Manual de Microbiología - Estomatología - Ucv -Piura 2017

MICROBIOLOGÍA MANUAL DE PRÁCTICAS

AUTOR: MSc. Biólogo Microbiólogo MIGUEL ANGEL RUIZ BARRUETO

ESCUELA DE ESTOMATOLOGÍA

PIURA – PERÚ, 2017

MANUAL DE PRÁCTICAS

MICROBIOLOGÍA

UNIVERSIDAD

CÉSAR VALLEJO

DATOS DEL ESTUDIANTE

 APELLIDOS Y NOMBRES:

 CÓDIGO DE ESTUDIANTE:  DIRECCIÓN:  

PERSONAL: INSTITUCIONAL:

 FACULTAD:  ESCUELA PROFESIONAL:

 SEMESTRE ACADÉMICO:  SECCIÓN:

CICLO: N o DE MESA:

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MICROBIOLOGÍA

UNIVERSIDAD CÉSAR VALLEJO FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS Escuela de Estomatología MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA PRIMERA EDICIÓN 2017

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AUTORIDADES ACADÉMICAS DE LA UNIVERSIDAD CÉSAR VALLEJO – Filial Piura  DIRECTOR GENERAL: Dr. Alcibíades Sime Marques  DECANA DE LA FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS Dra. Amalia Guadalupe Vega Fernández  DIRECTORA DE ESCUELA DE ESTOMATOLOGÍA Dra. Erika Raquel Enoki Miñano  SECRETARIO ACADÉMICO Mg. CD. Wilfredo Terrones Campos

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AUTORES DEL PRESENTE MANUAL  M.Sc. Mblgo. Miguel Angel Ruiz Barrueto. Coordinador de Investigación DTC - Escuela de Estomatología.

Piura, agosto de 2017.

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REGLAMENTO DE PRÁCTICAS 1. El alumno deberá portar su MANUAL DE PRÁCTICAS desde el primer día de clases. En caso contrario no podrá ingresar al laboratorio. 2. Deberá leer previamente la práctica correspondiente antes de ingresar al laboratorio. 3. El docente haciendo uso de un instrumento de evaluación evaluará a los estudiantes en todo lo concerniente a la práctica que corresponde, la evaluación se realizará de la información proporcionada en el presente manual de prácticas. 4. Antes de iniciada la práctica el docente cuestionará a los estudiantes de forma verbal sobre el tema que corresponda a fin de corroborar la lectura realizada por ellos. 5. Al inicio de la práctica el docente explicará la metodología de trabajo y el protocolo de la práctica en la pizarra o mediante una presentación PowerPoint. 6. Posterior a la explicación los estudiantes que conformen cada grupo colocarán sobre la mesa de trabajo los materiales solicitados para el desarrollo de la práctica y que consta detalladamente en cada práctica. No se permitirá el intercambio de materiales dentro del laboratorio. La falta de algún material solicitado influirá en la nota final de la sesión práctica. 7. El estudiante deberá anotar sus resultados, en su manual, en los espacios designados para ello. 8. Al finalizar la práctica se analizarán y discutirán los resultados obtenidos. El estudiante podrá realizar preguntas relacionadas al tema en cualquier momento del desarrollo de la práctica. 9. Cada alumno es responsable de la información que coloca en su Manual de Prácticas. Cada práctica desarrollada será revisada en la semana siguiente a su realización. En el caso que se encontrara duplicidad de prácticas, copias de respuestas de cuestionario, fotocopia de resultados o cualquier otro indicador de plagio este será calificado con nota cero, tanto para el que prestó el Manual como para el que plagió. Intentamos formar estudiantes con valores y respetuosos del esfuerzo de cada uno.

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PRESENTACIÓN El manual de Microbiología para los estudiantes de la EAP de Estomatología se ha elaborado teniendo en cuenta las competencias académicas que el futuro Cirujano Dentista debe adquirir durante el desarrollo del presente curso. La Microbiología es la ciencia que estudia los microorganismos, de su biología, su ecología y su relación con el hombre. Esta definición hace necesaria la de tres conceptos que se incluyen en ella: microorganismo, biología y ecología. El conocimiento de la biología y la ecología microbiana son imprescindibles para poder comprender de qué forma los microorganismos interaccionan con los seres humanos y qué tipos de relaciones establecen con ellos. Por microorganismo entendemos cualquier organismo vivo que no sea visible a simple vista. Esta definición operativa no incluye los hongos, tanto inferiores como superiores, ni las algas aunque ambos grupos son considerados microorganismos porque su organización es esencialmente unicelular (las células que los constituyen mantienen un alto grado de autonomía entre sí). Por otra parte, organismos pluricelulares pueden ser de tamaño tan pequeño que entren dentro de la definición anterior sin dejar por ello de ser estructuralmente tan complejos como cualquier animal superior. En nuestro curso nos centraremos en bacterias, virus, hongos y parásitos de interés clínico para el ser humano. Como estudiantes que inician su experiencia en el manejo de microorganismos, se les darán las indicaciones básicas de conducta que deben cumplir en un laboratorio de microbiología a fin de que pueda realizar un trabajo seguro y eficiente. Este manual inicia con la práctica de Bioseguridad, con los antecedentes y reglas de seguridad más importantes que deberán conocer y practicar siempre. Las prácticas propuestas tratan sobre el manejo de bacterias, hongos y parásitos, porque son los grupos microbianos más abundantes y porque muchos representantes de ellos tienen importancia clínica debido a su capacidad de causar enfermedad en seres humanos. Cada práctica comienza con el título, la Introducción y luego las competencias para facilitar la comprensión de los fundamentos de las prácticas. Seguidamente se indican los materiales que se requieren y los procedimientos a realizar en forma de instrucciones numeradas. Al final de cada práctica se proponen cuadros o figuras de recopilación de resultados y un espacio para que el alumno redacte una breve discusión de sus resultados. Los invitamos a consultar este manual y sobre todo a realizar los experimentos propuestos con interés y entusiasmo para adquirir los conocimientos y habilidades de trabajo que se requiere en un futuro Cirujano Dentista. Es nuestro deseo que el presente manual pueda ayudar al estudiante en la comprensión teórica y ejecución práctica de la asignatura y en la apertura de investigaciones básicas en el campo de la Microbiología oral. Se espera que el esfuerzo desplegado, cumpla su cometido en bien de una óptima formación profesional y una mejor comprensión del papel importante que cumple el estudio de la MICROBIOLOGÍA en las Ciencias Médicas. Así mismo se esperan las valiosas sugerencias de colegas y estudiantes que permitan el perfeccionamiento de este manual en ediciones futuras. EL AUTOR

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NORMAS, RECOMENDACIONES Y PRECAUCIONES PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA El trabajo en el laboratorio requiere la observación de una serie de normas de bioseguridad, a fin de evitar posibles accidentes debido a desconocimiento de lo que se está haciendo o a una posible negligencia. Quien trabaja en el laboratorio está expuesto a muchos riesgos, pues hay productos químicos que son tóxicos, inflamables, explosivos, corrosivos, carcinogénicos, agentes microbianos patógenos y, a veces, existe el peligro derivado del uso de altos voltajes, de luz ultravioleta y otras radiaciones. I. NORMAS PERSONALES 1. Seguir las instrucciones y recomendaciones dadas por el docente para cada sesión práctica. No manipule muestras, materiales, instrumentos o equipos por su cuenta. 2. Procure ingresar al laboratorio a la hora señalada, con el guardapolvo puesto y con el material de trabajo previamente solicitado. 3. En el laboratorio es obligatoria la utilización de guardapolvo (mandil) para evitar que posibles sustancias químicas lleguen a la piel o deterioren las prendes de vestir. El guardapolvo debe ser de color blanco, bordado con nombre y apellido del estudiante y el logro de la escuela de Estomatología UCV. Es de uso exclusivo dentro del laboratorio, hay que sacárselo si se va abandonar el mismo. 4. Si se tiene el cabello largo, es conveniente llevarlo recogido. 5. Durante su permanencia en el laboratorio aproveche y use adecuadamente el tiempo, materiales de trabajo, agua, corriente eléctrica, gas, mobiliario y espacio. 6. No arroje desechos a los lavaderos ni al piso. Procure colocarlos en los tachos correspondientes para que sean descartados una vez finalizada la práctica. En el tacho con bolsa ROJA, se desechan los residuos de materiales biológico (restos vegetales y animales, material contaminado con sangre); en el tacho con bolsa NEGRA se arrojan los desperdicios comunes no contaminados (papeles, etc.). 7. Está estrictamente prohibido comer, beber y fumar dentro del laboratorio. 8. Sobre la mesa de trabajo del laboratorio debe de tener solamente el material solicitado y el Manual de Prácticas de Biología. Coloque las carteras, mochilas, libros y otros en los casilleros o en los lugares destinados para ellos. 9. Durante el desarrollo de la práctica observe y grafique con detalle los diversos experimentos, protocolos u observaciones microscópicas; intercambie conceptos, ideas y puntos de vista con sus compañeros y profesor. 10. Al término de la práctica el estudiante debe limpiar su mesa de trabajo, lavar el material de vidrio utilizado, lavarse cuidadosamente las manos, despojarse del guardapolvo y retirarse ordenadamente. II. NORMAS DE UTILIZACIÓN DE PRODUCTOS QUÍMICOS 1. Antes de utilizar un compuesto químico, asegurarse de que es el que se necesita. 2. No devolver a los frascos de origen los sobrantes de los productos químicos o medios de cultivo. Si existiese sobrante, desecharlo.

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3. No tocar con las manos y menos con la boca, los productos químicos, utilizar peras de succión o propipetas. 4. Los ácidos requieren un cuidado especial, cuando haya que diluirlos, nunca echar agua sobre ellos; por el contrario, se debe agregar el ácido sobre agua. 5. Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc.) no deben estar cerca de fuentes de calor. Si hay que calentar tubos con estos productos, se hará al baño maría, nunca directamente a la llama. 6. Si se vierte sobre la piel cualquier ácido o producto corrosivo, lavarse inmediatamente con abundante agua y avisar al encargado del laboratorio. 7. Si se preparan soluciones químicas, éstas deben colocarse en un frasco limpio y seco y rotulado convenientemente. III. NORMAS DE UTILIZACIÓN DEL MATERIAL DE VIDRIO 1. Tener cuidado con los bordes y puntas cortantes de los tubos u objetos de vidrio. 2. El vidrio caliente no se diferencia a simple vista del vidrio frio. Para evitar quemaduras, dejarlo enfriar antes de tocarlo. 3. Las pipetas usadas deben colocarse en recipientes que contienen una solución desinfectante (mezcla sulfocrómica o bicloruro de mercurio). De la misma manera se procede para tubos de ensayo, láminas cubreobjetos y laminillas. 4. Si se tiene que calentar a la llama el contenido de un tubo de ensayo, debe considerarse lo siguiente: a) La boca del tubo de ensayo no debe apuntar a ningún compañero de trabajo ni a sí mismo. Puede hervir el líquido y salir disparado, ocasionando un accidente. b) El tubo de ensayo debe calentarse por la parte lateral, nunca por el fondo, agitando suavemente. Todos los que trabajan en el laboratorio, deben saber dónde está el botiquín, las botellas de irrigación de los ojos, y los extintores de incendio.

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PRÁCTICA N

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BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y MICROSCOPÍA ÓPTICA: MANEJO Y CUIDADOS I. INTRODUCCIÓN: En el campo de la salud existen diversos lugares donde el profesional se desempeña, como hospitales, clínicas, postas, centros asistenciales, etc. Sin embargo el laboratorio también constituye un lugar de trabajo, tanto en el campo clínico, educativo y de investigación, siendo por ello necesario que se conozcan las pautas mínimas necesarias para el normal desempeño dentro de él. Los laboratorios microbiológicos constituyen ambientes de trabajo especiales, generalmente únicos, que pueden presentar riesgos de enfermedades infecciosas identificables para las personas que se encuentren en o cerca de ellos. Durante el transcurso de la historia de la microbiología, muchas infecciones se han contraído en el laboratorio. Desde la década de 1940 hasta la actualidad existes reportes de casos de infecciones adquiridas por personal de los laboratorios en todo el mundo. Dichos reportes concluyeron que la “manipulación de cultivos o especímenes o la inhalación de polvo con contenido de microorganismos constituye un peligro inminente para quienes trabajan en los laboratorios”. Algunos casos se atribuyeron al descuido o a malas técnicas en la manipulación de materiales infecciosos. Según la Organización Mundial de la Salud (2005), la Bioseguridad es un conjunto de normas y medidas para proteger la salud del personal, frente a riesgos biológicos, químicos y físicos a los que está expuesto en el desempeño de sus funciones, también a los pacientes y al medio ambiente. Entonces definimos como bioseguridad al conjunto de combinaciones específicas (normas) de trabajo, equipo de seguridad y facilidades diseñadas para minimizar la exposición de los trabajadores y el ambiente a los agentes infecciosos; es así que las normas de bioseguridad están destinadas a reducir el riesgo de transmisión de microorganismos de fuentes reconocidas o no reconocidas de infección en Servicios de Salud vinculadas a accidentes por exposición a sangre y fluidos corporales, así como también agentes físicos y químicos. Los objetivos de estas normas son: 1. Proteger la salud del personal que pueda estar expuesto a riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos, químicos y físicos. 2. Establecer la conducta a seguir frente a un accidente con exposición a dichos elementos. 3. Participar de las normas de Bioseguridad a todo el personal que directa o indirectamente toma contacto con el laboratorio. DEFINICIONES Y ABREVIATURAS 1. Agente biológico: Todo organismo viviente capaz de causar infección, enfermedad o muerte en el ser humano con inclusión de los genéticamente modificados y endoparásitos humanos susceptibles de originar cualquier tipo de infección, alergia o toxicidad. 2. Antisépticos: Se definen como agentes germicidas para ser usados sobre la piel y los tejidos vivos. Aunque algunos germicidas pueden ser utilizados como desinfectantes y antisépticos (alcohol 70-90%), Escuela de Estomatología UCV - Piura

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su efectividad no es necesariamente la misma en cada caso, un buen antiséptico puede no ser eficaz como desinfectante y viceversa. Área contaminada: Área donde se manipulan microorganismos de riesgo. Ejemplo: Laboratorios donde se manipulan virus, producción de antígenos, etc. Área de tránsito limitado: Área donde el tránsito está permitido sólo a personas previamente autorizadas, debido a la presencia de agentes que corresponden a los grupos I y II de la clasificación de agentes de riesgo o al uso de sustancias químicas de bajo riesgo. El acceso del personal administrativo está terminantemente prohibido. Área de tránsito restringido: Área en la que el tránsito está permitido sólo al personal adecuadamente protegido y autorizado, debido a la presencia de agentes de los grupos III y IV. También incluye los laboratorios de producción de biológicos y control de calidad d alimentos, medicamentos y afines. El acceso del personal administrativo está terminantemente prohibido. Área limpia: Área del laboratorio donde no se manipulan microorganismos de riesgo. Ejemplo: donde se mantienen los medios de cultivos celulares, se preparan los medios de cultivo y a la vez se realiza la formulación de la vacuna. Área libre: Área de tránsito libre para todo el personal. Ejemplo: pasadizos, comedor y otras áreas de uso común. Accidente de trabajo: Ocurrencia durante las horas de trabajo que causa la inhabilitación temporal o permanente del trabajador. Acción correctiva: Procedimiento realizado para eliminar la causa de una disconformidad, defecto u otra situación no deseable y existente con el propósito de evitar que vuelva a suceder. Acción preventiva: Acción tomada para eliminar las causas de una disconformidad, defecto u otra situación potencial no deseada a fin de evitar que se produzca. Bioseguridad: Conjunto de medidas preventivas reconocidas internacionalmente orientadas a proteger la salud y la seguridad del personal y su entorno. Complementariamente se incluye normas contra riesgos producidos por agentes físicos, químicos y mecánicos. Modernamente se incorporan también las acciones o medidas de seguridad requeridas para minimizar los riesgos derivados del manejo de un organismo modificado genéticamente (OMG), sus derivados o productos que los contengan, y uso de la tecnología del ADN recombinante (ingeniería genética) y otras técnicas moleculares más recientes. Cabina de flujo laminar: Son recintos que emplean un ventilador para forzar el paso del aire a través de un filtro HEPA (acrónimo del término en inglés High Efficiency Particulate Air) es decir purificador de alta eficiencia de partículas suspendidas en el aire, barriendo la superficie de trabajo. El flujo de aire puede ser vertical u horizontal. Estas cabinas ofrecen protección únicamente al material que se maneja en su interior, pero nunca al operador. Cabina de seguridad biológica: Son equipos que proporcionan una barrera de contención para trabajar de forma segura con agentes infecciosos. Permiten proteger según su diseño y clasificación al trabajador, medio ambiente o al producto. Es una combinación de elementos electromecánicos/electrónicos y procesos físicos que impulsan el aire a través de unos filtros especiales de gran superficie estratégicamente situados, que tienen una eficiencia mínima de retención de partículas del 99,99%, cuando el tamaño de éstas es de 0,3 µ. Daño: Es la consecuencia producida por un peligro sobre la calidad de vida individual o colectiva de las personas. Desinfección: Proceso que mediante el empleo de agentes (sobre todo químicos), es capaz de eliminar los microorganismos patógenos de un material. Generalmente se presentan efectos tóxicos sobre tejidos vivos, por lo que se emplea sólo sobre materiales inertes.

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16. Equipo de Protección Personal (EPP): El equipo de protección personal (PPE-Personal Protection Equipment) está diseñado para proteger a los empleados en el lugar de trabajo, de lesiones o enfermedades serias que puedan resultar del contacto con peligros químicos, radiológicos, físicos, eléctricos, mecánicos u otros. Además de caretas, gafas de seguridad, cascos y zapatos de seguridad, el PPE incluye una variedad de dispositivos y ropa tales como gafas protectoras, overoles, guantes, chalecos, tapones para oídos y equipo respiratorio. 17. Esterilización: Proceso que mediante el empleo de agentes físicos o químicos produce la inactivación total de todas las formas de vida microbiana en forma irreversible (estado esporulado y vegetativo). 18. Ensayo: Operación técnica que consiste en la determinación de una o varias características o el rendimiento de un producto, material, equipo, organismo, fenómeno físico, proceso o servicio dados de acuerdo con un procedimiento especificado. 19. Incidente de trabajo: Situación de riesgo que podría generar la ocurrencia de un accidente de trabajo. 20. Inmunización: Proceso destinado a brindar protección mediante la aplicación de inmunobiológicos (gammaglobulinas, toxoides, vacunas) a personas en riesgo de contraer enfermedades. 21. Laboratorio: Organismo que calibra o ensaya. 22. Laboratorio de ensayo: Es el lugar donde se realizan actividades para la determinación de una o varias características o el rendimiento de un producto, material, equipo, organismo, fenómeno físico, proceso o servicio dados de acuerdo con un procedimiento especificado. 23. Laboratorio de biomedicina: Es en el que se realizan actividades de investigación biomédica relacionadas con enfermedades transmisibles y no transmisibles. 24. Laboratorio médico/laboratorio clínico: Laboratorio para los análisis biológicos, microbiológicos, inmunológicos, químicos, inmunohemato-lógicos, biofísicos, citológicos, patológicos u otros análisis de materiales derivados del cuerpo humano con el propósito de brindar información para el diagnóstico, prevención y tratamiento de las enfermedades o contribuyendo en la salud de los seres humanos. 25. Limpieza: Es el proceso físico por el cual se elimina de los objetos en uso, las materias orgánicas y otros elementos sucios, mediante el lavado con agua con o sin detergente. El propósito de la limpieza no es destruir o matar los microorganismos que contaminan los objetos, sino eliminarlos por arrastre. 26. Microorganismo: Toda entidad microbiológica, celular o no, capaz de reproducirse o de transferir material genético. 27. Muestra para diagnóstico: Es el material de origen humano o animal consistente en excretas, secreciones, sangre y sus componentes, tejidos y líquidos tisulares enviados para diagnóstico. Se excluyen los animales vivos infectados. 28. Peligro: Todo aquello que puede producir un daño o un deterioro de la calidad de vida individual o colectiva de las personas. 29. Peligro biológico: Todo agente biológico y materiales que son potencialmente peligrosos para los seres humanos, animales o plantas. 30. Producto biológico: Es una vacuna producida con microorganismos vivos o atenuados, componentes celulares, reactivos de diagnóstico o productos terapéuticos de naturaleza biológica destinados para uso humano o animal y fabricados según los requisitos estándares. Riesgo: Probabilidad de que ante un determinado peligro se produzca un cierto daño, pudiendo por ello cuantificarse. 31. Sustancia infecciosa: Es aquella que contiene microorganismos viables (bacterias, virus, rickettsias, parásitos, hongos o recombinantes híbridos mutantes) que pueden causar enfermedades tanto en el hombre como en los animales. No incluye toxina que no contiene ninguna sustancia infecciosa.

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MICROBIOLOGÍA RIESGOS EN EL LABORATORIO

Como la Bioseguridad se define como el conjunto de acciones que se ejecutan para proteger la vida y su entorno. El Laboratorio Clínico, es un espacio en donde deben considerarse potenciales riesgos inherentes a la naturaleza de sus actividades, dentro de los que se encuentran:  RIESGOS BIOLÓGICOS: Exposición a: Virus; Bacterias; Hongos, Parásitos y organismos genéticamente modificados.  RIESGO QUÍMICO: Exposición a sustancias químicas potencialmente tóxicas por diversas vías.  RIESGOS FÍSICOS: Ruidos intensos; Vibraciones; Exposición a radiaciones ionizantes y no ionizantes; Ausencia de protección personal (mascarilla, gorra de cirugía, guantes, gafas, ropa esterilizada, zapatos especiales, entre otros); Ausencia de protección colectiva (limpieza del lugar de trabajo, de los instrumentos, falta de ventilación, temperatura ambiental inadecuada.  RIESGO DE ACCIDENTES DE TRABAJO: Accidentes con punzocortantes, quemaduras.  RIESGO DE ENFERMEDADES PROFESIONALES: Dolores asociados a posturas inadecuadas; estrés, fatiga.  RIESGOS ERGONÓMICOS: Manejo de materiales pesados; transportes de aparatos.  RIESGO DE SOBRECARGA PSÍQUICA: Malas relaciones interpersonales en el lugar de trabajo; malas remuneraciones; alejamiento geográfico. CLASIFICACIÓN DE RIESGO POR TIPO DE PATÓGENO Las designaciones del nivel de bioseguridad se basan en una combinación de las características de diseño, construcción, medios de contención, equipo, prácticas y procedimientos de operación necesarios para trabajar con agentes patógenos de los distintos grupos de riesgo. Cuadro 1. Clasificación de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo Grupo de riesgo 1: (riesgo individual y poblacional escaso o nulo). Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser humano o los animales. Grupo de riesgo 2: (riesgo individual moderado, riesgo poblacional bajo). Agentes patógenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de ocasionar un riesgo grave para el personal de laboratorio. La exposición puede provocar una infección, pero existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces y el riesgo de propagación es limitado. Grupo de riesgo 3 (riesgo individual elevado, riesgo poblacional bajo). Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales graves, pero que de ordinario no se propagan de un individuo a otro. Existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces. Grupo de riesgo 4 (riesgo individual elevado, riesgo poblacional elevado). Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades graves en el ser humano o los animales y que se transmiten fácilmente de un individuo a otro, directa o indirectamente. No existen medidas preventivas o terapéuticas eficaces. Fuente: Manual de Bioseguridad en el Laboratorio. Organización Mundial de la Salud. 3ra. ed. 2005.

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TIPIFICACIÓN DE PATÓGENOS POR GRUPO DE RIESGO GRUPO DE RIESGO 1: Agrupa microorganismos que tienen escaso o nulo riesgo de provocar enfermedades. Bacterias Virus Hongos Parásitos Bacilos subtilis Virus de plantas. Saccharomyces sp. Entamoeba coli GRUPO DE RIESGO 2: Agrupa a microorganismos que pueden provocar enfermedades humanas de riesgo moderado. Si provoca una infección al personal de laboratorio, ésta tiene tratamiento y cura. Bacterias Virus Hongos Parásitos Bacteroides fragilis Astroviridae Actinomyces spp.´ Acantamoeba castellani Bartonella baciliformes Coranaviridae Blastomyces dermatitidis Ancylostoma duodenale Bordetella pertussis Parvoridae Candida albicans Ascaris lumbricoides Campylobacter jejuni Papviridae Mucor sp. Balantidium coli Clostridium sp. Parayxoviridae Rhyzopus sp. Leishmania peruviana Corynebacterium spp. Picornaviridae Sporothrix schenkii Giardia lamblia Enterococcus sp. Rubivirus Cryptococcus neoformans Fasciola hepática GRUPO DE RIESGO 3: Agrupa microorganismos que pueden provocar enfermedades humanas graves. Tienen tratamiento, cura limitada. Bacterias Virus Hongos Parásitos Bacillus anthracis Adenoviridae Ajellomyces dermatitidis Echinococcus granulosus Brucella abortus Astroviridae Histoplasma capsulatum Leishmania brasiliensis Mycobacyterium leprae Flebovirus Paracoccidioides brasiliensis Plasmodium falciparum Salmonella tiphi Calciviridae Taenia solium Yersinia pestis Flaviviridae Trypanosoma cruzi GRUPO DE RIESGO 4: Agrupa microorganismos que provocan enfermedades graves en el ser humano. No hay tratamiento para su cura. Solo Virus: Lassa, Guanarito, Junín, Machupo, Sabia, de la fiebre hemorragica de Crimea – Congo, Ébola, de Marburg, Variola (major&minor) virus, Whitepox virus y Morbilli virus equino MEDIDAS DE PROTECCIÓN Las medidas de protección en los laboratorios buscan disminuir la probabilidad de contacto con agentes potencialmente patógenos y/o sustancias que puedan afectar piel y/o mucosas. Las barreras de protección pueden ser individuales y físicas. A. MEDIDAS DE PROTECCIÓN INDIVIDUAL El personal que trabaje en el laboratorio, dependiendo del lugar de trabajo deberá usar como medidas de protección individual, respetando el principio de universal de que “cualquier muestra en el laboratorio deberá ser considerada potencialmente infecciosa”, todos los estudiantes sin ninguna distinción deberán portar al laboratorio los siguientes materiales de protección: a. Mandil o guardapolvo con manga larga, el cual deberá usarse siempre cerrado, para que ejerza su efecto de barrera mecánica. Por ningún motivo se deberá usar el mandil para acudir a áreas diferentes al laboratorio, como áreas de alimentación, áreas administrativas, más aún fuera del área física de laboratorio (incluso a las propias casas) pues por concepto se trata de ropa “SUCIA”, potencialmente infecciosa.

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b. Gafas de seguridad, para disminuir el contacto con aerosoles, debe ser de uso obligatorio en las áreas de recepción de muestras, separación de muestras y áreas de análisis. c. Guantes: De Látex, para la manipulación de muestras y contenedores independientemente del área de trabajo. Debe evitarse el uso de guantes en áreas de circulación de personal administrativo o de público en general. De caucho, para las áreas de Servicios Generales en la ejecución de las tareas de limpieza. d. Zapatos cerrados: para evitar el riesgo de accidentes con muestras. No se usarán sandalias. Esta instrucción aplica a todas las personas que ingresan al laboratorio. e. Otras: Como gorras, mascarillas, guantes de caucho. B. MEDIDAS FÍSICAS DE CONTENCIÓN Son todas aquellas medidas tendientes a separar físicamente a la(s) persona(s) del potencial agente patógeno o agente de riesgo. Las barreras físicas de separación deben aplicarse para áreas particulares como las de microbiología, cultivos celulares y biología molecular. Se consideran como medios físicos de contención también el uso de cabinas de seguridad y cámaras de flujo laminar. La infraestructura de los laboratorios, debe favorecer la disminución de potenciales riesgos, debiendo considerarse al menos:  

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Cada unidad debe tener un lavabo para el lavado de manos e incluir un lavador de ojos. Las superficies de trabajo tienen que ser impermeables y resistentes a los ácidos, álcalis, disolventes orgánicos y al calor moderado. Además hay que calcular una longitud de 2 metros lineales por persona. Deben existir medios de protección contra incendios, para evitar su inicio y propagación. Debe disponerse de una instalación eléctrica segura y de suficiente capacidad. MANEJO Y DISPOSICIÓN DE DESECHOS EN EL LABORATORIO

A. CLASIFICACIÓNDE LOS DESECHOS Por lo general, los laboratorios deben reconocer la existencia de 3 tipos de desechos: 1. Desechos generales o comunes: No representan riesgo adicional para la salud humana y el ambiente; no requieren manejo especial. Mismo grado de contaminación que los desechos domiciliarios. Ejemplo: Papel, cartón, plástico, restos alimenticios. 2. Desechos infecciosos: Contienen gérmenes patógenos, se encuentran: a. Desechos de laboratorio: cultivo de agentes infecciosos, placas Petri, láminas de frotis, etc. b. Desechos anátomo–patológicos: órganos, tejidos o partes corporales extraídas mediante cirugía autopsia, biopsia u otro procedimiento. c. Desechos de sangre: sangre de pacientes, suero, plasma u otros componentes, insumos usados para toma de muestras de laboratorio. d. Desechos cortopunzantes: agujas, pipetas de equipos, tubos primarios, tubos secundarios, copas, bajalenguas, isopos, palillos, entre otros. 3. Desechos especiales: Desechos provenientes de reactivos o materiales no infecciosos utilizados en el laboratorio (Ejemplo: reactivos vencidos). Escuela de Estomatología UCV - Piura

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B. SEPARACIÓN DE PUNTO PRIMARIO Los desechos deben separarse directamente en las áreas de trabajo, asegurando la clasificación en desechos infecciosos, especiales y generales o comunes. Cada una de las áreas de laboratorio deberá disponer al menos de los siguientes tipos de recipientes perfectamente rotulados e identificados: a. Recipientes para basura común (tachos con bolsas negras). b. Recipientes para basura infecciosa, que incluyen:  Tachos con bolsas rojas para almacenar desechos potencialmente infecciosos NO CORTOPUNZANTES.  Recipientes de plástico resistente y de boca angosta para DESECHOS CORTOPUNZANTES de plástico resistente de boca angosta; se llenarán hasta no más de las ¾ partes de su capacidad; no deben contener por ningún concepto ningún tipo de líquidos para evitar la generación de aerosoles.  Los desechos especiales: (Ejemplo: frascos de reactivos, toners de impresoras), deben almacenarse en recipientes de cartón rotulados DESECHOS ESPECIALES.

