Manual de Microbiologia UST.pdf

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

PORTAFOLIO EVIDENCIAS

2016 PORTAFOLIO EVIDENCIAS MANUAL MICROBIOLOGÍA APLICADA AL LABORATORIO

TM Carolina Sepúlveda B. TM Valeska Troncoso O. Revisado por TM Benjamín Riveros C. Coordinador Nacional TNS LABI

1

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Indice Página 

Introducción

5



Bioseguridad en el Laboratorio de Microbiología

6



Métodos de Desinfección y Esterilización

16



Niveles de Acción de los Desinfectantes

21



Esterilización

30



Trabajo Personal del Estudiante “Bioseguridad en el Laboratorio de Microbiología”

35



Microbiología

48



Trabajo Personal del Estudiante “Microbiología: Morfología Bacteriana”

55



Medios de Cultivo

65



Mantención y Preparación de los Medios de Cultivo

68



Esterilización de los Medios de Cultivo

70



Medios Usados en la Identificación Bioquímica de Enterobacterias

76



Pruebas Especiales para la Identificación Bacteriana

79



Clasificación de las Bacterias

81



Trabajo Personal del Estudiante “Microbiología: Medios de Cultivo”

84



Conceptos Generales de Salud

92



Muestras Microbiológicas

96



Siembras de Muestras

97



Siembra Muestras de Orina Aséptica

98



Siembra Muestra de Herida

99



Siembra Muestras Respiratorias

99



Muestra para Estudio de Koch

101

2

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Página 

Muestra Deposición

103



Muestra Secreciones

104



Muestra Sangre

104



Muestra Secreción Uretral

105



Muestra Líquidos

105



Estudio de Anaerobios

106



Etapas de Realización de un Frotis para Tinción

107



Realización y Estudio de Antibiogramas

109



Trabajo Personal del Estudiante “Microbiología: Muestras Microbiológicas y su Diagnóstico Procedimental”

111



Parasitología

120



Clasificación de los Parásitos

125



Protozoos

125



Helmintos

127



Artrópodos

129



Parasitosis por Protozoos

133



Amebiasis

133



Balantidiosis

134



Giardiasis

135



Isosporiasis

136



Criptosporidiasis

137



Tricomoniasis

138



Blastocistosis

139



Enfermedad de Chagas

140



Toxoplasmosis

141



Parasitosis por Helmintos

142



Ascariasis

142



Tricocefalosis

143

3

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Página 

Oxiuriasis

144



Teniasis

145



Cisticercosis

147



Difilobotriasis

148



Himenolepiasis

149



Dipilidiasis

151



Hidatidosis

152



Triquinosis

153



Fasciolasis

154



Trabajo Personal del Estudiante



“Microbiología: Diagnóstico Parasitológico Procedimental”

155

Bibliografía

172

4

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

INTRODUCCIÓN El presente Manual de Apoyo Microbiológico, tiene por finalidad establecer las directrices de bioseguridad que norman el trabajo en un Laboratorio de Microbiología, junto con aprender a realizar las diferentes técnicas de competencia del Técnico en Laboratorio Clínico, promoviendo un trabajo fácil, seguro y técnicamente correcto.

Se mostrarán las diferentes técnicas y sus fundamentos, para poder así relacionar lo que estamos haciendo con la importancia que radica el trabajo que realizamos con la salud del paciente.

No debemos olvidar el cuidado que hay que tener al manejar las muestras clínicas, ya que un mal manejo de éstas puede generar un resultado erróneo para el paciente y ver afectada nuestra salud.

En este sentido, aparece el concepto de Bioseguridad, que se define como el conjunto de medidas preventivas destinadas a disminuir o eliminar el riesgo de exposición a agentes biológicos, físicos y químicos potencialmente peligrosos.

5

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

Los riesgos a los cuales se puede estar expuesto en el Laboratorio de Microbiología, ya sea por las infecciones adquiridas en éste o por la liberación al medio ambiente, deben ser reducidos con la capacitación de todo el personal de salud, desde su formación empírica como desde la formación curricular académica.

Las competencias que se adquieren al capacitar al personal pueden ser medibles y éstas, a su vez, se pueden relacionar con las habilidades de las personas que trabajen ahí. Es importante evaluar el nivel de riesgo del laboratorio, clasificándolo según las actividades técnicas que se realizan (tipos de microorganismos a trabajar) y el nivel de seguridad que se requiere según el tipo de laboratorio que es.

Gran parte de los accidentes están relacionados con:  el carácter potencialmente peligroso de las muestras,  el poco compromiso con el uso de elementos de protección (pecheras, guantes de procedimientos, antiparras),  el mal manejo de las muestras,  errores humanos,  malos hábitos del personal y  el compromiso de los funcionarios con el seguimiento de las normas de bioseguridad.

6

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Para prevenir algún tipo de accidente relacionado con las enfermedades infecciosas dentro del laboratorio, es muy importante implementar medidas de buenas prácticas de bioseguridad, tales como:  No comer ni beber absolutamente nada,  No maquillarse,  Usar guantes de procedimientos cada vez que manipule una muestra,  Usar antiparras en el caso de existir riesgo de salpicaduras,  Usar mascarillas de alta eficiencia si hay generación de aerosoles (Ej: muestras respiratorias, líquido cefalorraquídeo).  Usar pecheras desechables por un eventual derrame y proteger nuestros uniformes,  Lavado de manos antes y después de manipular muestras y en forma recurrente. Cada laboratorio se clasifica según los riesgos a los cuales está expuesto, de acuerdo al tipo de microorganismos que ahí se trabaje. Según la OMS1, la clasificación es la siguiente:

7

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Tabla 1. Clasificación de Microorganismos Infecciosos (MO) por Grupo de Riesgo

Grupo 1

Riesgo Riesgo

individual

y Microorganismos con poca probabilidad de producir daño en el ser

poblacional escaso o nulo Riesgo

2

Tipo de Microorganismos Aislados

moderado

humano o animales.

individual Microorganismo que pueden producir infecciones en el ser humano y

poblacional

bajo

3

4

1

preventivas y terapéuticas existentes.

Riesgo individual elevado y poblacional bajo

Riesgo

pero con baja probabilidad en el personal debido a medidas

individual

poblacional alto

Microorganismo que producen infecciones graves pero no propagables de un ser humano a otro. Existen medidas preventivas y terapéuticas.

y

Microorganismos que producen infecciones graves y se propagan de un ser humano a otro. No existen medidas preventivas y terapéuticas.

Organización Mundial de la Salud.

8

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Tabla 2. Relación de los Grupos de Riesgo con los Niveles de Bioseguridad, Prácticas de Laboratorio y Equipo de Seguridad

Grupo

Nivel de Bioseguridad

1

Básico Nivel 1

Tipo de Laboratorio

Practica de Laboratorio

Enseñanza Básica,

TMA*

Investigación Servicios de

2

Básico Nivel 2

de riesgo biológico

Investigación

3

4

Contención Nivel 3

Ninguno, trabajo en mesa de laboratorio al descubierto Trabajo en mesa de

Atención Primaria, TMA y ropa protectora, señal Diagnóstico,

Equipo de Seguridad

laboratorio al descubierto y CBS** para posibles aerosoles.

Diagnóstico

Prácticas de Nivel 2 más ropa CBS además de otros medios

Especial,

especial, acceso controlado y de contención primaria para

Investigación

flujo direccional

todas las actividades

Prácticas de Nivel 3, más

CBS Clase III o trajes

Contención

Unidad de

cámara de entrada con cierre presurizados junto con CBS

Máxima

Patógenos

hermético, salida con ducha y

de Clase II, autoclave de

Nivel 4

Peligrosos

eliminación de residuos

doble puerta (a través de la

especiales

pared), aire filtrado.

* TMA: Técnicas Microbiológicas Aplicadas ** CBS: Cabina de Bioseguridad

9

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Cabe destacar que existen conceptos que se deben manejar al momento de hablar de bioseguridad y éstos son los siguientes: 

Accidente Laboral: Aquél que sucede al trabajador durante su jornada laboral pudiendo ser de origen biológico, físico y/o químico que puede revestir algún riesgo para su salud. La exposición laboral a fluidos corporales de riesgo biológico es considerada accidente laboral por lo que se encuentra amparada por el Seguro Social contra Riegos de Accidente Laboral y Enfermedades Profesionales2.



Accidente Cortopunzante: Aquél derivado de la manipulación de elementos o material cortopunzante, contaminado o no, que concurre en heridas que pudieran constituir puerta de entrada de diversos agentes infecciosos deletéreos para la salud del funcionario. Se considera como el principal agente de riesgo de transmisión el Virus de la Hepatitis B (10 a 40%), Virus de la Hepatitis C (3 a 10%) y Virus de la Inmunodeficiencia Humana (0,2-0,5%).



Área de Trabajo: Lugar delimitado físicamente (pared, panel, mesón) en el cual se manipulen y procesen muestras clínicas.



Área Limpia: Espacio físico libre de muestras clínicas y material relacionado con ellas (implementos para el procesamiento de ellas, desechos biológicos, etc.).



Área Sucia: Área de trabajo del laboratorio donde se depositen muestras clínicas.



Riesgo Biológico: Posibilidad de sufrir algún daño (infección) debido a agentes infecciosos como bacterias, virus, hongos y parásitos.



Riesgo Físico: Posibilidad de sufrir algún daño debido a fuego, radiaciones, ruidos, vibraciones, etc.

2

Ley 16.744

10

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3



Riesgo Químico: Posibilidad de sufrir algún daño debido a agentes químicos como ácidos, álcalis, etc.



Fluidos Corporales: Se clasifican según el riesgo de transmitir enfermedades de importancia

epidemiológica

con

bajo

riesgo

de

transmisión

(saliva,

sudor,

deposiciones, orina).

Respecto a la planta física de un laboratorio, es muy importante tener en consideración ciertos requisitos para evitar accidentes y así trabajar de forma segura.

Es por este motivo que se debe tener puertas de acceso y escape del laboratorio con apertura interna y debidamente señalizadas como acceso restringido a personal autorizado.

Las áreas de trabajo deben estar separadas por murallas o paneles con las puertas señalizadas con el tipo de estudio que se realiza ahí. Las superficies deben ser lavables, iluminación adecuada, sala para descontaminar material y para lavado de material. Baños y duchas de emergencia

Sistema de Precauciones Universales:

Se entiende como un conjunto de técnicas y procedimientos destinados a proteger al personal que conforma el equipo de salud de la posible infección con ciertos agentes, principalmente Virus de la Inmunodeficiencia Humana, Virus de la Hepatitis B, Virus de la Hepatitis C, entre otros, durante las actividades de atención a pacientes o durante el trabajo con sus fluidos o tejidos corporales.

Toda muestra debe considerarse como potencialmente infecciosa por lo que se deben utilizar las precauciones estándar mínimas al manejar cualquier tipo de estas.

11

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Lavado de Manos: Debe realizarse siempre antes y después de colación y eliminación de guantes. Examinar o realizar procedimiento en un paciente. Ej.: punciones, manipular fluidos corporales.

Tipos de Lavado de Manos: o Lavado de alta frecuencia o Lavado clínico o Lavado en seco. Lavado de Alta Frecuencia usado para: o Toma de muestras que involucran procedimientos no invasivos: Expectoración, deposición, orina en paciente incontinente, etc. o Manejo de muestras clínicas en general.

Instrucciones: -

Subir las mangas de la ropa hasta el codo y retire las joyas.

-

Adoptar posición cómoda frente al lavamanos.

-

Abrir la llave del agua y déjela corriendo.

-

Mojar las manos y muñecas antes de aplicar jabón de glicerina

-

Depositar gotas de jabón en la palma de la mano

-

Jabonar las manos y muñecas friccionando 15 segundos las manos para obtener espuma especialmente entre los dedos.

-

Enjuagar con abundante agua corriente, desde la punta de los dedos hacia las muñecas.

-

Secar con toalla de papel desechable.

-

Cerrar la llave con la toalla de papel y elimínela.

12

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Lavado Clínico usado para: o Toma de muestras que involucran procedimientos medianamente invasivos y/o de corta duración o

Toma de muestras microbiológicas (urocultivos, hemocultivos, punción venosa o arterial, etc.)

o

Atención de pacientes con precauciones de transmisión

o

Manipulación de muestras microbiológicas durante su análisis

Instrucciones: -

Subir mangas de la ropa hasta el codo y retire las joyas.

-

Adoptar una posición cómoda frente al lavamanos.

-

Abrir la llave del agua.

-

Mojar las manos y muñecas antes de aplicar jabón antiséptico

-

Dispensar jabón desde el dispensador

-

Jabonar sus manos y muñecas, friccionando 30 segundos para obtener espuma especialmente entre los dedos.

-

Enjuagar con abundante agua corriente, desde la punta de los dedos hacia la muñeca.

-

Secar las manos con 1 a 2 hojas de toalla de papel desechable.

-

Cerrar llave de agua con la toalla de papel y elimínela.

Lavado en Seco con Alcohol Gel: o Se usa hasta 3 veces seguidas con manos visiblemente limpias y secas entre lavado de manos. o Usado para: -

Realización de procedimientos no invasivos o invasivos de corta duración

-

Atención de pacientes con precauciones de transmisión

-

Manejo de muestras biológicas en general.

Este se debe friccionar durante 15 minutos.

13

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Uso de Guantes de Procedimientos: Se debe tener en cuenta que los guantes de procedimientos nunca deben sustituir el lavado de manos. Tampoco estos deben ser lavados, ya que el látex no esta fabricado para ser lavado y reutilizado, ya que puede formar microporos cuando es expuesto a este estrés.

Siempre utilizar al manipular cualquier tipo de muestra. Manejo de Derrames de Muestras en Superficies: o

Cubrir con toalla de papel zona derramada.

o

Verter solución de cloro al 0,5% sobre el papel absorbente.

o

Dejar actuar por 20 minutos.

o

Recoger con mano enguantada papeles embebidos con solución de cloro y desechos biológicos (basureros amarillos).

o

Retirar con pala y espátula o cepillo si hay material corto punzante.

o

Rociar 2 a 3 veces más con solución de cloro al 0,5%, secar con papel y eliminar en desechos biológicos (contenedores de color amarillos).

Manejo de Derrames Relacionados a Centrífugas: o

Esperar detención total de la centrífuga. Si el derrame se produce por quiebre de tubos con material potencialmente infeccioso se debe detener la marcha de la centrífuga y mantener ésta cerrada por lo menos 30 minutos, antes de su apertura.

o

Antes de destapar la centrífuga, colocarse lentes, mascarilla, guantes y pechera.

o

Abrir y cubrir base con toalla de papel.

o

Rociar abundantemente solución de alcohol 70° en paredes y base.

o

Dejar actuar 10 minutos.

o

Retirar con mano enguantada (doble guante si hay presencia de material cortopunzante) papeles embebidos con solución de alcohol 70°.

o

Eliminar restos según corresponda a material cortopunzante (cajas amarillas) o desechos biológicos (contenedores de color amarillos).

14

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

o

Rociar 2 a 3 veces más con alcohol 70°, secar con papel y eliminar en basura común.

Manejo de Derrame de Muestras con Sospecha de Agentes de Transmisión Aérea (muestras respiratorias, sangre, LCR) o

Cubrir zona de boca y nariz con delantal y contener respiración.

o

Evacuar lugar de derrame y cerrar sección.

o

Avisar a Jefatura o Supervisión.

o

Esperar 60 minutos antes de entrar (para decantación de partículas en suspensión).

o

Cubrir derrame con toalla de papel.

o

Rociar abundante Cloro al 2% y dejar actuar 10 a 15 minutos.

Precauciones Generales Durante las Actividades Prácticas: Uso de guantes de procedimientos, y todo tipo de barrera de protección, según la actividad a realizar. Pipeteo: Está prohibido pipetear con la boca, debido a los riesgos que involucra el uso de pipetas porque existe la posibilidad de succión bucal. Solo se deben ocupar con propipetas. Extensiones y Frotis para el Examen al Microscopio: Estas fijaciones se deben utilizar con guantes de procedimientos y deben ser eliminadas en contenedores amarillos de material cortopunzante.

Mecheros: Se deben encender en el momento en que comienza el trabajo en el laboratorio, es decir cuando realicemos siembra de muestras, tinciones, antibiogramas. Las asas metálicas se deben incinerar siempre al utilizarlas.

15

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

MÉTODOS DE DESINFECCIÓN Y ESTERILIZACIÓN En los ambientes hospitalarios podemos encontrar gran variedad de microorganismos. La presencia de éstos por si solos no constituye un riesgo para los pacientes al menos que, mediante una dosis infectante, puedan afectar a un huésped susceptible. La mayoría de los objetos inanimados destinados a la atención de pacientes requieren de algún tipo de procedimiento que elimine o disminuya los microorganismos con el fin de interrumpir la cadena de transmisión y ofrecer una práctica segura para el paciente.

Los objetos inanimados destinados a la atención de pacientes requieren de procedimientos que ayuden a disminuir o eliminar los microorganismos con el fin de interrumpir la cadena de transmisión y ofrecer una práctica segura para el paciente.

Los distintos procedimientos que se utilizan para la eliminación o disminución de la carga de microorganismos deben ser seleccionados adecuadamente para los distintos artículos dependiendo de la naturaleza del material y a la vez los procedimientos a realizar. Dentro de los principales procedimientos podemos encontrar la descontaminación, desinfección y esterilización. Semmelweis3 fue un médico húngaro, de origen alemán, que consiguió disminuir drásticamente la tasa de mortalidad (en un 70 %) por sepsis puerperal entre las mujeres que daban a luz en su hospital mediante la recomendación a los obstetras que se lavaran las manos con una solución de cal clorurada antes de atender los partos.

En 1862, Luis Pasteur publicaría la hipótesis microbiana, planteando que las infección están producidas por agentes causales. Y Joseph Lister en 1865, extendería la práctica quirúrgica higiénica

al

resto

de

especialidades

médicas

destacando

la

importancia de las medidas asépticas. Introdujo los términos de asepsia y antisepsia, utilizando el fenol como primer antiséptico. 3

Ignác Semmelweis 1918-1865.

16

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

En la actualidad cada recinto de salud se debe regir bajo las normas establecidas por la “Norma General Técnica Sobre Esterilización y Desinfección de Elementos Clínicos” del Ministerio de Salud4. Estas normas tienen por objetivo uniformar los procesos de esterilización y desinfección en el país, asegurar la calidad del material de uso clínico y recomendar sistemas para una mayor eficiencia de estas actividades.

En la atención directa se utilizan numerosos artículos y equipos que tienen contacto con el paciente por distintas vías. El método de eliminación de microorganismos requerido por cada artículo, está directamente relacionado con el riesgo potencial que tiene ese artículo en particular de producir infección en el paciente. En 1968, Spaulding clasificó los artículos en tres categorías de acuerdo al riesgo antes mencionado: Artículos Críticos: Corresponden a artículos que se ponen en contacto con cavidades normalmente estériles del organismo o el tejido vascular. Éstos deben ser siempre estériles.

Artículos Semicríticos: Corresponden a artículos que entran en contacto con piel no intacta o con mucosas. Estos artículos, deben estar libres de los microorganismos antes mencionados y de preferencia deben ser estériles. En caso que la esterilización no sea posible deben ser sometidos al menos a desinfección de alto nivel. Ejemplos de artículos en esta categoría son circuitos de las máquinas de anestesia, y endoscopios.

Artículos No Críticos: Estos artículos toman sólo contacto con piel sana o no se ponen en contacto con pacientes por lo que el riesgo de producir infecciones es mínimo o inexistente. En general sólo requieren limpieza y secado.

