Manual de Microbiologia i

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD CIENCIAS QUIMICAS MICROBIOLOGIA I

MANUAL DE LABORATORIO MICROBIOLOGIA I SISTEMATIZADO Y COMPENDIADO: Q.F MARIANA RENDON MARISCAL MSc.

Docente: Q.F Marianita Rendón M MSc.

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INDICE CONTENIDO INTRODUCCION CONSIDERACIONES GENERALES DEL TRABAJO DE LOS ESTUDIANTES PRACTICA No 1 BIOSEGURIDAD PRACTICA No 2 MEDIOS DE CULTIVO PRACTICA No 3

CONTROL DE LOS MICROORGANISMOS .- DESCONTAMINACION y ESTERILIZACION.- MANEJO DE INOCULOS: TECNICA

PAGINA

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PRACTICA No 4

MICROSCOPIO.- TINCION SIMPLE Y TINCION DE GRAM

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PRACTICA No 5

TINCION DE ALCOHOL ACIDO RESISTENTES

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PRACTICA No 6

LEVADURAS.- IDENTIFICACION MICROSCOPICA LEVADURAS.IDENTIFICACION MICROSCOPICA DE HONGOS PRACTICA No 7 SIEMBRA Y METODOS DE SIEMBRA

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PRACTICA NO 8

METODOS DE CUANTIFICACION DE LOS MICROOGANISMOS

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INTRODUCCIÓN Es aconsejable que toda persona que labore en un laboratorio de Bacteriología o en cualquier otra área de la Microbiología, no tenga riesgos innecesarios ya que el descuido, la negligencia y las prácticas poco seguras pueden causar daños serios, no solo en los individuos, sino también en los colaboradores o en los pacientes.

“CADA PROFESIONAL DE LA SALUD ES RESPONSABLE POR SU SEGURIDAD Y LA DE SUS COMPAÑEROS “(ORGANIZACION PANAMERICANA DE LA SALUD) Se entiende que la bioseguridad es el conjunto de políticas destinadas a mantener la vigilancia, para proteger el medio ambiente, la salud y la seguridad de los profesionales de la salud que realizan actividades frente a riesgos ocupacionales procedentes de agentes biológicos, físicos o químicos. Su objetivo es implementar una serie de acciones que garantizan una mejor calidad de vida. Por lo cual, se han implementado una serie de normas, tendientes a disminuir el riesgo de transmisión de microorganismos a partir de fuentes reconocidas o no reconocidas de infección en Servicios de Salud, relacionadas a accidentes por exposición a sustancias, sangre y fluidos corporales potencialmente peligrosos. Las siguientes consideraciones generales pueden hacer menos riesgosas las actividades a realizar en el laboratorio: Sugerencias generales e información. 1.- Cada persona que labore en el laboratorio, debe ser informado acerca de la ubicación y la operación de cada uno de los equipos de seguridad y las instalaciones, tales como extinguidores, duchas y lavaojos, los cuales deben ser fácilmente accesibles en el laboratorio. 2.- Los equipos de protección personal, que incluyen entre otros; guantes y bata, debe ser utilizados cuando sea indicado. La bata debe ser usada cerrada (abotonada) en todo momento y es necesario quitársela al abandonar el laboratorio. 3.- Los hábitos y el arreglo personal debe de tomarse en cuenta. El cabello largo debe atarse, de modo que no interfiera con el trabajo. Se debe evitar la aplicación de cosméticos dentro del área de trabajo. Las sandalias y zapatos abiertos están contraindicados ya que no protegen al pie. En lo posible, no llevarse los dedos y los lápices a la boca. 4.- Es aconsejable no llevar lentes de contacto puestos en el laboratorio ya que absorben solventes. Es recomendable usar lentes de seguridad cuando se trabaja con material cáustico o infeccioso. 5.- Esta prohibido comer o almacenar alimentos y bebidas en el laboratorio o en el refrigerador del laboratorio. Por tal motivo se debe designar un refrigerador específico para almacenar alimentos del empleado. 6.- Esta absolutamente prohibido pipetear con la boca cualquier material. Por lo que se aconseja emplear accesorios para pipetas. 7.- Cada sesión de laboratorio deberá iniciarse con una explicación y tiempo de instrucciones. 3

8.- No inicie a trabajar hasta que haya recibido las instrucciones. 9.- Pregunte cuando no entienda el método o la finalidad de algún experimento. 10.- La buena técnica de laboratorio depende primordialmente de que se conozca lo que se va a hacer. 11.- Anote cuidadosamente todas las observaciones en el momento de hacerlas.

NORMAS A SEGUIR EN EL LABORATORIO. 1.- Limpie la superficie de su mesa con una solución germicida, al principio y al final de cada sesión de laboratorio. 2.- Mantenga la mesa libre de todo lo que no sea esencial y al final de la sesión déjela limpia y libre de material y equipo (guardar todo en su sitio) 3.- Ponga todo el material CONTAMINADO en las .canastilla para este fin 4.- Debido a que algunos de los microorganismos con que se va a trabajar son patógenos en potencia, es necesario desarrollar técnicas de asepsia al manejarlos y transferirlos. 5.- Evite contacto de la boca con las manos, comer o humedecer las etiquetas con la lengua. 6.- Informe inmediatamente al instructor de cualquier accidente tal como cortaduras, quemaduras o derrame de cultivos. 7.- Tome todas las precauciones posibles para evitar estos a accidentes. Precauciones sistemáticas de seguridad. Material de vidrio 1.- Desechar todo material de vidrio que esté quebrado o rajado, y colocarlo en recipientes adecuados. 2.- Recoger los vidrios rotos con escobillón y pala; no hacerlo con la mano. 3.- Los artículos de vidrio no deben ser arrojados a la pileta ni arrojarlos sueltos a un cesto de desperdicios en el que se arrojan artículos de papel. Muestras y derrames 1.- Las muestras se deben de recolectar en recipientes sólidos, con cierres adecuados para evitar derrames y pérdidas. Todas las muestras deben ser consideradas potencialmente peligrosas. 2.-Las cortaduras en las manos deberán ser adecuadamente protegidas con tela adhesiva. Si la actividad laborar implica en manejo de sangre, suero, plasma u otras muestras, se debe de usar guantes desechables. 3.- Si una muestra presenta evidencia de rotura, derrame o suciedad dentro del recipiente, ponerse guantes. 4.- Las muestras contaminadas con sangre deben ser rechazadas. Manipularlas solo con guantes. Notificar este hecho como peligroso para la salud. 5.- Lavarse las manos minuciosamente con agua y jabón varias veces al día, en particular después de manipular las muestras y antes de retirarse. 6.- Inunde con solución desinfectante cualquier área donde haya ocurrido un derrame de sangre o suero. Utilizando guantes, toallas de papel o gasa para absorber e líquido, y luego realice un lavado minucioso con agua. Guarde en una bolsa todo el material empleado contaminado, para eliminarlo como material infeccioso.

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Manipulación de desperdicios. 1.- Reserve algunas de las piletas del laboratorio para eliminar muestras de sangre y orina. No permitir el lavado de manos en estas piletas. 2.- Eliminar en recipientes adecuados y rotulados; tubos con sangre, pipetas, puntas, agujas. 3.- El material de vidrio o cortante debe ser eliminado en recipientes adecuados de paredes sólidas. 4.- Llevar estos recipientes al área de desecho con la frecuencia necesaria para evitar su acumulo. 5.- Sumerja el material de vidrio contaminado en solución desinfectante. Enjuague minuciosamente con agua y esterilizarlo antes de usarlo otra vez. NOTA: Recuerde que las medidas de seguridad están dirigidas al manejo adecuado de productos Corrosivo, Reactivos. Explosivos, Tóxico, Inflamables, Biológicos-infecciosos (CRETIB) y Radioactivos con el fin de evitar riesgos

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CONSIDERACIONES GENERALES DE TRABAJO DE LOS ESTUDIANTES EN EL LABORATORIO Es muy importante para su seguridad y la de sus compañeros observar siempre las siguientes medidas mínimas de seguridad.  Es obligatorio concurrir al laboratorio con su uniforme, guantes, mascarillas, pluma y hojas de carpeta de línea.  Todo el material que use en el laboratorio debe considerarse como “CONTAMINADO” y, por lo tanto, debe manejarse con cuidado, procurando no dejarlos en los mesones sino eliminarlos sólo en los recipientes dispuestos para ello.  En la eventualidad de cualquier accidente, por pequeño que parezca, debe comunicarse inmediatamente al profesor a cargo de la actividad.  Respete siempre las indicaciones que se darán durante las primeras actividades prácticas respecto al uso del mechero para la esterilización de asas, tubos u otros materiales.  Está estrictamente prohibido ingerir cualquier tipo de alimento o bebida en el laboratorio. Jamás debe sacar material contaminado o cultivos bacterianos fuera del laboratorio.  No haga bromas, ni permita que sus compañeros las hagan, con cultivos bacterianos o material contaminado.  Al terminar su trabajo práctico debe limpiar su área de trabajo con la solución desinfectante que se le proporcionará. Su microscopio debe quedar igualmente limpio y debidamente guardado.  Al terminar el trabajo en el laboratorio lave cuidadosamente sus manos.  Se debe entregar un informe de la practica realizada antes de retirarse del laboratorio (formato de informe en anexos)

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PRACTICA Nº 1 TEMA: LA BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA COMPETENCIAS  CONOCER LAS NORMAS DE BIOSEGURIDAD PARA LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

TALLER DE BIOSEGURIDAD 1. NORMAS GENERALES DE SEGURIDAD BIOLÓGICA EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA La peligrosidad de un agente está directamente relacionada con el tipo de manipulación a la que es sometido. Por ello es básico: 1. Conocer los agentes, sustancias y productos peligrosos que existen en el laboratorio. 2. Conocer la metodología de trabajo del laboratorio. 3. Conocer el equipamiento del laboratorio. 4. Conocer las medidas a tomar en caso de emergencia. 5. Conocer las leyes relacionadas con la seguridad Biológica. 6. Respetar y hacer cumplir todo lo anterior. Para que se produzca un accidente por agente biológico deben concurrir básicamente cuatro elementos: un huésped susceptible, un agente infeccioso, una concentración suficiente de éste y una ruta de transmisión apropiada. De todos ellos, el que mejor se puede controlar en el laboratorio es la ruta de transmisión. Las rutas de transmisión más comunes en el laboratorio son la aérea y la inoculación directa, muy por encima de todas las demás, aunque la oral, la percutánea y el contacto directo con la piel o las mucosas también son posibles. Los microorganismos pueden penetrar en el organismo a través de la boca (ingestión), por los pulmones (inhalación), a través de la piel (inyección) y por los ojos. Pueden ser ingeridos cuando se pipetea con la boca y pueden también penetrar en ella mediante los dedos y artículos contaminados en las mesas de laboratorio, por ejemplo, cigarrillos, comida, lápices. Dicha contaminación ambiental puede ser consecuencia de derramamientos y salpicaduras que no se descubren o que se desinfectan inadecuadamente.

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La inhalación de partículas infectadas transmitidas por el aire (aerosoles), que se liberan durante muchas manipulaciones en el laboratorio habituales, han causado probablemente el mayor número de enfermedades relacionadas con el laboratorio. La inyección puede ser consecuencia de heridas accidentales con agujas hipodérmicas, pipetas Pasteur o material de vidrio infectado roto. Los gérmenes pueden también penetrar en el organismo a través de cortes y abrasiones de la piel, algunas de ellas de tamaño tan pequeño como para que pasen desapercibidas para el propio investigador. Las salpicaduras de líquidos infectados en los ojos han sido la causa de un gran número de infecciones, algunas mortales. Las vías de infección en las enfermedades adquiridas en el laboratorio no son necesariamente las mismas que las de las infecciones adquiridas «naturalmente». Además, la dosis infectante puede ser mucho mayor y, por tanto, los síntomas pueden ser diferentes. Siendo imposible determinar a ciencia cierta si cualquier material biológico está contaminado con microorganismos del grupo 2 ó 3, ciertas muestras (respiratorias, etc.) en las que sea posible que exista un microorganismo del grupo 3 deben manipularse rutinariamente en las cabinas de Seguridad Biológica (CSB). 1.1. MEDIDAS GENERALES Son de obligado cumplimiento en cualquier área del laboratorio. - El acceso al laboratorio estará limitado al personal autorizado. - No deben entrar en el mismo familiares ni amigos. - El personal del laboratorio debe implicarse en el cumplimiento de las normas de seguridad. - Todas las áreas estarán debidamente marcadas con la señal de riesgo biológico y su nivel de contención. - Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas para mantener la adecuada contención biológica. - Todas las superficies de trabajo se limpiarán y desinfectarán diariamente y siempre que se produzca un derrame. Los residuos y muestras peligrosas que van a ser incinerados fuera del laboratorio deben ser transportados en contenedores cerrados, resistentes e impermeables siguiendo las normas específicas para cada tipo de residuo. - El laboratorio debe permanecer limpio y ordenado y no es aconsejable utilizar los pasillos como almacén. Siempre debe quedar un espacio libre no inferior a 120 cm para poder evacuar el laboratorio en caso de emergencia. - El transporte de las muestras dentro o entre laboratorios se realizará de tal manera que, en caso de caída, no se produzcan salpicaduras. Lo recomendable es hacerlo en cajas herméticas o neveras transportables. Estas cajas o neveras deberán ser rígidas y resistentes a los golpes, contar con materiales absorbentes en su interior y de fácil 8

desinfección. Se etiquetarán o identificarán de forma oportuna y no podrán ser utilizadas para otros fines. Bajo ningún concepto se pueden transportar las muestras a mano. - La ropa protectora, fácilmente ajustable y confortable, así como guantes, gafas, etc. debe estar disponible en todo momento. La ropa protectora de las áreas con nivel de contención 3 (cubrebatas) nunca debe ser usada fuera del área de trabajo y si se quita debe de ser desechada automáticamente en una bolsa de material contaminado. Jamás debe volver a ser usada. - Todo el personal debe poner especial cuidado en evitar el contacto de la piel con materiales potencialmente infecciosos. Con este fin deben usarse guantes cuando se manipulen muestras o cultivos que contengan posibles patógenos. Los guantes siempre serán desechados antes de salir del área de trabajo. Jamás se saldrá de la misma con los guantes puestos, ni con ellos se cogerá el teléfono, se tocarán los volantes, etc. - Tras quitarse los guantes, se realizará un lavado de manos. - Se usarán gafas protectoras y mascarillas faciales si existe riesgo de salpicaduras y/o aerosoles. - Se pondrá extremo cuidado en minimizar el riesgo de autoinoculación y de generación de aerosoles. - Los derrames y accidentes deben ser informados inmediatamente al Supervisor y al Jefe del Laboratorio y hacerse constar por escrito. - Nadie podrá trabajar en el área de tuberculosis con una prueba de Mantoux negativa. - Está rigurosamente prohibido pipetear con la boca. Se realizará pipeteo automático con material adecuado y cada trabajador será instruido para manejarlo debidamente. - En la zona de trabajo no debe colocarse material de escritorio ni libros ya que el papel contaminado es de muy difícil esterilización. - No deberán usarse lentes de contacto. 1.2. HIGIENE - El personal con el cabello largo debe llevarlo recogido. - Comer, beber, fumar y aplicarse cosméticos esta formalmente prohibido en el área de trabajo del laboratorio, así como el almacenamiento de comida o bebida. - El personal debe lavarse las manos frecuentemente durante las actividades rutinarias, tras acabar la jornada laboral y siempre antes de abandonar el laboratorio (almorzar). Se usará un jabón antiséptico y el secado se realizará con papel. - Las heridas y cortes en las manos, si se han producido en el Laboratorio, serán comunicados al responsable de la Sección correspondiente, así como al Supervisor, que lo registrará haciendo constar todas las circunstancias. Las heridas y cortes deben ser convenientemente vendados y después es imprescindible ponerse guantes.

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1.3. OBJETOS PUNZANTES Y CORTANTES - El uso de agujas hipodérmicas y jeringas debe ser limitado. Sólo deben usarse las unidades ya montadas. - Nunca se debe volver a poner la capucha a las agujas y éstas no deben ser torcidas ni separadas de la jeringa. - Las agujas y jeringas usadas, así como los bisturíes, deben ser desechados sólo en contenedores especiales diseñados para este propósito. 2. NORMAS GENERALES DE UTILIZACIÓN DE EQUIPOS  

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Los equipos y aparatos nunca deben colocarse en zonas de paso, en particular en los pasillos del laboratorio. Todos los aparatos con toma eléctrica deberán cumplir las normativas de seguridad correspondientes. Nunca deben utilizarse en zonas mal aisladas y expuestas a la humedad. Las fuentes de calor (calentadores, termobloques, etc.), sobre todo si se alcanzan temperaturas elevadas, deberán estar debidamente señalizadas para evitar quemaduras accidentales. Todos los procedimientos de utilización de aparatos deberían contar obligatoriamente con apartados relativos a su utilización segura.

2.1. NEVERAS Y HABITACIONES FRIGORÍFICAS Un adecuado mantenimiento, limpieza y desinfección sistemáticos de los aparatos reduce considerablemente los riesgos asociados a su utilización. Sin embargo, aun en estas condiciones, hay que tener en cuenta lo siguiente: 

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No deben almacenarse cultivos de microorganismos patógenos por inhalación en recipientes que no estén convenientemente cerrados, especialmente si la cámara tiene un sistema de circulación de aire. No deben almacenarse reactivos que contengan compuestos volátiles inflamables (éter etílico, por ejemplo) en neveras que no posean un sistema de protección antideflagración. En los aparatos de tipo doméstico que se utilizan en el laboratorio debe anularse la lámpara de la luz.

2.2. CONGELADORES La congelación es un proceso que mantiene la viabilidad de muchos agentes infecciosos, de ahí un potencial riesgo y las siguientes recomendaciones:  

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Tratar de identificar en ficheros, listas, etc. el contenido de lo almacenado y sus riesgos potenciales. El material potencialmente infeccioso debe colocarse en tubos, recipientes, etc. bien cerrados. No se llenarán completamente, para evitar que rebosen por efecto del aumento de volumen tras la congelación. Descongelar periódicamente, limpiar y desinfectar si fuese procedente. Utilizar guantes para manipular el contenido. Si la temperatura es baja (por ejemplo -70ºC o inferior), los guantes representan una protección adicional. 10

2.3. ESTUFAS E INCUBADORES La limpieza y la desinfección, periódicas y sistemáticas, son el método recomendable para reducir los riesgos derivados de la contaminación accidental del personal del laboratorio. 2.4. MICROONDAS Los microondas cada vez son más populares en el Laboratorio de Microbiología y constituyen una nueva fuente de accidentes, entre los más frecuentes las explosiones cuando se usan para calentar medios con agar, ya que la diferencia de velocidad de calentamiento produce burbujas que pueden estallar.  

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Las botellas o matraces deben tener el tapón aflojado, ya que si está cerrado estallan fácilmente. Estar siempre presente, con la ropa y pantalla facial adecuadas, y controlar la intensidad del aparato, que sólo puede ser la máxima con agua y la mínima si se usa con agar. Deberá existir una tabla bien visible de los tiempos en cada posición del potenciómetro y de las cantidades a emplear. Los microondas interfieren con los marcapasos. No deben ser colocados a una distancia inferior a 2 m de las personas que sean portadoras de uno de estos dispositivos.

2.5. AUTOCLAVES Los autoclaves deben poseer manómetro y termostato, así como válvula de seguridad, sistema de desconexión rápido y la purga del vapor ha de realizarse a un recipiente estanco y con agua, jamás directamente al exterior.    

No deben usarse si no se conocen perfectamente todos los mandos y su fundamento. Usar guantes especiales para protegerse del calor. No abrir jamás si el manómetro no está a “0″ y la purga no ha sido abierta. Controlar una vez al mes su capacidad de desinfección mediante esporas, no siendo suficiente el método químico. El uso de registros de presión y temperatura de cada proceso y la instauración de un programa de mantenimiento también puede ser una alternativa válida al control mediante esporas. El agua debe ser cambiada regularmente.

2.6. CENTRÍFUGAS Los mayores riesgos derivan, sobre todo, de la contaminación por los aerosoles generados durante la centrifugación de materiales biológicos y, en menor medida, de los traumatismos accidentales. Se recomienda: 

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Cuando se centrifugue material biológico potencialmente infeccioso deben utilizarse tubos cerrados; la centrífuga debe disponer de rotores o cestillos de seguridad que protejan al operador de los posibles aerosoles. La rotura accidental de un tubo y su vertido en la cubeta representa una incidencia importante que debe ser comunicada inmediatamente al Supervisor o 11

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responsable, de forma que se proceda a la desinfección segura del aparato. No se deben utilizar centrífugas antiguas que no posean sistema de cierre de seguridad, del que disponen todos los aparatos actuales, ni manipular éstas de forma que permitan su apertura mientras están en funcionamiento. Si el laboratorio dispone de ultracentrífugas, el equilibrado cuidadoso del rotor es fundamental.

2.7. MISCELÁNEA   

Las bombas de vacío y los aspiradores deberán contar con las correspondientes trampas y filtros. Los baños de agua (“baños maría”) deberán contener un desinfectante adecuado, ser limpiados una vez a la semana y desinfectados con periodicidad mensual. En la zona de trabajo no debe colocarse directamente material de escritorio ni libros, ya que el papel contaminado es de difícil esterilización o desinfección.