MICROSCOPÍA ÓPTICA: MANEJO Y CUIDADOS El microscopio es un instrumento óptico que nos permite ver de cerca y aumentados objetos pequeños o detalles estructurales imperceptibles a simple vista. Es de mucha utilidad en el campo médico, con aplicaciones en el campo del diagnóstico y en la valoración clínica de trastornos o enfermedades en el hombre. Por ser los fotones (partículas elementales de la energía de todo el espectro luminoso desde el infrarrojo al ultravioleta) los que se utilizan para formar imágenes en los microscopios comunes, se le ha propuesto denominarlo microscopio fotónico, aunque se acepta unánimemente la de microscopio común u óptico. El desarrollo y perfeccionamiento del microscopio en los últimos años, ha permitido ampliar el campo de las investigaciones biológicas y se ha convertido en uno de los instrumentos básicos para abrir fronteras en la Biología. El microscopio es un instrumento que permite observar una imagen amplificada de un objeto pequeño. La imagen puede ser observada directamente, fotografiada o proyectada, dependiendo de la naturaleza y del uso que haya de hacerse de esta imagen. RESOLUCIÓN DE UN MICROSCOPIO: Se denomina así a la capacidad del microscopio de distinguir dos puntos vecinos individualmente. Dos puntos luminosos pueden formar imágenes separadas Escuela de Estomatología UCV - Piura

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siempre que exista entre ellos una distancia mínima llamada “límite de resolución”(r), si la distancia que separa dos puntos es menor que r, formarán una sola imagen, es decir se confunden. MICROSCOPIO ÓPTICO PARTES DEL MICROSCOPIO: Se pueden agrupar en cuatro sistemas: El sistema de soporte, el sistema de aumento, el sistema de iluminación, y el sistema de ajuste. A. EL SISTEMA DE SOPORTE 1. EL PIE: Es la parte que sostiene al microscopio, asegurando perfecta estabilidad del aparato en posición vertical, inclinada u horizontal. Presenta diferentes formas siendo la más común la de herradura. 2. LA COLUMNA, BRAZO O BASTIDOR: Es la parte articulada al pie por medio de una bisagra, sostiene la platina, el tubo óptico, lleva los tornillos macrométrico y micrométrico. Generalmente tiene la forma de un arco, es por donde se toma para su traslado de un lugar a otro. 3. LA PLATINA: Es una plancha metálica colocada en posición horizontal, presenta un orificio en la parte central que permite el paso de luz proveniente del sistema de iluminación. En algunos modelos la platina lleva adherida un par de pinzas que sirven para sujetar la lámina porta-objeto o un carro móvil (charriot) para el desplazamiento del preparado hacia la derecha o izquierda durante la observación. 4. EL REVOLVER: Es un dispositivo metálico de forma circular, atornillado en la parte inferior del tubo óptico, gira sobre su eje central; presenta 3 o 4 orificios a los que van atornillados los objetivos. Este dispositivo sirve para cambiar la posición de los objetivos durante las observaciones. B. EL SISTEMA DE AUMENTO 1. EL OCULAR. Denominado así porque va cerca al ojo del observador, dispuesto en un tubo cilíndrico de metal, con un diafragma intermedio, ambos lentes presentan las caras planas hacia el ojo del observador y las caras convexas hacia el objeto. La lente que va cerca al ojo del observador se denomina ocular propiamente dicho y la lente inferior como lente de campo; en la parte lateral y superior del tubo cilíndrico lleva una numeración que indica el número de aumento propio del ocular. El más común es el de 10X. 2. OBJETIVOS. Llamado así porque va cerca del objeto a observar, constituye la parte más importante del microscopio de los cuales depende su alcance. Está constituido por un tubo metálico cilíndrico cónico, que lleva en su interior un sistema de lentes destinados a dar la imagen real e invertida del objeto. a. Objetivos Secos. Son aquellos en los que, entre el lente frontal y el preparado a observar, no existe sustancia alguna, excepto el aire. Se utiliza generalmente para observaciones de preparados en fresco. Los más comunes son de 4X, 10X y 40X. b. Objetivos de Inmersión. Son aquellos en los que, entre el lente frontal y el preparado a observar, se interpone una sustancia líquida, comúnmente el aceite de cedro, cuyo índice de refracción es de 1.5; se utilizan generalmente para observaciones de preparados en seco. El más común es el de 100X. De acuerdo a la procedencia lleva una franja o una raya negra o blanca para facilitar su identificación.

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C. SISTEMA DE ILUMINACION: Se encuentra ubicado en la parte inferior de la platina y comprende: 1. Fuente de Luz: Antiguamente estaba constituido por un espejo de forma circular, sujeto por medio de un eje giratorio. Se utilizaba para enviar los rayos luminosos hacia el preparado. Actualmente la mayoría de microscopios compuestos presentan una fuente de luz eléctrica incorporada, constituida por una lámpara de 15 vatios. 2. El diafragma: Es un dispositivo constituido por un sistema de laminillas metálicas dispuestas concéntricamente, de tal forma que permita cerrar y abrir, regulando de esta manera la entrada de luz emitida por el espejo. 3. El condensador: Es un dispositivo constituido, por un sistema de dos o más lentes montadas dentro de un cilindro cónico truncado de metal, está situado por debajo de la platina. Este sistema óptico sirve para concentrar o condensar los rayos luminosos emitidos por el espejo; funciona accionando un tornillo. 4. Porta filtro: Es un dispositivo que permite colocar filtros de diferentes colores, los cuales facilitan la observación. D. EL SISTEMA DE AJUSTE: El sistema comprende: 1. TORNILLO MACROMETRICO. Se utiliza primero para lograr la aproximación del enfoque. Se encuentra situado en la parte superior o inferior de la columna, permite desplazamiento del tubo óptico y de la platina. 2. TORNILLO MICROMETRICO. Hace que el objetivo se desplace más lentamente. Se encuentra situado por debajo del macrométrico. En los microscopios modernos, el micrométrico y el macrométrico se encuentran accionados por un solo tornillo. 3. TORNILLO DE AJUSTE DEL CONDENSADOR. Se utiliza para elevar el condensador y aumentar la iluminación o descenderlo y reducir la iluminación. 4. TORNILLOS PARA CENTRAR EL CONDENSADOR. Se usan para centrar el condensador exactamente en relación con el objetivo. 5. ELEVADOR DEL DIAFRAGMA IRIS. Es un pequeño elevador fijado al condensador. Se mueve para cerrar o abrir el diafragma, reduciendo o aumentando así el ángulo y la intensidad de la luz. 6. REGULADORES DE LA PLATINA METALICA. Se utilizan para desplazar el portaobjeto sobre la platina (presente en los microscopios mejorados). ILUMINACION Y ENFOQUE La iluminación y enfoque son dos condiciones principales para realizar una observación microscópica. La iluminación se consigue utilizando fuentes luminosas adecuadas, que pueden ser: natural o artificial. Los rayos de luz son reflejados por el espejo o por la lámpara de iluminación hacia el objeto o preparado. Cuando se examina con grandes aumentos, la luz debe ser intensa, en cambio cuando se hacen con menores aumentos, la luz debe ser menos intensa, lo que se consigue desplazando en forma vertical (arriba o abajo) al condensador, y graduando la abertura del diafragma. Obtenida la iluminación conveniente, se efectuará el enfoque del preparado, utilizando primero el macrométrico hasta encontrar la imagen (enfoque aproximado), y por último accionando el tornillo micrométrico que permite el enfoque perfecto (visualización de la imagen). CONDICIONES NECESARIAS PARA LA ILUMINACIÓN Y ENFOQUE: Son las siguientes: 1. Objetivo a menor aumento (panorámico). Escuela de Estomatología UCV - Piura

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2. Diafragma abierto. 3. Lámpara encendida. 4. Descienda el objetivo hasta que se encuentre inmediatamente por arriba de la preparación que se encuentra en el portaobjetos. 5. Utilizando el tornillo macrométrico eleve el objetivo hasta que observe una imagen clara a través del ocular. AMPLIFICACION Cuando se trabaja en el laboratorio con el microscopio, es de gran importancia conocer los grados de aumento o de magnificación de los objetos observados. Así tenemos que, el grado de aumento es la amplificación que ha sufrido la imagen del objeto que está siendo observado. Para obtener la amplificación se multiplica el número de aumento del ocular por el número de aumento del objetivo. Ejemplo: La lente ocular presenta el número 10X y el número de la lente del objetivo es 4X, el poder de amplificación del microscopio cuando se trabaja simultáneamente con estas dos lentes será de: Amplificación: 10X x 4X = 40 diámetros. AUMENTO DE LA OBSERVACIÓN Pare determinar el aumento al cual se está observando una muestra en particular, se debe multiplicar el valor del lente ocular por el valor del lente objetivo. Aumento = (Valor del lente ocular) (Valor del lente objetivo)

Así por ejemplo: Lente ocular empleado = 10x, Lente objetivo utilizado = 4x Aumento = (10x) (4x) = 40x; es decir, 40 veces de su imagen real. MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES: 1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición de observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda. 2. Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo. 3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica. 4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el microscopio. 5. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menos recomendable). En cualquier caso se pasará el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden dañar las lentes y su sujeción. 6. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico, platina, revólver y condensador).

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7. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a través del ocular. 8. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún líquido, secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño humedecido en xilol. 9. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión práctica y, al acabar el curso, encargar a un técnico un ajuste y revisión general de los mismos. FACTORES QUE DAÑAN AL MICROSCOPIO: a. Lavar las lentes con alcohol. b. Mojar los objetivos con xilol o alcohol, o bien con alguna otra sustancia. c. Usar papel ordinario para limpiar las lentes. d. Poner los dedos sobre las lentes. e. Limpiar el soporte o la platina con xilol o alcohol Isopropílico. f. Limpiar el interior de las lentes con tela o papel, en caso de que sea completamente necesario, utiliza un pincel de cerdas muy pequeñas y/o utiliza papel seda. g. Dejar el microscopio sin oculares. h. Guardar el microscopio con aceite de inmersión en el objetivo. i. Transportar el microscopio con una sola mano. II. COMPETENCIAS:  Conoce y aplica las normas de bioseguridad durante el desarrollo de las prácticas de microbiología.  Utiliza adecuadamente y con responsabilidad el microscopio óptico dentro del laboratorio. III. MATERIAL Y MÉTODOS: 3.1. Materiales: a. De Laboratorio:  Microscopios ópticos  Estereomicroscopio b. Del Alumno: (por mesa de trabajo)  01 caja de láminas portaobjeto  01 caja de laminillas cubreobjeto 3.2. Procedimiento: Manejo y uso del microscopio óptico: 1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería estar en esas condiciones. 2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas. 3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición). Para realizar el enfoque: a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos.

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b. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítido la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.  Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3.  El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión.  Empleo del objetivo de inmersión: - Bajar totalmente la platina. - Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite. - Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo entre éste y el de x40. - Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz. - Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión. - Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente. - Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande. - Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3. - Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación. - Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio. IV. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 1. Dirección General de Salud Ambiental (DIGESA). Agencia Internacional de Cooperación del Japón. Manual de difusión técnica No 01: Gestión de los residuos Peligrosos en el Perú. Lima; 2006. 2. Chiriboga M., Sáenz K., Sánchez M., Montalvo G. Guía Básica de Bioseguridad para Laboratorios de Atención Primaria. Quito; 2010. 3. Organización Mundial de la Salud. Manual de Bioseguridad en el Laboratorio. 3a Ed. Ginebra; 2005. 4. Ministerio de Salud. Subsecretaria de Programas de Prevención y Promoción Programa de Vigilancia de la Salud y Control de Enfermedades (CDC). Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud. Bioseguridad en Laboratorios de Microbiología y Biomedicina. 4a ed. Atlanta, Georgia; 2010. 5. Ministerio de Salud. Dirección General de Salud Ambiental. Plan Nacional de Gestión de Residuos Sólidos en Establecimientos de Salud y Servicios Médicos de Apoyo 2010-2012. Lima; 2010. 6. Negroni M. MICROBIOLOGÍA ESTOMATOLÓGICA. Fundamentos y Guía práctica. 2ª ed. Buenos Aires: Médica Panamericana; 2009. Escuela de Estomatología UCV - Piura

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MORFOLOGÍA BACTERIANA: COLORACIONES MICROBIOLÓGICAS I. INTRODUCCIÓN: La coloración y la observación microscópica de las bacterias revelan su tamaño, morfología y tipos de agrupaciones, características que son de ayuda para la identificación bacteriana. Las bacterias tienen alrededor de 1 µm de diámetro y 0.2 a 3-4 µm de largo y poseen tres formas básicas; las cocáceas o cocos (bacterias de forma esférica); los bacilos (bacterias de forma cilíndrica) y las espiroquetas (bacterias con forma de espiral). Muchas especies bacterianas, especialmente las cocáceas, permanecen unidas luego de su división, dando origen a distintas agrupaciones que facilitan su identificación presuntiva. Las agrupaciones están determinadas por el plano de división bacteriana y la mayor o menor tendencia de las bacterias a permanecer unidas. Todas las células son demasiado pequeñas para ser observadas por el ojo humano, por lo que es esencial el uso del microscopio para evaluar la forma y estructura de estas. Además, se debe tener en cuenta dos factores de gran importancia:  Para que el objeto sea percibido a través del microscopio, este debe de poseer cierto grado de contraste con el medio circundante.  El microscopio debe poseer un poder de resolución suficiente para permitir la percepción, como objetos separados, de dos puntos adyacentes muy próximos en la imagen. Distinguimos dos tipos de microscopía: óptica y electrónica. Dentro de la primera tenemos, a su vez, microscopía de campo claro, de campo oscuro, de contraste de fase, ultravioleta y de fluorescencia mencionados en la práctica anterior. En la microscopía óptica, muchas veces es necesaria la utilización de colorantes. Un colorante es sustancia química orgánica de naturaleza variable. Los colorantes aumentan el contraste, estos constan de dos partes en su molécula: grupo cromóforo (confiere el color) y grupo auxocromo (confiere su capacidad a comunicar el color a la estructura). Los colorantes se clasifican en función al grado de ionización o a su origen. En microbiología, el uso de colorantes es fundamental para la identificación de la morfología bacteriana. Y como se sabe, inicialmente se clasificaron a las bacterias según la técnica propuesta por Christian Gram, 1844, en Gramnegativas (rojas) y Grampositivas (violetas).

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II. COMPETENCIAS:  Distingue al microscopio las distintas morfologías bacterianas.  Conoce los diferentes tipos de coloraciones empleadas en microbiología.  Realiza inequívocamente una tinción Gram y explica su fundamento. III. MATERIAL Y MÉTODOS: 3.1. Materiales: a. De Laboratorio (por mesa de práctica).  03 Microscopios  03 mecheros bunsen o de alcohol.  Cultivo de Staphylococcus aureus en caldo (2 mL).  Cultivo de Bacillus sp. en caldo (2 mL).  Cultivo de Escherichia coli en caldo (2 mL).  06 Tubos de ensayo de 13 x 100 mm en gradilla.  02 Asas bacteriológicas en anillo.  100 mL de agua destilada  Set de GRAM: Cristal violeta, Lugol, Alcohol-acetona, Safranina.  Set BK: Ziehl Neelsen, Alcohol-ácido, Fucsina fenicada de Ziehl.  Tinción de espirilos: Líquido de Rouge (ácido acético glacial 1mL, formol 2 mL y agua destilada 100 mL). Alcohol de 96o, ácido tánico al 5%. Solución de fontana (Colocar solución de nitrato de plata al 5 % y agregar, gota a gota, una solución de amoníaco al 5 % hasta opalescencia. Seguir agregando amoníaco hasta clarificación de la solución y finalmente agregar solución de nitrato de plata hasta ligera opalescencia. La solución debe prepararse en el momento de usarse).  Colorante azul de metileno.  Colorante verde de malaquita.  Colorante nigrosina o tinta china negra. b. Del Alumno: (Individual)  Manual de prácticas impreso y anillado.  Libreta de apuntes y lapicero.  Barreras de bioseguridad personal: Guantes descartables, mascarilla descartable y toca o gorro  01 Marcador indeleble c. Del alumno: (Grupal)  Paquete de hisopos de toma de muestra microbiológica (por mesa de trabajo).  Caja de láminas portaobjeto.  Caja de laminillas cubreobjeto.  Caja de mondadientes 3.2. Procedimiento: 3.2.1. Preparados para microscopia óptica: Procedimiento General. Los pasos fundamentales previos a una coloración son: extendido, secado y fijado. a. Extendido: se coloca una pequeña porción de la muestra en un portaobjetos y se extiende con el asa en forma circular en el centro de la lámina. Para muestras provenientes de medios sólidos, debe colocarse previamente una gota de agua sobre el portaobajetos. b. Secado: puede dejarse secar el extendido a temperatura ambiente, o colocar a 30-40 cm sobre la llama del mechero. Escuela de Estomatología UCV - Piura

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c. Fijado: la fijación tiene como finalidades evitar el desprendimiento del preparado durante la coloración así como también preservar la forma original de los microorganismos. El procedimiento más común es pasar el preparado 3 veces por la llama del mechero. Sin embargo, esta técnica no es conveniente para ciertas coloraciones para las cuales deben utilizarse procedimientos más suaves. Algunos agentes fijadores utilizados son etanol, metanol, formol, sales de mercurio, tetróxido de osmio, ácido pícrico, etc. Debe tenerse en cuenta que, luego del procedimiento de coloración, los preparados pueden contener microorganismos viables, en especial si hay esporos. Por consiguiente siempre deben considerarse como potencialmente riesgosos y manejarse con precaución. 3.2.2. Coloración simple 1. Extender, secar y fijar por calor. 2. Aplicar solución de colorante durante alrededor de 2 minutos. En general, el tiempo de la coloración depende de la concentración y del colorante utilizado. 3. Lavar con agua corriente. 4. Secar entre papeles de filtro y observar con objetivo de inmersión. 3.2.3. Tinción negativa 1. Colocar sobre un portaobjetos, con la ayuda de un asa, una gota de una solución acuosa de nigrosina al 10 %. 2. Tomar una porción del cultivo, suspender en la gota de nigrosina y extender en forma circular en el centro de la lámina. 3. Dejar secar (no exponer al calor) y observar con objetivo de inmersión. 3.2.4. Tinciones compuestas y específicas 3.2.4.1. Coloración de Gram.  Prepare un extendido con los cultivos bacterianos proporcionados y con el sarro dentario de la manera ya conocida. Déjelo secar y fíjelo por calentamiento sobre la llama del mechero.  Cubra el extendido con la solución de cristal violeta y déjelo actuar por un minuto. Escurra el exceso de colorante y lave a chorro suave con agua de caño o con piseta.  Agregar solución de Lugol y dejar actuar durante un minuto. Elimine el exceso de Lugol y decolore con una mezcla de alcohol-acetona hasta que no se desprenda más colorante de la preparación (15 segundos). Lave con agua corriente.  Aplique solución de safranina y déjela actuar por 30 segundos. Elimine el colorante y lave. 3.2.4.2. Coloración de Ziehl Neelsen.  Prepare un extendido con la muestra indicada por el docente. Déjelo secar y fíjelo por calentamiento sobre la llama del mechero.  Coloque la lámina en el soporte apropiado y cubra el extendido con fucsina fenicada de Ziehl concentrada y caliente suavemente hasta la emisión de vapores. No debe dejarse hervir el colorante. Sostenga el calentamiento por 3 minutos.

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 Lave con agua corriente y decolore con alcohol-ácido hasta que deje de eliminar colorante. Lave con agua corriente y cubra el extendido con la solución de azul de metileno y déjelo actuar por 1 minuto.  Lave nuevamente con agua corriente, escúrralo y deje secar al ambiente. observar con objetivo de inmersión. 3.2.4.3. Coloración de Espirilos 1. Extender la muestra a examinar sobre un portaobjetos. Si la muestra es sanguinolenta deshemoglobinizar con líquido de Rouge (ácido acético glacial 1 ml, formol 2 ml y agua 100 ml). Lavar con agua corriente. 2. Fijar vertiendo alcohol sobre el preparado, dejando escurrir y encendiendo el alcohol. Apagar inmediatamente. 3. Cubrir con la solución de ácido tánico (5 %) y calentar con hisopo encendido hasta emisión de vapores. 4. Mantener la emisión de vapores durante 30 segundos cuidando que no hierva la solución. Lavar con abundante agua destilada. 5. Cubrir con solución de Fontana en frío, mover el preparado hasta que tome color castaño claro. Calentar y mantener emisión de vapores durante 15 segundos. 6. Lavar con agua destilada, secar entre papeles de filtro y observar con objetivo de inmersión. 3.2.4.4. Coloración de Esporas: Según método de Dorner. 1. Preparar una suspensión del cultivo a analizar en 1 mL de agua destilada. Añadir 1 mL de fucsina fenicada (solución acuosa de fucsina 1 % y fenol 5 %) y colocar la mezcla en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos. 2. Tomar una asada del material y colocar en un portaobjetos. Añadir una asada de una solución acuosa, saturada, fresca y filtrada de nigrosina (10 %). Mezclar bien y extender en forma de circular en el centro de la lámina. 3. Dejar secar y observar con objetivo de inmersión. IV. FUNDAMENTACIÓN: 4.1. Coloración simple Esta coloración permite la observación de la morfología y agrupación de los microorganismos. Se realiza con un solo colorante. Entre los colorantes más utilizados para realizar coloraciones simples podemos nombrar el cristal violeta y el azul de metileno que se utilizan en soluciones acuosas al 1 %. 4.2. Coloración negativa Para esta coloración, se utilizan sustancias que no penetran en la célula y por lo tanto se tiñe el fondo quedando los microorganismos incoloros. Normalmente el tamaño de las bacterias observadas por esta técnica es mayor que el real y no debe utilizarse para la medición de microorganismos. Los agentes más utilizados son la nigrosina y la tinta china y los microorganismos quedan incluidos en el colorante que forma una capa relativamente gruesa. Con este método pueden observarse morfología y agrupación así como también estructuras extracelulares como la cápsula.

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4.3. Coloración GRAM Esta coloración fue ideada por el bacteriólogo danés Christian Gram en el año 1883 y ha demostrado ser de suma utilidad. Permite agrupar a los microorganismos en Gram (+) y Gram (-) lo cual reviste especial importancia taxonómica. En esta técnica, el preparado fijado por calor se trata primeramente con cristal violeta, luego se agrega Lugol como mordiente, se decolora con alcohol-acetona y finalmente se contracolorea con safranina. Las bacterias Gram (+) serán las que resulten violetas luego del procedimiento de coloración de Gram mientras que las Gram (-) se verán rojas. La explicación de las diferencias en el comportamiento tintorial entre bacterias Gram (+) y Gram (-), debe buscarse en la estructura y composición de la pared celular bacteriana. La pared de las bacterias Gram (+) está constituida fundamentalmente por una gruesa capa de peptidoglucano (20-30 nm), que es un polímero de N- acetil glucosamina y ácido N-acetil murámico. Las cadenas de peptidoglucano, se unen a través de puentes formados por aminoácidos, en arreglos que varían de una especie bacteriana a otra. En esta capa podemos también encontrar ácidos teicoicos, formados por ésteres fosfato de glicerol o ribitol, y ácidos lipoteicoicos cuya estructura es similar a los ácidos teicoicos pero se hallan anclados a la membrana citoplasmática. En las bacterias Gram (-), la capa de peptidoglucano es mucho más delgada (3-5 nm) y poseen una membrana externa de estructura compleja en cuya composición intervienen fosfolípidos, proteínas y lipopolisacáridos. En la figura puede observarse una representación de las paredes celulares de organismos G (+) y G (-). GRAM +

GRAM –

Al tratar los preparados con cristal violeta y Lugol, se forman agregados entre el colorante y el mordiente que durante el proceso de decoloración, no pueden ser extraídos de las bacterias Gram (+) Escuela de Estomatología UCV - Piura

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debido a la gruesa capa de peptidoglucano. En las bacterias Gram (-), la mezcla decolorante puede atravesar fácilmente la capa de lípidos de la membrana externa y la delgadez de la capa de peptidoglucano presente, permite la extracción de los agregados y, por consiguiente, del color violeta. Al ser tratadas con safranina, las bacterias Gram (-) tomarán el color del colorante de contraste. En esta coloración, el paso crítico es la decoloración, ya que si se prolonga demasiado resultarán decoloradas aún las bacterias Gram (+). Debe tenerse en cuenta asimismo, que como la integridad de las envolturas celulares resulta fundamental para lograr una buena diferenciación, debe trabajarse en lo posible con cultivos jóvenes. Es importante mencionar, que la clasificación en Gram (+) y Gram (-) no puede aplicarse a todas las bacterias ya que hay algunas que no pueden colorearse con esta técnica o para las cuales no tiene sentido esta clasificación. 4.4. Coloración de Ziehl-Neelsen La pared celular de los bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR) está compuesta por una gran cantidad de lípidos tanto libres como covalentemente unidos: los ácidos micólicos y los micósidos. La alta proporción lipídica otorga a estas bacterias una gran hidrofobicidad, con la consiguiente tendencia a formar agregados y la dificultad para captar colorantes que hace necesaria la utilización de métodos drásticos. Se utiliza fucsina fenicada en caliente, luego un paso de decoloración con ácido-alcohol y una contracoloración con azul de metileno. La mezcla decolorante no podrá extraer el colorante de los BAAR que permanecerán rojas mientras que las demás bacterias se verán azules. Entre las bacterias ácido-alcohol resistentes más representativas se encuentran las pertenecientes al género Mycobacterium, al cual pertenecen los agentes etiológicos de la tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis) y de la lepra (Mycobacterium leprae). Esta coloración es de suma importancia diagnóstica. Otro género de bacterias que se colorean mediante esta técnica es Actinomyces.

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4.5. Coloración de Espirilos y Espiroquetas Existen bacterias de forma espiralada que son llamadas en forma general espirilos aunque debe hacerse una aclaración: los espirilos son bacterias con morfología helicoidal y un cuerpo bastante rígido, que se mueven mediante flagelos, pero existe otro tipo de microorganismos con la misma morfología que se llaman espiroquetas cuyo cuerpo es flexible y tienen flagelos internos. Las espiroquetas están formadas por un cilindro protoplasmático constituido por el citoplasma, la región nuclear, la membrana citoplasmática y la pared celular. El cilindro protoplasmático se halla rodeado a su vez por una membrana multilaminar llamada capa externa en cuya composición intervienen proteínas, lipoproteínas, polisacáridos y fosfolípidos. Alrededor del cilindro protoplasmático se encuentran un número variable de flagelos periplásmicos que, según la especie, puede variar entre 2 y más de 100. La composición química de los flagelos es similar a la de otros flagelos bacterianos. A diferencia de otras bacterias móviles, las espiroquetas pueden desplazarse en medios de alta viscosidad a través de un movimiento de sacacorchos. Entre los géneros de bacterias espiraladas del tipo de las espiroquetas, podemos nombrar Treponema (el Treponema pallidum es el agente etiológico de la sífilis), Borrelia y Leptospira. En general, estos microorganismos son demasiado delgados para poder ser visualizados mediante microscopía óptica y por lo tanto deben engrosarse. En la técnica de Fontana – Tribondeau, se usa ácido tánico como mordiente y luego se realiza una impregnación argéntica con nitrato de plata amoniacal (solución de Fontana). Es importante que los lavados se realicen con agua destilada libre de cloruros ya que de otra manera precipitaría cloruro de plata. En los casos en que la muestra contenga sangre, debe deshemoglobinizarse con líquido de Rouge (ácido acético – formaldehído – agua). Al aplicar esta técnica de coloración, se verán los microorganismos marrón oscuro sobre fondo amarillento. 4.6. Coloración de Esporas Algunas bacterias, son capaces de producir formas de resistencia a través de un proceso llamado esporulación. Este proceso de diferenciación, está codificado genéticamente y permite a los microorganismos sobrevivir hasta que las condiciones exteriores sean favorables para el desarrollo. Los géneros de bacterias capaces de esporular hasta ahora descriptos son Bacillus, Clostridium y Sporosarcina por lo cual la presencia de esporas en una bacteria es de gran utilidad taxonómica. Estructuralmente, las esporas bacterianas están rodeadas por gruesas envolturas y tienen muy bajo contenido de agua. El córtex o corteza, está compuesto por un peptidoglucano que contiene menos enlaces cruzados que el correspondiente a la pared celular. La cubierta está formada por una proteína del tipo de la queratina con gran cantidad de puentes disulfuro. Esta capa es fundamental para la resistencia de la espora a los agentes físicos y químicos. El exosporium es de naturaleza lipoproteica. Asimismo poseen en su composición química, una alta concentración de dipicolinato de calcio, que es una sustancia que no se encuentra en las células vegetativas, y que estaría involucrada en la eliminación de agua durante el proceso de esporulación. Estas características, dan cuenta de la resistencia de las esporas a los agentes físicos y químicos y de la dificultad que presentan para ser coloreados. Cabe aclarar que una vez coloreados son difíciles de decolorar. En todas las técnicas para colorear esporas se utilizan procedimientos drásticos. Describiremos las técnicas de Dorner y de Moeller. Para la coloración de esporos según Dorner, se sensibiliza y colorea al esporo con fucsina fenicada en caliente y luego se extiende sobre nigrosina. La nigrosina extraerá el colorante de todas las estructuras celulares excepto de las esporas y por consiguiente, se verán las esporas rojas, el resto de la bacteria incolora y el fondo oscuro. La técnica de Moeller utiliza ácido crómico y fucsina fenicada Escuela de Estomatología UCV - Piura

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en caliente para sensibilizar y colorear la espora. La decoloración se realiza con ácido-alcohol y se contracolorea con azul de metileno. Se observan las esporas rojas y el resto de la bacteria azul. Si bien es cierto que con otras coloraciones las esporas se verán incoloras, en algunos casos las bacterias pueden presentar zonas sin colorear que no corresponden a esporas y debe confirmarse su presencia mediante una coloración específica. Otro aspecto que debe tenerse en cuenta al observar esporas es su posición: terminal, subterminal o central, y si deforman o no a la bacteria ya que serán características que ayudarán en la clasificación.

V. RESULTADOS: Observaciones microscópicas.

Muestra: Coloración: Aumento: Observación:

Muestra: Coloración: Aumento: Observación:

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Muestra: Preparado: Coloración: Aumento: Observación:

Muestra: Preparado: Coloración: Aumento: Observación:

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 1. Montoya HH. Microbiología básica para el área de salud y afines. 2a. Editorial Universidad de Antioquia. Colombia; 2008. 2. Koneman EW., Allen SD., Jorda WM., Procop GW., Schreckenberger PC., Woods GL. Diagnóstico microbiológico. 6a. Editorial médica: Panamericana. Argentina; 2008. 3. Davis B., Dulbecco R., Eisen H., Ginsberg H., Wood W. Tratado de Microbiología. Editorial Salvat. Buenos Aires. Argentina; 1983. 4. Basualdo J., Coto C., De Torres R. Microbiología Biomédica. Editorial Atlante Argentina S. R. L; 1996. 5. Velasco J., Araque M., Araujo E., Longa A., Nieves B., Ramírez A., Sánchez K., Velazco E. Manual práctico de bacteriología clínica. Colección Textos Universitarios. Universidad de los Andes. Colombia; 2008.

