquél que resulta poco probable que cause una enfermedad en el hombre.

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Agente biológico del grupo 2. Aquél que puede causar una enfermedad en el hombre y puede suponer un peligro para los trabajadores, siendo poco probable que se propague a la colectividad y existiendo generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Agente biológico del grupo 3. Aquél que puede causar una enfermedad grave en el hombre y presenta un serio peligro para los trabajadores, con riesgo de que se propague a la colectividad y existiendo frente a él generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Agente biológico del grupo 4. Aquél que, causando una enfermedad grave en el hombre, supone un serio peligro para los trabajadores, con muchas probabilidades de que se propague a la colectividad y sin que exista generalmente frente a él profilaxis o tratamiento eficaz. Niveles de contención La seguridad biológica se fundamenta en tres elementos: 1) Las técnicas de laboratorio 2) El equipo de seguridad (o barreras primarias) 3) El diseño de la instalación (o barreras secundarias). El término “contención” se emplea para describir los métodos que hacen seguro el manejo de materiales infecciosos en el laboratorio. El propósito de la contención es reducir al mínimo la exposición del personal de los laboratorios, otras personas y el entorno a agentes potencialmente peligrosos. Se suelen describir cuatro niveles de contención o de seguridad biológica, que consisten en la combinación, en menor o mayor grado, de los tres elementos de seguridad biológica descritos: técnica microbiológica, equipo de seguridad y diseño de la instalación. Cada combinación está específicamente dirigida al tipo de operaciones que se realizan, las vías de transmisión de los agentes infecciosos y la función o actividad del laboratorio. Nivel de contención 1 Es el nivel de seguridad requerido para los agentes biológicos del grupo 1, es decir, los que no producen enfermedad en el ser humano sano y de susceptibilidad conocida y estable a los antimicrobianos. Es el utilizado habitualmente en los laboratorios de prácticas de universidades o centros docentes donde se emplean cepas no patógenas (E. coli K12, Saccharomyces cerevisiae, etc.). Ejemplos típicos son todos los microorganismos que se utilizan en la industria de la alimentación para la elaboración de quesos, cerveza, embutidos, etc. Nivel de contención 2 Es el obligado para agentes del grupo 2 como algunos que, perteneciendo a la propia flora habitual del hombre, son capaces de originar patología infecciosa humana de gravedad moderada o limitada. Deben ser manipulados por personal especializado (técnicos de laboratorio, especialistas en Microbiología) y son los que con más frecuencia se estudian en el Laboratorio de Microbiología Clínica: estafilococos, Salmonella, etc. Nivel de contención 3

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Debe utilizarse cuando se manipulan agentes biológicos del grupo 3, microorganismos que cursan con patología grave, de difícil y largo tratamiento, que pueden curar con secuelas y ocasionalmente producir la muerte. El mayor y más frecuente peligro que entrañan éstos es la infección adquirida a través de aerosoles y por fluidos biológicos. Por ello, las principales medidas a tomar en este caso son la correcta manipulación y la utilización de cabinas de seguridad. En los laboratorios de Microbiología Clínica los ejemplos más típicos de este tipo de microorganismos son M. tuberculosis, Brucella, Coxiella burneti, etc. Sólo pueden ser procesados por personal calificado y en una zona con la infraestructura apropiada para el Nivel de Contención 3, es decir, con aire acondicionado independiente, sin recirculación de aire, con gradiente de presión, cabinas de bioseguridad, etc. Nivel de contención 4 Nivel requerido cuando se procesa con certeza o se sospecha un agente especialmente patógeno e infectocontagioso, exótico o no, que produce alta mortalidad y para el que no existe tratamiento y/o es poco fiable. Normalmente son microorganismos de dosis infectiva baja y alta contagiosidad. Este nivel también puede utilizarse para trabajar con animales de experimentación infectados por microorganismos del grupo 4. Ejemplos de este nivel son los arenavirus como el que produce la fiebre de Lassa y el virus Machupo, virus Ebola, etc. Además, deben incluirse en este nivel de contención los microorganismos propios del grupo 3 que adquieran propiedades patógenas que los eleven al grupo 4. Un ejemplo sería Mycobacterium boris multirresistente que puede causar fallecimiento por fracaso terapéutico. Los laboratorios que realicen trabajos que impliquen la manipulación de agentes biológicos de los grupos 2, 3 ó 4 con fines de investigación, desarrollo, enseñanza o diagnóstico deberán establecer medidas de contención que se aplicaran según la naturaleza de las actividades, la evaluación del riesgo para los trabajadores y las características del agente biológico de que se trate (Picazo, 2000). Manejo de residuos peligrosos biológico-infecciosos Identificación y envasado En las áreas de generación de los establecimientos generadores, se deberán separar y envasar todos los residuos peligrosos biológico-infecciosos, de acuerdo con sus características físicas y biológicas infecciosas, conforme a la tabla 2 de esta Norma Oficial Mexicana. Durante el envasado, los residuos peligrosos biológico-infecciosos no deberán mezclarse con ningún otro tipo de residuos municipales o peligrosos. Las bolsas deberán ser de polietileno de color rojo translúcido de calibre mínimo 200 y de color amarillo traslúcido de calibre mínimo 300, impermeables y con un contenido de metales pesados de no más de una parte por millón y libres de cloro, además deberán estar marcadas con el símbolo universal de riesgo biológico y la leyenda Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos. Los recipientes de los residuos peligrosos punzocortantes deberán ser rígidos, de polipropileno color rojo, con un contenido de metales pesados de no más de una parte por millón y libres de cloro, que permitan verificar el volumen ocupado en el mismo, resistentes a

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fracturas y pérdidas de contenido al caerse, destructibles por métodos físicos, tener separador de agujas y abertura para depósito, con tapa(s) de ensamble seguro y cierre permanente, deberán contar con la leyenda que indique “RESIDUOS PELIGROSOS PUNZOCORTANTES BIOLOGICO-INFECCIOSOS” y marcados con el símbolo universal de riesgo biológico.

Figura 1. Tabla 2 en la cual se indica la separación de residuos biológico-infecciosos. Los recipientes de los residuos peligrosos líquidos deben ser rígidos, con tapa hermética de polipropileno color rojo o amarillo, con un contenido de metales pesados de no más de una parte por millón y libres de cloro, resistente a fracturas y pérdidas de contenido al caerse, destructible por métodos físicos, deberá contar con la leyenda que indique "RESIDUOS PELIGROSOS LIQUIDOS BIOLOGICO-INFECCIOSOS" y marcados con el símbolo universal de riesgo biológico. OBJETIVO GENERAL 

Explicar y observar las reglas básicas de higiene y seguridad para los laboratorios de microbiología, dada la importancia que éstos tienen.

OBJETIVOS PARTICULARES  

Elaborar un reglamento sobre la seguridad e higiene en el laboratorio de microbiología. Elaborar guías de observación para supervisar el cumplimiento de las normas establecidas.

METODOLOGÍA Parte A. Reglamento Interno del Laboratorio

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1. Elaborar un reglamento interno para el laboratorio, contemplando las normas de seguridad del personal, manejo de reactivos, así como cuidados e higiene dentro de las instalaciones del laboratorio para microbiología. Parte B. Disposiciones Federales 1. Investigar cual es la Norma Oficial Mexicana que establezca los requisitos para la separación, envasado, almacenamiento, recolección, transporte, tratamiento y disposición final de los residuos peligrosos biológico-infecciosos que se generan en establecimientos que prestan atención médica. RESULTADOS Parte A. Reglamento Interno del Laboratorio Propuesta del reglamento de Laboratorio Para el desarrollo de las prácticas es conveniente tener en cuenta algunas normas elementales que deben ser observadas con toda escrupulosidad: 1. Antes de realizar una práctica, debe leerse para adquirir una idea clara de su objetivo, fundamento y técnica. (Los resultados deben ser siempre anotados cuidadosamente apenas se conozcan). 2. Accidentes personales, tales como derrame de reactivos, cortes y quemaduras, deben comunicarse inmediatamente al profesor. 3. El orden y la limpieza son esenciales en todas las experiencias de laboratorio. En consecuencia, al terminar cada práctica se procederá a limpiar cuidadosamente el material que se ha utilizado. Cada grupo de prácticas se responsabilizará de su zona de trabajo y de su material. 4. Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc.) deben mantenerse alejados de las llamas de los mecheros. Si se manejan mecheros de gas se debe tener mucho cuidado de cerrar las llaves de paso al apagar la llama. 5. Cuando no se utilizan los mecheros, éstos deben guardarse y se debe estar seguro que se les ha apagado al final de cada laboratorio. 6. Antes de utilizar un compuesto hay que fijarse en la etiqueta para asegurarse de que es el que se necesita y de los posibles riesgos de su manipulación. 7. Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como lupas y microscopios, deben manejarse con cuidado evitando los golpes o el forzar sus mecanismos. 8. Todos los materiales de desecho que hayan entrado en contacto con microorganismos (como pipetas usadas, placas petri o tubos), deben proceder posteriormente a su esterilización. 9. Utilizar los recipientes adecuados para depositar los residuos peligrosos, biológico infecciosos que se generen en la realización de la práctica. No tirar nada en los lavabos.