Para entender los aspectos relacionados con la higiene del medio sanitario es importante que se tengan claro el significado de diversos términos:

4

http://juridico1.minsal.cl/RESOLUCION_1665_01.doc

17

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Infección Se denomina infección a la penetración en un huésped de un microorganismo o agente infeccioso. Los agentes infecciosos son los microorganismos y pueden encontrarse en cualquier parte del medio ambiente pudiendo ser bacterias, hongos, virus y protozoos. La infección no siempre produce una enfermedad ya que el organismo dispone de mecanismos de defensa producidos por el sistema inmunológico capaces de actuar sobre el agente agresor. Cuando el sistema inmunológico es sobrepasado por los agentes infecciosos aparecen los diversos signos y síntomas de las distintas enfermedades. Asepsia La asepsia es un conjunto de medidas y técnicas que tiene como finalidad impedir la proliferación de microorganismos, así impidiendo la contaminación del material, personas y ambiente hospitalario. Se logra una ausencia total de microorganismos patógenos que causan enfermedades.

Antisepsia Utilización de agentes químicos sobre la piel o sobre tejidos vivos para inhibir o eliminar los microorganismos (no implica una acción esporicida). Limpieza Procedimiento físico por arrastre del material orgánico contenido en los utensilios.

Antisépticos y Desinfectantes: Los antisépticos y los desinfectantes son usados ampliamente en los hospitales y otros centros del cuidado de la salud. Son parte esencial de las prácticas de control de la infección y ayudan en la prevención de las infecciones nosocomiales. Los agentes antisépticos rápidamente desinfectan superficies por disminución de la cantidad de bacterias sobre la piel intacta. Cuando se usan pre-quirúrgicamente, los antisépticos sirven como profilácticos para la prevención de la infección.

18

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Se denomina desinfección a la técnica de saneamiento que tiene como objetivo la destrucción de formas vegetativas de microorganismos en objetos inanimados y no necesariamente esporas. Esta destrucción se realiza por métodos químicos o físico siendo muy útil para la mayoría de los microorganismos. Existen agentes desinfectantes que se clasifican dependiendo del tipo de destrucción frente a los microorganismos vegetativos. De acuerdo al tipo de agentes que es capaz de destruir, se han definido tres niveles de desinfección: Desinfección de Bajo Nivel: La desinfección de nivel bajo elimina bacterias patógenas en su forma vegetativa y algunos hongos, no elimina el Mycobacterium tuberculosis ni los virus de tamaño pequeño no lipídico. Existen desinfectantes de nivel bajo que no destruyen las formas vegetativas de todas las bacterias.

Desinfección de Nivel Intermedio: La desinfección de nivel intermedio elimina formas vegetativas de bacterias, hongos y virus pero no de tamaño pequeño no lipídico. En circunstancias especiales puede eliminar Mycobacterium tuberculosis. Desinfección de Alto Nivel: La Desinfección de alto nivel elimina todos los microorganismos incluyendo los virus resistentes y Mycobacterium tuberculosis. No elimina esporas bacterianas.

Entre los principales métodos de desinfección podemos encontrar Desinfección Térmica por Medio de Vapor a Baja Temperatura y la Desinfección por Métodos Químicos. Desinfección Térmica por Medio de Vapor a Baja Temperatura: Esta consiste en procesar el material en autoclave de vapor a temperatura de 73ºC. El equipamiento usado para este proceso es una autoclave a vapor común con modificaciones para efectuar ciclos a menor temperatura.

19

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Este método puede utilizarse para la desinfección de artículos que resistan la temperatura requerida y al poder utilizar material empaquetado permite su posterior almacenaje. Para obtener una desinfección de alto nivel se debe procesar en la autoclave por un tiempo de 12 a 15 minutos.

Desinfección por Métodos Químicos: Consiste en poner en contacto el material o superficies con agentes químicos. Para la desinfección de alto nivel, el material debe permanecer en inmersión por un tiempo determinado de acuerdo al producto.

La institución de salud debe tener definido el listado de desinfectantes en uso y a su vez los desinfectantes de alto nivel deben estar aprobados por el Ministerio de Salud, estando sujetos a una seria de normas (Normas Técnicas Sobre Esterilización y Desinfección de Elementos Químicos” del MINSAL)

Las propiedades que podemos encontrar en un desinfectante ideal son: 

Amplio espectro



Rápida acción



No se afecta por factores del medio ambiente



Sin toxicidad



Compatibles con las superficies



Dentro de los hospitalarios

desinfectantes usados con mayor frecuencia en los recintos podemos

encontrar

ácido

Peracético,

alcoholes,

amonios

cuaternarios, cloro y compuestos clorados, fenoles, formaldehído, Glutaraldehido, orthophtalaldehido y peróxido de hidrógeno estabilizado

20

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Niveles de Acción de los Desinfectantes Alto Nivel El procedimiento de desinfección de alto nivel es complejo porque se aplica en numerosas oportunidades a equipos que son difíciles de manipular como son los endoscopios. En general dado que el proceso de desinfección de alto nivel es engorroso, difícil de evaluar y sujeto a falla humana, dentro de lo posible deben preferirse los métodos vigentes de esterilización para los artículos de uso médico. Los artículos no críticos y las superficies inanimadas (Ej. muebles, suelo y muros) en general no han sido involucradas en la transmisión de infecciones y se pueden tratar con limpieza y en situaciones excepcionales con desinfectantes de nivel bajo o intermedio. Los agentes desinfectantes apropiados para desinfección de alto nivel deben cumplir varias características: 

Amplio espectro



Estabilidad frente a materia orgánica



Compatibilidad con el material de los equipos



Posibilidad de medir su actividad o concentración por medio de indicadores químicos

Idealmente estos desinfectantes deben tener rapidez en su acción, baja toxicidad, vida media prolongada, degradabilidad en el medio ambiente y ausencia de olor. El personal a cargo del procesamiento de estos equipos, debe estar capacitado y ser evaluado en forma constante. Para obtener buenos resultados, se deben lavar todas las superficies (internas y externas) usando detergentes enzimáticos o neutros que aseguren la eliminación de materia orgánica sin dañar los equipos

Si se procesan por inmersión, se debe asegurar que tanto superficies internas como externas se pongan en contacto con el agente desinfectante. Para el enjuague se debe

21

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

utilizar agua estéril y en el caso de no contar con este suministro, se debe usar agua potable y posteriormente aspirar alcohol por los canales.

El secado debe ser realizado con aire filtrado para evitar su re contaminación, se recomienda procesar los equipos inmediatamente antes de su uso para evitar contaminación de los mismos. No obstante si no se utilizan inmediatamente de procesados, el almacenamiento debe ser en un sitio libre de polvo y las superficies externas protegidas con cubiertas estériles

Métodos de Desinfección de Alto Nivel

Glutaraldehido Corresponde a un di aldehído saturado que se utiliza como desinfectante de alto nivel. Las formulaciones convencionales de Glutaraldehido tienen una duración aproximada de 14 días. Existen formulaciones nuevas en las que se han agregado agentes estabilizantes para prolongar la vida útil a alrededor de 28 días. El mecanismo de acción de Glutaraldehido se debe a la alquilación de los grupos amino, sulfidrilo, hidroxilo y carboxilo, los cuales alteran el ARN, el ADN y la síntesis proteica en los microorganismos. Cloro y Compuestos Derivados del Cloro Los agentes clorados tienen amplio espectro microbicida. Su uso está limitado porque se inactivan en presencia de materia orgánica, son inestables y corroen el material metálico. Por otra parte, son tóxicos en contacto con piel y mucosas.

Los hipocloritos son los desinfectantes clorados más utilizados. Su presentación líquida como hipoclorito de sodio es la más conocida, y existe una forma sólida como hipoclorito de calcio. Las soluciones de cloro no deben conservarse en envases destapados por más de 12 horas debido a la evaporación del producto activo, haciendo que las concentraciones de cloro disponible disminuyan. Ácido Peracético/Peróxido de Hidrógeno

22

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Mezcla de Ácido Peracético al 0.08% y Peróxido de Hidrógeno al 1%. No requiere activación, su duración es de 14 días. Buena compatibilidad con el material. Experiencia limitada en endoscopios.

Formaldehído Este agente inactiva los microorganismos por alquilación de los grupos aminos y sulfidrilo de las proteínas y el anillo del átomo de nitrógeno de las bases purínicas. El formaldehído con alcohol es un desinfectante de alto nivel y fue usado en el pasado para la desinfección de equipos. En la actualidad su uso está discontinuado debido a su alta toxicidad y el olor penetrante que aparece aún a muy bajas concentraciones. Características y tiempo de inmersión de productos vigentes disponibles en Chile para Desinfección de Alto Nivel.

23

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Para efectuar los procedimientos de Desinfección de Alto Nivel siempre deben cumplirse los siguientes aspectos 

El material debe estar totalmente libre de materia orgánica, porque ésta interfiere en el proceso de desinfección.



Se recomienda la utilización de detergentes de tipo enzimático y sumergir el endoscopio inmediatamente después de ser utilizado.



Enjuagar y secar prolijamente para evitar dilución del desinfectante y alterar su concentración.



El tiempo de desinfección de alto nivel debe ser establecido de acuerdo a las características propias de cada desinfectante.



No es recomendable enjuagar los artículos desinfectado con agua corriente debido a la posibilidad de contacto con superficies contaminadas.



En caso de no contar con agua estéril para este fin debe usarse alcohol etílico o isopropílico para el último enjuague.

Nivel Intermedio: Se utiliza para la limpieza de superficies o de instrumentos en los que es poco probable la contaminación por esporas bacterianas o por microorganismos con alto grado de resistencia. Métodos de desinfección de Nivel Intermedio

Alcoholes Destruyen rápidamente formas vegetativas de bacterias, hongos, virus y M. tuberculosis.

24

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

El alcohol se considera un desinfectante de nivel intermedio y se usa en la desinfección de superficies y artículos no críticos. Se utiliza en la desinfección de termómetros orales y rectales, laringoscopios y pequeñas superficies como las tapas de goma de algunos frascos de medicamentos y para el enjuague de canales de endoscopios. Fenoles Estos productos fueron de los primeros usados en desinfección hospitalaria. En concentraciones altas, el fenol actúa como un gran tóxico del protoplasma penetrando y destruyendo la pared celular y precipitando las proteínas celulares. Se usa para limpieza de superficies hospitalarias y elementos no críticos. Compuestos Yodados Similares a los alcoholes, pero ligeramente más tóxicos, También se desactivan con las sustancias orgánicas.

Bajo Nivel Se utilizan para tratar instrumentos no críticos, no traspasan las mucosas ni los tejidos estériles de los pacientes. Método de Desinfección de Bajo Nivel:

Amonios Cuaternarios (AC) Estos productos han sido utilizados ampliamente como desinfectantes y hasta hace algunos años como antisépticos. No deben usarse como antiséptico ni como desinfectante de alto nivel, debido a que existe evidencia que las soluciones pueden contaminarse con bacilos gram negativos ya que el agente activo es absorbido por textiles como los géneros y gasas. La acción microbicida de los amonios cuaternarios es en general

muy

limitada.

La

mayoría

de

las

formulaciones

son

como

detergentes/desinfectantes y su uso se limita al saneamiento ambiental común de superficies. Antisépticos

25

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Los antisépticos son biosidas o sustancias químicas que se aplican sobre los tejidos vivos, con la finalidad de destruir o inhibir el crecimiento de microorganismos patógenos. No tienen actividad selectiva ya que eliminan todo tipo de gérmenes.

Un antiséptico ideal debería cumplir con los siguientes atributos para su elección: 

Amplio espectro



Bajo costo



Inocuo para tejidos vivos



No debe ser toxico



Rapidez y eficacia en materia orgánica



Efecto acumulativo y residual



Baja capacidad de generar resistencia



No irritante, ni sensibilizante

Los antisépticos y desinfectantes se clasifican más en la actualidad según el grupo químico a las que pertenecen:

Jabón Corriente Por remoción mecánica (arrastre) tiene la capacidad de eliminar a los microorganismos presentes en la microbiota transitoria. Jabón Antiséptico A diferencia del jabón corriente, el jabón antiséptico tiene la capacidad de eliminar los microorganismos presentes en la microbiota residente. Este debe ser utilizado en los siguientes momentos: 

Antes de hacer un procedimiento con cualquier paciente



Antes de procedimientos invasivos



Antes de atender pacientes en unidades críticas



Antes y después de atender pacientes en aislamiento



Después de un procedimiento

26

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Alcoholes El mecanismo de acción de los alcoholes es la desnaturalización de las proteínas de los microorganismos. La desnaturalización proteica sólo es posible en presencia de agua; por este motivo el alcohol absoluto presenta un poder bactericida mucho menor que las mezclas de alcoholes con agua. Podría tener cierta acción bacteriostática al inhibir la producción de metabolitos esenciales para la división celular rápida. Tiene acción bactericida pero poco efecto residual. Los alcoholes tienen excelente actividad frente a todos los microorganismos, exceptuando las esporas, se inactiva por sustancias orgánicas por lo que se debe limpiar la piel antes de ser usados y no son tóxicos. Dentro de los efectos adversos que se pueden destacar por el uso de alcoholes podemos destacar que al ser aplicado brevemente a la piel no causa daño, pero irrita si se deja mucho tiempo. En superficies lesionadas empeora el daño y causa un coágulo bajo el cual pueden crecer bacterias, por lo que no se utiliza como antiséptico para heridas abiertas. Su utilización puede provocar irritación y sequedad de la piel. Al volatilizarse puede causar irritación de la mucosa nasal y lagrimal. Alcohol 70%- 90% Se utiliza principalmente para el lavado de manos en preparación preoperatorio y preparación de piel en procedimientos invasivos de corta duración. Dentro de sus ventajas podemos destacar su acción rápida y amplio espectro y sus limitantes es la rápida evaporación, inflamable, produce sequedad de piel y no tiene efecto residual

Alcohol Gel Reemplaza lavado de manos clínico (solo 3 veces el lavado clínico) tiene gran aceptación por los usuarios y mejora la adherencia. Compuestos Yodados

27

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

El yodo y sus compuestos han sido usados ampliamente para la prevención de las infecciones y el tratamiento de heridas. Los compuestos yodados son agentes oxidantes, precipitan las proteínas bacterianas y ácidos nucleicos.

El yodo tiene una poderosa actividad germicida, ataca bacterias gram positivas y gram negativas, Micobacterias, esporas, hongos, virus, quistes y protozoos. Hay varios tipos de preparaciones de yodo, según la zona que haya que desinfectar. La actividad antiséptica de todas las preparaciones depende del yodo en forma libre. Se emplea en: la desinfección de la piel sana, el tratamiento de afecciones de la piel causadas por bacterias y hongos, la limpieza de las heridas en solución acuosa, etc. Alcohol Yodado (Alcohol 70% + Yodo 0,5%) Se utiliza en el lavado de manos preparación preoperatoria y preparación de piel. Tiene como ventaja su amplio espectro, acción rápida, Delimitación de zonas por coloración; puede producir sequedad de piel, Irritación, alergia y se puede evaporar.

Clorhexidina Constituye uno de los tres antisépticos quirúrgicos más importantes y es el antiséptico bucal que más se usa actualmente. La clorhexidina posee amplio espectro de acción. Es bactericida sobre bacterias gram positivas y gram negativas. Las ventajas que justifican el empleo de la clorhexidina son la acción germicida rápida y su duración prolongada, gracias a que ésta sustancia tiene gran adhesividad a la piel y buen índice terapéutico.

Clorhexidina (2% / 4%) Se utiliza en lavado quirúrgico de manos, preparación de piel preoperatoria y procedimientos invasivos. Dentro de los beneficios podemos encontrar: acción bactericida rápida, actividad residual duradera entre 6 y 8 horas, reducción rápida del número de bacterias de la piel, efecto antiséptico prolongado, amplio espectro de actividad.

28

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Dentro de las limitaciones se encuentran su poco efecto frente a Micobacterias, efecto lento (3 minutos en adherirse al estrato corneo), produce ototoxicidad e irritación de córnea.

Triclosán Es un derivado fenólico, poco soluble en agua su mecanismo de acción es disrupción de la membrana bacteriana a través del bloqueo de la síntesis de lípidos. El Triclosán ha demostrado actividad contra bacterias gram positivas y gram negativas, bacterias multiresistentes donde se destaca su acción frente al Staphylococcus aureus meticilinorresistente. Entre sus propiedades, el Triclosán tiene rápida acción y son útiles frente a la microbiota residente y transitoria. Su eficacia es inhibida mínimamente por la presencia de materia orgánica, y tiene gran afinidad con la piel, no produciendo irritación ni efectos tóxicos. El Triclosán está disponible en un amplio rango de productos, incluyendo jabones para la preparación pre quirúrgica de la piel, lavado de manos y antisépticos se utiliza además como desinfectantes de superficies y lavado de manos en la industria de la alimentación. Triclosán (0,5% al 1%) Se utiliza en el lavado clínico de manos. Tiene como ventajas su buen efecto residual, buena aceptación de usuarios y amplio espectro. Dentro de sus limitantes podemos encontrar su nulo efecto frente a Pseudomonas spp.

Consideraciones en el uso de un antiséptico y desinfectantes 

Su almacenaje (Fecha de Vencimiento y Condiciones )



Contaminación intrínseca (al momento de utilizar )



Inactivación : Materia orgánica, agua, jabones, Resistencias



Los desinfectantes deben usarse solo en objetos inanimados o superficies.



Los antisépticos deben usarse solo para piel indemne

29

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3



No rellenar ni trasvasijar antisépticos ni desinfectantes



No deben hacerse mezclas (altera su acción, inactivándolos)



Deben usarse respetando las instrucciones del fabricante respecto a la duración del producto, conservación, dilución y tiempo de contacto



Previo a su uso, limpiar la superficie

Esterilización La esterilización del material de uso médico es un componente clave en la prevención y control de infecciones. Históricamente han sido utilizados métodos físicos para la destrucción de microorganismos que actúan por medio de altas temperaturas como son la autoclave a vapor y las estufas por calor seco (Pupinel).

En los últimos años ha habido un aumento progresivo de artículos críticos que no pueden ser sometidos a calor. Por lo anterior, se han desarrollado nuevas tecnologías de esterilización a bajas temperaturas.

Los métodos validados que se utilizan en la actualidad en los hospitales para la esterilización del material pueden clasificarse en métodos de esterilización a altas temperaturas: calor seco (Pupinel) y calor húmedo (Autoclave a Vapor), y métodos de esterilización a bajas temperaturas: Inmersión en Ácido Peracético, Óxido de Etileno, vapor de Formaldehido, Plasma de Peróxido de Hidrógeno y Plasma combinado (Peróxido de Hidrógeno y Ácido Peracético). Métodos de Esterilización a Altas Temperaturas

Esterilización por Calor Húmedo: Este método de esterilización elimina microorganismos por desnaturalización de las proteínas, proceso que es acelerado por la presencia de agua, requiriendo temperaturas y tiempos menores de exposición que el calor seco.

Este método de esterilización se

considera el método más efectivo, económico y rápido disponible en la actualidad, por lo

30

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

que debe ser la primera opción en la selección de métodos de esterilización; el equipo más utilizado es el autoclave a vapor. Existe una gran variedad de modelos de autoclaves. Estos tienen diferencias en cuanto a operación, tiempos de esterilización y forma de acción.

Clasificación de los Autoclaves: 1. Según Sistema de Operación: 

Manuales



Semiautomáticos



Automáticos

2. De acuerdo a la Producción de Vapor: 

Vapor centralizado



Generador eléctrico incorporado



Vapor centralizado y generador eléctrico incorporado



Generador a gas

3. En relación al Funcionamiento: 

Desplazamiento por gravedad



Con vacío previo



De sistema pulsante

Esterilización por Calor Seco: Para la esterilización con calor seco se utilizan estufas que comúnmente reciben el nombre de Pupinel.