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PRÁCTICA N

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MEDIOS DE CULTIVO Y TÉCNICAS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO MICROBIANO I. INTRODUCCIÓN: Dos conceptos para analizar, el término medio es el nexo para conseguir algo, en este caso, es que la vida continúe, y el proceso de cultivar es buscar que los seres vivientes sigan con su existencia, el término cultivar lo usan otros pensadores, como la acción de hacer o crear, en los seres vivientes es hacer algo para multiplicar o crecer. Así las bacterias aparecen dentro de la evolución de las especies y su estudio hubiese sido muy difícil si no se hubieran diseñado medios de cultivo dónde poderlos estudiar. Años han pasado desde que se comenzó a cultivar microorganismos fuera de su hábitat, en ambientes diseñados en un laboratorio o cerca de su entorno natural, así es como el hombre ha creado ambientes y productos químicos para proporcionarle a los microorganismos los nutrientes necesarios para que puedan vivir y reproducirse. Un medio de cultivo es el alimento para las bacterias. Nutrientes y ecología artificial para preservar la vida de los microorganismos fuera de su hábitat natural. Hoy en día, las técnicas de cultivo, para aislar y de crecimiento de los microorganismos, se han desarrollado notablemente con requisitos nutricionales específicos. Por lo tanto un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Puesto que la diversidad metabólica de los microorganismos es enorme, la variedad de medios de cultivo es también muy grande. La mayoría de los medios de cultivo se comercializan en forma de liofilizados que es preciso rehidratar. Todo medio de cultivo debe contener: fuente de carbono, de nitrógeno, presentar un equilibrio acido-base (pH) y estar libre de gérmenes contaminantes. A. Constituyentes habituales de los medios de cultivo:  Agar: Se utiliza como agente solidificante. Es un polisacárido que se obtiene de ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de degradarlo.  Carbohidratos: Son una fuente de carbono para los microorganismos. Los más empleados son la glucosa, la lactosa y la sacarosa.  Extractos: Son preparados de ciertos órganos o tejidos animales o vegetales obtenidos con agua y calor. Ej.: extracto de carne, de levadura, de malta, etc.  Peptonas: Son proteínas hidrolizadas, se obtienen por digestión química o enzimática de proteínas animales o vegetales.  Fluidos corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguíneo son añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos microorganismos patógenos.  Sistemas amortiguadores. Son sales que se añaden al medio para mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano. Ej.: fosfatos bisódicos o bipotásicos.  Indicadores de pH. Se incorporan a los medios de cultivo para dar prueba visual del pH y otros cambios producidos durante el crecimiento de la bacteria. Los indicadores no deben ser tóxicos.  Agentes reductores. Sustancias que se añaden al medio para crear las condiciones que permitan el desarrollo de los gérmenes microaerófilos o anaerobios. Ej.: cisteína y tioglicolato. Escuela de Estomatología UCV - Piura

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 Agentes selectivos. Sustancias como el cristal violeta, las sales biliares etc. que a determinadas concentraciones en el medio actúan como agentes selectivos frente a determinados microorganismos. - Bilis. Contiene varios ácidos biliares como compuestos conjugados con aminoácidos. También contiene pigmentos, como bilirrubina y biliverdina. - Sales biliares. Son extraídas de la bilis, inhiben el crecimiento de microorganismos Gram positivos y bacilos que forma esporas, sin afectar el desarrollo de los bacilos entéricos gramnegativos. B. Clasificación de los Medios de Cultivo:  Por su naturaleza:  Naturales: Ejemplo. Leche, Suero, papa.  Artificiales: Son de composición química conocida y constante, producidos en una fábrica o laboratorio: constituidos en su mayor parte por sales inorgánicas, peptonas y carbohidratos. Ejemplo. Agar Nutritivo.  Por su estado físico  Líquidos: Caldos.  Semisólidos: Medio Cary – Blair.  Sólidos: Agar nutritivo. (todos los medios que llevan agar de 13 – 18 %).  Por su Aplicación a. Medios comunes: Permiten el desarrollo de una gran variedad de Microorganismos. Ejemplo: agar común, caldo nutritivo, caldo peptona. b. Medios Especiales: Presentan constituyentes esenciales. Se dividen en:  Medios mejorados o enriquecidos: Son medios comunes a los que se les agrega aditivos orgánicos como sangre, albumina, suero, yema de huevo, liquido ascítico, etc. Se emplean para el cultivo de gérmenes exigentes. Ejemplo: Agar Sangre, Medio Lowenstein, Caldo Suero.  Medios selectivos o de aislamiento: Tienen por objeto facilitar el desarrollo de determinado grupo de Microorganismos, inhibiendo a la vez otros acompañantes, proveniente de muestras que contengan flora mixta. Ejemplo: Agar Acida de Sodio, Agar Chapman, Agar telurito de Potasio.  Medios selectivos diferenciales: Son semejantes a los medios de aislamiento pero contienen además un sustrato definido y un indicador de pH. Tienen por objeto permitir el desarrollo de un determinado grupo de estos y diferenciarlos según la utilización del sustrato, observándose la variación del pH del medio por el cambio de color del indicador. Ejemplo: Agar MacConkey, Agar salmonella-Shigella.  Medios Diferenciales: Permiten poner de manifiesto algunas propiedades bioquímicas de los gérmenes. Se caracteriza por tener uno o más sustratos específicos como carbohidratos, sales, etc. y un indicador de pH. Ejemplo: Caldo Lactosado, Caldo Urea, Agar TSI. C. Preparación, Esterilización y Servido de los Medios de Cultivo  Preparación y Esterilización: Pesar la cantidad de gramos indicados en el frasco para una cantidad de agua destilada. Utilizar papel de aluminio y evitar que caigan residuos fuera del área de pesado. Transferir el medio de cultivo al recipiente de preparación este debe ser un matraz o un balón de fondo plano. Adicionar la medida de agua destilada lentamente y disolver bien con ayuda de una cocina o un baño maría Escuela de Estomatología UCV - Piura

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hirviente. Enfriar y ajustar el pH si fuere necesario. Colocar el tapón de algodón y cubrir con un pedazo de papel kraft cuadrado, anotar el nombre del medio y amarrar a la boca del matraz con hilo pabilo, llevar los medios al autoclave y esterilizar a 121 oC por 15 minutos, terminada la esterilización dejar el autoclave baje su presión a cero para luego abrir la misma, retirar los frascos y se agitan por rotación para que la mezcla sea homogénea.  Servido: En la mesa limpia y desinfectada, a lado de un mechero encendido se procede a servir los medios de cultivo en placas Petri, tubos de ensayo y en viales.

MÉTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO MICROBIANO El cultivo de microorganismos es una actividad que requiere del conocimiento de técnicas de siembra o inoculación y de aislamiento para transferirlos de un medio a otro, o mantener su crecimiento y actividad. Es indispensable para realizar diversos estudios morfológicos, de identificación, bioquímicos, de patogenicidad y ecológicos, entre otros. Existen diferentes técnicas de siembra: por suspensión de la muestra en medios líquidos; extensión de diluciones de un cultivo en superficie de medios en placa de Petri; por estría en placa de Petri y en tubos con medios solidificados en forma inclinada; por piquete o picadura en tubos con medios sólidos o semisólidos. Con la aplicación de cada técnica se obtiene información de importancia para el estudio básico o aplicado de los microorganismos de interés. En la naturaleza, los microorganismos generalmente se encuentran en poblaciones, formando parte de comunidades de gran complejidad, por lo que uno de los objetivos de estudio más importantes en microbiología es aislarlos. El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayoría de los casos, mediante la técnica de estría cruzada para producir colonias aisladas en cultivos sólidos y así, obtener un cultivo puro o axénico, también conocido como cepa, que contiene un solo tipo de microorganismo con la misma composición genética. Cuando la técnica por estría se aplica para aislar un microorganismo de interés a partir de mezclas donde se encuentra en pequeñas cantidades, generalmente se obtendrán las bacterias dominantes. En este caso, se utilizan medios selectivos o de enriquecimiento, los que contienen nutrientes especiales, antibióticos, altas concentraciones de sales y/o condiciones de pH, luz o temperatura que incrementarán la población del microorganismo de interés y se facilitará su aislamiento. Si se agregan a los medios de cultivo otros componentes como: sangre, colorantes, indicadores, es posible distinguir entre especies bacterianas por la forma en que metabolizan los sustratos y que se manifiesta por cambios en la apariencia del pH del medio de cultivo. Estos medios se conocen como medios diferenciales y son de gran utilidad para la caracterización e identificación de especies bacterianas. II. COMPETENCIAS:  Reconoce y diferencia a los medios de cultivo sólidos/líquidos; comunes/especiales.  Utiliza técnicas de siembra y medios de cultivo adecuados para aislar bacterias patógenas humanas.

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MICROBIOLOGÍA III. MATERIAL Y MÉTODOS:

3.1. Materiales: a. De Laboratorio (por mesa de trabajo)  03 Placas con cada uno de los siguientes medios de cultivo: Agar Mueller – Hinton, agar nutritivo, agar Sangre, agar chocolate, agar MacConkey, agar manitol salado, agar SS, agar cetrimide y agar sabouraud.  06 Tubos con cada uno de los siguientes medios de cultivo: TSI, LIA, Citrato de Simmons, caldo úrea, caldo RM-VP, medio SIM, caldo nutritivo.  Cultivo microbiano en caldo.  Cepa bacteriana en vial.  09 tubos de ensayo estériles.  03 asas bacteriológicas (02 en anillo y 01 en punta). Equipos instrumentos y otros  01 Incubadora microbiológica  03 mecheros bunsen o de alcohol b. Del Alumno: (individual)  Manual de prácticas impreso y anillado.  Libreta de apuntes y lapicero.  Barreras de bioseguridad personal: Guantes descartables, mascarilla descartable y toca o gorro  01 Marcador indeleble c. Del alumno: (Grupal)  Paquete de hisopos de toma de muestra microbiológica (por mesa de trabajo). 3.2. Procedimiento: Para realizar la siembra es necesario observar las siguientes reglas microbiológicas:  Limpiar y desinfectar el área de trabajo antes de empezar el trabajo y al finalizar.  Colocar todo el material que se requiera para la siembra sobre la mesa de trabajo.  Evitar las corrientes de aire. No hablar durante la siembra.  Esterilizar el asa bacteriológica antes y después de la siembra.  Emplear medios de cultivo estériles. 3.2.1. Siembra de microorganismos en medios líquidos La siembra se realiza llevando el inoculo o la muestra con el asa en anillo o en punta al medio líquido y se deposita o mezcla. También pueden emplearse pipetas estériles. Flameado

Flameado

Muestra

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Inoculación

Incubación

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3.2.2. Siembra de microorganismos en medios semisólidos Colocar la muestra por puntura en el Medio Gelatina, utilizando el asa en punta. Sembrar también en Medio Tioglicolato; luego de la inoculación, agitar suavemente los tubos por rotación entre las palmas de las manos para obtener una dispersión. Flameado Flameado

Muestra

Medio semisólido

Incubación

3.2.3. Siembra de microorganismos por diseminación en superficie Se emplean porque ofrecen mayor área de siembra y permiten diferenciar a los microorganismos por sus características culturales. Con el asa bacteriológica tomar la muestra y realizar un estriado muy junto en el primer tercio de la placa (agotar) y luego realizar estrías en forma de zigzag más separadas hasta el lado opuesto. También se puede realizar el estriado utilizando los cuadrantes de la placa; en dos cuadrantes o cuatro cuadrantes. A). 1 cuadrante

b). 2 Cuadrantes

c). 4 Cuadrantes

3.2.4. Siembra en tubos con agar inclinado Se emplean tubos de prueba con agar inclinado o pico de flauta. La siembra se realiza mediante estrías en la superficie inclinada y en algunos casos se realiza una puntura hasta las dos terceras partes de profundidad; o una puntura seguida de estrías en la superficie. En estos casos se emplea el asa bacteriológica en punta.

Asa en punta.

Pico de flauta

Siembra en estría en superficie inclinada.

Siembra en profundidad (Picadura profunda) Escuela de Estomatología UCV - Piura

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3.2.5. Siembra por difusión en placa - por incorporación: Utilizado para el recuento total de gérmenes a partir de una muestra líquida. La siembra se realiza colocando una alícuota (1 mL.) de la muestra sobre la superficie de una placa Petri estéril vacía. Luego agregar de 12 a 15 mL. de agar Nutritivo enfriado a 45 – 50ºC. Homogenizar mediante movimientos de rotación y traslación. Dejar solidificar. Las placas se llevan luego a incubación. Colonias de superficie

SIEMBRA POR EXTENSIÓN EN SUPERFICIE: Incubación

La muestra se pipetea sobre la superficie del agar (0,1 mL o menos).

Resultado típico de la siembra por extensión en superficie.

La muestra se extiende uniformemente utilizando un asa de Drigalsky estéril.

Colonia debajo del medio de cultivo.

SIEMBRA POR INCORPORACIÓN O VERTIDO EN PLACA Incubación

La muestra se pipetea en una placa estéril.

Se añade medio de cultivo estéril y se mezcla bien con el inóculo.

Resultado típico de la siembra por vertido en placa o incorporación.

Colonia de superficie

3.3. Manejo de residuos. Todo el material de vidrio que tenga contacto con microorganismos debe ser esterilizado en autoclave a 121°C /15 libras de presión / 15 minutos para descarte o reutilización. IV. RESULTADOS: Pinta los medios de cultivo observados en práctica y responde lo que se le solicita.

Nombre: Utilidad:

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Nombre: Utilidad:

Nombre: Utilidad:

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Nombre: Utilidad:

Nombre: Utilidad:

Nombre: Utilidad:

V. FUNDAMENTACIÓN: Los medios de cultivo se utilizan para diferentes propósitos: la enumeración, el aislamiento de ciertos tipos de bacterias, el mantenimiento de cultivos para su uso posterior y para facilitar el reconocimiento de algún tipo de bacteria en particular. Frecuentemente, en el laboratorio se requiere aislar un tipo de bacteria a partir de una mezcla de diversos tipos. Para ello, se ha diseñado diversos medios de cultivo que favorece el crecimiento de la bacteria de interés e inhibe el resto. Entre estos tenemos: a. Medios generales: Permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos no exigentes, también son usados como medios de cultivo base para la preparación de otros medios (enriquecidos y selectivos). b. Medios de enriquecimiento: Favorece el crecimiento de un determinado tipo de microorganismos, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto. Son medio generales o usuales a los que se les añade: suero, sangre o factores esenciales específicos como vitaminas o cofactores. Permiten el crecimiento de bacterias exigentes como estreptococos, neumococo, gonococo y otras. Ejemplo: Agar sangre, Agar chocolate, Agar Mueller- Hinton c. Medios selectivos: Permite el crecimiento de un tipo microbiano determinado, inhibiendo el desarrollo de los demás pues dentro de su composición presentan sustancias inhibitorias para algunos microorganismos. d. Medios diferenciales: Son aquellos en los que se ponen en relieve propiedades que posee un determinado tipo de microorganismo. Ejemplos de Medios de cultivos selectivos diferenciales: Agar Mac Conkey, Agar manitol salado, agar xilosa-lisina-desoxicolato (XLD), Medio de Lowenstein–Jensen, Chromagar, Agar con inhibidor de hongos filamentosos, y otros. VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 1. Garcia V. Introducción a la Microbiología. En línea [Consultado el17 de febrero del 20017]. Disponible en: https://books.google.com.pe/books?isbn=9968313580. 2. Gamazco C., López I., Díaz R. Manual Práctico de Microbiología. 3a. Editorial Masson S.A. España; 2005. 3. Prast G. Microbiología clínica. Editorial medica Panamericana. Buenos Aires.2007. 4. Murray R. Microbiología Médica. 7a. Editorial: Elsevier. Madrid. 2013.

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OBSERVACIÓN DE EFECTOS CITOPÁTICOS CAUSADOS POR VIRUS I. INTRODUCCIÓN: Para cultivar virus se utilizan tipos específicos de células de cultivo tisular. Los cultivos de células primarias se obtienen por tratamiento de algún órgano animal específico con tripsina o colagenasa. Las células obtenidas con este método se cultivan en monocapa (fibroblasto o células epiteliales) o en suspensión (linfocitos) en medios artificiales complementados con suero bovino o alguna otra de factores de crecimiento. Las células primarias se pueden separar con tripsina, se diluyen y crecen en nuevas monocapas (subcultivos) para convertirse en cultivos celulares secundarios. Las líneas de células diploides son cultivos de un único tipo de células con los que se puede hacer un gran número de pases, aunque finito, antes de presentar signos de senescencia o experimentar cambios significativos en sus características. Las líneas celulares tumorales y las líneas celulares inmortalizadas, iniciadas a partir de tumores de pacientes o por efecto de virus o compuestos químicos respectivamente, se componen de células de un solo tipo que pueden ser sometidas a pases continuos sin envejecer. Las células primarias de riñón de mono son muy adecuadas para llevar a cabo el aislamiento del virus de la gripe, paramixovirus, muchos enterovirus y alguno adenovirus. Las células diploides fetales humanas, que generalmente son fibroblastos, permiten el crecimiento de un amplio abanico de virus (VHS, VVZ, CMV, adenovirus, picornavirus). Las células HeLa, una línea continua de células epiteliales derivadas de un cáncer humano son excelentes para aislar el VRS, los adenovirus y los VHS. Muchos virus con importancia clínica se pueden aislar con algunos de estos cultivos celulares. Se denomina efecto citopático (ECP) a los cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica, causados durante el ciclo de replicación viral. Estos efectos se usan para reconocer las células infectadas por virus en un cultivo. Los efectos citopáticos inducidos por los virus se pueden examinar con un microscopio de luz invertida de baja potencia. Se determinan características como redondeamiento y contracción de las células, aumento de la refractabilidad, fusión o formación de sincitios, agregación, pérdida de adherencia y lisis o muerte celular. Los efectos citopáticos se producen como resultado de:  Ingreso del virus en el huésped (paso a través de la membrana plasmática)  Inhibición de la transcripción celular o estimulación de la actividad de la RNA polimerasa celular  Interacciones del virus con las vías de procesamiento del RNA  Interacciones del virus con el aparato de traducción  Respuesta del huésped a la infección viral Los efectos citopático pueden ser identificados en cultivos no fijados y no teñidos con baja iluminación del microscopio, pero la fijación de la monocapa ayuda a tener mayor detalle en el diagnóstico y de esta forma se pueden observar cuerpos de inclusión o células gigantes. Los cuerpos de inclusión formados durante la replicación viral tienen afinidad por los colorantes ácidos y pueden encontrarse en el citoplasma de las Escuela de Estomatología UCV - Piura

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células nerviosas, denominados cuerpos de Negri, para el diagnóstico de la rabia; en el núcleo como el virus de la laringotraqueitis, o en ambos como el virus del sarampión. El análisis más ampliamente utilizado para el virus infectante es la demostración de formación de placas al inocular monocapas con diluciones adecuadas del virus. Los métodos para el diagnóstico de la rabia deben ofrecer condiciones óptimas de precisión, rapidez y economía. Dentro de estas técnicas está la investigación microscópica de los corpúsculos de Negri, que se realizan en un frotis de tejido encefálico infectado con el virus rábico y es teñido por la técnica de Sellers. Los efectos citopáticos son los criterios más simples y utilizados con más frecuencia para reconocer las infecciones virales, aunque no todos los virus causan estos efectos. Por tal razón deben usarse otros métodos para detectar las infecciones virales. La práctica consistirá en la visualización del efecto citopático de los virus VHS, CMV y virus rabia. II. COMPETENCIAS:  Reconoce efectos citopáticos causados por virus en láminas con montaje permanente y semipermanente.  Fundamenta la importancia del reconocimiento de efectos citopáticos virales como una herramienta de diagnóstico viral rápido. III. MATERIAL Y MÉTODOS: 3.1. Materiales: a. De Laboratorio:  Formación de placas en cultivo celular primario  03 Microplacas de cuatro pozos estéril  01 Campana de flujo laminar horizontal o cabina de seguridad nivel II  03 Matraz de tripsinización, 03 Probetas de 100 mL, vasos de precipitado de 50, 100 y 250 mL (03 de cada uno), 12 Tubos de vidrio con tapón de rosca 15 x125 mm estériles, pipetas de 1.0 a 10.0 mL y micropipetas de 1000 µL.  25 mL de suspensión de fibroblastos en medio MEM  25 mL Medio MEM y 25 mL de Suero de bovino  01 Incubadora a 37ºC y 01 Microscopio óptico  100 mL de Caldo triptosa fosfato (TPB) y 100 mL de Solución salina buferada (SSB pH 7.2)  Un vial de Gentamicina  02 Bombillas de seguridad  01 Vacuna comercial  Carboximetil celulosa  100 mL de metanol al 20% y de Hipoclorito de sodio al 2% y 20 mL de Cristal violeta al 1% 

Formación de corpúsculos de Negri por virus rábico (tinción de Sellers)  Estuche de disección  01 pliego de papel filtro  Colorante de Sellers  Soporte para tinción  200 mL de solución amortiguadora de fosfatos pH 7.5  Cronómetro

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Observación de células citomegálicas en orina  09 Beakers de 100 y 250 mL  12 Tubos de vidrio con tapón de rosca 15 x125 mm estériles o de plástico de primer uso  12 Tubos de 16 x 150 mm.  06 Pipetas de 5 mL.  01 caja de láminas portaobjetos.  200 mL de alcohol-éter al 50%.  500 mL de Buffer fosfato pH 7.2.  Set para coloración de hematoxilina Eosina.  Centrífuga refrigerada.  Mechero bunsen o de alcohol

b. Del Alumno: (Individual)  Manual de prácticas impreso y anillado.  Guardapolvo limpio en bolsa de transporte (en su defecto guardapolvo descartable).  Libreta de apuntes y lapicero.  Barreras de bioseguridad personal: Guantes descartables, mascarilla descartable y toca o gorro.  01 Marcador indeleble.  01 fosforo o encendedor. c. Del Alumno (Grupal)  02 Embriones de pollo SPF de 9 -11 días de edad.  02 Ratones de 3 - 5 semanas de nacidos.  Orina fresca de mujer gestante (indiferente el tiempo de gestación).  Orina fresca de estudiante (indiferente el sexo).  02 Tijeras rectas  10 Baja lenguas 3.2. Procedimiento: 3.2.1. Formación de Placas en cultivo celular primario 1. Ya preparada una suspensión de fibroblastos de embrión de pollo con la concentración celular indicada por cada ml en medio de cultivo MEM, como se señaló anteriormente, 2. Distribuir 2.0 ml de suspensión celular en microplacas de cuatro posos con tapa. Incubar las placas a 37ºC en presencia de atmósfera de CO2 durante 72 horas y en alta humedad. 3. Reconstituir el virus y diluirlo por dilución decimal. 4. Retirar el medio de cultivo de los pozos e Inocular el virus diluido con 0.5 ml por pozo, utilizar dos pozos por dilución. 5. Esperar 60 minutos a 37 cultivo suplementando con 1% de suero y con 1.5% de carboximethil celulosa, incubar a 37°C, en presencia de CO2 y humedad abundante nuevamente. 6. A las 48 o 72 horas post inoculación, observar el monoestrato celular para detectar la formación de placas bajo el microscopio de luz invertida. 7. Lavar la monocapa con solución salina buferada PBS de forma suave y eliminar el sobrenadante. 8. Fijar la monocapa con 1% de cristal violeta en 20% de metanol por 5minutos para observar al microscopio invertido o de luz normal el número de placas formadas por dilución viral.

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3.2.2. Formación de corpúsculos de Negri por virus rábico (tinción de Sellers) 1. Con ayuda del equipo de disección y de las tijeras de punta fina se realizará un corte entre ambas fosas orbitales del ratón. 2. Se levanta la piel y músculos de la cara y cabeza para exponer el cráneo. 3. Se dobla el cuello del ratón para exponer el agujero magno. 4. Se inserta la punta de una tijera para cortar el hueso y se corta la bóveda hasta exponer el cerebro. Se saca integro el cerebro desprendiéndolo de la base del cráneo (incluyendo cerebelo y parte de la medula). Se saca integro el cerebro desprendiéndolo de la base del cráneo (incluyendo cerebelo y parte de la medula). 5. Con el bisturí se hace una sección transversal tomando un fragmento del cerebro que contenga el asta de Ammon o cuerpo de Ammon del hipocampo donde los corpúsculos de Negri son especialmente visibles. Preparación de la impronta 1. En el extremo de un baja lenguas se coloca una banda de papel filtro y sobre este se pone el corte del cerebro del ratón. Luego en un portaobjetos se hacen de 3 a 4 impresiones del cerebro, tomando ligeramente y haciendo presión hasta que quede marcado en el porta objetos la silueta de la pieza de cerebro a estudiar. 2. Se realiza la tinción de Sellers de acuerdo al siguiente metodología: a. Cubrir la impronta con el colorante de Sellers durante 15 segundos. b. En seguida enjuagar con buffer pH = 7.5. c. Dejar secar al aire y observar al microscopio con objetivo de inmersión. 3. Observar y describir las células nerviosas, no se apreciarán los corpúsculos de Negri pues el riego de manejar virus rábico es muy alto (solo se simulará que el ratón está infectado). 3.2.3. Observación de células citomegálicas en orina  Procesamiento de la orina 1. Colocar 5 mL de orina en un tubo plástico con tapa rosca y agregar 5 mL de alcohol-éter al 50%. Agitar mecánicamente hasta conseguir una mezcla homogénea. Dejar a temperatura ambiente durante 10 min y luego centrifugar a 1500 rpm durante 15 minutos. Descartar el sobrenadante. 2. Agregar al sedimento 5 mL de buffer fosfato pH 7.2, mezclar y transvasar a otro tubo con tapa rosca. Centrifugar a 1500 rpm durante 15 minutos y descartar el sobrenadante. Repetir este lavado por dos veces. 3. Después del último lavado, descartar el sobrenadante y a partir del sedimento realizar extensiones en láminas portaobjetos, si el sedimento está muy denso agregar buffer fosfato pH 7.2. Dejar secar a temperatura ambiente durante 24 horas. Colorear con hematoxilina Eosina o Giemsa y observar a 400 aumentos las células citomegálicas. 

Coloración Hematoxilina Eosina 1. Fijar la muestra en alcohol éter al 50% durante 20 minutos. Secar a temperatura ambiente. 2. Colorear con hematoxilina durante 10 minutos, luego lavar con agua de caño. Decolorar en ácido clorhídrico al 0,5% introduciendo y sacando inmediatamente la lámina. 3. Lavar con agua de caño. Fijar en amoniaco al 1% durante 3 minutos y decolorar con alcohol de 95%. Decolorar con alcohol al absoluto y aclarar con xilol por dos veces. Finalmente secar a temperatura ambiente.

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MICROBIOLOGÍA IV. RESULTADOS: Graficar las observaciones realizadas.

Muestra: Preparado: Coloración: Aumento: Observación:

Muestra: Preparado: Coloración: Aumento: Observación:

Muestra: Preparado: Coloración: Aumento:

Observación:

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V. FUNDAMENTACIÓN: 5.1. EFECTO CITOPÁTICO: Se conoce como efecto citopático al aspecto macroscópico e histológico del daño producido por un virus en un cultivo celular el cual es un importante criterio de diagnóstico ya que muchos virus causan efectos citopáticos característicos. Entre los cambios citopáticos en la células se encuentran los siguientes: 5.1.1. Degeneración: Se refiere a todas las lesiones causadas por los virus en el tejido afectado, este daño es causado por distintos factores como son la síntesis de proteínas toxicas por parte del virus dentro de la célula o por la acumulación de proteínas víricas que van a afectar la configuración original de la célula; el virus al sintetizar sus proteínas impide que la célula sinteticé sus proteínas estructurales lo que provoca la degeneración de esta hasta llegar a la muerte. 5.1.2. Corpúsculo: Un cambio característico de las células infectadas por virus es la formación de cuerpos de inclusión identificables por microscopia óptica con ayuda de tinciones. Dependiendo del virus estos cuerpos de inclusión pueden ser simples o múltiples, grandes o pequeños, redondos o irregulares, intranucleares o intracitoplasmáticos y acidófilos o basófilos; estos cuerpos de inclusión son formados por acumulación de viriones o de componentes virales como agregados cristalinos, es decir fábricas de virus donde los componentes virales están siendo sintetizados; Estos cuerpos de inclusión también pueden ser causados por agentes químicos y bacterias. Ejemplo:(Corpúsculos de Negri-virus de la rabia). 5.1.3. Fusión celular: Es una característica de la infección de monocapas celulares por paramixovirus, herpes virus, coronavirus y poxvirus es la formación de sincitios también llamados policariocitos o células gigantes, esto se da por cambios en la membrana celular que determinan la fusión de las células infectadas con las células vecinas no infectadas. 5.1.4. Incorporación de antígenos a la membrana plasmática: En muchas infecciones víricas se insertan proteínas codificadas por el virus en la membrana plasmática de las células infectadas por virus RNA por ejemplo: influenza, paramixovirus y togavirus. Estas glicoproteínas víricas no se insertan al azar en la membrana si no que indican el lugar en el que ha de madurar el virus. Estos antígenos en la membrana constituyen la diana para los mecanismos inmunitarios específicos del organismo los cuales pueden destruir la célula antes de que se produzca un número significativo de nuevos viriones. 5.1.5. Muerte celular: El evento terminal de muchas relaciones virus-célula es la muerte celular causado por virus citocidas, la apariencia del daño producido en los cultivos celulares es utilizado como criterio de diagnóstico; la muerte celular puede ser causada por la suspensión de la síntesis del ARN y de las proteínas del huésped lo que es incompatible con la vida de este, otra causa puede ser el acumulo de proteínas virales toxicas para la célula como las proteínas de la cápside, las proteínas de viriones se congregan en grandes cristales agregados o en inclusiones que distorsionan a la célula, otra causa es que las células infectadas se hinchan bastante lo que provoca cambios en la permeabilidad de la membrana, eventualmente las enzimas lisosomales de la célula se derraman en el citoplasma dando lugar a la digestión autolítica de la célula. VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 1. Carballal G., Oubiña J. Virología Médica. Ed. El ateneo. Argentina; 1998. 2. Díaz R., Gamazo C., López G. Manual práctico de virología. 2da Edición. Editorial Masson. S.A. Barcelona; 1999. 3. Ruiz M., Santillán J., Morales E. Manual de Laboratorio de Virología. Facultad de Química. Universidad Autónoma del estado de México. México D.F; 2012.

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DIAGNÓSTICO CLÍNICO DE LAS MICOSIS Y OBSERVACIÓN DE ESTRUCTURAS FÚNGICAS I. INTRODUCCIÓN: Durante la última década se han incrementado las enfermedades micóticas, sobre todo las de tipo oportunista, ello ha significado la aparición de nuevas formas clínicas de micosis, además de la presencia de nuevas especies fúngicas consideradas antiguamente como no patógenas pero que excepcionalmente producían enfermedad en individuos inmunodeprimidos. Diversos factores han permitido la aparición de infecciones emergentes: cambios poblacionales, avances tecnológicos y desarrollo económico de algunos países, permitiendo la generalización de tratamientos médicos quirúrgicos invasivos, con supervivencia de enfermos que difícilmente superaban procesos patológicos y que favorecen el desarrollo de micosis sistémicas; nuevos mecanismos de adaptación de algunos microorganismos que conlleva a la aparición de resistencia a los antifúngicos e infección por VIH. Actualmente se reconocen casi 400 especies de hongos causantes de micosis sistémicas, las cuales constituyen un pequeño porcentaje del total de más de 100 000 especies catalogadas. Se prefiere mencionar un “comportamiento oportunista” por parte del hongo, debido a que los patógenos primarios al infectar a individuos inmunosuprimidos, se comportan con mayor agresividad, originando infecciones sistémicas, diseminadas, de evolución aguda y mal pronóstico. Las infecciones oportunistas se producen cuando los mecanismos de defensa específicos e inespecíficos del huésped son ineficaces, mientras que las sistémicas o diseminadas se producen cuando fallan los mecanismos celulares de defensa. La mayoría de las micosis oportunistas siguen siendo ocasionadas por las especies clásicas: Candida albicans, Aspergillus fumigatus, Cryptococcus neoformans. El aumento en la prevalencia de las infecciones fúngicas ha sido constante en los últimos años, y se relaciona con el incremento de pacientes inmunocomprometidos y con el uso generalizado de antimicrobianos, la utilización de inmunosupresores, maniobras diagnósticas invasoras y la implantación de alimentación parenteral. Junto a estas micosis (oportunistas), coexisten otras micosis primarias, causadas por hongos muy adaptados para la supervivencia en los tejidos infectados. Algunas se comportan como micosis profundas, y se caracterizan porque se distribuyen en determinadas zonas geográficas, donde son endémicas. Otras, ubicuas, se caracterizan por afectar a piel y mucosas: las dermatomicosis y candidosis de las mucosas. Con menos frecuencia, se encuentran las micosis subcutáneas, caracterizadas por la agresividad local y que suelen contar con antecedentes traumáticos que justifican la inoculación del hongo. El cultivo sigue siendo el "gold standard" del diagnóstico microbiológico, ya que permite la identificación del agente etiológico y la realización del estudio de sensibilidad. Sin embargo, no está exento de inconvenientes: la necesidad de obtener muestras por métodos invasores, la posible contaminación de la muestra, su dificultad para diferenciar fácilmente entre infección y colonización, la baja sensibilidad que presenta y su lentitud para el diagnóstico. Las pruebas de sensibilidad a los antifúngicos están basadas en las técnicas de microdilución en caldo, que se desarrollaron para conocer la actividad in vitro de los antibacterianos. Estas técnicas determinan la CMI (concentración mínima inhibitoria), que se obtiene calculando porcentajes de inhibición respecto a un control de crecimiento. Escuela de Estomatología UCV - Piura

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1. MICOSIS SUPERFICIALES 1.1. COSMÉTICAS. Son las que afectan la capa córnea de la piel y la porción suprafolicular del cabello y vellos, generalmente asintomáticas por la poca o nula respuesta inmune. a) Pitiriasis versicolor Producida por especies del hongo lipofíilico Malassezia: M. furfur, M. globosa, M. obtusa, M. restricta, M. slooffiae, M. sympodiales, hongo que puede ser colonizante de la epidermis; se relaciona con la presencia de ciertos aminoácidos y compuestos hidrófobos en la piel, así como la disminución del recambio epitelial del estrato córneo. b) Tiña negra palmar Infección crónica del estrato córneo causada por el hongo levaduriforme dematiaceo Phaeoannelomyces wernekii, que consiste en lesiones maculares color oscuro afectando principalmente las palmas de las manos y las plantas de los pies, rara vez en la cara. c) Piedra negra Son nódulos duros, negros, adheridos a la porción extrafolicular del cabello, producida por la forma sexual del hongo Piedraia hortae. d) Piedra blanca. Son nódulos blandos de color blanquecino que se pueden localizar en vellos de cejas, bigote o pelo escrotal y vulva, al igual que en cabello de la cabeza. Es producida por colonización de especies del hongo levaduriforme Trichosporum: T. asteroides, T. beigelii / T. cutaneum, T. inkin, T. mucoides, T. ovoides, T. pullulans. Este hongo también se ha asociado a fungemia en pacientes inmunosuprimidos, especialmente VIH positivos. 1.2. CUTÁNEAS. Se refiere a una diversidad de cuadros clínicos en los que están involucrados la piel y sus anexos. Las manifestaciones en piel son prurito, eritema y descamación; en cuero cabelludo son alopecia e invasión al cabello tipo endothrix, ectrothrix y tipo fávico; y en uñas, onicomicosis. a) Dermatofitosis Producida por un grupo de hongos queratinolíticos identificados como dermatofitos: Microsporum, Trichophyton, Epidermophyton. Sus cuadros clínicos se denominan tiñas y se encuentran entre las infecciones más prevalentes a nivel mundial en países en desarrollo y son T. capitis y T. fávica (cuero cabelludo), T. barbae, T. córporis, T. manum, T. ungium, T. cruris y T. pedis. b) Dermatomicosis Son infecciones crónicas que afectan la piel altamente queratinizadas de palmas, plantas, uñas y espacios interdigitales. Los cuadros clínicos son muy similares a las tiñas producidas por dermatofitos, pero el tratamiento es diferente. Dentro de los principales agentes etiológicos están los hongos hialinos como el Scytalidium dimidiatum, S. hyalinum, Fusarium sp, Aspergillus spp, especies de Cándida y especies del género Phialophora, Curvularia, Alternaria, Bipolares, etc. 2. MICOSIS PROFUNDAS 2.1. SUBCUTANEAS Son infecciones del tejido celular subcutáneo, adquiridas por trauma con material contaminado por hongos saprofitos ambientales. Afectan la dermis y epidermis y las manifestaciones clínicas son crónicas; se pueden caracterizar por ser inflamatorias y granulomatosas.