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El material de desecho no contaminado como papeles de envoltura depositarlos en los recipientes de basura común. 10. Usar siempre bata en el laboratorio. 11. Nunca deben sustraerse cultivos de microorganismos del laboratorio. 12. Lavarse las manos con jabón o con un desinfectante si es necesario, antes de dejar el laboratorio. 13. Para la hora de llegada se darán 15 minutos de tolerancia. 14. Utilizar zapato cerrado. 15. Nunca se debe trabajar solo. 16. Entrar con el cabello recogido para las personas que lo tengan largo, no traer uñas largas además de no usar rimel. 17. Utilizar, de preferencia, las campanas cuando se vacíen los medios de cultivo. 18. Los medios inoculados deben colocarse en las cámaras de cultivo con su identificación respectiva, ej.: número de mesa, nombre, naturaleza del espécimen o sustrato del cual se aísla 19. Al estar sembrando procurar no hablar, para así evitar cultivos contaminados, además de no caminar alrededor de la mesa para evitar dicha situación. 20. Los tubos de ensayo que contengan medios de cultivos o cultivos de microorganismos, nunca deben abrirse en posición vertical, sino lo más horizontalmente posible (inclinados) y para quitar el tapón se mantendrán inclinados con una mano y se abrirán con la otra, que sostendrá a su vez el asa. Una vez abierto, se flamea por algunos segundos el orificio, repitiendo dicha operación una vez realizada la siembra (el tapón nunca debe dejarse sobre la mesa). 21. Antes de utilizar las asas con hilos de platino que sirven para las siembras, éstas deben flamearse al rojo en posición vertical bajo la acción de la llama; también debe flamearse el mango. Antes de efectuar la siembra debe esperarse algunos segundos a que se enfríen, pudiendo enfriarse también en el borde de la placa de Petri que contiene el medio de cultivo. Inmediatamente después de haberlas utilizado, deben flamearse nuevamente. 22. Cuando se utilice luz ultravioleta debe tomarse en cuenta que la exposición a esta radiación es peligrosa. Parte B. Disposiciones Federales Clasificación de los residuos peligrosos biológico-infecciosos Para efectos de la NOM-087-ECOL-SSA1-2000 se consideran residuos peligrosos biológicoinfecciosos los siguientes: 1. La sangre y los componentes de ésta, sólo en su forma líquida, así como los derivados no comerciales, incluyendo las células progenitoras, hematopoyéticas y las fracciones celulares o acelulares de la sangre resultante (hemoderivados). 2. Los cultivos generados en los procedimientos de diagnóstico e investigación, así como los generados en la producción y control de agentes biológicos.

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3. Utensilios desechables usados para contener, transferir, inocular y mezclar cultivos de agentes infecciosos. 4. Los tejidos, órganos y partes que se remueven durante las necropsias, la cirugía o algún otro tipo de intervención quirúrgica. 5. Las muestras biológicas para análisis químico, microbiológico, citológico e histológico, excluyendo orina y excremento. 6. Los cadáveres y partes de animales que fueron inoculados con agentes enteropatógenos en centros de investigación, bioterios y consultorios veterinarios. 7. Los recipientes desechables que contengan sangre líquida. 8. Los materiales de curación empapados, saturados o goteando sangre o cualquiera de los siguientes fluidos corporales: líquido sinovial, líquido pericárdico, líquido pleural, líquido céfalo-raquídeo o líquido peritoneal. 9. Los materiales desechables que contengan esputo, secreciones pulmonares y cualquier material usado para contener éstos, de pacientes con sospecha o diagnóstico de tuberculosis o de otra enfermedad infecciosa según sea determinado por la Secretaría de Salud mediante memorándum interno o el Boletín Epidemiológico. 10. Los materiales desechables que contengan sangre, o secreciones de pacientes con sospecha o diagnóstico de fiebres hemorrágicas, así como otras enfermedades infecciosas emergentes según sea determinado por la Secretaría de Salud mediante memorándum interno o el Boletín Epidemiológico. 11. Materiales absorbentes utilizados en las jaulas de animales que hayan sido expuestos a patógenos entéricos. 12. Los que han estado en contacto con humanos o animales o sus muestras biológicas durante el diagnóstico y tratamiento, únicamente: tubos capilares, navajas, lancetas, jeringas desechables con aguja, agujas hipodérmicas, de sutura, de acupuntura y para tatuaje, bisturíes y estiletes de catéter, excepto todo material de vidrio roto utilizado en el laboratorio, el cual deberá desinfectar o esterilizar antes de ser dispuesto como residuo municipal. DISCUSIÓN:

CONCLUSIONES:

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BIBLIOGRAFÍA NOM-087-ECOL-SSA1-2000, Protección ambiental – Salud ambiental - Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y especificaciones de manejo. (Ver anexo) Picazo, P. 2000. Procedimientos en Microbiología Clínica. Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica.

Nombre de la práctica: MICROSCOPÍA Y MORFOLOGÍA

Práctica 2

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Realizó: Q.B. Sergio Pacheco Hernández

Revisó:

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Fecha: marzo 2008

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Contenido

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Página

I. INTRODUCCIÓN

2

III. CONOCIMIENTOS PREVIOS

5

II. ANTECEDENTES IV. OBJETIVO

V. METODOLOGIA

V. 1. Material y equipo.

V. 2. Reactivos y soluciones.

V. 3. Requerimientos de seguridad V.4. Disposición de residuos V. 5. Procedimiento.

V. 6. Diseño experimental (si lo hay)

VI. RESULTADOS. VI.1 Cálculos

VII. DISCUSION.

VIII. CONCLUSIONES.

IX. BIBLIOGRAFIA

4

5

6 8 8 8 8 9 9

10

11

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I.

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INTRODUCCION.

Para poder realizar una buena identificación de microorganismos por medio de tinciones requerimos tener un microscopio calibrado y en condiciones óptimas para su uso. El microscopio es un aparato de precisión, hecho de materiales valiosos por obreros expertos. Prestándole un cuidado razonable, dura por mucho tiempo, pero el menor descuido bien puede arruinarlo. El microscopio se debe llevar por su brazo y mientras no se usa, se debe colocar en su caja o taparse adecuadamente para protegerlo contra el polvo. Cuando el microscopio se lleva de una habitación fría a una habitación caliente, se debe permitir que se caliente poco a poco antes de usarse. Las lentes se deben guardar exquisitamente limpias. El polvo se debe aflojar, quitándose con un cepillo de pelo de camello, y la lente se debe limpiar con papel para lentes. El vidrio óptico es por lo general más blando que el vidrio para ventana, y se puede rayar fácilmente por el paño ordinario o cuando las partículas de polvo no se quitan antes de pulir. Hay papel especial para lentes, y es poco económico el no usarlo. Los objetivos secos, el condensador, y los oculares se pueden limpiar con agua destilada cuando es necesario un líquido; un objetivo de inmersión, y la lente superior del condensador, con xileno. La lente no se debe empapar en xileno ni con otro disolvente porque la montura de la lente podría dañarse, si se mete más allá del cierre de la lente anterior en el objetivo. De manipularse desmañadamente o si se deja caer, podría entorpecer con el ajuste de las partes ópticas del microscopio. Así en óptimas condiciones se puede proceder a leer las tinciones preparadas. Tinciones simples • Azul de metileno (Tinción positiva). Permite teñir el interior celular. Tiñe microorganismos procarióticos (vivos o muertos). Los eucarióticos sólo se tiñen si están muertos. Algunas estructuras, como los corpúsculos meta cromáticos, se tiñen más intensamente con este colorante que el resto de la célula. • Nigrosina (Tinción negativa). Se trata de un colorante aniónico, que no penetra en el interior celular. Proporciona una visión de la forma y el tamaño celulares al observarse los microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro. Tinción Simple Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol). El Hidróxido de potasio al 10% (solución de KOH) permite ver elementos de hongos ya que el KOH digiere parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la célula huésped, pero no actúa sobre los polisacáridos de las paredes celulares de los hongos. La tinta china o Nigrosina permite observar células levaduriformes capsuladas Criptococcus, sobre todo en LCR. Los polisacáridos capsulares rechazan la tinta china y la cápsula aparece como un halo claro