Este sistema elimina microorganismos por coagulación de las proteínas. La acción microbicida del calor seco está condicionada por la presencia de materia orgánica o

31

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

suciedad en el artículo. El calor seco penetra lentamente en los materiales por lo que se requieren largos períodos de exposición. El uso del calor seco debe limitarse a materiales que no pueden ser esterilizados en autoclave. Los materiales que pueden esterilizarse en Pupinel y no pueden esterilizarse en autoclave son sólo aceites, vaselina, petrolatos y polvos.

Existen dos tipos de equipos que obtienen el calor a través de la energía eléctrica: 

Convección gravitatoria



Convección mecánica

Esterilización a Baja Temperatura

Esterilización por Óxido de Etileno (ETO) El óxido de etileno es un agente químico con alto poder microbicida que puede ser utilizado para esterilizar artículos sensibles al calor y a la humedad. Su acción microbicida se produce por alquilación de la pared celular del microorganismo que inhabilita a la célula para tener un metabolismo normal o reproducirse. La esterilización por óxido de etileno debe ser realizada en equipos que reúnen los parámetros para lograr la esterilización. Los equipos existentes son automáticos con dispositivos de seguridad que impiden abrir el equipo mientras no se haya completado el ciclo. Están dotados de un sistema de vacío para facilitar la introducción del gas en la cámara y la evacuación después del período de exposición. Existen unidades de distintos tamaños y cada establecimiento deberá seleccionar el adecuado de acuerdo a sus necesidades. Esterilización por Peróxido de Hidrógeno en estado de Plasma: El Peróxido de Hidrógeno (H2O2) es un agente químico que se ha utilizado por muchos años como desinfectante de alto nivel. Elimina los microorganismos por oxidación.

32

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

La esterilización por peróxido de hidrógeno se realiza en equipos automáticos. Es compatible con la mayoría de los materiales de uso médico. No son compatibles con el método los derivados de la celulosa como el papel, género, lino, ni tampoco líquidos y polvos.

Esterilización Por Acido Peracético El Ácido Peracético es un agente químico oxidante soluble en agua, efectivo en forma rápida contra un amplio espectro de microorganismos a bajas concentraciones. Tiene poder bactericida, fungicida y esporicida. No deja residuos tóxicos. Se ha utilizado desde hace años como desinfectante de alto nivel.

Esterilización con Formaldehído El formaldehído esteriliza a temperaturas entre 60 y 80°C. Elimina los microorganismos por alquilación, requiere equipos especiales. Esterilización por Radiaciones Ionizantes La esterilización se obtiene sometiendo los materiales a dosis predeterminadas de radiaciones. Hasta la fecha se han utilizado tecnologías con rayos gamma. Este tipo de proceso es de alta complejidad y sólo puede ser realizado bajo estrictas condiciones de seguridad. Requiere infraestructura especializada que en general no es posible ni se justifica en centros de salud.

33

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Ventajas y Limitaciones de los distintos Métodos de Esterilización

Método

Ventajas

Limitaciones

Autoclave a vapor

Ciclos más cortos. Menor costo de Método no compatible con material operación. Efectivo frente a la eliminación Termosensible. de priones.

No elimina pirógenos.

No presenta toxicidad para el personal ni

No esteriliza sustancias oleosas ni polvos.

para el ambiente. Certificable. Calor seco

Equipamiento de menor costo que el

Daño del material por exposición a

autoclave

Temperaturas elevadas.

Facilidad de operación de los equipos

Tiempos de exposición prolongados en Comparación con la esterilización a vapor. Dificultad en la certificación del método. Costos de operación elevados. No hay información respecto a su efectividad contra priones

Óxido de etileno

Permite la esterilización de material

Requieren períodos prolongados de

Termosensible

Proceso y aireación.

Certificable

No es un método efectivo contra priones.

Penetración

Tóxico para el personal, pacientes y ambiente

Baja temperatura.

Incompatibilidad con algunos materiales.

Ciclos de corta duración.

Controversia respecto a su utilización en

No tóxico para las personas ni para el

artículos con lúmenes largos entre 1

Ambiente.

y 2mt. y angostos (entre 1 y 3mm).

No requiere instalaciones especiales

No elimina priones

Ácido Peracético

Rápido. Efectivo en la esterilización

Sólo puede ser utilizado para material

líquido

de endoscopios y laparoscopios

sumergible

Plasma

34

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Equipo automático estandarizado

Esteriliza un solo contenedor por ciclo por lo

No contamina al medio ambiente

que no puede ser utilizado para cantidades Mayores de material. No elimina priones Debe ser utilizado en forma inmediata

Formaldehído

Baja temperatura.

Incompatibilidad con algunos materiales.

Ciclos de corta duración.

Método no aprobado para su utilización en

Certificable

USA No elimina priones

35

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

TRABAJO PERSONAL DEL ESTUDIANTE “Bioseguridad en el Laboratorio de Microbiología”

Desarrolle los siguientes Talleres o Actividades de acuerdo a instrucciones dadas para cada uno de ellos. El desarrollo de estos talleres le ayudará a estudiar y a comprender lo relevante que serán en su quehacer técnico y cuidado personal. La base del conocimiento está en esta etapa del proceso, después solo quedará el aplicar y agregar su proactividad, dándole el sello que lo debe caracterizar en su Práctica Curricular y Laboral.

36

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Taller Formativo N° 1 “Asepsia y Antisepsia” I Parte I Ítem: Respuesta Breve

1.- ¿Qué representa una Norma?

2.- ¿A quién le corresponde la responsabilidad en un Centro Asistencial de entregar los elementos estériles y desinfectados, sin que ellos involucren un riesgo para el paciente?

3.- Defina los siguientes conceptos:  Esterilización:

 Desinfección:

 Asepsia:

37

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

 Antisepsia:

 Limpieza:

 Descontaminación:

 Empaque:

4.- ¿Qué importancia le atribuye Ud. a la presencia de materia orgánica en los elementos que van a ser sometidos al proceso de esterilización?

5.- Realice un listado de microorganismos considerando su capacidad de resistencia a los procesos de esterilización (de mayor a menor resistencia)

6.- ¿Qué métodos de esterilización son recomendables para esterilizar los siguientes materiales?:    

Líquidos Plásticos Vidrios Goma

: : : :

38

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

7.- Identifique en orden las etapas del proceso de esterilización:

8.- ¿Cómo se realiza la recepción y distribución del material en una Central de Esterilización?:

9.- ¿Cuáles son las etapas del proceso de lavado?:

10.- Mencione los dos elementos más importantes para el lavado de material y describa sus características más relevantes:

11.- ¿Cómo se clasifican los tipos de empaques a preparar en una Central de Esterilización? Mencione 3 ejemplos de cada uno de ellos.

39

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Taller Formativo N° 2 “Esterilización y Desinfección” I Ítem: Respuesta Breve

1.- ¿Cuáles son los métodos de Esterilización a Alta Temperatura?

40

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

2.- ¿Cuáles son los métodos de Esterilización de Baja Temperatura?

3.- Describa las características del Método de Esterilización por Calor Húmedo:

4.- Identifique la Clasificación de los Autoclaves:

41

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

5.- ¿Qué variables o parámetros participan en el proceso?:

6.- ¿En qué consisten los Esterilizadores “Flash” y cuando se utilizan?:

7.- Desarrolle un comentario referido a los esterilizadores por Calor Seco:

42

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

II Ítem: Completación de Oraciones  Tiempo

de

esterilización

es

aquella

que

comienza

cuando………………………………………………………………………………….  La relación de tiempo / temperatura para el Pupinel es………°C por…..….. min.  El Óxido de Etileno se caracteriza por………………………………………………..  La exposición al ETO puede ocurrir por…………………… y………………………  La aireación es fundamental en.………………………………………………………  La tecnología más barata y efectiva para esterilizar es…………………………….  La esterilización por radiaciones ionizantes es en base a rayos………………….  Los controles mecánicos de un autoclave son………………… - …………………  Las etapas del proceso de lavado son:……………… - ……………… - ………….  El uso de agua dura en los materiales se detecta por la presencia de…………………………………………………………………………………………

43

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Taller Formativo Individual N° 3 Mapa Conceptual “Indicador Biológico” Realice la lectura del siguiente artículo “El uso de Indicadores Biológicos en la Esterilización con Óxido de Etileno”, y desarrolle con posterioridad un “Mapa Conceptual” una vez finalizada su revisión y comprensión lectora..

El uso de indicadores biológicos en la Esterilización con Óxido de Etileno Introducción El óxido de etileno desde los años 50 ha sido el agente esterilizante por excelencia y desde que comenzó a utilizarse ha demostrado ser uno de los métodos más sencillos, seguros y económicos para esterilizar a baja temperatura toda una gama de dispositivos médicos, en fábricas como así también e todas las instituciones hospitalarias tanto privadas como estatales. Este método de esterilización aún no ha podido ser superado por otras tecnologías, lo que lo hace imprescindible para la esterilización de elementos termo sensibles. El desarrollo de nuevos materiales y por lo tanto de nuevos productos, para uso médico principalmente, ha hecho que esta técnica de esterilización se adapte y actualice permanentemente para poder satisfacer las necesidades que demanda el mercado.

44

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Mecanismo de Acción Es por muchas conocidas su actividad sobre bacterias, hongos, levaduras, virus. En la célula bacteriana existen tres sitios principales susceptibles de ser atacados por los agentes químicos: las capas superficiales, las enzimas, y el material nuclear. El funcionamiento correcto de cada uno de estos sectores es esencial para la vida del microorganismo. Las proteínas enzimáticas contienen cierto número de grupos reactivos esenciales para su actividad. Entre éstos están los grupos ácidos y básicos de las nucleoproteínas, grupos carboxilos, hidroxilos y aminos, sulfidrilo, amino y otros. El óxido de etileno actúa químicamente como un agente alquilante reemplazando átomos lábiles, de hidrógeno de los grupos antes mencionados, por radicales hidroxietilos. Debido a sus características químicas es uno de los más efectivos métodos de esterilización gaseosa. Las características fisicoquímicas del gas lo hacen muy activo principalmente por su alta capacidad de penetración que permite la mortalidad de los microorganismos en lugares de muy difícil acceso. Además podemos decir que penetra en sustancias porosas como así también permitiendo la esterilización de superficies que no se puede lograr por otros métodos. Monitoreo del proceso de esterilización Existen básicamente tres tipos de controles o indicadores de un proceso de esterilización:   

Físicos Químicos Biológicos

Los físicos, son los instrumentos con que el fabricante diseña el esterilizador, que monitorizan y además deben registrar, es decir, imprimir y/o graficar curvas del proceso de esterilización donde provee información sobre las condiciones internas de la cámara de esterilización. El instrumental debe ser validado y fundamentalmente sensible. Los indicadores químicos para óxido de etileno deben definir los parámetros críticos siguientes:    

Concentración del gas Tiempo de exposición Temperatura Humedad relativa

El cambio que se debe observar en el indicador después de la exposición al proceso debe ser perfectamente definido para poder realizar una lectura segura. Los indicadores biológicos para monitorear un proceso de esterilización, consisten en obtener una población estandarizada de microorganismos viable, usualmente esporos microbianos, de conocida resistencia al proceso de esterilización que se destina.

45

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Con los indicadores biológicos se intenta demostrar si las condiciones del proceso fueron las adecuadas para alcanzar la esterilización. Un indicador biológico negativo no prueba que todos los items del ciclo son estériles, solo que ellos fueron expuestos a condiciones adecuadas de esterilización. Utilización La esterilidad absoluta de un lote de esterilización no puede demostrarse sin realizar prueba de esterilidad de cada elemento que componen dicho lote, lo que es un imposible. En consecuencia, la esterilidad de un lote se define en términos probabilísticos, donde la probabilidad que un elemento esté no estéril es prácticamente remota. Por lo tanto para establecer condiciones óptimas de garantía de la esterilización, pueden implementarse mediante el uso de procesos adecuados, es decir validados, y buenas prácticas donde se debe establecer:

   

Equipamiento adecuado Demostrar que se opera dentro de los parámetros establecidos Demostrar que la probabilidad de supervivencia microbiana no es mayor que los limites establecidos Controlar diariamente y protocolizar los resultados

Es por lo anteriormente expuesto, que los indicadores biológicos cumplen como un único sistema integrador de todas las variables que concurren en un ciclo de esterilización, y sin dudarlo es el indicador más válido para un proceso con óxido de etileno. Desarrollo de los indicadores biológicos Diferentes pruebas se realizaron antes de aceptar internacionalmente al Bacillus subtilis o Globigii, como comúnmente también se lo conoce, antes de su uso como indicador biológico para la esterilización gaseosa con óxido de etileno. Generalmente el soporte utilizado para transportar las esporas microbianas son tiras de papel de filtro que después de inoculadas son colocadas en sobres, y una vez terminada la esterilización son llevadas al laboratorio y preferiblemente en cabina de flujo laminar son transferidas a un medio de cultivo líquido. Posteriormente son incubadas a 37º C durante 5 o 7 días para recién ser leídos, observando la turbidez producida por el crecimiento de microorganismos. La desventaja de éste método es el largo período de incubación, puesto que se necesita observar turbidez, es decir que el desarrollo microbiano debía ser abundante, por lo tanto su período de incubación, largo. En una segunda etapa se introdujeron mejoras a éste método, evitando la transferencia de la tira de papel porque se envasa en una unidad plástica la tira y el medio de cultivo líquido contenido

46

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

en una ampolla de vidrio, que después del ciclo se rompe logrando así impregnar la tira y luego incubar. Con este método también se ve facilitada la lectura, porque al medio de cultivo líquido se le adiciona o incluye un indicador de pH, púrpura de bromocresol que cambia de color cuando existe desarrollo microbiano, puesto que el medio de cultivo se acidifica. Existen algunas ventajas con este método porque el cambio permite una mejor y segura lectura del resultado, la reducción del tiempo de incubación de 24 a 48 hs, la no transferencia de la tira de papel inoculada del sobre al medio de cultivo, lo que podría ser motivo de introducir contaminación, teniendo por resultado posibles falsos positivos. Finalmente en los últimos años se ha introducido en el mercado indicadores biológicos de lectura rápida para el monitoreo de la esterilización con óxido de etileno. Estos indicadores detectan la presencia de una enzima: a D-glucosidasa contenida en las esporas, lo que permite una lectura fluorescente al cabo de 4 hr de incubación.

Esta lectura se realiza en la misma incubadora mediante un sistema de luces que de acuerdo a color indica si la esterilización ha sido satisfactoria, es decir, si existen indicios de desarrollo microbiano o no. Este método todavía no ha sido suficientemente aceptado. Existen diferentes tipos de indicadores biológicos y su elección depende para el uso que se lo destine:   

Desarrollo de ciclo Validación de ciclo Monitoreo de rutina

La carga microbiana utilizada por indicador biológico es de no menos de 10 (4) y no más de 10 (9) d esporas de Bacillus subtilis-variedad niger. En la fabricación y validación de los indicadores biológicos se emplean equipos altamente especializados de esterilización, por lo tanto las características de resistencia del indicador utilizado por el usuario pueden no coincidir con las especificadas en la etiqueta del mismo debido a diferencias entre las condiciones del usuario y las condiciones de esterilización empleadas por el fabricante. Por lo tanto la elección de un indicador biológico es crítica y requiere que se le de debida importancia, conociendo la resistencia de la población microbiana del indicador biológico en relación al proceso de esterilización específico, para que cuando se lo emplee dentro de sus características de desempeño constituya un desafío para el proceso de esterilización, mayor que el desafío representado por la carga microbiana contenida en el producto a procesar. La determinación de diferentes niveles de carga microbiana está basada en recuperar microorganismos y esporos del producto a ser esterilizado, teniendo en cuenta la eficiencia del método utilizado en la toma de la muestra en orden que los resultados obtenidos reflejen con exactitud la carga existente.

47

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Generalmente el indicador biológico seleccionado para monitorear rutinariamente ciclos de esterilización debería ser el mismo que se utilizó en el programa de desarrollo del ciclo, estableciéndose así una íntima relación y conocimiento de la resistencia del indicador. Destacamos además que no es probable que microorganismos aislados de la carga microbiana sean más resistentes al empleado en la fabricación de indicadores biológicos. Por último este escrito informativo de indicadores biológicos para la esterilización con óxido de etileno, intenta proporcionar una descripción general de conceptos y principios a tener en cuenta en el momento de elegir un indicador para la rutina en la esterilización y su importancia en la información que nos proporciona. Luis Barlassina VISION. Vol.4 Nº 14 - Octubre 99 Referencias 



USP 23 - Esterilización y garantía de esterilidad  USP 23 - Indicadores Biológicos  American Nacional Standard - ANSI / AAMI ST 34  Barlassina, Luis - III Congreso Nacional de Microbiología de Barcelona Barlassina, Luis - Esterilización Gaseosa con Óxido de Etileno, 1ra Edición

MICROBIOLOGÍA Es la ciencia de la biología dedicada al estudio y análisis de los MICROORGANISMOS en su naturaleza, vida y acción.

Estos seres no se pueden visualizar a ojo desnudo, por tanto van a ser visibles solo a través del Microscopio. 

En 1674 el biólogo holandés Antón van Leeuwenhoek examinó una gota de agua y descubrió

un

mundo

formado

por

millones

de

diminutos

animáculos

(microorganismos). 

Cien años después el biólogo danés Otto Müller amplió los estudios de van Leeuwenhoek y, siguiendo los métodos de clasificación de Carlos Linneo, organizó a las bacterias en géneros y especies.

48

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3



En 1840, el alemán Friedrich Henle propuso unos criterios y demostró que los microorganismos eran responsables de la aparición de enfermedades en el ser humano.



En los años setenta y ochenta del mismo siglo, Robert Koch y Louis Pasteur confirmaron esta teoría demostrando que los microorganismos eran responsables de la aparición del carbunco, la rabia, la peste, el cólera y la tuberculosis.



La era de la quimioterapia comenzó en 1910, cuando el químico alemán Paul Ehrlich descubrió el primer compuesto antibacteriano, un compuesto que resultó efectivo contra la espiroqueta causante de la sífilis.



Alexander Fleming en 1928 descubrió de la Penicilina.



Así, en la actualidad se sabe que existen miles de diferentes tipos de microorganismos que viven en el interior, en la superficie o alrededor del ser humano y, asimismo, pueden contarse por centenares los que son capaces de provocar en él enfermedades graves. ¿Qué es un Microorganismo? 

Un microorganismo, también llamado microbio, es un ser vivo que solo puede visualizarse con el microscopio.



El concepto de microorganismo carece de cualquier implicación taxonómica dado que engloba organismos: Unicelulares: compuesto por una sola célula.

Procariotas: (células sin núcleo definido) como las bacterias.

49

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Eucariotas: (células con núcleo) como los protozoos, una parte de las algas y los hongos. Entidades biológicas de tamaño ultramicroscópico, como los virus. 

Los microorganismos se hallan capacitados para cometer una extensa gama de reacciones

metabólicas

y

adaptarse

a

muchos

ambientes

diferentes

y

temperaturas extremas 

Por su poco peso pueden ser transportados por las corrientes de aire y estar en todas partes

Estos pueden subdividirse en cuatro grupos: 

Virus



Bacterias



Hongos

50

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3



Parásitos

Virus Los virus son las partículas infecciosas de menor tamaño, con un diámetro que oscila entre los 18 a 300 nm5 (el tamaño de la mayor parte de los virus es inferior a 200 nm y no pueden visualizarse mediante el microscopio óptico). Se han descrito más de 25 familias víricas que contienen más de 1.550 especies de virus, muchas de las cuales se asocian a enfermedad en el ser humano. Los virus están formados por ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN) (no por ambos a la vez) así como por las proteínas, necesarias para su replicación y patogenia. Estos microorganismos son verdaderos parásitos cuya replicación exige la existencia de unas células anfitrionas.