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a) Esporotricosis. El hongo que la produce se denomina Sporothrix schenkii. Después de un período de incubación de 15 a 30 días (se ha reportado hasta 2 años) se produce una lesión nodular, denominada chancro, en el tejido cutáneo y subcutáneo en el sitio de inoculación. b) Cromoblastomicosis. Micosis producida por un grupo de hongos dematiaceos, tales como Fonsecae pedrosoi, Fonsecae compactum, Phialophora verrucosa, Cladosporum carrionii y Rhinocladiella aquasperma. c) Lobomicosis. Producida por el hongo Loboa loboi, con lesiones crónicas tipo queloides en sitios anatómicos expuestos, como por ejemplo la región sacra, miembros inferiores, superiores y región auricular. d) Rinosporidiasis. El agente etiológico no es un hongo, es un microorganismo acuático perteneciente al reino Stromophila denominado Rhinosporidium seeberii. e) Eumicetomas. Infección de carácter crónico que se adquiere por trauma con material contaminado por hongos como Madurella mycetomatis y Exophiala sp. f) Faeohifomicosis. Infección por inoculación traumática de hongos dematiaceos, como por ejemplo Alternaria alternata, Bipolaris spicifera, Curvularia geniculata, Exophiala jeanselmei, Exophiala moniliae, Wangiella dermatitidis. g) Hialohifomicosis. Infección por inoculación traumática de hongos hialinos a nivel subcutáneo, pero también puede cursar con compromiso sistémico. Los pacientes inmunocomprometidos los pueden adquirir por vía aérea, por ejemplo infección por Fusarium spp, y Aspergillus spp. 2.2. SISTÉMICAS. Este tipo de micosis se adquieren por inhalación de propágulos de los hongos que están en el medio ambiente, muchas veces en nichos ecológicos muy restringidos. Causan cuadros clínicos que dependen del estado inmunológico del huésped y de la cantidad de propágulos inhalados, y pueden ser desde cuadros asintomáticos inespecíficos, hasta procesos pulmonares granulomatosos; en pacientes inmunocomprometidos se manifiesta de forma generalizada. a) Histoplasmosis. Es producida por el hongo Histoplasma capsulatum variedad capsulatum, quien predomina en América, desde el sur de Canadá hasta Argentina, y la variedad duboisii en el África; su nicho son cuevas de murciélagos, gallineros y palomares. b) Blastomicosis. Infección causada por Blastomyces dermatitidis, cuyo nicho ecológico es el suelo de gallineros, corrales y establos, terrenos con alto contenido orgánico, abonados o con deyecciones de animales, pH ácido y elevada humedad. c) Coccidioidomicosis. Infección causada por Coccidioides inmitis en zonas endémicas desde el sudoeste estadounidense, Centro América, Venezuela, Paraguay hasta la Patagonia en Argentina. La inhalación de artroconidios puede causar un cuadro pulmonar con o sin diseminación sistémica principalmente en pacientes inmunocomprometidos. d) Paracoccidioidomicosis. Micosis granulomatosa producida por el hongo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis, restringido a zonas boscosas de los grandes ríos y lagos del Brasil, Venezuela, Colombia, Paraguay y norte de Argentina. e) Criptococosis. Infección subaguda o crónica pulmonar o meníngea causada por Cryptococcus neoformans, hongo ubicuo en la naturaleza principalmente en excretas de palomas (variedad neoformans y grubii) y detritus de árboles (variedad gatti). Las levaduras desecadas y de menor tamaño son inhaladas, llegan a espacios alveolares, pero el desarrollo de la enfermedad depende de la respuesta del sistema inmune celular.

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2.3. OPORTUNISTAS. Este tipo de micosis involucra especies de hongos que forman parte de la microbiota ambiental o son comensales de la piel y mucosa, y quienes habitualmente son eliminadas por el sistema inmune celular. Cuando hay deficiencia de la respuesta inmune, alteraciones de la flora bacteriana por suministro de antibióticos o la existencia de enfermedades de base en el paciente, como por ejemplo la diabetes o enfermedades mieloproliferativas con neutropenia, pueden causar una infección diseminada fatal para el paciente. a) Candidiasis sistémica: Es la micosis más frecuente. Es producida por Candida albicans y otras especies del mismo género, capaces de invadir sangre y otros órganos profundos. Las levaduras de Candida son colonizadoras de la mucosa rectal, vaginal y bucal, por lo que las infecciones pueden ser endógenas. b) Aspergilosis sistémica: Es producida por especies del género Aspergillus. Aspergillus fumigatus es el agente causal de más del 90% de los casos de aspergilosis invasora; se adquiere por inhalación de conidios, que germinan e invaden los tejidos. c) Zigomicosis: Infecciones causadas por hongos pertenecientes a los mucorales: Mucor spp, Rhizomucors spp, Rhizopus spp, Cunninhanella spp, etc. Su hábitat es la materia orgánica en descomposición. Causan cuadros principalmente subcutáneos.. d) Pneumocistosis: Neumonía causada por el hongo Pneumocystis jiroveci y que afecta pacientes inmunocomprometidos, principalmente VIH positivos. II. COMPETENCIAS:  Reconoce estructuras fúngicas y valora su importancia en la identificación de hongos.  Diferencia los hongos tipo levadura de los mohos. III. MATERIAL Y MÉTODOS: 3.1. Materiales: a. De Laboratorio:  10 Microscopios ópticos  02 Estereomicroscopios  Láminas montadas con diferentes estructuras fúngicas.  Placas de Petri con colonias de hongos (levadura y moho).  Colorante azul de lactofenol.  Hidróxido de potasio al 10%. b. Del Alumno (Individual)  Manual de prácticas  Guardapolvo limpio  Libreta de apuntes y lapicero.  Barreras de bioseguridad personal: Guantes descartables, mascarilla descartable y toca o gorro.  01 Marcador indeleble.  01 fosforo o encendedor. c. Del Alumno (grupal)  Muestras biológicas con micosis humanas o de animales (uñas, pelo, raspado de piel, exudados, etc).  Estuche de disección.

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3.2. Procedimiento: 3.2.1. Para Levaduras: Cultivar Candida albicans en agar sabouraud por 96 horas a temperatura ambiente. Con la ayuda de un asa bacteriológica en anillo extraer una colonia y realizar una extensión en un portaobjeto. Asegurar la esterilidad del área de trabajo. Realizar una coloración simple. También se puede observar en fresco con azul de lactofenol. Graficar las observaciones. 1.2.2. Para Hongos queratinolíticos presente en uñas: Trabajar con el mechero encendido. Con la ayuda de un asa bacteriológica en “L” colocar una pequeña cantidad de muestra (uñas, pelos, raspado de piel, etc) sobre un portaobjeto. Agregarle a la muestra una gota de hidróxido de potasio al 10%. Dejar actuar de 3 a 5 minutos. Para aumentar contraste agregar una gota de azul de lactofenol. Cubrir con una laminilla y observar al microscopio con objetivos de 4x, 10x y 40x. Buscar hifas de hongos. Indicador de colonización fúngica. IV. RESULTADOS:

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V. FUNDAMENTACIÓN: 5.1. EXAMEN DIRECTO El diagnóstico definitivo de la mayoría de las micosis requiere el aislamiento e identificación del hongo a partir del cultivo, lo que supone con frecuencia, varios días o semanas de dilación. Las muestras para estudio micológico deben examinarse tanto macroscópica como microscópicamente. El método más rápido para la detección de estructuras fúngicas en una muestra clínica es el examen microscópico de la misma. Este examen puede aportar, en ocasiones, un diagnóstico definitivo (pitiriasis versicolor) y en otras, un diagnóstico de sospecha previo a la confirmación definitiva por cultivo. Por lo tanto, es un procedimiento que debería realizarse en todos los laboratorios ya que utiliza técnicas sencillas, permitiendo un cultivo mejor dirigido, seleccionando los medios más apropiados. Sin embargo, si la muestra es escasa, el cultivo debe ser prioritario. Las técnicas moleculares comienzan a ser una realidad y permitirán un diagnóstico más rápido que el cultivo, si bien están menos desarrolladas que para las bacterias o los virus. 5.1.1. Observación macroscópica Las muestras, antes de ser procesadas, tienen que observarse macroscópicamente, en busca de material caseoso, purulento, hemorrágico, necrótico o gránulos. 5.1.2. Observación microscópica El examen microscópico directo de una muestra clínica correctamente tomada es el medio más simple y rápido de detectar una infección fúngica. Cuando los elementos fúngicos están presentes en número suficiente se puede establecer una orientación diagnóstica presuntiva, en ocasiones definitiva, y en pocos minutos informar al clínico, lo cual permitirá la instauración temprana de una terapia antifúngica, siendo éste uno de los factores esenciales en el pronóstico de las micosis en los pacientes inmunocomprometidos. La microscopía sigue siendo una de las herramientas más antiguas y útiles del micólogo clínico. Con frecuencia los hongos tardan en desarrollar las estructuras conidiógenas características para su identificación definitiva. Por lo tanto, es de gran utilidad que a la vez que se inoculan los medios de cultivo, se realicen las técnicas microscópicas que, en tiempo real (menos de 10 min), puedan orientar de forma preliminar la etiología del proceso. El examen microscópico directo proporciona un diagnóstico definitivo si se observan elementos fúngicos patognomónicos: cápsula de Cryptococcus neoformans, células fumagoides en cromoblastomicosis, levaduras pequeñas intracelulares de Histoplasma capsulatum, quistes/ascas típicos de P. jiroveci, levaduras con brotes de base ancha de Blastomyces dermatitidis, levaduras con gemación multipolar en rueda de timón de Paracoccidiodes brasiliensis o las esférulas de Coccidioides immitis. En algunos casos, el diagnóstico microscópico puede ser la única evidencia de infección fúngica y, en otros, su negatividad puede sustentar la interpretación de aislamientos como contaminantes. La escasez de la muestra es, en la práctica, la única razón para no efectuar la observación microscópica en beneficio del cultivo. El examen microscópico puede también orientar la técnica de cultivo (medios, temperatura, tiempo de incubación, precauciones especiales de bioseguridad) e, incluso, su inutilidad por tratarse de patógenos enigmáticos no cultivables como Rhinosporidium seeberi, Lacazia loboi o Pneumocystis jiroveci. Los métodos usados para la visualización fúngica difieren en algunos aspectos de los de las bacterias; el mayor tamaño de los hongos hace, generalmente, innecesarios la tinción de frotis secos; en su lugar son más utilizadas las preparaciones directas en fresco con o sin líquidos de montaje y clarificación. La observación microscópica se realiza con bajo aumento, seguida de alto aumento en seco y, si es necesario, con aceite de inmersión. Escuela de Estomatología UCV - Piura

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Tabla 1. Agentes etiológicos de micosis superficiales cutáneas y mucocutáneas

Tabla mostrando las características morfológicas de las diferentes especies de hongos patógenos y su morfología. In vivo: tal como se observa la morfología en una tinción al fresco y al directo de la muestra; In vitro: tal como se observa la morfología de un frotis al fresco del cultivo de la misma muestra.

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MICROBIOLOGÍA Tabla 2. Agentes etiológicos de micosis profundas, subcutáneas y sistémicas

Leyenda: In vivo: tal como se observa la morfología en una tinción al fresco y al directo de la muestra. In vitro: tal como se observa la morfología de un frotis al fresco del cultivo de la misma muestra.

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 1. Cercenado E., Cantón R. Diagnóstico microbiológico y de la micosis y estudios de sensibilidad a los antifúngicos. Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica; 2006. 2. Ministerio de Salud. Manual de procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas causantes de micosis humanas. Instituto Nacional de Salud serie de normas técnicas lima; 2007. Escuela de Estomatología UCV - Piura

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OBSERVACIÓN DE PARÁSITOS DE IMPORTACNIA MÉDICA I. INTRODUCCIÓN: Los parásitos son organismos que requieren de otro organismo (un huésped u hospedero) para vivir o por lo menos para completar una parte de su ciclo vital. Son eucariotas y contienen estructuras y organelos similares a los de las células humanas, presentan pared celular y se consideran animales. Por ello es muy difícil crear antibióticos eficaces y seguros contra los parásitos, ya que la mayor parte de los fármacos antiparasitarios ejercen algunos efectos adversos en las células de los humanos. Las enfermedades parasitarias constituyen un importante problema de salud pública mundial. Su prevalencia es mayor en los países del tercer mundo, donde afectan a millones de personas ya que están ligadas a la pobreza y a las condiciones socio sanitarias precarias. En países desarrollados su incidencia y gravedad se está incrementando debido al aumento de pacientes inmunodeprimidos no debiendo olvidarse la posible aparición de casos importados. Aunque los microorganismos patógenos, como los virus, algunas bacterias y hongos, también son parásitos, éstos son estudiados por la microbiología. La parasitología es la ciencia que estudia los protozoarios, los helmintos y los artrópodos parásitos. Los protozoarios son organismos unicelulares, dentro de los cuales se encuentran varios grupos como parásitos:  Apicomplexa (esporozoarios): se localizan en la sangre, los tejidos o en el intestino y presentan reproducción sexual y asexual. Entre los más importantes se encuentran Plasmodium (paludismo), Pneumocystis (neumonía), Toxoplasma (toxoplasmosis) y Cryptosporidium (cryptosporidiasis).  Ciliophora (ciliados): Balantidium coli (disentería).  Sarcomastigophora (flagelados y amebas): incluye los flagelados que se encuentran en la sangre (Trypanosoma), tejido linfático (Leishmania) o aparato digestivo (Giardia). Entre los sarcodina se tiene a Entamoeba histolytica (disentería amebiana), y a las amebas de vida libre Acanhthamoeba y Naegleria. Cerca del 10 % de la población mundial está infectada con E. histolytica, el paludismo es la causa principal de muerte relacionada con enfermedades infecciosas en todo el mundo. La neumonía por Pneumocystis carinii es la principal causa de muerte en enfermos de SIDA. Los Helmintos incluyen organismos metazoarios denominados gusanos (redondos y planos) que miden desde unos mm hasta varios metros, aunque sus huevos son microscópicos, así como algunas de sus larvas (etapas juveniles). Los Helmintos son miembros de dos grupos:  Nematelmintos (gusanos redondos), por ejemplo Ancylostoma, Ascaris, Enterobius, Necator, Onchocerca, Strongyloides, Trichinella, Trichuris.  Platelmintos (gusanos planos), como Taenia, Hymenolepis, Echinococcus, Dipylidium, Fasciola. Todos las etapas de un parásito pueden ser desarrolladas en un sólo huésped o en varios, o parte en un huésped y parte en el medio ambiente. En el caso de los parásitos que desarrollan ciclo sexual y asexual, se le denomina huésped intermediario a aquél donde forma las etapas asexuales. Y huésped definitivo, donde desarrolla la etapa sexual.

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El parásito después de penetrar en el huésped se establece en un órgano blanco o en tejidos. La mayoría de los parásitos que entran por ingestión de alimentos o agua contaminados con heces (vía fecal-oral) pasan su ciclo de vida en el aparato digestivo. Los que penetran de manera directa a través de la piel o se introducen a través de un vector, infectan la sangre o los vasos sanguíneos o establecen infecciones en los tejidos subcutáneos u órganos principales, incluso en la médula ósea y en los tejidos linfáticos. Diagnóstico de parásitos en el laboratorio Se basa sobre todo en el hallazgo del parásito en los tejidos infectados, en heces y en líquidos corporales (sangre, L.C.R, orina, esputo y otros). Casi todos los parásitos se pueden detectar en muestras de los tejidos infectados, observadas al microscopio. Cuando el parásito es un protozoario, las muestras se tiñen y se examinan al microscopio, donde se pueden detectar trofozoítos (formas metabólicamente activas que se nutren del huésped) o quistes (formas latentes). Cuando el agente infeccioso es un helminto, el diagnóstico se basa en el hallazgo de huevos del gusano o de larvas en heces, microfilarias en sangre, gusanos adultos en los tejidos subcutáneos o en el aparato digestivo. II. COMPETENCIAS:  Reconoce formas evolutivas de parásitos de importancia clínica.  Enuncia la forma evolutiva de los principales parásitos de importancia clínica. III. MATERIAL Y MÉTODOS: 3.1. Materiales: a. De Laboratorio:  10 Microscopios ópticos  04 Estereomicroscopios  Lugol parasitológico.  solución salina fisiológica estéril (SSF).  Láminas portaobjeto y laminillas cubreobjeto (22 x 22mm). b. Del Alumno (Individual)  Barreras de bioseguridad personal: Guantes descartables, mascarilla descartable y toca o gorro.  01 Marcador indeleble.  01 fosforo o encendedor. c. Del Alumno (grupal)  Muestras de haces positivas para parásitos.  Láminas portaobjetos y laminillas cubreobjetos.  Goteros descartables. 3.2. Procedimiento: 3.2.1. Preparación en fresco a partir de una muestra de heces. 1. Colocar en un portaobjetos limpio una gota de Lugol parasitológico y una de solución salina fisiológica de forma equidistante en ambos extremos de la lámina. 2. Suspender en cada gota una pequeñísima cantidad de heces y cubrir con una laminilla evitando la formación de burbujas. 3. Observar al microscopio con objetivo de 40X. 4. Buscar quistes de protozoarios o huevos de helmintos. Dibujar las observaciones.

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3.2.2. Observación de Parásitos adultos. 1. Con la ayuda de una pinza retirar los especímenes de los frascos de conservación con mucho cuidado, evitando romper o alterar alguna de sus estructuras. 2. Colocarlas en una placa Petri y observar sus estructuras taxonómicas. 3. Graficar las observaciones. IV. RESULTADOS: 4.1. Observaciones Microscópicas:

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4.2. Observaciones Macroscópicas:

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Forma evolutiva: Género: Especie:

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V. FUNDAMENTACIÓN: 5.1. El laboratorio en la identificación parasitológica La confirmación de parásitos o sus productos de reproducción en muestras de pacientes sospechosos clínicamente de tener una infección o enfermedad de origen parasitario, se basa en la identificación morfológica de los organismos causantes. Los criterios utilizados para este reconocimiento e identificación deben ser del dominio de todo personal de laboratorio, irrespectivamente de su formación profesional. Esto debido a que el personal ocupa diferentes cargos en instituciones que tienen sus exigencias particulares o cuando labora en hospitales públicos o privados, rota por diferentes turnos de trabajo, sobre todo en aquellos que mantienen una consulta durante 24 horas y debe estar preparado para atender estas solicitudes. La aparición de nuevos métodos de diagnóstico laboratorial, tales como pruebas moleculares e inmunoensayos, exigirá primero conocimientos epidemiológicos sólidos de las parasitosis que prevalecen geográficamente, para poder interpretar en países tropicales el significado de estos resultados de manera correcta. Será indispensable, a su vez, que el clínico sea capaz de interpretar la relevancia o no de esos resultados, lo cual exigirá una formación sólida sobre la especialidad de parasitología. Por los momentos, la identificación parasitológica continuará dependiendo de la capacidad y confiabilidad del personal de laboratorio en la identificación morfológica. La recolección adecuada de muestras es crítica, ya sea para confirmación o para realizar encuestas y estudios de investigación sobre diferentes especies de parásitos del humano. Si esto no se cumple, los parásitos o sus productos de identificación no serán detectados. A su vez, para la observación microscópica será requisito la aplicación de técnicas que permitan recobrar, concentrar, extraer, las formas diagnósticas observables bajo el microscopio óptico con la menor alteración posible. No es competencia de este Manual considerar cada uno de esos aspectos, esto depende de las normas por las cuales se rigen los laboratorios nacionales. Sin embargo, cada método incluye un párrafo sobre la manera de recolectar la muestra para ejecutar esa técnica en particular. Muchos de los métodos son los mismos que se utilizan en encuestas epidemiológicas y en investigaciones puntuales. 5.2. Principios generales para la recolección de muestras de heces para diagnóstico parasitológico.  Cuando las heces no se recogen de manera adecuada, los resultados no son confiables. Heces viejas y no preservadas no tienen valor diagnóstico. Heces refrigeradas no son recomendadas para

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buscar larvas de helmintos como Strongyloides stercoralis. Para buscar trofozoítos de protozoos se requiere que la muestra sea examinada dentro de una hora o menos después de evacuada. Cuando hay moco y sangre debe incluirse esta porción, igual que parásitos adultos, segmentos de estróbila de cestodos, otros. Debe evitarse dar antidiarreicos o antibióticos o antiparasitarios antes del examen de heces; tampoco se acepta administración de laxantes aceitosos, bario o bismuto antes de la recolección de la muestra. Se tratará de revisar las instrucciones de recolección de muestras según parásito o método a aplicar en donde amerite. Es práctica recomendada de informar al clínico por medio de memoranda o avisos cada vez que se requiera recolección particular de muestras al implementar nuevas metodologías.

5.3. Regla de oro en Parasitología: Recobrar, identificar y demostrar el parásito, o sus productos de reproducción para determinar la etiología de la infección o enfermedad parasitaria.  Métodos directos: Aquellos que identifican al parásito o sus productos de reproducción. Ejemplo:  Baermann: extrae larvas que se identifican a especie por morfología.  Flotación de Sheather: Concentra ooquistes de algunos apicomplexa.  Raspado de úlcera perineal: Demuestra trofozoítos de Entamoeba histolytica en amebiasis cutis.  Raspado de úlcera cutánea: Evidencia amastigotes de Leishmania.  Lavado bronquial: Demuestra estadios de Pneumocystis spp. en algunas situaciones de inmunocompromiso. 

Métodos indirectos: Ofrecen resultados sugestivos de enfermedad parasitaria pero no confirman el agente etiológico. Ejemplo:  Inmunológicos: Hemaglutinación indirecta para tripanosomiasis americana.  Inmunohistoquímicos: Microsporidiosis.  Radiografía de abdomen: Para visualizar intestinales en infección aguda o crónica por Angiostrongylus costaricensis.  Tomografía axial computarizada: Neurocisticercosis.  Resonancia magnética: Absceso hepático amebiano.  Péptidos sintéticos, otra tecnología biomolecular: Diferenciar Trypanosoma cruzi de T. rangeli. Ejemplos de muestra a enviar al laboratorio para demostrar parásitos en general: Heces, sangre, LCR, biopsia de tejidos, aspirados, pus, orina, secreciones, esputo, excreciones y otros líquidos.

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 1. Girard R. Manual de Parasitología: Técnicas para laboratorios de atención primaria de salud y para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas desatendidas. Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Nacional Autónoma de Honduras. 3ra. Edición; 2014. 2. Haro I., Salazar P., Cabrera M. Diagnostico morfológico de las parasitosis. Méndez editores; México D. F. 1995. 3. Atías A. Parasitología Médica. Edit. Mediterráneo. Santiago de Chile; 1999. 4. Biagi F. Enfermedades parasitarias. Edit. La Prensa Medica Mexicana. 17ª reimpresión. México D.F; 2000.

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ACCIÓN DE LOS AGENTES FÍSICOS Y QUÍMICOS SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBANO I. INTRODUCCIÓN: Agentes Químicos: Existen ciertas sustancias químicas que influyen negativamente sobre las bacterias, pudiendo ejercer dos tipos de efectos diferentes:  Bacteriostáticos: cuando impiden el crecimiento bacteriano;  Bactericidas: cuando destruyen (matan) las bacterias. Si nos referimos a cualquier tipo de microorganismos, hablamos respectivamente de agentes microbiostáticos y microbicidas. Ahora bien, para una misma sustancia química, la línea de demarcación entre un efecto microbiostático y otro microbicida depende muchas veces de la concentración de dicha sustancia y del tiempo durante el que actúa. Pero ¿Cómo podemos saber que un microorganismo está “muerto”? El único criterio válido es la pérdida irreversible de la capacidad de división celular, es decir, de la pérdida de viabilidad, y se suele comprobar empleando técnicas con placas de Petri (confirmando que no crecen en medios sólidos adecuados). Antes de proceder al estudio de las diversas moléculas que pueden afectar el crecimiento o la viabilidad de los microorganismos, veamos unas cuantas definiciones básicas.  Agentes esterilizantes: Son aquellos que producen la inactivación total de todas las formas de vida microbiana (o sea, su “muerte” o pérdida irreversible de su viabilidad).  Agentes desinfectantes (o germicidas): Son agentes (sobre todo químicos) antimicrobianos capaces de matar los microorganismos patógenos (infecciosos) de un material. Pueden (y en muchos casos suelen) presentar efectos tóxicos sobre tejidos vivos, por lo que se suelen emplear sólo sobre materiales inertes.  Agentes antisépticos: Son sustancias químicas antimicrobianas que se oponen a la sepsis o putrefacción de materiales vivos. Se trata de desinfectantes con baja actividad tóxica hacia los tejidos vivos donde se aplican.  Quimioterápicos: Son compuestos químicos con actividad microbicida o microbiostática, con una toxicidad suficientemente baja como para permitir su administración a un organismo superior, en cuyos fluidos corporales y tejidos permanece estable un cierto tiempo a concentraciones tales que los hace eficaces como antimicrobianos dentro del organismo. Todos los días usamos agentes químicos para controlar el crecimiento microbiano: detergentes y jabones para el cuerpo y la ropa, cloración de las aguas potables, antisépticos para la piel y el tratamiento de heridas, desinfectantes para tratar superficies en la industria y en los laboratorios, quimioterápicos y antibióticos para tratar enfermedades bacterianas, etc. Agentes Físicos: Las células procarióticas sufren los cambios ambientales de un modo mucho más directo e inmediato que las células de los organismos pluricelulares. A lo largo de miles de millones de años, los procariotas han venido estando sometidas a diversas presiones ambientales, y han respondido evolutivamente creando numerosos mecanismos de adaptación. Actualmente, las únicas formas de vida existentes en determinados

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ambientes extremos son exclusivamente procarióticas. Desafiando a nuestras ideas preconcebidas de lo que es la vida “normal”, encontramos extraordinarios seres vivos unicelulares viviendo “cómodamente” a pHs muy ácidos o muy alcalinos, sumergidos en salmueras y salinas, o reproduciéndose a temperaturas de más de 100ºC y a grandes presiones. Este tipo de microorganismos que habitan medios que los humanos consideramos como “extremos” reciben el calificativo de extremófilos. No todos los microorganismos toleran del mismo modo un determinado factor ambiental. Así, unas determinadas condiciones pueden ser nocivas para una especie bacteriana, y en cambio ser neutras o beneficiosas para otra. Antes de abordar el estudio de distintos agentes ambientales, conviene distinguir entre los efectos que un determinado agente puede tener sobre la viabilidad y los efectos que pueden simplemente afectar al crecimiento, a la capacidad de diferenciación (si la hubiera) o de reproducción. Los principales tipos de factores físicos a considerar se pueden desglosar de la siguiente manera: Temperatura desecación, radiaciones, ondas sonoras, presión hidrostática, presión osmótica. II. COMPETENCIAS:  Valora la importancia de los métodos físicos y químicos en el control de microorganismos patógenos.  Enuncia los métodos físicos y productos químicos para el control de microorganismos patógenos orales. III. MATERIAL Y MÉTODOS: 3.1. Materiales: a. De Laboratorio:  12 Placas con agar Mueller-Hinton  Cultivo de Escherichia coli en caldo nutritivo.  Cultivo de Staphylococcus aureus en caldo nutritivo.  Discos de papel de filtro de 6 mm de diámetro embebidos con: fenol al 1%, alcohol al 70%, formol al 1%, Hipoclorito de Sodio al 5%, solución de Jabón bactericida, solución desinfectante comercial (poet, pineSol, etc.).  Tubos estériles con 02 mL de caldo nutritivo.  1 L de agua destilada.  20 tubos de ensayo de 13 x 100 mL.  06 beaker de 250 mL.  Pinzas de metal.  Mecheros de alcohol o Bunsen. b. Del alumno (Individual):  Barreras de bioseguridad personal: Guantes descartables, mascarilla descartable y toca o gorro.  01 Marcador indeleble.  01 fosforo o encendedor. c. Del alumno (Grupal).  100 mL de las siguientes sustancias: Lejía, Jabón líquido bactericida, Poet, pineSol, Ayudín.  01 paquete de hisopos de toma de muestra.  100 mL de agua de caño.  100 mL de agua estancada.  100 mL de agua oxigenada  Hisopos de toma de muestra estériles

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3.2. Procedimiento: 3.2.1. Efecto de las Temperatura Elevadas: 70 oC. Se proporcionarán cultivos de dos microorganismos: E. coli y S. aureus. Dividir la placa con Mueller-Hinton como indica la figura N° 1; tome una muestra del tubo con el asa bacteriológica para el tiempo 0, seguidamente colocar los microorganismos en agua a 70 oC y tomar muestras a los 5, 10 y 15 minutos. Incubar a 37 °C por 24 horas.

0

5

Minutos

Minutos

10

15

Minutos

Minutos

Placa con Agar Mueller-Hinton

3.2.2. Efecto de los Agentes Químicos sobre el crecimiento Bacteriano. Según la cantidad de placas con medio Mueller-Hinton con las que se cuenten por mesa sembrar en la mitad de ellas E. coli y en la otra mitad S. aureus, mediante la técnica de dispersión en superficie con hisopo a partir de los cultivos bacterianos que se encuentran en caldo. Dividir la placa con un marcador indeleble en tres cuadrantes y rotular cada cuadrante según el producto químico a colocar. Los compuestos químicos se encuentran embebidos en discos de papel de filtro, los cuales hay que colocar con la ayuda de una pinza de metal en el centro de cada cuadrante correspondiente teniendo mucho cuidado de no arrastrar el disco sobre el agar antes de colocarlo. Re alizar el mismo procedimiento con los materiales traídos de casa. Observar las siguientes figuras:

FENOL 1%

Lejía 5%

Jabón bactericida

Desinfectante

ALCOHOL 70%

FORMOL 10% Placas con Agar Mueller-Hinton

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IV. RESULTADOS: 4.1. Acción de los agentes físicos: Temperatura Para el efecto de la temperatura colocar los resultados (recuentos de unidades formadoras de colonias UFC de cada cuadrante) en cuadros de la siguiente manera: BACTERIA (UFC)

0 min.

5 min.

10 min.

15 min.