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alrededor de los microorganismos. Azul de metileno de Loeffler puede agregarse a las preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de leucocitos. Preparación en fresco o húmeda : para poder observar la movilidad de un microorganismo es preciso que no esté fijado. Consiste en suspender una gota, tomada directamente de la muestra, sobre un portaobjetos y cubriéndola, sin formar burbujas de aire, con un portaobjetos se observa al microscopio de contraste de fases. I. El microscopio, Calibración ANTECEDENTES El microscopio es un instrumento que permite la observación de organismos que no pueden ser apreciados en detalle a simple vista, es decir de los microorganismos. El tipo de microscopio más utilizado es el microscopio óptico, que se sirve de la luz visible para crear una imagen aumentada del objeto. El microscopio óptico más simple es la lente convexa doble con una distancia focal corta. Estas lentes pueden aumentar un objeto hasta 15 veces. Por lo general, se utilizan microscopios compuestos, que disponen de varias lentes con las que se consiguen aumentos mayores. Algunos microscopios ópticos pueden aumentar un objeto por encima de las 2.000 veces. Hay diversos microscopios ópticos para funciones especiales. Uno de ellos es el microscopio estereoscópico, que no es sino un par de microscopios de baja potencia colocados de forma que convergen en el espécimen. Estos instrumentos producen una imagen tridimensional. El microscopio de luz ultravioleta utiliza el rango ultravioleta del espectro luminoso en lugar del rango visible, bien para aumentar la resolución con una longitud de onda menor o para mejorar el detalle absorbiendo selectivamente distintas longitudes de onda de la banda ultravioleta. Dado que el vidrio no transmite las longitudes de onda más cortas de la luz ultravioleta, los elementos ópticos de estos microscopios están hechos con cuarzo, fluorita o sistemas de espejos aluminizados. Además, dado que la radiación ultravioleta es invisible, la imagen se muestra con fosforescencia en fotografía o con un escáner electrónico. El microscopio de luz ultravioleta se utiliza en la investigación científica. El microscopio en campo oscuro utiliza una luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espécimen. El campo de visión del objetivo se encuentra en la zona hueca del cono de luz y sólo recoge la luz que se refleja en el objeto. Por ello, las porciones claras del espécimen aparecen como un fondo oscuro y los objetos minúsculos que se están analizando aparecen como una luz brillante sobre el fondo. Esta forma de iluminación se utiliza para analizar elementos biológicos transparentes y sin manchas, invisibles con iluminación normal. El microscopio de fase ilumina el espécimen con un cono hueco de luz, como en el microscopio en campo oscuro. Sin embargo, en el microscopio de fase el cono de luz es más estrecho y entra en el campo de visión del objetivo, que contiene un dispositivo en forma de

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anillo que reduce la intensidad de la luz y provoca un cambio de fase de un cuarto de la longitud de onda. Este tipo de iluminación provoca variaciones minúsculas en el índice de refracción de un espécimen transparente, haciéndolo visible. Este tipo de microscopio es muy útil a la hora de examinar tejidos vivos, por lo que se utiliza con frecuencia en biología y medicina. Microscopia de campo luminoso En la microscopia de campo luminoso, el campo microscópico está intensamente iluminado y los objetos que se estudian allí aparecen más oscuros. Por lo general, los microscopios de este tipo dan aumentos útiles de unos 1000 diámetros. Poder de resolución Es la capacidad de distinguir dos puntos adyacentes como distintos y separados. El poder de resolución de un microscopio está en función de la longitud de onda de la luz que se usa y de la apertura numérica que es una característica del sistema de lentes que se explica a continuación. Apertura numérica El ángulo  determinado por el eje óptico y los rayos más externos que aún capta el objetivo es una medida de la apertura del objetivo, es la mitad del ángulo de apertura. La magnitud de este ángulo se expresa como un valor seno. El valor seno de la mitad del ángulo de apertura se multiplica por el índice de refracción n del medio que llena el espacio entre el cubreobjetos, y el objetivo de la apertura numérica: AN = nsen El límite de resolución, el objeto más pequeño que pueda verse distintamente, se consigue con la longitud de onda más corta de luz visible y un objetivo que tenga el máximo de AN. Poder de resolución 

longitud de onda de la luz (  ) AN objetivo  AN condensado r

El objeto removible que puede verse con un microscopio típico de luz es de 0.2m. La mayor parte de los microscopios de los laboratorios están equipados con tres objetivos de diferente amplificación cada uno. El grado de amplificación se determina multiplicando el poder de amplificación del objetivo por el del ocular. Regularmente, se usa el ocular que amplifica 10 veces (Pelczar, 1982). Manejo y uso del microscopio óptico compuesto Partes de un microscopio óptico Sistema óptico Ocular: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo.

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Objetivo: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta. Condensador: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación. Diafragma: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. Foco: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador. Sistema mecánico Soporte: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo. Platina: Lugar donde se deposita la preparación. Cabezal: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular. Revólver: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos. Tornillos de enfoque: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que consigue el enfoque correcto. Manejo del microscopio óptico 1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería estar en esas condiciones. 2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas. 3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias. Para realizar el enfoque Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítida la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión. Empleo del objetivo de inmersión Bajar totalmente la platina. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de 40x. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión.

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Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio. Mantenimiento y precauciones Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición de observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda. Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el microscopio. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menos recomendable). En cualquier caso se pasará el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden dañar las lentes y su sujeción. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico, platina, revólver y condensador). El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a través del ocular. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún líquido, secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño humedecido en xilol. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión práctica y, al acabar el curso, encargar a un técnico un ajuste y revisión general de los mismos.

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Iluminacion de Köhler

En microscopia, la iluminación de la muestra es la variable más importante para obtener imágenes de alta calidad. No obstante, con frecuencia la mayoría de los sofisticados y bien equipados microscopios no pueden rendir las imágenes excelentes debido al uso incorrecto de la fuente de luz, que conduce generalmente a la iluminación inadecuada de la muestra. Toda muestra correctamente iluminada debe estar libre de brillo y la luz dispersada uniformemente en el campo visual. Los cambios más importantes en la microscopia surgieron a partir de los comienzos del siglo XX, cuando el gran físico Alemán, el Dr. August Köhler, desarrolló un nuevo sistema de iluminación, que aún hoy en día se maneja y lleva su nombre. Esta es recomendada por todos los fabricantes de los microscopios modernos del laboratorio permitiendo así que el microscopista utilice el microscopio a su capacidad máxima. La iluminación de Köhler es una técnica de iluminación utilizada en la mayoría de los microscopios, que consigue una iluminación uniforme de la muestra y con ello el uso óptimo del microscopio. Los tres objetivos que persigue son: Crear un campo uniforme de iluminación sobre la muestra (donde la muestra está desenfocada). El diafragma de campo, está en el mismo plano de foco que la imagen. El diafragma de campo puede ajustarse de forma que enfoque toda la muestra o únicamente una parte de ésta. La apertura numérica de la fuente luminosa es ajustable (variando la apertura del diafragma), sin que esto afecte al tamaño del campo iluminado (Ramos, 2003). OBJETIVO GENERAL   

Realizar el estudio microscópico de los microorganismos procariotes y eucariotes, además de diferenciarlos. Seleccionar las tinciones adecuadas para la observación de grupos y características específicas de microorganismos. Organizar e interpretar los resultados del estudio microscópico de los microorganismos.

OBJETIVOS PARTICULARES    

Realizar tinciones simples. Utilización de colorantes vitales. Realizar tinciones diferenciales. Realizar la calibración del microscopio.

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MATERIALES Y MÉTODOS Microscopio de campo claro Frotis bacterianos Papel para lentes Diagrama de Flujo Colocar el microscopio en una mesa que permita una cómoda observación a través del ocular. Abrir luz (ni tan amarilla ni tan blanca)

Buscar hexágono en campo así como anillos de Newton

Ajustar la distancia interpupilar así como las dioptrías

Abrir diafragma de iris

Centrar el hexágono

Cerrar diafragma de campo

Bajar condensador

Abrir diafragma de campo para corroborar que hexágono está en el centro

Sólo observar con diafragma de iris y condensador

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a)

b) Figura 1. Mala y buena iluminación para el uso del microscopio (a y b).

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Figura 2. Obtención de una iluminación Köhler. II. Tinciones simples y húmedas Antecedentes Observación microscópica Para observar una muestra al microscopio óptico se puede recurrir a: Preparación húmeda: Se realiza colocando una gota de la suspensión de microorganismos entre un porta y un cubreobjetos, se observa directamente. Preparación fijada: Se coloca una suspensión homogénea de microorganismos en una gota de agua sobre un portaobjetos y se fija mediante calor y agentes químicos. Después se tiñen mediante diferentes técnicas. Estas preparaciones se observan sin cubreobjetos y habitualmente con objetivos de inmersión. Las tinciones pueden ser simples, donde se utilizan un colorante. Se basan en el hecho de que las células tienen una composición química diferentes a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un colorante. El colorante tiñe las células (azul de metileno, safranina o nigrosina). Estudia levaduras, en y se observan cocos en las levaduras. Estas células bacterianas difieren desde el punto de vista químico de su medio exterior y por eso se tiñen contrastando con su alrededor.

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Azul de metileno (Tinción positiva)

Permite teñir el interior celular. Tiñe microorganismos procarióticos vivos o muertos. Los eucarioticos sólo se tiñen si están muertos. Algunas estructuras, como los corpúsculos metacromáticos, se tiñen más intensamente con este colorante que el resto de la célula (Olivas, 2004). Nigrosina, tinción negativa o tinción de cápsula Los organismos procarióticos secretan en su superficie materiales viscosos y pegajosos, suelen ser polisacáridos y otras proteínas. Se le llama cápsula o capa mucosa o glicocálix, material polisacárido alrededor de la célula. La composición de estas capas varían dependiendo de la naturaleza química de cada organismo. Se emplean algunos colorantes como la tinta china, si el glucocálix se deforma, no excluye partículas y es difícil visualizar la llamada capa mucosa. Se ha visto que las bacterias con cápsula resisten mejor la acción de las células fagocitarias del sistema inmunitario. Como las capas de polisacárido retienen gran cantidad de agua, se piensa que el glucocálix puede contribuir a la resistencia y a la desecación. Se trata de un colorante aniónico, que no penetra en el interior celular. Proporciona una visión de la forma y el tamaño celulares al observarse los microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro (Brock, 2002). OBJETIVOS GENERALES 

Realizar el estudio microscópico de los microorganismos procariotas y eucariotas además de su diferenciación

OBJETIVOS PARTICULARES   

Seleccionaran las tinciones adecuadas para la observación de grupos y características específicas de microorganismos. Determinarán microscópicamente las dimensiones de los microorganismos. Organizarán e interpretaran los resultados del estudio microscópico de los microorganismos.