Bacterias Son microorganismos procariotas, es decir unos microorganismos unicelulares sencillos, sin membrana nuclear, mitocondrias, aparato de Golgi ni retículo endoplásmico Se reproducen por división asexual. Poseen una pared celular que las rodea, la cual es compleja. Los microorganismos procarióticos poseen una cubierta celular muy diferente de la de los eucariotas. Las paredes celulares de muchos de los procariotas poseen un componente químico común, el peptidoglucano (mureína), que es el responsable de la

forma y

consistencia de la pared. El peptidoglucano es un extenso polímero que se halla integrado por subunidades alternas de N-acetil glucosamina (que es también el constituyente de la quitina en los eucariotas) y el ácido N-acetilmurámico. Existen 2 formas básicas:

5

Nanómetros.

51

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Pared celular Gram positiva con una gruesa capa de peptidoglucano Pared celular Gram negativo con una delgada capa de peptidoglucano, la cual posee una membrana externa. Tinciones Tinciones utilizadas en microbiología para observar bacterias y hongos en el microscopio óptico. Lo primero que debemos tener en cuenta es el nivel de toxicidad de los colorantes a utilizar, en este caso los que se ocupan para realizar Tinción de Gram y de Ziehl-Neelsen son reactivos tóxicos que deben ser eliminados en recipientes adecuados para esto (contenedores de color rojo), nunca al desagüe. Se deben utilizar con guantes de procedimientos y pechera desechable, durante su manipulación.

El proceso de tinción se debe a reacciones químicas entre el colorante y la célula o de alguna estructura celular. Para realizar una tinción de un microorganismo se debe realizar siempre la siguiente secuencia de pasos:

1. Preparación del frotis (Extensión de la Muestra) 2. Secado de la preparación 3. Fijación de la muestra 4. Tinción propiamente tal

1.- Preparación del Frotis (Extensión de la Muestra): Sobre un portaobjeto limpio, se debe colocar una gota de la muestra directa (en el caso que sea de un cultivo, debo agregar previamente una gota de agua o suero fisiológico estéril y luego una colonia bacteriana directa del cultivo). 2.- Secado del Frotis:

52

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Esta se seca con calor de la llama del mechero, a una distancia en la cual no nos quememos las manos, y el vidrio resista, ya que si lo exponemos a mucho calor directo podemos destruir la pared bacteriana, lo que impediría la lectura correcta de la Tinción de Gram. Otro modo es dejarlo secar al ambiente al lado del mechero Bunsen. Es muy importante que no quede muy grueso, ya que al haber muchas bacterias, estas estarían mal distribuidas y sería dificultoso observar sus características morfológicas y no quedara bien teñido.

3.- Fijación del Extendido al Portaobjetos: Ya realizado el frotis y seco, se procede a la etapa de fijación, la cual se hace en la llama del mechero, flameándolo 2 a 3 veces. Este se toma con una pinza de madera para evitar algún accidente.

4.- Tinción: Esto tiene por objetivo demostrar microscópicamente la morfología, agrupación y afinidad tintorial de las bacterias a través de la fijación de los colorantes a las bacterias y así de esta forma, resistan cuando se realiza el lavado durante la tinción. Una de las principales tinciones que utilizamos en microbiología es la Tinción de Gram.

Tinción de Gram

Una característica taxonómica importante de las bacterias es su respuesta a la Tinción de Gram. Esta característica parece ser fundamental, ya que la reacción a la tinción se correlaciona con muchas otras propiedades morfológicas en maneras relacionadas filogenéticamente. Un microorganismo potencialmente gram positivo puede verse como tal solo cuando concurren un conjunto particular de condiciones ambientales en un cultivo joven.

53

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

El procedimiento para la Tinción de Gram se inicia con la aplicación de un colorante básico, el Cristal Violeta. Luego se aplica una Solución de Iodo; en este momento todas las bacterias se tiñen de azul. A continuación se agrega Alcohol Acetona, se lava y finalmente se agrega un contra colorante, como es la Safranina (colorante rojo).

Esta tinción se basa en la capacidad que presenta la pared bacteriana de las bacterias para retener el colorante al cual se expone, ya sean gram positivas o gram negativas. En el caso de las bacterias gram positivas, la pared contiene una gruesa capa de peptidoglicano que ayuda a retener el colorante Cristal Violeta, lo que a su vez impide la decoloración, cuando agregamos Alcohol Acetona durante la realización de la tinción. Es por esto que al ser observadas al microscopios las bacterias se ven de color morado (Gram +). Las bacterias Gram Negativas a diferencia de las Gram Positivas, tienen una delgada capa de peptidoglicano, que no retiene el colorante Cristal Violeta y al ser decoloradas con el Alcohol Acetona, se destiñe y se vuelva a teñir cuando se agrega el contra colorante Safranina, tiñéndose de color rojo. (Gram -).

Tinción de Gram Se colocan sobre un portaobjetos bacterias fijadas por calor o secadas de algún otro modo 

Se tiñen con Cristal violeta para teñir morado. (aplicar por 1minuto) LAVAR



Se añade una solución yodada que actúa como mordiente. (1 minuto) LAVAR



Agregar decolorante (alcohol/acetona) con el fin de eliminar el colorante no fijado. (10 segundos) LAVAR

54

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3



Posteriormente se cubre con un colorante de contraste, Safranina, para teñir de rojo las células que no hayan retenido el Cristal Violeta. (30 segundos)

Algunos ejemplos de bacterias Gram Positivas:

Todas las formas Cocaceas como: Staphylococcus, Streptococcus, Micrococcus, excepto las de la familia Neisseriaceae y Moraxellaceae que son formas cocaceas Gram Negativas. Todos los bacilos esporulados, tales como: Clostridium, Bacillus Otros bacilos como Corynebacterium, Listeria, Lactobacillus.

Importante destacar que a pesar de no ser bacterias se tiñen Gram Positivos las Levaduras.

55

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

TRABAJO PERSONAL DEL ESTUDIANTE “Microbiología: Morfología Bacteriana”

56

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Desarrolle los siguientes Talleres o Actividades de acuerdo a instrucciones dadas para cada uno de ellos. El desarrollo de estos talleres le ayudará a relacionar la teoría con la realidad procedimental del diario vivir en su quehacer técnico. Recuerde que es Ud. el único forjador de su aprendizaje, aplique su proceso activo con apego absoluto a lo indicado en la técnica y obtendrá un resultado absoluto y confiable, como espejo de la condición de la muestra en estudio.

Taller Teórico Práctico Formativo N° 1 57

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

“Flujograma Procedimental Tinción de Gram”

I Ítem: Flujograma de Proceso Preparación de la Muestra a Teñir Desarrolle un Flujograma de proceso de la preparación de la muestra, de acuerdo a las características de esta, según lo indicado:

a) Preparación del Extendido desde una Muestra Líquida:

58

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

b) Preparación del Extendido de una Muestra obtenida de una colonia:

Taller Práctico Formativo N° 2

59

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

“Preparación del Extendido y Tinción de Gram”

1ª Actividad Teórica Práctica: I Ítem: Preparación de la Muestra a Teñir Realice la preparación de la muestra indicada por el docente, para efectuar con posterioridad la Tinción de Gram. Recuerde aplicar todas las medidas de bioseguridad que se han mencionado reiteradamente para su seguridad y de sus compañeros de trabajo. Aplique los elementos de protección personal en la sección de procesamiento, tenga especial cuidado al momento de hacer abandono del Laboratorio.

a) Extendido de una Muestra Líquida (agua, caldo, orina, etc.) Describa brevemente como realizará el procedimiento:

b) Extendido de una Muestra obtenida de una colonia:

60

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Describa brevemente como realizará el procedimiento:

c) Extendido de una Muestra de Secreción de Herida (recolectada en tórula): Describa brevemente como realizará el procedimiento:

II Ítem: Secado de la Preparación: 61

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Realice un comentario de análisis conforme a lo realizado para esta etapa de secado según los tipos de muestras extendidos:

III Ítem: Fijado de la Preparación: Identifique los riesgos asociados a esta etapa del proceso y mencione las medidas de prevención que deberá tener presente en todo momento:

IV Ítem: Tinción:

62

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

1.- Identifique con claridad cuáles son los componentes de la Tinción de Gram, diferenciando sus colorantes, fijador y decolorante respectivamente.

2.- Desarrolle un comentario en referencia a un cambio del orden en su aplicación. Fundamente su observación.

63

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

3.- Observe con detención el siguiente esquema y fundamente las diferencias que se observan y como se manifiestan estas en la actividad práctica procedimental que Ud. realiza y en la observación microscópica:

2ª Actividad Teórica Práctica: Observación Microscópica

64

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Observe la preparación dispuesta en el Microscopio y esquematice en el recuadro lo observado, destacando su afinidad tintorial coloreando según lo observado. Asocie a especie de importancia médica lo observado Describa morfología, agrupación y afinidad tintorial.

Cocaceas gram (-)

cocaceas gram +

Bacilos gram (-)

Morfología Bacteriana

Morfología Bacteriana

Agrupación

Agrupación

Afinidad Tintorial

Afinidad Tintorial

Especies Asociadas

Especies Asociadas

bacilos gram +

MEDIOS DE CULTIVOS

65

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Para el aislamiento estudio y clasificación de los microorganismos es necesario mantenerlos en un medio en el que dispongan de las sustancias orgánicas e inorgánicas necesarias e indispensables para el normal desarrollo de su metabolismo. En estos medios además de su desarrollo, los microorganismos pueden manifestar sus características de crecimiento y sus propiedades bioquímicas, aspectos bien importantes para su clasificación.

Los medios de cultivos son soluciones en estado de gel, que poseen todas las sustancias que se requieren para el desarrollo de los microorganismos. Estos medios son imprescindibles paran el laboratorio de microbiología, por lo que su buena preparación, mantención y control nos entregan confiabilidad en los resultados. Para que las bacterias se puedan desarrollar de forma adecuada en los medios, estos deben cumplir ciertas condiciones, es decir temperatura adecuada, Ph y deben ser estériles (libres de cualquier microorganismo).

Estos según sus componentes se dividen en: o Agar nutritivos, agar selectivos, agar diferencial, agar enriquecidos. o Existen medios de cultivos sintéticos o artificiales de composición química definida y medios naturales que se preparan en base a sustancias naturales. (Por Ej: agua Peptonada, caldo común, leche, etc.)

Según el estado físico se clasifican en: o Medios líquidos, o Medios sólidos, o Medios semisólidos

Los medios de cultivos, según sus componentes pueden clasificarse en cuatro tipos: 

medios de enriquecimiento,

66

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3



medios nutrientes o de soporte,



medios selectivos y



medios diferenciales

Medios de Enriquecimiento Favorecen el sobrecreciendo de un determinado microrganismo a partir de una muestra que lo tiene en escasa cantidad, con predominio de la microbiota habitual.

Medios Nutrientes o de Soporte Contienen nutrientes que permiten que la mayoría de los microorganismos no fastidiosos crezcan en la misma proporción en que se encuentran en la muestra, sin permitir que otro microorganismo crezca exageradamente (agar nutriente, agar cerebro corazón). Medios Selectivos Contiene uno o más agentes inhibitorios (antibiótico-colorantes) que inhiben a los microorganismos excepto al que se desea recuperar (Fenil-Etil-Alcohol).

67

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Medios Diferenciales Emplean metabolitos que permiten a los microorganismos expresar características metabólicas o de cultivo que hacen posible distinguirlos de otros con características diferentes (Ej: el agar sangre cordero permite el crecimiento y diferenciación según tipo de hemólisis y/o producción de pigmento)

68

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Mantención de los Medios de Cultivos Los medios de cultivos deshidratados deben mantenerse en un lugar seco y oscuro, a una temperatura aproximadamente de 15ºC a 25ºC, en frascos bien cerrados para evitar la entrada de humedad, ya que la absorción de agua lleva a una alteración del Ph y eventualmente a formación de precipitados. Bajo condiciones ideales, los medios de cultivos deshidratados, en sus frascos originales sellados, pueden ser mantenidos al menos hasta 5 años sin deteriorarse.

Preparación del medio de cultivo deshidratado: Se debe usar agua destilada con pH lo más cercano posible a 7,0. Los receptáculos destinados para usar deben ser absolutamente limpios y lo suficientemente grande para poder mezclar el medio de cultivo con facilidad. En lo posible, no se debe prepara más de 1-2 litros por recipiente.

69

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

El medio de cultivo se debe pesar según los ml a preparar y según indicación del fabricante. A este ya pesado se le añade aproximadamente la mitad del agua necesaria para su reconstitución y se mezcla hasta conseguir una suspensión homogénea. Después se incorpora la cantidad restante del agua.

Luego de esto se llevan al autoclave para su posterior esterilización (se debe tener en cuenta que hay medios de cultivos que no se esterilizan)

Los medios de cultivos que no contienen ni agar ni gelatina, se pueden disolver en general en agua fría o con un ligero calentamiento. Los medios nutritivos que contiene agar o gelatina, deben ser calentados al baño María hasta conseguir su disolución. Debe evitarse el calor excesivo. En los medios de cultivos que no necesitan ser sometidos a ulterior esterilización en autoclave, es imprescindible lograr su completa disolución.

Ajuste del pH: El valor del pH depende mucho de la composición del medio de cultivo, de su temperatura y del tratamiento al que ha sido sometido (disolución, esterilización) Debido a que los microorganismos encontrados en muestras clínicas crecen mejor a un pH cercano al pH neutro, es esencial controlarlo en forma regular después de autoclavar. En los medios de cultivos sólidos, la medición del pH se realiza a 45-50ºC (medios liquido aun) y en los medios nutritivos líquidos se hace a temperatura ambiente.

70

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Esterilización de los Medios de Cultivos: Esta puede realizarse en un autoclave o por filtración. Volúmenes de hasta 500ml de la mayoría de los medios son autoclavados a 121ºC por 15 minutos. Volúmenes más grandes pueden necesitar de 20-30 minutos o más. Deberían usarse temperaturas de 116-118º C para medios conteniendo carbohidratos termoestables. Los carbohidratos termolábiles, deberían ser esterilizados por filtración y agregarse al medio ya autoclavado y enfriado, en forma aséptica.

Si las normas de preparación no indican otra cosa, la esterilización se hace en autoclave a 121ºc durante 15 minutos. Los medios de cultivo deben sacarse de inmediato del autoclave y enfriarlos rápidamente.

Vertido del Medio de Cultivo en Placas: Para evitar la formación de gotitas de agua de condensación en la tapa de las placas, se debe verter en ella el medio de cultivo a una temperatura de 45-55º C. Previamente hay que mezclar bien el medio de cultivo. La repartición debe ser hecha cuidadosamente para evitar la formación de burbujas. Si estas se producen, se puede pasar la llama del mechero sobre la superficie del agar antes de que este se solidifique. Cuando el agar haya solidificado, dar vuelta las placas.

71

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Tubos de Agar Inclinado: Los tubos llenos con medio de cultivo esterilizado, todavía líquido, se colocan en una posición inclinada, de tal manera que quede una parte cilíndrica de aproximadamente 3 cm y otra parte en pico de flauta de igual dimensión.

Control de Calidad de los Medios de Cultivo: Cada vez que se preparan medios de cultivo de un nuevo lote o de un nuevo frasco, deben efectuarse cultivos de control que aseguren su esterilidad, un pH adecuado y reacciones bioquímicas correspondientes a los controles de calidad establecidos. En aquellos medios en que se agregan materiales después de la esterilización (por ejemplo agar Thayer Martin, Agar Chocolate, Agar Campylobacter) en cada preparación deberá realizarse control de calidad, sembrando los microorganismos sugeridos para el control de cada medio. Para controlar las esterilidad de las placas preparadas, incubar el 1% de las placas a 36º C durante la noche (luego de esto, estas se deben eliminar). El control de calidad debería ser visual y por subcultivo. Si se observa consistentemente que no hay contaminación, este control de esterilidad puede discontinuarse. Deberá reiniciarse el control cada vez que se vuelva a observar contaminación y hasta que el problema se haya resuelto. Cada tubo, placa o reactivo preparado, debe tener una etiqueta que indique la fecha de preparación.

72

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Conservación de Medios de Cultivos Preparados, listos para su uso Los medios de cultivos preparados tienen un tiempo limitado de conservación; cuando no se indica otra cosa y bajo condiciones adecuadas, éste es de varios meses. Los medios que no contienen suplementos ni enriquecimientos son estables hasta por un año si se conservan en tubos con tapa rosca. Estos mismos medios en placa pueden mantenerse hasta por 6 meses. Los medios como Agar Sangre, Agar Chocolate y Thayer Martin se consideran estables hasta por 3 meses. Se recomienda su almacenamiento a 412ºC, cuando van a mantenerse por periodos de tiempos prolongados. No deben guardarse a temperatura por debajo a 0ºC. Es posible su conservación durante 1 semana a temperatura ambiente y siempre que estén protegidos de la luz. Las placas pueden ser refrigeradas durante una semana sin deteriorarse, pero deberían envolverse en bolsas de plásticos o papel para minimizar la perdida de agua. Por otro lado, luego de utilizar estos medios con cultivos bacterianos, se deberá efectuar la esterilización en autoclave (73º C por 12-15 minutos), antes de ser eliminados.

Agar Sangre El agar sangre de cordero al 5% es el medio de cultivo más comúnmente usado para el aislamiento primario de la mayoría de las bacterias aeróbicas no fastidiosas. Por su contenido en nutrientes, permite el buen desarrollo de las bacterias. Por otra parte, es posible realizar una identificación primaria de las bacterias por las características morfológicas de las colonias en el agar sangre.

73

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Agar Chocolate Es un medio de cultivo usado para el aislamiento primario de la mayoría de las bacterias aeróbicas incluyendo además a algunos fastidiosos (Haemophilus, Gardnerella, Neisseria). El agar chocolate es preparado agregando sangre de cordero a un medio de agar base enriquecido, el que está a una alta temperatura (aprox. 80º C) para lisar los glóbulos rojos y liberar los factores X y V, lo que lleva a mejorar el desarrollo de las bacterias y permite además el aislamiento de Haemophilus.

Agar Mac Conkey Es un medio de cultivo selectivo y diferencial más usado para inhibir microorganismos gram positivos. Permite la selección y recuperación de las Enterobacterias y bacilos gram negativos entéricos relacionados. Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de las bacterias gram positivas y de algunas bacterias gram negativas fastidiosas. El indicador de pH, rojo neutro, da las características diferenciales. La lactosa es el único carbohidrato presente en el medio.

74

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Agar Salmonella-Shigella (SS) Es uh medio selectivo usado para el aislamiento de Salmonella y Shigella, inhibiendo el desarrollo de bacterias coliformes.

Agar TCBS Medio selectivo para recuperar cepas de Vibrio a partir de muestras clínicas. Las altas concentraciones de tiosulfato y citrato férrico, junto con la fuerte alcalinidad del medio inhiben el crecimiento de las Enterobacterias, haciendo de este un medio selectivo para el desarrollo de Vibrio.

75

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Caldo Selenito Es recomendable para el aislamiento de Salmonella, de muestras tales como: deposiciones, orina o aguas sucias que tiene altas concentraciones de bacterias mixtas.

Agar Thayer Martin Este medio es recomendado para el aislamiento de Neisseria gonorrhoeae de todos aquellos sitios que podrían tener microbiota mixta, y de Neisseria meningitidis de muestras nasales y bucofaríngeas. Es un medio enriquecido que contiene 3 antibióticos y un antifúngico, los que actúan como agentes selectivos para la inhibición de la microbiota.

76

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Medios Usados en la Identificación Bioquímica de Enterobacterias (bacilos gram negativos). Baterías bioquímicas.

TSI (Triple Sugar Iron) Medio usado para determinar la fermentación de carbohidratos y producción de H2S como primer paso en la identificación de bacilos gram negativos. Preparación del Medio: Suspender los componentes en un litro de agua destilada. Calentar hasta disolver. Distribuir en tubos y esterilizar a 121°C por 15 min. Disponer en posición inclinada y enfriar a temperatura ambiente hasta que solidifique, para obtener un extremo inferior profundo y un tendido superior corto.