Escherichia coli Staphylococcus aureus 4.2. Acción de los agentes químicos Para el efecto de la los agentes químicos dibujar el halo de inhibición formado (en mm) y colocar los valores obtenidos en los cuadros siguientes:

BACTERIA (UFC)

Fenol 1%

Formol 10% Alcohol 70% Lejía 5%

Poet

Jabón

PineSol

Ayudín

Escherichia coli Staphylococcus aureus Agua estancada Agua de albañal

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V. FUNDAMENTACIÓN: 5.1. Factores que afectan la potencia de un desinfectante 1. Concentración del agente y tiempo de actuación. 2. pH: El pH afecta tanto a la carga superficial neta de la bacteria como al grado de ionización del agente. En general, las formas ionizadas de los agentes disociables pasan mejor a través de las membranas biológicas, y por lo tanto son más efectivos.  Los agentes aniónicos suelen ser más efectivos a pH ácidos.  Los agentes catiónicos muestran más eficacia a pH alcalinos. 3. Temperatura. Normalmente, al aumentar la temperatura aumenta la potencia de los desinfectantes. Para muchos agentes la subida de 10 grados supone duplicar la tasa de muerte. 4. Naturaleza del microorganismo y otros factores asociados a la población microbiana:  Según la especie empleada: p. ej., el bacilo tuberculoso resiste los hipocloritos mejor que otras bacterias;  Según la fase de cultivo;  Dependiendo de la presencia de cápsulas o de esporas (suelen conferir más resistencia);  Dependiendo del número de microorganismos iniciales. 5. Presencia de materiales extraños: La existencia de materia orgánica en el material a tratar (p. ej., sangre, suero, pus) afecta negativamente a la potencia de los desinfectantes de tipo oxidante (como los hipocloritos) y de tipo desnaturalizante de proteínas, hasta el punto que pueden llegar a hacerlos inactivos en cuanto a su poder desinfectante o esterilizante. Por lo tanto, para el empleo eficaz de muchos desinfectantes hay que contar con este factor, determinando previamente el gasto de materia orgánica inerte, o calculando la potencia neta del desinfectante en presencia de la materia orgánica. 5.2. Efecto letal del calor Al subir la temperatura por encima de la temperatura máxima de crecimiento, se dejan sentir los efectos sobre la viabilidad: la pérdida de viabilidad significa que las bacterias dejan de ser capaces de crecer y dividirse, aun cuando las transfiramos a un medio idóneo. ¿Cómo podemos caracterizar o medir en la práctica la inactivación por calor de una suspensión bacteriana? He aquí algunos parámetros utilizados:  Tiempo térmico mortal: es el tiempo mínimo requerido para que mueran todas las bacterias de una determinada suspensión a una determinada temperatura;  Tiempo de reducción decimal: es el tiempo requerido para reducir al 10% la densidad de la suspensión, a una determinada temperatura (también llamado valor D);  Punto térmico mortal: es la temperatura mínima que mata a todas las bacterias en un tiempo determinado (normalmente el tiempo de referencia empleado es de 10 min). Es importante tener claro que, dependiendo de la temperatura y el tiempo a que sometamos un material a tratamiento térmico, lograremos inactivación parcial de la población microbiana (es decir, queda una fracción de células viables) o bien esterilización (=inactivación total). VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 1. Lañez E. Curso de Microbiología General. Departamento de Microbiología. Facultad de Ciencias. Universidad de Granada. España; 2006. 2. Jawetz, E., Melnick J., Adelberg E. Microbiología Médica. 17ava edición. Edit. El Manual Moderno, S.A., México D.F.; 2001. 3. Murray P., Rosenthal K. Microbiología Médica. 4ta. Edición. Edit. Elsevier Science. Barcelona; 2002.

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PROTOCOLOS DE ASEPSIA EN ESTOMATOLOGÍA I. INTRODUCCIÓN: La infección cruzada es considerada como la transmisión de diversos agentes infecciosos a distintos niveles: paciente-paciente, paciente-profesional sanitario, o profesional sanitario-paciente. Las vías de contagio pueden ser por contacto directo con sangre, fluidos orales u otras secreciones, por contacto indirecto con superficies u objetos contaminados, o por inhalación de aerosoles que contengan partículas infecciosas. Así pues, es fundamental seguir un protocolo de control de la infección cruzada durante la práctica odontológica, y aplicarlo a todos los pacientes por igual, considerándolos como potencialmente infecciosos. En EEUU los Center for Disease Control and Prevention (CDC) consideraron conveniente adoptar ciertas medidas de seguridad al manejar sangre y determinados fluidos orgánicos (como la saliva), ya que la identificación a simple vista de individuos infectados por VIH o VHB, no es nada fiable. Estas medidas pasaron a denominarse “Precauciones Universales”. Con esta revisión se pretende proporcionar unos principios actualizados sobre asepsia y recomendaciones generales. Protocolos sencillos de llevar a cabo de forma continua en nuestra actividad diaria e indispensables para evitar que aparezcan casos de infección cruzada en nuestra actividad clínica. Hay que conocer y tener claro una serie de conceptos como son asepsia, antisepsia, desinfección y esterilización. La asepsia es la ausencia total de microorganismos infecciosos o estado libre de infección. La antisepsia es el conjunto de métodos destinados a prevenir y combatir la misma, destruyendo los microorganismos existentes en la superficie o interior de las cosas y/o los seres vivos. Desinfección es la disminución o reducción de microorganismos en un área, que incluye la destrucción de los gérmenes patógenos en estado vegetativo o no esporulante, pero no incluye la destrucción de esporas, bacilo tuberculoso ni VHB o VIH. Por ello, solo se deben utilizar para controlar la contaminación sobre superficies u objetos no esterilizables. Por último, la esterilización supone la eliminación completa de todas las formas microbianas, incluyendo las formas más resistentes como son las esporas bacterianas. Representa el nivel más avanzado de control de infección y contaminación. Los programas de control de infección cruzada, siguiendo los parámetros de la asepsia, fueron desarrollados con el fin de evitar riesgos profesionales y garantizar una protección total a nuestros pacientes. Se basan en una serie de medidas preventivas eficaces como son las normas de higiene personal, el uso de barreras de protección, la esterilización y desinfección correcta de instrumentos y superficies, correcto manejo y tratamiento de los instrumentos punzantes y desechos, así como la vacunación ante la hepatitis B de los trabajadores sanitarios. Así mismo, es importante que el paciente esté informado sobre los riesgos de infección y los métodos de los que disponemos para combatirlos, consiguiendo así, que acuda a la consulta sin temor a contagiarse de alguna enfermedad.

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La finalidad de estas medidas es procurar que nuestros pacientes reciban atención en un medio lo más aséptico posible para reducir al máximo la posibilidad de contagio; así como de evitarlo durante la realización de los tratamientos quirúrgicos. Todo ello se debe realizar y poner en práctica a todos los niveles. ASEPSIA DEL PACIENTE Debido a la microflora oral propia de cada individuo, el área bucal no se puede considerar un medio aséptico. Para reducir al máximo el número de microorganismos presentes, se aconseja que antes de iniciar el tratamiento el paciente realice un cepillado dental minucioso y enjuagues durante 30 - 60 segundos con una solución desinfectante, como por ejemplo clorhexidina a una concentración de 0,12 – 0,2%. En el caso que se vaya a realizar un procedimiento quirúrgico, se procederá al aislamiento del campo operatorio colocando al paciente un gorro que le recoja el pelo, una bata y una toalla sobre el pecho; preferiblemente estériles y desechables. Además, se recomienda pincelar con povidona yodada el área perilabial, para desinfectar y evitar contaminar los instrumentos que entran en contacto con esa zona. Por último, es importante que siempre que se prevea la formación de aerosoles se debe proporcionar al paciente unas gafas protectoras, ya que la mucosa ocular puede ser puerta de entrada para diversos agentes infecciosos. ASEPSIA DE LOS PROFESIONALES SANITARIOS Las medidas preventivas las deben desarrollar tanto odontólogos como higienistas o auxiliares. Según diversos estudios, el paciente percibe estas barreras de modo satisfactorio, es decir, se siente más cómodo y seguro ante la amenaza de cualquier tipo de contagio. De hecho, si un odontólogo no usa estas protecciones puede ser interpretado como un signo de falta de profesionalidad por subestimar la importancia del control de las infecciones. Así mismo, es aconsejable que todo el personal que pueda tener contacto directo o indirecto con sangre o saliva esté vacunado contra el virus de la hepatitis B y se revacune cada 5 años aproximadamente. Otro tipo de vacunas recomendables son la del tétanos, que requiere dosis de recuerdo cada 10 años, y la de la gripe de forma anual. La protección de las manos incluye tanto el uso de guantes como el lavado y cuidado de las mismas. Hay que procurar mantener la piel hidratada y las uñas cortas, no llevar anillos ni otras joyas, y si existe alguna herida cubrirla con apósitos impermeables. Las manos se deben lavar al principio y final de la jornada laboral y entre pacientes, una vez desechados los guantes usados y antes de iniciar el siguiente tratamiento. Se usará jabón líquido desinfectante y cepillo de uñas; a continuación se aclararan con agua fría (ya que el agua caliente abre los poros de la piel) y se secaran con toallas de papel desechables esforzándose en las zonas interdigitales, ya que son más propensas a permanecer húmedas y por tanto a irritarse y a permitir la proliferación de microorganismos una vez colocados los guantes. Es conveniente que el grifo sea de pedal o disponga de un mango largo que permita manejarlo sin tener que tocarlo con las manos contaminadas o desinfectadas. En la década de los 80, para actos de exploración era posible reutilizar los guantes entre pacientes, siempre y cuando estuvieran intactos y fueran desinfectados. Actualmente, está demostrado que constituyen el elemento de barrera de protección más importante, a pesar de que no evitan accidentes con objetos punzantes o afilados. De hecho, reducen al menos en un 50% la carga de sangre transmitida tras un pinchazo o corte accidental; esto se debe tener en cuenta, ya que la probabilidad de adquirir una enfermedad infecciosa transmitida por vía sanguínea depende en gran medida de la cantidad de

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microorganismos inoculada. Por tanto, es obligatorio colocarse guantes en cualquier acto de operatoria, si se trata de exploración clínica u otros tratamientos no invasivos es suficiente con utilizar unos no estériles de látex o vinilo; sin embargo, ante un procedimiento quirúrgico se deben usar siempre estériles, para reducir al máximo la probabilidad de contaminación en el campo operatorio. En el caso de guantes no estériles se pueden desinfectar con una solución alcohólica con el fin de evitar la posible contaminación que puedan haber sufrido durante el proceso de fabricación. Por último, en el caso de los pacientes de alto riesgo, como los infectados por VIH o hepatitis B o C, se aconseja el uso de doble guante para asegurar una mayor protección. Al finalizar cada tratamiento los guantes se deben desechar; bajo ningún concepto pueden reutilizarse, porque al lavarlos o desinfectarlos pierden su capacidad protectora. Igualmente han de cambiarse si se rasgan durante la actividad clínica o si resultan defectuosos. También se ha establecido que a partir de dos horas de uso continuado es más probable que aparezcan anomalías y no hay garantía de que permanezcan totalmente íntegros. Las características que buscaremos al elegir los guantes son: que queden ajustados para evitar la fatiga manual, de superficie no deslizante, que no dificulten la sensibilidad al tacto, y que no tengan ni olor ni sabores desagradables para el paciente. Así mismo, es preferible que sean hipoalérgicos, es decir, que contengan una baja cantidad de aceleradores residuales como en proteínas del látex, estas últimas suelen ser las causantes de reacciones alérgicas (como por ejemplo edemas, urticaria o picazón); y los aceleradores residuales y el polvo que llevan en el interior pueden provocar dermatitis de contacto. Otra medida protectora que debe usar el odontólogo y sus ayudantes durante su actividad profesional son las mascarillas, ya que evitan la inhalación de aerosoles o salpicaduras contaminadas a través de la cavidad oral o nasal de los sanitarios. Las de papel son ineficaces porque no poseen ningún tipo de filtro, por eso se recomiendan las que incorporan filtros de polipropileno, que permiten respirar sin dificultad a la vez que impiden el paso de partículas y humedad. Se debe cambiar entre pacientes y desechar cada vez que se humedezca, ya que esa zona es una puerta de entrada para los microorganismos, así pues se colocara de forma que no contacte con labios ni narinas. Además, deben quedar ajustadas a la nariz para producir menos vaho en las gafas de protección. Siguiendo esta línea, algunos autores recomiendan las rectangulares con barra nasal ajustable frente a las rígidas preformadas, además de haber mostrado mejores resultados respecto a la filtración bacteriana. Para evitar cualquier traumatismo ocular o infección a través de la mucosa conjuntiva se emplean las gafas protectoras o bien la máscara facial. Es imprescindible usarlas cuando se prevea que se van a generar spray o aerosoles. Deben ser de policarbonato, ofrecer protección total, tanto frontal como lateral, y a ser posible con propiedades de antivaho y antirayado. La ventaja que presenta la máscara facial es que ofrece un mayor campo de protección respecto al de las gafas, pero, no exime del empleo de mascarilla. Debido a su composición no se pueden esterilizar en el autoclave, así que se aconseja limpiar con agua y jabón primero y una vez secas frotarlas con toallitas impregnadas en desinfectante. Esto se debe hacer al finalizar cada tratamiento. Respecto a la indumentaria, no hay que llevar la misma ropa ni calzado que en la calle para evitar el trasiego de microorganismos desde el exterior y que se puedan desencadenar infecciones. El uniforme, tanto si es guardapolvo o uniforme, debe ser cómodo y holgado para permitir la libertad de movimientos, los tejidos recomendados son el tergal y el algodón ya que son capaces de resistir las altas temperaturas Escuela de Estomatología UCV - Piura

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de lavado, la lejía y las condiciones de la esterilización. Es recomendable cambiarlo diariamente o siempre que esté visiblemente manchado. Los zuecos también se han de limpiar con jabón o cualquier otro desinfectante. En el caso de la cirugía, para garantizar la asepsia es obligatorio usar guardapolvo, gorros y polainas estériles descartables, y desecharlos al finalizar el tratamiento. ASEPSIA DE INSTRUMENTAL El mejor medio para evitar desencadenar una posible infección cruzada a nivel del material es usarlo desechable siempre que sea posible. En el caso del resto de instrumental antes de reutilizarlo se debe eliminar toda la contaminación que puedan presentar, y para conseguirlo sólo hay que seguir el protocolo adecuado. En función de la necesidad de descontaminación podemos clasificar los objetos en críticos, semicríticos y no críticos. Los críticos son aquellos que penetran en los tejidos o contactan con sangre o mucosas no intactas; por ello, tras su uso deben ser siempre esterilizados, preferiblemente en autoclave. Los semicríticos son los que entran en contacto con mucosas íntegras, pero al estar expuestos a saliva se aconseja esterilizarlos igualmente. Sólo en el caso que puedan dañarse por el calor del autoclave, se deben desinfectar con glutaraldehido. Por último, los objetos que no se introducen en la cavidad oral pero que por cercanía están expuestos a salpicaduras de sangre o saliva, aerosoles o al contacto con manos contaminadas representan el material no crítico, con lo que será suficiente con someterlos simplemente a la desinfección química. El protocolo recomendado a cerca de la manipulación del instrumental crítico y semicrítico contaminado se basa en una serie de fases y procesos que una vez cumplidos garantizan la asepsia. En primer lugar, una vez finalizado el tratamiento, inmediatamente el instrumental se sumerge en un baño con solución desinfectante, para impedir que la sangre, saliva u otros restos se sequen en el material y así facilitar su limpieza posterior. La presencia de restos de sangre y detritus protegen los microorganismos de la penetración del vapor del autoclave, y por tanto no se logra una total esterilización. El agente desinfectante ideal es el glutaraldehido porque presenta un amplio espectro, eliminando los microorganismos por alquilación, alterando la síntesis proteica de sus ácidos nucleicos. Se puede emplear a una concentración del 2% durante aproximadamente 25 minutos o al 3% durante una hora. Su único inconveniente es que es tóxico e irritante para piel y mucosas. Además hay que tener en cuenta que la solución de gluteraldehido se activa alcalinizándola con polvo o líquido amortiguador, y se debe cambiar al cabo de quince días aproximadamente o cuando se observe turbia. También se puede controlar con indicadores químicos en forma de tiras que señalan cuando la concentración desciende por debajo de su valor eficaz. Otro desinfectante recomendado es el ácido peracético, combinación de ácido acético al 35% con peróxido de hidrógeno, que actúa por oxidación desnaturalizando las proteínas de los gérmenes. Su concentración idónea es de 0,1-0,2% en 10-15 minutos. No necesita activación ni produce residuos tóxicos, pero puede corroer metales y se debe diluir en el momento de usarlo. Tanto el glutaraldehido como el ácido peracético son agentes químicos que ofrecen una desinfección de alto nivel, es decir, que eliminan todos los microorganismos y algunas esporas bacterianas. Por ello se aconsejan usar estos desinfectantes en el material termosensible frente a los alcoholes, los compuestos halogenados (clorados y yodados) o los compuestos de amonio cuaternario, ya que únicamente logran una desinfección de nivel bajo o intermedio. A continuación, se debe limpiar cualquier resto orgánico que pueda haber quedado sobre la superficie de los instrumentos. Esto se puede llevar a cabo mediante el lavado manual con cepillo, o bien utilizando la cuba de ultrasonidos. Escuela de Estomatología UCV - Piura

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En el caso del primero es obligatorio usar guantes de goma domésticos resistentes, para disminuir el riesgo de pinchazos y cortes con el material contaminado. De todas formas es más aconsejable el uso de ultrasonidos por ser más seguro ya que permite una limpieza que no requiere manipular el material con las manos, reduciendo la posibilidad de pinchazos y cortes accidentales. La cuba de ultrasonidos es un microvibrador que contiene una solución enzimática detergente y desincrustante, que al generar ondas permite una limpieza mucho más eficaz del instrumental que la manual. El tiempo necesario variará de 5 a 15 minutos en función del grado de suciedad que presenten los objetos, una vez finalizado se inspeccionarán los instrumentos y si siguen sucios se repasarán a mano con el cepillo. La eficacia del ultrasonidos puede potenciarse si la solución que introducimos tiene como base el glutaraldehido, logrando una limpieza adecuada en menos tiempo. Tanto de una forma u otra, tras la limpieza se procederá al aclarado con agua abundante para eliminar el desinfectante; y después, inmediatamente, se deben secar los instrumentos con papel absorbente para evitar la corrosión. Además, hay zonas como las junturas de fórceps, pinzas o tijeras, que se deben engrasar para evitar que se oxiden. Una vez el material ya está limpio, y antes de esterilizarlo, se debe empaquetar para protegerlo de la contaminación posterior, ya que una vez sale del autoclave deja de ser estéril y simplemente está desinfectado. Además, el material embolsado es una evidencia para el paciente de que se cumplen las normas asépticas. Los paquetes utilizados tienen una cara de plástico transparente que permite mostrar el contenido y otra cara de papel a través de cuyo poro penetra el vapor del autoclave, la cual debe ser impermeable a las bacterias. El siguiente paso es introducir el material empaquetado en el autoclave para lograr la eliminación total de los microorganismos presentes. Este método de esterilización por calor húmedo se basa en vapor saturado a presión que penetra en las formas microorgánicas provocando la desnaturalización y coagulación de sus enzimas y proteínas. Es preferible a otros métodos como el horno de aire caliente, el quimiclave o el óxido de etileno, por ser el más eficaz y rápido, además de no deteriorar la mayoría de materiales (metales y textiles). Es fundamental monitorizar el proceso para asegurarnos que se alcanza la esterilización. Para ello se pueden emplear indicadores físicos, químicos o biológicos. Los de tipo físico consisten en un control visual de los valores de temperatura, tiempo y presión mientras dure el proceso; sin embargo, esto resulta poco práctico y no se puede demostrar que se cumplan en el interior del aparato. Los químicos son unas tiras de papel que viran de color bajo ciertas condiciones de presión y temperatura; el problema es que sólo indican que en algún momento se alcanzan esas condiciones pero no garantiza que se mantengan durante todo el ciclo. Los indicadores más eficaces son los biológicos porque son tiras de papel impregnadas con esporas bacterianas no patógenas que crecen en cultivo si fracasa la esterilización. Se presentan en sobres y cápsulas, es preferible utilizar las últimas porque el cultivo se realiza en una incubadora en 48 horas, mientras que con el sistema de sobres el cultivo se realiza posteriormente con lo que aumenta la posibilidad de que aparezcan falsos negativos. Así pues, se aconseja emplear los indicadores químicos de forma rutinaria en cada ciclo de esterilización, debido a su sencillez; y los biológicos semanalmente y siempre y cuando se use un nuevo sistema de bolsas, un nuevo autoclave o tras la reparación del mismo. Para finalizar, el material estéril y empaquetado se debe almacenar en un lugar adecuado donde estén protegidos de la contaminación externa, y es aconsejable indicar sobre el papel la fecha en la que se ha introducido en el autoclave. Es muy difícil determinar el tiempo que permanece estéril el instrumental empaquetado, los estudios que se han realizado sobre este tema establecen que la esterilidad podría mantenerse indefinidamente siempre y Escuela de Estomatología UCV - Piura

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cuando se almacenara en unas condiciones en las que no se comprometa su integridad. Causas externas como desgarros, pinchazos, humedades o algún contacto con fluidos pueden provocar la contaminación del paquete, independientemente del factor tiempo. Establecer una media de período de tiempo de esterilidad es complicado, ya que en este punto no hay consenso, algunos autores consideran que se mantiene durante 2 o 6 meses, y en otros estudios se concluyó como válido el período de 1 año. Durante muchos años ha habido grandes dudas sobre el correcto manejo del instrumental rotatorio, clásicamente para evitar su deterioro solo se procedía a la desinfección externa, pero con los avances tecnológicos actualmente no hay riesgo de avería; por lo que se debe esterilizar siempre. La secuencia a seguir sería hacer funcionar el circuito aire-agua del equipo durante 15-20 segundos, después se limpia la superficie externa con agua y jabón, sin sumergirlo en el ultrasonidos. Una vez seco se procede a la esterilización, en el autoclave sin ciclo de secado y con el cabezal más alto que el cuerpo, para evitar que el agua de condensación penetre en el cabezal. Por último, el material rotatorio se engrasa y embolsa, no se engrasa antes porque el calor degrada el aceite y se empaqueta al final del proceso para evitar que la humedad pueda corroer el interior de los cabezales. Las jeringas de triple uso que se comercializan actualmente no son esterilizables, habiendo riesgo de contaminación cruzada por contacto directo con fluidos o por reflujo al interior del mismo al dejar de presionar el botón. Por ello, se recomienda emplear cánulas desechables o que sean desmontables y esterilizables. Una variante del protocolo se debe aplicar en el caso de los materiales que no toleran la esterilización por calor, como los que contienen caucho y plástico; y siempre que no sean punzantes o cortantes. En este caso el objeto contaminado se sumerge inmediatamente en una solución de gluteraldehido al 3% durante 10 horas o bien glutaraldehido fenolato al 2% que tan sólo necesita 6 horas y 45 minutos. A continuación se aclara con agua estéril o alcohol, se seca y se almacena. Estas soluciones son muy eficaces y no corrosivas, sin embargo, son irritantes y despiden vapor tóxico, por eso debe mantenerse siempre cubierto con la tapa. El mayor inconveniente que presenta es que este proceso no se puede monitorizar, por tanto este método se debe aplicar únicamente a instrumental crítico y semicrítico que se estropea con el autoclave. INSTRUMENTAL CONTAMINADO BAÑO CON GLUTERALDEHIDO LIMPIEZA DEL INSTRUMENTAL ULTRASONIDOS / LAVADO MANUAL ACLARADO SECADO EMPAQUETADO ESTERILIZACIÓN EN AUTOCLAVE Fig. 1. Asepsia del material crítico esterilizable.

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MICROBIOLOGÍA ASEPSIA DEL EQUIPO Y SUPERFICIES

Las superficies del área operativa se contaminan por contacto directo o aerosoles y pueden servir como vía indirecta de transmisión de la infección cruzada. Por tanto, al finalizar cada tratamiento se procederá a la desinfección de las probables superficies contaminadas. Los desinfectantes recomendables son los que contienen una base de glutaraldehido a solas o combinada con alcoholes, ya que son los más eficaces y no perjudican metales ni plásticos o caucho, debido a su toxicidad, se deben utilizar guantes y mascarillas. Cualquier desinfectante es más eficaz si se usa sobre superficies previamente limpias, porque ya se han eliminado los restos orgánicos. Por ello, la secuencia a seguir consiste en primer lugar en aplicar el desinfectante, preferiblemente en forma de spray y frotar enérgicamente hasta que queden limpias. Después se vuelve a pulverizar y se deja humedecer durante unos 3 minutos, con lo que se logra la desinfección. De todas formas, siempre es preferible limitar las superficies contaminadas a tener que desinfectarlas después. Para ello, previamente hay que dispensar todo el material que pueda ser necesario durante el tratamiento, y el odontólogo procurará evitar tocar objetos innecesarios. Así mismo, se recomienda usar fundas o sobreguantes de plástico para proteger las superficies que se vayan a tocar durante el tratamiento, como por ejemplo, la bancada de los muebles del gabinete, el cono de rayos X, el asa de la lámpara o los mandos del sillón. Un tema controvertido es la posibilidad de contaminación del agua del equipo dental. Esto es debido al pequeño diámetro de los conductos del mismo, que representan un medio ideal para que se forme una biopelícula compuesta por los microorganismos procedentes de la boca de los pacientes y del sistema de aguas públicas. Generalmente se trata de bacterias ambientales no patógenas, aunque se han aislado formas patógenas y oportunistas como Legionella, Pseudomonas y Mycobacterias. Así pues, el biofilm actúa como reservorio de gérmenes aumentando la cantidad presente en el circuito del agua del equipo. En el momento en que se produzca una disminución repentina de la presión del agua los fluidos corporales pueden ser aspirados desde la boca del paciente, en este caso habría un posible riesgo de transmisión de gérmenes entre personas que usen el mismo sistema de agua. Pero realmente, este intercambio a través del agua no se reconoce como un problema de salud pública, ya que la evidencia científica demuestra que la ruta de contagio de virus sanguíneos, como el VIH o el VHB, es a través del contacto íntimo con sangre o fluidos potencialmente infecciosos. Por tanto, la infección a través de cualquier fuente de agua es improbable; además, estos microorganismos son incapaces de reproducirse fuera del huésped. De todos modos, el hecho de introducir microorganismos en la boca del paciente es indefendible según los parámetros de asepsia. Organismos como la Organización Mundial de la Salud (OMS), la Asociación Dental Americana (ADA) y el CDC pretenden que en el agua del equipo no se superen las 200 UFC/ml en el caso de los tratamientos no quirúrgicos, para garantizar la calidad de la misma. Esto se basa en los valores estándar empleados en la hemodiálisis. Para lograrlo se proponen unas estrategias de prevención como son las de cambiar periódicamente las válvulas antireflujo tanto del material rotatorio como del de la jeringa de aire-agua, emplear reservorios de agua destilada independientes a las del sistema público, la desinfección química de los filtros y conductos del equipo, y además purgar y drenar el aire del compresor diariamente. Sin embargo, no hay datos suficientes para establecer la eficacia de cada uno de los métodos, la información pre-eliminar sugiere que ninguno puede erradicar completamente el biofilm, por ello se recomienda combinarlas. Escuela de Estomatología UCV - Piura

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II. ACTIVIDAD:  Elabora un protocolo de asepsia para el instrumental y la unidad dental durante su práctica clínica estomatológica utilizando referencias bibliográficas actualizadas y criterio científico.

III. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 1. Araujo M, Andreana S. Riesgo y prevención de la transmisión de enfermedades infecciosas en odontología. Quintessence (ed. Esp.) 2003; 16:603-10. 2. Lozano V. Control de las infecciones cruzadas en odontología. Madrid: Ediciones Avances; 2000. p. 93-153. 3. Ministerio de Sanidad y Consumo. Plan Nacional sobre el SIDA. Prevención de la infección por virus de transmisión sanguínea ( VIH, VHB, VHC)en odontoestomatología. Madrid; 2001. 4. Molinari J. Practical infection control for the 1990s. J Am Dent Assoc 1994; 125: 1189-97. 5. Molinari J. Infection control: its evolution to the current standard precautions. J Am Dent Assoc 2003; 134: 569-74. 6. Porta J.Asepsia en odontología. Barcelona: Col·legi Oficial d’Odontòlegs i Estomatòlegs de Catalunya; 1994. p. 7-29, 37-38 Escuela de Estomatología UCV - Piura

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OBSERVACIÓN DE CÉLULAS DE LA RESPUESTA INMUNE Y REACCIÓN ANTÍGENO ANTICUERPO I. INTRODUCCIÓN: Erlich fue el primero en utilizar colorantes simples de anilina aunque sus preparados ya no se utilizan en la actualidad. Lanner en 1 889, encontró que el precipitado obtenido por la mezcla de eosina y azul de metileno podía disolverse en alcohol metílico para formar un colorante útil, que combinaba algunas propiedades de los dos colorantes iniciales. Romanowsky, 1 890, encontró que al mezclar una solución de azul de metileno madura, con eosina (policromía), y disolviendo el precipitado en alcohol metílico, se obtenía un colorante de uso más amplio que el de Lanner, que podía teñir los núcleos celulares y los gránulos de las plaquetas (a los que la mezcla de Lanner no coloreaba). Colorantes modernos a los de Romanowsky; por ejemplo, los colorantes de Wright, Leishman, etc., son semejantes, en principio, al método original de Romanowsky, la diferencia principal estriba en el método de obtención de la policromía del azul de metileno. El estudio citomorfológico de extendidos coloreados de la sangre pone de manifiesto el producto final de un maravilloso y complicado proceso de maduración que tiene lugar en el sistema hematopoyético, y que se encuentra representado por los eritrocitos, los leucocitos y las plaquetas. Cada profesional debe entrenarse y aprender a observar todos los elementos del frotis sanguíneo, mientras lleva a cabo el recuento diferencial. Debe formar el hábito de verificar en cuanto al tamaño, forma y concentración de hemoglobina en eritrocitos, además si existe un grado importante de anisocitosis o poiquilocitosis, hipocromía, microcítocis, macrocitocis e hipercromía aparente, etc. En cuanto a plaquetas se debe tener en cuenta si se encuentran en cantidades aproximadamente normales (de 3 a 8 por 100 x glóbulos rojos), si son normales o si hay formas gigantes o extrañas. Asimismo, en cuanto a leucocitos se debe considerar si son maduros o atípicos; si su número es normal, aumentado o disminuido. En los frotis muy gruesos, los leucocitos son pequeños, difíciles de teñir siendo imposible su reconocimiento. Aun en los mejores frotis, a causa de la diferencia de tamaño, densidad, etc., los leucocitos muestran una distribución particular. Los monocitos grandes y los polimorfonucleares (PMN) predominan en los bordes y al final de la extensión, mientras que los linfocitos, más pequeños, se distribuyen en forma más uniforme en la parte media. II. COMPETENCIAS:  Colorea extendidos de muestras de sangre con orden y limpieza.  Reconoce células sanguíneas y las clasifica según tipo.

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III. MATERIAL Y MÉTODOS: 1. COLORACIÓN DE EXTENDIDOS SANGUÍNEOS: (Método de Wright) PROCEDIMIENTO: a. El frotis bien seco y rotulado se coloca sobre la gradilla de coloración. b. Cubrir la lámina con un volumen de colorante y dejar por un minuto (4-5 gotas) c. Diluir el colorante con dos volúmenes de agua tamponada pH. 6.4, mezclar bien, observándose la formación de una escarcha metálica y dejar por 6 minutos. d. Lavar con agua corriente y dejar secar colocando la lámina verticalmente. NOTA: Los tiempos indicados pueden variar de acuerdo a la antigüedad del colorante. 2. RECONOCIMIENTO DE CÉLULAS SANGUÍNEAS: MATERIAL: 1. Láminas con extendidos sanguíneos coloreados. 2. Microscopio óptico. PROCEDIMIENTO: a. Colocar las láminas coloreadas al microscopio, colocar una gota de aceite de cedro y observar con objetivo de inmersión. b. Reconocer los diversos tipos de células sanguíneas y dibujar.

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MICROBIOLOGÍA IV. RESULTADOS:

Célula Tipo: Aumento: Características:

Célula Tipo:

Aumento: Características:

Célula Tipo: Aumento: Características:

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Célula Tipo: Aumento: Características:

Célula Tipo: Aumento: Características:

REACCIÓN ANTÍGENO ANTICUERPO: DETERMINACIÓN DE GRUPO SANGUÍNEO SISTEMA ABO I. INTRODUCCIÓN El grupo sanguíneo al que pertenece un individuo está determinado por los antígenos de membrana de sus eritrocitos y los anticuerpos del suero. Algunos antígenos y sus anticuerpos se encuentran además en las secreciones. Los anticuerpos del suero suelen producir aglutinación de los eritrocitos portadores de antígenos de grupo distinto. Por ello, algunos grupos sanguíneos, como los del sistema ABO o el factor Rh, han de tenerse en cuenta a la hora de realizar transfusiones sanguíneas o trasplante de órganos. Por ejemplo, las reacciones de aglutinación que revisten peligro, son aquellas en los que los anticuerpos del receptor aglutinan los eritrocitos del donante. Es por eso que las personas AB pueden recibir transfusiones de todos los grupos sanguíneos (receptor universal), mientras que no pueden donar sangre más que a personas de su grupo. Sin embargo, a los del grupo O (donante universal), le ocurre lo contrario.