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MATERIALES Y REACTIVOS Portaobjetos Cubreobjetos Asa Mechero Azul de metileno Solucion salina isotónica Nigrosina Procedimiento

Parte A. Preparaciones en fresco 1. En un portaobjetos colocar una gota de la muestra más una gota de solución salina isotónica y luego un cubreobjetos. 2. Observar con objetivo de 10, 20 o 40X. Parte B. Preparaciones teñidas en fresco 1. En un portaobjetos colocar una gota de la muestra más una gota de solución salina isotónica. 2. Agregar una gota de colorante (azul de metileno). 3. Observar a 10, 20 o 40X. Parte C. Tinción Positiva (Frotis Teñido) 1. Poner una gota de agua en el portaobjetos y extender en ella la muestra utilizando el asa de siembra. 2. Parar el portaobjetos varias veces por encima de la llama del mechero sin permitir que llegue a hervir, hasta que se seque. 3. Añadir azul de metileno y esperar 2 minutos 4. Lavar con agua 5. Secar 6. Observar primero en el objetivo 40X, luego se añade aceite de inmersión y se observa con el objetivo 100X. Parte D. Tinción negativa 1. Colocar una gota de Nigrosina sobre uno de los extremos del portaobjetos 2. Extender la muestra en la gota con el asa de siembra. 3. Realizar un frotis con un segundo portaobjetos se extiende la muestra de modo que cubra toda la superficie del primero. 4. Secar al aire 5. Observar primero 40X y luego a 100X con aceite de inmersión

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III. Tinciones Diferenciales ANTECEDENTES Las tinciones diferenciales se denominan así por que son capaces de diferenciar estructuras e incluso microorganismos que poseen características superficiales diferentes. Tinción de Gram Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa. Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas. La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglucano, además de dos clases de ácidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmática, se encuentra el ácido lipoteicoico, y más en la superficie, el ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglucano (también conocido como mureína). Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y lipopolisacárido.

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Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas. La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglicano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea. El primer paso en cualquier tinción debe ser siempre la fijación con calor. Posteriormente el cristal violeta penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas). El lugol está formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual está presente para solubilizar el iodo. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta. La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen. Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules. La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al término del protocolo, las Gram positivas se verán azul-violáceas y las Gram negativas, se verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina). Tinción de ácido-alcohol resistente Se basa en que ciertos microorganismos no son desteñidos por una mezcla de ácido y alcohol si han sido previamente teñidos con fucsina fenicada. Se dice que son microorganismos ácido-alcohol resistentes. Una vez realizada la decoloración con esta mezcla se utiliza un colorante de contraste (el Azul de metileno) para poder observar las células sensibles a la decoloración por ácido-alcohol. Son microorganismos ácido-alcohol resistentes las micobacterias, por la específica composición de su pared celular, y algunos actinomicetos, como Nocardia. Algunos microorganismos patógenos son ácido-alcohol resistentes: Mycobacterimum tuberculosis (tuberculosis), M. leprae (lepra). Las células ácido-alcohol resistentes permanecen teñidas de fucsia, ya que retienen el primer colorante, mientras que las no resistentes se decoloran con el ácido-alcohol y se teñirán de azul con el colorante de contraste.

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MATERIAL Y REACTIVOS

Mechero Asa Portaobjetos Cubreobjetos Vaso de precipitados Tripie Papel filtro Pipeta Paster Pipetas de 1 mL graduada Cultivo bacteriano Violeta cristal Yodo-lugol Etanol al 75 %, etanol al 95 % acetona o alcohol-acetona Safranina Fuscina Azul de metileno Mezcla ácido-alcohol Microscopio Diagrama de Flujo Parte A. Tinción de Gram

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Fijar el frotis: con un mechero flamear el asa y esperar que se enfríe

Enjuagar al chorro delgado de la llave, en la parte superior del portaobjetos

Poner yodo-lugol durante 1 min Enjuagar

Con el asa tomar un poco de muestra

Cubrir la muestra con cristal violeta, durante 1 min

Colocar alcoholacetona 20 seg. Enjuagar y dejar secar

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Depositar la muestra contenida en el asa en un portaobjetos. Extender la muestra

Esperar a que se seque. Flamear con el mechero

Poner safranina 1 min, enjuagar y dejar secar. Observar al microscopio

Parte B. Tinción ácido alcohol-resistente Cubrir con fucsina

Calentar la preparación por 5min con mechero

Decolorar con mezcla ácidoalcohol, 20 seg

Lavar con agua el resto del colorante

No dejar que hierva, añadir más fucsina si es necesario

Lavar con agua

Teñir con azul de metileno, 1min. Enjuagar con agua

Fijar el frotis

Secar y observar al microscopio

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RESULTADOS

Laboratorio de microbiología ABORATORIOExp. Biológica Tinción de Gram positiva

Tinción Gram Negativa

Tinción ácido-alcohol resistente

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IV. Utilización de colorantes vitales. Identificación y descripción de la morfología de bacterias esporuladas y capsuladas ANTECEDENTES Los procedimientos que ponen de manifiesto diferencias entre las células bacterianas o en partes una célula se conoce como técnica de coloraciones diferenciales. Son algo mas que elaboradas que la técnica simple en la que las células se someten a una sola solución colorante o reactivo colorante. Las tinciones se combinan químicamente con el protoplasma bacteriano; si la célula no ha muerto el proceso termina de hacerlo. El método, por consiguiente, es bastante drástico y puede producir artificios. Las tinciones mas frecuente son sales. Las tinciones básicas consisten en un catión coloreado unido a un anión incoloro, mientras las ácidas constituyen exactamente lo contrario, unido a dos cationes. Las células bacterianas son abundantes en ácidos nucleicos, los cuales portan cargas negativas en formas de fosfatos. Los colorantes ácidos no tiñen a las células bacterias, y por tanto, pueden utilizarse para teñir al fondo con un color de contraste. Las tinciones básicas tiñen uniformemente en las células bacterianas, a menos que antes de destruyan el ARN del citoplasma. También se pueden usar técnicas de tinción especiales para flagelos, membranas celulares, paredes celulares, gránulos, nucleótidos y esporas. Tipo de Tinción

Descripción Las bacterias acidorresistentes son las que retiene la carbolficsina, aun cuando intente descolorarlas con un mezcla de Acidorresistente alcohol y ácido clorhídrico. Las bacterias acidorresistentes se tiñen de color rojo; el resto adquiere el color del colorante de contraste en este caso el verde o azul. Este procedimiento consiste en la tinción de fondo con un colorante ácido para dejar las células incoloras en contraste. Negativa Comúnmente se utiliza el colorante negro llamado nigrusína. El método sirve para observar bacterias o estructuras que difícilmente se tiñen con las técnicas directas. Los flagelos son estructuras demasiado finas para poder ser visibles en el microscopio de luz. Sin embargo si se tratan con una suspensión coloidal inestable de sales de ácidos tánico para formar un precipitado denso en la pared celular y en los flagelos, De los flagelos se pueden poner de manifiesto su presencia y disposición en las células. De esta manera el diámetro aparenta que la estructura aumento de tamaño con fuscina básica los hace visibles en el microscopio óptico. La cápsula se pone de manifiesto mediante una coloración Cápsula negativa o una modificación de esta. Uno de los métodos de ´´ tinción de la cápsula ´´ incluye el tratamiento de las bacterias con

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Núcleo Esporas

Gram

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un solución caliente de cristal violeta seguido por un lavado con una solución de sulfato de cobre. El CuSO4 también imparte color al fondo y esto resulta en que la célula y el fondo aparezcan teñido en color azul oscuro mientras la cápsula aparece de color azul pálido. Los núcleos se pueden teñir por la tinción de Feulgen la cual es específica para el ADN. Las esporas se observan de la manera mas simple como cuerpos refringentes intracelulares en suspensiones de bacterias sin teñir, la parte de las esporas relativamente impermeable, las esporas comúnmente se tiñen con verde de malaquita y carbolfucsina o carbolfucsina Una característica taxonómica importante de las bacteria es su respuesta a la tinción a de Gram esta característica parece ser fundamental, reacción a la tinción se correlaciona a con muchas otras propiedades morfológicas en maneras relacionadas filogenéticamente. Microorganismo potencialmente grampositivo puede verse como tal cuando concurren un conjunto de particular de condiciones ambientales en un cultivo joven. El procedimiento para tinción de Gram se inicia con la aplicación de un colorante básico el cristal de violeta. Luego se aplica una solución de yodo en este momento todas las bacterias de tiñen de azul. Continuación las células se tratan con alcohol las células grampósitiva contienen el cristal violeta-yodo y permanecen de color azul; en cambio las gramnegativa se descoloran completamente por el alcohol. Por ultimo se aplican un colorante de contraste safranina, que es un colorante rojo. De esta manera, las células gramnegativas, previamente descoloradas, toman el colorante de contraste y las células grampositivas ahora aparecen púrpura. La base de la reacción diferencial de Gram es la estructura de la pared celular. Esta técnica diferencial es una de las de uso más común en microbiología. El frote bacteriano teñido se somete a las soluciones siguientes en el orden en que se indica: cristal violeta, alcohol y safranina o alguna otra solución de contraste conveniente. Las bacterias gramnegativas contienen un gran porcentaje mas alto de lípidos que de las bacterias grampositivas. Las paredes celulares de la bacterias gramnegativas son también mas delgadas que las grampositivas con alcohol extrae lípidos con lo cual se aumenta la porosidad o permeabilidad de la pared celular gramnegativa. Así el complejo cristal violeta-yodo (CV-I) puede extraerse en los organismos gramnegativos y de esta manera se destiñen las paredes celulares de las bacterias grampositivas, por su composición diferente (bajo contenido lípido) se deshidratan

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alcohol y se logra extraer el complejo (CV-I). En las bacterias (CV-I) queda retenido en la pared después del tratamiento con etanol, la cual se supone se supone causa una disminución de en el diámetro de los poros glucopéptido o péptidoglicano de la pared celular. Las bacterias gramnegativas tienen una cantidad mucho menor de pépidoglicano con ligaduras cruzadas menos extensas que en las paredes de las bacterias grampositivas.