PRINCIPIOS BÁSICOS DE LA SEGURIDAD BIOLÓGICA 1.1. DEFINICIONES Agentes biológicos. Microorganismos, con inclusión de los genéticamente modificados, cultivos celulares y endoparásitos humanos susceptibles de originar cualquier tipo de infección, alergia o toxicidad. Microorganismo. Toda entidad microbiológica, celular o no, capaz de reproducirse o de transferir material genético. Cultivo celular. El resultado del crecimiento in vitro de células obtenidas de organismos multicelulares. Peligro. Todo aquello que puede producir un daño o un deterioro de la calidad de vida individual o colectiva de las personas. Daño. Es la consecuencia producida por un peligro sobre la calidad de vida individual o colectiva de las personas. Riesgo. Probabilidad de que ante un determinado peligro se produzca un cierto daño, pudiendo por ello cuantificarse. Desinfección. Eliminación de agentes infecciosos que están fuera del organismo por medio de la exposición directa a agentes químicos o físicos. Contaminación. Presencia de un agente infeccioso en la superficie del organismo; también en vestimenta, ropa de cama, juguetes, instrumentos quirúrgicos, apósitos u otros objetos inanimados o substancias, incluyendo el agua y los alimentos. Esterilización. Destrucción de todas las formas de vida por calor, radiación, gas o tratamiento químico. 12

Limpieza. Eliminación, mediante fregado y lavado con agua caliente, jabón o un detergente adecuado, o por el empleo de una aspiradora, de agentes infecciosos y substancias orgánicas de superficies en las cuales éstos pueden encontrar condiciones adecuadas para sobrevivir o multiplicarse. 1.2. CLASIFICACIÓN DE LOS AGENTES BIOLÓGICOS POR GRUPOS DE RIESGO Se clasifican los agentes biológicos en cuatro grupos en función del riesgo de infección: Agente biológico del grupo 1. Aquél que resulta poco probable que cause una enfermedad en el hombre. Agente biológico del grupo 2. Aquél que puede causar una enfermedad en el hombre y puede suponer un peligro para los trabajadores, siendo poco probable que se propague a la colectividad y existiendo generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Bacterias, Chlarnydias, Mycoplasmas y Rickettsias Actinobacillus spp. Actinomadura pelletieri Actinomyces spp. Bacillus cereus Bacteroides spp. Bordetella pertussis (V), B. parapertussis, B. bronchiseptica Borrelia spp. Campylobacter spp. Chlamydia pneumoniae,Clostridium botulinum (T), C. chauvoei, C. difficile, , C. perfringens, C. septicum , C. sordellii, C. tetani (Corynebacterium diphtheriae (, C. minutissimum, C. pseudotuberculosis Edwardsiella tarda Ehrlichia spp. Eikenella corrodens Enterobacter spp. Enterococcus spp. Escherichia coli (excepto las cepas no patógenas)Flavobacterium spp. Francisella tularensis (tipo B), F. novocida Fusobacterium spp. Gardnerella vaginalis Haemophilus spp. Helicobacter pylori Klebsiella spp. Legionella spp. Leptospira interrogans Listeria monocytogenes Mycobacterium spp. (excepto M. tuberculosis, M. bovis (no BCG), M. africanum, M. leprae, M. microti y M. ulcerans) Mycoplasma spp. Neisseria gonorrhoeae, N. meningitidis (V) Nocardia asteroides, N. brasiliensis, N. farcinica Pasteurella spp. Peptostreptococcus spp. Prevotella spp. Proteus spp. Providencia spp. Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas spp

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Rickettsia spp. Salmonella paratyphi A, B, C (V), Salmonella spp. (excepto S. typhi) Shigella boydii, S. dysenteriae (excepto tipo 1), S. flexneri, S. sonnei Staphylococcus aureus Streptococcus spp. Treponema carateum, T. pallidum, T. vincentii Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, Vibrio spp. Yersinia enterocolitica, Y. pseudotuberculosis

Hongos Aspergillus fumigatus Candida albicans , Candida spp. Cryptococcus neoformans Microsporum spp. Penicillium marneffei . Virus Hantavirus Citomegalovirus Virus Epstein-Barr Herpes simplex virus tipos 1 y 2 Herpes varicella-zoster Virus linfotrópico humano B (HBLV- HHV6) Herpes virus humano 7Herpes virus humano 8 Virus de la influenza tipos A, B y C Virus del papiloma humano Virus del sarampión Virus de las paperas Virus de la enfermedad de Newcastle Virus de la parainfluenza tipos 1 a 4 Virus respiratorio sincitial Virus de la hepatitis A (enterovirus humano tipo 72) Poliovirus Rinovirus Rotavirus humanos

Agente biológico del grupo 3. Aquél que puede causar una enfermedad grave en el hombre y presenta un serio peligro para los trabajadores, con riesgo de que se propague a la colectividad y existiendo frente a él generalmente profilaxis o tratamiento eficaz.

Bacterias, Chlamydias y Rickettsias Bacillus anthracis Brucella spp. Chlamydia psittaci (cepas aviares) Coxiella burnetii Escherichia coli (cepas verocitotóxicas como O157:H7 u O103) (T) Francisella tularensis tipo A Mycobacterium tuberculosis , M. bovis, M. leprae Rickettsia akari (*), R. canada (*), R. montana (*), R. conorii, R. mooseri, R. prowazekii, R. rickettsii, R. tsutsugamushi Salmonella typhi [V (*)] Shigella dysenteriae (tipo 1) [T (*)]

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Yersinia pestis (V) Hongos Blastomyces dermatitidis Cladophialophora bantiana Coccidioides immitis Histoplasma capsulatum Paracoccidioides brasiliensis Virus Hantavirus Virus de la hepatitis E Virus de la encefalitis de las garrapatas de Europa Central Virus del Dengue tipos 1-4 Virus de la hepatitis C ] Virus de la hepatitis G Virus de la encefalitis Virus de la fiebre amarilla Virus de la hepatitis Herpesvirus simiae (virus B) Virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) Virus de las leucemias humanas de células T (HTLV) tipos 1 y 2

Agente biológico del grupo 4. Aquél que causando una enfermedad grave en el hombre supone un serio peligro para los trabajadores, con muchas probabilidades de que se propague a la colectividad y sin que exista generalmente frente a él profilaxis o tratamiento eficaz. Bacterias, Chlamydias, Mycoplasmas y Rickettsias Ninguno Hongos Ninguno Virus Complejos virales LCM-Lassa: virus de Lassa Complejos virales Tacaribe: virus Junin, virus Machupo, virus Sabia, virus Guanarit Nairovirus Virus Marburg Virus Ebola Virus Kyasanur Variola (major & minor) virus “Whitepox” virus (variola virus) Virus no clasificados Morbillivirus equino

1.3. NIVELES DE CONTENCIÓN La Seguridad Biológica se fundamenta en tres elementos: 1) Las técnicas de laboratorio, 2) El equipo de seguridad (o barreras primarias) y 3) El diseño de la instalación (o barreras secundarias). 

Técnicas de laboratorio. El elemento más importante para contener los riesgos biológicos es el seguimiento estricto de las prácticas y técnicas estándar microbiológicas. Como parte de estas prácticas está el desarrollo o adopción por parte de cada laboratorio de un manual de operaciones (o Manual de Seguridad 15

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Biológica) en el que se identifiquen los riesgos que pueda sufrir el personal y que especifique los procedimientos que puedan minimizar esos riesgos. Equipo de seguridad (barreras primarias). Se incluyen en este apartado tanto dispositivos o aparatos que garantizan la seguridad (por ejemplo, las cabinas de seguridad biológica), como las prendas de protección personal (guantes, mascarillas, batas, calzado…). Diseño y construcción de la instalación (barreras secundarias). La magnitud de las barreras secundarias dependerá del tipo de agente infeccioso que se manipule en el laboratorio. Dentro de ellas se incluyen la separación de las zonas donde tiene acceso el público, la disponibilidad de sistemas de descontaminación (autoclaves), el filtrado del aire de salida al exterior, el flujo de aire direccional, etc.

El término “contención” se emplea para describir los métodos que hacen seguro el manejo de materiales infecciosos en el laboratorio. El propósito de la contención es reducir al mínimo la exposición del personal de los laboratorios, otras personas y el entorno a agentes potencialmente peligrosos. Se suelen describir cuatro niveles de contención o de seguridad biológica, que consisten en la combinación, en menor o mayor grado, de los tres elementos de seguridad biológica descritos: técnica microbiológica, equipo de seguridad y diseño de la instalación. Cada combinación está específicamente dirigida al tipo de operaciones que se realizan, las vías de transmisión de los agentes infecciosos y la función o actividad del laboratorio. Nivel de contención 1. Es el nivel de seguridad requerido para los agentes biológicos del grupo 1, es decir, los que no producen enfermedad en el ser humano sano y de susceptibilidad conocida y estable a los antimicrobianos. Es el utilizado habitualmente

en los laboratorios de prácticas de universidades o centros docentes donde se emplean cepas no patógenas (E. coli K12, Saccharomyces cerevisiae, etc.). Ejemplos típicos son todos los microorganismos que se utilizan en la industria de la alimentación para la elaboración de quesos, cerveza, embutidos, etc. Nivel de contención 2. Es el obligado para agentes del grupo 2 como algunos que, perteneciendo a la propia flora habitual del hombre, son capaces de originar patología infecciosa humana de gravedad moderada o limitada. Deben ser manipulados por personal especializado (técnicos de laboratorio, especialistas en Microbiología) y son los que con más frecuencia se estudian en el Laboratorio de Microbiología Clínica: estafilococos, Salmonella, etc. Nivel de contención 3. Debe utilizarse cuando se manipulan agentes biológicos del grupo 3, microorganismos que cursan con patología grave, de difícil y largo tratamiento, que pueden curar con secuelas y ocasionalmente producir la muerte. El mayor y más frecuente peligro que entrañan éstos es la infección adquirida a través de aerosoles y por fluidos biológicos. Por ello, las principales medidas a tomar en este caso son la correcta manipulación y la utilización de cabinas de seguridad. En los Laboratorios de Microbiología Clínica los ejemplos más típicos de este tipo de microorganismos son M. tuberculosis, Brucella, Coxiella burneti, etc. Sólo pueden ser procesados por personal 16

cualificado y en una zona con la infraestructura apropiada para el Nivel de Contención 3, es decir, con aire acondicionado independiente, sin recirculación de aire, con gradiente de presión, cabinas de bioseguridad, etc. Nivel de contención 4. Nivel requerido cuando se procesa con certeza o se sospecha un agente especialmente patógeno e infectocontagioso, exótico o no, que produce alta mortalidad y para el que no existe tratamiento y/o es poco fiable. Normalmente son microorganismos de dosis infectiva baja y alta contagiosidad. Este nivel también puede utilizarse para trabajar con animales de experimentación infectados por microorganismos del grupo 4. Ejemplos de este nivel son los arenavirus como el que produce la fiebre de Lassa y el virus Machupo, virus Ebola, etc. Además, deben incluirse en este nivel de contención los microorganismos propios del grupo 3 que adquieran propiedades patógenas que los eleven al grupo 4. Un ejemplo sería Mycobacterium bovis multirresistente que puede causar fallecimiento por fracaso terapéutico. En general, la naturaleza infecciosa del material clínico es desconocida y al Laboratorio de Microbiología suelen remitirse muestras muy diversas. Es responsabilidad del Jefe del Laboratorio el establecimiento de prácticas normalizadas que de forma realista permitan su manipulación. Excepto en casos excepcionales (por ejemplo: sospecha de fiebres hemorrágicas), el procesamiento inicial de los especimenes clínicos y las pruebas serológicas pueden realizarse de forma segura en un nivel 2, que es el nivel recomendado para trabajar con patógenos que se transmiten por vía sanguínea como el virus de la hepatitis B y el VIH, a lo que habría

que añadir las precauciones universales que deben ser tomadas con todas las muestras de sangre y otros materiales potencialmente infecciosos. Los laboratorios que realicen trabajos que impliquen la manipulación de agentes biológicos de los grupos 2, 3 ó 4 con fines de investigación, desarrollo, enseñanza o diagnóstico deberán establecer medidas de contención que se aplicaran según la naturaleza de las actividades, la evaluación del riesgo para los trabajadores y las características del agente biológico de que se trate. Medidas de contención para los distintos niveles de contención Observación preliminar. Las medidas que figuran a continuación se aplicarán según la naturaleza de las actividades, la evaluación del riesgo para los trabajadores y las características del agente biológico de que se trate. Las actividades que supongan la manipulación de un agente biológico se ejecutarán:   

Únicamente en zonas de trabajo que correspondan por lo menos a un nivel de contención 2 para un agente biológico del grupo 2. Únicamente en zonas de trabajo que correspondan por lo menos a un nivel de contención 3 para un agente biológico del grupo 3. Únicamente en zonas de trabajo que correspondan por lo menos a un nivel de contención 4 para un agente biológico del grupo 4.

Los laboratorios que manipulen materiales con respecto a los cuales exista 17

incertidumbre acerca de la presencia de agentes biológicos que puedan causar enfermedad en el hombre, pero que no tengan como objetivo trabajar con ellos como tales, cultivándolos o concentrándolos, deberán adoptar al menos el nivel de contención 2. Deberán utilizarse los niveles 3 ó 4 cuando proceda, siempre que se sepa o sospeche que son necesarios, salvo cuando las líneas directrices establecidas por las autoridades sanitarias indiquen que, en algunos casos, conviene un nivel de contención me Medidas de contención Medidas de contención

2

3

4

1. El lugar de trabajo se encontrará separado de toda actividad que se desarrolle en el mismo edificio

No

Aconsejable

Sí

2. El aire introducido y extraído del lugar de trabajo se filtrará mediante la utilización de filtros de alta eficacia para partículas en el aire (HEPA) o de forma similar

No

Sí, para la salida de aire

Sí, para la entrada y salida de aire

3. Solamente se permitirá el acceso al personal designado

Aconsejable

Sí

Sí, con esclusa de aire

4. El lugar de trabajo deberá poder precintarse para permitir su desinfección

No

Aconsejable

Sí

5. Procedimientos de desinfección específicos

Sí

Sí

Sí

6. El lugar de trabajo se mantendrá con una presión negativa respecto a la presión atmosférica

No

Aconsejable

Sí

7. Control eficiente de vectores, por ejemplo,

Aconsejable

Sí

Sí

18

roedores e insectos

8. Superficies impermeables al agua y de fácil limpieza

Sí, para banco de pruebas y mesa de trabajo

Sí, para banco de pruebas, mesa de trabajo y suelo

Sí, para banco de pruebas, mesa de trabajo, suelo, paredes y techos

9. Superficies resistentes a ácidos, álcalis, disolventes y desinfectantes

Aconsejable

Sí

Sí

10. Almacenamiento de seguridad para agentes biológicos

Sí

Sí

Sí, almacenamiento seguro

11. Se instalará una ventanilla de observación o un dispositivo alternativo en las zonas de manera que se pueda ver a sus ocupantes

Aconsejable

Aconsejable

Sí

12. Laboratorio con equipo propio

No

Aconsejable

Sí

13. El material infectado, animales incluidos, deberá manejarse en una cabina de seguridad biológica o en un aislador u otra contención apropiada

Cuando proceda

Si, cuando la infección se propague por el aire

Sí

14. Incinerador para destrucción de animales muertos

Aconsejable

Sí, disponible

Sí, en lugar

el

mismo

Barreras primarias: equipos o prendas de protección personal Tal y como su nombre indica, las llamadas barreras primarias son la primera línea de defensa cuando se manipulan materiales biológicos que puedan contener agentes patógenos. El concepto de barrera primaria podría asimilarse a la imagen de una “burbuja” protectora que resulta del encerramiento del material considerado como foco de contaminación.

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Los EQUIPOS O PRENDAS DE PROTECCIÓN PERSONAL constituyen uno de los componentes de las llamadas barreras primarias. El equipo de protección individual o EPI se define como cualquier equipo destinado a ser llevado o sujetado por el trabajador para que le proteja de uno o varios riesgos que puedan amenazar su seguridad o su salud, así como cualquier complemento o accesorio destinado a tal fin. Entre las obligaciones generales del centro de trabajo está la de determinar los puestos de trabajo en los que deba recurrirse a la protección individual, proporcionar gratuitamente a los trabajadores los equipos de protección individual que deban utilizar, velar por su correcta utilización, así como reponerlos cuando resulte necesario y asegurar su mantenimiento. Entre las obligaciones generales de los trabajadores está la obligación de utilizar y cuidar correctamente los equipos de protección individual, a colocarlos después de su utilización en el lugar indicado para ello y a informar de inmediato a su superior jerárquico de cualquier defecto, anomalía o daño apreciado en el equipo. Equipos de protección individual que pueden ser necesarios, en algún momento, en un Laboratorio de Microbiología Clínica: los protectores de los ojos y de la cara (gafas de seguridad, pantallas faciales), los protectores de las vías respiratorias (mascarillas, máscaras), los protectores de manos y brazos (guantes, manguitos), los protectores de la totalidad del cuerpo (batas) y los protectores del oído (tapones, cascos). Es infrecuente que en este ámbito laboral se precise algún tipo de calzado de seguridad, pero sí es necesario conocer que deben evitarse los modelos que no cubran por completo al pie y, además, que esta prenda es una fuente importante de arrastre de contaminación. Consideraciones generales en torno a los EPI a) Actualmente existen equipos que ofrecen un altísimo grado de protección, pero eso no significa que el EPI sea un substituto de una buena práctica de trabajo b) la utilización de un equipo equivocado creará un riesgo adicional al operario al inspirar en éste un falso sentido de seguridad c) el EPI se seleccionará en función del máximo nivel de riesgo que se espera encontrar al desarrollar la actividad d) la prenda ha de ser de una talla/tamaño adecuada a la del usuario e) cualquier EPI exige una limpieza y un mantenimiento adecuados f) sólo pueden emplearse equipos que lleven la marca de conformidad “CE”.

Protección de los ojos y de la cara. Las lentillas no proporcionan protección alguna a los ojos, por lo que no se recomienda su utilización durante el trabajo en el Laboratorio de Microbiología. En el caso de que una persona necesitara 20

llevarlas por prescripción facultativa, y no simplemente como corrección de la visión, estaría obligada a llevar también, siempre que estuviera expuesta a un riesgo biológico y/o químico, unas gafas de seguridad.

Existen también las denominadas pantallas faciales, que ofrecen protección frente a impactos y salpicaduras. Son elementos indispensables para protegerse frente a radiaciones, como es el caso de la luz ultravioleta. Protección de las manos y los brazos. Los guantes son quizás las prendas más empleadas, aunque no siempre se siguen correctamente las normas elementales de uso: a) las manos han de lavarse obligatoriamente al quitarse los guantes; b) el uso de los guantes debe quedar restringido para las operaciones frente a las que es necesario protegerse, de manera que es inadmisible, por ejemplo, abrir puertas con los guantes puestos, manejar volantes, coger el teléfono; c) cualquier tipo de guante no protege frente a cualquier producto químico, lo que significa que es preciso escoger el modelo según el riesgo al que se está expuesto. Los guantes tienen un amplio uso en el laboratorio pues, además de contra riesgos biológicos y químicos, también se emplean como protección frente a riesgos físicos, como el calor o el frío en determinadas manipulaciones. Para la protección de brazos existen los manguitos, que resultan interesantes, sobre todo, cuando la ropa que lleva el operario no es de manga larga.

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Protección respiratoria. Las mascarillas en general tienen utilidad en el Laboratorio de Microbiología especialmente para protección frente a polvo (partículas), aerosoles y gases y vapores químicos. Las conocidas mascarillas tipo “cirujano” no ofrecen protección alguna.

La máscara, ya sea media máscara o máscara facial, puede resultar útil en caso de protección frente vertidos accidentales de consideración. Los diferentes filtros que se pueden acoplar hay que desecharlos como material contaminado. El vestuario como equipo de protección. En principio es imprescindible hacer una clara distinción entre la ropa que es parte de un uniforme y las prendas del vestuario que actúan como elementos de protección individual. Además, existen una serie de recomendaciones generales, como son: a) no es aconsejable que el personal del Laboratorio de Microbiología que está en contacto con materiales contaminados emplee su ropa de calle; b) la ropa del laboratorio no debe ser nunca lavada fuera del Hospital; c) el usuario debe llevar la prenda de manera que se beneficie de su utilización pero que no resulte un elemento peligroso que arrastre contaminación fuera del laboratorio; d) el vestuario que sirve como protección personal no debe salir nunca del lugar de uso (a la biblioteca, a la cafetería, a la calle); e) en el ambiente de trabajo no se debe llevar ropa de calle que aumente la superficie corporal expuesta (pantalones cortos, sandalias).

Como parte del vestuario de protección se incluyen las batas (que se prefieren abrochadas a la espalda y con los puños elásticos) y los delantales. A veces, también resultan útiles los cubrezapatos. 22

Protección auditiva. Es la menos considerada en el ambiente de un Laboratorio de Microbiología, siendo habitual que el personal acepte como “normal” un nivel de ruido, procedente de aparatos y/o determinadas operaciones, por encima de los límites tolerables. Una reducción importante de estos niveles se consigue con un buen mantenimiento de los equipos. BARRERAS PRIMARIAS: CABINAS DE SEGURIDAD BIOLÓGICA Las cabinas de seguridad biológica (CSB) son cámaras de circulación forzada que, según sus especificaciones y diseño, proporcionan diferentes niveles de protección. Son fundamentales en un Laboratorio de Microbiología Clínica y se clasifican según el nivel y tipo de protección. En principio es necesario distinguir entre las campanas de extracción de gases, las cabinas de flujo laminar y las cabinas de Seguridad Biológica. La campana de gases (o vitrina extractora de gases) es un recinto ventilado que captura los humos y vapores procedentes de la manipulación de los productos químicos en el laboratorio. Si bien constituye un equipo muy útil en la contención del riesgo químico, no ofrece protección alguna frente a riesgos biológicos. Las cabinas de flujo laminar son recintos que emplean un ventilador para forzar el paso del aire a través de un filtro HEPA (acrónimo del término anglosajón High Efficiency Particulate Air) barriendo la superficie de trabajo. Su función es la de mantener un área libre de partículas, especialmente de posibles contaminantes (bacterias, levaduras,…) que puedan acceder al cultivo. Esto se consigue mediante los dos sistemas descritos antes (barrera de aire y filtro) que impiden la salida de contaminación.

Las barreras de aire se crean permitiendo que éste fluya en una sola dirección y a una velocidad constante dando lugar a una verdadera “cortina” de aire que se conoce como flujo de aire laminar. Es, por definición, un flujo con ausencia de turbulencias. Los filtros tienen como finalidad atrapar las partículas contenidas en este flujo de aire y los empleados habitualmente son los HEPA, que retienen con una eficacia del 99,97% partículas de hasta 0,2 micras de diámetro. El flujo laminar se asegura tanto por la gran superficie del filtro HEPA como por la velocidad constante del aire, como por la ausencia de fuentes intensas de calor (mecheros bunsen) en el interior de las cabinas, generadores de intensas corrientes de convección. 23

Las CSB tienen un dispositivo mecánico que fuerza el paso del aire a través de un filtro de gran superficie (filtro HEPA) situado o bien en el techo (flujo vertical) o en la pared frontal (flujo horizontal). Por tanto, el flujo de aire puede ser vertical u horizontal y determina el tipo de CSB. - Las cabinas de flujo laminar horizontal son muy adecuadas para una buena protección del producto, pero no son adecuadas para el trabajo con materiales peligrosos o con algún tipo de riesgo pues el operador queda completamente expuesto.

- Las cabinas de flujo vertical, más sofisticadas, se segura una buena protección del producto, y, dependiendo de su diseño se puede asegurar una protección total del operador. Son por ello más adecuadas para el trabajo con agentes peligrosos.

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Estas cabinas ofrecen protección únicamente al material que se maneja en su interior, pero nunca al operador, por lo que no son recomendables para el trabajo en un Laboratorio de Microbiología Clínica. Son, sin embargo, un instrumento de trabajo imprescindible en las denominadas “zonas limpias”. Las cabinas de Seguridad Biológica son recintos ventilados diseñados para limitar al máximo el riesgo del personal de laboratorio expuesto a agentes infecciosos. Ello es especialmente importante si se tiene en cuenta que muchas de las operaciones realizadas en un laboratorio implican la formación de aerosoles. Estos equipos tienen como objetivo principal proporcionar una zona de trabajo que minimice la probabilidad que una partícula transportada por el aire tiene de escapar hacia el exterior de la cabina y contaminar así al operario y a la zona que le rodea. Además, algunas de ellas, ofrecen protección al material que se manipula. Cuando una CSB es utilizada por personal debidamente formado y consciente de las limitaciones de ésta, se convierte en un equipo de contención muy efectivo para reducir el posible escape de contaminación biológica. Sin embargo, es conveniente tener muy en cuenta que una cabina no es nunca un substituto de una técnica microbiológica adecuada. Las CSB se dividen en tres categorías: clase I, clase II y clase III. Cabinas de clase I. Son cámaras cerradas con una abertura al frente para permitir el acceso de los brazos del operador. El aire penetra por este frontal, atraviesa la zona de trabajo y todo él sale al exterior a través de un filtro HEPA. La velocidad del flujo de aire es de unos 0,40 m/s (75 pies/m). Son apropiadas para manipular agentes biológicos de los grupos 1, 2 ó 3. La mayor desventaja que presentan es que no proporcionan protección al material con el que se trabaja, no evitando por lo tanto que éste se pueda contaminar.