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FUNDAMENTO TEÓRICO: A principios del siglo XIX, K. Landsteiner observó que al mezclar eritrocitos de una persona con el suero de otra, a veces, se producían aglutinaciones. Es así que estudiando este comportamiento de los eritrocitos, se percató de que en la población existen individuos de tres fenotipos diferentes correspondientes a los grupos A, B y O.

GRUPO SANGUÍNEO

A

B

AB

O

ERITROCITOS

EN MEMBRANA EN EL PLASMA

Antígeno A Anticuerpo-B

Antígeno B Anticuerpo-A

Antígenos A y B Sin anticuerpos

Sin antígenos Anticuerpos-A y B

En 1940, Landsteiner y Wiener descubrieron otra diferenciación hereditaria en la sangre. El llamado factor Rh. Inyectaron sangre de Macacus rhesus en conejos, obteniendo de estos un suero, capaz de aglutinar los eritrocitos de los monos y que al ser inyectados en humanos, se observó que podían aglutinar los eritrocitos de un 85% de los neoyorquinos, llamados Rh positivos, a diferencia del 15% que no reaccionaron, a los que se denominaron Rh negativos. Poco tiempo después se dieron cuenta de que el carácter Rh negativo es recesivo frente al Rh positivo. En el mismo año se comprobó que las transfusiones de sangre Rh positivos a individuos Rh negativos provocaban crisis hemolíticas, a pesar de que fueron del mismo grupo sanguíneo del sistema ABO, lo que llevó a reconocer que este factor está involucrado en la producción de la enfermedad hemolítica del recién nacido (eritroblastosis fetal). II. MATERIAL Y MÉTODOS 2.1. MATERIALES: Del Laboratorio:  Sueros anti A. anti B y anti D (factor Rh)  Alcohol yodado o de 70o  Algodón  Beaker  Láminas de aglutinación Del estudiante:  Lancetas de punción  Palitos mondadientes

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MICROBIOLOGÍA 2.2. PROCEDIMIENTO:

La técnica que permite la identificación de los grupos sanguíneos se basa en la aglutinación o no de los eritrocitos, empleando para ello sueros. 1. Desinfecte la pulpa del dedo medio con un algodón con alcohol. 2. Seguido de la desinfección, una vez seco el dedo realice una punción con la lanceta o aguja. 3. Coloque, tres gotas de sangre en una lámina portaobjetos.

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2

3

4. Agregue una gota de suero anti A en la primera gota de sangre, de suero anti B en la segunda gota y suero anti D en la tercera gota. Anti A

1

Anti B

2

Anti D

3

5. Mezcle de manera circular cada gota (con ayuda de un mondadientes) y deje reposar entre 1 a 2 minutos. 1

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6. Interpretar el resultado.

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III. RESULTADOS

IV. ACTIVIDADES 1. ¿En qué se basa la técnica de aglutinación directa? ………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………. 2. ¿Qué es un antígeno y qué es un anticuerpo? ………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………. ………………………………………………………………………………………………………………………… 3. ¿En qué consiste una reacción antígeno – anticuerpo? ………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………. 4. ¿En qué consiste el fenómeno de eritroblastosis fetal y cómo podría evitarse? ………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………. 5. Explique la diferencia entre aglutinación y coagulación. ………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………….

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FAGOCITOSIS IN VIVO I. INTRODUCCIÓN: La fagocitosis es un mecanismo crucial en la inmunidad innata. Las células fagocíticas son atraídas quimiotácticamente hacia los focos inflamatorios inducidos por la presencia de agentes patógenos en los tejidos. Alternativamente, el sistema fagocítico mononuclear consiste en un número de fagocitos fijos en ciertos órganos, como bazo e hígado, que retiran las partículas extrañas presentes en la sangre. Esta actividad de depuración de la sangre es un parámetro importante de la capacidad de defensa del organismo frente a microorganismos, inmunocomplejos y células muertas por apoptosis. Por tanto, una deficiencia en la capacidad de depuración tiene como consecuencia un mayor riesgo de infecciones y de trastornos inmunopatológicos. El fenómeno de la fagocitosis es parte de la respuesta inmune inespecífica y representa el contacto inicial del huésped con las sustancias extrañas. Existe un término más general, el de endocitosis, que incluye a la vez la fagocitosis (ingestión de partículas) y la pinocitosis (ingestión de sustancias que no se presentan como partículas, o sea gotas de líquido). En ambos casos la célula engulle y substrae al medio partículas o gotas de líquido; los grupos de células especializadas que llevan a cabo estas funciones suelen llamarse células fagocitarias. En algunos casos, la digestión ulterior de dichas sustancias hasta producir fragmentos menores, facilita su eliminación. En el hombre, la fagocitosis es realiza fundamentalmente por los fagocitos mononucleares, los neutrófilos y en menor grado los Eosinófilos. El fenómeno de fagocitosis involucra tres procesos. En primer lugar, las células deben llegar al lugar donde se encuentra la sustancia extraña (quimotactismo). Luego deben ingerir dicha sustancia (fagocitosis). Finalmente, después de una serie de acontecimientos metabólicos, deben destruir la sustancia en mención o inhibir la multiplicación del microorganismo (muerte microbiana). II. COMPETENCIAS:  Demuestra la capacidad fagocítica de algunas células de la cavidad peritoneal del ratón.  Comprende la técnica de evaluación de la fagocitosis in vivo. III. MATERIAL Y MÉTODOS: 3.1. Materiales: a. De Laboratorio:  01 Cultivo de Staphylococcus aureus en caldo (en fase logarítmica).  Colorante Giemsa o Wright.  02 microscopio  100 mL de Solución salina fisiológica estéril a 37oC.  10 mL de cloroformo

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b. Del Alumno: (individual)  Manual de prácticas impreso y anillado.  Libreta de apuntes y lapicero.  Barreras de bioseguridad personal: Guantes descartables, mascarilla descartable y toca o gorro.  01 Marcador indeleble.  01 fosforo o encendedor. c. Del alumno: (Grupal)  02 Ratones blancos (por sección)  01 Paquete de hisopos de toma de muestra microbiológica (por mesa de trabajo).  01 Caja de Láminas portaobjeto  01 Caja de laminillas cubreobjeto  04 Jeringa de 5 mL.  04 Agujas Hipodérmicas No 211/2”  Estuche de disección completo  10 hojas de bisturí.  Paquete de algodón pequeño.  Botella de alcohol pequeña. 3.2. Procedimiento: 3.2.1. Preparación de la suspensión bacteriana Suspender un cultivo de Staphylococcus aureus en 2 mL de solución salina a pH 7.0 hasta obtener una turbidez equivalente a 900 000 gérmenes por mL (tubo No 3 del NMF). 3.2.2. Fagocitosis in vivo 1. 24 horas antes de la prueba, inocular un ratón con 0,5 mL de una suspensión de S. aureus muerto por calor. Vía Intraperitoneal. 2. Dos horas antes de la prueba, al ratón anteriormente inoculado, se le debe inocular con 0,5 mL de suspensión de cultivo vivo de S. aureus (suspensión ajustada al tubo No 3 del NMF). Vía intraperitoneal. 3. Hacer una inoculación igual en un ratón no inoculado previamente. 4. Cumplida las dos horas, sacrificar los dos ratones inoculados colocándolos en una cámara con éter o cloroformo. 5. Abra la cavidad abdominal y realice frotis de cada una de ellas utilizando torundas. 6. Rote cuidadosamente la torunda sobre una lámina portaobjeto. 7. Secar a temperatura ambiente y colorear con Giemsa, Leishman o con azul de metileno. 8. Observar la presencia de bacterias libres y la existencia de células mostrando bacterias dentro de su citoplasma (englobadas). 9. Realizar el recuento de bacterias libres y de bacterias fagocitadas en ambos ratones. 10.Al abrir la cavidad abdominal si puede inocular con una jeringa 2 mL de SSF estéril a 37 oC a fin de lavar el exudado y hacer un preparado en fresco en el cual se puede observar el momento de la fagocitosis.

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MICROBIOLOGÍA IV. RESULTADOS: Graficar las observaciones realizadas.

Muestra: Preparado: Coloración: Aumento: Observación:

Muestra:

Preparado: Coloración: Aumento: Observación:

V. FUNDAMENTACIÓN: 5.1. El proceso de la Fagocitosis: No obstante que hay disparidades específicas entre la función fagocítica de los macrófagos y neutrófilos, el proceso fagocítico incluye varias etapas secuenciales que son comunes en ambas células y que comprenden la quimiotaxis, la adhesión, la endocitosis (la cual se optimiza por la opsonización de las partículas), y los cambios físicos y bioquímicos intracelulares que capacitan a los fagocitos para endocitar, matar y digerir a los microorganismos: el incremento en el metabolismo general de las células, la formación del fagosoma, la interacción del fagosoma con endosomas y lisosomas para formar el fagosoma maduro (fagolisosoma), la acidificación del fagolisosoma, la formación de metabolitos reactivos del oxígeno y del nitrógeno, la activación de las hidrolasas lisosomales, y finalmente la expulsión del material de desecho mediante el proceso de la exocitosis. Estos cambios son generales y ocurren aun cuando se trate del enfrentamiento entre los fagocitos y partículas o parásitos de tamaño muchas veces mayor que el de ellos. En estos casos, los fagocitos, al hacer contacto con las macropartículas, estimulan sus mecanismos citocidas y vierten al exterior el contenido de sus gránulos. La “fagocitosis frustrada”, como se le llama a este fenómeno, ocasiona no sólo la destrucción de la partícula sino también daño del tejido circundante. Escuela de Estomatología UCV - Piura

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VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 1. Brown GD, Gordon S. Phagocytes and anti-infective immunity. In: Kaufmann SHE, Sher A, Ahmed R, eds. Immunology of infectious diseases. Washington DC: ASM Press. 2002; 79-91. 2. Labro MT. Interference of antibacterial agents with phagocyte functions: immunomodulation or «immuno-fairy tales»? Clin Microbiol Rev 2000; 13: 615-650. 3. Bonnet M, Van de Auwera P. In vitro and in vivo intraleukocytic accumulation of azithromycin (CP-62, 993) and its influence on ex vivo leukocyte chemiluminiscence. Antimicrob Agents Chemother. 1992; 36: 1302-1309. 4. Ortega E, Escobar MA, Gaforio JJ, Algarra I, Alvarez de Cienfuegos G. Modification of phagocytosis and cytokine production in peritoneal and splenic murine cells by erythromycin A, azithromycin and josamycin. J Antimicrob Chemother 2004; 53: 367-370. 5. Vicente-Manzanares M, Sancho D, Yañez-Mó, M, Sánchez-Madrid M. The leukocyte cytoskeleton in cell migration and immune interactions. Internat Rev Cytol 2002; 216:233-289.

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SHOCK ANAFILÁCTICO RETARDADO IN VIVO INDUCIDO POR OVOALBÚMINA EN COBAYOS I. INTRODUCCIÓN: Los modelos experimentales desempeñan un papel relevante dentro de las Ciencias Biomédicas en el esclarecimiento de la etiopatogenia y de las bases moleculares involucradas en cualquier patología, en el desarrollo de marcadores de diagnóstico y en la evaluación de la eficacia y seguridad de diferentes alternativas de tratamiento, incluso en terapias farmacológicas de interés potencial. En tal sentido, gran parte del conocimiento actual sobre anafilaxia, una de las formas de alteración de la inmunidad de mayor riesgo potencial para la vida humana que se asocia a reacciones de hipersensibilidad inmediata o alérgica Tipo 1 (Clasificación de Gell y Coombs), ha sido obtenida a partir de modelos experimentales. La anafilaxia es un síndrome de aparición brusca y afectación plurisistémica cuya incidencia global no se conoce con toda precisión, si bien se sabe que el número de casos de anafilaxia va en aumento y que puede llegar a afectar hasta el 20 % de la población caucásica en algún momento de su vida. La anafilaxia constituye una reacción inflamatoria de instauración generalmente inmediata, a veces lenta, causada por la liberación masiva de mediadores inflamatorios (histamina, prostaglandinas, serotonina, factor activador de plaquetas, leucotrienos) de leucocitos basófilos y mastocitos, como consecuencia de la unión de anticuerpos tipo inmunoglobulina E (IgE) frente a determinados antígenos. Tales mediadores son causantes de manifestaciones clínicas que según la vía de acceso y el grado de difusión intracorporal del alérgeno (sustancia extraña), pueden adoptar una forma localizada como la rinitis o el asma, o generalizada como el eritema, diaforesis, palidez o cianosis, vasodilatación sistémica, hipotensión, shock, etc. La unión Ag-Ac. (Antígeno y anticuerpo tipo IgE) es uno de los mecanismos fisiopatológicos más importantes que se involucran en el desarrollo de la anafilaxia, por lo cual los modelos que desarrollan las reacciones de hipersensibilidad tipo1 asociadas a esta interacción han cobrado vital importancia en la evaluación preclínica de sustancias con efectos antianafilácticos. II. COMPETENCIAS:  Reconocer los signos durante el shock anafiláctico inducido por ovoalbúmina en el cobayo.  Conocer y aplicar las medidas farmacológicas y no farmacológicas de rescate durante el shock anafiláctico III. MATERIAL Y MÉTODOS: 3.1. MATERIALES: Del laboratorio:  Balanza digital, campana nebulizadora y accesorios. Del estudiante  Dos cobayos (cuyes) machos adultos en jaulas separadas. Dos ampollas de adrenalina 1:1000, dos ampollas de clorfenamina de 10mg/ml, dos ampollas de dexametasona de 4mg/ml.

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3.2. MÉTODO: Método 1: Shock anafiláctico retardado in vivo inducido por albúmina de huevo en cobayos 1. Para la evaluación del shock anafiláctico retardado, se sensibilizan cobayos albinos machos (300 a 400 g) mediante tres inyecciones intraperitoneales de disolución de albúmina de huevo al 5 % que se efectúan en el primer, tercer y quinto días del experimento, respectivamente. 2. Pasados 21 días se administra la sustancia a evaluar. Dos horas más tarde, los animales se preparan para la inducción de la anafilaxia. 3. Para ello, se anestesia localmente la zona ventral del cuello con procaína 2 % (2 mL/kg) y se aísla la vena yugular, a través de la cual se inyecta una disolución de mepiramina (100 µg/kg) y a los 5 min la albúmina de huevo (10 mg/kg). 4. Finalmente, se registra el tiempo de supervivencia. Método 2: Shock anafiláctico (Nebulización de Histamina) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Pesar y marcar a cada uno de los cobayos Calcular la dosis de antihistamínico para administrar a cada cobayo. A uno de los cobayos, administrar el antihistamínico por vía intramuscular Esperar 20 minutos y observar los efectos producidos por el antihistamínico Colocar a ambos cobayos en la campana e iniciar nebulización de histamina Observar los efectos en ambos cobayos Administrar adrenalina, dexametasona y clorfenamina según se requiera Anotar y discutir los resultados

IV. RESULTADOS

V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 1. Goodman Gilman: Las Bases Farmacológicas de la terapéutica. Undécima edición. México. McGraw Hill Interamericana. 2006. 2. Katzung B. Farmacología Básica y Clínica. Editorial Manual Moderno, novena edición. México DF. México, 2006.

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ANTIBIOGRAMA DE COCOS GRAM + I. INTRODUCCIÓN: La resistencia a los antimicrobianos es un fenómeno biológico que ocurre de manera natural, pero que se ha incrementado enormemente debido al uso inapropiado y negligente de estos fármacos. Los ensayos de susceptibilidad están indicados para apoyar la quimioterapia antimicrobiana de tratamiento en procesos infecciosos por bacterias en las que la identidad del microorganismo no es suficiente para predecir en forma confiable su susceptibilidad. Estos ensayos son a menudo indicados cuando se piensa que el organismo causante pertenece a una especie capaz de mostrar resistencia a los agentes antimicrobianos más comúnmente usados. Los mecanismos de resistencia incluyen la producción de enzimas inactivantes del antibiótico, que alteran el objetivo, o alteran la acción. Las colonias aisladas de cada tipo de microorganismo que pueda desempeñar un rol patógeno deberían ser seleccionadas de un agar primario y probar su susceptibilidad. Los procedimientos de identificación a menudo son realizados al mismo tiempo. Mezclas de diferentes microorganismos no deberían probarse en una misma placa de ensayo de susceptibilidad. Diferentes métodos de laboratorio pueden ser usados para determinar in vitro la susceptibilidad de bacterias ante agentes microbianos. En muchos laboratorios de microbiología clínica, el test de difusión en agar es usado en forma rutinaria para bacterias de rápido crecimiento y algunas bacterias fastidiosas patógenas. Este documento incluye un método estandarizado de difusión en disco descrito por el Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). Los ensayos de susceptibilidad basados solamente en la presencia o ausencia de una zona de inhibición sin importar su tamaño, no son aceptables. Resultados confiables sólo se pueden obtener con un disco de ensayo de difusión que use el principio de metodología estandarizada y con medidas de diámetro de zonas correlacionadas con la determinación de Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) con cepas conocidas susceptibles y resistentes a varios antibióticos. El método que actualmente recomienda el CLSI está basado en el método originalmente descrito por Bauer et al., (método de Kirby-Bauer). Este es el método de difusión en disco en que se han desarrollado estándares para su interpretación y está apoyado por datos clínicos y de laboratorio. El incremento de la resistencia bacteriana, la aparición y adquisición de nuevos mecanismos de resistencia a los diferentes antibióticos utilizados en la práctica clínica, se han convertido en un problema a nivel mundial; no solamente para el diagnóstico de las infecciones sino por la dificultad en la detección por el laboratorio de los diferentes perfiles de resistencia. Las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos se han convertido en procedimientos de rutina en la práctica clínica y la información generada a partir de ellas es fundamental para la vigilancia de los perfiles de sensibilidad y la detección de nuevos patrones de resistencia por el laboratorio. Existen vanos métodos para probar la susceptibilidad de los microorganismos a los antibióticos siendo la difusión en disco el más utilizado. Se realiza en un medio transparente y simple como el agar de Müeller Hinton. Se fundamenta en la liberación del antibiótico al medio e inhibición del crecimiento bacteriano en áreas concéntricas a la del disco. La técnica se describe en el desarrollo de la práctica. Escuela de Estomatología UCV - Piura

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II. COMPETENCIAS:  Conoce el fundamento del antibiograma y el método correcto para realizarlo.  Describe el comportamiento bacteriano susceptible, intermedio y resistente a los antibióticos probados. III. MATERIAL Y MÉTODOS: 3.1. MATERIALES: a. De Laboratorio (por mesa de práctica):  Cultivo de Staphylococcus aureus en caldo (2 mL). En fase logarítmica (18-24 horas).  Cultivo de Streptococcus mutans en caldo (2 mL). En fase logarítmica (18-24 horas).  06 placas Petri con agar Mueller-Hinton refrigeradas.  02 tubos de ensayo de 13 x100 mm con 2 mL de agua destilada estéril.  03 microscopios.  03 mecheros bunsen o de alcohol.  01 set de discos de susceptibilidad antimicrobiana para gram positivos.  03 pinzas de metal punta fina. b. Del Alumno: (individual)  Manual de prácticas impreso y anillado.  Libreta de apuntes y lapicero.  Barreras de bioseguridad personal: Guantes descartables, mascarilla descartable y toca o gorro  01 Marcador indeleble  01 fosforo o encendedor. c. Del alumno: (Grupal)  01 Paquete de hisopos de toma de muestra microbiológica (por mesa de trabajo).  01 Caja de Láminas portaobjeto  01 Caja de laminillas cubreobjeto 3.2. PROCEDIMIENTO: 3.2.1. Prueba de susceptibilidad antimicrobiana de difusión en agar. a. Preparación del Inóculo Bacteriano  A partir del cultivo bacteriano en caldo tomar de éste 0.1 mL de cultivo y colocarlo en un tubo con 2 mL agua destilada estéril.  Mezclar por rotación o en vórtex y llevar la turbidez al tubo 0.5 del nefelómetro de MacFarland. b. Preparación de la placa  Rotular la placa de agar Mueller–Hinton con el nombre del microorganismo a inocular, la fecha y hora de realización y el nombre del estudiante que realizará la prueba. c. Colocación de los discos de susceptibilidad antimicrobiana  En una placa Petri sembradas con el microorganismo a evaluar, colocar 5 discos de antibióticos con la ayuda de una pinza estéril.  Los espacios entre los discos en la placa deben ser proporcionalmente semejantes.  Incubar a 37oC por 24 horas, observar y explicar los resultados.  Con la ayuda de las tabla adjunta, determinar si la bacteria es sensible o resistente a cada antibiótico. Escuela de Estomatología UCV - Piura

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INTERPRETACIÓN DE LOS DIÁMETROS DE LOS HALOS DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIBIÓTICOS

ABREVIATURA

Ampicilina Amikacina Aureomicina Bacitracina Bactrim Cafalotina Cloromicetín Eritromicina Gentamicina Kanamicina Lincomicina Ácido Nalidíxico Novobiocina Oxacilina Penicilina Polimixina B Tetraciclina

AM AN A B SxT CR CR E GM KM L NA NB OX P PB T

RESISTENTE (mm o menos) 20 14 14 8 14 14 12 13 12 13 13 13 17 9 20 8 14

INTERMEDIO (mm rango) 21 - 28 15 -16 15-18 9-12 15-18 15-17 13-17 14-17 13-16 14-17 14-17 14-18 18-21 10-13 21-18 9-11 15-18

SUSCEPTIBLE 29 17 19 13 19 18 18 18 17 18 18 19 22 14 29 12 19

DIAGRAMA DE LECTURA

3.2.2. Manejo de Residuos: Después de observado el crecimiento microbiano, esterilizar las cultivos en autoclave a 121°C /15 libras de presión / 15 minutos. Posteriormente, el material de vidrio deberá ser lavado con agua y detergente y enjuagado varias veces para que no queden residuos de detergente. Se envolverá en papel y luego esterilizará en horno a 180°C por 2 horas para su reutilización.

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MICROBIOLOGÍA IV. RESULTADOS: 4.1. Representación gráfica: Staphylococcus aureus

Streptococcus mutans

4.2. Mediciones y conclusiones: MICROORGANISMO

ANTIBIÓTICOS

Halo (mm)

CONCLUSIÓN (R-I-S)

Staphylococcus aureus

Streptococcus mutans

V. FUNDAMENTACIÓN: 4.1. Método de Difusión en Disco En muchos laboratorios de Microbiología se utiliza el método de difusión en disco como de rutina para microorganismos de rápido crecimiento y microorganismos de crecimiento exigente. El método de difusión en disco está basado en la presencia o ausencia de una zona de inhibición de crecimiento, que se mide en milímetros. La interpretación de la prueba está basada en la correlación entre el diámetro de la zona de inhibición (mm) con la CMI (μg/mL) para cada antimicrobiano y microorganismo. Los resultados obtenidos con el método de difusión en disco pueden estar afectados por varios factores que deben ser controlados para asegurar la confiabilidad y reproducibilidad de los resultados:  Medio de cultivo: Se utiliza Agar Mueller Hinton que está formulado y avalado de acuerdo a los criterios de CLSI. El medio debe tener una profundidad de 4mm.

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 Cationes divalentes: Variaciones en los cationes de Ca++ y Mg++ pueden afectar los resultados de aminoglucósidos y tetraciclinas para P. aeruginosa, exceso de cationes pueden dar una falsa resistencia y baja cantidad de cationes una falsa sensibilidad. Variaciones en los niveles de calcio pueden afectar los resultados para daptomicina. Excesiva cantidad de iones de zinc puede dar una falsa resistencia a carbapenemes  Cantidad de timina y timidina: Una cantidad excesiva de timina y timidina puede revertir el efecto inhibitorio de sulfonamidas y trimetoprim causando una falsa resistencia.  pH: Debe estar entre 7.2 y 7.4. Un pH bajo puede bajar la potencia de aminoglucosidos y macrólidos mientras que otros agentes antimicrobianos pueden parecer tener mayor actividad como las tetraciclinas. Si el pH es alto se observa el efecto contrario.  Turbidez del Inóculo: Preparar el inóculo del microorganismo con suspensión directa de la colonia; se ajusta la suspensión del microorganismo a la turbidez equivalente al estándar 0.5 McFarland. También se puede preparar el inoculo por el método de crecimiento, cuando la colonia es difícil de suspender directamente, ajustando la turbidez al estándar 0.5 McFarland.  Sensidiscos: Los Sensidiscos del antimicrobiano deben ser almacenados en refrigeración a 8ºC o en refrigeración a -14ºC, con desecante. Antibióticos lábiles como son β lactámicos, carbapenemes, ácido clavulánico y tetraciclinas pueden ser almacenados en congelación y dejar en refrigeración los antibióticos que usan de rutina.  Incubación: Incubar las placas en ambiente aerobio a 35±2ºC de 16 a 18 horas para microorganismo no exigentes.  Lectura: Se mide el diámetro de la zona completa de inhibición, incluyendo el diámetro del disco, utilizando una regla o caliper y luz reflejada o transmitida. VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 1. Picazo J. Procedimientos en Microbiología clínica en líneo [consultado el 21 de Febrero del 2017].Disponible en: coesant-seimc.org/documents/MétodosBásicos_SensibilidadAntibióticos.pdf 2. Sacsaquispe R., Velásquez J. Manual de Procedimientos para la Prueba de Sensibilidad Antimicrobiana por el Método de Disco Difusión. Instituto Nacional de Salud. Lima; 2002. 3. García P., Fernández MT., Paredes F. Microbiología Clínica Practica. 2ª. Universidad de Cadis. España; 1994. 4. Gilbert A., Angel M. Interpretación clínica del Laboratorio. 7ª. Editorial Médica Panamericana. Bogotá. 2007.

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PRÁCTICA N

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CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE LOS GÉNEROS STAPHYLOCOCCUS Y STREPTOOCCUS I. INTRODUCCIÓN: Los cocos Gram positivos son un grupo heterogéneo de bacterias. Las características que tienen en común son su forma esférica, su reacción a la tinción de Gram y la ausencia de endoesporas. La presencia o ausencia de actividad catalasa es una prueba sencilla que se utiliza para subdividirlas en varios géneros. Las catalasas son enzimas que catabolizan peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno gaseoso. Cuando se pone en contacto una gota de solución de peróxido de hidrógeno con una colonia productora de catalasa, aparecen burbujas a medida que se forma oxígeno gaseoso. El nombre del género STAPHYLOCOCCUS se refiere a que las células de estos cocos se desarrollan en un patrón que recuerda a un racimo de uvas; sin embargo, los microorganismos presentes en muestras clínicas aparecen como células aisladas, en pares o en cadenas cortas. La mayor parte de los estafilococos tiene un diámetro de entre 0,5 y 1 m y son anaerobios facultativos (es decir, crecen aerobia y anaerobiamente), inmóviles capaces de crecer en un medio con una elevada concentración de sal (p. ej., cloruro sódico al 10%) y a temperaturas de 18-40 °C. Estas bacterias están presentes en la piel y las mucosas del ser humano. En la actualidad, el género comprende 40 especies y 24 subespecies, muchas de las cuales se encuentran en el ser humano. Algunas especies se desarrollan en nichos muy específicos en los que se encuentran habitualmente. Por ejemplo, Staphylococcus aureus coloniza las narinas anteriores, Staphylococcus capitis crece en regiones con glándulas sebáceas (como la frente) y Staphylococcus haemolyticus y Staphylococcus hominis se hallan en zonas dotadas de glándulas apocrinas (como la axila). Los estafilococos conforman un importante grupo de patógenos en el ser humano y originan un amplio espectro de enfermedades sistémicas que pueden poner en peligro la vida, infecciones de la piel, los tejidos blandos, los huesos y el aparato genitourinario e infecciones oportunistas. Las especies que se asocian con mayor frecuencia a enfermedad en el ser humano son S. aureus (el miembro más virulento y mejor conocido del género), Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus lugdunensis y Staphylococcus saprophyticus. Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) es importante porque produce graves infecciones en pacientes hospitalizados y más recientemente también de forma extrahospitalaria en niños y adultos previamente sanos. Las colonias de S. aureus son doradas como consecuencia de los pigmentos carotenoides que se forman durante su crecimiento y que dan el nombre a la especie. Es la única presente en las personas que produce la enzima coagulasa. Cuando se suspende una colonia de S. aureus en un tubo con plasma, la coagulasa se une a un factor sérico y el complejo convierte el fibrinógeno en fibrina, lo que da lugar a un coágulo. Dado que las restantes especies estafilocócicas carecen de la capacidad de producir coagulasa, son conocidas colectivamente como estafilococos coagulasa-negativos.

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Por otra parte el género STREPTOCOCCUS ha sido objeto de numerosas revisiones en la literatura científica, y su nomenclatura ha sido modificada con frecuencia; son varias las especies que se han transferido de un subgrupo a otro, se han añadido o se han redefinido. En estos últimos años, con la aplicación de técnicas moleculares, la taxonomía y la clasificación del género han sufrido algunas modificaciones. Muchas especies son difíciles de diferenciar por sus características fenotípicas, algunas sólo se pueden identificar empleando técnicas moleculares, e incluso hay casos en que ni siquiera así se puede llegar a una identificación completa y segura. El género Streptococcus es un grupo muy heterogéneo, formado por bacterias de forma redondeada, Gram positivas, con tendencia a formar cadenas o parejas, que se hallan ampliamente distribuidas en la naturaleza. Hay especies que son importantes patógenos para el ser humano, pero la mayoría son comensales, miembros de la microbiota normal humana de piel y mucosas. Los estreptococos son descritos en el Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology como bacterias que forman células ovoides o esféricas, de menos de 2 µm de diámetro, Gram positivas, catalasa negativas, anaerobias facultativas, con tendencia a formar cadenas o parejas. Fermentan la glucosa produciendo ácido láctico. El contenido de guanina y citosina (G + C) del ADN está entre 34 y 46 mol%. Las distintas especies del género Streptococcus, excepto S. thermophilus, crecen bien en medios enriquecidos con sangre, suero o carbohidratos, a 35-37 oC, especialmente si son incubados en una atmósfera con dióxido de carbono al 57%. Algunas especies necesitan el CO2 para crecer, como algún S. pneumoniae y ciertos estreptococos del grupo viridans. Muchos estreptococos, el neumococo entre ellos, crecen mejor en condiciones anaerobias. En general, las colonias de los estreptococos en agar sangre no son pigmentadas. La característica de algunas especies es formar colonias grandes, mientras que otras forman colonias pequeñas (colonias puntiformes o minute, menores de 0,5 mm de diámetro). La clasificación más actual basada en la secuencia del gen 16SrRNA, los estreptococos se clasifican en 5 grandes grupos. 1. Grupo piogénico: formado principalmente por especies betahemolíticas, de colonias grandes, y que incluye especies que son patógenos importantes para el ser humano. 2. Grupo mitis: incluye al patógeno neumococo (S. pneumoniae) y a otros estreptococos habituales de la cavidad oral, que producen alfahemólisis en agar sangre. 3. Grupo anginosus o milleri: formado por especies que se encuentran en la cavidad oral humana, en el tracto genital y gastrointestinal, con colonias de tamaño pequeño y característico olor a caramelo. 4. Grupo salivarius: incluye 3 especies de estreptococos genotípicamente relacionados, que normalmente se encuentran en la cavidad oral humana: S. vestibularis, S. salivarius y S. thermophilus. El último de ellos se relaciona con productos lácteos. 5. Grupo bovis: formado por especies que principalmente habitan en el canal intestinal de los animales y que, en ocasiones, infectan a humanos. Pertenecen al grupo D de Lancefield. Además de estos 5 grupos, existe otro denominado “grupo mutans” que engloba 8 especies que no están incluidas en los grupos mencionados anteriormente, y que son genéticamente diversas, aunque fenotípicamente similares. En este grupo hay especies relacionadas con la producción de la caries dental. II. COMPETENCIAS:  Reconoce a pruebas de identificación fenotípica para el género Staphylococcus.  Reconoce pruebas de identificación fenotípico para el género Streptococcus.