77

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

LIA (Lysine Iron Agar) Medio diferencial usado para ver la habilidad de las Enterobacterias para producir H2S, descarboxilar y deaminar la lisina. Preparación del medio: Disolver el medio en agua destilada, repartir en tubos, esterilizar, poner los tubos semitendidos.

MIO (Motilidad Indol Ornitina) Permite determinar tres importantes características en la identificación de las Enterobacterias: movilidad, Indol, descarboxilación de la Ornitina. Preparación del Medio: Suspender los componentes en un litro de agua destilada y calentar hasta disolver completamente. Repartir en tubos y esterilizar por 15 min a 121°C (estos se mantienen en 90°, no inclinados como los anteriores).

78

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Urea (Urea de Stuart (Caldo) y Urea de Christensen (Agar) Medio utilizado para ver que microorganismos poseen la enzima ureasa y actúan hidrolizando la urea presente en el medio, liberando amoniaco

Citrato de Simmons Medio utilizado para ver la capacidad de ciertas bacterias de utilizar el citrato como única fuente de carbono. Preparación del Medio de Cultivo: Disolver los componentes en un litro de agua destilada. Repartir en tubos, esterilizar a 15 minutos a 121°C y dejar enfriar los tubos en agar tendido. El medio listo para usar es de color verde claro.

79

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

PRUEBAS ESPECIALES QUE PODEMOS REALIZAR PARA LA IDENTIFICACIÓN BACTERIANA Prueba Coagulasa: Permite separar S. aureus que es capaz de producir la enzima coagulasa, de las otras especies de Staphylococcus. El S. aureus posee dos tipos de coagulasa, la que realizamos es la exo coagulasa o coagulasa libre que actúa mediante la activación de un factor, formándose un complejo coagulasa, el cual reacciona con el fibrinógeno produciéndose un coagulo de fibrina (esta prueba se realiza en tubo con plasma de conejo idealmente).

Test en Tubo Se emulsionan varias colonias en un tubo con 0.5 ml de plama citratado de conejo. Se incuba a 35º C y se examina la formación del coagulo a las 4 horas. Si es negativo se re incuba toda la noche y se procede a su lectura a las 18-24 horas. La lectura a las 4 horas es fundamental porque en alguna oportunidad puede suceder que las fibrinolisinas de S. aureus lisen el coagulo luego de 18 horas de incubación y de esta maneras se produzcan un test falso negativo.

80

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Prueba de la Catalasa Se agrega una gota de agua oxigenada y una colonia de la bacteria a estudiar, todo esto una lámina limpia de vidrio.

Se utiliza para comprobar la presencia de la enzima citocromo oxidasa que se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepción es Streptococcus.

Una reacción positiva se evidencia por la formación de burbujas por el desprendimiento de oxigeno molecular libre.

81

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Clasificación de las Bacterias

Para realizar una clasificación preliminar de las bacterias se utiliza la tinción de gram: 

Tamaño



Forma (esferas, bastoncillos, espirales)



Disposición espacial (células aisladas, en cadenas y formando acúmulos)



Afinidad tintorial (gram positiva o negativa)

Su clasificación definitiva se refiere a sus propiedades fenotípicas y genotípicas. Bacilos Gram Positivos: Formadores de Esporas: Bacillus y Clostridium No formadores de Esporas: Corynebacterium, Listeria, Propionibacterium Bacilos Gram Negativos: Enterobacterias, Vibrio cholerae, Pasteurella. Bacilo No Fermentador de Azúcares: como Pseudomona, Acinetobacter, Burkolderia, Helicobacter, Stenotrophomonas, Campylobacter, Haemophilus, Bordetella, Brucella etc. Cocaceas Gram Positivas: Catalasa Positivas: Staphylococcus (aureus o coagulasa negativa), Micrococcus. Catalasa Negativa: Enterococcus, Streptococcus. Cocaceas Gram Negativas: Neisserias spp (gonorrhoeae o meningitidis), Moraxella spp. Anaerobios: Se desarrollan en ausencia de oxígeno. Bacilos

Gram

Negativos:

Bacteroides

fragilis,

Prevotella

melaninogenica,

Fusobacterium Bacilos Gram Positivos: Actinomyces, Lactobacillus, Propionibacterium, Clostridium. Cocaceas Gram Negativas: Veillonella Cocaceas Gram Positivas: Peptostreptococcus

82

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Necesidades Metabólicas de las Bacterias El crecimiento bacteriano requiere una fuente de energía y la materia prima necesaria para fabricar las proteínas, las estructuras y las membranas que conforman la maquinaria estructural y bioquímica de la célula. Las bacterias deben obtener o sintetizar: 

Aminoácidos



Hidratos de carbono



Lípidos utilizados

Las necesidades mínimas para el crecimiento son una fuente de carbono y nitrógeno, otra fuente de energía son el agua y diversos iones. El oxígeno es esencial para el ser humano. Constituye una sustancia tóxica para muchas bacterias. Algunos microorganismos (p. ej., Clostridium perfringens, causante de gangrena gaseosa) no pueden crecer en presencia de oxígeno. Este tipo de bacterias son conocidas como Anaerobias Estrictas Hay otras que requieren la presencia de oxígeno molecular para su crecimiento y en consecuencia, se denominan Aerobias Estrictas. Sin embargo, la mayor parte de las bacterias puede crecer tanto en presencia como en ausencia de oxígeno, en cuyo caso reciben el nombre de Anaerobias Facultativas.

Hongos La estructura celular de los hongos es más compleja. Son microorganismos eucariotas que poseen un núcleo bien definido, mitocondrias, aparato de Golgi y retículo endoplásmico. Los hongos pueden existir en una forma unicelular (levadura) capaz de replicarse de manera asexual, o en una forma filamentosa (moho). (Reproducción tanto sexual como asexual).

83

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

HONGOS FILAMENTOSOS

HONGOS LEVADURIFORMES

84

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

TRABAJO PERSONAL DEL ESTUDIANTE “Microbiología: Medios de Cultivo”

85

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Desarrolle los siguientes Talleres o Actividades de acuerdo a instrucciones dadas para cada uno de ellos. El desarrollo de estos talleres le permitirá comprender lo relevante

que

son

estos

elementos

de

diagnóstico

microbiológico en el quehacer de su competencia. Recuerde que es Ud. el único forjador de su aprendizaje, aplique su proceso activo con apego absoluto a lo indicado en la técnica y obtendrá un resultado absoluto y confiable, como espejo de la condición de la muestra en estudio.

86

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Taller Teórico Práctico N° 1 “Reconocimiento y Uso Procedimental de Medios de Cultivo” I Ítem: Recuadro Temático I Ud. encontrará una serie de medios de cultivo en el mesón de trabajo en el Laboratorio Clínico Experimental, identifíquelos uno por uno y desarrolle el siguiente recuadro, de acuerdo a instrucciones. Disposición (Placa / Tubo) (Dibuje y Coloree)

Nombre del Medio de Cultivo

Estado Físico

Clasificación Composición Objetivo de su Uso

87

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Disposición (Placa / Tubo) (Dibuje y Coloree)

Nombre del Medio de Cultivo

Estado Físico

Clasificación Composición Objetivo de su Uso

88

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

II Ítem: Recuadro Temático II Ud. ya ha identificado los medios de cultivo, por lo tanto; es momento de aplicar sus conocimientos prácticos referidos al uso que les dará en el proceso de las muestras para cultivar, aislar e identificar los microorganismos.

MEDIOS DE CULTIVO ENRIQUECIDOS Y SELECTIVOS Nombre del Medio de Cultivo

Técnica de Siembre (Dibuje el medio de cultivo y esquematice la Técnica de Siembra)

Diagrame y coloree el Desarrollo Microbiano En el medio de cultivo

89

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

MEDIOS DE CULTIVO DIFERENCIALES Y CROMOGÉNICOS Nombre del Medio de Cultivo

Técnica de Siembre (Dibuje el medio de cultivo y esquematice la Técnica de Siembra)

Diagrame y coloree el Desarrollo Microbiano En el medio de cultivo

90

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

III Ítem: RECUADRO TEMÁTICO Realice la lectura del siguiente recuadro con detención y luego responda lo solicitado. Posibles Defectos en la Preparación y Manipulación de los Medios de Cultivo Defecto Apelmazamiento del medio de cultivo

   

Desviación del pH

  

Turbidez, Precipitación

   

Punto de Solidificación Demasiado Elevado Escasa estabilidad del Gel

       

Desviación del Color

  

Causal Conservación en atmósfera excesivamente húmeda Envase ha permanecido abierto demasiado tiempo El envase no quedó suficientemente cerrado después de su uso El medio de cultivo deshidratado está muy pasado de la fecha de vencimiento Agua no neutra Envase insuficientemente bien cerrado Medio de cultivo deshidratado muy pasado de la fecha de vencimiento Defecto de preparación Agua insuficientemente desionizada Sobrecalentamiento del medio durante su preparación Envases de preparación insuficientemente limpios pH incorrecto o desajustado Excesiva proporción de medio de cultivo deshidratado Agar-agar no adecuado Proporción demasiado pequeña de medio de cultivo deshidratado Medio de cultivo deshidratado no disuelto completamente Medio de cultivo deshidratado sobrecalentado durante su preparación El medio de cultivo no se mezcló o fue insuficiente cuando fue vertido a las placa de Petri En el caso que el medio de cultivo es preparado por el usuario, muy poca cantidad de Agar-agar Medios de cultivo ácidos Error en la medición o ajuste de pH Sobrecalentamiento del medio de cultivo o envase de preparación sucio

91

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Posibles Defectos en la Preparación y Manipulación de los Medios de Cultivo Defecto Medios de Cultivo Contaminados

Crecimiento Demasiado Pobre en Bacterias

    

Crecimiento Demasiado Intenso de Bacterias

 

Causal Esterilización insuficiente Contaminación accidental posterior a la esterilización. Por ej.: en el vertido de placa, placas de Petri no estéril Residuos de sustancias inhibidoras del crecimiento (Ej.: detergentes) pH incorrecto medio de cultivo sobrecalentado durante su preparación Medio de cultivo sobrecalentado durante su preparación Medio de cultivo sembrado con excesiva cantidad de muestra

Desarrolle un “MAPA CONCEPTUAL” del recuadro considerando las diversas variables y sus causas, que se consideran con respecto a la preparación y uso de los medios de cultivo

92

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

CONCEPTOS GENERALES DE SALUD La salud es un estado de completo bienestar físico, mental y social, y no solamente la ausencia de afecciones o enfermedades (1946). En 1992 un investigador agregó a la definición de la OMS: "y en armonía con el medio ambiente“. Enfermedad Alteración o desviación del estado fisiológico en una o varias partes del cuerpo, por causas en general conocidas, manifestada por síntomas y signos característicos, y cuya evolución es más o menos previsible. Agente Infeccioso Microorganismo causante de la infección: Bacterias, virus, hongos, parásitos.

Reservorio Hábitat natural del agente infeccioso. El lugar donde pueden sobrevivir (crece y se reproduce). Puerta de salida del agente. Desde el reservorio (líquido, gotas) hacia el exterior por vía aérea, digestiva y piel. Mecanismos de Transmisión Vía de Transmisión Contacto Directo. Vía de Transmisión Indirecta. A través del aire.

Vía de Transmisión Contacto Directo: el Reservorio es la Fuente de Infección. No existen intermediarios en la transmisión. Personas Enfermas (Reservorio Humano) Varicela, Rubéola. (De una persona a otra). Animales Enfermos (Reservorio Animal) la Rabia.

93

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Vía de Transmisión Indirecta El Reservorio no es la Fuente de Infección. Los agentes llegan a través de elementos contaminados o vectores. Animales Enfermos: contaminan con sus heces alimentos y agua que se convierten en la fuente de infección o elemento directamente infectante Ej: Hidatidosis, Triquinosis, salmonelosis. Vehículos de Transmisión: objetos o materiales contaminados como juguetes, ropa de cama, agua, tierra, utensilios: bacterias Vectores Vivos: Este tipo de transmisión incluye un huésped intermediario. Ej: un insecto, un animal o planta. A través del Aire: diseminación de aerosoles microbianos, son suspensiones aéreas de partículas constituidas total o parcialmente por microorganismos: gotillas o polvo (> de 5 micras) Ej: Tuberculosis. Pueden difundirse por: 

Tos



Estornudo



Conversación

Mecanismo de Infección 

INFECCION DIRECTA

Contacto de piel a piel, desde un paciente a otro o de un trabajador de salud. (Ej.: el saludo con las manos, el baño de pacientes, control de signos vitales). 

INFECCION INDIRECTA (VECTORIAL)

Tocar objetos o artículos que estuvieron en contacto directo con el paciente contaminado (Ej: termómetro, chatas, patos, esfigmomanómetro, utensilios de alimentación). 

INFECCION CRUZADA

Trasmisión de agentes infecciosos entre pacientes y el personal que les proporcionan atención en un entorno clínico. Ello puede ser resultado del contacto directo, persona a persona, o indirecto, mediante objetos contaminados llamados fómites.

94

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Otros mecanismos de infección: 

TRANSFUSIONAL

•

LACTANCIA

•

TRANSPLACENTARIO O VERTICAL

Los agentes infecciosos presentan cuatro características que los identifican: 

Patogenicidad



Contagiosidad



Virulencia



Poder de invasión

Los agentes infecciosos presentan cuatro características que los identifican: 

Patogenicidad: capacidad de un agente infeccioso de producir la enfermedad en un huésped susceptible. Características: - Transmisibilidad. - Capacidad para adherirse a las células huésped. - Invasión de células o tejidos. - Toxigenicidad (exotoxinas). - Capacidad de evadir el sistema inmunitario del huésped.



Virulencia: Es el grado de patogenicidad de un agente infeccioso, indicado por las tasas de letalidad y por su capacidad de invadir y lesionar los tejidos del huésped.

- Adherencia. - Producción de toxinas. - Producción de enzimas.

95

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

MUESTRAS MICROBIOLÓGICAS

Para trabajar las muestras microbiológicas deben haber portaobjetos para realizar la tinción de gram y para poder realizar los exámenes al directo (es decir cuando se carga la muestra de forma directa en el portaobjeto y se cubre con una laminilla). Para poder trabajar las muestras se deben utilizar medios de transporte estériles. Esto es porque el medio debe estar libre de cualquier tipo de microorganismo, es decir; asegurarnos de que si encontramos algún microorganismo en las muestras, este sí está causando infección y no es algo que ha estado en el recolector en el cual se obtuvo. Las muestras de orina, tejido, líquidos, catéter, muestras respiratorias se deben tomar en:  Contenedor de tapa rosca, estéril (para evitar derrame).

Las muestras de secreción de heridas, se deben tomar en:  Tórula estéril con medio de transporte (Stuart).

96

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Las muestras de raspado de piel: 

Placas de Petri estéril o contenedor estéril.

Las muestra de deposición para Coprocultivo: 

Tórula estéril con medio de transporte (Cary-Blair).

Los medios de transporte evitan la muerte de los microorganismos de interés, pues mantienen el pH y la humedad, por su composición permiten la viabilidad de los microorganismos pero no su multiplicación, ejemplos: Stuart, Cary y Blair, Amies, etc. Medio de Transporte Stuart: medio usado para el transporte de secreciones, permitiendo preservar la viabilidad de los agentes patógenos (el medio es esencialmente una solución de buffers con carbohidratos, peptona y otros nutrientes).

97

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Medio de Transporte Cary-Blair: medio usado para mantener muestras de deposición. Es un medio no nutritivo, semisólido que impide el sobre crecimiento de los microorganismos, permitiendo a su vez recuperar cepas de: Salmonella, Shigella, Yersinia y Vibrio.

Siembra de Muestras Para sembrar las muestras, se requiere de material estéril también y de un mechero para poder sembrar alrededor de él.

Asa estériles de 1ul y 10 ul. Asas de metal, que se puedan incinerar en la llama del mechero. Medios de cultivos estériles. Tubos con suero fisiológico estéril. Estufas de cultivo.

98

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Siembra: Muestras de Orina Aséptica (Urocultivo) Sembrar en:  Agar sangre de cordero  Agar MacConkey y/o agar Cromogénico Esta debe ser sembrada con asas estériles de 1 ul, ya que el estudio que se hace es cuantitativo. Factores a considerar:  la orina si no es sembrada de forma inmediata se puede guardar hasta por 4 horas en el refrigerador.  El urocultivo es una muestra de orina, la cual se solicita para ver si existe infección urinaria o no.  La muestra debe ser de 2º chorro, (es decir se elimina el primer chorro y el segundo se recoge en un frasco estéril tapa rosca). Previo a la toma de muestra, el paciente debe hacerse aseo genital con agua y jabón de la zona genital).  Puede ser por punción vesical o sondeo, y ese procedimiento lo realiza la enfermera con técnica aséptica.

99

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Siembra: Muestras de Herida Sembrar en:  Agar Sangre de Cordero  Agar MacConkey  Caldo Thioglicolato Realizar Tinción de Gram Factores a considerar:  la muestra debe mantenerse a temperatura ambiente en el medio de transporte hasta su siembra.  esta muestra es obtenida cuando se sospecha de heridas infectadas.  esta muestra se siembra de forma directa del medio de transporte Stuart.

Siembra: Muestras Respiratorias Utilizar mascarilla N 95 (de alta eficiencia) Sembrar en:  Agar Sangre de Cordero  Agar MacConkey  Agar Chocolate Realizar Tinción de Gram Factores a considerar:  debe venir en frasco o tubo estéril y en un volumen no inferior a 1-2 ml.  debe sembrarse lo antes posible y si no, debe mantenerse en refrigeración. Estas muestras pueden ser: expectoración, lavado bronquial, lavado broncoalveolar, aspirado traqueal cuantitativo y faríngeo.

100

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

-

Con una pipeta estéril agregar 10 μl de muestra en cada uno de los siguientes

medios: Placa Agar Sangre (Ambiente CO2), Placa chocolate (Ambiente CO2), Placa Agar Mac Conkey y realizar siembra. Realizar tinción de gram de las diferentes muestras: -

Se realiza tomando un asa de 10 ul, se introduce en la muestra y se pone en un

portaobjeto. -

Se deja secar para luego teñir.

-

Incubar a 35 ºC en estufa de cultivo.

En caso que la muestra sea un Aspirado Traqueal Cuantitativo (ATC) Realizar Tinción de Gram de las diferentes muestras. -

Se realiza tomando un asa de 10 ul.

-

Se introduce en la muestra y se pone en un portaobjeto.

-

Se deja secar para luego teñir.

Sacar del refrigerador: -

Dos placas de Agar Sangre de Cordero,

-

Dos placas de Agar Mc Conkey, y un tubo que contenga 9.9 ml de Suero

Fisiológico. -

Dejar que logren temperatura ambiente.

Diluir la muestra en igual volumen de suero fisiológico (Dilución 1:2). -

Homogeneizar con perlas de vidrio.

-

Agitar en Vortex durante 2 minutos.

-

Extraer 0.1 ml de la muestra diluida y agregar a un tubo con 9.9 ml de suero

fisiológico. -

Agitar en Vortex por 2 minutos.

-

Rotular una placa de Agar Sangre de Cordero y otra de Agar Mac Conkey con la

letra “A”. -

Rotular una placa de Agar Sangre de Cordero, Agar Chocolate y otra de Agar

Mac Conkey con la letra “B”. -

En las placas “A” sembrar 0.1 ml de la muestra homogeneizada.

-

Diseminar con asa de 10 ul y dejar secar. (Dilución final de las placas: 1: 2000)

101

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

-

En las placas “B” sembrar 0.01 ml de la muestra. Asa de color Azul calibrada para

10 ml (Dilución final de las placas: 1: 20000) -

Incubar las placas de Agar Sangre de Cordero en CO2 y las placas de Agar Mac

Conkey en atmósfera aeróbica a 35º C. -

Incubar por un máximo de 72 horas.