Cabinas de clase II. Se diferencian principalmente de las de clase I en que, además de al operario y su entorno, ofrecen protección al producto frente a la contaminación. La superficie de trabajo está bañada por aire limpio que ha atravesado un filtro HEPA. La salida del aire se produce a través de otro filtro HEPA. Son equipos válidos para el manejo de agentes biológicos de los grupos 1, 2 ó 3. Existen varios tipos de cabinas de clase II, A, B1, B2 y B3, según sus características de construcción, flujo de aire y 25

sistema de extracción.

l Tipo A. En este tipo el 30 % del aire es eliminado en cada ciclo y el 70 % es recircularizado. El aire extraído desemboque en el mismo laboratorio o fuera de éste vía una conexión de tipo canopy. El escape al medio de los agentes potencialmente peligrosos se previene mediante una corriente de aire entrante en una rejilla frontal. l Tipo B. Se trata de una cabina de flujo laminar para uso general, y en ella se recirculariza sólo el 30 % del aire en cada ciclo, eliminándose el 70 % del aire restante, a través de un conducto hermético de salida, exclusivo para ellas, con un extractor y un sistema de alarma apropiado. Entonces se puede emplear para manipulaciones que impliquen pequeñas cantidades de productos tóxicos y radionucleidos. l Tipo 100 % exhausto. Se trata de una cabina en la que el 100 % del aire de cada ciclo es eliminado hacia dispositivos que puedan retener los posibles agentes peligrosos. Este tipo de cabinas se emplean fundamentalmente en laboratorios de

toxicología en los que se requieren áreas de contención limpias y eliminación del aire posiblemente contaminado. Cabinas de clase III. Constituyen el máximo nivel de seguridad. Son recintos herméticos en presión negativa y, por ello, su interior está completamente aislado del entorno. Se opera en ellas por medio de unos guantes, con trampa para introducir el producto, el aire entra a través de un filtro HEPA y se expulsa al exterior a través de dos filtros HEPA. Se recomiendan para el manejo de agentes de los grupos 1, 2, 3 ó 4.

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CSB. Recomendaciones generales Instalación de la cabina: 1. Debe situarse lo más lejos posible de las rejillas de aire acondicionado, campanas de gases, puertas y zonas de mucho tráfico de personas, que claramente interfieren en el flujo laminar. 2. Las ventanas del laboratorio han de permanecer siempre cerradas. 3. Debe existir al menos 0,3 m entre la salida de aire de la cabina y el techo del laboratorio. 4. Se instalará sobre una superficie sólida y nunca móvil. Si es posible, en un recinto cerrado o en una zona de acceso restringido.

Al inicial el trabajo: 1. Poner en marcha la cabina durante 5-10 minutos, a fin de purgar los filtros y “lavar” la zona protegida. 2. Comprobar que el manómetro situado en la parte superior del frontal se estabiliza e indica la presión adecuada (varía con el modelo de cabina). 3. Apagar la luz ultravioleta (si estuviera encendida) y encender la luz fluorescente. 4. Limpiar la superficie de trabajo con un producto adecuado (por ejemplo, alcohol etílico al 70%). 5. Antes y después de haber trabajado en una cabina deberían lavarse con cuidado manos y brazos, prestando especial atención a las uñas 6. Se aconseja emplear batas de manga larga con bocamangas ajustadas y guantes de látex. Esta práctica minimiza el desplazamiento de la flora bacteriana de la piel hacia el interior del área de trabajo, a la vez que protege las manos y brazos del operario de toda contaminación 7. En determinados casos, además es recomendable el empleo de mascarilla.

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Durante la manipulación: 1. Todo el material a utilizar (y nada más) se sitúa en la zona de trabajo antes de empezar. De esta forma se evita tener que estar continuamente metiendo y sacando material durante el tiempo de operación. 2. Es aconsejable haber descontaminado el exterior del material que se ha introducido en la cabina. 3. Este material se coloca con un orden lógico, de manera que el material contaminado se sitúa en un extremo de la superficie de trabajo y el no contaminado ocupa el extremo opuesto de la misma. 4. Según el tipo de manipulación y el modelo de la cabina, la zona de máxima seguridad dentro de la superficie de trabajo varía. En general, se recomienda trabajar a unos 5-10 cm por encima de la superficie y alejado de los bordes de la misma. Especial atención se prestará a no obstruir las rejillas del aire con materiales o residuos. 5. Una vez que el trabajo haya comenzado y sea imprescindible la introducción de nuevo material, se recomienda esperar 2-3 minutos antes de reiniciar la tarea. Así se permite la estabilización del flujo de aire. Es conveniente recordar que cuanto más

material se introduzca en la cabina, la probabilidad de provocar turbulencias de aire se incrementa. 6. Mantener al mínimo la actividad del laboratorio en el que se localiza la cabina en uso, a fin de evitar corrientes de aire que perturben el flujo. El flujo laminar se ve fácilmente alterado por las corrientes de aire ambientales provenientes de puertas o ventanas abiertas, movimientos de personas, sistema de ventilación del laboratorio… 7. Evitar los movimientos bruscos dentro de la cabina. El movimiento de los brazos y manos será lento, para así impedir la formación de corrientes de aire que alteren el flujo laminar. 8. Al igual que en el resto del laboratorio, no debe utilizarse el mechero Bunsen, cuya llama crea turbulencias en el flujo y además puede dañar el filtro HEPA. 9. Cuando deban emplearse asas de platino es aconsejable el incinerador eléctrico o, mejor aún, asas desechables. 10. Si se produce un vertido accidental de material biológico se recogerá inmediatamente, descontaminado la superficie de trabajo y todo el material que en ese momento exista dentro de la cabina. 11. No se utilizará nunca una cabina cuando esté sonando alguna de sus alarmas. Al finalizar el trabajo: 1. Limpiar el exterior de todo el material que se haya contaminado. 2. Vaciar la cabina por completo de cualquier material.

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3. Limpiar y descontaminar con alcohol etílico al 70% o producto similar la superficie de trabajo. 4. Dejar en marcha la cabina durante al menos 15 minutos. 5. Conectar si fuera necesario la luz ultravioleta (UV). Conviene saber que la luz UV tiene poco poder de penetración por lo que su capacidad descontaminante es muy limitada. Limpieza y desinfección de la CSB 1. Se llevará a cabo una desinfección completa en las siguientes situaciones: a) en caso de que se haya producido un vertido importante; b) antes de cualquier reparación; c) antes de iniciarse los chequeos periódicos; d) siempre que se cambie el programa de trabajo; e) cuando se substituyan los filtros HEPA y f) al cambiarla de lugar (incluso dentro del mismo laboratorio).

2. Se realizará con vapores de formaldehído y siempre por personal debidamente entrenado y con las prendas de protección personal adecuadas. 3. Por otro lado, debe tenerse en cuenta que una buena limpieza de la zona de trabajo es una garantía de ausencia de polvo y otros contaminantes. La limpieza tiene por objeto eliminar la suciedad que se halla adherida a las superficies y que sirve de soporte a los microorganismos. Al limpiar se elimina también la materia orgánica, contribuyendo de forma decisiva a la eficacia de la posterior descontaminación. 4. Es conveniente una vez a la semana levantar la superficie de trabajo y limpiar y descontaminar por debajo de ella. 5. Nunca se debe utilizar la cabina como almacén transitorio de equipo o material de laboratorio. Esta mala práctica conduce a una acumulación de polvo totalmente innecesaria. 6. Evitar introducir en la cabina materiales que emitan partículas fácilmente como algodón, papel, madera, cartón, lápices… Mantenimiento de la CSB 1. Semanalmente se limpiará la superficie de trabajo y el resto del interior de la cabina. 2. Semanalmente se pondrá en marcha a fin de comprobar la medida que da el manómetro. 3. Mensualmente, con un paño mojado, se limpiarán todas las superficies exteriores con objeto de eliminar el polvo acumulado. 4. Mensualmente se revisará el estado de las válvulas interiores con que vaya equipada.

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5. Anualmente se certificará por una entidad cualificada. Usos de la CSB en el Laboratorio de Microbiología 1- Control de aerosoles infecciosos. Se generan en el procesamiento de muestras o cultivos como: a.- Manipulación de microorganismos del grupo de riesgo 3. b.- Machacamiento de tejidos. c.- Descontaminación de muestras para cultivo de Micobacterias. d.- Procedimientos de identificación de hongos.

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PRACTICA No 2 TEMA: MEDIOS DE CULTIVO COMPETENCIAS  Conocer que es un medio de cultivos y los distintos tipos medios de cultivos.  Preparar, envasa los medios de cultivo líquidos y sólidos.  Esterilizar y almacena los medios de cultivo.

MARCO TEORICO El cultivo de las bacterias en el laboratorio es esencial para la identificación de estos microorganismos. El cultivo consiste en observar el crecimiento de las bacterias en medios especiales que contengan los nutrientes que favorezcan su desarrollo. El medio que contiene estas sustancias alimenticias se denomina medio de cultivo y existen en gran variedad. Para el crecimiento bacteriano además de un medio de cultivo adecuado es necesario mantener condiciones de temperatura, humedad y pH. CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Definición.- Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismo. La diversidad de los microorganismos es enorme; por ello, la variedad de medios de cultivos es también grande, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos. Daremos únicamente una idea general sobre algunos de los constituyentes habituales de un medio de cultivo. Constituyentes habituales de los medios de cultivos 1. Agar.- Se lo utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivos. El componente dominante en el agar bacteriológico es un polisacárido, al que acompañan algunas impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. Un gel de agar al 1-2 % en agua licua hacia los 1000C y se gelifica alrededor de los 400C, dependiendo de su grado de pureza. Con la excepción de algunos microorganismos marinos, el agar no es empleado como nutriente. 2. Extractos.- Para su preparación, ciertos órganos o tejidos animales o vegetales (Ejemplo: carne, hígado, cerebro, semillas) son atraídos con agua y calor y posteriormente concentrados hasta la forma final de pasta o polvo. Estos preparados deshidratados son frecuentemente usados en la confección de medios de cultivos. Ejemplo: extractos de carne, levaduras, malta, etc. 3. Peptonas.- son mezclas complejas de compuestos orgánicos nitrogenados y sales minerales que se obtienen por digestión enzimática o de proteínas

animales o vegetales (soya, caseína, carne, gelatina, etc.). las peptonas son muy 31

4.

5.

6. 7.

8.

ricas en péptidos y aminoácidos, pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales. Fluidos corporales.- sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguíneo son frecuentemente añadido a los medios empleados para el cultivo de algunos patógenos. La sangre no puede ser esterilizada y debe, por tanto, ser obtenida en condiciones asépticas directamente de un animal sano. Los fluidos corporales no solamente contribuyen con factores de crecimiento, sino también con sustancias que neutralizan inhibidores de crecimiento de algunas bacterias. Sistemas amortiguadores.- algunos componentes son incorporados al medio de cultivo para mantener el pH dentro de un rango óptimo de crecimiento bacteriano. Los microorganismos más comunes son neutrófilos (el pH óptimo para su crecimiento está próximo a la neutralidad), y sales como fosfatos bisódicos o bipotásicos, o sustancias como las peptonas, previenen una desviación del pH. Indicadores de pH.- indicadores ácidos-bases se añaden a menudo a los medios de cultivos con objeto de detectar variaciones del Ph. Agente reductores.- cisteína, tioglicolato y otros son agentes reductores que se añaden a los medios de cultivos para crear condiciones que permitan el desarrollo de gérmenes microaerófilos o anaeróbicos. Agentes selectivos.- la adicción de determinadas sustancias al medio de cultivo puede convertirlo en selectivo. Por ejemplo. Cristal violeta, sales biliares, azida sódica, telurito potásico, antibióticos, etc., a la concentración adecuada, actúan como agente selectivos frente a determinados microorganismos.

Medio extendido en tubo o Agar tendido

MATERIALES Algodón Fósforos Espátula Cajas de Petri Pipeta Tubos de ensayos

MEDIOS Medios de cultivo Caldo Nutritivo Agua de Peptona Agar Manitol sal Agar nutritivo Agar Mac Conkey

EQUIPOS REACTIVO Refrigerador Alcohol Reverbero Balanza Mechero Autoclave

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Fiolas vasos de precipitación Agitador agua destilada

Agar Mueller-Hinton Agar eosina azul de metileno

Elaborado: QF. Mariana Rendón M. MSc.

PROCEDIMIENTO 1.-Se proporciona a los alumnos diversos medios de cultivo para que primero anoten los siguientes datos: Nombre del medio de cultivo, tipo de medio de cultivo de acuerdo a su consistencia y uso, para qué tipo de microorganismos se utiliza o qué pruebas se pueden realizar, composición y como se prepara 2.- Posteriormente que se procede a preparar algunos de los medios de cultivo que Se necesitan para las prácticas de laboratorio siguientes Preparación de medios de cultivo liquido 1. Leer la instrucciones del frasco y de acuerdo a esto realizar una regla de tres para preparar la cantidad requerida 2. Pesar la cantidad obtenida en el calculo 3. Disolver en un beaker con la cantidad de agua destilada(medida en una probeta) de acuerdo a lo que se va a preparar 4. Disolver adecuadamente y envasar en tubos de ensayo o fiolas según el medio que se va a preparar 5. Llevar al autoclave y esterilizar Preparación de medios de cultivo solido 1. Leer la instrucciones del frasco y de acuerdo a esto realizar una regla de tres para preparar la cantidad requerida 2. Pesar la cantidad obtenida en el calculo 3. Disolver en un beaker con la cantidad de agua destilada(medida en una probeta) de acuerdo a lo que se va a preparar 4. Llevar al reverbero para calentar hasta que hierva, por lo menos 3 minutos. 5. Envasar en tubos de ensayo o fiolas según el medio que se va a preparar 6. Llevar al autoclave y esterilizar Esterilización de medios de cultivo: Una vez preparado el medio, éste se debe esterilizar lo antes posible para evitar el crecimiento de microorganismos: - Medios sólidos en placa de Petri 1) Tapar el matraz con tapón de algodón graso y cubrir con papel de aluminio para llevar a esterilizar en el autoclave (121º C, 15-20 min). 2) Una vez estéril repartir el medio en placas de Petri estériles y dejar en reposo para su solidificación. - Medios sólidos en tubo (agar inclinado) 1) Luego la ebullición del medio con agar, éste se reparte en los tubos de vidrio, de forma que queden llenos hasta aproximadamente la mitad (20ml). Los tubos se cubren con tapón. 2) Llevar a él autoclave a 121º C por 15-20 min 33

3) Una vez esterilizado, los tubos se disponen en posición inclinada para su solidificación. - Medios líquidos 1) Una vez disueltos los componentes del medio en el matraz, repartir en su caso en tubos a razón de 2-4 ml por tubo, cubrir con tapón y llevar a esterilizar en el autoclave. Alternativamente, se puede esterilizar el medio en el matraz, y posteriormente repartirlo en tubos estériles. - Medios semisólidos 1) Se preparan con concentraciones inferiores de agente solidificante (agar agar). 2) El medio se reparte en tubos. En caso de desear proporcionar condiciones anaeróbicas, existen diversas metodologías para ello. Los medios semisólidos se utilizan para el crecimiento bacteriano a lo largo del tubo. Los niveles de difusión de oxígeno en las distintas capas condicionará el crecimiento de distintos tipos de microorganismos (aerobios, anaerobios). PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO 1.- AGAR NUTRITIVO: USOS.----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------FORMULA APROXIMADA POR LITRO Ingredientes --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Cantidad ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

INSTRUCCIONES.---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------34

--------------------------------------------------------------------------------------------CALCULOS

2.- CALDO NUTRITIVO USOS.------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------FORMULA POR LITRO Ingredientes -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Cantidad -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

INSTRUCCIONES.------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ----------------------------------------------------35

CALCULOS

3.- AGUA MUELLER HINTON Usos.------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------.-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------. FORMULA POR LITRO Ingredientes -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Cantidad -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

INSTRUCCIONES.------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------CALCULOS

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4.- AGAR HIERRO TRIPLE AZUCAR Usos.------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------FORMULA APROXIMADA POR LITRO Ingredientes

Cantidad

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

INSTRUCCIONES.------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------CALCULO

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CONCLUSIONES -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

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PRACTICA No 3 TEMA: CONTROL DE LOS MICROORGANISMOS .- DESCONTAMINACION y ESTERILIZACION.MANEJO DE INOCULOS: TECNICA ASEPTICA COMPETENCIAS

 Conocer la técnica aséptica  Practicar las diferentes formas de manejar las muestras.  Adquirir experiencia en la toma del inóculo en condiciones de asepsia, es decir, en un ambiente libre de contaminación microbiana. MARCO TEORICO INTRODUCCIÓN La microbiología es la ciencia que se encarga del estudio de los microorganismos, y su desarrollo ha contribuido de manera fundamental en áreas biológicas, médicas y químicas entre muchas otras. El estudio en laboratorio de un microorganismo requiere que esté aislado de otros; es decir se necesita tener un cultivo puro. Para trabajar con cultivos de microorganismos y en general en microbiología, es de gran importancia mantener condiciones de asepsia, es decir trabajar en ambientes libres de contaminación microbiana, cuidando mantener la esterilidad del material y de las soluciones. Por esta razón, todo el material a utilizar en el laboratorio (mesones, frascos de soluciones, incluso el aire) debe estar bajo estricto control, con el objeto de asegurarse que cuando se está cultivando una determinada especie de microorganismo, sólo se desarrolle el microorganismo de interés y no poblaciones que se encuentran en el aire o en el ambiente general. El término aséptico significa “sin microorganismos”. La técnica aséptica se refiere a las prácticas que reducen la posibilidad de que los microorganismos entren en el cuerpo durante procedimientos clínicos, reduciendo así a su vez el riesgo de que los usuarios se infecten más tarde. Algunas de estas prácticas también disminuyen a posibilidad de que los profesionales de salud tengan contacto con sangre y tejidos infecciosos durante los procedimientos clínicos. La técnica aséptica se realiza para:  Eliminar o matar los microorganismos que se encuentren en las manos o en otros objetos.  Emplear instrumentos y otros objetos que se hayan esterilizado.  Reducir el contacto que tengan los usuarios con los microorganismos que no se puedan eliminar. El tipo de microorganismo que será utilizado en este laboratorio serán bacterias y levaduras. Estos microorganismos se cultivan sobre materiales conocidos como medios de cultivo. La composición química o nutricional de los medios es extremadamente variada (Práctica Medios de Cultivo). Los medios más comunes son los caldos (medios líquidos), tubos con agar inclinado, tubos con agar y cajas de Petri o placas de agar. A menudo es necesario tomar una muestra de bacterias de un tubo y colocarlas en otro. 39

El proceso requiere cuidado y precisión, y se lleva a cabo siguiendo la técnica aséptica para evitar que la bacteria en el tubo contamine el área de trabajo o a la persona que lleva a cabo a transferencia. MATERIALES

Algodón Lápiz graso Fósforos Gradilla Tubos Asas de inoculación Guantes Mascarillas

MEDIOS DE CULTIVO Y CEPAS BACTERIANAS

REACTIVOS

EQUIPOS

alcohol

Mechero Refrigeradora Incubadora

St. Aureus E. coli Agar Nutritivo Caldo Nutritivo

Elaborado: QF. Mariana Rendón M. MSc.

PROCEDIMIENTO 1: Control de la Esterilidad en el trabajo microbiológico:  Desinfectar con un algodón impregnado con etanol 70% limpiar el lugar de trabajo, manos y utensilios no esterilizados por autoclave. Procurar tener mucho cuidado con el mechero ya que el etanol es inflamable. Trabajar con utensilios del laboratorio cerca del mechero.  Colocar frente al mechero la muestra y todo el material que se vaya a necesitar para realizar la siembra.  Dependiendo del tipo de siembra se utiliza el asa adecuada. Para sembrar en caldos utilizar el asa redonda, para realizar una siembra en superficie (slant) y TECNICA ASEPTICA a) Importancia de las condiciones de asepsia 1. Marcar las cajas de la siguiente manera: Caja 1: Puntas de los dedos sin guantes Caja 2: Puntas de los dedos con guantes Caja 2: Hablar frente a la placa. Caja 3: Abiertas. Caja 4: Caja control. 2. Para la caja 1, toca suavemente la superficie del agar con las puntas de los dedos sin guantes. 3. Caja 2, toca suavemente la superficie del agar con las puntas de los dedos con guantes 4. Destapa la caja 2 y sostenla a una distancia de 10 a 15 cm de tu boca. Repite 40

5. 6. 7. 8. 9.

tres veces el trabalenguas de “tres tristes tigres tragaban trigo en un trigal en tres tristes platos. En tres tristes platos, en un trigal, tragaban trigos tres tristes tigres”. Tapa de nuevo las cajas. La caja 3 se dejará destapada durante toda la sesión de laboratorio. La caja 4 se conservará sin abrir. Una vez que las placas han sido expuestas, deben colocarse en la incubadora en posición invertida por 24 horas y a 37 °C. L a siguiente sesión examina las placas y registra los resultados en la tabla Regresa las cajas a la profesora para que se desechen adecuadamente.