OBJETIVO GENERAL 

Seleccionar las tinciones adecuadas para la observación de grupos y características específicas de microorganismos.

OBJETIVOS PARTICULARES   

Determinar la utilización de colorantes vitales. Identificar y describir a microorganismos por su morfología. Determinar y caracterizar las bacterias esporuladas y capsuladas.

MATERIALES Y REACTIVOS Pipeta de 1 ml. Tubo de ensayo. Placa de petri. Portaobjetos Mechero Equipo de tinción Estufa Microscopio Colorante tinta china Solución verde de malaquita (5%) Solución de safranina (0.5%) Solución salina estéril Medio de cultivo para el microorganismo. Suspensión del microorganismo. Azul de metileno

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METODOLOGÍA

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Parte A. Tinción de Esporas 1. Preparar frotis bacterianos. 2. Teñir con verde de malaquita. Colocar un pedacito de papel filtro encima de la muestra sobre el porta. 3. Añadir el colorante hasta empapar bien el papel filtro. De esta manera se evitara que el colorante salpique y manche toda la zona de trabajo. Con unas pinzas colocar la muestra encima de la llama del mechero de forma que el colorante humee durante 5min. 4. Evitar que la muestra hierva, añadir más colorante si este se evapora: es importante que la muestra no se seque. 5. Lavar con abundante agua el exceso de colorante. 6. Teñir con safranina (1min). 7. Lavar con abundante agua el exceso de colorante. 8. Secar la preparación. 9. Observar la preparación al microscopio. Parte B. Tinción negativa de cápsulas 1. 2. 3. 4.

Seleccionar portaobjetos que estén perfectamente limpios. Tomar unas pocas gotas de los medios de cultivo y depositarlas en sendos portaobjetos. Añadir una gota de tinta china a cada preparación y mezclar bien. Colocar suavemente un cubreobjetos sobre cada suspensión de células con tinta china. Evitar que se formen burbujas. 5. Colocar los portaobjetos con los cubreobjetos entre dos papeles absorbentes. Presionar con los dedos sobre el portaobjetos. El exceso de suspensión será absorbido por los papeles. 6. Tirar el papel de un contenedor para “Material contaminado” y lavarse las manos con jabón desinfectante. 7. Examinar al microscopio; trabajando con el diafragma del condensador cerrado para aumentar el contraste de las células.

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Diagrama de Flujo

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Parte A. Tinción de Esporas

Parte B. Tinción negativa de cápsulas

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RESULTADOS

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DISCUSIÓN DE RESULTADOS

CONCLUSIÓN . BIBLIOGRAFÍA Ramos, E. C. 2003. Manual del laboratorio de instrumentación básica. Universidad Autónoma de Veracruz. Facultad de Bioanálisis. Pelczar, M. 1982. Microbiología. Cuarta edición. McGraw Hill, México, D.F.: 46-47. Brock T. 2002. Biología de los Microorganismos. Editorial Omega. Olivas, Evangelina; Alarcón, Luis. 2004. Manual de prácticas de microbiología Básica y Microbiología de Alimentos. Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. México. Fernández Escartín, Eduardo. 2000. Microbiología e Inocuidad de los alimentos. 1a ed., Universidad Autónoma de Querétaro. México. http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Gram http://microral.wikispaces.com/18.+Bacterias+acido-alcohol+resistentes. http://www.microbiologia.com.ar/bacteriologia/general.php?Mostrar=baar

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Nombre de la práctica:

El manejo de los cultivos puros Realizó: Revisó: Q.B. Sergio Pacheco Hernández Fecha: marzo 2008

Fecha:

Práctica 3

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Páginas 8 Autorizó:

Fecha:

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Páginas de la 1a8

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Laboratorio de microbiología ABORATORIOExp. Biológica Contenido I. INTRODUCCIÓN

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Página 1

II. CONOCIMIENTOS PREVIOS

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IV. METODOLOGIA

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III. OBJETIVO

IV. 1. Materiales.

IV. 2. Requerimientos de seguridad. IV. 3. Disposición de residuos

6

7 7 7

V. RESULTADOS.

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VI. DISCUSION.

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VII. CONCLUSIONES.

VIII. BIBLIOGRAFIA

8

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INTRODUCCION.

Un cultivo puro esta formado de poblaciones de células derivadas de una sola célula. El cultivo puro representa las condiciones artificiales para el desarrollo de las bacterias y otros microorganismos y las condiciones impuestas a los microorganismos mediante el manejo de laboratorio. Existen diferentes técnicas por medio de las cuales las diferentes especies en una muestra natural pueden ser aisladas y desarrollarse como cultivo puro.

II. ANTECEDENTES Esterilización significa dejar libre de microorganismos y es un proceso útil para desarrollar sólo las poblaciones de microorganismos que se desean. Los procesos que se utilizan para esterilizar son los que se ilustran en el siguiente diagrama:

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Para comprobar que el proceso de esterilización se efectúo de manera correcta, se recurre a uso de Indicadores biológicos como el Bacillus Estereotehermophylus o se incuban cajas petri con medio de cultivo para métodos estándar a 37°C por 24-48hr después de su esterilización. Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuada, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes. El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él. La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes. También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram-positivas).

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III. CONOCIMIENTOS PREVIOS.

1. ¿Cómo debemos de preparar un medio de cultivo? 2. ¿Cuáles son los principales componentes de los medios de cultivo? 3. ¿Qué procedimientos de esterilización debo de emplear para esterilizar un medio de cultivo?. 4. ¿Cuáles son las formas de cultivar para lograr un buen aislamiento y obtener un cultivo puro?

IV. OBJETIVO GENERAL 

Realizar una buena preparación de material microbiológico, así como elaboración de cultivos puros.

IV.1 OBJETIVOS PARTICULARES      

Cultivaran y conservaran adecuadamente cepas puras de bacterias y hongos. Prepararan material de vidrio y medios de cultivos de uso común en el laboratorio de microbiología. Seleccionaran adecuadamente los medios de cultivo y métodos de esterilización para algunos de los casos más frecuentes en el laboratorio de microbiología. Cultivaran en diversos medios de cultivo, mediante diferentes técnicas de inoculación e incubación a las bacterias aerobias, anaerobias y hongos. Organizaran e interpretaran las características morfológicas macroscópicas y microscópicas de diversos microorganismos. Conservaran adecuadamente, por el resto del curso a algunos cultivos puros.

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V. MATERIALES Y REACTIVOS Autoclave u olla de presión Agar para métodos estándar Cajas petri de vidrio Matraces Erlenmeyer Pipetas Mecheros Espátulas Algodón Papel de estraza VI. METODOLOGÍA

Parte A. Esterilización del Material en autoclave 1. Preparación del material de vidrio a esterilizar. 2. Envolver todo material en papel de estraza. 3. Antes de envolver las pipetas, colocarles una pequeña torunda de algodón en la parte superior de estas. 4. Los tubos de ensaye con rosco, no necesitan ser envueltos, sólo hay que cerrarlos sin apretar. 5. El material no debe de tocar el agua, ni estar cerca de las paredes de la autoclave o la olla de presión. Parte B. Esterilización de material en olla de presión 1. Colocar agua hasta poco antes de la rejilla que se encuentra hasta el fondo. 2. Colocar el material a esterilizar y los medios de cultivo preparados, evitando que el papel se moje, que el material toque las paredes de la olla, y que el material esté muy encimado. 3. Cuando esté listo todo el material, se coloca la tapadera y se espera a que salga en forma constante vapor por la válvula, cuando esto suceda, colocar la perilla que cubre la válvula y esperar a que llegue a una presión de 15lb. 4. Una ves que llegue a la presión de 15lb, se debe mantener así por 15min. 5. Cuando transcurra el tiempo indicado, se debe esperar que la olla enfrie y que el material esté a temperatura ambiente. 6. Llenar las cajas petri con aprox. 20 ml de agar, en un ambiente estéril. 7. Almacenar el material, en caso de no usarse de inmediato. 8. Para verificar que el material y los medios de cultivo están estériles, se puede utilizar un indicador biológico o incubar una porción de los medios de cultivo por 24hr. 9. Observar si existe crecimiento microbiano.