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III. MATERIAL Y MÉTODOS: 3.1. Materiales: a. De Laboratorio:  Cultivo de Staphylococcus aureus en vial.  Cultivo de Streptococcus pyogenes y/o pertenecientes al género.  12 placas con agar sangre.  12 placas con agar chocolate.  12 placas con agar manitol salado.  100 mL de caldo Mueller-Hinton.  20 tubos de ensayo estériles en dos gradillas.  01 Asa bacteriológica en anillo.  01 Asa bacteriológica en punta.  Set de Tinción Gram (Cristal violeta, lugol, alcohol-acetona y safranina).  Aceite de inmersión.  100 mL de agua destilada estéril.  100 mL Solución salina fisiológica estéril.  Incubadora microbiológica.  06 Microscopios ópticos. b. Del alumno (Individual):  Barreras de bioseguridad personal: Guantes descartables, mascarilla descartable y toca o gorro.  01 Marcador indeleble.  01 fosforo o encendedor. c. Del Alumno (grupal):  Secreción faríngea.  Plasma sanguíneo.  Caja de láminas portaobjeto y laminillas cubreobjeto.  100 mL de agua oxigenada. 3.2. Procedimiento: 3.2.1. Género Staphylococcus  Prueba de Catalasa. 1. En una lámina portaobjeto limpia y desengrasada, colocar una gota de peróxido de hidrógeno. 2. Con ayuda de un asa bacteriológica y cerca al fuego del mechero tomar una colonia bacteriana y sumergirla en la gota de peróxido de hidrógeno. 3. La prueba es positiva si se observa una efervescencia por desprendimiento de oxígeno.

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MICROBIOLOGÍA 

Estudio del crecimiento de Staphylococcus aureus en Agar Manitol Salado. Comparar una placa Petri que contenga agar manitol salado sin sembrar con una que contenga un cultivo de Staphylococcus aureus de 24 horas. Analizar: 1. Color del medio de cultivo antes y después. 2. Color de las colonias de Staphylococcus aureus.



Hemólisis de Staphylococcus aureus en agar sangre. Comparar una placa Petri que contenga agar sangre sin sembrar con una que contenga un cultivo de S. aureus de 24 horas. Analizar: 1. Tipo de Hemólisis. 2. Color de la colonia de S. aureus.

BETA HEMÓLISIS 

ALFA HEMÓLISIS

GAMMA HEMÓLISIS

Prueba de coagulasa. Con el asa estéril obtenga una colonia beta hemolítica bien aislada y mézclela con 0.5 ml de plasma sanguíneo. Incube a 37 oC por 30 min. Si no hay formación de coagulo, hacer la lectura cada 30 minutos durante 2 horas. Si hay coagulación del plasma, la bacteria es coagulasa positivo.

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3.2.2. Género Streptococcus  Procedimientos de laboratorio. En cuanto a los requerimientos nutricionales el género Streptococcus es exigente y por lo tanto debe ser cultivado en medios ricos que le aporten los nutrientes necesarios, por ejemplo agar sangre ovina al 5%. Dentro de las pruebas bioquímicas para la identificación, la primera, luego de determinar que se trata de cocos Gram positivos, es la prueba de la catalasa. Luego de determinar que se trata de cocos Gram positivos, catalasa negativos, debemos observar el efecto que producen las colonias de la cepa en estudio sobre placas de agar sangre ovina al 5% (tipo de hemólisis). Así podemos clasificar este grupo de gérmenes en:  Beta-hemolíticos: son aquellos que producen una hemólisis total de los glóbulos rojos, observándose como un halo transparente alrededor de las colonias.  Alfa-hemolíticos: son aquellos que producen hemólisis parcial, la cual se observa como un halo con tonalidad verdosa alrededor de las colonias.  Gamma-hemolíticos: son aquellos que no producen hemólisis sobre el agar sangre.

BETA HEMÓLISIS 

ALFA HEMÓLISIS

GAMMA HEMÓLISIS

Sensibilidad a la bacitracina Separa el Streptococcus pyogenes de los demás estreptococos beta hemolíticos. El 99% de las cepas de Streptococcus pyogenes son sensible a bajas concentraciones de bacitracina (discos con 0,04 U). Un 5% de las cepas de Streptococcus agalactiae son sensibles a la bacitracina.  Se realiza sembrando 3-4 colonias, tomadas con asa bacteriológica de un cultivo puro, que se estrían sobre una placa de agar sangre en varias direcciones intentando obtener un cultivo confluente.  Luego se coloca el disco de bacitracina y se incuba 18-24 horas a 35-37ºC.  La aparición de cualquier halo de inhibición del crecimiento alrededor del disco se considera una prueba positiva (no importa el diámetro del halo).

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Hidrolisis del PYR: Separa Streptococcus pyogenes y Enterococcus de los demás estreptococos. S. pyogenes y Enterococcus poseen la capacidad de hidrolizar el substrato PYR (pirridonil ß-naftilamida) debido a que poseen la enzima l-piroglutamil aminopeptidasa. Existen varias configuraciones comerciales de este test por eso no detallaremos ninguna en particular. En general siempre se revelan por un cambio de color. Este test es más específico y menos laborioso que realizar el test de sensibilidad a la bacitracina, la bilis esculina y caldo salado (se verán más adelante).



Bilis esculina Esta prueba permite diferenciar los estreptococos del grupo D y Enterococcus de los demás grupos de estreptococos. Se basa en la capacidad de los estreptococos del grupo D y Enterococcus para crecer en un medio de cultivo con 40% de bilis y de hidrolizar la esculina a esculetina; ésta se combina con el citrato ferroso que posee el medio, dando un complejo de color negro. La concentración de bilis es fundamental, ya que existen estreptococos del grupo viridans que son capaces de crecer a concentraciones menores de bilis.  Se realiza sembrando en superficie tubos de agar bilis esculina inclinado.  Una reacción positiva se evidencia como ennegrecimiento del medio.



Prueba de tolerancia a la sal (caldo salado) Separar los Enterococcus, capaces de crecer en caldo salado, de los demás estreptococos del grupo D. Esta prueba se fundamente en la capacidad de los enterococos de crecer en una concentración de 6,5% de NaCl. Se trata de un medio de cultivo líquido que contiene además de NaCl, glucosa y un indicador de pH: púrpura de bromocresol.  Se inocula el caldo salado con la cepa a estudiar y se incuba 18-24 horas a 35ºC.  Se considera la prueba positiva cuando aparece turbidez con o sin acidificación del medio, que se observa como un viraje de color del púrpura al amarillo. La no aparición de turbidez indica una prueba negativa.

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Sensibilidad a la optoquina Sirve para diferenciar S. pneumoniae de otros estreptococos β-hemolíticos se fundamenta en la sensibilidad de S. pneumoniae a una concentración menor o igual a 5 µg/mL de hidroxicuprina (optoquina).  Estriar un cuadrante de una placa de agar sangre en varias direcciones.  Con una suspensión Mc Farland 0,5.  Colocar luego un disco de optoquina en el centro del área estriada. Incubar 18-24 horas a 37ºC en 5-10% de CO2.  Los halos de inhibición iguales o mayores a 14 mm; o iguales o mayores a 16 mm con discos de optoquina de 6 y 10 mm de diámetro, respectivamente, indican sensibilidad.

IV. RESULTADOS: 4.1. Género Staphylococcus: Tinción Gram

Especie: Aumento: Coloración: Disposición:

4.2. Género Streptococcus: Tinción Gram

Especie: Aumento: Coloración: Disposición:

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MICROBIOLOGÍA 4.3. Cuadro de pruebas fenotípicas: Colocar la lectura correspondiente. BACTERIA (UFC)

Gram Catalasa Coagulasa Manitol Hemólisis Bacitracina Optoquina PYR Bilis-esculina

Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophyticus Streptococcus α-Hemolítico Streptococcus β-Hemolítico Streptococcus ɣ-Hemolítico

V. FUNDAMENTACIÓN: 5.1. Hemólisis en agar sangre El agar sangre se prepara utilizando un medio base puede ser agar base sangre, agar Mueller-Hinton, o una combinación de nutritivo con agar soya tripticasa al cual después de su preparación y esterilización hay que incorporarle en condiciones de esterilidad 5% de sangre ovina, bajo ciertas circunstancias puede usarse sangre humana. Es un medio de aislamiento especialmente diseñado para facilitar el crecimiento de microorganismos exigentes, bacterias Gram positivas y todas las especies encontradas en muestras de origen clínico. Se usa también para observar la capacidad hemolítica de los microorganismos patógenos (que es un factor de virulencia). Observando los halos hemolíticos alrededor de las colonias se determina el tipo de hemólisis que genera, y estos pueden ser:  Alfa: Halos verdosos (reducción de la hemoglobina de los glóbulos rojos a metahemoglobina en el medio, formación de biliverdina).  Beta: Halos incoloros (hemólisis total).  Gamma: Inexistencia de halos (sin hemólisis). Staphylococcus aureus, presentan beta hemólisis en agar sangre, aunque algunas cepas pueden carecer de hemolisinas, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus epidermidis no producen hemólisis en agar sangre. 5.2. Crecimiento en Agar Manitol salado El agar Manitol Salado es un medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciación de estafilococos. Es recomendable para el aislamiento de estafilococos patógenos a partir de muestras clínicas, alimentos y otros materiales de importancia sanitaria. Es un medio altamente selectivo debido a su alta concentración salina. Los estafilococos coagulasa positivos hidrolizan el manitol acidificando el medio; las colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona roja o púrpura. En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona constituyen la fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales, el manitol es el carbohidrato fermentable, el cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentración) es el agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompañante, y el rojo de fenol es el indicador. Las bacterias que crecen en un medio con alta concentración de sal y fermentan el manitol, producen ácidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo a amarillo. Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no fermentar el manitol. Escuela de Estomatología UCV - Piura

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5.3. Streptococcus pyogenes Es la especie más importante de los estreptococos del grupo A. Origina diversas enfermedades supurativas, aunque este microorganismo constituye la causa más frecuente de faringitis bacteriana. Las cepas de Streptococcus pyogenes, son cocos esféricos de diámetro comprendido entre 1 y 2 µm que forman cadenas cortas en las muestras clínicas y cadenas de mayor longitud cuando crecen en medios de cultivo líquido. Su crecimiento es óptimo en el medio de agar sangre enriquecido, pero se inhibe cuando contiene una concentración elevada de glucosa. 5.3.1. Enfermedades provocadas por especies de estreptococos. Streptococcus pyogenes ENFERMEDAD DESCRIPCION INFECCIONES SUPURATIVAS Faringitis Faringe enrojecida con presencia frecuente de exudados. Escarlatina Exantema eritematoso difuso que comienza en el tórax y se extiende posteriormente a las extremidades; complicación de faringitis estreptocócica. Pioderma Infección cutánea localizada con vesículas que avanzan a pústula; sin indicios de enfermedad sistémica. Erisipela Infección cutánea localizada con dolor, inflamación, adenopatía y síntomas sistémicos. Celulitis Infección cutánea que afecta a los tejidos sub cutáneos. Fascitis necrosante Infección profunda de la piel que provoca la destrucción de capas musculares y de tejido adiposo. Síndrome del shock Infección multiorgánica que remeda el síndrome del shock toxico estafilocócico; no toxico estreptocócico obstante la mayor parte de los pacientes presentan bacteriemia e indicios de Fascitis. INFECCIONES NO SUPURATIVAS Fiebre reumática Caracterizado por alteraciones inflamatorias del corazón, articulaciones, vasos sanguíneos y tejidos subcutáneos. Glomerulonefritis Inflamación aguda de los glomérulos renales con edema, hipertensión, hematuria y aguda. proteinuria.

Streptococcus agalactiae (grupo B). Enfermedad neonatal de comienzo precoz Enfermedad neonatal de comienzo tardío Infecciones en mujeres gestantes Infecciones en otros pacientes adultos

En el transcurso de los 7 días siguientes al nacimiento, los neonatos infectados desarrollan signos y síntomas de neumonía, meningitis y septicemia. Más de una semana después del nacimiento, los neonatos presentan signos y síntomas de bacteriemia con meningitis. Más a menudo, se manifiestan con infecciones del aparato urinario; pueden provocar bacteriemia y complicaciones diseminadas. Las enfermedades más frecuentes son la bacteriemia, la neumonía, infecciones óseas y articulares, infecciones cutáneas y de partes blandas.

Streptococcus pneumoniae Neumonía Meningitis Bacteriemia

Inicio agudo con escalofríos intensos y fiebre mantenida; tos productiva con esputo tenido de sangre; consolidación lobular. Infección grave que afecta a las meninges y cursa con cefalea, fiebre y septicemia; elevada mortalidad y graves deficiencias neurológicas en los supervivientes. Más frecuente en pacientes aquejados de meningitis que en aquellos con neumonía, otitis media o sinusitis; septicemia fulminante en pacientes esplénicos

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 1. Murray P., Baron E., Pfaller M., Tenover F., Yolken R. Manual of Clinical Microbiology. 7th edition. Edited by ASM Press. Washington; 1999. 2. Brogden K., et al. Virulence Mechanisms of Bacterial Pathogens. 3rd ed. Edited by ASM Press. Washington; 2000. 3. Roitt W. Microbiología Médica, 2ª edición. Mosby, Harcourt Brace. España; 1999.

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OBSERVACIÓN DE BACILOS ÁCIDO–ALCOHOL RESISTENTES (BAAR) I. INTRODUCCIÓN: Se estima que alrededor de un tercio de la población mundial, dos mil millones de personas, están infectadas con Mycobacterium tuberculosis, bacilo causante de la tuberculosis; aproximadamente 8 millones de ellos enferman anualmente y cerca de dos millones mueren por la enfermedad, aun cuando se cuenta con técnicas de diagnóstico sencillas y precisas y tratamientos eficaces. La transmisión de los bacilos de la tuberculosis se produce casi exclusivamente por medio de núcleos suspendidos en pequeñas gotas que son expulsadas con la expectoración de las personas afectadas por tuberculosis pulmonar. Estas pequeñas gotas pueden permanecer infectantes en el aire durante bastante tiempo y pueden ser inhaladas por otras personas. La infección de los contactos es más probable cuando conviven o permanecen durante un tiempo prolongado cerca del enfermo que está expectorando bacilos y en un ambiente poco ventilado. No todas las personas infectadas enferman, sólo una de cada diez aproximadamente, que son las más susceptibles. La tuberculosis puede manifestarse en cualquier órgano, porque M. tuberculosis se disemina por todo el organismo; sin embargo, la enfermedad pulmonar es la más frecuente (80-85% de todos los casos diagnosticados) debido a que el bacilo necesita abundante oxígeno para multiplicarse. En los pulmones de los enfermos se pueden formar cavidades en las que se alojan grandes poblaciones de bacilos que pueden ser detectados en muestras de esputos. Los síntomas más característicos de la tuberculosis pulmonar son la tos y la expectoración persistentes por más de 2 semanas. A las personas con estos síntomas se los llama Sintomáticos Respiratorios (SR). Otras manifestaciones pueden ser pérdida de peso, febrícula, sudores nocturnos, cansancio físico y dolores de tórax. El diagnóstico de certeza de tuberculosis puede hacerse en forma confiable en el laboratorio demostrando la presencia de bacilos en una muestra de la lesión por medio de la baciloscopía (examen microscópico) o el cultivo. Para que la baciloscopía sea positiva es preciso que la muestra tenga como mínimo, entre 5.000 y 10.000 bacilos por mililitro de muestra. Este alto contenido de bacilos se encuentra en los pacientes con tuberculosis pulmonar, especialmente en aquellos con enfermedad avanzada y con lesiones cavitadas. Estos pacientes son los que transmiten los bacilos manteniendo la enfermedad en la comunidad. El Programa de Control de Tuberculosis tiene como objetivo principal cortar la cadena de transmisión, diagnosticando tempranamente los casos infectantes y tratándolos con esquemas eficaces hasta lograr su curación. Para que la baciloscopía sea una buena herramienta de control no es suficiente la calidad técnica. También es necesaria la calidad de los registros, de los informes del laboratorio y el análisis de la información que produce el laboratorio. La estandarización de los procedimientos involucrados en la baciloscopía se basa en normas técnicas que son el producto de amplia experiencia, periódicamente revisada por organizaciones internacionales como la Organización Panamericana de la Salud (OPS) / Organización Mundial de la Salud (OMS) y la Unión Internacional Contra la Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias (UICTER). En el Perú el Ministerio de Salud (MINSA) y EsSalud son las instituciones que aplican estos programas de control de la tuberculosis. Escuela de Estomatología UCV - Piura

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II. COMPETENCIAS:  Reconoce bacilos ácido alcohol resistente en montajes permanentes.  Aplica la colocación de Ziehl neelsen en preparados no patogénicos y fundamenta dicha coloración. III. MATERIAL Y MÉTODOS: 3.1. Materiales: a. De Laboratorio:  Láminas con montajes semipermanentes de BAAR.  06 Beaker de 250 mL limpios.  01 Asa bacteriológica en anillo.  Set de Tinción de Ziehl Neelsen (Fucsina fenicada de Ziehl, Alcohol ácido y Azul de metileno).  Aceite de inmersión.  100 mL de Lejía.  06 Microscopios ópticos.  Mecheros de alcohol o bunsen. b. Del alumno (Individual):  Barreras de bioseguridad personal: Guantes descartables, mascarilla descartable y toca o gorro.  01 Marcador indeleble.  01 fosforo o encendedor. c. Del Alumno (grupal):  10 baja lengua.  Muestra de esputo negativa.  Caja de láminas portaobjeto. 3.2. Procedimiento: 3.2.1. Toma de Muestra: 1. Dar al paciente el recipiente rotulado o etiquetado con sus datos. 2. Indicar al paciente que se enjuague la boca antes de emitir la muestra. 3. Explicar al paciente que es necesario obtener una muestra del tracto respiratorio inferior y que no es válida la saliva. Para ello habrá que indicar al paciente que inspire profundamente, retenga el aire por un instante breve y posteriormente elimine las secreciones con un golpe intenso de tos. 4. Una vez obtenida la primera muestra, lo ideal es que se procesen de forma inmediata y que no pasen más de dos horas desde su obtención hasta la llegada al laboratorio. 5. Si las muestras de esputo llegasen al laboratorio a una hora que no permita procesarlas en el día, se debe introducir cada uno de los envases en una bolsa de polietileno que se anudará fuertemente sobre la tapa del mismo. Posteriormente las muestras se introducirán en una caja de plástico que se colocará en un lugar fresco, seco y protegido de la luz. Registro de la muestra: Una vez que la muestra de esputo está en el laboratorio, es importante anotar en una libreta los datos del paciente, la fecha de recepción y características de la muestra, así como el resultado del examen. De esta manera se puede obtener un registro y control del número de casos de tuberculosis en la zona.

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3.2.2. Preparación de la muestra para ser teñida 1. Rotular el portaobjetos con el nombre del paciente o sus iniciales y el nº de identificación de la muestra. No utilizar bolígrafo o rotulador, dado que se decoloran durante el proceso. Recuerde que los portaobjetos deben ser siempre nuevos, nunca reutilizados. 2. Colocarse guantes desechables (o domésticos en caso de no tener desechables) y mascarilla antes de comenzar a manipular la muestra. 3. En caso de disponer de mecheros de gas o de alcohol, abrir el envase que contiene la muestra por detrás de la llama del mechero, para protegerse de posibles aerosoles (la llama debe quedar entre el envase y la persona que está manipulando la muestra). 4. Con la ayuda de una varilla o palillo de madera, tomar la muestra desde el envase. Las partes más purulentas y densas del esputo son las que deben utilizarse, ya que son las que con mayor probabilidad contendrán bacterias. 5. Para tomar la muestra con mayor facilidad se puede partir uno de los extremos de la varilla y tomar el esputo con esta parte astillada o quebrada. Para cada muestra se empleará siempre una varilla o palillo diferente, para no producir contaminaciones cruzadas entre las muestras. 6. Extender la muestra sobre la parte central del portaobjetos, teniendo cuidado de que no resulte una extensión demasiado densa o demasiado fina, lo que dificultaría la visualización y, por tanto, el diagnóstico. Repetir el proceso para cada una de las muestras a estudiar. 7. Dejar secar las preparaciones a temperatura ambiente (hasta que no se encuentren completamente secas no se podrán teñir). Una vez que estén complemente secas podrán ser teñidas para su análisis en el microscopio como se explica en el siguiente punto. 8. Las varillas y resto del material desechable que se haya empleado durante el proceso, se debe tirar en un contenedor o frasco que contenga fenol al 5% o hipoclorito de sodio al 1%. Si se han utilizado guantes domésticos, una vez terminada la preparación de todas las muestras sumergir las manos enguantadas en una solución de hipoclorito de sodio al 1% para desinfectarlos antes de quitárselos. 9. Limpiar (desinfectar) la superficie de trabajo con papel empapado en hipoclorito de sodio al 1% o fenol al 5%. En caso de haber cubierto la superficie, desechar el material. 3.2.3. Tinción de Ziehl-Neelsen Los bacilos tuberculosos resisten la decoloración con alcohol–ácido (bacilos ácido-alcohol resistentes o BAAR), por lo que las tinciones ácido-alcohol resistentes (tinción de Ziehl-Neelsen) son adecuadas para su visualización microscópica. Los pasos para realizarla son los siguientes: 1. Una vez que las muestras de esputo están secas, deben fijarse pasándolas 2 o 3 veces por encima de la llama de un mechero, con cuidado de no calentarlas demasiado. 2. Colocar las preparaciones en las varillas de metal sobre las que se vayan a realizar la tinción. 3. Cubrir la preparación con el reactivo FUCSINA FENICADA y calentar hasta que emita vapores pero sin dejar que el colorante hierva (evitar que haga burbujas). 4. Dejar enfriar unos segundos y repetir otras 2 veces el calentamiento y luego Lavar con agua. 5. Decolorar con alcohol-ácido (alcohol-clorhídrico al 3%) hasta decolorar completamente la lámina (los microorganismos AAR, no se decoloran, permaneciendo de color rojo-fucsia). 6. Lavar con agua y luego cubrir la preparación con el reactivo AZUL DE METILENO durante 30 segundos (tanto el fondo de la preparación como los microorganismos no AAR quedan teñidos de azul). Lavar con agua y dejar secar la preparación en posición vertical y visualizar en el microscopio con el objetivo 100X (aceite de inmersión).

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MICROBIOLOGÍA IV. RESULTADOS:

BACILOS ALCOHOL ÁCIDO RESISTENTES

Observación: Aumento: Coloración: Disposición:

V. FUNDAMENTACIÓN:  Los bacilos tuberculosos se observan como filamentos o bastones finos, ligeramente curvados de color fucsia sobre fondo azul. Para no repetir campos microscópicos, se deben recorrer las preparaciones en líneas rectas (de izquierda a derecha o de arriba abajo, por ejemplo).  Para saber si la muestra de esputo es válida (del tracto respiratorio inferior) se deben observar leucocitos polimorfonucleares (PMN) y células epiteliales. La muestra es adecuada para el diagnóstico si presenta más de 25 PMN y menos de 10 células epiteliales por campo a 100 aumentos.  Se deben examinar sistemáticamente 100 campos microscópicos y contar el nº de bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR) identificados en cada uno. VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 1. Organización Mundial de la Salud. Manual de bioseguridad en laboratorios. 3ª edición. Ginebra.2005. 2. Suárez A. Actualización de la Doctrina, Normas y procedimientos para el Control de la Tuberculosis en Perú. Lima; 2000. 3. Pío A., Chaulet P., Tuberculosis Handbook. WHO/TB/98253. Geneve; 1998.

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AISLAMIENTO DE BACTERIÓFAGOS E INTRODUCCIÓN A LA FAGOTERAPIA I. INTRODUCCIÓN: Los bacteriófagos son virus que fueron descubiertos de forma independiente por los microbiólogos Frederick W. Twort en 1915 y Félix d’Hérelle en 1917. Siendo esta la última clase principal de virus en ser descubierta; este tipo de virus constituye un sistema simple y de gran abundancia en la naturaleza. En esencia, los bacteriófagos se encuentran de manera ubicua en el ambiente y en el lugar en que se encuentre su célula huésped. Un bacteriófago es un virus que se multiplica en bacterias y probablemente cada tipo de bacteria es portadora de un fago. Los bacteriófagos se encuentran dónde están sus hospedadores, para muchas bacterias del grupo entérico, las aguas residuales son una fuente de fagos, así como la leche es la fuente de fagos para Streptococcus lactis. Los índices de crecimiento son muy rápidos una vez que se añade el virus sobre la bacteria huésped, ya que la partícula vírica ingresa a la célula y se multiplica hasta que la bacteria estalla y libera nuevas partículas formadas. El tiempo que tardan los virus en lisar a una bacteria varía entre 13 y 40 minutos y el número de partículas virales producidas en cada microorganismo varía entre 120 y 400. La acción de los fagos sobre las bacterias sensibles es la lisis bacteriana, la cual puede evidenciarse en medio líquido (los cultivos en caldo turbios pueden aclararse en cuestión de horas, como resultado de la acción lítica) o en medio sólido, generalmente en medio sólido se evidencia por la aparición de calvas o placas líticas. El tamaño de la placa lítica depende de: La concentración de nutrientes (metabolismo bacteriano), la acumulación de inhibidores, la concentración de agar (a mayor concentración, la difusión es más lenta y el tamaño de la placa lítica es menor). Las dimensiones de las partículas fágicas (las pequeñas difunden más rápidamente) y la velocidad de replicación fágica. Una placa lítica contiene entre 106 a 109 partículas fágicas, a veces más. De una placa lítica aislada se puede obtener una línea pura de fago. La fagoterapia es un tratamiento basado en la actividad bactericida de los bacteriófagos (fagos), virus específicos de las bacterias. Los fagos reconocen la superficie de la célula bacteriana con alta especificidad, inyectan su ADN o ARN, y se multiplican y ensamblan dentro de la bacteria, para finalmente romper la célula y liberar su progenie, que infectará nuevas células bacterianas. El número de fagos crece de forma exponencial, por lo cual su mayor efecto es en el sitio de infección. Además, la selección de nuevos fagos es un proceso relativamente rápido. La terapia con fagos se propuso desde el descubrimiento de los mismos y se ha desarrollado en países como República de Georgia, Polonia, Rusia, y la antigua Alemania del este; sin embargo, después del boom del descubrimiento de la penicilina y otros antibióticos, la investigación en fagoterapia en Europa occidental y América fue abandonada. En los últimos años, con el incremento en la frecuencia de aparición de cepas multirresistentes y panresistentes a antibióticos, los investigadores han retomado el interés en el desarrollo de fagoterapia y su implementación para el control de la contaminación e infecciones bacterianas en diversos campos.

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II. COMPETENCIAS:  Reconoce la importancia de los fagos en el desarrollo de la fagoterapia.  Aísla fagos de la cavidad oral con potencial para el control de microorganismos patógenos orales. III. MATERIAL Y MÉTODOS: 3.1. Materiales: a. De Laboratorio:  Láminas portaobjeto  06 Beaker de 250 mL limpios.  01 Asa bacteriológica en anillo.  Set de Tinción de Gram  Aceite de inmersión.  100 mL de Lejía.  03 Microscopios ópticos.  Mecheros de alcohol o bunsen.  Cultivo de Streptococcus pyogenes del grupo A β-hemolítico  01 L de solución salina fisiológica estéril o PBS.  100 mL de caldo tioglicolato.  20 placas con agar sangre. b. Del alumno (Individual):  Barreras de bioseguridad personal: Guantes descartables, mascarilla descartable y toca o gorro.  01 Marcador indeleble.  01 fosforo o encendedor. c. Del Alumno (grupal):  Paquete de hisopos de toma de muestra estériles.  Paquete de baja lengua.  Caja de láminas portaobjeto. 3.2. Procedimiento: 3.2.1. Aislamiento e Identificación de Streptococcus pyogenes 1. Se tomarán muestras de hisopado faríngeo-amigdalar de 10 estudiantes presentes en la práctica con la ayuda de un depresor lingual, tocando con la torunda todas las partes con exudados, membranas o inflamación, frotando las criptas tonsilares y la faringe posterior. No se requerirán medidas especiales para su transporte y conservación. 2. Las torundas serán colocadas en caldo tioglicolato para el enriquecimiento y se inocularon a 37°C durante 24 horas, luego se sembrará en placas con agar sangre y se incubará en condiciones ya indicadas anteriormente para el enriquecimiento. 3. Posteriormente se seleccionarán las colonias con β-hemólisis y se colorearán con tinción Gram. La observación de cocos Gram positivos en cadena se utilizará como indicador de Streptococcus. Estas colonias serán sometidas a la prueba presuntiva basada en la susceptibilidad a la inhibición del crecimiento por Bacitracina (0,04U) para confirmar la presencia de Streptococcus pyogenes del grupo A βhemolítico. 4. Los resultados son cualitativos y es positiva si se encuentra cualquier halo de inhibición alrededor del disco. Escuela de Estomatología UCV - Piura

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3.2.2. Aislamiento para bacteriófago 1. Se tomarán 10 muestras de gargarismo faríngeo en frascos de boca ancha con tapa rosca, estériles, conteniendo 15 mL de solución buffer fosfato (PBS). 2. Se le instruirá al paciente de modo que mantenga la solución en la garganta el mayor tiempo posible mientras hace gárgaras y deposite nuevamente el líquido en el frasco. 3. Se hará pasar cada una de las muestras por filtro bacteriológico al vacío, y se realizará un paso de enriquecimiento previo para fagos mezclando 4 mL del filtrado anterior con 5 mL de caldo BHI + Triptosa fosfato 2X y 1 mL de cultivo joven del estreptococo aislado previamente llevándose a incubar a 37°C durante 24 horas. 4. El paso siguiente fue realizar un filtrado bacteriológico del medio de enriquecimiento del paso anterior y el filtrado se guardará y conservará a 4°C. 5. Con cada filtrado se analizará la existencia del fago, para lo cual, se sembrará al Streptococcus pyogenes, en camada, sobre una placa de agar sangre y se colocará una gota del filtrado (fagos). Luego se llevará a incubar a 37 oC durante 24 horas. Finalmente se observará la presencia o ausencia de placas líticas. IV. RESULTADOS: 4.5. Aislamiento de bacteriófagos

CALVAS

V. FUNDAMENTACIÓN: Existe una relación entre la tasa de crecimiento de la bacteria hospedera y el tiempo de aparición del halo lítico. Por lo que aquellas en aquellas cepas bacterianas de crecimiento lento los halos líticos aparecerán más tarde, en tanto que en cepas de crecimiento rápido aparecen a las 24 horas. El habitad del hospedero juega un rol importante y decisivo en el aislamiento de bacteriófagos, porque de las condiciones que se brinde a la célula hospedera a nivel de laboratorio dependerá en gran medida del éxito del aislamiento de dichos bacteriófagos.

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La etapa del enriquecimiento previo para el aislamiento del bacteriófago, de los gargarismos faríngeos con cepas de los estreptococos empleados en el presente estudio, se realiza para aumentar el número de las posibles partículas virales (fagos) presentes en los gargarismos empleados ya que estas partículas necesitan células jóvenes para su replicación. En el filtrado final del proceso de enriquecimiento, utilizado para el aislamiento de los fagos, se debe encontrar una concentración de fagos anti Streptococcus pyogenes del grupo A β-hemolíticos capaz de lisar a las bacterias presentes en el cultivo. Para esto, se utilizará bacterias del mismo cultivo empleado para el enriquecimiento previo. La alta especificidad del bacteriófago frente a Streptococcus pyogenes explica esta baja incidencia, pues la lisis de una bacteria por su fago depende tanto de las propiedades de éste, como de los receptores específicos situados en la superficie bacteriana debido a que la multiplicación de los bacteriófagos ocurre sólo cuando el organismo tipo y el fago coinciden La infección es el proceso en el cual el fago reconoce y se adhiere a la célula huésped e inyecta su ácido nucleico atravesando la membrana celular hasta llegar al citoplasma. En el medio ambiente, la infección que es siempre un evento al azar, está altamente influenciada por la densidad bacteriana. Esto quiere decir que a mayor densidad de huésped, mayor oportunidad de infección. El reconocimiento y la interacción altamente específica entre la célula huésped y el fago hacen parte del proceso inicial de la infección conocido como adsorción. Este evento es afectado por factores como el ambiente iónico y la temperatura. En trabajos donde se añadieron los cationes divalentes Ca+2 y Mg+2 a los ensayos de placa, se observó un incremento en el número y tamaño de las placas virales. De la misma manera, las bajas temperaturas hacen inestable el proceso de la adsorción fago-huésped. Aunque la infección parezca un evento sencillo, hay varios factores o barreras intracelulares como lo son las restricciones específicas del huésped. La carga de la membrana externa, un periplasma con nucleasas y el carácter de la membrana citoplasmática; constituyen un sistema de defensa para la bacteria hacia las moléculas de ADN exógeno, lo que tiene una marcada influencia sobre la aparición de placas líticas sobre un cultivo bacteriano. VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 1. Miller, R.V. Environmental bacteriophage–host interactions: factors contribution to natural transduction. Antonie Van Leeuwenhoek 2001; 79 (2): 141 – 147. 2. Hankin, M. E. L'action bactéricide des eaux de la Jumna et du Ganges sur la microbe du choléra, Ann. de l'Inst. Pasteur 1896; 10: 541 – 523. 3. Wagner, P. L. and Waldor, M. K. Bacteriophage teraphy: II. The bacteriophage. Its nature and its therapeutic use. J. Am. Med. Assoc 2002; 116 (21): 60 – 67. 4. Slopeck, S., Weber-Dabrowska, B. Dabrowski, M. And KucharewiczKrukowska, A. Results of bacteriophages treatment of supurative bacterial infections in the years 1981-1986.,Arch. Inmunol. Ther. Exp. 35. 1987. 5. Kleczkowska, J. A cuantitative study of the interaction of bacteriophage with Streptococcus using the technique of pured plates. J. Bacteriol. 1945; 50: 81 – 94. 6. StaniewskI, R. Morphology and general characteristics of phages active against Streptococcus. J. Basic Microbiol. 1987; 27: 155 – 165.