La toma del inóculo, es decir de la muestra que hay que examinar, ya sea esta sólido o líquido, es muy sencilla, pero, se debe realizar con cuidado, para que se lleve a cabo un trabajo exitoso. En la toma de inóculo se debe tomar en cuenta que se corre el riesgo de contaminación por microorganismos, como ejemplo, es por esa razón que se debe trabajar en frente de un mechero. La toma del inóculo es muy importante para el trabajo de laboratorio, en especial debemos tener en cuenta que debemos trabajar con precaución b) Transferencia tubo a tubo Cada alumno sembrará 4 tubos practicando los diferentes tipos de transferencia (Fig. 1).  Caldo-Caldo  Caldo-Agar inclinado  Agar inclinado-Caldo  Agar inclinado-Agar inclinado Siempre mantener los tubos con caldo en una gradilla. Nunca acostados en la mesa de trabajo, ni en la bata. Al acabar la práctica, coloca la gradilla con los tubos en la incubadora a 37 °C por 24 horas

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Manejo de inoculo en caja de Petri Para traspasar un cultivo sólido proveniente de una placa para realizar un frotis o aislar un microorganismo, se toma un pequeño inóculo con una asa metálica y se siembra sobre el agar de una nueva placa, haciendo un movimiento de zigzag con el asa cargada sobre el agar, diluyendo el inóculo tres veces (ver fig. 1). También es posible traspasar cultivos sólidos a medios líquidos, sacando una muestra de una colonia con un asa e introduciéndola en el medio líquido, y agitando el asa en el frasco. Del mismo modo se pueden traspasar cultivos líquidos a cultivos líquidos con micro pipeta o con una pipeta Pasteur. PROCEDIMIENTO 1. Colocar frente al mechero la muestra del microorganismos y el resto de material a trabajar 2. Tome el asa de la siembra y flamee el filamento hasta que este alcance un rojo incandescente y luego enfríelo con proximidad de la llama 3. Tome con la otra mano el recipiente que contiene los microorganismos. Si la muestra está en un tubo, quite el tapón con los dedos meñique y anular con la mano que sostiene el asa y flamee la boca del tubo, si esta muestra está en caja petri, coloque la caja invertida sobre la mesa de trabajo y levante la parte 4. Que contiene el medio de cultivo con los microorganismos. Llévela a la proximidad de la llama del mechero 5. Trabajando en todo momento en la proximidad de la llama, introduzca el asa de siembra y tome una pequeña cantidad del cultivo. Si el medio es líquido, agite ligeramente el tubo y tome una muestra que quedará adherida, por tensión superficial, en el extremo del filamento del asa de la siembra. Si los microorganismos se multiplican en medio sólido, tome una pequeña porción de aquellos mediante un ligero roce con el asa de siembra. Si la muestra se encuentra en la profundidad del agar, hunda el filamento dentro del medio hasta tomar una pequeña porción de la misma 6. Transfiera el inóculo a otro medio de cultivo estéril, tomando las mismas precauciones en su manejo (flameando bocas de tubos, trabajando en la proximidad de la llama, etc.) o bien proceda a preparar un frotis para tinción  si la transferencia se va a realizar a un caldo estéril, descargue el inóculo mediante la agitación del asa de siembra en aquel.  Si la transferencia se va a realizar a un slant, introduzca el asa con el inóculo y siempre en zigzag sobre la superficie slant.  Si la transferencia se va a realizar sobre un medio estéril en una caja petri, deposite el inóculo en un área pequeña de la superficie de la placa, próxima del borde. Extienda el inóculo formando estrías muy juntas sobre la superficie de la porción muy pequeña de la placa. Tomando esta vez como inóculo el obtenido mediante el rozamiento del asa de siembra  con las estrías sembradas por primera vez, realice la segunda tanda de estrías sobre una porción virgen de la placa. Repita este proceso tres o cuatro veces. Una vez realizada la transferencia:  en el caso de los tubos, flamee la boca de éstos antes de colocar el tapón. Marque los tubos con la identificación del cultivo, la fecha y el nombre. 42

Incube a temperatura adecuada durante el tiempo necesario para que se desarrolle los microorganismos  si se realizó sobre un medio contenido en una placa de petri, tape la placa. Esta se incubará en posición invertida para evitar que el agua de condensación se deposite sobre la superficie del agar, lo cual impedirá la obtención de colonias aisladas. Marque en la base de la placa la identificación del cultivo, la fecha y el nombre. 7. Antes de dejar el asa de siembra sobre la mesa, flaméela de nuevo con el objeto de esterilizarla. RESULTADOS Realiza la descripción morfológica de las colonias (si es que hay) obtenidas en las cajas con los distintos tratamientos en relación a la caja control.

Procedimiento Punta de los dedos Con guantes Hablar frente a la placa Caja abierta durante la practica Caja control

RESULTADOS Características observadas

Descripción de las características del cultivo en caja de Petri con diferentes tratamientos Elaborada: QF. Mariana Rendón M. MSc.

Nota: Reportar el crecimiento 1. En forma cualitativa: (-) no hay crecimiento, (+) poco crecimiento. (++) crecimiento regular y (+++) crecimiento abundante. 2. Consistencia y color de la cepa cultivada( si hubiera crecimiento) Registra la morfología macroscópica del microorganismo sembrado en los tubos con agar inclinado y en los caldos de acuerdo a la guía de observación. DISCUSIÓN.- CONCLUSIONES En esta sección se analizarán los resultados obtenidos, tratando de dar respuesta a las siguientes preguntas (entre otras): 1. ¿Debes tocar las cajas de agar con tus manos? 2. ¿Puedes encontrar organismos en el aire? 3. ¿Qué resultados soportan tus conclusiones? 4. ¿Cuándo trabajas con cultivos microbianos, puedes hablar? 5. ¿Por qué sí o por qué no? Contestar 43

DEBER No 2 a) Cuestionario Contesta las siguientes preguntas relacionadas con la técnica de transferencias. 1. ¿Por qué razón no debes compartir el mechero de Bunsen? 2. ¿Cuál es la razón para flamear los tubos antes y después de cada transferencia? 3. ¿Por qué debes evitar el usar el pulgar para sostener las tapas durante una transferencia? 4. Explica por qué debes evitar que el asa llena de inóculo toque la boca del tubo fuente o del tubo a ser inoculado. 5. Cuando tomas un inóculo de un tubo con agar inclinado. ¿Por qué es necesario tocar una parte estéril del agar con el asa antes de tocar el crecimiento bacteriano? 6. ¿Por qué el asa debe ser flameada antes y después de todos los procedimientos de siembra? 7. ¿Por qué las placas de agar deben mantenerse invertidas durante la incubación? c) Glosario. Define los siguientes términos: TERMINO

DEFINICION

Agar Medio de cultivo Caldo de cultivo Incubación Colonia Inoculación Contaminación Técnica aséptica Estéril Desinfección d) Haz un diagrama de flujo del procedimiento de transferencia microbiana de tubo a tubo. e) Completa el siguiente cuadro Cuadro 2. Equipo y material del laboratorio. Equipo y Material Caja de Petri Pipetas Asa bacteriológica Balanza analítica

Para que se utiliza

Dibujo o Foto

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Incubadora Refrigerador Probeta Mechero de Bunsen

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PRACTICA No 4 TEMA: MICROSCOPIO.- TINCION SIMPLE Y TINCION DOBLE Y DIFERENCIAL: TECNICA DE GRAM COMPETENCIAS:     

Aprender a realizar un frotis o extendido y diferentes tipos de fijación Realizar una tinción simple Diferenciar la disposición y agrupación de los microorganismos Realizar la técnica de Gram Diferenciar los microorganismos Gram positivos de los Gram. negativos observando las limitaciones de la tinción en cultivos en la fase estacionaria  Adquirir destreza en el manejo del microscopio

MARCO TEÓRICO: La morfología bacteriana se puede ser estudiada de dos formas distintas: 1. Por visualización de los microorganismos vivos sin teñir, lo que nos permite además observar su posible movilidad 2. Por visualización de los microorganismos teñidos mediante colorantes, con una concentración tal que hacen morir a la bacteria y no permiten observar su movilidad, pero sin embargo se mejora notablemente la visualización de su morfología y otras estructuras según el tipo de tinción llevada a cabo. En general las bacterias vivas son prácticamente incoloras, no presentando suficiente contraste en el medio acuoso donde estas se presentan suspendidas, con lo cual no pueden ser observadas con claridad. Pero si se tiñen se producen una gran contraste con respecto al medio que las rodea. Además algunos de estos colorantes pueden también teñir estructuras internas de la bacteria, lo que nos sirve para su identificación Por todo esto las principales ventajas, de la técnica de tinción son:  observar más adecuadamente su morfología  proporcionar el contraste preciso y suficiente en cada caso, lo que permitirá diferenciar distintos tipos morfológicos  establecer una información complementarias sobre su estructuras internas y/o externas que no podrían ser observadas por examen en fresco  conocer su características tintoriales orientándolos hacia un grupo taxonómico u otro en la clasificación bacteriana

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BACTERIAS Cocos (esféricas)

CARACTERISTICAS Forma esférica o casi esférica ya que sus diámetros (largo y ancho) son casi iguales

TIPOS DE AGRUPACION  Células agrupadas en Pares (Diplococos)  Células agrupadas en cadenas cortas y largas (estreptococos)  Células agrupadas en forma de racimo (estafilococos Bacilos o Tienen uno de los ejes o  Sin agrupación o diámetro notablemente agrupación irregular Bastones mayor que el otro, de tal  Células aisladas en (cilíndricas) manera que se parejas observan como  Células en cadenas bastoncitos de diferente  Disposición celular, ancho y longitud. una al lado de la otra Helicoidales o Generalmente de No se tienden a agrupan curvas (Espirales) presentación aislada; las células son muy largas en relación a su ancho y se observa una torsión alrededor de su eje (espiras). Elaborado por: QF. Mariana Rendón M MSc.

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TINCION SIMPLE

MATERIALES

MEDIOS DE REACTIVOS CULTIVO/CEPAS

EQUIPOS

Algodón

Caldo nutritivo

Alcohol

Mechero

Fósforos

Cepas varias

Azul de metileno Safranina

Microscopio

Gasa Placas portaobjetos Asa de inoculación Papel filtro

Violeta de genciana Aceite cedro

de

Elaborado: Mariana Rendón M MSc.

PROCEDIMIENTO FROTIS  Se saca la placa portaobjeto del recipiente en que esta almacenas y se seca con una gasa, se rotula el número de muestra con el lápiz graso. Se agrega con el asa estéril 1 0 2 gotas de agua destilada o caldo nutritivo estéril. Se toma con el asa de siembra la muestra y se extenderá de forma uniforme.  Si la muestra problema es líquida se tomará con el asa estéril una o dos gotas y se añadirá al portaobjetos extendiéndola uniformemente con el asa de siembra FIJACION  Dejar que la muestra en el portaobjeto se seque al aire y una vez seca, si la muestra es solida se fijará con calor, haciendo pasar por ello la extensión de 2 a 3 veces por la llama del mechero, ayudándonos con pinzas si fuera necesario.  Si es liquida, se debe agregar metanol y dejar secar al ambiente TINCION  Ya realizado el frotis se pondrá este en la rejilla de tinciones, que estará sobre el lavadero. A partir de aquí se cubrirá la totalidad de extensión con el correspondiente colorante, que para la tinción simple suele ser azul de metileno, dejándole actuar durante un minuto o azul de toloudina durante el mismo tiempo  Transcurrido este tiempo, se verterá agua abundante en la preparación, a fin de eliminar el resto de colorante que pudiera haber.  Dejar secar la preparación al aire  Observar al microscopio con el objetivo de inmersión TINCION DOBLE Y DIFERENCIAL:TECNICA DE GRAM MARCO TEÓRICO: La observación de la morfología bacteriana se realiza utilizando colorantes biológicos que permiten aumentar el contraste entre la célula bacteriana y el 48

medio que las contiene. La técnica más utilizada para el estudio de la morfología bacteriana es la tinción de Gram. Esta técnica doble y diferencial es la más empleada en microbiología. Fue desarrollada por Hans Christian Gram, en 1884. A pesar del tiempo transcurrido, la tinción se ha modificado poco y es uno de los primeros pasos para identificar microorganismos. Este método divide las bacterias en dos grupos: las Gram positivas y las Gram negativas. Este distinto comportamiento en la tinción de Gram es debido a la distinta composición de la pared celular de las bacterias. Los microorganismos que retienen el violeta de genciana, licor de Gram se van a observar de color violeta y aquellos microorganismos que se decoloran van a adquirir el color de contraste de la safranina, por lo que se observan de color rojo rosado. En general se pueden decir, que las bacterias Gram positivas van a reaccionar de manera diferente a las Gram negativas frente a muchos agentes físicos y químicos. En la técnica de Gram se usan cuatro tipos de soluciones Solución colorante primario (básico) mordiente

Nombre Cristal violeta o violeta de genciana

Función Tiñe todas las bacterias del frotis

El licor o lugol de Es una sustancia que va a incrementar Gram la afinidad entre la célula microbiana y el colorante haciendo que se formen un complejo coloreado que fija el colorante, por la acción del mordiente, las células se tiñen más intensamente. Retira el colorante de ciertas las célula El decolorante Alcohol al 70% o Alcohol Cetona teñida (bacterias Gram negativas). Algunas células se van a decolorar más fácilmente que otras. En la tinción de Gram y en otras tinciones diferenciales, es el diferente comportamiento en la decoloración, lo que sirve para diferenciar las bacterias. Colorante de Safranina Va a ser de un color diferente al del contraste o colorante primario. Su misión será dar secundario color a las células decoloradas. Los microorganismos que no se decoloran fácilmente retienen el color del colorante primario. Los que se decoloran, toman el color de contraste. Soluciones de la técnica de Gram Elaborado por: QF. Mariana Rendón M. MSc.

La Tinción de Gram es una tinción que nos permite evaluar: 49

1. Afinidad Tintorial 2. Morfología 3. Agrupación MATERIALES

MEDIOS DE REACTIVOS CULTIVO/CEPAS

EQUIPOS

Algodón

Caldo nutritivo

Alcohol

Mechero

Fósforos

Cepas varias

Licor de Gram

Microscopio

Gasa

Safranina

Refrigeradora

Placas portaobjetos Asa de inoculación

Violeta de genciana Aceite de cedro

Papel filtro

Alcohol Cetona

Elaborado por: Mariana Rendón M. MSc.

PROCEDIMIENTO DE LA TECNICA Frotis FROTIS Y FIJACION DE LA MUESTRA:

4. 5. 6. 7. 8. 9.

En un portaobjeto colocar una gota de agua o caldo estéril y a partir de una placa de cultivo se toma una colonia con el asa y posteriormente se realiza una disolución de las bacterias extraídas del cultivo con el agua. La preparación se seca a temperatura ambiente Fijación

Se pasa por la llama del mechero (3 veces) teniendo la precaución de Tinción no exponerla demasiado al fuego directo, ya que Ejecute la técnica de la forma que a continuación se detalla esto perjudica la evaluación de la forma y tinción de las bacterias. Una vez seca la lámina se tiñe.

50

TINCION 1. Disponga la preparación bacteriana realizar la tinción

sobre la cubeta diseñada para

2.-Cubra la lámina con Cristal violeta durante 1 minuto. 3.-Lave el exceso de colorante con agua 4.-Cubra con Lugol durante 1 minuto. 5.-Lave el exceso de lugol con agua. 6.-Decolore con solución alcohol-acetona durante 20 segundos. 7.-Lave con abundante agua para eliminar el exceso de disolvente. 8.-Cubra la lámina con Safranina durante 30 segundos. 9.-Secar la preparación entre 2 laminas de papel filtro y observar al microscopio con aceite de inmersión. NOTA: Luego de cada lavado elimine el exceso de agua para evitar la dilución del colorante o solución empleada. Disponga cada solución durante el tiempo estrictamente estipulado.

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1.- Visualice al microscopio la morfología de las bacterias (40x), fijándose sobre todo en el color de la preparación para clasificarlas en Gram + o Gram -. Ej.: Bacilos Gram (+), Bacilos Gram (-), Cocaceas Gram (+) o Cocaceas Gram (-) 2.- Determine la agrupación de las bacterias observadas. Ej.: En cadena, agrupación irregular, etc.

10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. COCACEAS GRAM POSITIVAS 22.AGRUPACIÓN EN CADENA

racimos,

BACILOS GRAM POSITIVOS AGRUPACIÓN EN CADENA

RESULTADOS TINCION SIMPLE

52

TINCION DOBLE O DIFERENCIAL

CONCLUSIONES ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

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PRÁCTICA N° 5 TEMA: Preparaciones teñidas.- Tinción doble y diferencial Tinción de Bacterias Ácido Alcohol Resistentes (Ziehl - Neelsen) COMPETENCIAS  Conocer la morfología y capacidad de tinción de las bacterias ácidoalcohol resistentes.  Distinguir las agrupaciones que estas presentan.  Realizar la técnica de Ziehl-Neelsen  Diferenciar e identificar las bacterias no ácido alcohol resistentes de las alcohol ácido resistentes. MARCO TEÓRICO Esta tinción permite diagnosticar y estudiar enfermedades producidas por especies alcohol ácido resistente, como la tuberculosis y la lepra, que son producidas por bacterias que son de la Familia Micobactereaceae, Género Mycobacterium, Especies: Mycobacterium Tuberculosis y Mycobacterium Leprae. Esta técnica diferencia las bacterias alcohol ácido resistentes del resto que no presentan esta propiedad (bacterias no alcohol ácido resistentes). Fundamento Existe un grupo de microorganismos como las micobacterias y actinomicetos, cuya propiedad de ácido-resistencia está relacionada con un alto contenido de lípidos y componentes céreos, por lo que este tipo de bacterias presentan grandes dificultades a la hora de teñirse con los colorantes convencionales que no pueden penetrar en el interior de las bacterias. La tinción de estas células de debe realizar con colorantes que presente una gran afinidad con ellas y ayudados con el calor y un solvente como el fenol. Una vez que han sido teñidas, son difíciles de decolorar e incluso resisten las decoloraciones del alcohol ácido. Las bacterias ácido alcohol resistentes, tras la unión de la fucsina resisten el tratamiento orgánico y se verán teñidas de rosa. El resto de las bacterias decoloran y se contrastan con azul de metileno. La técnica fue ideada por Robert Koch y en la actualidad este proceso se lo conoce como la técnica de Ziehl-Neelsen. Esta técnica diferencia las bacterias alcohol ácido resistentes del resto que no presentan esta propiedad (bacterias no alcohol ácido resistentes). 54

Requiere de tres colorantes:  Mezcla en fucsina-fenol: capaz de teñir células en caliente. El fenol facilita la penetración de la fucsina en la envoltura celular.  Decolorante: mezcla de ácido y alcohol.  Colorante de contraste: azul de metileno. MATERIALES

MEDIOS DE REACTIVOS CULTIVO/CEPAS

EQUIPOS

Algodón

Caldo nutritivo

Alcohol

Mechero

Fósforos

Cepas varias

Azul de Microscopio metileno(0.3 %) Carbol fucsina o fenol fucsina Ácido clorhídrico (0.36 N) en etanol Aceite de cedro

Gasa Placas portaobjetos Asa de inoculación Papel filtro Elaborado por: QF. Mariana Rendón M. MSc.

PROCEDIMIENTO:  Preparar el frotis con una muestra microbiana  Fijar  Tinción a) Cubrir toda la preparación con Carbol fucsina o fenol fucsina. Calentar en el mechero, sin que hierva por 5 minutos. Añadir carbol fucsina o fenol fucsina periódicamente la placa no debe quedar seca. Lavar con agua el exceso de colorante. b) Decolorar con la solución ácido-alcohol hasta observar un color rosado (30 segundos.). Lavar para detener la decoloración. c) Teñir con azul de metileno por 1 minuto. Lavar el exceso de colorante d) Secar la muestra e) Leer con objetivo de inmersión, en el sentido de las manecillas del reloj 100 campos y contar los BAAR por campo. Los bacilos aparecen como bastoncillos delgados, ligeramente curvos, teñidos de rojo, generalmente con gránulos más coloreados en su interior, aislados, en parejas o en grupos, sobre el azul claro de la tinción de contraste. PASO

TÉCNICA

Primer colorante Decolorante

Fucsina fenicada 5 minutos con calor Alcohol ácido

Colorante de contraste

Solución Hidro-alcohólica Azul de metileno1 minuto

RESULTADO AARAAR+ Se tiñen rojo Se tiñen rojo Se decoloran Se tiñen azul

No se decoloran Permanecen rojas Permanecen rojas (Mycobacterium)

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Cuadro de SistematizacionTécnica de Ziehl-Neelsen Elaborado por: QF. Mariana Rendón M. MSc.

REPORTE DE RESULTADOS NEGATIVO

POSITIVO (+)

POSITIVO (++) POSITIVO (+++) MÀS DE 100 POSITIVO (++++)

NEGATIVO No se encontraron bacilos ácido-alcohol resistentes en 100 campos observados 1-9 BAAR Informar el número de bacilos observados en 100 campos Menos de 1 bacilo por campo en promedio, en 100 campos observados De 1 a 10 bacilos por campo en promedio en 50 campos observados Más de 10 bacilos por campo en 20 campos observados

Cuadro de reporte de resultados de la Baciloscopia Elaborado por: QF. Mariana Rendón M. MSc.

RESULTADOS

CONCLUSIONES -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

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PRACTICA No 6 TEMA: IDENTIFICACION MICROSCOPICA DE LAS LEVADURAS COMPETENCIAS  Identificar microscópicamente las levaduras en preparaciones en fresco y la técnica de Gram  Diferenciar microscópicamente a las levaduras de las bacterias  Diferenciar la morfología y estructura de los hongos  Identificar microscópicamente los géneros de hongos LAS LEVADURAS MARCO TEORICO Las levaduras se han definido como hongos microscópicos, unicelulares. Este grupo de microorganismos comprende alrededor de 60 géneros y unas 500 especies. Históricamente, los estudios sobre microbiología enológica se han centrado en las levaduras pertenecientes al género Saccharomyces, que son las responsables de la fermentación alcohólica. Anteriormente se creía que sólo ellas participaban en el proceso de producción de alcohol, sin embargo, las diferentes levaduras no-Saccharomyces, especialmente durante la fase inicial de la fermentación, pueden influir en las propiedades organolépticas de las bebidas alcohólicas. El papel de las levaduras como agentes fermentadores no fue reconocido sino hasta 1856 por Luis Pasteur. Las teorías científicas de esa época reconocían la presencia de éstas en la fermentación alcohólica, pero eran consideradas como compuestos químicos complejos, sin vida. Esta era la teoría mecanística liderada por los químicos alemanes von Liebig y Wöhler. Luis Pasteur, propuso la teoría vitalística y demostró que las células viables de levaduras causan fermentación en condiciones anaerobias; durante la cual el azúcar presente en el jugo es convertido principalmente en etanol y CO2. Las levaduras son los agentes de la fermentación y se encuentran naturalmente en la superficie de las plantas, el suelo es su principal hábitat encontrándose en invierno en la capa superficial de la tierra.

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En verano, por medio de los insectos, polvo y animales, son transportados hasta el fruto, por lo que su distribución se produce al azar. Existe un gran número de especies que se diferencían por su aspecto, sus propiedades, sus formas de reproducción y por la forma en la que transforman el azúcar. Las levaduras del vino pertenecen a varios géneros, cada uno dividido en especies.

MATERIALES MEDIOS DE REACTIVOS CULTIVO/CEPAS COLORANTES Algodón Caldo nutritivo Alcohol Fósforos

Cepas varias

Gasa Placas portaobjetos Asa de inoculación Papel filtro

Y EQUIPOS Mechero

Algodón de Azul de Microscopio Lacto fenol Lugol Kit de Gram Aceite de cedro

Lapiz graso Elaborado por: QF. Mariana Rendón M. MSc.

PROCEDIMIENTO Preparación en fresco.- Lamina y laminilla 1. 2. 3. 4.

5.

6. 7. 8.

Desinfectar la superficie de trabajo con alcohol. Prender el mechero para dar un área de esterilidad. Sacar la lamina del frasco con alcohol y secarla con una gasa. Flamear el asa al rojo vivo, tomar el tubo con el cultivo de la forma adecuada, es decir, quitar el tapón con los dedos meñique y anular, flamear con la boca del tubo. Tomar el inoculo (medio liquido) con el asa de cultivo, una 8 gotas y colocarla en el centro de portaobjetos. Si la muestra está en un medio solido, tomar primero unas 8 gotas de lugol y ponerlas en el portaobjeto Flamear y tapar el tubo con el cultivo, llevar al rojo el asa. Colocar la laminilla sobre la suspensión bacteriana sin formar burbujas y presionar suavemente. Examinar la preparación con objetivo seco débil primero y después con seco fuerte.

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Preparación teñida.- Técnica de Gram Frotis En un portaobjeto colocar una gota de agua o caldo estéril y a partir de una placa de cultivo se toma una colonia con el asa y posteriormente se realiza una disolución de las bacterias extraídas del cultivo con el agua. La preparación se seca a temperatura ambiente Fijación Se pasa por la llama del mechero (3 veces) teniendo la precaución de no exponerla demasiado al fuego directo, ya que esto perjudica la evaluación de la forma y tinción de las bacterias. Una vez seca la lámina se tiñe. Tinción 1. Disponga la preparación bacteriana sobre la cubeta diseñada para realizar la tinción 2.-Cubra la lámina con Cristal violeta durante 1 minuto. 3.-Lave el exceso de colorante con agua 4.-Cubra con Lugol durante 1 minuto. 5.-Lave el exceso de lugol con agua. 6.-Decolore con solución alcohol-acetona durante 20 segundos. 7.-Lave con abundante agua para eliminar el exceso de disolvente. 8.-Cubra la lámina con Safranina durante 30 segundos. 9.-Secar la preparación entre 2 laminas de papel filtro y observar al microscopio con aceite de inmersión. NOTA: Luego de cada lavado elimine el exceso de agua para evitar la dilución del colorante o solución empleada. Disponga cada solución durante el tiempo estrictamente estipulado.