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Parte C. Preparación del medio de cultivo

1. Pesar en un matraz Erlenmeyer la cantidad de agar que señala el producto, de acuerdo a la cantidad de medio que se requiera. 2. Disolver con agua destilada. 3. Colocar en la boca del matraz una torunda de algodón y un capuchón de papel de estraza. 4. Calentar hasta ebullición. 5. Meter a la autoclave u olla de presión. Diagrama de Flujo

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VII. RESULTADOS

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Selección de medios de cultivo Antecedentes Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Estos medios son esenciales en el Laboratorio de Microbiología por lo que un control en su fabricación, preparación, conservación y uso, asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos. En los laboratorios de microbiología se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser preparados en forma líquida o en forma sólida. Usualmente para preparar un medio sólido se parte de un medio líquido al que se le añade un agente solidificante como el agar, la gelatina o la sílicagel. Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de sus constituyentes en: a) Medios naturales o complejos: constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal, las que son usualmente complementadas por la adición de minerales y otras sustancias. En ellos no se conocen todos los componentes ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos. b) Medios definidos o sintéticos: son los medios que tienen una composición química definida cuali y cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigación. De acuerdo al uso del medio de cultivo, éstos se clasifican en:

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c) Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en particular. Permiten aumentar el número de microorganismos de ese tipo. Usualmente contienen una o más sustancias inhibidoras del crecimiento de los microorganismos con excepción de los que se quieren cultivar. d) Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios sólidos y están diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos. e) Medios diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos derivados de la actividad microbiana de los microorganismos. No contienen ningún tipo de sustancia con actividad antimicrobiana. Permiten revelar características fisiológicas de los microorganismos. Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes básicos o por simple rehidratación de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, además de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles. Recomendaciones Para su preparación se deben tener en cuenta los siguientes aspectos: 1. Prepararlos sólo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores que suministren productos de calidad. 2. Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiológica y fisicoquímica adecuada. 3. Utilizar material de vidrio bien lavado y enjuagado con agua destilada o desmineralizada. 4. Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilización. 5. Nunca se deben exceder las condiciones señaladas por el fabricante. Material y Reactivo Cajas petri Agar selectivo (dependiendo del MO que se desee aislar) Mecheros Olla de presión Asa para sembrar Metodología Parte A. Selección del microorganismo 1. Seleccionar el Microorganismo que se desea aislar. 2. Investigar las necesidades y requerimientos para su desarrollo, así como el medio de cultivo en el que se da dicho desarrollo.

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3. 4. 5. 6. 7.

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Preparar el material y el medio de cultivo que se utilizará. Esterilizar todo el material a usar. Llenar cajas petri con 20ml de medio de cultivo en ambiente estéril. Aislar el microorganismo de su habitad natural. Con un asa de platino y en un lugar estéril inocular el microorganismo en las cajas petri estérles. 8. Incubar en el ambiente requerido por el microorgnismo. Diagrama de Flujo

RESULTADOS

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VERIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS

LA

EFICACIA

DE

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ESTERILIZACIÓN:

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RECUENTO

DE

ANTECEDENTES El crecimiento de una población bacteriana puede ser entendido desde diferentes perspectivas y de acuerdo a éstas se puede llegar a determinar la medida del crecimiento mediante diversas metodologías, que se dividen en dos principalmente: Métodos directos Recuento microscópico Recuento electrónico Métodos indirectos Medida de la biomasa Determinación de ácidos nucleícos Determinación de nitrógeno Incorporación de precursores radiactivos Medida de consumo de nutrientes o de producción de algún metabolito por unidad de tiempo Dispersión de la luz, turbidimetría. Medida de consumo de nutrientes o producción de algún metabolito por unidad de tiempo Ejemplo: Consumo de oxígeno (QO2) y consumo de carbónico (QCO2), determinados por el respirómetro de Warburg. Producción de ácidos. El respirometro de Warburg (1926) usado extensivamente por Don Bloodgood en la universidad de Purdue y por H. Huekelekian en la universidad de Rutgers fué una modificación del " manómetro de sangre-gas" desarrollado por Haldane y Barcroft (1902). El trabajo pionero de Sawyer, de Nichols y de Rohlich (1939) en el estudio y el desarrollo de las curvas de la utilización del oxígeno en lodos activados, fue hecho usando los dispositivos manométricos que ellos desarrollaron para satisfacer su necesidad de utilizar muestras más grandes y de sistemas mas herméticos - Estos sistemas, sin embargo, requerían la adición manual de aire atmosférico para suplir el oxígeno. Analistas expertos eran necesarios para funcionar y vigilar visualmente las lecturas del manómetro. La interpretación era aburrida y dispendiosa ya que no existían aparatos automatizados para la manipulación de los datos. John W. Clark en la universidad de estado de nuevo México a fines de los años 50 desarrolló y reportó un dispositivo en el cual el oxígeno fue generado por una pila electrolítica, que también funcionó como un manómetro, asociado a un reactor cerrado. Cuando el dispositivo es accionado por la reducción de la presión en el recipiente de la prueba causado por el retiro químico del CO2 generado por la respiración bacteriana, el oxígeno fue producido por

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una corriente controlada de corriente continua. El valor integrado de la corriente proporcionó una indicación del oxígeno consumido. Una de las primeras aplicaciones de aparato VoithSapromat (desarrollado por Popel en 1964) fue un procedimiento manual para evaluar el efecto de varios deshechos en degradación de la peptona. Liebmann y Offhaus también colaboraron en procedimientos para determinar la DBO5 y la toxicidad de algunos elementos en el agua.

Figura 3. Botella respirométrica El Método Respirométrico, para la determinación de la DBO5 se basa en medir el consumo de oxígeno, o la producción de CO2, en una Botella Respirométrica. Este objetivo se logra entre otras formas (Método Manométrico) midiendo la variación de la presión en la botella, mediante un manómetro lo suficientemente sensible. Otros métodos respirométricos propiamente dichos miden la producción de CO2 u otros gases como Metano, Anhídrido Sulfhídrico, etc. dentro de la botella. En el Método Clásico, para la determinación de la DBO5, se calcula la diferencia entre el Oxígeno Disuelto en la muestra o en una dilución de la misma, entre el día 0 y el día 5. Este método tiene muchas limitaciones, siendo una de las principales la pequeña cantidad de oxígeno disponible en la muestra. Usualmente unos 10 mg/lt a nivel del mar, y menos de 7 mg/Lt a nivel de Bogotá (2540 m.s.n.m.). Si tenemos en cuenta que la muestra deberá terminar la prueba con al menos 1 mg/Lt, (algunas normas especifican terminar con al menos 2 mg/Lt) se observa que el oxígeno total disponible para la prueba será alrededor de 5 mg/Lt. En el supuesto caso de que se trabajase con Botellas de 0.5 Lt de capacidad, la cantidad absoluta de oxígeno disponible sería de tan solo 2.5 mg. En la mayoría de los Laboratorios usualmente se trabaja con Botellas de 300 ml., lo cual disminuye aun más la cantidad de oxígeno disponible para la prueba. Esta pequeña cantidad a determinar hace que pequeños errores en la manipulación de la prueba produzcan grandes diferencias (errores) en el resultado.

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En el método Respirométrico, trabajando con botellas de 1 lt de capacidad, llenas con medio litro de muestra o dilución de muestra, se cuenta hasta con 125 mg de Oxígeno, contenidos en el aire presente en la cámara superior de la botella. Y se puede contar aun con mayor cantidad de oxígeno en caso de trabajar con volúmenes inferiores de muestra. En este caso, el oxígeno disuelto, fuere cual fuere su contenido inicial en la muestra (exceptuando muestras altamente sobresaturadas) no tiene casi incidencia en el resultado. Por lo general esta por debajo de 2.5 mg frente a los 125 mg presentes en la cámara superior. Esto es un error máximo del 2 %. Absorción del CO2 En el método llamado método manométrico, se mide el vacío creado por el consumo de oxígeno causado por la muestra. Para que el método basado en la medición manométrica del vacío causado en la botella funcione adecuadamente es necesario absorber el CO2 formado de alguna manera. De lo contrario no habría cambio de presión en las botellas ya que el volúmen de CO 2 producido podría ser igual o casi igual al volúmen de Oxígeno consumido. La absorción del CO2 puede hacerse de varias maneras. 1. Adecuando el poder buffer de la solución en ensayo para absorber la totalidad del CO2, en forma de Bicarbonato disuelto en el líquido y 2. Absorbiendo el CO2 mediante algún hidróxido alcalino en un recipiente apropiado en contacto con la fase gaseosa de la botella. En el presente artículo analizaremos ambas opciones aunque en principio consideramos que adecuar el poder buffer de la solución de ensayo es especialmente adecuado para la determinación de la Demanda Bioquímica de Oxígeno en 5 días en aguas y el método de absorber el CO2 en un recipiente con reactivos especiales insertos en la botella respirométrica es mas adecuado para la determinación de la respiración en muestras sólidas como suelos, deshechos orgánicos, lodos secos etc. Capacidad de absorción de CO2 del sistema difosfato-monofosfato La cantidad de CO2 producida en el método respirométrico, al igual que la cantidad de oxígeno consumida, es relativamente más grande que la producida en el método clásico. Esto requiere entonces de una adecuación del poder buffer de la solución de ensayo. Para adecuar el poder buffer de la solución de ensayo a las nuevas condiciones es necesario conocer la capacidad de absorción del CO2 del sistema Difosfato-Monofosfato dentro del rango de pH permisible o compatible con un crecimiento adecuado de los microorganismos presentes en la muestra en ensayo. Como base teórica para la absorción del CO2 dentro del sistema tenemos la siguiente ecuación: Na2HPO4 + CO2 + H2O -------------> NaHCO3 + NaH2PO4 (1) De acuerdo con la anterior reacción 142 mg de Fosfato Disódico anhidro absorberían 44 mg de CO2.