Muestras para Estudio de Koch Baciloscopía: Si la muestra es para búsqueda de Bacilo de Koch, esta muestra debe ser tomada en un frasco oscuro, ya que el bacilo es lábil a la luz. Se debe tomar a primera hora en la mañana, en días consecutivos y se toman 2 muestras. Se realiza el procedimiento en GBS (Gabinete de Bioseguridad A II), utilizando este de acuerdo a protocolo. Se abre la muestra numerada dentro del GBS y se coloca la porción más purulenta y mucosa de la muestra sobre un portaobjeto previamente identificado con el número correspondiente a la muestra. Con un segundo portaobjeto presione la muestra, con el fin de extender la muestra uniformemente en los portaobjetos. Friccione suavemente entre ambas caras de las láminas que contiene la muestra. Repetir este proceso hasta obtener una capa gruesa y homogénea de la muestra en 2/3 del portaobjeto. Depositar la lámina sobre el agitador térmico para que se seque. Realizar la tinción de Ziehl Neelsen bajo la campana extractora.

Cultivo de Koch: Descontaminación de la Muestra Poner las muestras a estudiar y los respectivos tubos cónicos de plástico de 50 ml previamente identificados con el número de la muestra al GBS,

en dos gradillas

independientes.

102

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Etapas en común para las muestras naturalmente contaminadas: 

Agregar al tubo cónico previamente enumerado con el número de la muestra un volumen de solución de Hidróxido de Sodio 3,5% con Rojo Fenol como indicador, igual al volumen de muestra recolectada.



Tapar el tubo cónico con su respectiva tapa.



Trasladar los tubos cónicos que contienen la muestra con la solución de álcalis a la cámara de incubación de la sección.



Agitar los tubos cónicos en el agitador mecánico durante 20 minutos a 37°C.



Trasladar los tubos cónicos de regreso al GBS.



Neutralizar el pH de la muestra de inmediato. Para ello deberá agregar gota a gota una solución de Ácido Sulfúrico 7%, hasta observar una leve tonalidad amarilla en la mezcla de la muestra.



Ajustar el pH de la solución con Hidróxido de Sodio 2%, gota a gota hasta cuando esta obtenga un leve tono rosado que corresponde a un pH 6.6 a 7.2.



Comprobar el pH con papel indicador.



Esperar 5 a 10 minutos y tomar pH al azar a 2 ó 3 muestras de la serie para ver si se estabilizo el pH, si no es así se vuelve a neutralizar.

Siembra de la Muestra  Se realiza la siembra de las muestras a continuación de la neutralización y descontaminación de la muestra según se requiera, dentro del GBS. 

Identificar los tubos de Medio de Lowenstein-Jensen a utilizar durante la siembra de las muestras respectivas.



Trasvasijar 0,3 a 0,5 ml de la muestra en tubo cónico, en cada tubo de medio de cultivo Lowenstein-Jensen



Sembrar la muestra en cuatro tubos (a excepción de las muestras de expectoración que se siembran en tres tubos y las muestras de orina que se siembran en 6 tubos).



Incubar los tubos de medio de cultivo

Lowenstein-Jensen en posición horizontal

inclinada, (cajas con inclinación de 10°) de manera que la muestra bañe la superficie del medio.

Muestras de Deposición 103

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Coprocultivo Deber ser sembrado en: 

Agar MacConkey



Agar TCBS



Agar Salmonella-Shigella



Caldo selenito

Este examen se solicita cuando hay sospecha de infecciones por las siguientes bacterias:  Salmonella, Shigella, Yersinia y Campylobacter.  Escherichia coli O157H7 en menores de 2 años Se toma la muestra con medio de transporte Cary-Blair, se pasa la tórula por la región perianal y se guarda en el medio hasta ser sembrada en el Laboratorio Clínico lo antes posible. Leucocitos Fecales: Este se carga directamente en un portaobjeto en donde se ponen 2 gotas de la deposición y encima se pone una laminilla para poder ser observada al microscopio por el Tecnólogo Médico. La muestra se toma en un recipiente con tapa rosca, y se deposita la muestra de forma directa.

Muestra Secreciones

104

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Muestra: Secreción Ótica-Ocular Sembrar en: 

Agar Sangre de Cordero



Agar MacConkey



Agar Chocolate



Agar Thayer Martin (solo las oculares)



Caldo Tioglicolato

Realizar Tinción de Gram

Factores a considerar: La muestra debe mantenerse a temperatura ambiente hasta su siembra. Estas muestras se toman en medio de transporte Stuart.

Muestras de Sangre (Hemocultivo) Sembrar en:  Agar Sangre de Cordero  Agar MacConkey  Agar Chocolate Realizar Tinción de Gram Estas muestras se solicitan cuando hay sospecha de infección en la sangre, y se toman de forma directa del paciente y pueden ser Hemocultivos Periféricos o de Catéter. Se utiliza técnica aséptica. Se utilizan medios comerciales que tienen anticoagulantes para depositar la muestra obtenida. La cantidad en adultos debe ser de 5-10 ml y en recién nacidos de 0.5-2 ml de sangre.

Secreción Uretral

105

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Se debe sembrar en:  Agar Chocolate  Agar Sangre de Cordero Si solicitan cultivo de Neisseria, se debe sembrar además en Agar Thayer Martin. Estas muestras se toman en medio de transporte Stuart. Se realiza Tinción de Gram de la muestra.

Muestras de Líquidos Centrifugar muestra en centrifuga de siembra (3000 rpm por 10 minuto). Eliminar sobrenandante y el sedimento sembrar. Se debe sembrar en:  Agar Chocolate  Agar Sangre de Cordero  Agar MacConkey  Agar Thioglicolato Tinción de Gram (si es de LCR se debe informar de forma inmediata) Todo se debe realizar alrededor de la llama del mechero. Incubar placas sembradas a 35° C (las placas de Agar Sangre y Chocolate se incuban en CO2), el resto de las placas solo en estufa de cultivo. Lectura e informe de Tinción de Gram de forma inmediata en sistema informático. Luego de haber transcurrido 24 horas se pueden sacar las placas de la estufa de cultivo e identificar el agente aislado, realizar estudio de susceptibilidad. En caso de muestras negativas, estudiar por 72 horas.

Estudio de Anaerobios

106

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3



La muestra debe venir en jeringa tapada sin aire y ser procesada de forma rápida.



Utilizar guantes de procedimientos para su realización.



Etiquetar muestra a trabajar y todo el material seleccionado para siembra y microscopía. Realizar siembra de anaerobios en:



Tioglicolato-hemina,



PAS-anaerobio,



PAS-Kanamicina (+hemina). Incubar por 5 días a 35°C en estufa de cultivo para secreciones en anaerobiosis en Jarra GAS-PACK Realizar Tinción de Gram. Además sembrar en:



Agar sangre y Agar Mc Conkey que queda en aerobiosis. Incubar 72 horas a 35°C en estufa de cultivo para secreciones.



Realizar todo esto antes de 30 minutos, una vez llegada la muestra.



Leer Tinción de Gram Luego de 5 días de incubación, se deben retirar las placas de la estufa de cultivo para la lectura de las placas. Identificar agente aislado

ETAPAS DE REALIZACIÓN DE UN FROTIS PARA TINCIÓN

107

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Lo primero que debo hacer es: 

Prender mechero regulando llama azul.



Flamear portaobjeto.



Dejar enfriar portaobjeto.



Enumerar la lámina con lápiz dermatográfico. [Esterilizar asa metálica (si se decide utilizar ésta) hasta “rojo vivo”, dejar enfriar].



Usar asa plástica estéril utilizada en siembra de la misma muestra.



Expandir muestra sobre la superficie del portaobjetos (esta puede ser directa o del cultivo).



Fijar muestra al calor, flameando repetidas veces portaobjeto por la llama. También se puede secar a temperatura ambiente.



Proceder a hacer tinción (ver paso de tinciones)



Los materiales a utilizar son: portaobjetos de 76 x 26 mm, asa estéril o asa metálica, agua destilada, lápiz dermatográfico o marcador de vidrio, mechero Bunsen. centrífuga, agua destilada.

Tipos de Frotis Frotis de Muestra Primaria 

Enumerar lámina con número de la muestra trazando una línea de separación para evitar que el número se borre durante la tinción.



Tomar desde la muestra una gota (con asa estéril) o un Torulado y distribuir en forma circular al centro de la lámina.



Fijar la lámina con calor en la llama del mechero.



Teñir para Tinción de Gram.



Si la muestra es para Coprocultivo, teñir con tinción para Campylobacter spp. (AX2).

Frotis de Colonias 

Enumerar lámina con número de la muestra.

108

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3



Colocar una gota de agua destilada estéril por cada colonia a la que se le realice frotis



Flamear un asa o utilizar un asa estéril y tomar la colonia en estudio.



Emulsionar la colonia.



Fijar lámina al calor de la llama (mechero).



Teñir con Tinción de Gram,

Frotis de Líquido Cefalorraquídeo 

Centrifugar la muestra a 3000 r.p.m. por 15 minutos.



Traspasar el sobrenadante a un tubo Kahn



Marcar una lámina con el número de la muestra y hacer dos círculos que servirán para delimitar la muestra.



Tomar una muestra desde el sedimento y extenderla dentro de las marcas.



Fijar al calor de la llama del mechero.



Teñir mediante Tinción de Gram.

Extendido de Hemocultivo 

Numerar una lámina de 76 x 26 mm con el número de petición en estudio.



Homogeneizar el contenido de la botella, limpiar tapa con torunda con alcohol al 70%.



Extraer una muestra de sangre desde la botella, pinchando con una jeringa desechable.



Eliminar la primera gota de sangre en solución de Hipoclorito de Sodio 0,5% para evitar que la muestra salpique en la lámina.



Depositar una gota de la muestra en la lámina enumerada.



Eliminar el exceso de sangre en Hipoclorito de Sodio 0,5%.



Eliminar la jeringa completa con aguja en caja para cortopunzantes.



Con un cubreobjeto en ángulo de 45º extender una capa de sangre sobre la lámina.



Fijar al calor de la llama del mechero.



Teñir para Tinción de Gram.

109

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

REALIZACION Y ESTUDIO DE ANTIBIOGRAMAS

Los estudios de susceptibilidad están indicados para apoyar la terapia antimicrobiana de tratamiento en procesos infecciosos por bacterias en las que la identidad del microorganismo no es suficiente para predecir en forma confiable su susceptibilidad.

Método de Difusión en Agar Reactivos para Método de Difusión en Agar o Kirby Bauer •

Medio Agar Müller Hinton

•

Sensidiscos dependiendo del agente.

•

Caldo Triptosa fosfato (Tripticase) o,

•

Solución salina 0,9% estéril

•

Etalón 0.5 Mcfarland de BaSO4

Técnica a realizar: 

Utilizar guantes desechables para realizar el procedimiento.



Enumerar todo el material seleccionado para el procedimiento.



Crear un campo de trabajo estéril encendiendo el mechero.



El Técnico debe tomar 2-4 colonias de la cepa aislada para realizar el inóculo en un tubo con Tripticase, el cual se debe ajustar a 0.5 Mcfarland (medir con turbidímetro)



Con una tórula estéril, tomar inóculo y pasarlo a una placa de agar Müller Hinton (sembrando toda la placa).



Agregar los sensidiscos según el microorganismo a estudiar con pinzas estériles o con el dispensador (los sensidiscos se guardan refrigerados a 4ºC).



Incubar placas sembradas por 18-24 horas a 35° C en estufa para Antibiograma.



El Tecnólogo Médico es el encargado de leer e interpretar los antibiogramas, pasada 24 horas.

Métodos Automatizados

110

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

En este momento existen varios sistemas que ofrecen diferentes niveles de automatización para el estudio de susceptibilidad. Utilizan una medición turbidimétrica o fluorométrica para detectar crecimiento bacteriano en un medio líquido. La mayoría de ellos emplea el método de micro dilución y períodos de incubación menores que los habituales. Estos métodos son bastante confiables para el estudio de Enterobacterias y otros gérmenes de crecimiento rápido.

111

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

TRABAJO PERSONAL DEL ESTUDIANTE “Microbiología: Muestras Microbiológicas y su Diagnóstico Procedimental”

112

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Desarrolle los siguientes Talleres o Actividades de acuerdo a instrucciones dadas para cada uno de ellos. El desarrollo de estos talleres le permitirá comprender lo relevante que es su quehacer en el proceso analítico de las diversas muestras para el diagnóstico clínico y tratamiento antimicrobiano de las diversas patologías infecciosas.

Recuerde que es Ud. el único forjador de su aprendizaje, aplique su proceso activo con apego absoluto a lo indicado en la técnica y obtendrá un resultado exacto y confiable, como espejo de la condición de la muestra en estudio.

113

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Taller Teórico Práctico N° 1 “Técnica del Asa Calibrada” I Ítem: Actividad Procedimental Realice la siguiente actividad práctica de acuerdo a las instrucciones:

1ª Actividad Práctica: Urocultivo  Obtenga una muestra de Orina Aséptica y siémbrela según protocolo.  Al día siguiente, observe su desarrollo microbiano y determine si corresponde realizar el Antibiograma.  Complemente su actividad con un análisis conceptual de la técnica realizada y el resultado de su siembra bacteriológica.

114

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

2ª Actividad Práctica: Coprocultivo  Obtenga una muestra de Deposición y siémbrela según protocolo.  Observe su desarrollo microbiano al día siguiente y determine si corresponde realizar estudio bacteriano al desarrollo obtenido. Identifique las variables que determinan esta decisión.  Desarrolle un “Flujograma de la Técnica” realizada e identifique potenciales patógenos relacionados.

115

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

3ª Actividad Práctica: Hemocultivo  Confeccione un “Mapa Conceptual” del Examen de Hemocultivo en relación al rol que le corresponde realizar en su proceso analítico cuando es (+) .

 ¿Cuál es el rol que el compete a Ud. como Técnico en el proceso automatizado?

116

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

4ª Actividad Práctica: Observación Temática 1

1

2

3

4

Observe con detención los esquemas, identifique la actividad, ordénelos según secuencia procedimental e identifique posibles errores y/o etapas faltantes

117

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

5ª Actividad Práctica: Observación Temática 2

Observe con detención e identifique la actividad, destacando las etapas y pasos faltantes para una correcta técnica aséptica.

118

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

6ª Actividad Práctica: Pruebas de Identificación Bioquímica Bacteriana Observe el recuadro y complete de acuerdo a lo solicitado referente a Medios de Cultivo Diferenciales. Medios de Cultivo Diferenciales Dibujo Nombre Del Medio

Disposición (Tubo / Placa)

Medio Original

Medio con Técnica de Siembra

Medio con Desarrollo Microbiano

Desarrolle un breve comentario de la actividad realizada:

119

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

7ª Actividad Práctica: Pruebas de Susceptibilidad Microbiana (Antibiograma)

Observe con detención ambos esquemas e indique las diferencias de ambas técnicas:

120

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

PARASITOLOGÍA El hombre puede enfermar tanto por causas internas y externas. Dentro de las causas externas están los agentes biológicos que reciben el nombre de “Parásitos” y el ser vivo que los alberga se denomina “Huésped”.

Cuando un organismo parásito produce manifestaciones clínicas sobre el organismo hospedador, decimos que se está produciendo un fenómeno de parasitosis. Hay que tener muy en cuenta que todos los tipos de parasitosis son parasitismos, pero no todos los tipos de parasitismos son necesariamente parasitosis.

Un parásito se puede definir como una de las partes de dos especies que interaccionan teniendo integrados sus genomas hasta tal punto que el parásito depende, como mínimo, de uno de los genes de la otra especie para sobrevivir.

Hay varios tipos de interacciones biológicas en las cuales dos organismos se asocian para vivir. Las más importantes son: Parasitismo: Este tipo de asociación sucede cuando un ser vivo (parásito) se aloja en otro de diferente especie (huésped u hospedero) del cual se alimenta. El parasitismo abarca desde los virus hasta los artrópodos, pero por costumbre se ha restringido el término parásito para aquellos organismos que pertenecen al reino animal. Comensalismo: Se presenta cuando dos especies diferentes se asocian en tal forma que solamente una de las dos obtiene beneficio, pero ninguna sufre daño. Inquilinismo: Ocurre cuando un ser se aloja en otro sin producirle daño y sin derivar alimento de él.

121

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Simbiosis: Sucede cuando dos especies diferentes se asocian para obtener beneficio mutuo, sin el cual no pueden subsistir.

Terminología

A continuación se presentaran las terminologías principales para entender el estudio de parasitología: 

Huésped u Hospedero: Se conoce como el animal que recibe el parásito.



Huésped Definitivo: Hospedero en el cual el parasito alcanza su madurez sexual.



Huésped Intermediario: Hospedero en el cual el parasito desarrolla parte de su ciclo evolutivo, sin alcanzar su madurez sexual.



Reservorio: Se considera reservorio al hombre, animales, plantas o materia inanimada, que contengan parásitos u otros microorganismos que puedan vivir y multiplicarse en ellos y ser fuente de infección para un huésped susceptible.



Vector: Se considera en parasitología que el vector es un artrópodo u otro animal invertebrado que transmite el parásito al huésped, bien sea por inoculación al picar, por depositar el material infectante en la piel o mucosas o por contaminar alimentos u otros objetos. Los vectores pueden ser sólo portadores mecánicos de los parásitos como en el caso de moscas o cucarachas, o ser verdaderos portadores biológicos cuando los parásitos se multiplican en ellos o las larvas se transforman para ser infectantes.



Infección Parasitaria: Sucede cuando el huésped tiene parásitos que no le causan lesión o enfermedad, lo cual constituye el estado de portador sano.



Enfermedad Parasitaria: Se presenta cuando el huésped sufre alteraciones patológicas y sintomatología producidas por parásitos.



Zoonosis: Infección que se trasmite en forma natural entre el hombre y los demás vertebrados.



Ciclo Evolutivo: etapas secuenciales del desarrollo de un parasito.

122

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3



Ciclo de Transmisión: Etapas por las cuales pasa un parasito desde la fuente de infección hasta el susceptible.



Forma Infectante: Fase del parasito capaz de infectar al huésped.

Clasificación Los parásitos se pueden clasificar de distintas maneras: Dependiendo del tiempo de permanencia del parásito en su huésped se dividen en: 

Permanentes (aquellos que indispensablemente deben permanecer toda su vida en el huésped)



Temporales (los habitan transitoriamente en el huésped)

Según la capacidad de producir lesión o enfermedad en el hombre, los parásitos pueden dividir: 

Patógenos



No patógenos

Según su ubicación topográfica: 

Ectoparásitos: infestaciones



Endoparásitos: infecciones

Según su ubicación en órganos y sistemas: 

Enteroparásitos (ej: tubo digestivo)



Histoparásitos (ej: en tejidos)



Hemoparásitos (ej: en sangre)

Ciclo de Vida Es el proceso que desarrolla el parasito para llegar al huésped, desarrollarse en él y producir formas infectantes que perpetúan la especie.

123

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Los protozoos intestinales desarrollan el ciclo de vida más simple, es aquél que permite a los parásitos dividirse en el interior del huésped, para aumentar su número y a su vez producir formas que salen al exterior para infectar nuevos huéspedes.

En los helmintos, se presentan otros tipos de ciclo que requieren la salida al exterior de huevos o larvas, que en circunstancias propicias de temperatura y humedad, llegan a ser infectantes.

En ciclos más complicados existen Huéspedes Intermediarios, en los cuales las formas larvarias crecen o se multiplican antes de pasar a los nuevos huéspedes definitivos. En algunos casos existen reservorios animales o más de un huésped intermediario y en otros, es indispensable la presencia de vectores. Los pasos, a veces muy complicados, a través de huéspedes o del organismo humano, están regidos por tropismos que llevan a los parásitos por determinadas vías o los hacen permanecer en ciertos lugares.