LOS HONGOS FILAMENTOSOS MARCO TEÓRICO El término hongo viene del latín fungus, que significa hongos. Están ampliamente distribuidos en la naturaleza, abundante en el suelo, vegetación, en la materia existente en el agua y en general en cualquier medio húmedo. Son en su mayoría beneficiosos para el hombre, se encarga de destruir la materia orgánica compleja degradándola a formas químicas simples que pasan 59

a formas químicas simples que pasan a formar parte del suelo, donde finalmente son absorbidas por otras generaciones de plantas, encargándose en gran medida de la fertilidad de la tierra. Gracias a los hongos se pueden obtener ciertos alimentos como los quesos yogures, pan bebidas alcohólicas (cerveza, vino) producción de antibióticos, vitaminas, etc. Desde el punto de vista clínico, el grupo de hongos más importante para el hombre va a corresponder a aquellos que crecen como parásitos en este produciendo infecciones, fundamentalmente de tipo superficial o cutáneo, llamados micosis superficiales y más excepcionalmente de formas sistemáticas de micosis profundas. La ciencia que estudia los hongos se llama micología

MATERIALES MEDIOS DE CULTIVO/CEPAS Algodón Hongos en algunos alimentos (arroz, zanahoria, banano, pan) Fósforos Gasa Placas portaobjetos Placas cubreobjetos Asa de inoculación Hilo de inoculación Lapiz graso

REACTIVOS Y EQUIPOS COLORANTES Alcohol Mechero

Algodón de Azul Microscopio de Lacto fenol Lugol Kit de Gram Aceite de cedro

Papel filtro Elaborado por: QF. Mariana Rendón M. MSc

PROCEDIMIENTOS TECNICA DE LA LÁMINA Y LA LAMINILLA  Preparar la suspensión de la muestra microbiana en una laminilla, usar lugol o algodón de azul de lactofenol como medio de suspensión.  Tomar adecuadamente la muestra, con las dos asas, desde la superficie del alimento para observar el hongo completo.  Agregar la laminilla.  Observar con las lentes de 10X o 40X TÉCNICA DE GRAM  Preparar el frotis a partir de cepas 60

 Fijar  Tinción  Observar con 100X, agregando una gota de aceite de cedro

RESULTADOS

CONCLUSIONES

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PRACTICA No 7 TEMA: SIEMBRA Y METODOS DE SIEMBRA COMPETENCIAS  Conocer y realiza diferentes formas de siembra,  Realizar la técnica de agotamiento por estrías para la obtención de cultivos puros  Utilizar diferentes medios de cultivo para el aislamiento de microorganismos  Practicar la transferencia de inóculos MARCO TEÓRICO: Introducción La identificación bacteriana se realiza tras el estudio de las características de tinción, morfológicas y bioquímicas de los microorganismos. Con este fin, existen en el mercado una enorme variedad de medios de cultivos diseñados no solo para permitir el crecimiento y multiplicación de los microorganismos, sino también para inhibir los de otros (medios selectivos) o resaltar determinadas características metabólicas (medios diferenciales) que nos permitan establecer los fundamentos de algunas pruebas diferenciales. Los ambientes microbianos solo en raras ocasiones albergan una cepa única. Para identificar los microorganismos de un cierto hábitat, es preciso aislar cada especie en un cultivo puro, para lo cual es necesario realizar aislamiento en medios especiales, selectivos y diferenciales, y poder obtener un solo tipo de microorganismo identificándolo mediante pruebas bioquímicas o serológicas. El primer paso para el diagnostico de un microorganismo es sembrar las muestra en un medio de cultivo adecuado para su desarrollo y utilizar una técnica de siembra para poder observar sus características macroscópicas y microscópicas como son las morfológicas y tintoriales SIEMBRA Concepto: Depositar un inoculo o semilla en n medio de cultivo adecuado para que se desarrolle. Se necesita darle las condiciones físicas adecuadas como son temperatura, tiempo, oxigeno, pH, dependiendo de lo que requiere el microorganismos que se desea cultivar METODOS DE SIEMBRA Se pueden distinguir dos tipos de siembra:  

En superficie: Corresponde a la modalidad más empleada. En profundidad: Se utiliza en las pruebas de identificación bacteriana

Las siembras se pueden realizar directamente desde una muestra clínica que contenga un microorganismo, desde otro cultivo bacteriano o desde un inóculo. Inóculo: suspensión de 62 bacterias en un volumen pequeño de medio líquido que generalmente es un caldo nutritivo básico o agua

Forma correcta de sembrar en tubo

Estría de crecimiento

Asa

Siembra en superficie Siembra en profundidad (picadura) Las siembras se pueden realizar con diferentes elementos, entre ellos: a) Siembra con asa: Se puede realizar:  Tomando un inóculo a partir de una suspensión de bacterias o para sembrar muestras biológicas líquidas (orinas, líquido cefalorraquídeo, etc.)  Para formar una estría de crecimiento a partir de un inóculo realizado con hisopo.  Para realizar traspaso de bacterias de un medio a otro, tomando directamente una porción de una colonia. 63

b) Siembra con hisopo: El hisopo está compuesto de algodón hidrófilo, lo que permite empapar este material con el fluido en el que se desea estudiar una bacteria. Generalmente para que las bacterias permanezcan viables se utilizan medios de cultivo denominados "de transporte", en el que se sumerge el hisopo. La siembra se realiza depositando el hisopo sobre una sección de la placa y posteriormente se realiza la estría de crecimiento con asa. c) Siembra con pipeta Pasteur: Se realiza para sembrar bacterias en suspensión.

AISLAMIENTO Para llevar a cabo el estudio de estos microorganismos y de sus propiedades, es necesario separar unos de otros y trabajar con especies aisladas, obteniendo cultivos axénicos o puros. Un cultivo axénico o puro es aquel que contiene un sólo tipo de microorganismo y que procede generalmente de una sola célula; el crecimiento de ésta origina, en medio sólido, una masa de células fácilmente visible que recibe el nombre de colonia. Para obtener cultivos axénicos o puros a partir de una población microbiana mixta, se utilizan las denominadas técnicas de aislamiento, que fueron desarrolladas durante el siglo XIX. En un principio, Lister utilizó diluciones seriadas en medio líquido con esta finalidad, pero la presencia de contaminación, es decir, de microorganismos no deseados dificultó el aislamiento. 64

La escuela de Robert Koch introdujo los medios sólidos, complementados con Agar, y las placas de Petri en Bacteriología, permitiendo así la separación física de las colonias sobre la superficie del medio de cultivo o en el interior del mismo. El aspecto de las colonias sirve para diferenciar distintas especies microbianas. También es posible tratar el medio para eliminar otro tipo de bacterias diferentes de las que se desean aislar, antes de sembrar en las placas. El aislamiento de una especie microbiana a partir de mezclas microbianas, puede a menudo ser simplificado aprovechando una característica particular de las necesidades nutricionales de los organismos, requerimientos de temperatura, productos metabólicos, etc. Regulando la temperatura y el suministro de oxígeno, hemos establecido unas condiciones selectivas que determinan el desarrollo de la flora. Los microorganismos que no se reúnen las condiciones impuestas, no crecen. Añadiendo ciertas sustancias químicas a un medio base, o imponiendo algunas otras condiciones especiales durante el crecimiento del cultivo es posible: 1. Reprimir el crecimiento de microorganismos que interfieren, permitiendo al mismo tiempo el del cultivo deseado-selección por inhibición ó 2. Favorecer el crecimiento del microorganismo buscado, por lo que se desarrolla más que sus competidores-selección por enriquecimiento. En ocasiones el aislamiento a partir de un cultivo mixto puede ser favorecido sencillamente facilitando el reconocimiento del cultivo buscado. Este método, que no requiere el empleo de un inhibidor especial o sustancias de enriquecimiento, se denomina cultivo en medios diferenciales. Una gran cantidad de procedimientos de aislamiento se basan en combinaciones de varios de estos principios. Desde luego, cuanta mayor información se posee de las propiedades de un microorganismo determinado, existen más posibilidades de conseguir un medio que impida de una manera más efectiva el crecimiento de los microorganismos competidores. Para realizar la identificación de un microorganismo será necesario partir de una cepa pura, para lo cual es necesario realizar aislamiento en medios especiales, selectivos y diferenciales para poder obtener un solo tipo de microorganismo y de esta forma realizar las pruebas de identificación, sean estas bioquímicas o serológicas. El primer pasa para el diagnostico de un microorganismo es sembrar las muestra en un medio de cultivo adecuado para su desarrollo y utilizar una técnica de siembra para poder observar sus características macroscópicas y microscópicas como son las morfológicas y tintoriales TÉCNICAS GENERALES DE AISLAMIENTO Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS 1. Se aconseja que la siembra de todas las muestras a los medios de cultivos se realice bajo una cabina de flujo de aire laminar o en un gabinete de seguridad biológica, con los protectores de plástico o vidrio 65

2. 3.

4. 5. 6. 7. 8.

para el cuello y la cara, las muestras procesadas se las debe considerar como potencialmente infecciosas y manipularlos adecuadamente. Se debe contar con todos los medios de cultivos necesarios para realizar las siembras. Las asas deben esterilizarse antes de utilizarlas y enfriarse sobre el agar o el material de vidrio (en zonas estériles) antes de tomar la muestra de microorganismos, con objeto de no destruirlos por calor. Después de utilizarlas, las asas se vuelven a esterilizar en todo su perímetro Las bocas de los tubos y matraces de vidrio se flamean ligeramente una vez destapadas, antes y después de la inoculación. Durante la inoculación, los tapones se mantienen en la mano sujetándolos por la parte que no entra en contacto con tubos y matraces. Los tubos abiertos deben mantenerse en posición inclinada hacia el frente para que el riesgo de contaminación sea mínimo. Las tapas de las placas Petri no deben colocarse nunca sobre la mesa de trabajo boca arriba trabajando con bacterias.

Resiembra periódica a medios nuevos Los cultivos de bacterias se pueden mantener en tubos en los que han sido cultivados mediante pasos periódicos a medios nuevos. Cuando se va a utilizar este procedimiento para mantener una colección de cepas controles o para un estudio posterior, se deben considerar 3 parámetros antes de realizar la resiembra: 1. El medio de cultivo 2. Tiempo de incubación 3. Temperatura de incubación

MATERIALES

MEDIOS DE REACTIVOS CULTIVO/CEPAS

EQUIPOS

Algodón

Cepas varias

Mechero

Fósforos Asa de inoculación

Agar Mac Conkey Agar Nutritivo

Hilo de inoculación

Caldo Nutritivo

Alcohol

Incubadora Refrigeradora

Lápiz graso Hisopos estériles Gradilla Elaborado: QF..Mariana Rendón M. MSc.

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PROCEDIMIENTO 1.- Prender el mechero bunsen para crear un área estéril y aplicar la técnica aséptica 2.- Coloca las placas en posición invertida sobre la mesa de trabajo para que se facilite manipularlas mejor. Técnica de siembra por estrías en placa 1.- Desinfectar el área de trabajo, ordenar el material de trabajo 2.- Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la caja de petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se enfríe el asa y toma una colonia de la placa. Tape la caja de petri. 3.- Ahora, toma una placa con agar estéril (donde vayas a sembrar) y con cuidado de no romper el agar, inocula la muestra en un extremo de la placa y con el asa en posición ligeramente horizontal realiza las estrías (muy juntas), oscilando el asa de siembra sobre la superficie de una porción pequeña del agar; mediante un balanceo sucesivo y rápido de la muñeca. 4.- Esteriliza el asa de nuevo y déjala enfriar. Rozar una vez con el asa de siembra las estrías sembradas la primera vez y realiza sobre una porción virgen del agar una segunda tanda de estrías que no toque la primera. 5.- Repetir exactamente la operación descrita en el punto anterior, pero rozando al empezar la segunda tanda de estrías, hasta completar 3 o 4. No hagas más presión sobre el agar que la debida al propio peso del asa y su mango. Es importante emplear un asa de siembra en buen estado, pues una rota o deteriorada rasgará el agar. 6.- Lleva a la incubadora y deja en posición invertida 24 horas al término de las cuales se puede observar ya el desarrollo de colonias aisladas.

Carga la muestra Tocar estría A 1ero estría A flamear estria B flamear

Tocar estria B estria C 24h 37 oC

Resultados

Sembrado por estrías en tubo inclinado

67

1.- Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la caja de petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se enfríe el asa y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera. 2.- Ahora toma el tubo de agar en pico de flauta (agar inclinado) y cerca del mechero retira el tapón de algodón ayudándote con los dedos meñique y anular y flamea la boca del tubo. 3.- Introduce el asa con la muestra (cuidando de no tocar las paredes del tubo) y empezando en el área del fondo del agar realiza una estría hacia fuera hasta terminar en la punta del agar. Retira el asa. 4.- Flamea la boca del tubo de nuevo y coloca el tapón de algodón bien firme. Esteriliza el asa y déjala enfriar. 5.- Lleva a incubar y observa el desarrollo a las 24 o 48 horas después de la siembra. Inoculación en Agar inclinado

INCUBAR 24 horas 37C Resultados

Sembrado por agitación en caldo 1.- Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la caja de petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se enfríe el asa y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera. 2.- Ahora toma el tubo con el caldo estéril y cerca del mechero retira el tapón de algodón ayudándote con los dedos meñique y anular, flamea la boca del tubo. 3.- Introduce el asa con la muestra (cuidando de no tocar las paredes del tubo) y por agitación dentro del caldo, siembra el inóculo. Retira el asa y flamea de 68

nuevo la boca del tubo y coloca el tapón de algodón firmemente. Esteriliza el asa y déjala enfriar. 4.- Lleva a incubar y observa el desarrollo a las 24 o 48 horas después de la siembra.

INCUBAR 24 horas 37C Resultados

Sembrado en picadura en tubo vertical 1.- Esteriliza el filamento de la aguja de inoculación y toma la parte de la caja de petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se enfríe la aguja de inoculación y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera. 2.- Ahora toma el tubo con el medio de cultivo y cerca del mechero retira el tapón de algodón ayudándote con los dedos meñique y anular, flamea la boca del tubo. 3.- Introduce la aguja con el inóculo y sin tocar las paredes del tubo, inocula en el centro del medio de cultivo sin llegar hasta el fondo del tubo. Retira la aguja de inoculación en la misma dirección de la siembra. Retira el asa y flamea de nuevo la boca del tubo y coloca el tapón de algodón firmemente. Esteriliza el asa y déjala enfriar.

4.- Lleva a incubar y observa las características del desarrollo a las 24 o 48 horas después de la siembra.

69

. Siembra por dilución en masa o por inclusión en agar

INCUBAR 24horas 37c Resultados

CARACTERISTICAS MACROSCOPICAS

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Descripción del tipo de colonias obtenidas Observar las colonias obtenidas y describirlas teniendo en cuenta las siguientes características: 

Forma: Puntiforme, Circular, Rizoide, Irregular, Filamentosa. Tamaño: Grande (más de 3Mm.), Mediana (2-3Mm.), Pequeña (1-2



Mm.)    

Color: Reportar el color final después de la incubación Borde: Entero, Ondulado, Lobulado, Filamentoso, Ondeado Elevación: Plano, Elevado, Convexo, Pulvinado, Umbonado Superficie: Suave, Brillante, Rugosa, Plegada, Seca, Polvorienta

Procedimiento Inhibidores

No

2

Aislamiento

en

medios

Selectivos

e

Siembre por agotamiento por estrías múltiples combinada: Agar Manitol sal Agar Mac Conkey Luego de realizar estas siembras (placas y suspensiones) incube en estufa a 37º C durante 24 horas, tras las cuales debe evaluar el crecimiento bacteriano.

Procedimiento Nº 3: Siembra de muestras biológicas 1. Realice una toma de muestra de secreción nasal de alguno de los integrantes del grupo. 2. Siembre la muestra en las mitades restantes de las placas de agar sangre y Mac Conkey e incube durante 24 horas a 37º C. RESULTADOS 1. Observe y registre las características más importantes de los medios de cultivo que se presentarán. 2. Observe las características macroscópicas de las colonias bacterianas presentes en los cultivos que se le entregarán. (Color, Forma, Hemólisis, tamaño) 3. No olvide registrar la placa, tubo y portaobjeto con el número de la muestra trabajada y con una señal que identifique a su grupo.

CONCLUSIONES 71

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PRACTICA NO 8 TEMA: DETERMINACIÓN DEL NÚMERO DE MICROORGANISMOS EN UNA MUESTRA: CONTAJE DE AEROBIOS TOTALES COMPETENCIAS:  Realizar diluciones cuantitativas  Siembrar en cajas de petri por vaciado  Cuantificar los aerobios totales presentes en una muestra MARCO TEÓRICO: Prácticamente todas las fases de microbiología requieren métodos para medir el número de microorganismos. El crecimiento microbiano puede definirse como el incremento en el número de células, o sea al crecimiento de poblaciones. Este viene dado como consecuencia del crecimiento de cada célula individual y su división celular. El crecimiento de un microorganismo depende de varios factores como se observa en la siguiente tabla El microorganismo En condiciones óptimas la bacteria Escherichia Coli tiene un ciclo de vida de 15-20 minutos, mientras que el en sí Mycobacterium Tuberculosis lo tiene de 18 horas. Condiciones de La temperatura de incubación, la concentración de CO2 incubación en la atmósfera de cultivo, la agitación, etc., son factores importantes. La procedencia y características del inóculo

La curva de crecimiento variará dependiendo de que se parta de un cultivo estacionario o de uno en crecimiento exponencial, que se pase de un medio de cultivo crecido en MM + Glc a MM + Gal o MR a MM + Glc.

Cuadro No Factores de que depende el crecimiento de los microorganismos Elaborado por: QF. Mariana Rendón M. MSc.

Diluciones Con algunos de estos métodos mencionados, a medida de la turbidez por ejemplo: es necesario en algunos puntos diluir la muestra. Es conveniente además hacer algunas diluciones, generalmente seriadas en base de 10. Así para tener una dilución 10 veces se mezclará 1ml con 9 ml de diluyente (medio de cultivo o agua destilada estéril). Si hacemos lo mismo con esta dilución obtendríamos una dilución 100 veces menor. Si lo hacemos con esta última conseguiremos una dilución 1000 veces menor y así sucesivamente. De esta forma obtendremos valores más exactos y más reales. Método cuantitativo de siembra en placa: contaje La siembra en placa para aislar bacterias que permite ver que cada célula bacteriana viable daba origen a cada colonia, fácilmente visible, de células hijas. Debido a que una bacteria da origen a una colonia, se puede utilizar la 73

siembra en placa para determinar el número de bacterias que hay en una muestra. Para realizar esto se diluye la muestra y se siembra en placa y después de la incubación se cuenta el número de colonias que se han desarrollado. Luego se determina el número original de colonias multiplicando el número de colonias desarrolladas por el grado de dilución (factor de dilución) de la placa en que se está haciendo el recuento, para diluir una muestra cuantitativamente, una porción de 1 g o 1 ml, se suele ir diluyendo en una serie de tubos que tienen 9 ml de agua o solución tampón estéril. MATERIALES Algodón Fósforos Pipetas

MEDIOS DE CULTIVO/CEPAS

REACTIVOS , MUESTRAS Agar Nutritivo o Plate Alcohol Count Agua destilada estéril Muestra de leche

Pipeteador Pipetas automaticas 1000 landas puntas para pipetas para 1000 landas 100 a 1000 landas Lápiz graso

EQUIPOS Mechero Incubadora Refrigeradora Reverbero

Tubos de 150x20mm Cajas de Petri Gradilla Elaborado: QF. Mariana Rendón M. MSc.

PROCEDIMIENTO 1. Desinfectar el mesón con un algodón impregnado en alcohol 2. Prender el mechero de Bunsen para tener un área aséptica 3. Rotular 6 tubos de ensayo de 150x20 con las diluciones correspondiente (1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000, 1/100000, 1/1000000). 4. Agregar 9 ml de agua destilada o agua de peptona estéril a cada tubo 5. Se preparan las diluciones señaladas agregando 1 ml de la muestra del primer tubo. 6. Homogenizamos la primera dilución absorbiendo con la pipeta y expulsando a presión alejando el tubo. 7. Se realiza la siguiente dilución tomando 1 ml de la primera (1/10) y se homogeniza. 8. Las siguientes diluciones se preparan tomando 1 ml de la anterior dilución es decir 1ml de la 1/10 para formar la 1/100, y así sucesivamente 9. Se realiza de manera sucesiva de tal forma que se utilice una sola pipeta. 74

10. Para la siembra se debe tomar 1 ml de cada dilución, comenzando de la mas diluida a la más concentrada, agregándolos en la caja que ha sido rotulada con la dilución correspondiente con anticipación 11. Se agrega a cada caja Petri aproximadamente 20 ml de Agar Nutritivo o Plate Count, que esté a temperatura aproximada de 45 oC; esto se logra cuando podemos sostener la fiola con las manos sin quemarnos. 12. Se homogeniza con giros sobre el mesón sin derramar el contenido y dejamos solidificar. Cada caja debe tener los datos correspondientes. 13. Se incuba por un periodo de 24 a 48 horas a 37oC.

Resultados: recuento en placa Las colonias que se desarrollan en las placas de Agar pueden contarse de manera eficaz usando un artificio tal como el contador de colonias Quebec, que ofrece una fuente de luz indirecta transmitida y una lente amplificadora. Ponga las placas invertidas sobre el contador. Marque cada colonia sobre el vidrio utilizando una pluma o un lápiz, para volver a contarlas. Cálculos del número de colonias en la placa El número de bacterias por ml de muestra original (el recuento de placas) se obtiene multiplicando el número de bacterias que hay sobre la placa, por el factor de dilución. Por ejemplo si usted ha contado 150 colonias en la placa de dilución 1/1000. Se puede calcular así: 150 X 1000 = 150.000 U.F.C. (unidades formadoras de colonias por ml o por g de muestra). 75

Generalmente, se aconseja preparar las placas por duplicados para cada dilución. Entonces se halla la medida aproximada del número medio. Al obtener recuentos de 148 y 154 en la placa 1/1000. Se promedia así: 148+154=303, se divide 302/2=151 Se multiplica por el factor de dilución 151X1000= 151.000 U.F.C/ ml o g de muestra. NOTA: Solo se cuentan las cajas con las diluciones que tienen entre 30-300 colonias por considerarse representativas para el recuento bacteriana. RESULTADOS

CONCLUSIONES ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

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PRACTICA No 9 TEMA: PRUEBAS BIOQUIMICAS COMPETENCIAS  Conocer el fundamento de las diferentes pruebas bioquímicas  Siembrar en los diferentes medios para las pruebas bioquímicas  Aprender a interpretar algunas pruebas bioquímicas MARCO TEÓRICO: Se trata de un conjunto de reacciones basadas en el metabolismo de los microorganismos. En otros aspectos se analiza la acción de las bacterias sobre los hidratos de carbono, la presencia de enzima en los diferentes microorganismos y su acción sobre los distintos compuestos químicos presentes en los medios de cultivos. A partir del conocimiento del metabolismo, las pruebas bioquímicas nos permiten determinar el género y la especie de la bacteria en estudio. Casi todas las reacciones que tiene lugar en una ruta bioquímica están catalizadas por una enzima específica. Los catalizadores son sustancias que pueden acelerar una reacción química sin sufrir ellas mismas alteración, aumentando la frecuencia de las colisiones o disminuyendo la energía necesaria de activación. Las enzimas son catalizadores biológicos. Actúan siempre de forma específica, es decir, cada enzima afecta solamente a un sustrato específico, debido a la estructura específica de cada enzima. Esta identificación debe hacer a partir de un cultivo puro y fresco (18-24 horas). Hay que considerar, además, que las características metabólicas en los microorganismos pueden variar en función de distintos factores de manera que para realizar una caracterización confiable es necesario realizar las pruebas en condiciones estandarizadas (en cuanto al inóculo, los reactivos, las condiciones de incubación y el tiempo de lectura) y utilizar más de una prueba en cada caso. La elección de las pruebas bioquímicas se hará en base a la familia en estudio, lo cual se irá determinando en el curso del aislamiento.