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La anterior reacción es reversible y a medida que procede hacia la derecha se va reduciendo el pH del medio de tal manera que esta misma condición paraliza el desarrollo de la reacción en un punto intermedio de la transformación del Fosfato Disódico en Fosfato Monosódico. Creemos que no todo el Fosfato Disódico logra transformase en Fosfato Monosódico. Para saber que tanto CO2 logra capturar una solución de Fosfato Disódico se llevó a cabo el siguiente experimento: Se preparó una solución de Fosfato Monosódico (NaH 2PO4.H2O) de 2 gr/Lt. Se tituló con NaOH 0.1 N hasta viraje incipiente de la Fenolftaleina (Aproximadamente pH = 8.5-9.0). En este punto la solución se saturó con CO2 permitiendo así que se desarrolle la reacción (1) en la mayor extensión posible. Acto seguido se expulsó el CO2 libre mediante agitación y barrido con aire. Después se tituló en reversa con NaOH 0.1 N nuevamente hasta viraje incipiente de la fenolftaleina. Se considera que la cantidad de CO2 fijado por el sistema es directamente proporcional a la cantidad de NaOH consumida en la segunda titulación. Los datos del ensayo fueron los siguientes: Titulación del Fosfato Monosódico Alícuota de solución de Fosfato Monosódico = 25 ml Cantidad de NaOH 0.1 N usado en la titulación inicial = 3.65 ml Esta cantidad coincide casi exactamente con la cantidad teórica necesaria para la transformación de todo el Fosfato Monosódico en Fosfato Disódico según la ecuación siguiente: NaH2PO4 + NaOH -------------------> Na2HPO4 + H2O Fijación de CO2 Alícuota de solución de Fosfato Monosódico = 50 ml Cantidad de NaOH 0.1 N usado en la titulación inicial = 7.2 ml Saturación con CO2 y eliminación del Sobrante con Aire. Titulación en reversa con NaOH 0.1 N = 4.5 ml De acuerdo con la ecuación: NaOH + CO2 --------> NaHCO3 40 gr de NaOH neutralizan 44 gr de CO2 Entonces 4.5 ml de NaOH 0.1 N neutralizarán 4.5 x 4 x 44/40 = 19.8 mg de CO 2

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Lo cual quiere decir que los 100 mg de Fosfato Monosódico (50 ml de solución de NaH2PO4*H2O de 2 gr/lt) utilizados, equivalentes a 87 mg de Fosfato Monosódico Anhidro y transformados en 102.9 mg de Fosfato Disódico anhidro tienen capacidad para absorber 19.8 mg de CO2 transformándolo en Bicarbonato de Sodio. Al comparar el resultado teórico según la ecuación (1) con la cantidad resultante de este último ensayo se hace evidente que no todo el Fosfato disódico utilizado inicialmente logra transformarse en Fosfato Monosódico. En consecuencia, la cantidad de Fosfato Disódico que se debe utilizar como Buffer en la prueba respirométrica deberá ser de como mínimo de 102.9 mg por cada 19.8 mg de CO2. Absorcion del CO2 en recipiente aparte inserto en la botella con hidróxido de sodio Esta forma de absorber los gases también funciona adecuadamente y consiste en colocar en la cámara de aire encima del líquido, un recipiente perforado, en el cual se coloca hidróxido de sodio como material absorbente para el CO2. Este material absorbe rápidamente el CO2 producido. Se ha observado que la botella requiere algo de agitación para la adecuada y rápida absorción del CO2. De lo contrario la difusión del CO2 desde la parte inferior de la botella hacia el recipiente de absorción puede resultar demasiado lenta. Para la Absorción se debe tener en cuenta la siguiente ecuación: 2 NaOH + CO2 -----------> Na2CO3 + H2O Así que 80 gr de NaOH absorberán 44 gr de CO2 Para una botella respirométrica de 1105 ml de capacidad, llena de CO 2 puro a 20 °C, se requieren 1.105x0.8878x80/44 = 1.784 gr de NaOH y para una Botella normal con medio litro de muestra, suponiendo que se agotara completamente el oxígeno de la cámara y que se generan 125 x 44/32 = 171.8 mg de CO2 se requieren 171.8 x 80/44 = 312 mg de NaOH. En la práctica se recomienda colocar 1 gr de NaOH. Dispersión de Luz Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partícula en suspensión, parte de la luz es reflejada, parte es diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida. La nefelometría mide la luz dispersada por una solución de partículas. La turbidimetría mide la luz dispersada como un decrecimiento de la luz transmitida a través de la solución. En relación a la longitud de onda y al tamaño de la partícula pueden existir tres tipos de dispersión. Los métodos de dispersión de la luz son las técnicas más utilizadas para monitorear el crecimiento de los cultivos bacterianos. Son muy útiles y poderosos pero pueden llevar a resultados erróneos. Principalmente, dan información sobre el peso seco (contenido macromolecular). Turbidimetría La turbidimetría mide la reducción de la transmisión de luz debido a partículas de una suspensión y cuantifica la luz residual transmitida.

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Estudios teóricos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de diferentes tipos de bacterias, independientemente del tamaño celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentración de peso seco. Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamaño celular del microorganismo. Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes por partícula o por UFC (Unidad Formadora de Colonia) cuando los tamaños de las células bacterianas son diferentes. Por esta razón, para estimar el número de microorganismos totales o el número de microorganismos viables de una suspensión bacteriana debe realizarse una "curva de calibración" con cada tipo de microorganismo, sólo de esta forma es posible relacionar Absorbancia (Densidad Óptica) con el número de microorganismos totales o con UFC.

Figura 4. Absorbancia en función del Peso Seco. Absorbancia = K x Peso Seco K: constante que varía con la longitud de onda utilizada y representa la inversa del peso seco del microorganismo que produce un aumento de 10 veces en el valor de la absorbancia (1/W 0). Peso seco: Concentración celular bacteriana expresada en unidades de peso seco (µg/mlmg/ml).

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Figura 5. Absorbancia en función del Peso Seco. La relación directa entre la absorbancia y el peso seco sólo se aplica para suspensiones diluidas de bacterias. Estas suspensiones no deben tener una absorbancia mayor a 0.3, ya que valores mayores producen desviaciones de la ley de Beer. Sin embargo, el inconveniente de utilizar suspensiones diluidas puede involucrar un mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por el bajo nivel de absorción.

Figura 6. Absorbancia en función del Número de Microorganismos Totales. En estos gráficos se puede apreciar que suspensiones diluidas de dos microorganismos diferentes con igual peso seco tienen la misma absorbancia, mientras que para el mismo número de microorganismos totales la absorbancia de cada suspensión es distinta.

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CULTIVO PURO DE MICROORGANISMOS ANTECEDENTES

Luego que se ha preparado un medio de cultivo puede ser inoculado, e incubado, cubriendo las condiciones adecuadas para favorecer el crecimiento de un cultivo axénico o puro, es decir, de un cultivo que contiene sólo un tipo de microorganismos, para obtener y mantener un cultivo axénico o puro es esencial la evitar la entrada en el de otros microorganismos, de esta manera se han diseñado técnicas microbiológicas para evitarlos. Un método importante para obtener y asegurar la pureza de un cultivo es el uso de medios sólidos en placas de Petri. Los medios de cultivo se preparan con frecuencia en forma semisólida o sólida mediante la adición al medio líquido de un agente solidificante, como agar agar. Los medios sólidos aseguran que las células se inmovilizan, y les permiten crecer y formar masas aisladas visibles que son llamadas colonias, estas pueden ser de forma y tamaño variable dependiendo del organismo, las condiciones del cultivo y el suministro de nutrientes y de otros parámetros fisiológicos. Algunas bacterias pueden producir pigmentos que dan color a las colonias, y hacen fácil su distinción, la observación de las colonias permiten reconocer la pureza del cultivo, las placas que contengan más de un tipo de colonia no fueron sembradas con un cultivo axénico o puro, las placas Petri se usan como un criterio para establecer la pureza en los cultivos de microorganismos. Técnicas de inoculación para la obtención de cultivos puros Los microorganismos crecen en poblaciones mixtas y complejas que contienen varias especies. Esto presenta un problema pues no se puede estudiar adecuadamente un único tipo de microorganismo en un medio mixto. Se necesita un cultivo puro, es decir, una población de células que procede de una única célula, para caracterizar una especie individual. Por esta razón es imprescindible recurrir a métodos de laboratorio que permitan y aseguren la obtención de cultivos axénicos o puros. Técnica aséptica Puesto que los microorganismos son ubicuos, los medios de cultivo deben ser esterilizados antes de usarse. Una vez preparado un medio de cultivo estéril, se puede inocular un cultivo puro y cultivarlo nuevamente. Esto requiere el uso de la técnica aséptica. Esta técnica consiste en una serie de procedimientos que evitan la contaminación durante la manipulación de los cultivos y de los medios de cultivo estériles. Cuando las placas o tubos se abren deben manejarse de tal modo que los contaminantes del aire no penetren. La transferencia aséptica de un cultivo desde un tubo con medio a otro, se realiza habitualmente con el asa o aguja de siembra previamente esterilizada a la llama por incandescencia. Los cultivos en los que ha habido crecimiento se pueden transferir luego a la superficie de placas con agar, donde se desarrollaran colonias. La toma y resiembra por extensión de una colonia aislada