Ciclo de Trasmisión Son etapas que deben trascurrir en un parasito para pasar del huésped infectado (fuente de infección) al huésped susceptible. Además pueden ser congénitos, connatales y adquiridos. Mecanismos Adquiridos: a) Directo: 

Cutáneo



Ciclo ano-mano-boca

b) Indirecto 

Vehículo: Alimento-agua; Tierra-cosas; Fómites-ropa; Utensilios



Aire: Gotitas de flugge; polvo

c) Vectores 

Mecánico



Biológico

124

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Mecanismo de Acción Los parásitos afectan al organismo humano de maneras muy diversas, dependiendo del tamaño, número, localización, etc.; los principales mecanismos por los cuales los parásitos causan daño a sus huéspedes son: 

Mecánicos: Los efectos mecánicos son producidos por obstrucción, ocupación de espacio y compresión; el primero sucede con parásitos que se alojan en conductos del organismo, y el segundo ocurre con aquellos que ocupan espacio en vísceras.



Traumáticos: Los parásitos pueden causar traumatismo en los órganos donde se localizan.



Bioquímicos.: Algunos parásitos producen sustancias tóxicas o metabólicas que tienen la capacidad de destruir tejidos.



Inmunológicos: Los parásitos y sus productos de excreción derivados del metabolismo, producen reacción de hipersensibilidad inmediata o tardía.



Expoliativos: Es el mecanismo por el cual el parasito consume elementos propios del huésped

125

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Clasificación de los Parásitos

Protozoos El reino Protista y el subreino Protozoa, agrupan los organismos unicelulares que se denominan Protozoos o Protozoarios. Se pueden encontrar de diferentes formas, de vida libre y otros siendo parásitos de animales y plantas. Son microscópicos y se localizan en diferentes tejidos. Los protozoos constituyen uno de los reinos animales más primitivos de la historia de la Tierra. En los protozoos se distinguen los Trofozoitos (forma vegetativa) y Quistes (forma de resistencia). Morfología Los Trofozoitos constan de membrana, citoplasma y núcleo. La membrana varía de espesor según las especies y sus principales funciones son: limitar el parásito, servir como elemento protector y permitir el intercambio de sustancias alimenticias y de excreción. El citoplasma es una masa coloidal y representa el cuerpo del organismo, en algunas especies se puede diferenciar claramente una parte interna, granulosa y vacuolada llamada endoplasma y otra externa, hialina, refringente que es el ectoplasma. En algunos protozoos existen vacuolas en el citoplasma, unas son alimenticias encargadas del metabolismo de los nutrientes y otras excretoras que facilitan la eliminación de sustancias. El núcleo es esférico u ovoide, se encuentra localizado en cualquier parte del citoplasma.

Reproducción Los protozoarios se multiplican por reproducción asexual y sólo algunos tienen reproducción sexual. La asexual tiene dos modalidades división binaria y división múltiple.

126

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Locomoción Los protozoos presentan mecanismos diversos de locomoción, función que se tiene en cuenta como uno de los parámetros para su clasificación. Según el modo que tienen para desplazarse se habla de: 

Rizópodos o Amebianos: se desplazan emitiendo pseudópodos.



Flagelados: Se desplazan mediante flagelos



Ciliados: Se desplazan mediante cilios



Esporozoos: al no tener organelos visibles de movilización, lo hacen mediante deslizamiento.

127

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Helmintos Los helmintos, comúnmente llamados gusanos, son seres multicelulares o metazoarios, ampliamente distribuidos en la naturaleza. Muchos de ellos viven libremente y otros se han adaptado a llevar vida parasitaria en vegetales, animales o en el hombre. Según su aspecto se dividen en: Nematodos y Platelmintos. Morfología y Fisiología Los Nematelmintos o Nemátodos y los Platelmintos difieren morfológicamente, los primeros son gusanos cilíndricos, habitualmente de sexos separados y con dimorfismo sexual. Al corte transversal presenta una envoltura externa, la cutícula, que impide que el gusano sea destruido por las enzimas del huésped, a su vez la capa muscular es la que proporciona movilidad al parasito.

128

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

A su vez los Platelmintos son gusanos acintados generalmente hermafroditas y sin cavidad visceral. En este grupo podemos encontrar los Cestodos que son de cuerpo plano, dividido en escólex o cabeza, cuello y estróbilo, formado por proglótidas (inmaduras, maduras y grávidas) y los Trematodos que son de cuerpos planos no segmentados.

129

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Artrópodos Son en su mayoría animales invertebrados, caracterizados por poseer patas articuladas, pueden ser parásitos de forma permanente o temporales del hombre; actúan como huésped intermediario. Se pueden distinguir según la cantidad de patas que poseen: 

Insectos hexápodos con 6 patas,



Arácnidos u octógodos con 8 patas y



Crustáceos o decápodos con 10 patas

Insectos Hexápodos: Los insectos adultos tienen el cuerpo dividido en tres regiones: a) cabeza que posee un aparato bucal y un par de antenas; b) tórax, dividido en tres segmentos: protórax, mesotórax y metatórax, de cada uno de los cuales sale un par de patas; en los insectos que tienen alas se encuentran un par en el mesotórax y otro en el metatórax; c) abdomen; dividido en segmentos.

130

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Arácnidos u Octógodos: Comprende las arañas, garrapatas, ácaros y escorpiones. El cuerpo de los adultos está dividido en dos regiones, cefalotórax y abdomen.

Crustáceos o Decápodos: Hay pocos crustáceos de importancia médica. Sirven como huésped intermediario de algunos parásitos humanos.

131

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Los artrópodos producen lesiones o enfermedades de intensidad muy variable y por diferentes mecanismos que agrupamos en prurito, alergias cutáneas, alergias respiratorias, intoxicaciones y lesiones destructivas e invasivas. Además, podemos diferenciar en aquellos que realizan según su ciclo evolutivo, Metamorfosis Incompleta y Metamorfosis Completa.

La Metamorfosis Incompleta es aquella donde se produce un desarrollo gradual de un insecto en etapa adulta. Se caracteriza por la ausencia de la fase de pupa. Consta de tres etapas: huevo, larva o ninfa y adulto. Dentro de los artrópodos que desarrollan metamorfosis incompleta podemos encontrar: Cucarachas, piojos, chinches, acaro de la sarna, garrapatas y arañas. Ciclo Evolutivo de Metamorfosis Incompleta

132

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Por su parte la Metamorfosis Completa consta de cuatro etapas: huevo, larva o ninfa, pupa y adulto. Dentro de los artrópodos que desarrollan metamorfosis completa podemos encontrar: Moscas, mosquitos y pulgas Ciclo Evolutivo de Metamorfosis Completa

133

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Parasitosis por Protozoos Amebiasis Es la infección del intestino grueso del hombre por el protozoo Entamoeba histolytica.

Forma infectante

 Quiste tetrágeno

Vía de infección



Mecanismo de trasmisión Fuente de infección



Oral Fecalismo humano Alimentos y agua contaminada con heces humanas, Manipuladores de alimentos

Reservorio



Ciclo

 Monoxénico

Hombre

Ciclo Evolutivo Entamoeba histolytica

134

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Balantidiosis Zoonosis producida por Balantidium coli, protozoo ciliado, comensal del intestino grueso del cerdo (hombres infectados), que afecta al hombre originando a veces un síndrome disentérico o diarreico.

Forma infectante

 Quiste

Vía de infección



Mecanismo de trasmisión Fuente de infección



Oral Fecalismo de cerdo (humano) Alimentos y agua contaminada con heces de cerdos (humanos)

Reservorio



Ciclo

 Zoonosis directa (Monoxénico)

cerdo

Ciclo Evolutivo Balantidium coli

135

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Giardiasis Infección del intestino delgado del hombre, producida por el protozoo Giardia lamblia

Forma infectante

 Quiste

Vía de infección



Mecanismo de trasmisión Fuente de infección



Oral Fecalismo humano Alimentos y agua contaminada con heces humanas, Manipuladores de alimentos

Reservorio



Ciclo

 Monoxénico

hombre

Ciclo Evolutivo Giardia lamblia

136

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Isosporiasis Infección del intestino delgado del hombre, por Isospora belli, protozoo, coccidio que produce un cuadro clínico caracterizado por fiebre, diarrea subaguda y Eosinofilia.

Forma infectante



Ooquiste maduro

Vía de infección



Oral

Mecanismo de trasmisión

Fecalismo humano

Fuente de infección



Alimentos y agua contaminada con heces humanas

Reservorio



hombre

Ciclo



Monoxénico

Ciclo Evolutivo Isospora belli

137

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Criptosporidiasis Infección del aparato digestivo por protozoos del género Cryptosporidium sp., de los cuales Cryptococcus muris y Cryptococcus parvum afectan a mamíferos, siendo Cryptococcus parvum el que parasita al hombre.

Forma infectante



Ooquiste maduro

Vía de infección



Oral

Mecanismo de trasmisión Fuente de infección



Fecalismo humano o animal Alimentos y agua contaminada con heces humanas o animales, Manipuladores de alimentos

Reservorio



Animales

Ciclo



Zoonosis directa (Monoxénico)

Ciclo Evolutivo Crytosporidium sp.

138

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Tricomoniasis Infección del hombre provocada por protozoos flagelados del género Trichomonas, localizadas en la cavidad bucal, digestiva y urogenital. En el ser humano se han demostrado 3 especies: Trichomonas tenax (comensal de la boca), Trichomonas hominis (comensal del intestino grueso) y Trichomonas vaginalis, parasito de la vagina en la mujer y uretra, vesículas seminales y próstata en el hombre.

Forma infectante



Trofozoito

Vía de infección



Genital

Mecanismo de trasmisión

Sexual

Fuente de infección



Individuos infectados

Reservorio



Hombre

Ciclo



Monoxénico

Ciclo Evolutivo Trichomonas vaginalis.

139

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Blastocistosis Infección del intestino del hombre producida por el protozoo Blastocystis hominis, no presenta forma quística. Es causante de diarrea y su patogenicidad depende del número de parásitos.

Forma infectante



Trofozoito (vacuolar, granular, ameboide)

Vía de infección



Oral

Mecanismo de trasmisión  Fuente de infección



Fecalismo humano Alimentos y agua contaminada con heces humanas, manipuladores de alimentos.

Reservorio



Hombre

Ciclo



Monoxénico

Ciclo Evolutivo Blastocystis hominis

140

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Enfermedad de Chagas Es la infección del hombre, de mamíferos y triatominos (vinchuca) producida por un protozoo flagelado, Tripanosoma cruzi. En el hombre la infección puede ser congénita o adquirida. En Chile se han identificado solo dos vectores capaces de trasmitir este protozoo, el Triatoma infestans (hábitat domiciliario nocturno) y Triatoma spinolai (rural y silvestre), artrópodos hematofogos conocidos popularmente como vinchuca.

Clasificación



Protozoo, flagelado con kinetoplasto

Estadio evolutivo



Tripomastigoto, epimastigoto y amastigoto

Mecanismo de trasmisión  Vectorial, transfusional, transplacentario, trasplante de órganos. Ciclo



Metazoonosis

Ciclo Evolutivo Tripanosoma cruzi

141

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Toxoplasmosis Infección parasitaria del hombre y de diversas especies de mamíferos y de aves, producida por un protozoo coccidio llamado Toxoplasma gondii.

Clasificación



Protozoo, Apicomplexo, coccidio

Estadio evolutivo



Zoito, pseudoquiste, quiste y ooquiste

Mecanismo de trasmisión  Fecalismo

felino,

carnivorismo,

transplacentario,

transfusional y trasplante de órganos. Ciclo



Ciclozoonosis

Ciclo Evolutivo Toxoplasma gondii

142

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Parasitosis por Helmintos

Ascariasis Helminto- Nematodo que afecta el intestino delgado del hombre, por Ascaris lumbricoides, Es un geo helminto ya que sus huevos maduran en la tierra, es por esto que parasita preferentemente a los niños.

Forma infectante



Huevo larvado

Vía de infección



Oral

Mecanismo de trasmisión 

Fecalismo humano

Fuente de infección



Alimentos y agua contaminada con heces humanas.

Reservorio



Hombre

Ciclo



Monoxénico

Ciclo Evolutivo Ascaris lumbricoides

143

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Tricocefalosis Helminto -Nematodo que afecta el intestino grueso del hombre por Trichuris trichiura, a diferencia de Ascaris lumbricoides, no efectúa migraciones (sin Ciclo de Loos)

Forma infectante



Huevo larvado

Vía de infección



Oral

Mecanismo de trasmisión 

Fecalismo humano

Fuente de infección



Alimentos y agua contaminada con heces humanas.

Reservorio



Hombre

Ciclo



Monoxénico

Ciclo Evolutivo Trichuris trichiura

144

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Oxiuriasis Infección del tipo familiar producida por el Helminto- Nematodo Enterobius vermicularis conocido popularmente como “pidulle”. Habita en el ciego del hombre y las hembras migran a la región perianal para depositar sus huevos.

Forma infectante



Huevo larvado

Vía de infección



Oral, Respiratoria

Mecanismo de trasmisión 

Ciclo ano-mano- boca

Fuente de infección



Ambiente oxiuriótico

Reservorio



Hombre

Ciclo



Monoxénico

Ciclo Evolutivo Enterobius vermicularis

145

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Teniasis Infección humana producida por los Helmintos- Cestodos por los ejemplares adultos de Taenia solium y Taenia saginata.

Taenia solium El huésped intermediario de este parasito es el cerdo, en el que se desarrolla el estado larval denominado Cysticercus cellulosae. El hombre al comer carne de cerdo crudo y/o mal cocida adquiere la Taenia (huésped definitivo), infectando el intestino delgado del hombre.

Forma infectante

Cisticerco de Taenia solium (Cisticercus cellulosae)

Vía de infección

Oral

Mecanismo de trasmisión

Carnivorismo porcino

Fuente de infección

Carne de porcino infectada con cisticercos

Hospedero definitivo

Hombre

Hospedero intermediario

Cerdo

Reservorio

Hombre

Ciclo

Heteroxénico

Ciclo Evolutivo Taenia solium

146

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Taenia saginata El huésped intermediario de este parasito es el Vacuno, en el que se desarrolla el estado larval denominado Cysticercus bovis. El hombre al comer carne de vacuno crudo y/o mal cocida adquiere la Taenia (huésped definitivo), infectando el intestino delgado del hombre.

Forma infectante

Cisticerco de Taenia saginata (Cisticercus bovis)

Vía de infección

Oral

Mecanismo de trasmisión

Carnivorismo porcino

Fuente de infección

Carne de vacuno infectada con cisticercos

Hospedero definitivo

Hombre

Hospedero intermediario

Vacuno

Reservorio

Hombre

Ciclo

Heteroxénico

Ciclo Evolutivo Taenia saginata

147

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Cisticercosis

Es la localización en los tejido del hombre del Cysticercus cellulosae, forma larval de Taenia solium que habitualmente infecta al cerdo

Forma infectante



Huevo

hembrionado

de

Taenia

solium

(Cisticercus

cellulosae) Vía de infección



Mecanismo de trasmisión  Fuente de infección



Oral Fecalismo humano Alimentos y agua contaminada con heces humanas, Manipuladores de alimentos

Localización



Tejido subcutáneo, musculo, Sistema nervioso central y ojo

Ciclo Evolutivo Cysticercus cellulosae

148

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Difilobotriasis Infección del intestino delgado que afecta a hombres y animales ictiófagos del HelmintoCestodo Dyphyllobothrium latum.

Forma infectante



Plerocercoide

Vía de infección



Oral

Mecanismo de trasmisión 

Carnivorismo de peces

Fuente de infección



Carnes de peces infectada con plerocercoides

Hospedero definitivo



Hombre y animal ictiófago

Hospedero intermediario 

Copépodo y peces

Reservorio



Animales ictiófagos

Ciclo



Heteroxénico

Ciclo Evolutivo Dyphyllobothrium latum

149

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Himenolepiasis por Hymenolepis nana Infección del intestino delgado del hombre causada por el Helminto- Cestodo Hymenolepis nana, siendo este la infección por cestodos más frecuente del hombre.

Forma infectante

Huevo hembrionado (Cisticercoide)

Vía de infección

Oral

Mecanismo de trasmisión

Fecalismo humano (consumo de artrópodos)

Fuente de infección

Alimentos y agua contaminada con heces humanas, Manipuladores de alimentos, artrópodos infectados con cisticercoides

Hospedero definitivo

Hombre

Hospedero intermediario

Hombres , Artrópodos

Reservorio

Hombre

Ciclo

Monoxénico

Ciclo Evolutivo Hymenolepis nana

150

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Himenolepiasis por Hymenolepis diminuta

Infección accidental del intestino delgado del hombre causada por el Helminto- Cestodo Hymenolepis diminuta propia de ratas y ratones

Forma infectante

Cisticercoide

Vía de infección

Oral

Mecanismo de trasmisión

Consumo de artrópodos

Fuente de infección

Artrópodos infectados con cisticercoides

Hospedero definitivo

Ratas (accidentalmente el hombre)

Hospedero intermediario

Artrópodos

Reservorio

Rata

Ciclo

Heteroxénico

Ciclo Evolutivo Hymenolepis diminuta

151

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Dipilidiasis Infección accidental del intestino delgado del hombre causada por el Helminto- Cestodo Dipylidium caninum, propia perros, gatos, otros caninos y felinos silvestres.

Forma infectante



Cisticercoide

Vía de infección



Oral

Mecanismo de trasmisión 

Consumo de artrópodos

Fuente de infección



Artrópodos infectados con cisticercoides

Hospedero definitivo



Caninos y felinos (accidentalmente el hombre)

Hospedero intermediario 

Artrópodos

Reservorio



Caninos y felinos

Ciclo



Heteroxénico

Ciclo Evolutivo Dipylidium caninum

152

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Hidatidosis

Es la presencia en los órganos de animales y hombre de la taenia Echinococcus granulosus que vive en el intestino delgado del perro.

Forma infectante



Cisticercoide

Vía de infección



Oral

Mecanismo de trasmisión 

Consumo de artrópodos

Fuente de infección



Artrópodos infectados con cisticercoides

Hospedero definitivo



Caninos y felinos (accidentalmente el hombre)

Hospedero intermediario 

Artrópodos

Reservorio



Caninos y felinos

Ciclo



Heteroxénico

Ciclo Evolutivo Echinococcus granulosus

153

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Triquinosis Es la presencia en la carne de cerdo de quistes tisulares del Helminto nematodo Trichinella spiralis que vive en el intestino delgado de animales infectados.

Forma infectante



Quiste tisular

Vía de infección



Oral

Mecanismo de trasmisión 

Carnivorismo

Fuente de infección



Carne de cerdo infectada con quiste larvados

Hospedero definitivo



Animales infectados

Hospedero intermediario 

Animales infectados

Reservorio



Rata

Ciclo



Monoxénico

Ciclo Evolutivo Trichinella spiralis

154

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Fasciolasis Es la presencia en los canalículos biliares del hombre y animales herbívoros del helminto trematodo Fasciola hepática.

Forma infectante



Metacercaria

Vía de infección



Oral

Mecanismo de trasmisión 

Consumo de berros

Fuente de infección



Berros contaminados con metacercarias

Hospedero definitivo



Hombres y animales herbívoros

Hospedero intermediario 

Caracol de agua dulce

Reservorio



Caninos y felinos

Ciclo



Heteroxénico

Ciclo Evolutivo Fasciola hepática

155

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

TRABAJO PERSONAL DEL ESTUDIANTE “Microbiología: Diagnóstico Parasitológico Procedimental”

156

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Desarrolle los siguientes Talleres o Actividades de acuerdo a instrucciones dadas para cada uno de ellos. El desarrollo de estos talleres le permitirá comprender lo relevante que es su quehacer en el proceso analítico de las diversas muestras para el diagnóstico parasitológico, como de las medidas de prevención y de saneamiento básico.