MATERIALES Algodón Fósforos Lápiz graso Gradilla Tubos Cajas de Petri Pipetas

MEDIOS REACTIVOS Agua de Peptona Alcohol Agar Urea Kovacs Agar Citrato Agar hierro triple azúcar Agar Lisina Agar Mio

EQUIPOS Mechero Refrigeradora Incubadora

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Asa de Inoculación Hilo de Inoculación Elaborado por: QF. Mariana Rendón M. MSc.

PROCEDIMIENTO Vamos a estudiar diversas enzimas que pueden tener los distintos microorganismos, los que nos permitirán clasificarlos e identificarlos. 1. PRUEBA DEL CITRATO Únicamente las bacterias capaces de metabolizar citrato podrán multiplicarse en este medio, al utilizar los fosfatos presentes liberan iones amonio (básicos) que junto con la eliminación de citrato (ácido) generará que el medio se vuelva muy alcalino, lo que se demuestra con un cambio de color del indicador de pH de verde a azul. Fundamento: Esta prueba determina la capacidad que presenta el microorganismo problema para utilizar el citrato como única fuente de carbono. Este medio indica la capacidad de las bacterias de metabolizar el citrato. Contiene citrato como única fuente de carbono, fosfato de amonio como única fuente de fosfato y azul de bromotimol como como indicador de pH. Técnica: a. A partir de un cultivo puro y reciente del microorganismo problema se tomará una muestra con un hilo. b. Sembrar en picadura y estría en un tubo con citrato de Simmons. c. Incubar a 37oC durante 18-24 horas. Interpretación de los resultados: Prueba positiva. Citrato positivo (+): si aparece crecimiento en el slam y si el medio vira de verde a azul (debido a la producción de amoniaco que lo alcaliniza y cambia el color del indicador), el microorganismo es citrato positivo. Prueba negativa. Citrato negativo (-): no vira el indicador. No hay cambio del color del medio.

2. PRUEBA DEL INDOL

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El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptófano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptófano con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La producción de indol es una característica importante para la identificación de muchas especies de microorganismos. La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptófano y puede ser suministrado por una peptona adecuada La práctica va a consistir en observar si el microorganismo es capaz de producir indol cuando está en presencia de agua de peptona. El indol producido es detectado por indol de Kovacs que produce una coloración al reaccionar con él. Fundamento: Esta prueba se basa en que ciertos microorganismos poseen una enzima llamada triptofanasa que puede degradar el triptófano a indol. Técnica: a. A partir de un cultivo puro y reciente del microorganismo problema se tomará una muestra con asa de siembra. b. Sembrar en un tubo con agua de peptona. c. Incubar a 37oC durante 18-24 horas. Pasado el tiempo de incubación se sacan los tubos de la estufa y se les añade 1 ml de reactivo de Kovacs o de Erlich y se deja reposar. Prueba positiva. Indol positivo (+): si aparece un anillo rojo en la capa etérea, indica que la prueba es positiva, el microorganismo produce indol. Prueba negativa. Indol negativo (-): no hay cambio de color del medio.

3. PRUEBA DE SCREENING DE PRODUCCIÓN DE ÁCIDO Y GAS Se aplica para averiguar la capacidad degradativa de un microorganismo de un cierto hidrato de carbono. Se puede realizar sobre distintos hidratos de 79

carbono, esta prueba orienta para posteriormente realizar otras más selectivas, como la de rojo o metilo o Voges Proskauer. Fundamentos: Se basa en el viraje de color de un indicador de pH al producirse ácidos. La formación de gas se observa en una campana de campana de Durham Técnica: a. Rotular cada tubo con el nombre del azúcar correspondiente (lactosa, glucosa, maltosa, sucrosa, etc.) b. Agregar con una pipeta 0.5 ml de los diferentes azúcares en el tubo correspondiente. c. Tomar la cepa bacteriana con el asa de cultivo puro del microorganismo problema. d. Incubar a 37oC durante 24 horas. Interpretación de los resultados: La formación de ácido se verá por el viraje de incoloro a fucsia. Si se formará gas, éste se verá en el interior de la campana de Durham.

La campana de Durham debe estar perfectamente llena de agua de peptona con indicador de Andrade en el momento de incubar la muestra pues una sola burbuja induciría a error. 4. PRUEBA DE HIERRO TRIPLE AZUCAR Esta prueba se recomienda para la identificación de patógenos entéricos Gram negativos. Se emplea para detectar la fermentación de lactosa, sacarosa y glucosa, con formación de ácido y gas, y también para detectar producción de ácido sulfhídrico. Procedimiento Realice una estría en la superficie y una punción en la profundidad del medio. Incube a 37°C. Observar a las 18-24 horas, ni menos ni más. Resultados 1. Profundidad ácido (amarillo): Glucosa fermentada. Superficie ácido (amarillo): Lactosa y/o sacarosa fermentada. 2. Profundidad ácido (amarillo): Glucosa fermentada. Superficie alcalino (rojo): Lactosa y/o sacarosa no fermentada. 3. Profundidad alcalino (rojo) Superficie alcalino (rojo): Ninguno de los tres glúcidos es fermentado 4. La aparición de burbujas en la profundidad del medio indica que la fermentación se ha efectuado con producción de gas. 5. Un ennegrecimiento en el medio indica la producción de ácido sulfhídrico. 80

A

B

C

D

A Glucosa, lactosa y/o sacarosa fermentada B Glucosa fermentada con producción de ácido sulfhídrico y gas C Glucosa fermentada con producción de ácido sulfhídrico D Ninguno de los tres azúcares es fermentad Se reporta como un quebrado a) A/A b) K/AG+ c) K/A+ o SH2 d) No cambio 5.- PRUEBA DE LA CATALASA Esta prueba permite diferenciar a los Staphilococcus y Micrococcus de los Streptococcus y Enterococcus. Fundamento La catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno (H 2O2) en agua y oxígeno (H2O2 → H2O + O2). Cuando se agrega una pequeña cantidad de microorganismos se produce la catalasa a una gota de H2O2, se produce la formación de burbujas de oxígeno que es el producto gaseoso de la actividad enzimática Técnica 1. Realizar una suspensión en una placa portaobjeto del microorganismos problema 2. Agregar 3 gotas de Agua oxigenada 3. La presencia de burbujas indica que la prueba es catalasa positiva, sino se presentan las burbujas la prueba es catalasa negativa

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Resultados Muestra No 1 Pruebas T.S.I Citrato Urea Indol Lactosa Glucosa Sucrosa Catalasa

Características del medio

Resultados

Elaborado: QF. Marianita Rendón M. MSc.

Pruebas T.S.I Citrato Urea Indol Lactosa

Muestra No 2 Características del medio

Resultados

Glucosa

Sucrosa Catalasa Elaborado: QF. Marianita Rendón M. MSc.

CONCLUSIONES _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ ______________________________________________________________

82

PRACTICA No 10 TEMA: ANTIBIOSIS O SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIOTICOS.ANTIBIOGRAMA COMPETENCIAS:  Conocer la importancia clínica y microbiológica de las pruebas de susceptibilidad.  Elaborar correctamente un antibiograma de acuerdo al método de difusión del disco.  Conocer los criterios que permiten la elección adecuada de los discos de antibióticos a probar en un antibiograma.  Interpretar y elaborar correctamente el reporte de un antibiograma . MARCO TEORICO El aislamiento e identificación de un agente infeccioso a partir de una muestra clínica proveniente de un paciente, no es suficiente para impartir una terapia antimicrobiana adecuada. Actualmente, numerosos microorganismos han desarrollado múltiples mecanismos que les permiten resistir a la acción de los más nuevos y potentes agentes antimicrobianos. Como no se puede predecir la susceptibilidad de las bacterias a los antimicrobianos, en la actualidad se dispone de varios métodos para determinar el patrón de susceptibilidad de una bacteria a los antibióticos. Entre los métodos más utilizados podemos mencionar: 1. Método de difusión del disco en agar (prueba de Kirby-Bauer). 2. Antibiograma ATB Rapid (bioMérieux). 3. Método de dilución en caldo o en agar (Concentración Inhibitoria Mínima [CIM]). 4. Método de la cinta o Epsilómetro EtestR (AB BIODISK). Otro aspecto importante que se debe tener en cuenta en la realización de las pruebas de susceptibilidad, es la elección correcta de los antibióticos a probar. A continuación se señalan algunos criterios que pueden ayudar a seleccionar adecuadamente dichos agentes: 1. Microorganismo aislado. 2. Mecanismo de acción del antibiótico. 3. Espectro de acción del antibiótico. 4. Biodisponibilidad del antibiótico en órganos y sistemas (localización de la infección). 5. Origen o fuente de la infección (hospitalaria o extrahospitalaria). 6. Estados fisiológicos del paciente (edad, embarazo, entre otros). 7. Estados patológicos subyacentes (inmunosupresión, tratamiento previo con antibióticos, insuficiencia renal o hepática, entre otros). El reporte de los resultados de una prueba de susceptibilidad bien realizada, es un instrumento que le permitirá al clínico elaborar un plan antibacteriano eficaz contra el patógeno, seleccionando la droga menos tóxica para el paciente, y 83

con las características farmacocinéticas más apropiadas según la naturaleza y gravedad de la infección Fuentes de error más comunes en la realización de un antibiograma 1. Falta del control de calidad de los medios de cultivo a utilizar, patrón de McFarland y los discos de antibióticos. 2. Trabajar con cepas bacterianas que no están puras. 3. Inadecuada estandarización de la concentración del inóculo. 4. Utilización de un número excesivo de discos de antibióticos por placa. 5. Utilización de medios de cultivo no aptos para las pruebas de susceptibilidad. 6. Lectura prematura o extemporánea de las pruebas de susceptibilidad. 7. Medición incorrecta de los halos de inhibición por una iluminación deficiente o regla inadecuada. 8. Incubación en atmósfera inadecuada. 9. Error en la transcripción de los resultados en la hoja de reporte. El antibiograma Se define como un método de estudio de susceptibilidad bacteriana. El método utilizado con mayor frecuencia para evaluar la sensibilidad de las bacterias a los agentes antimicrobianos es el denominado prueba de difusión del disco. Esta técnica fue estandarizada por Kirby y Bauer en 1966, de allí que dicho método también se le conozca con el nombre de “prueba de KirbyBauer”. Es un método sencillo y fácil de realizar en los laboratorios de rutina que sólo brinda información cualitativa o semicuantitativa sobre la sensibilidad de un microorganismo a un antibiótico determinado. Sin embargo, los resultados obtenidos son de gran valor clínico para iniciar, mantener o modificar una antibioticoterapia. Este método, que se realiza en placa petri y en agar Mueller-Hinton, para su realización necesita realizar una suspensión de la bacteria que se ha aislado e identificado previamente, en forma homogénea por el método de la escobilladura sobre toda la superficie del agar a modo de tapizar éste con el microorganismo. Una vez que se ha realizado esta siembra, se colocan sobre el agar discos pequeños empapados de sustancia antibiótica que difundirá en el agar. Posteriormente se incuba en condiciones adecuadas y por un tiempo determinado. (37ºC; 24 horas) "Halo de inhibición": Comprende la zona alrededor del disco en donde no se observa crecimiento de las bacterias. Para cada antibiótico se encuentra descrito un halo de inhibición mínimo que define la verdadera sensibilidad de una bacteria a un antibiótico ya que existe una relación entre la concentración del antibiótico y su capacidad de inhibir la cepa bacteriana. El halo de inhibición se evalúa por el diámetro en mm alrededor del disco. Por ejemplo: Tetraciclina (30g ) Sensible:  19 mm y Resistente  14 mm.

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Halo de inhibición

Medición del diámetro del halo MATERIALES

MEDIOS DE CULTIVO/CEPAS

REACTIVOS

EQUIPOS

Algodón

Agar Mueller Hinton Cepas varias

Alcohol

Mechero

Fósforos Asa de inoculación

Caldo soya tripticasa

Pinzas

Solución salina Incubadora estéril Patrón 0.5 del Refrigeradora estándar de McFarland Discos de Antibiótico

Lápiz graso Hisopos estériles Tablas de los criterios estándares Regla milimetrada Elaborado por: QF. Mariana Rendón M. MSc.

PROCEDIMIENTO 1. Cepa bacteriana a estudiar: Debe provenir de un cultivo fresco, de un cultivo en agar, de manera que podamos comprobar que sea una cepa pura. 2. Inóculo: Se transferirán una o dos colonias del cultivo a un tubo que contenga solución fisiológica estéril. En el caso de bacterias exigentes (Ej: especies de Haemophilus, especies de Streptococcus, etc.), las colonias se transferirán a un tubo que contenga caldo Mueller Hinton. En cualquiera de los casos, el crecimiento bacteriano se ajustará a la turbidez del patrón 0.5 del estándar de McFarland. 3. Siembra: a) Se introducirá un hisopo de algodón estéril dentro del tubo que contiene el inóculo estandarizado en el paso anterior. El exceso de líquido se eliminará haciendo rotar suavemente el hisopo contra las paredes del tubo.

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b) Con el hisopo debidamente humedecido, se inoculará en tres o cuatro direcciones toda la superficie de una placa con agar Mueller Hinton, girando sucesivamente dicha placa en ángulos de 90o. Nota: El agar Mueller Hinton se suplementará con 5% de sangre de carnero en los casos que se esté estudiando la sensibilidad en especies de Streptococcus o Corynebacterium. En cepas de Neisseria y Haemophilus se tendrán en cuenta las recomendaciones del Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI, 2007). Nunca utilice agar sangre, agar chocolate, agar tripticasa soya, agar nutriente, agar Luria Bertani, BHI entre otros, para la realización de antibiogramas convencionales. c) Se deja secar el inóculo en la incubadora a 37oC durante 5 minutos d) Se colocarán con una pinza estéril hasta un máximo de 6 discos de antibióticos en forma equidistantes, presionándolos suavemente contra la superficie de agar. e) Se colocarán las placas a 37oC, en atmósfera aeróbica por 24 horas 4. Lectura: Se realizará después de 18-24 horas de incubación. Con una regla milimetrada, se medirá la zona clara alrededor del disco de antibiótico, el cual se corresponde con la inhibición del crecimiento bacteriano. Estos datos se compararán con los diámetros de zona establecidos para cada antibiótico en las tablas de interpretación internacional.(6) La interpretación de los halos de inhibición nos permitirá expresar el resultado como sensible, sensibilidad intermedia o resistente. Estas categorías indican lo siguiente: • Sensible (S): la infección debida al microorganismo aislado puede ser tratada apropiadamente con el antibiótico a la dosis recomendada, de acuerdo a la gravedad de la infección. Sin embargo, para la prescripción definitiva del medicamento, el médico tratante tendrá en cuenta algunos factores tales como biodisponibilidad del antibiótico en el tejido o sistema afectado, presentación del medicamento, edad del paciente, condiciones patológicas subyacentes o fisiológicas, entre otras. • Intermedia (I): indica que el antibiótico tiene aplicabilidad clínica en sitios corporales donde el antibiótico alcance concentraciones terapéuticas adecuadas, como es el caso de β-lactámicos y quinolonas en el tracto urinario. En otros casos, puede utilizarse el medicamento con seguridad en dosis elevadas que no alcancen los niveles de toxicidad pero que garanticen actividad terapéutica. Sin embargo, es recomendable evitar el uso de la categoría “intermedia” cuando sea posible. • Resistente (R): la bacteria aislada no es inhibida por el antibiótico a las concentraciones terapéuticas ideales o la bacteria ha generado mecanismos de resistencia que evaden la actividad del antibiótico, por lo tanto, la eficacia clínica de éste no es confiable. Es recomendable que ante el aislamiento de un microorganismo multirresistente clínicamente significativo se ensayen otras pruebas de susceptibilidad adicionales (CIM), tal es el caso de cepas de Staphylococcus resistentes a la vancomicina.

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Utilice la siguiente tabla para registrar los resultados obtenidos en el antibiograma:

1. Según los resultados concluya la sensibilidad y resistencia de la bacteria que estudió de acuerdo a la información que proporciona la tabla adjunta. 5. El reporte de los resultados del antibiograma debe ser realizado en forma clara y precisa y enviados en forma inmediata al médico tratante.

Conclusiones:

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1. Según los resultados concluya la sensibilidad y resistencia de la bacteria que estudió de acuerdo a la información que proporciona la tabla adjunta. 2. Luego de evaluado el antibiograma complete el siguiente cuadro: Microorganismo aislado:_______________________________________ Disco de antibiótico

Diámetro en Milímetros

Interpretación

Elaborado por: QF. Mariana Rendón M. MSc.

Autoevaluación 1. De acuerdo a los datos suministrados por el profesor y los registrados en la tabla anterior, elabore el reporte del antibiograma: 2. ¿Cuál es la finalidad de las pruebas de susceptibilidad? 3. ¿Qué significa sensibilidad y resistencia cuando se interpreta un antibiograma? 4. ¿En qué casos, las pruebas de susceptibilidad requerirán de medios de cultivos distintos al de Mueller Hinton?

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PRACTICA No 11 TEMA: Bacterias Gram positivas.- Identificación de Staphilococcus patógenos COMPETENCIAS:  Diferenciar el tipo de cocácea Gram positiva correspondiente mediante la prueba de catalasa.  Identificar los Staphilococcus patógenos mediante la prueba de la coagulasa MARCO TEORICO De acuerdo al Manual de Bergey, las cocaceas positivas de importancia clínica para los seres humanos comprenden los géneros Streptococcus y Staphilococcus. Su morfología es muy parecida, pero existen pruebas para diferenciar los dos géneros y cada una de sus especies Genero Staphylococcus Dentro de este grupo destacan algunas especies de importancia clínica como son:  Staphylococcus aureus  Staphylococcus epidermidis  Staphylococcus sapropyticus  Staphylococcus hominis En general, este género se caracteriza por desarrollar colonias relativamente grandes, redondas, lisas y brillantes. Al microscopio y mediante la tinción de Gram, los Staphylococcus se ven como cocáceas Gram positivas, redondas, de un mismo tamaño, aisladas, o agrupadas en racimos o en cadenas cortas. Poseen una pigmentación blanca, amarilla o dorada según la especie. Al cultivar estas bacterias en agar sangre (incubada 18-24 h a 37oC) aparecen como colonias redondas, blancas o amarillas, con o sin hemólisis por la presencia de enzimas especiales para este fin. Tienen la característica de crecer en medios con elevada concentración de sal o cloruro de sodio, lo que les brinda una característica diferencial importante. El St. aureus es un microorganismo patógeno capaz de producir una gran variedad de síndromes clínicos. Poseen enzimas que hidrolizan un amplio espectro de sustratos y producen diversas toxinas: Hemolisinas, exfoliativas y enterotoxinas. La presencia de cepas toxigénicas en aguas envasadas y de recreo puede ser causa de infecciones. Otras características que permiten su identificación son la producción de Catalasa, coagulasa y susceptibilidad a la Novobiocina.

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Pruebas de identificacion

Catalasa Es una característica de todas las especies de Staphylococcus. La catalasa es una enzima que desarrollan como mecanismo de defensa que les permite neutralizar los productos tóxicos derivados del metabolismo del oxígeno. Los Streptococcus no poseen catalasa, por lo que esta prueba es muy importante a la hora de diferenciar ambos grupos. Coagulasa Esta prueba es útil para identificar una especie de Staphylococcus en especial, el Staphylococcus aureus. La síntesis de esta enzima permite la coagulación del plasma y una prueba positiva identifica con certeza a la especie mencionada.

Susceptibilidad a la noboviocina Esta prueba diferencia el Staphylococcus saprophyticus de otras especies coagulasa negativo. Se pone en contacto las bacterias con el antibiótico, lo que permite evaluar si hay o no desarrollo bacteriano. La prueba positiva indica que existe resistencia a la novobiocina, porque aún cuando el antibiótico está presente, existe crecimiento. PRUEBA Hemólisis Catalasa Coagulasa Novobiocina MATERIALES Algodón Fósforos

S. aureus + + + -

S.epidermidis S.saprophyticus S.hominis -/+ -/+ + + + + -

MEDIOS DE REACTIVOS CULTIVO/CEPAS Cepa Plasma Staphylococcus Agar Mueller Hinton Agua Oxigenada al 3%

Asa de inoculación Pinzas

Discos de Novobiocina

Lápiz graso

Kit de Gram

EQUIPOS Mechero Incubadora Refrigeradora

Discos de Bacitracina

Placas portaobjeto Gasa Elaborado por: QF. Mariana Rendón M. MSc.

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PROTOCOLO DE PROCESAMIENTO 1. Diferenciación de Cocaceas Gram Positivas Frotis Técnica de Gram Seguir el procedimiento de la Práctica de Tinción de Gram

COCACEAS GRAM POSITIVAS 2. Diferenciación de staphylococcus y streptococcus

Prueba de la catalasa 1. 2. 3. 4. 5.

Tome una colonia de la placa de cultivo con un asa. Peróxido de hidrógeno al 3% Si se producen burbujas la reacción es positiva. Prueba positiva indica que es un Staphylococcus Prueba negativa es un Streptococcus

Prueba de catalasa 3. Identificación de staphilococcus patógeno Prueba de la coagulasa 1. Tome una colonia de la placa de cultivo con un asa. 2. Sumerja el asa en un tubo con aproximadamente 1 ml de plasma. 3. Incube a 37º C en estufa de cultivo y observe periódicamente hasta 4 horas de incubación. 4. La formación de un coágulo en el fondo del tubo indica una prueba coagulasa positiva. 91

5. Si el plasma sigue liquido indica una prueba coagulasa negativa

PRUEBA DE COAGULASA

4. Diferenciación de staphilococcus coagulasa negativos Prueba de la Novobiocina (30 g) 1. 2. 3. 4.

Realice una siembra de la colonia en estudio en un agar sangre. En medio de la siembra coloque un disco de novobiocina. Incube por 24 horas aproximadamente a 37º C. Transcurrido el tiempo de incubación observe si existe un halo alrededor del disco para ver si hay o no crecimiento bacteriano. 5. Si no existe crecimiento de las bacterias alrededor del disco, mida con una regla el diámetro del halo o circulo que se observa alrededor de la novobiocina. 6. La prueba es negativa cuando existe crecimiento alrededor del disco y se dice que es resistente. 7. La prueba es positiva cuando se observa un halo de inhibición alrededor del disco de más de 21 mm y se dice que es sensible.