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CLAVE 591

Prerequisito 724

es un método idóneo para obtener cultivos axénicos o puros a partir de mezclas complejas que contienen muchos microorganismos diferentes. Siembra en profundidad Esto puede emplearse tanto con bacterias y hongos, ya que puede generar colonias aisladas. La muestra original se diluye varias veces para reducir la población microbiana lo suficiente, con el fin de obtener colonias separadas cuando se siembren, en seguida se mezclan volúmenes pequeños de varias muestras diluidas con agar líquido, enfriado hasta aproximadamente 45 centígrados, la mezcla se vierte en seguida en placas de cultivo estéril. La mayoría de las bacterias y hongos no se destruye con una exposición breve al agar caliente. Se deja solidificar el agar, cada célula se fija a un lugar y se forma una colonia individual. El número total de colonias equivale al número de microorganismos viables en la muestra diluida. Las colonias que crecen en la superficie pueden usarse para inocular un medio fresco, es decir, puede recurrirse a la resiembra para la preparación de cultivos puros. Siembra en placa por extensión y en estrías Si se extiende una mezcla de células en la superficie de una placa con agar, de forma que se busque que cada célula crezca formando una colonia independiente, es decir, una formación o agrupación microscópicamente visible de microorganismos en un medio sólido, cada colonia representa un cultivo puro. La siembra por extensión es una forma directa, además de fácil de conseguir este resultado. Se coloca un volumen pequeño de una mezcla microbiana diluida conteniendo alrededor de 100 y 200 células, o menos, al centro de una placa de agar y se extiende uniformemente sobre la superficie con una varilla doblada de vidrio estéril. Las células dispersadas desarrollan colonias aisladas. Las colonias puras también se pueden obtener mediante siembra en estrías. Se pasa la mezcla microbiana a un extremo de la placa de agar con un asa de inoculación o un hisopo y se extiende formando estrías sobre la superficie. En algún punto de este procedimiento, algunas células individuales se desprenden del asa al frotarlas sobre la superficie y desarrollan colonias separadas. Un buen aislamiento depende de la separación adecuada de las células individuales. OBJETIVO GENERAL 

Realizar y mantener cultivos puros de un microorganismo aislado.

OBJETIVOS PARTICULARES   

Cultivaran y conservaran adecuadamente cepas puras de bacterias. Cultivaran en diversos medios de cultivo, mediante diferentes técnicas de inoculación e incubación a las bacterias aerobias y anaerobias. Conservaran adecuadamente, por el resto del curso a algunos cultivos puros.

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MATERIAL Y REACTIVO

Autoclave u olla de presión Agar para métodos estándar Cajas petri de vidrio Matraces Erlenmeyer Mecheros Espátulas Algodón Papel de estraza METODOLOGÍA Parte A. Cultivo Puro 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Preparar el volumen de Agar necesario como se indica en el frasco Calentar el agar hasta que hierva, esterilizar por 15 minutos a 121 ºC y 15 libras Dejar enfriar un poco el agar y verter en la caja Petri, estando en la zona estéril. Esterilizar el asa de inoculación en la flama del mechero Acercar el cultivo previo o la mezcla a la zona estéril, cuidar de no contaminar Tomar un inoculo con el asa esterilizada Colocar la mezcla microbiana en un extremo de la caja Petri y extender sobre la superficie formando estrías abiertas 8. Incubar durante 24 horas a 37 ºC, observar la formación de colonias independientes

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RESULTADOS

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CONSERVACIÓN DE CULTIVOS PUROS ANTECEDENTES

EI éxito en la preservación de los cultivos microbianos es esencial para las actividades de investigación o industriales basadas en la actuaci6n de estos microorganismos. Las cepas valiosas se tienen que conservar durante largos periodos de tiempo libres de cambios fenotípicos adversos. Además, y tomando como ejemplo los procesos de elaboración de alimentos fermentados donde participan cultivos microbianos, nos encontramos con que el éxito de la producción depende principalmente y directamente de las técnicas de procesamiento utilizadas, pero lo que permite estandarizar y mantener una calidad uniforme del producto final es en una gran parte la correcta selecci6n, conservación, manipulación y resiembra o propagación de los cultivos. La elecci6n del método de conservaci6n utilizado debe permitir mantener las características del microorganismo por las cuales fue seleccionado. En la industria alimentaria los cultivos microbianos se guardan en pequeñas cantidades conocidas como Gu/tivQS de reserva. Cuando se reactivan para su utilización industrial, se tienen que utilizar sistemas de siembra a gran escala con el objetivo de obtener el volumen necesario para inocular los fermentadores de producción. Un cultivo de aplicaci6n industrial tiene que reunir unas determinadas características: Contener el máximo número de células viables. Estar libre de contaminantes. Ser activo en las condiciones de procesamiento. Par esta razón el mantenimiento de cultivos es extremadamente importante. No existe un método universal para mantener los cultivos de microorganismos. La selecci6n del método tiene que basarse en la naturaleza del cultivo y en las ventajas e inconvenientes del método escogido. Si el microorganismo aun no se conoce del todo es aconsejable utilizar varios métodos de conservaci6n. Los cultivos de microorganismos se siembran en medios estériles y en condiciones de asepsia, y se mantienen activos aplicando alguno de los siguientes métodos: 1. Reduciendo o controlando su actividad metabólica a través de la refrigeración. Este método solo es aplicable durante periodos cortos de almacenaje (por ejemplo en medios líquidos o tubos inclinados de Agar nutritivo). 2. Conservación mediante Congelación Deshidrataci6n Normalmente se concentran o se separan de los productos residuales de su metabolismo, a continuaci6n se resuspenden en medio estéril y se procede a la etapa final de conservaci6n por alguno de los dos métodos mencionados. Este sistema permite mantener los cultivos durante largos periodos de tiempo y la viabilidad de los cultivos conservados depende de:

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EI medio de cultivo base. EI método de concentración. La rápida eliminaci6n de metabolitos. La naturaleza del medio de suspensi6n. Las condiciones de deshidrataci6n 0 congelaci6n. La presencia de agentes crioprotectores (en la congelaci6n). La velocidad de descongelaci6n (en el caso de cultivos congelados).

Conservación en refrigeración EI objetivo general de la refrigeraci6n es incrementar la vida útil de los cultivos, y en consecuencia incrementar sus posibilidades de conservación. Generalmente hace falta hacer resiembras en medio fresco a intervalos regulares. Es un procedimiento laborioso y que consume mucho tiempo. El intervalo entre las transferencias depende de la temperatura y la humedad de almacenamiento. Los tubos de cultivos almacenados en contenedores que no permiten la perdida de humedad pero si el intercambio de gases, a una temperatura entre 5-8°C necesitan transferencias cada 6-8 meses. Las condiciones que permiten que se de una deshidrataci6n rápida del cultivo requieren intervalos de transferencia mas cortos.

Conservación por congelación La congelación se puede emplear como método de conservación de cultivos bacterianos, por ejemplo, para la elaboración de productos fermentados. La mayor tasa de destrucción bacteriana se observa inmediatamente tras la congelación, después se reduce notablemente y lIega a estabilizarse durante largos periodos de tiempo. Por eso, aunque el número de supervivientes disminuya, la congelación es un método efectivo para mantener la viabilidad de las bacterias. Cuanto menor sea la temperatura de almacenamiento, mayor será la supervivencia de las bacterias. Para conseguir una mínima destrucción de las bacterias interesa que la cristalización sea extracelular y que las bacterias se deshidraten parcialmente impidiéndose la nucleación intracelular, pero no lo suficiente como para que se reduzca su viabilidad. En los medios suelen incluirse, además, agentes crioprotectores (glicerol, clara de huevo, leche, etc.). EI principal problema del mantenimiento de microorganismos a temperaturas por debajo del punta de congelación es la muerte durante los procesos de congelaci6n y descongelaci6n. Si los microorganismos pueden sobrevivir a temperaturas del orden o por debajo de -20°C seguidas de un recalentamiento rápido hasta la temperatura ambiente es posible conservarlos congelados. La supervivencia de los microorganismos a los procesos de congelación y descongelación depende de (1) el numero inicial de células viables; (2) la tasa de congelaci6n y descongelaci6n; (3) la temperatura de congelación y almacenamiento (de 0 a -20°C son mas destructivas que