Recuerde que es Ud. el único forjador de su aprendizaje, aplique su proceso activo con apego absoluto a lo indicado en la técnica y obtendrá un resultado exacto y confiable, como espejo de la condición de la muestra en estudio.

157

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Taller Teórico Práctico N° 1 “Técnica Examen Parasitológico Seriado de Deposiciones” I Ítem: Actividad Procedimental El EPSD es el procedimiento de diagnóstico de laboratorio de mayor demanda en el área de la Parasitología en los laboratorios clínicos del país. Para realizarlo, se describen métodos basados principalmente en la concentración de los elementos parasitarios mediante sedimentación por fuerza de gravedad, centrifugación o flotación, entre los más empleados, que permiten concentrar los distintos estadios microscópicos o elementos de desarrollo de protozoos y helmintos parásitos presentes en una muestra de deposiciones. El procesamiento debe ser de un número de tres muestras recogidas en días alternados (el periodo de recolección total comprende 5 días). Materiales para la Obtención de la Muestra 

3 frascos plásticos limpios, no necesariamente estériles, con cierre hermético, de tapa rosca, boca ancha, con etiquetas y que contengan 15 mL de solución fijadora c/u para frascos de 30 ml.

Se recomienda el uso de frascos con cucharilla

incorporada o 3 paletas de madera auxiliares. 

Hoja impresa con las instrucciones para la recolección de las muestras. La hoja debe basarse en los aspectos generales detallados en los requisitos de la muestra, en lenguaje sencillo y comprensible. Las etiquetas deben tener suficiente espacio para los siguientes datos: - Nombre y apellido del paciente. - Fecha de obtención de la muestra

Método de Burrows Modificado Este método fue descrito por Burrows en 1967 con el nombre de Método de PAFS (Fenol Alcohol Formalina) y modificado posteriormente por Torres y Navarrete en 1972. En Chile, se le conoce mayoritariamente como Método de Burrows Modificado.

158

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Éste es un método de concentración por sedimentación mediante centrifugación que se caracteriza por su buen rendimiento en el diagnóstico de huevos de helmintos, quistes y Trofozoitos de protozoos, especialmente en el diagnóstico de elementos del género Entamoeba. La ventaja radica en la calidad de la solución empleada como fijador, que penetra rápidamente en el elemento parasitario permitiendo que las características morfológicas no se alteren e inactiva las formas infectantes que pudieran estar presentes en la muestra. Procedimiento 1. Durante el procesamiento de las muestras, al igual que para los otros métodos aplicados a fluidos corporales, se deben guardar las precauciones contenidas en los manuales de bioseguridad. 2. Numerar los tres frascos del paciente con el mismo número. 3. Numerar 2 portaobjetos diferenciando la Fase “T” (Trofozoitica) de la Fase “Q” (quística), 2 vasos y 1 tubo de centrífuga con el mismo número de los frascos. 4. Homogenizar el contenido de los frascos mediante ayuda de una paleta de madera. 5. Vaciar todo el contenido de cada frasco en un vaso y agregar suero fisiológico 0,85% con la precaución de efectuar una buena dilución y homogenización. 6. Tamizar la emulsión a través de la malla colocada en un vaso limpio. 7. Observar el material retenido en la malla en busca de parásitos macroscópicos. 8. Colocar aproximadamente 12 ml de tamizado en el tubo de centrífuga. 9. Centrifugar por 3 minutos a 1.800 r.p.m. 10. Eliminar el sobrenadante invirtiendo el tubo. Si el sedimento es menor de 0,5 ml agregar del tamizado hasta lograr un sedimento de 0,5 a 0,6 ml. 11. Resuspender con suero fisiológico 0,85 % y centrifugar nuevamente. 12. Resuspender el sedimento hasta 2 ml con suero fisiológico 0,85 % y agitar para soltar el sedimento. 13. Completar a 12 ml con suero fisiológico 0,85% y centrifugar por 3 minutos a 1.800 r.p.m. aprox.

159

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

14. Repetir los pasos 11 y 12 entre dos y cuatro veces hasta obtener un sobrenadante limpio o transparente. 15. Colocar una gota de tinción, en el portaobjeto marcado con la letra “T” (fase trofosoitica). 16. Colocar una gota del sedimento, una junto a cada gota de tinción. 17. Con un ángulo del cubreobjetos mezclar el sedimento y la tinción; luego cubrir. 18. Guardar en cámara húmeda. 19. Resuspender el contenido del tubo de sedimento con suero fisiológico 0,85% hasta 10 ml. 20. Agregar 2 ml de acetato de etilo. 21. Tapar el tubo y agitar enérgicamente por 30 segundos. Destapar lentamente. 22. Centrifugar por 3 minutos a 2.000 r.p.m. 23. Vaciar todo el sobrenadante de una sola vez, en forma rápida, invirtiendo el tubo. 24. Resuspender el sedimento en 1 ml de suero fisiológico 0,85 % y homogenizar. 25. Proceder como en el punto 14 y marcar el portaobjetos con una letra “Q” (fase quística). 26. Proceder igual que en el punto 15 y 16. 27. Colocar en cámara húmeda hasta su lectura. Estas preparaciones se pueden conservar hasta 24 horas en la cámara húmeda en un lugar fresco o refrigerar entre 2 y 8°C.

Desarrolle un análisis conceptual del procedimiento realizado:

160

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Taller Teórico Práctico N° 2 “Test de Graham” I Ítem: Actividad Procedimental Los métodos diagnósticos dirigidos a la búsqueda de formas evolutivas de Enterobius vermicularis son de uso rutinario en los laboratorios clínicos del país y son de gran utilidad debido al bajo porcentaje de rendimiento que posee el examen parasitológico seriado de deposiciones en el diagnóstico de este parásito y además porque su fundamento guarda estrecha relación con el ciclo biológico de este nematodo.

Para su realización, se describen métodos basados principalmente en la observación microscópica de la muestra obtenida mediante técnicas estandarizadas de recolección diaria. El test de Graham es un método descrito en 1941 por Graham que permite adherir huevos y /o adultos de Enterobius vermicularis los que pueden ser identificados mediante observación microscópica. Se recomienda su uso para el diagnóstico en lactantes y niños menores de 12 años.

Materiales para la obtención de la muestra Test de Graham: 

5 portaobjetos de 75 mm x 25 mm limpios, no necesariamente estériles.



Cinta adhesiva transparente de 12,7 mm de ancho x 9 cm de longitud.



Contenedor plástico o de cartón prensado para proteger los portaobjetos con las muestras. Él o los contenedores deben tener etiquetas para registrar los datos del paciente.



Hoja impresa con las instrucciones para la recolección de las muestras.

161

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Procedimiento

Se deben recolectar 5 muestras por las mañanas en días sucesivos sin que el paciente lave o limpie el margen anal y perianal, de la siguiente manera, a partir del primer día: 1. Despegar la cinta adhesiva transparente del portaobjeto tomándola desde su pestaña y sin despegar el borde de fijación quedando la superficie engomada hacia afuera. 2. Indicar al paciente que debe colocarse en decúbito ventral, se deben separar los glúteos 3. Se debe aplicar repetidamente la superficie engomada en la región anal y perianal. 4. Pegar la cinta adhesiva transparente sobre el portaobjetos, procurando dejarla lo más estirada posible en toda su extensión. 5. Colocar el portaobjeto ya utilizado en el contenedor para las muestras. 6. El paciente y/o la persona que haya colaborado en la toma de muestra debe lavarse muy bien las manos después del procedimiento. 7. Repetir los pasos anteriores los días restantes hasta completar las 5 muestras.

Describa las precauciones que debe tener presente al manipular estas muestras recepcionadas en el Laboratorio de Parasitología:

162

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Taller Teórico Práctico N° 3 “Tinción de Cryptosporidium” I Ítem: Actividad Procedimental Desarrolle las actividades que se indican en el Laboratorio Clínico, conforme a instrucciones de su docente.

Técnica a desarrollar: Debe realizar los pasos previos indicados para un EPSD y extender un frotis del centrifugado:  

Teñir frotis con tinción de Ziehl – Neelsen. Cubrir el extendido con Fucsina ácida y calentar flameando hasta la aparición de vapor (No hervir).



Dejar la tinción por 10 minutos.



Lavar la lámina con agua corriente dejando escurrir.



Decolorar con alcohol-ácido durante un minuto aproximadamente.



Lavar la lámina con agua corriente dejando escurrir.



Cubrir el extendido con Azul de metileno durante 7 minutos.



Lavar la lámina con agua corriente dejando escurrir.



Secar a temperatura ambiente.

163

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Taller Teórico Práctico N° 4 “Análisis de Casos” II Ítem: Análisis de Casos Procedimentales “Una Atención de Urgencia de Cuidado”

La Sra. Angélica, de 62 años de edad, de contextura delgada, jubilada del Servicio de Salud, ex funcionaria del Laboratorio Clínico del Hospital Regional sufre una caída en el baño de su casa, la cual le deja un hematoma importante en su cara, llegando a perder el conocimiento por algunos momentos. Con posterioridad a ello, logra recuperarse y llama al Servicio de Urgencias, momentos más tarde concurre la ambulancia y la traslada al Servicio de Emergencia más cercano a su domicilio. Durante el traslado en ambulancia la Enfermera de manera amable y cordial se presenta y le realiza preguntas para saber su condición, la Sra. Angélica menciona que vive sola, y que en días anteriores se había sentido muy débil, desvaneciéndose en el sillón mientras miraba su teleserie favorita, que ha tenido cuadros febriles en las tardes y que además le duele el pecho, relacionándolo con su hábito crónico de fumar, no dándole mayor importancia. Al llegar al Box de Atención, la Enfermera de turno sin preguntarle el nombre, realiza la toma de muestras de sangre venosa y arterial, y sin dar explicaciones del procedimiento le entrega un contenedor de boca ancha para recolectar la muestra de expectoración, el que una vez obtenido deberá enviar al Laboratorio de Urgencia. Conjuntamente con ello, el médico indicó un examen radiológico de tórax. Transcurridas 3 horas desde su ingreso al Servicio de Urgencias, la Enfermera de turno le indica que el Laboratorio solicitó una nueva muestra para Pruebas Hematológicas y de Coagulación, y que junto con ello, obtendrá a continuación muestra para Hemocultivo. Realizado el procedimiento en el orden que se menciona, le señala a la Sra. Angélica que debe orinar en la chata para realizar el Examen de Urocultivo, solicitado por el Médico. Recolectadas las muestras en sus contenedores específicos, se verifican los rótulos de los envases, son envueltas con la Solicitud de Examen y enviadas por Correo Neumático al Laboratorio de Urgencia inmediatamente una vez obtenidas. Son recepcionadas y derivadas una vez ingresadas al Sistema Informático del Laboratorio (SIL). Las muestras para estudio bacteriológico son numeradas con números distintos a los exámenes urgentes, según protocolo. El examen de Urocultivo es recibido por la Técnico Carolina, en la sección de Bacteriología y dejada en bandeja sobre el mesón, mientras termina de recepcionar todas las muestras procedentes de pacientes hospitalizados. Las muestras para Hemocultivo, son ingresadas al SIL e incubadas de inmediato al Incubador Automatizado de la sección. Este da alarma acústica y visual a las 2 horas de incubada, debiendo realizar la Técnico Carolina procedimiento según protocolo de su competencia. Durante el proceso de Tinción de Gram, aplica ambos colorantes y decolorante respectivamente, lo cual determinó que el Tecnólogo Médico solicitara repetir el procedimiento.

164

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

Al día siguiente, el Tecnólogo Médico de la sección al realizar la lectura de Urocultivo, observa que hay dos placas de medios sembrados sin enumerar, no logrando establecer con claridad a que pacientes corresponden estos cultivos. Las colonias que se observan en ambas placas son de características distintas y con desarrollo abundante. Al dirigirse a la Técnico Carolina, que se encuentra en Sala de Siembras; observa que está hablando por celular y con todos sus elementos de protección personal para el proceso de siembra.

De acuerdo a la información contenida en el relato, responda utilizando lenguaje técnico adecuado en las siguientes preguntas:

1. Mencione 3 (tres) tipos de contenedores, sus características y examen relacionado de acuerdo al relato. Tipo de Contenedor

Características del Contenedor

Examen Relacionado

2.- De acuerdo al relato: ¿Por qué las muestras para estudio bacteriológico son enumeradas en forma separada con respecto a las otras muestras recepcionadas de la Sra. Angélica?

__________________________________________________________________ __________________________________________________________________

165

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

3.- En relación al Examen de Urocultivo, de acuerdo al relato, mencione: 3.1.- ¿Qué errores procedimentales pre analíticos, de competencia del Técnico se observan? Mencione 2 (dos)

A.-…………………………………………………………………………………… B.-……………………………………………………………………………………

3.2.- ¿Qué consecuencias o situaciones se desprenden del error detectado por el Tecnólogo Médico en las placas sembradas sin enumerar? Mencione 3 (tres) A.-…………………………………………………………………………………… B.-…………………………………………………………………………………… C.-…………………………………………………………………………………… 3.3.- ¿Qué información técnica entrega un Informe de un Examen de Urocultivo, que es relevante para el Médico al confirmar el diagnóstico de Infección Urinaria? A.-…………………………………………………………………………………… B.-…………………………………………………………………………………… C.-……………………………………………………………………………………

166

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

4.- En relación al Examen de Hemocultivo, responda de acuerdo al caso: 4.1.- ¿Qué procedimiento de su competencia debe realizar la Técnico Carolina de acuerdo a protocolo, al detectar positividad de Hemocultivo en el Incubador Automatizado? A.-…………………………………………………………………………………… B.-…………………………………………………………………………………… 4.2.- ¿Qué situación procedimental en la realización de la Tinción de Gram, determina que el Tecnólogo Médico solicite la repetición del proceso, conforme al relato del caso? ………………………………………………………………………………………….

5.- Con respecto a Bioseguridad, responda de acuerdo al caso: 5.1.- Mencione 2 (dos) normas de bioseguridad que no se cumplen: A.-…………………………………………………………………………………… B.-…………………………………………………………………………………… 5.2.- Mencione los EPP mínimos que debe tener la Técnico Carolina para el procedimiento que debe realizar en la sección de bacteriología al procesar el Hemocultivo. A.-……………………………………………………………………………………… B.-……………………………………………………………………………………… C.-……………………………………………………………………………………… 5.3.- ¿Qué elemento del proceso técnico de su competencia, le da la esterilidad a su área de trabajo? ……………………………………………………………………………………

167

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

“Atención de Urgencia Integral” Don Roberto Gómez es un adulto de 38 años, que se encuentra retenido en el Centro Penitenciario Colina 2 por vender películas piratas. Por diferencias de opinión con su compañero de celda se origina una riña, quien toma una estaca artesanal que guarda entre sus pertenencias y se la entierra en el muslo. Don Roberto es llevado rápidamente al Servicio de Urgencias del Complejo Hospitalario San José, con la estaca enterrada en la extremidad inferior. Al llegar al hospital, es ingresado inmediatamente al box de atención. Su condición general es de cuidado, presenta innumerables cortes y contusiones con sangrado. La Técnico realiza las primeras atenciones de enfermería en forma inmediata aplicando solución antiséptica, rellenando el contenedor al observar que queda muy poco y no alcanza para realizar el proceso. Aísla la herida con apósitos estériles vencidos. Durante el procedimiento quirúrgico, se le indica a la Enfermera tomar muestras para estudio microbiológico de la lesión, recolectando la muestra de secreción en un tubo estéril con medio de transporte Cary y Blair. La muestra es recepcionada en el Laboratorio Clínico con la Solicitud de Examen, que se adjunta directamente con el recolector con muestra. El Auxiliar del Laboratorio traslada rápidamente la muestra por mano a la Unidad de Microbiología, la que es sembrada inmediatamente. La muestra es sembrada en medios selectivos y enriquecidos determinadas para este tipo de muestra, obteniendo un desarrollo abundante en estrías. Al día siguiente, el Tecnólogo Médico indica resembrar la muestra y al leer la Tinción de Gram realizada, solicita revisar el procedimiento: se observan Cocaceas Gram Negativas agrupadas en racimo.

168

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

PREGUNTA 1: De acuerdo a la información contenida en el relato del caso y en relación a la atención de enfermería realizada en el Servicio de Urgencia como en Pabellón Quirúrgico, responda: Pregunta 1.1

Mencione una solución antiséptica que pueda utilizarse en el procedimiento realizado por la Técnico de Enfermería

1.2 Mencione 3 errores procedimentales que se deducen de las actividades realizadas por la Técnico de Enfermería y Enfermera respectivamente

Respuestas

-

………………………………………… …………………………………………

-

……………………………………………… ……………...............................................

-

……………………………………………… ………………………………………………

-

……………………………………………… ………………………………………………

1.3 Mencione 1 barrera protectora que debió utilizar la Técnico para efectuar la atención directa del paciente en el caso descrito

- ………………………………………………

1.4 ¿Qué acción debió realizar antes de utilizar las barreras protectoras?

- ………………………………………………

………………………………………………

………………………………………………

1.5 Mencione 2 medidas efectivas que permita evitar los errores cometidos en la atención de enfermería en el Servicio de Urgencia con Don Roberto Gómez

-

……………………………………………… ……………...............................................

-

……………………………………………… ……………………………………………..

169

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

PREGUNTA 2: En relación al material utilizado en la curación, indique: Pregunta 2.1 De acuerdo a la Clasificación de Spaulding ¿Cómo se clasifica el tipo de material utilizado en el proceso de curación?

Respuestas

- ……………………………………………. …………………………………………….

PREGUNTA 3: En relación a los procesos realizados en el transporte y recepción de la muestra, responda: Pregunta 3.1 Identifique 1 error asociado al transporte de la muestra, observado en el caso de análisis.

Respuestas

- ……………………………………………. …………………………………………….

PREGUNTA 4: En relación a los procesos realizados en el Laboratorio Clínico, responda: 4.1.- Identifique el error que detectó el Tecnólogo Médico en el proceso de siembra

- ……………………………………………. ……………………………………………...

4.2.- Mencione una consecuencia del error técnico en el proceso de siembra

- ……………………………………………. ………………………………………………

4.3.- Identifique 4 probables causas que generaron el error en la Tinción de Gram realizada por la Técnico

- ……………………………………………. ……………………………………………. - ……………………………………………. …………………………………………….

170

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

- ……………………………………………. ……………………………………………. - ……………………………………………. ……………………………………………. 4.4.- ¿Qué debió haber observado al microscopio el Tecnólogo Médico, si la tinción hubiera estado correctamente realizada?

4.5.- Mencione 2 medios sólidos requeridos para la siembra de la muestra definida en el caso

- ……………………………………………. ………………………………………………

- ……………………………………………. ……………………………………………. - ……………………………………………. …………………………………………….

Colorante Base: 4.6.- Identifique el colorante base y de contraste utilizados por la Técnico en …………………………………………………….. el caso descrito Colorante de Contraste: ……………………………………………………...

4.7.- Mencione el mordiente utilizado en el procedimiento de tinción -

4.8.- Mencione una medida de control analítico que debió utilizar la Técnico en el procedimiento de Tinción de Gram para validar su correcta ejecución

……………………………………………..

- …………………………………………….. ………………………………………………

171

Dirección Nacional Área Salud Carrera “Técnico en Laboratorio Clínico, Banco de Sangre e Imagenología” Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3

BIBLIOGRAFÍA

http://www.scfarmclin.org/docs/higiene/part2/232.pdf

http://sisbib.unmsm.edu.pe/bvrevistas/dermatologia/v15_n2/pdf/a02.pdf

Norma General Técnica sobre Esterilización y Desinfección de Elementos Clínicos.

Montiel Fernando, Manual de Microbiología Clínica, 2001

Jawetz, Melnick y Adelberg. Microbiologia Médica, 2001

ISP, Guía de Bioseguridad Para Laboratorios Clínicos, 2013

172