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CONCLUSIONES ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

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PRACTICA No 12 TEMA: IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS COMPETENCIAS  Realizar reacciones bioquímicas relacionadas con la fisiología bacteriana utilizadas para la identificación de enterobacterias  Saber interpretar las pruebas bioquímicas y relacionarlas con las tablas estándares de identificación MARCO TEORICO Las enterobacterias son bacilos Gram negativos, que en general no adoptan agrupaciones características, no forman esporas y la mayoría son móviles debido a que poseen flagelos. Se han desarrollado una serie de medios para cultivarlas, aislarlas e identificarlas de acuerdo a sus propiedades bioquímicas. Todas las enterobacterias tienen la propiedad de fermentar la glucosa y de no poseer actividad de la citocromo oxidasa. Algunas enterobacterias de importancia clínica son:     

Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Proteus mirabilis Shigella sonnei Salmonella typhi

La orientación básica hacia el estudio de las enterobacterias es la identificación de bacilos Gram negativos a partir de la tinción de Gram y de sus cultivos en agar Mac Conkey (selectivo para este grupo de bacterias). Una vez realizadas estas observaciones se realiza una batería de 5 tubos que contienen los siguientes medios de cultivo: TSI (agar triple azúcar-fierro), LIA (Agar lisinafierro), MIO (agar movilidad, indol, ornitina), agar Citrato y agar Urea. TSI: Permite identificar básicamente la fermentación de azúcares tales como glucosa, lactosa y sacarosa por cambios de color en el medio. Además permite ver si producto de la fermentación se produce gas y ácido sulfhídrico o hidrógeno sulfurado. El medio es de color rojo por la presencia de un indicador de pH de este color. Producto de la fermentación se produce una acidez que hace que el color vire a amarillo. El gas se evidencia por la formación de burbujas y el ácido sulfhídrico por un color negro en el medio. LIA: Este medio evidencia si las bacterias descarboxilan la lisina o desaminan la lisina. También permite ver la formación de gas y de ácido sulfhídrico. La descarboxilación de la lisina se observa por un color violáceo en la profundidad del medio y la desaminación de la lisina por un color rojo en la superficie.

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MIO: Este medio es semisólido, a diferencia de los anteriores que son sólidos. Permite el estudio de indol a partir de triptófano, por ser semisólido permite ver la movilidad de la bacteria, ya que cuando es así el medio se vuelve muy turbio, porque la bacteria puede crecer en todo el medio. También permite observar la descarboxilación de la ornitina que se evidencia por un color violáceo en el medio. El indol se visualiza agregando un reactivo que provocará la formación de un anillo color rojo. CITRATO: Permite evidenciar la utilización del citrato como única fuente de carbono. Por medio de un indicador de pH se evidencia el viraje desde un color verde a un color azul, cuando se utiliza el citrato. UREA: Permite evidenciar la presencia de la enzima ureasa en la bacteria. Se utiliza un medio de color naranja que por medio de un indicador de pH vira a fucsia cuando existe esta enzima que hidroliza la urea presente en el medio. La interpretación de las pruebas se realiza en base a tablas que de acuerdo a las propiedades entregadas por los medios de cultivo permiten identificar la bacteria correspondiente. Estas tablas se escogen de acuerdo a los resultados que presenten el TSI y el LIA. INTERPRETACIÓN E INFORME DE LAS PRUEBAS TSI (Agar triple azúcar-fierro) POSIBLES INFORME INTERPRETACION RESULTADOS Amarillo/Amarillo Fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa A/A Rojo/Amarillo

K/A

Rojo/Rojo

K/K

No fermentación de Lactosa, Fermentación de glucosa y sacarosa No fermentación de glucosa, ni lactosa, ni sacarosa

LIA (Agar lisina-fierro) POSIBLES INFORME INTERPRETACION RESULTADOS Morado/Morado K/K Lisina desaminasa negativa y Lisina descarboxilasa positiva Morado/Amarillo K/A Lisina desaminasa negativa y Lisina descarboxilasa negativa Rojo/Morado R/A Lisina desaminasa positiva y lisina descarboxilasa positiva A: Acido; K: Alcalino  Información adicional que entrega TSI y LIA: 95

Producción de H2S: Se visualiza de color negro en el medio. Indica producción de hidrógeno sulfurado y se informa como H2S (+) o (-) Producción de gas de glucosa: Se visualiza con burbujas de aire en el medio o espacios vacíos. Se informa como G (+) o (-) MIO (Agar movilidad, indol, ornitina) POSIBLES RESULTADOS Turbidez Transparencia Indol Positivo Indol Negativo Morado en profundidad Amarillo en todo el medio

INTERPRETACION Movilidad positiva (+) Movilidad Negativa (-) Anillo rojo en superficie al agregar reactivo de Kovacs No se forma anillo rojo al agregar el reactivo de Kovacs Ornitina positiva (+) Ornitina negativa (-)

CITRATO POSIBLES RESULTADOS

INTERPRETACION

Azul intenso en Citrato positivo (+): utilización de citrato como fuente de superficie carbono Verde en superficie Citrato negativo (-)

UREA POSIBLES RESULTADOS

INTERPRETACION

Fucsia

Ureasa positivo(+): Tiene la enzima ureasa para hidrolizar la Urea Permanece el mismo color Ureasa negativo(-) del medio ( naranjo) METODOS DE SIEMBRA:

MEDIO TSI LIA MIO Citrato Simmons Urea

SIEMBRA En profundidad y en superficie ( 1 picadura) En profundidad y en superficie ( 3 picaduras) En profundidad En superficie En superficie 96

PICADURA:

Siembra en superficie

Pinchar el medio con asa en aguja

MATERIALES Algodón

Fósforos Asa inoculación Hilo de Inoculación

MEDIOS DE REACTIVOS CULTIVO/CEPAS

Placas de agar Alcohol Mac Conkey con Enterobacterias Agar Hierro triple Kit de Gram azúcar(TSI) Reactivo de Kovacs Hierro de Agar Lisina(LIA)

EQUIPOS Mechero

Incubadora Refrigeradora

Agar Citrato Agar Urea

Lápiz graso Agar MIO Elaborado por: QF. Mariana Rendón M. MSc.

PROTOCOLO DE PROCESAMIENTO 1. Observe las placas entregadas, anotando las características macroscópicas de las colonias 2. Realice la siembra de una colonia en los medios de identificación bacteriana según lo indicado en cada medio 3. Incubar a 37º C por 18 a 24 hrs 4. Observar resultados y anotar la interpretación de las pruebas 5. Identificar la bacteria con su género y especie, llevando los resultados a las tablas de interpretación RESULTADOS 1. Anote las observaciones de cada tubo (antes y después de inocular), utilizando los colores apropiados.

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2. Anote los resultados de cada prueba usando las abreviaturas correctas. En caso de no corresponder a la bacteria que se le dio con el resultado de sus pruebas bioquímicas, especifique de que bacteria se trata. PRUEBAS TSI LIA MIO motilidad indol ornitina Citrato Urea

CEPA 1

CEPA 2

OBSERVACIONES

Elaborado por: QF. Mariana Rendón M. MSc.

CONCLUSIONES ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

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PRACTICA No 13 COPROCULTIVO.- IDENTIFICACION DE PATOGENOS: SALMONELLA, SHIGUELA, YERSINIA . COMPETENCIAS  Comprobar mediante coprocultivo la presencia en las heces de los microorganismos más frecuentes (Salmonella, Shigella y Yersinia) que puedan ser responsables de un proceso infeccioso.  Diferenciar los microorganismos patógenos de los componentes de la microbiota fecal normal.  Identificar mediante pruebas bioquímicas los posibles microorganismos patógenos INTRODUCCION Microorganismos como protozoos, bacterias y virus pueden ser responsables de cuadros gastrointestinales caracterizados por diarrea, acompañada en ocasiones de vómitos, dolor abdominal y fiebre. Este cuadro suele ser de corta duración y autolimitado. Ante la sospecha de una gastroenteritis bacteriana es necesario realizar un cultivo de heces o coprocultivo para asilar e identificar el microorganismo responsable del proceso diarreico. El tubo digestivo contiene una abundante microbiota intestinal (microbiota entérica normal) que parece desempeñar, en condiciones fisiológicas, una función beneficiosa para el hombre. Aproximadamente el 99,9 % de la microbiota entérica está constituida por anaerobios (Bacteroides, Clostridium, Peptostreptococcus, Peptococcus y otros) y, en menor proporción, bacilos coliformes (E. coli, Klebsiella, Proteus), Enterococcus y otras especies. Los principales agentes bacterianos infecciosos pueden afectar el tubo digestivo invadiendo la mucosa y provocando una diarrea sanguinolenta (mecanismo invasor).Dentro de este grupo destacan Salmonella entérica,Shigella spp.., Yersinia enterocolitica y Y.pseudotuberculosis, Campylobacter jejuni y Escherichia coli (serotipos enteroinvasivos).Otras bacterias lesionan el tubo digestivo por la acción de toxinas bacterianas (enterotoxinas) que actúan sobre la mucosa intestinal (mecanismo toxigénico). El cuadro se caracteriza por la ausencia de fiebre y porque existe poco dolor abdominal. Dentro de este grupo se pueden encontrar bacterias como Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Vibrio cholerae (serotipo 01 y otros), Staphylococcus aureus y Escherichia coli enterotoxigenica. Las heces pueden recogerse en un frasco estéril. También puede recogerse la muestra pasando un hisopo estéril por el esfínter anal. Para su traslado al laboratorio el hisopo se introduce en un medio de transporte adecuado, que mantiene los microorganismos viables e impide su multiplicación.

Las heces se procesaran lo más rápidamente posible o, en caso contrario, se mantendrán a 4°C.

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PROCESAMIENTO 1.-) Coprocultivo: Sembrar la muestra en las placas siguientes:  Agar sangre.  Agar MacConkey.  Agar Salmonella Shigella (S-S).  Agar entérico Hektoen (HK). Para ello se extiende el hisopo desde un borde hasta la mitad de la placa. A continuación con un asa de siembra estéril de punta redonda se hace un agotamiento por estrías en el resto de la placa. Por último, se introduce el hisopo en el caldo de tetrationato agitándolo ligeramente (enriquecimiento). Incubar las placas y el caldo a 37°C durante 24 horas. 2.-) Al día siguiente, realizar una resiembra del caldo de tetrationato en agar Salmonella Shigella. Para ello, con un asa estéril tomar una cantidad del caldo y sembrar por agotamiento por estrías. 3.-) Lectura de las placas: Observar las placas para detectar los microorganismos patógenos entre la abundante microbiota fecal e identificarlos. En el agar sangre (medio general) se puede observar la composición de la microbiota fecal normal aerobia. En el resto de los medios (selectivos) lo fundamental es distinguir colonias que no fermentan la lactosa (Salmonella, Shigella, Yersinia) de los coliformes, que habitualmente la fermentan. El caldo de tetrationato permite la detección de los patógenos entéricos cuando están presentes en bajo número, ya que se retrasa el desarrollo de los microorganismos de la microbiota normal y favorece el de los patógenos entéricos. Puede ocurrir que en las placas de cultivo no observemos colonias lactosa negativas y, sin embargo, en la resiembra del caldo sí aparezcan. En este caso se procede a identificar a los microorganismos patógenos a partir de la resiembra del caldo. a.-) Observar el aspecto de las colonias en los medios selectivos:  Colonias transparentes en agar MacConkey y con un precipitado de color negro en agar S-S y agar HK: altamente sugestivas de Salmonella.  Colonias grandes, planas, transparentes en los medios selectivos: sugestivas de Shigella.  Colonias puntiformes y transparentes en los medios selectivos: sugestivas de Yersinia. 4.-) Pruebas Bioquímicas: A partir de cualquier colonia sospechosa lactosa negativa (seleccionada en el punto anterior), picar con un asa de siembra de punta recta y sembrar un slant de KIA e inocular el agar urea. Incubar ambos medios a 37°C durante 24 horas. RESULTADOS PRUEBAS GAS SH2 UREA KIA

CEPA 1

CEPA 2

OBSERVACIONES

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CONCLUSIONES ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------

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PRACTICA No 14 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE LAS INFECCIONES DEL TRACTO URINARIO (ITU).-UROCULTIVO COMPETENCIAS  Describir las condiciones adecuadas para la toma y transporte de la muestra de orina.  Cuantificar la carga bacteriana.  Identificar el (los) microorganismo(s) aislado(s).  Analizar los resultados obtenidos.  Reportar los resultados siguiendo las normas de taxonomía y de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana. MARCO TEORICO El término ITU define la presencia de microorganismos en las vías urinarias, siendo las patologías más frecuentes cistitis (infección de la vejiga) y pielonefritis (infección del riñón y su pelvis). Epidemiología Las ITU son de las enfermedades más frecuentes, en particular en mujeres. Su prevalencia es dependiente de la edad y el género. Casi 1% de los niños, muchos con anomalías funcionales o anatómicas del aparato urinario, presenta infección durante el período neonatal. Se calcula que 20% o más de la población femenina sufre alguna forma de ITU en su vida. La infección en la población masculina es rara hasta el quinto decenio de la vida, cuando el crecimiento de la próstata empieza a obstaculizar el vaciamiento de la vejiga. En los ancianos de ambos sexos las intervenciones quirúrgicas ginecológicas o prostáticas, la incontinencia, la instrumentación y el sondeo uretral crónico favorecen tasas de ITU de 30 a 40%. Un solo sondeo vesical con lleva riesgo de infección del 1% y al menos 10% de los individuos con sondas a permanencia se infecta. Patogenia La orina, producida en el riñón y descargada a través de la pelvis renal y los uréteres hacia la vejiga, es estéril en el individuo sano. Se desarrolla infección cuando las bacterias logran ingresar a ese ambiente y pueden persistir en él, sobre todo a través de una vía ascendente de bacterias residente de la flora perineal, provenientes de la flora del intestino grueso.

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Entre los factores que favorecen el acceso de las bacterias el más importante es el coito, que desplaza bacterias de forma transitoria al interior de la vejiga y pone en riesgo a la mujer por la corta longitud de la uretra. Otro es la manipulación de la uretra como el sondeo. Las bacterias también pueden alcanzar las vías urinarias desde la corriente sanguínea, lo cual es menos frecuente y requiere una infección en otro sitio. La persistencia se favorece por factores del hospedero que interrumpen o retardan el flujo urinario, como instrumentación, obstrucción o anomalías estructurales. Los factores bacterianos incluyen la capacidad de adherirse al uroepitelio y producir otros factores como las exotoxinas. Los miembros del género Proteus, productores de ureasa, se vinculan con cálculos urinarios, que por sí mismos son factores que predisponen a la infección. Diagnóstico El diagnóstico de laboratorio de una ITU se realiza a través del urocultivo, el cual consiste en el cultivo bacteriológico de la orina para determinar la presencia y cuantificación de gérmenes patógenos. Para la evaluación de estos gérmenes y de su potencial importancia en un proceso infeccioso de las vías urinarias es imperativo conocer los siguientes aspectos: Flora habitual de los genitales externos y la uretra anterior Estafilococos coagulasa negativa, Corinebacterias no patógenas (difteroides), Enterobacterias: Escherichia sp., Proteus sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp. entre otras. Micobacterias saprofíticas, especialmente Mycobacterium smegmatis, Levaduras y Streptococcus sp. Todos estos microorganismos pueden contaminar fácilmente las muestras de orina sin que ello signifique infección, por eso se deben seguir estrictamente las normas que se explican más adelante, que permiten recolectar y conservar correctamente las muestras para urocultivo. Agentes productores de ITU Todo microorganismo puede potencialmente producir infección urinaria; sin embargo, las más frecuentes son: Escherichia coli (85% aproximadamente), Proteus sp. (especialmente Proteus mirabilis), Klebsiella pneumoniae, Enterococcus sp., Enterobacter sp. Pseudomonas sp., Serratia y Acinetobacter generalmente en pacientes hospitalizados con sondas permanentes o con otra patología de base. Levaduras, Staphylococcus saprophyticus (generalmente en mujeres en edad reproductiva),Haemophilus, principalmente en niños. Del hospedero Para interpretar correctamente el resultado del urocultivo es importante conocer la epidemiología, condiciones generales y la clínica del paciente, tales como: 103

enfermedades metabólicas, estrechez uretral, hipertrofia prostática, desórdenes neurogénicos. En estos casos una buena relación entre el médico y el microbiólogo es determinante para un diagnóstico preciso. FASES DEL PROCESO DEL UROCULTIVO Etapa pre-analítica Antes de iniciar el estudio de la muestra, el microbiólogo debe conocer algunos datos concernientes al paciente: edad, género, factores predisponentes, síntomas, antecedentes de ITU, tratamiento actual o previo con antibióticos. El paciente no debe haber recibido terapia antimicrobiana durante los tres días anteriores a la recolección, excepto en los casos de control de tratamiento y pacientes gravemente enfermos. Recomendaciones previas a la toma de muestra Mujeres: se debe higienizar la zona genital con agua y jabón, de adelante hacia atrás, secarse con toalla limpia y se recomienda orinar separando los labios mayores. Hombres: se debe retraer el prepucio e higienizar el glande y surco balanoprepucial con agua y jabón (no usar antisépticos). Recolección de la muestra 

Adultos que controlan esfínteres(micción normal) Se elimina el primer chorro de orina y luego se recolecta en un envase estéril el chorro medio miccional, entre 15 a 30 ml y luego se sigue con la micción normal El tiempo de retención deseado es por lo menos 3 o 4 horas, siendo la muestra más representativa la primera orina de la mañana.  Niños y adultos que no controlan esfínteres Al acecho: se aplica a los lactantes y es similar al descrito para los pacientes que controlan esfínteres. El operador deberá esperar el momento de la micción y recogerá en un envase estéril lo que seguramente será la porción media del chorro miccional. Punción suprapúbica: se reserva para casos especiales por ejemplo: pacientes cuyos urocultivos previos presentan resultados conflictivos, neonatos graves,entre otros. Deberá ser realizada por médicos entrenados. Cateterización: Debe ser realizada por personal entrenado y se recomienda en enfermos con vejiga neurogénica, lactantes entre otros. La muestra recolectada debe ser la porción media del chorro de orina que sale por la sonda.

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

Enfermos sondados: Nunca tomar la orina que fluye del extremo distal de una sonda que no es nueva. En caso de estar recién colocada tomarla directamente del extremo distal en un recipiente estéril. Punción de la sonda: se realiza en aquellos pacientes con sonda permanente. Se obtura la sonda con una pinza “ad hoc”, se espera unos minutos, se desinfecta la parte externa de la sonda en la zona proximal con alcohol yodado y se punza con una jeringa estéril, colocando posteriormente el contenido en un envase estéril.

Conservación y trasporte de la muestra: La muestra para urocultivo debe refrigerarse a 4 – 8 ºC inmediatamente después de recolectada. Si el traslado al laboratorio demora más de 15 minutos, debe colocarse el recipiente con la orina dentro de un contenedor con hielo. Este procedimiento permitirá que el número de microorganismos permanezca relativamente constante por un tiempo no mayor de 24 horas. Etapa analítica Procesamiento de la muestra: antes de iniciar el estudio de la muestra, el microbiólogo debe conocer algunos datos concernientes a la misma. Muestra: tipo de recolección: chorro medio, punción suprapúbica, sonda (punción, sonda nueva). Conservación. Examen directo 1. Examen macroscópico: olor, color, aspecto, pH, densidad. 2. Examen microscópico: estudio del sedimento (en fresco): se centrifuga entre 10 - 15 ml de orina a 3000 rpm durante 10 min, el sedimento obtenido se coloca entre lámina y laminilla y se observa al microscopio con objetivo de 40X. Interpretación • Presencia de 5 o más leucocitos por campo, es signo inequívoco de piuria y refuerza el diagnóstico de infección. • La demostración de cilindros leucocitarios en una muestra en la que se ha identificado un germen con recuento significativo, sugiere posibilidades de pielonefritis. • En infecciones vesicales agudas, además de piuria, puede comprobarse hematuria. • La presencia de gran cantidad de células epiteliales escamosas, evidencia contaminación y la necesidad de repetir la muestra 3. Preparación del frotis: Se toma una gota (con pipeta Pasteur) o una asada de orina, se coloca sobre una lámina portaobjeto y se deja secar sin extender, luego se fija y se colorea con la técnica de Gram. Cuando se sospecha de tuberculosis renal, la orina se centrifuga y se toma una gota del sedimento, se coloca sobre una lámina portaobjeto, se deja secar sin extender, se fija y se colorea con la técnica de Zielh Neelsen, para la búsqueda de bacilos ácidos resistentes. 105

Interpretación • La observación de una o más células microbianas por campo de inmersión se presenta en muestras con contajes mayores de 100.000 colonias/ml de orina, acompañadas generalmente por al menos un leucocito cuando existe piuria. • En las muestras que contienen contajes menores de 100.000 colonias/ml de orina, generalmente no se observan microorganismos ni células. La presencia de muchas células epiteliales escamosas así como de una flora vaginal mixta, evidencia contaminación y la necesidad de repetir la muestra 4. Cultivo y recuento de colonias: Permite diferenciar la verdadera bacteriuria de una contaminación. Se conocen varios métodos para determinar la cantidad de microorganismos. • Método de dilución en tubo o método de Kass: Es un método poco práctico, muy laborioso, está basado en diluciones 1:100 y luego 1:10.000 de la orina, depositadas en placas estériles a las que se les agrega el agar fundido. Después de varios pasos se observa el crecimiento en las diferentes placas. • Método del asa calibrada: Es un método práctico, sencillo y económico, que consiste en sembrar la orina sin centrifugar con un asa calibrada a 0.001 ml (3mm de diámetro) o 0,01 ml (4mm de diámetro). En la elección de los medios de cultivo debe considerarse la recuperación de la mayoría de los patógenos, con el menor costo posible. Generalmente se recomienda la utilización de un agar sangre (AS) y un agar CLED o un medio selectivo diferencial como MK o EMB. En niños incluir un agar chocolate suplementado para la recuperación de Haemophilus. Agar CLED (cistina-lactosa-electrolito-deficiente): utilizado como medio diferencial para el aislamiento, contaje e identificación de microorganismos en orina; su contenido en cistina y lactosa y la presencia del azul de bromotimol (como indicador de pH) facilitan diferenciar a las bacterias fermentadoras de lactosa, que acidifican el medio, virando el indicador de pH al color amarillo (color que toman las colonias). Por otra parte, la deficiencia en electrolitos inhibe el carácter invasor de las colonias de Proteus. Nota: en caso de muestras obtenidas por punción suprapúbica, se recomienda utilizar un medio para la recuperación de bacterias anaerobias Procedimiento 1. Mezclar cuidadosamente la orina restante. 2. Insertar el asa estéril verticalmente en la muestra y luego diseminarla sobre la superficie de la placa desde el centro, formando una línea y posteriormente hacer estrías sobre la placa cruzando la línea del inóculo varias veces. 3. Incubar las placas durante 18–24 horas a 37 ºC en aerobiosis y el AS en microaerofilia y en anaerobiosis si la muestra así lo exigiera. En caso de tener cultivos negativos a las 24 horas, se deben incubar 24–48 horas más.