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CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE

Candida albicans I. INTRODUCCIÓN: Los hongos corresponden a un reino independiente, son heterotróficos y eucariotas, porque el genoma está organizado en un núcleo envuelto por una membrana contigua al retículo endoplásmico, presentan organelos celulares como mitocondrias, ribosomas, vacuolas, cuerpos lipídicos y otros. De las más de 100.000 especies de hongos descritas, solo 100 son conocidas por participar regularmente en micosis humanas y animales. En la actualidad el reino Fungi, se divide en dos subreinos, Dykaria el cual agrupa las divisiones Ascomycota y Basidiomycota, y el llamado «Hongos Basales», que agrupa al resto de los hongos. Refiriéndose únicamente a los patógenos, dentro del segundo subreino se ubican aquellas especies que antes pertenecían a la división Zygomycota. Ciertos grupos de hongos se caracterizan por la presencia de su fase levaduriforme en las etapas de su ciclo de vida, mientras que otros se caracterizan por su ausencia. Algunos zigomicetos, ascomicetos y basidiomicetos puede ser dimórficos y pasar de un crecimiento micelial a un crecimiento tipo levadura en ciertas condiciones ambientales. Se reconocen dos tipos de reproducción: sexual y asexual; en la reproducción asexual no participa la cariogamia, la fusión de núcleo y meiosis, tampoco lo hacen los órganos sexuales, en cambio la reproducción sexual se caracteriza por la unión de dos núcleos seguida por meiosis resultando en recombinación y formación de nuevos genotipos. Dentro de la División Ascomycota, orden Saccharomycetales se encuentra el género Candida, caracterizado como levadura. Se presenta como células redondas u ovoides que miden entre 2,0 a 4,0 µm de diámetro, considerablemente mayor que las cocáceas bacterianas. Las levaduras del género Candida se reproducen por brotamiento o gemación y en determinadas condiciones producen un pseudomicelio filamentoso, la identificación de este género se hace por características morfológicas y fisiológicas, como lo es el test de auxonograma y zimograma. Tienen una distribución amplia en la naturaleza, pudiendo ser encontrados en agua, vegetales, alimentos y otros; en el ser humano forman parte de nuestra microbiota residente. Dentro del género Candida está la especie Candida albicans que es un comensal común en las membranas de las mucosas de la boca, el intestino y la vagina de individuos sanos, pero puede invadir localmente, causando por ejemplo, candidiasis en niños, vaginitis en mujeres embarazadas y estomatitis subprotésica hasta en un 50% en personas con dentadura postiza. En casos extremos, puede crecer sistemáticamente y causar la muerte después de colonizar la sangre a través de un catéter intravenoso, en el cual las células de levadura se adhieren. El equilibrio entre la infección, la colonización y la eliminación depende de la capacidad de las cepas de Candida para modular la expresión de factores de virulencia en la respuesta a los cambios del medio ambiente, combinado con la competencia del sistema inmune del huésped. Para permitir la invasión a los tejidos del huésped, las cepas de Candida poseen constitutivamente enzimas hidrolíticas que destruyen o alteran los constituyentes de las membranas. Las enzimas secretadas por C. albicans, que se cree reflejan su grado de patogenicidad, se clasifican en dos tipos principales de enzimas llamadas proteasas y fosfolipasas. Escuela de Estomatología UCV - Piura

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Las micosis invasoras son cada vez más frecuentes en la práctica clínica, afectando especialmente a sujetos con grados variables de inmunocompromiso, por causas como infección por el Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) y enfermedades hematológicas malignas. Además, se presentan en forma secundaria a tratamientos agresivos como cirugía mayor, terapia anti retroviral, quimioterapia, trasplante de precursores hematopoyéticos y tratamientos antimicrobianos de amplio espectro. La frecuencia de aislamiento de las diferentes especies presenta variaciones significativas dependiendo de la ubicación geográfica. En todo el mundo C. albicans sigue siendo la especie más aislada, pero de las especies distintas de C. albicans se observan variaciones considerables, pues en América del Norte hay un claro predominio de C. glabrata, en cambio en América del Sur se encuentra principalmente C. parapsilosis y C. tropicalis. En inmunodeprimidos, cada vez se describen con más frecuencia otras especies de Candida, que incluyen C. parapsilosis, C. krusei, C. glabrata o C tropicalis. Otras especies menos comunes son C. guilliermondi o C. lusitaniae. Es necesario reconocerlas porque algunas especies son intrínsecamente resistentes a los azoles, como C. krusei y C. glabrata. C. lusitania pueden ser resistente a la anfotericina. II. COMPETENCIAS:  Valora la caracterización fenotípica de Candida albicans, especie fúngica de importancia estomatológica.  Realiza pruebas bioquímicas de identificación de Candida albicans. III. MATERIAL Y MÉTODOS: 3.1. Materiales: a. De Laboratorio:  Láminas portaobjeto  06 Beaker de 250 mL limpios.  01 Asa bacteriológica en anillo  Set de Tinción de Gram  Aceite de inmersión.  03 Microscopios ópticos.  03 Estereomicroscopios.  01Incubadora microbiológica.  Mecheros de alcohol o bunsen.  Cultivo de Candida albicans.  20 placas con agar sangre y 10 pacas con agar sabouraud.  100 mL de Caldo Mueller-Hinton. b. Del alumno (Individual):  Barreras de bioseguridad personal: Guantes descartables, mascarilla descartable y toca o gorro.  01 Marcador indeleble.  01 fosforo o encendedor. c. Del Alumno (grupal):  Paquete de hisopos de toma de muestra estériles.  Caja de láminas portaobjeto.  Suero sanguíneo.  Muestra de Candida albicans proveniente de candidiasis orofaríngea.

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3.2. Procedimiento: 3.2.1. Identificación de levaduras  Se preparará una extensión en lámina a partir de las muestras traídas por los estudiantes.  Posteriormente se realizará una tinción Gram para identificar la presencia de levaduras.  Es necesario trabajar con todas las medidas de bioseguridad a fin de evitar contagios. 3.2.2. Verificación de la viabilidad y pureza de las levaduras  Para verificar la pureza de las cepas de Candida, éstas deberán ser sembradas por agotamiento en placas de Petri que contienen CHROMagar Candida® (CHROMagar Company, París, Francia) o agar sabouraud e incubadas a 32°C por 72 horas de tal forma que se obtengan colonias aisladas de un color común verde.  Como control de comparación se puede utilizar una cepa de C. dubliniensis CBS 7987 para la clasificación de los colores, siendo la observación de colores realizada por dos observadores.  Si las crecen especies de levaduras que presentan color blanco cremoso, necesitarán una identificación bioquímica posterior.  A partir de una colonia representativa se depositará una colonia en agua destilada y se resembrará en Agar sabouraud (MERK) sin antibióticos para realizar las pruebas de caldo hipertónico y de crecimiento a 42°C.  En todas estas etapas se pueden utilizar cepas de referencia de C. albicans ATCC 28367 y C. dubliniensis CBS 7987 sembradas en CHROMagar Candida®, las cuales se diferencian en la tonalidad verde. 3.2.3. Análisis micromorfológico (microcultivo)  Cada cepa será sembrada con ayuda de un asa bacteriológica en punta en tres estrías paralelas sobre una placa Petri (60 x15mm), con agar Arroz Tween-80 (polisorbato), el que se preparará con 20 gramos de arroz, 20 gramos de peptona, y 10 ml de Tween-80 para 1 litro.  Las estrías realizadas sobre el agar serán cubiertas con un cubreobjeto estéril y la placa será incubada a 36°C durante 48 a 96 horas.  Las lecturas serán realizadas diariamente en un microscopio de luz con objetivos de 10X y 40X. La presencia de clamidoconidios terminales y únicos es confirmatorio de C. albicans y clamidoconidios múltiples de C. dubliniensis.  Este método debe utilizarse como criterio de inclusión de las levaduras compatibles con ambas especies. 3.2.4. Asimilación de fuentes de carbono (auxonograma)  A partir de colonias aisladas se preparará una suspensión en agua destilada estéril con una turbidez equivalente al patrón N°5 de la escala de McFarland.  A partir de ella se inoculará 4 mL al medio con fuentes de carbono o comúnmente llamado medio C, el cual previamente será estabilizado en baño María de manera que su estado fuera líquido. Luego se depositará la mezcla en una placa de Petri de 120 x 18 mm.  Una vez sólido se agregarán los diferentes hidratos de carbono. La incubación será realizada a 32°C y las lecturas verificadas a las 24 y 48 horas.  La presencia de un halo de crecimiento alrededor del hidrato de carbono se considera como positivo para la asimilación del azúcar. Esta prueba es fundamental para la identificación de levaduras en clínica

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3.2.5. Fermentación de Hidratos de Carbono (zimograma)  A partir de colonias aisladas del medio CHROMagar Candida®, se utilizará una suspensión en agua destilada estéril con una turbidez equivalente al patrón N°5 de la escala de McFarland.  A partir de ella se inocularán 200-250 µL a cada uno de los tubos de fermentación con los diferentes hidratos de carbono.  La incubación se realizará a 32°C por un mínimo de 48 horas y un máximo de 15 días.  La presencia de burbujas en la campana de Durham se considerará como positivo. Esta prueba es utilizada como base para la identificación de levaduras en clínica, otorgando la capacidad de diferenciar otras especies distintas a C. albicans o C. dubliniensis. 3.2.6. Desarrollo a 42°C  Se realizará la siembra en el medio de cultivo agar Sabouraud sin antibióticos de cepas provenientes de la siembra en CHROMagar Candida® o de muestras clínicas y se incubará 42°C durante 48 horas en una estufa.  Las cepas que no presenten crecimiento o su crecimiento sea débil a esta temperatura serán clasificadas como sospechosas de C. dubliniensis ya que solo un 9% de esta especie es capaz de desarrollarse a esta temperatura dentro de las 48 horas. 3.2.7. Prueba de Caldo Hipertónico  A partir de colonias con coloración verde en el medio CHROMagar Candida® crecidas durante 48 horas, se preparará una suspensión en agua destilada estéril con turbidez equivalente al patrón N° 5 de la escala de McFarland del cual se transfirieron 20 µL a 1 mL de caldo hipertónico (6,5 gramos de cloruro de sodio en 100 ml de caldo Sabouraud).  La incubación de los 261 aislamientos fue realizada a 32°C por 96 horas. Esta prueba tiene la capacidad de diferenciar C. albicans de C. dubliniensis ya que la presencia de turbidez es indicativo de crecimiento y esto sólo lo realiza C. albicans. Tabla 1. Pruebas fenotípicas para la caracterización de Candida albicans PRUEBA

Candida albicans

Candida dubliniensis

Crecimiento en agar AGS a 45ºC por 48 horas Crecimiento en agar AGS a 42ºC por 48 horas Producción de clamidosporas en Agar arroz Utilización de medio CHROMagar

99% de las cepas presentan crecimiento Todas las cepas presentan buen crecimiento En general produce clamidosporas terminales

En general ninguna cepa logra crecer

Caldo Hipertónico al 6,5% Actividad betaglucosidasa

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9% de las cepas logran crecer en estas condiciones Produce clamidosporas agrupadas de a pares, tripletas o cadenas largas, pero no todas las cepas las producen Produce colonias verdesProduce colonias verdes a las 48 azuladas a las 48 horas a horas a 37ºC, pero solo en cultivos 37ºC primarios Presencia de turbidez en el No evidencia turbidez en el medio medio Presencia de actividad Ausencia de actividad

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MICROBIOLOGÍA IV. RESULTADOS: 4.1. Caracterización fenotípica de Candida albicans.

Figura 1. Cepas de referencia utilizadas en las pruebas fenotípicas y moleculares sembradas en CHROMagar Candida®.

Figura 2. Microcultivo en Agar Tween – 80: Clamidoconidios. Esta imagen muestra las estructuras básicas de los clamidoconidios presentándose de forma única y agrupados de a pares o múltiples en la muestra de hemocultivo

Figura 3. Auxonograma: Prueba considerada base. Permite diferenciar C albicans de otras especies de Candida. Azúcares evaluados en sensidiscos: glucosa, galactosa, maltosa, sacarosa, melobiosa y lactosa.

Figura 4. Zimograma. En esta prueba se observa la fermentación la glucosa (Glu) y maltosa (Mal), siendo negativa la fermentación para sacarosa (Sac), trehalosa (Tre), galactosa (Gal) y lactosa (Lac). Característico de C. albicans. Figura 5. A.Grupo de cepas con crecimiento a 42°C comparadas con las cepas de referencia C. albicans ATCC 28367 y C. dubliniensis CBS 7987. B.C. albicans ATCC 28367 y C. dubliniensis CBS 7987 en caldo hipertónico fueron utilizadas como control de comparación.

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V. FUNDAMENTACIÓN: 5.1. Candidiasis orofaríngea A los pacientes con prótesis dentales se les debe sugerir remover y limpiar las prótesis todas las noches antes de acostarse, mediante cepillado y sumergiéndolas en una solución de desinfectante. Ante el paciente con sospecha clínica de candidiasis oral, se requiere investigar los factores predisponentes y de riesgo: xerostomía, tabaquismo, desnutrición, pérdida de la integridad de la mucosa oral mediante traumatismo, maceración y oclusión (prótesis dental), antecedente de quimioterapia, radioterapia, neoplasia, infecciones crónicas, así como enfermedades endocrinas y estados de inmunosupresión. El diagnóstico de la candidiasis orofaríngea es generalmente clínico. El médico de primer contacto debe reconocer e investigar las lesiones clínicas características, los factores predisponentes (locales y sistémicos), así como el tipo, la gravedad y la cronicidad de las lesiones. Para la identificación y el diagnóstico de las lesiones de la mucosa oral, se requiere de una historia clínica y exploración física completa de la cavidad oral. El conocimiento de las características clínicas, como el tamaño, la ubicación, la morfología de la superficie, el color, la presencia o no de dolor y la duración de las lesiones, son útiles para establecer el diagnóstico. Para el diagnóstico de la candidiasis orofaríngea, es importante identificar la localización y el tiempo de evolución de las lesiones, así como investigar la presencia de comorbilidad y el uso de fármacos, particularmente antimicrobianos y antineoplásicos. El patrón clínico reconocido con mayor facilidad es la candidiasis pseudomembranosa (aftas), el cual se presenta como placas blancas amarillentas que comprometen toda la mucosa bucal, principalmente en la cara interna de las mejillas, la superficie de la lengua paladar, encías y piso de la boca y que generalmente pueden desprenderse mediante raspado con una gasa o baja lenguas, dejando expuesta una base eritematosa, habitualmente no dolorosa. En el diagnóstico diferencial de la forma pseudomembranosa, se sugiere considerar lesiones blancas como quemaduras, leucoplasia, liquen, desechos alimentarios, infecciones bacterianas o alteraciones congénitas tipo nevo blanco esponjoso. En el caso de una quemadura, la historia clínica será definitiva, y en el liquen plano o leucoplasia no se desprenderán las lesiones ni responderán al tratamiento. Se sugiere considerar la posibilidad de candidiasis eritematosa ante la presencia de manchas rojas localizadas frecuentemente en el paladar duro y el dorso de la lengua, en pacientes con antecedente de uso de corticoesteroides o antimicrobianos de amplio espectro. Ante el paciente con lesiones características de candidiasis eritematosa se sugiere investigar la presencia de depapilación de la mucosa lingual, acompañada de la imposibilidad de ingerir alimentos ácidos, picantes y calientes; disfagia y pérdida del espesor de la lengua. Se sugiere considerar la sospecha clínica de candidiasis hiperplásica crónica ante la identificación de placas blancas que no pueden removerse con una gasa o baja lenguas y que habitualmente se localizan en la mucosa bucal, el paladar y la lengua. El paciente puede estar asintomático o bien referir ardor, escozor y/o alteración del gusto. Ante el paciente con candidiasis hiperplásica crónica se sugiere vigilancia y toma de biopsia para confirmar el diagnóstico y excluir displasia.

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En el diagnóstico diferencial de las formas hiperplásicas, se sugiere considerar: queratosis congénitas y leucoplasias, en estos casos los hallazgos de anatomía patológica y la respuesta al tratamiento, son elementos de apoyo para el diagnóstico. Durante la exploración física del paciente con queilitis angular se observa fisuras, eritema y/o lesiones costrosas, en las comisuras labiales. Habitualmente asintomática o bien asociado con ardor, escozor o irritación. Se sugiere considerar la sospecha diagnóstica de glositis romboidal media, ante la presencia de una zona central eritematosa de atrofia papilar de la lengua, que generalmente se observa en los fumadores o personas que usan corticoesteroides inhalados. En la mayoría de los casos, el diagnóstico de la candidiasis orofaríngea se basa en la identificación de signos y síntomas clínicos. Cuando el diagnóstico clínico no es claro o el paciente no responde al tratamiento antifúngico empírico, se pueden considerar pruebas adicionales, tales como: citología exfoliativa, biopsia de tejido o cultivo y pruebas de sensibilidad. Se puede sospechar el diagnóstico de candiadiasis esofágica cuando el paciente con candidiasis bucal refiere disfagia. La confirmación de la sospecha clínica de candidiasis se puede obtener por citología exfoliativa. El material obtenido se debe extender sobre un portaobjetos de vidrio. La aplicación de unas gotas de hidróxido de potasio al 10% (KOH) al frotis citológico fresco puede permitir el examen microscópico inmediato de la preparación. El médico o el estomatólogo generalmente pueden diagnosticar la candidiasis bucal observando la boca y la lengua, si el diagnóstico no es claro, se pueden llevar a cabo los siguientes exámenes: cultivo de lesiones bucales y examen microscópico de raspados bucales. Para mejorar la sensibilidad, del frotis citológico puede dejarse secar, fijar con etanol y teñir con ácido periódico de Schiff. Se sugiere utilizar la inmunofluorescencia para detectar anticuerpos anticandida, la cual tiene especial importancia en las candidiasis crónicas y en estudios clínicos, ya que en estas formas el frotis y el cultivo son menos concluyentes. D En ocasiones es necesario realizar un raspado de la lesión o zona afectada, para obtener una muestra y enviarla a laboratorio para la identificación de hifas e incluso realizar cultivo, para confirmar la especie y sensibilidad. VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 1. Muñoz V. Caracterización fenotípica y molecular de Candida albicans y Candida dubliniensis en muestras clínicas. [Tesis de Grado]. Facultad de Ciencias. Universidad Austral de Chile. Chile; 2012. Disponible en: http://cybertesis.uach.cl/tesis/uach/2012/fcm971c/doc/fcm971c.pdf 2. Rodríguez J., Miranda J., Morejón H., Santana J. Candidiasis de la mucosa bucal: Revisión bibliográfica. Rev Cubana Estomatol [revista en la Internet]. [citado enero13 del 2017] 2002; 39(2): 187-233. Disponible en: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0034-75072002000200007 3. Labarca M. Epidemiologial profile of invasive candidiasis in intensive care units at a university hospital. Rev. Chilena. Infectol, 28, 118-122; 2011. 4. Pineda G., Scollo K., Santiso G., Lehmann E., Arechevala A. Aislamiento de Candida dubliniensis en distintos materiales clínicos. Análisis de métodos fenotípicos de diferenciación con Candida albicans. Rev. Argentina Microbiol., 40, 211-217; 2008.

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CARACTERIZACIÓN DE MICROORGANISMOS DE LA CAVIDAD ORAL I. INTRODUCCIÓN: La cavidad bucal se considera un ambiente y sus propiedades influyen en la composición y la actividad de los microorganismos que en él se encuentran. El sitio donde los microorganismos crecen es el hábitat. Los microorganismos que permanecen y se desarrollan en un hábitat particular constituyen una comunidad microbiana formada por especies individuales. La comunidad en su hábitat específico junto con los elementos abióticos con los cuales los microorganismos están asociados, constituyen un ecosistema. El término nicho ecológico describe la función de los microorganismos en un hábitat particular y marca su papel en la comunidad. Este papel está dado por las propiedades biológicas de cada población microbiana. Las distintas interacciones ecológicas que se producen en la cavidad bucal son las determinan las características cualitativas y cuantitativas de la totalidad de su microbiota, en los distintos nichos ecológicos y en las distintas situaciones de salud (eubiosis) y enfermedad (disbiosis). La cavidad bucal del feto en el útero se encuentra libre de gérmenes. A partir del nacimiento dicha cavidad queda expuesta a la microbiota del tracto vaginal materno donde aparecen microorganismos tales como especies de corinebacterias, lactobacilos, coliformes y cocos anaerobios facultativos, anaerobios estrictos y algunas veces protozoos. A partir del nacimiento también se produce la sucesión de la microbiota oral que viene a ser la sustitución de unos microorganismos por otros en respuesta a modificaciones que afectan a las características intrínsecas del lugar en que habitan. Se trata de un proceso continuo en el que la microbiota que inicialmente se instaura en una zona recibe el nombre de comunidad pionera; diversas circunstancias van modificándola hasta conseguir cierto grado de estabilidad en su composición; la microbiota presente al completarse la dentición primaria y más tarde la dentición permanente es lo que se denomina comunidad clímax. Los microorganismos que se encuentran en la cavidad oral humana se han referido como la microflora oral, microbiota oral, o más recientemente, como el microbioma oral. Se define el microbioma oral humano como todos los microorganismos que se encuentran sobre o en la cavidad bucal humana y sus extensiones contiguas. Las comunidades microbianas orales son algunas de las floras microbianas más complejas del cuerpo humano formado por más de 700 especies bacterianas diferentes. Se utilizan las comunidades microbianas bucales como punto focal para describir una nueva tendencia y discutir su posible impacto en futuros estudios en microbiología. La comunidad microbiana oral es uno de los mejores modelos de biofilms para el estudio de interacciones entre especies. Interacciones bacterianas pueden afectar la composición de la comunidad microbiana, así como la incidencia de enfermedades. Múltiples nichos ecológicos mantienen por lo menos cinco principales ecosistemas bacterianos. Estos son: las bacterias en la lengua; bacterias en la mucosa bucal, bacterias del margen gingival de los dientes (placa supragingival); bacterias que son apicales al margen gingival (placa subgingival), y bacterias en la saliva. La cavidad bucal es también la puerta de entrada para una amplia gama de desafíos antigénicos, éstos son representados por la colonización bacteriana sustancial que existe en la cavidad oral. Muchas especies del complejo de la microbiota bucal mantienen una relación simbiótica con el hospedero. Para mantener la Escuela de Estomatología UCV - Piura

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homeostasis dentro de la cavidad oral, el anfitrión tiene dos sistemas inmunológicos distintos pero relacionados entre sí: el sistema de respuesta inmune salival y el sistema inmune proveniente del suero. El equilibrio cambiante de las condiciones en la boca influye en la estabilidad y la integridad de los tejidos mucosos orales. El equilibrio puede ser perturbado por tanto en un aumento del estrés local o una disminución de la inmunidad innata. Las bacterias han desarrollado mecanismos para asegurar su supervivencia y la reproducción mediante el control de su medio ambiente y eludir o modificar al hospedero, según sea necesario. Las bacterias han adaptado un equilibrio para el nicho ecológico que es proporcionado por las superficies totales de la boca, así como a las condiciones del entorno ambiental de la cavidad oral, por lo que un equilibrio dinámico suele existir entre la comunidad microbiana oral (microorganismos libres) y el anfitrión. En condiciones normales, "sanas”, el anfitrión recibe el estímulo inflamatorio adecuado de estas bacterias comensales para mantener una barrera eficaz inflamatoria pero no destructiva contra los patógenos potenciales. El contacto físico del huésped con la comunidad microbiana oral se lleva a cabo a través de la mucosa oral, especialmente las células epiteliales. A medida que pasa de una forma comensal a una forma patógena, una comunidad microbiana puede inducir cambios significativos en la estructura de los tejidos, con un desglose de la homeostasis oral. La microbiota comensal es un componente integral de un mecanismo de homeostasis complejo que impide la actividad de los microorganismos patógenos. En la composición óptima, los comensales puede prevenir tanto la unión y la multiplicación de patógenos, invasión y circulación de las células epiteliales. Los comensales suministrar nutrientes esenciales, regulan el desarrollo epitelial, y contribuyen a la maduración y mantenimiento del sistema inmune. Los habitantes comensales se han convertido en anfitrión adaptado durante una relación evolutiva larga. Bajo ciertas condiciones, un subconjunto de especies puede escapar de mecanismos de retención y de iniciar la enfermedad, estas especies han sido llamados comensales oportunistas. Hay evidencia creciente de que el sistema inmune innato puede discriminar entre comensales, y patógenos oportunistas, declarados, esta discriminación controla el equilibrio entre la intrusión microbiana y de integridad del hospedero. El crecimiento de los microorganismos orales está influenciado por una variedad de factores tales como la temperatura, pH, potencial de oxidación-reducción, la disponibilidad de nutrientes y el agua, la anatomía de las estructuras orales, flujo salival, y sustancias antimicrobianas. Cada factor en un hábitat oral determinado influye en la selección de los microorganismos orales y ayuda a mantener el equilibrio entre las poblaciones bacterianas. Existen diferencias en la microbiota oral entre los diferentes sitios de la cavidad oral y factores externos tales como la dieta o la higiene oral. Cuando las bacterias comensales cambian a un estado patógeno, una implicación significativa adicional dicha conversión puede ser causal para la aparición de la enfermedad bucal. Patógenos oportunistas son agentes infecciosos que normalmente no inducen la enfermedad en un hospedero sano, pero puede afectar a personas con un sistema de defensa que funcionan mal o inmunitario débil. El microbioma humano comensal se estima que superan en número a la cantidad de células del cuerpo humano por un factor de 10, éstas comunidades microbianas complejas son residentes normales de la piel, la cavidad oral, la mucosa vaginal e intestinal y llevan una amplia gama de funciones indispensables para el bienestar del anfitrión, sólo se hacen conscientes de su presencia cuando el equilibrio entre la microbiota y el huésped se pierde, y la enfermedad se manifiesta.

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La cavidad oral difiere de todos los hábitats microbianos humanos por la presencia simultánea de dos tipos de superficies para la colonización microbiana: mucosa y superficies sólidas (dientes). Esta propiedad intrínseca de la cavidad oral proporciona inmensas posibilidades para una amplia variedad de microbiota. Cuando el equilibrio se ve comprometido, y cuando aparece un desequilibrio entre las bacterias indígenas, infecciones bucales podrían ocurrir. Las bacterias orales comensales y patógenas pueden programar controladores de dominio. Los mecanismos de defensa locales que protegen contra la invasión de agentes patógenos, el sistema inmune de la mucosa han desarrollado mecanismos especializados de regulación anti-inflamatoria para eliminar o tolerar alimentos inofensivos y antígenos transportados por el aire, así como microorganismos comensales II. COMPETENCIAS:  Aplica procedimientos para la observación microscópica de microorganismos orales.  Enuncia a los principales microorganismos orales asociados a patologías bucodentales. III. MATERIAL Y MÉTODOS: 3.1. Materiales: a. De Laboratorio:  Láminas portaobjeto  01 Asa bacteriológica en anillo.  Set de Tinción de Gram y Set de tinción de Ziehl Neelsen.  03 Microscopios ópticos y 01Incubadora microbiológica.  Mecheros de alcohol o bunsen.  20 placas con agar sangre y 10 placas con agar mitis salivarius b. Del alumno (Individual):  Barreras de bioseguridad personal: Guantes descartables, mascarilla descartable y toca o gorro.  01 Marcador indeleble.  01 fosforo o encendedor. c. Del Alumno (grupal):  Paquete de hisopos de toma de muestra estériles.  Caja de láminas portaobjeto.  Muestra de saliva, sarro dentario y 01 diente cariado 3.2. Procedimiento: 3.2.1. Observación de microorganismos de la cavidad oral  Realizar un frotis directo de la cavidad oral con un hisopo estéril y teñir con set de Gram.  También se pueden realizar las otras tinciones especiales ya conocidas.  Una muestra puede ser sembrada en medios de cultivo selectivos para microorganismos orales como son: Agar sangre, agar sabouraud, agar manitol salado, medio CRT bacteriaMR, agar mitis salivarius, medio Alban y otros.  Sembrar por duplicado e incubar una placa en aerobiosis y la otra en anaerobiosis. 48 horas después de la incubación realizar tinciones Gram a partir de las colonias que desarrollaron y observar al microscopio.  A las colonias aisladas se les puede realizar pruebas bioquímicas para la identificación de las especies bactrianas aisladas.

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IV. RESULTADOS: 4.1. Microbiota oral  Bacterias  Cocos Gram Positivos: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Micrococcus sp., Peptococcus sp., Enterococcus faecalis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans, Streptococcus salivarius, Streptococcus mutans, Streptococcus mitis, Streptococcus sanguis, Streptococcus oralis, peptostreptococcus sp.  Cocos Gram Negativos: Neisseria sicca, Neisseria flavescens, Neisseria flava, Neisseria perflava, Veilonella sp.  Cocobacilos: (Gram Negativos) Haemophilus sp.  Bacilos Gram Positivos: Lactobacillus acidophillus, Actinomyces naeslundii, Actinomyces israelli, Actinomyces bovis, Biphidobacterium sp., Rothia dentocariosa, Corynebacterium matruchtii, Diphteroides.  Bacilos Gram Negativos: Prevotella sp., Fusobacterium sp., Porphyromonas sp., Capnocytophaga sp., Actinobacillus sp., Eikenella sp.  Espiroquetas: Spirochaeta plicatilis, Spirochaeta sp.  Espirilos: Campylobacter sp.  Micoplasmas: Mycoplasma hominis, Mycoplasma sp.  Levaduras: Candida albicans, Candida stellatoidea, Candida guillermondii.  Protozoos: Trichomonas tenax, Entamoeba gingivalis.

V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 1. Hormigot L., Enrique D., González A., Meriño Y. Estudio descriptivo transversal sobre promoción de salud bucal y nivel de conocimientos de caries dental en niños de 11-12 años. Medwave [en línea]. 2013 [acceso 24 de febrero de 2017]; 13 (5). Disponible en: http://www.medwave.cl/medios/medwave/PDFinvestigacion/ Junio2013/medwave.2013.05.5674.pdf 2. Rodríguez A., Martínez I. Influencia de la lactancia materna en el micrognatismo transversal y los hábitos bucales deformantes. Rev Med Electrón. 2011; 33 (1): 45-51. 3. Quirynen M., Teughels W., Kinder HS., Newman MF. Microbiología de las enfermedades periodontales. Periodontología clínica. 10a edición. México: Mac Graw-Hill Interamericana; 2010. 4. Riveron D., Pérez J., Fuentes I. Caries dental y ecología bucal, aspectos importantes a considerar. Rev Cubana Estomatol. 2006; 43 (1): 1-12 5. Sánchez M., Ustrell I., Torrent M. Fisiología bucal infantil: función y crecimiento de la cavidad oral del lactante. Matronas Profesión. 2003; 4 (14): 19-21.

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