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Análisis cualitativo La identificación de los agentes se hace mediante el estudio de las características microscópicas de las colonias y la utilización de los sustratos del medio, ejemplo: lactosa, hemólisis y la identificación final a través de pruebas fisiológicas diferenciales, como la prueba de la oxidasa, acción sobre azúcares. Análisis cuantitativo Contar el número de colonias y multiplicar por el factor 1000 o 100, de acuerdo a la capacidad del asa utilizada, para determinar las unidades formadoras de colonia por mililitro de orina (UFC/ml). Pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos Generalmente se usa el método de Kirby Bauer, tomando en cuenta para la elección de los antibióticos el agente aislado y aquellos que más se utilizan en el tratamiento de las ITU. Etapa post-analítica Informe de resultados Datos personales del paciente: Nombre y apellidos, cédula de identidad. Nombre del médico tratante Fecha de recepción de la muestra y emisión del reporte. Tipo de muestra: Orina (especificar método de recolección) Examen realizado: Urocultivo o cultivo y antibiograma Resultados del examen directo: fresco o frotis Agente microbiano aislado (género y especie) y recuento de colonias: Recuento de colonias: Generalmente un recuento de 10.000 o menos colonias por ml de orina indica contaminación y un recuento de 100.000 o más, indica infección. Cuando se obtienen valores intermedios, el examen debe ser repetido, ya que existen factores como, por ejemplo, la obstrucción uretral, diuresis, infecciones crónicas e infecciones por cocos Gram positivos, que pueden explicar recuentos bajos en infecciones urinarias verdaderas.

MATERIALES Algodón Fósforos Gasa

MEDIOS Agar Sangre Agar Cled Caldo Nutritivo

EQUIPOS Mechero Centrifuga Microscopio

Lápiz graso

Agar Hinton

Incubadora

Placa Portaobjeto Asa calibrada Papel filtro Pinzas Hisopo Estéril

REACTIVOS Alcohol Kit de Gram Reactivo de Kovacs Mueller- Plasma Agua Oxigenada Aceite de Cedro

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PROCEDIMIENTO Primer día 1. Llenar la planilla de registro del laboratorio con los datos personales, epidemiológicos y clínicos del paciente. 2. Realizar el examen macroscópico y microscópico (Sedimento y Gram) de una muestra de orina y describir lo observado en cada caso. 3. Sembrar la muestra de orina en AS y CLED, utilizando el asa calibrada e incubar en las condiciones ya señaladas Segundo día 1. Observar las placas sembradas en el período anterior, describa las características observadas en cada medio y realice el contaje de colonias. 2. De acuerdo a las características macroscópicas y microscópicas observadas, ¿sospecha de un agente en particular? Escriba el nombre. 3. Con base en la morfología y tinción observada en el examen directo de la muestra de orina coloreada con Gram y el estudio de las características de las colonias y su efecto sobre el medio del agente etiológico, seleccione y siembre las pruebas bioquímicas que le permitirán identificar el microorganismo, así como los antibióticos para la prueba de sensibilidad de acuerdo al agente presuntamente identificado y los datos clínicos y epidemiológicos. 4. Incubar a 37 ºC durante 24 horas. Tercer dia Procedimiento 1. Realizar la prueba de la oxidasa si es el caso. 2. Realizar la lectura de las pruebas fisiológicas montadas en el período anterior e identifique el agente aislado. 3. Realizar la lectura de la prueba de susceptibilidad antimicrobiana. 4. Elaborar el informe definitivo de los resultados. Cultivos negativos: Negativo a las 48 horas de incubación o no se observó desarrollo bacteriano hasta las 48 horas de incubación. Cultivos positivos: Desarrollo de número de UFC/ml de orina de nombre del microorganismo. Ejemplo: Desarrollo de más de 100.000 de UFC/ml de orina de Escherichia coli. Autoevaluación 1. Mencionar en orden de frecuencia las especies bacterianas productoras de ITU. 2. Describir la técnica más utilizada para el diagnóstico microbiológico de una ITU. 3. Señalar las condiciones de conservación y transporte de una muestra de orina para urocultivo, justificar la respuesta. 4. Mencionar los antibióticos más utilizados para el tratamiento de una ITU. 5. Definir los siguientes términos: disuria, poliaquiuria, piuria, cistitis, pielonefritis. 6. Mencionar la ventaja de incorporar el medio CLED en el urocultivo. CONCLUSIONES ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------108

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PRACTICA No 15 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE LAS INFECCIONES DEL TRACTO RESPIRATORIO SUPERIOR.- EXUDADO FARINGEO COMPETENCIAS  Describir las condiciones adecuadas para la toma y transporte de la muestra de exudado faríngeo  Identificar el (los) microorganismo(s) aislado(s) mediante pruebas bioquímicas.  Reportar los resultados MARCO TEORICO El sistema respiratorio se divide en vías altas o superiores, que comprenden las áreas anteriores a la laringe, incluyendo la nasofaringe, orofaringe, laringe, epiglotis, oído externo y medio, y los senos paranasales, y vías bajas o inferiores que incluyen todas las estructuras posteriores a la laringe. El tracto respiratorio habitual (la faringe) está formado por distintos microorganismos entre los que destacan los siguientes grupos y especies: estreptococos, estafilococos, micrococos, neisserias, Moraxella catarrhalis, corinebacterias, Haemophilus spp, Porphyromonas, Prevotella, Fusobacterium, Veillonela, Peptostreptococcus, Actinomyces, etc. Sin embargo, cuando encontramos una patología en la faringe, el agente etiológico más frecuentemente aislado es el Streptococcus pyogenes, pero también, otros microorganismos patógenos que podemos hallar son: Streptococcus pneumoniae, Streptococcus alfa-hemolítico grupo viridans, etc. Para poder identificar el agente microbiano de la muestra problema, se procederá a la siembra del mismo en diferentes medios de cultivo, y así observar si hay o no crecimiento en cada uno de ellos. Además se procederá a realizar diferentes pruebas, como la tinción de Gram, la catalasa, etc. TOMA DE MUESTRA Se pide al paciente que se siente y coloque su cabeza hacia atrás. Se ilumina bien la cavidad orofaríngea y con un bajalenguas se empuja la lengua hacia abajo para facilitar el acceso a la parte posterior de la faringe. Con un hisopo de algodón se hace un raspado de las áreas hiperémicas, purulentas o necróticas, así como de las membranas o manchas de Koplic, si es que las presenta.

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TRANSPORTE 



Agentes virales: El hisopo con la muestra se introduce en un tubo de tapón de rosca con 1 a 2 mL de solución salina isotónica estéril. Se rompe la varilla de madera a la altura del tapón y se tapa herméticamente. Agentes bacterianos: El hisopo con la muestra se introduce en un tubo de tapón de rosca con medio de Amies o de Stuart. Se rompe la varilla de madera a la altura del tapón y se tapa herméticamente.

MATERIALES Algodón Fósforos Gasa Lápiz graso Placa Portaobjeto Asa calibrada Papel filtro Pipetas Guantes Mascarilla Hisopo Estéril /medio de transporte Stuart

MEDIOS REACTIVOS Agar Sangre Alcohol Agar Mac Kit de Gram Conkey Caldo Nutritivo Plasma Agua Oxigenada Aceite de Cedro

EQUIPOS Mechero Microscopio Incubadora

PROTOCOLO DE PROCESAMIENTO Una vez obtenida la muestra, exudado faríngeo, se procederá a la identificación de los microorganismos que posiblemente estén presentes en la misma. Para ello se realizarán las pruebas que a continuación se describen: En primer lugar se escogerán los medios específicos para la muestra de exudado faríngeo: - Estreptococos β-hemolíticos; Columbia ANC + 5% sangre de cordero – agar. - Haemophilus; Chocolate Poly Vitex Bacitracina – Agar. - Cándida albicans, levaduras; Sabouraud Gentamicina Cloranfenicol – agar. - Pneumococos; Columbia ANC + 5% sangre de cordeno – agar. - Staphylococcus aureus; Chapman agar.

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No se ha utilizado el medio Loeffler, puesto que en el laboratorio no se disponía de él; no obstante, es un medio específico para el microorganismo Corynebacterium diphteriae el cual es muy improbable que no se hallara en la muestra. A continuación se procede a sembrar cada uno de los medios por la técnica de los cuatro cuadrantes, y así obtener un mejor aislamiento de las colonias. 

El primer día

Se incuban todos los medios en aerobiosis, excepto el de agar sangre, que se incubó dentro de una campana de anaerobiosis. Para crear dicho ambiente de anaerobiosis, se introdujo en la campana un sobre que tiene como función quelar el oxígeno disponible, tanto en el espacio interno de la campana como en el de la placa. Para comprobar que estas condiciones anaeróbicas se han dado, se introdujo también dentro de la campana una tira, la cual en un principio es de color azul, y tras el periodo de incubación, si efectivamente se han dado dichas condiciones, esa coloración cambiará a transparente. La incubación tuvo una duración de 24 horas a 37⁰C.



El segundo día

1.- Todos los medios que anteriormente fueron incubados en aerobiosis, se incubaron en anaerobiosis como ya se explicó en el párrafo anterior. Además se sembró otra placa de agar sangre, pero esta vez se incubó en aerobiosis. Esta segunda incubación tuvo una duración de 24 horas a 37⁰C. 2.- Se realiza la visualización macroscópica a las placas en las que se produjo crecimiento bacteriano, estas placas corresponden con las dos de agar sangre, una incubada en condiciones de aerobiosis y otra en anaerobiosis. En ambas 112

placas se observó que las colonias tenían un halo de hemólisis correspondiente a la beta hemólisis.

3.- Se realizan dos tinciones de Gram, una de cada placa, para así diferenciar tanto la forma, agrupación, morfología de estos microorganismos, así como las características de su pared bacteriana, Gram positivos o Gram negativos.

4.- Se realiza dos pruebas bioquímicas, catalasa y oxidasa a las dos placas. - Placa agar sangre en aerobiosis: La catalasa se realizó con el fin de diferenciar el género Streptococcus del género Staphylococcus; y, la oxidasa se realizó para confirmar el género Streptococcus. - Placa agar sangre en anaerobiosis: la catalasa y la oxidasa se realizaron para confirmar que el microorganismo presente en esta placa es la Veillonella.

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INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS Visualizando las colonias obtenidas, tanto en la muestra en condiciones aeróbicas, como la muestra en condiciones anaeróbicas, podemos deducir lo siguiente: En el primer caso (muestra en condiciones aeróbicas) Se realiza una observación a luz natural (sin la aplicación de luz UV), en la que se ven colonias muy pequeñas de color blanco, con un halo de hemólisis alrededor, pertenecientes al grupo de los ------ hemolíticos. Posteriormente, se realiza la misma operación, pero aplicando una luz ultravioleta; en la que se observan colonias rojizas, con su halo de hemólisis amarillo-verdoso. En el segundo caso (muestra en condiciones anaeróbicas) Con la luz natural se observan minúsculas colonias blancas con un halo de hemólisis de color amarillas-anaranjado. Expuesta a luz UV, se observan colonias rojizas y el halo de hemólisis amarillo-verdoso. Una vez hecho esto, a partir de una colonia aislada obtenida en el medio de cultivo agar sangre, expuesta en condiciones anaeróbicas; se ha realizado una tinción de Gram, cuyo resultado ha dado cocos, streptococcus, staphilococcus De la misma forma, se ha realizado la tinción de Gram de una colonia aislada obtenida por crecimiento en condiciones aeróbicas, en el medio agar sangre. En este caso, los microorganismos observados al microscopio han sido cocos, diplococos, tétradas, estreptococcus (observado de un tamaño mayor, que la muestra anterior) En el resto de las placas sembradas, no ha habido crecimiento microbiano, por lo que no se ha podido realizar ningún tipo de tinción, prueba. Esto, nos ha ayudado a descartar la presencia de algunos microorganismos. Para poder seguir reduciendo la lista de posibles microorganismos se ha realizado la prueba de la catalasa, dando resultados negativos en ambas muestras; así como en la prueba de la oxidasa. Se realizan otras pruebas bioquímicas para diferenciar la especie del microorganismo encontrado CONCLUSIÓNES ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------115

BIBLIOGRAFIA - Granados R., Microbiología, Ed. Paraninfo 1999 - Gamazo, C., López-Coñi, I. y Díaz, R. Manual Práctico de Microbiología 3ª Edición. Editorial Masson. España. 2005. -Koneman. E.W. y Col Diagnostico Microbiológico, Ed. Editorial Medica Panamericana 2008 -MacFaddin – 2003 Pruebas Bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica. Edit. Médica Interamericana. 3ª Edic. Bs.As .Argentina 850 pp. -Merck, Manual de Medios de Cultivo 2007 -Velasco Judith, et alt. Manual Práctico de Bacteriología Clínica. Colección de Textos Universitarios, Universidad de los Andes, Venezuela 2008

Internet http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/CDS_CSR_LYO_2004_ 11SP. pdf. Organización Mundial de la Salud, Manual de bioseguridad en el laboratorio. Tercera edición 2012 http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/ Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica, Métodos de identificación bacteriana en el laboratorio de microbiología, 2ª Edición (37), 2010Fernández Olmos A. y otros http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia, Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica, Diagnostico Microbiologico del tracto urinario, Edición 14ava 2010, Andreu Domingo A. y otros http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia, Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica, Diagnóstico microbiológico de las infecciones del tracto respiratorio superior 2ª Edición (23), 2006, Batista Díaz N. y otros http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia, Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica ,Recomendaciones para la implantación de la normativa de calidad ISO 15189 en el Laboratorio de Microbiología Clínica: bacteriología y serología 2ª Edición (32), 2009 http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia, Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica, Diagnóstico microbiológico de las infecciones gastrointestinales ,2ª Edición (30), 2008

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GLOSARIO DE TÉRMINOS Agentes biológicos: Microorganismos, con inclusión de los genéticamente modificados, cultivos celulares y endoparásitos humanos susceptibles de originar cualquier tipo de infección, alergia o toxicidad Agentes patógenos: Todo aquel microorganismo capaz de producir enfermedad o infección.. Aglutinación: Agrupamiento de un antígeno en suspensión u otra partícula bacterial con su anticuerpo específico que se hace visible mediante el látex o partículas de carbón o eritrocitos. Anatomopatológico: Piezas anatómicas potencialmente infectantes. Antibiótico: literalmente destructor de la vida. Término que comprende todas las sustancias antimicrobianas independientemente de su origen, ya sean derivadas de microorganismos (bacterias, hongos, etc.) de productos químicos sintéticos o de ingeniería genética. Anticuerpo: sustancia defensora (proteína) sintetizada por el sistema inmunológico como respuesta a la presencia de una proteína extraña (antígeno) que el anticuerpo neutraliza. Anticuerpo monoclonal: anticuerpo monoclonado a partir del cultivo de un único tipo de células (un clon de hibridoma), y que contiene por tanto un sólo tipo de proteínas (inmunoglobulina). Antígeno: sustancia extraña a un organismo, normalmente una proteína, que desencadena como reacción defensiva la formación de anticuerpos que reaccionan específicamente con el antígeno. En general, cualquier sustancia que provoca una respuesta inmunitaria. Anticoagulante: Sustancia que demora o suprime la coagulación de la sangre. Asepsia: Método de prevenir las infecciones mediante la destrucción de los agentes infectivos. Autoclave: Olla con la cual se realiza esterilización por medio de vapor de agua a presión. Auto inoculación: Desarrollar algún tipo de auto infección o enfermedad causada por malos hábitos Biología Molecular: parte de la biología que trata de los fenómenos biológicos a nivel molecular. En sentido restringido comprende la interpretación de dichos fenómenos sobre la base de la participación de las proteínas y ácidos nucleicos. Bioseguridad: Es el conjunto de lineamientos y regulaciones para prevenir, eliminar o reducir cualquier riesgo potencial en las personas, la comunidad y el medio ambiente. Biotecnología: toda aplicación tecnológica que utilice sistemas biológicos y organismos vivos o sus derivados para la creación o modificación de productos o procesos en usos específicos. Células epiteliales: Células superficiales que protegen las cavidades internas y la superficie externa del cuerpo. Cepa: en microbiología, conjunto de virus, bacterias u hongos que tienen el mismo patrimonio genético. Cilindros urinarios: Aglomerados de proteínas de estructura tubular que se forman durante las enfermedades de los túbulos renales, pueden contener en su matriz eritrocitos, otras células y depósitos de sustancias químicas. Coagulación: Proceso de formación de la sangre en una masa gelatinosa.

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Coágulo: La conversión del fibrinógeno en una red de moléculas de fibrina polimerizada, que transforma la sangre en una masa gelatinosa.. Concentración: Es la relación entre la cantidad de soluto y la cantidad de solvente o solución. Contaminación: Presencia de un agente infeccioso en la superficie del organismo; también en vestimenta, ropa de cama, juguetes, instrumentos quirúrgicos, apósitos u otros objetos inanimados o substancias, incluyendo el agua y los alimentos. Cristales urinarios: Formas geométricas de diferentes sustancias químicas que se cristalizan en la orina dependiendo del pH de esta. Cultivo celular: El resultado del crecimiento in Vitro de células obtenidas de organismos multicelulares Daño. Es la consecuencia producida por un peligro sobre la calidad de vida individual o colectiva de las personas. Desinfección: Disminución de microorganismos patógenos en materiales, equipos o áreas del Laboratorio de Anatomía. Diseminación: Proliferación de microorganismos Enfermedad: alteración o desviación del estado fisiológico en una o varias partes del cuerpo, por causas en general conocidas, manifestada por síntomas y signos característicos, y cuya evolución es mas o menos previsible. Ensayo: Experimento. Enzimas: Catalizadores que modifican la velocidad de una reacción. Esputo: Material eyectado desde los pulmones a la boca. Estándar: Una solución patrón que se utiliza para comparar o para la elaboración de otras diluciones. Esterilización: proceso físico o químico con el cual se logra la total eliminación o destrucción de todas las formas de vida microbianas Fármaco: droga, medicamento. Fermentación: conversión biológica anaeróbica (sin oxígeno) de las moléculas orgánicas, generalmente hidratos de carbono, en alcohol, ácido láctico y gases, mediante la acción de ciertos enzimas que actúan bien directamente o como componentes de ciertas bacterias y levaduras. En su uso más coloquial, el término hace referencia a menudo a bioprocesos que no están estrictamente relacionados con la fermentación. Gram negativa: Característica de los tejidos o bacterias que pierden la coloración por el método de Gram (toman color rosado). Gram positiva: Característica de los tejido o bacteria que conservan la coloración por el método de Gram (toman color azul). Heces: Mezcla de productos de excreción y secreción que se eliminan por el intestino. Hemólisis: Destrucción de Glóbulos Rojos. Hifa: Hongo de estructura larga filamentosa en forma de tubo.. Incineración: consiste en reducir los desechos a cenizas inodoras para evitar la propagación de microorganismos patógenos Infección: invasión de un ser vivo por un agente patógeno que desencadena una enfermedad. Inoculación: Introducción de microorganismos, materiales infecciosos, etc. en un ser vivo o en cultivos potencialmente infectantes Líquidos de precaución universal: Son aquellos que se consideran potencialmente infectantes, entre ellos tenemos: Sangre 118

Semen Secreción vaginal Leche materna Liquido cefalorraquídeo Liquido pleural Liquido amniótico Liquido peritoneal Liquido pericardico Cualquier otro liquido contaminado con sangre Material corto punzante: es todo aquel material que puede producir cortes, pinchazos o laceraciones, como agujas, lancetas, vidriera, hojas de bisturí, entre otros. Material de riesgo biológico: se caracteriza por albergar microorganismos patógenos, los cuales inciden en el proceso salud - enfermedad. Material genético: todo material de origen vegetal, animal, microbiano o de otro tipo que contenga unidades funcionales de la herencia. Micelio: Masa de hifas. Microorganismo: organismos microscópicos pertenecientes por regla general a virus, bacterias, algas, hongos o protozoos.Toda entidad microbiológica, celular o no, capaz de reproducirse o de transferir material genético. Morfología bacteriana: Forma de los microorganismos Mucosas: Áreas del cuerpo cubiertas con membranas sensible a agentes patógenos, como boca, orificios nasales, ojos, oídos y genitales Organismo: entidad biológica capaz de reproducirse o de transferir material genético, incluyéndose dentro de este concepto a las entidades microbiológicas, sean o no celulares. Casi todo organismo está formado por células, que pueden agruparse en órganos, y éstos a su vez en sistemas, cada uno de los cuales realizan funciones específicas. Patógeno: productor o causante de enfermedad. Plasma: Componente líquido de la sangre que se obtiene al separar una sangre con anticoagulante del paquete globular, contiene fibrinógeno y componentes de la coagulación neutralizados. Peligro. Todo aquello que puede producir un daño o un deterioro de la calidad de vida individual o colectiva de las personas. Potencialmente infectante: material orgánico o inorgánico contaminado con agentes patógenos. Procedimiento: Serie de pasos en forma cronológica, por los cuales se logra un resultado deseado. Profilaxis: conjunto de medios que sirven para preservar de enfermedades al individuo o a la sociedad. Sinónimo de tratamiento preventivoPseudohifas: Hongo de tipo de levadura que presenta una extensión tubular de protoplasma que difiere de las hifas porque continúan con la célula madre.. Reacción enzimática: Reacción química que tiene por catalizador una enzima. Riesgo: Posibilidad o probabilidad de que ocurra un daño a la salud, puede ser causado por accidente, enfermedades u otros, pudiendo por ello cuantificarse Ruta hospitalaria: es la encargada de recolectar las basuras de riesgo biológico y llevarlos a un sistema de relleno sanitario la cual consiste en la disposición definitiva de los residuos sólidos, bajo condiciones que aseguren su normal descomposición sin riesgo para la salud humana o medio ambiente. Secreción: Sustancia que se vierten al exterior de una célula. 119

Suero: Componente líquido de la sangre que se obtiene al separar una sangre sin anticoagulante del paquete globular Tejido corporal: Todo tipo de material orgánico proveniente de cualquier parte del cuerpo de un individuo Toxina: proteína responsable de la especificidad funcional de ciertas bacterias, que es venenosa para determinados organismos. Entre las mejor conocidas, tanto por su estructura como por los mecanismos de acción, figuran las toxinas colérica y tetánica que interaccionan con las células diana a través de gangliósidos de membrana. Vacuna: antígeno procedente de uno o varios organismos patógenos que se administra para inducir la inmunidad activa protegiendo contra la infección de dichos organismos. Es una aplicación práctica de la inmunidad adquirida. Virus: entidad acelular infecciosa que, aunque puede sobrevivir extracelularmente, es un parásito absoluto porque solamente es capaz de replicarse en el seno de células vivas específicas, pero sin generar energía ni ninguna actividad metabólica. Los componentes permanentes de los virus son ácido nucleico (ADN o ARN, de una o de dos cadenas) envuelto por una cubierta proteica llamada cápside. Virión: unidad estructural de los virus. Consta fundamentalmente de dos estructuras imprescindibles: un ácido nucleico (ADN o ARN) y una envoltura proteica (cápside). A estas estructuras básicas se añade en algunos casos una envoltura lipídica (peplos) y/o espículas de glucoproteína. Viroides: agente causal de ciertas enfermedades de las plantas denominado así por su semejanza con los virus, de los que se diferencia por carecer de cápside. Se trata de ácido nucleico envuelto por una membrana procedente de la célula en la que se replicó. Por extensión se aplicaba a lo que hoy se denomina priones.

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