Manual de Microbiologia Cuba UNAM

Manual de Técnicas Microbiológicas

Para la Evaluación de la Calidad Ambiental de Ecosistemas Marino costeros

HONORABLE AYUNTAMIENTO DE SOLIDARIDAD 2008-2011

CRÉDITOS COMITÉ EDITORIAL

Honorable Ayuntamiento del Municipio de Solidaridad C. Eduardo Román Quian Alcocer Presidente Dirección General de Ordenamiento Ambiental y Urbano Arq. Jorge Alonso Durán Rodríguez Director General Dirección de Medio Ambiente M. en C. Gladys Pérez de la Fuente Directora MANUAL DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS PARA EVALUACIÓN DE LA CALIDAD AMBIENTAL DE ECOSISTEMAS MARINO COSTEROS Ministerio de Ciencia, Tecnología y Medio Ambiente Instituto de Oceanología, Cuba Departamento de Microbiología-Necton Dra. María Elena Miravet Regalado M. en C. Diana Iris Enríquez Lavandera Dra. Margarita Lugioyo Gallardo Universidad Nacional Autónoma de México Instituto de Biología Departamento de Botánica Dra. María del Carmen González Villaseñor Colaboradores Dirección de Medio Ambiente M. en C. Gladys Pérez de la Fuente Directora M. en C. Nuria Joseph Montero Lic. María Cristina Capó de Paz Técnico Francisca Rodríguez Acosta

PREFACIO Estamos conscientes de la importancia de este libro para los especialistas de habla hispana que se desenvuelven en el tema del medio ambiente e incluso, para los estudiantes que se inician en esta línea, ya que brindan los detalles necesarios para determinar la calidad ambiental del ecosistema marino a partir de diferentes indicadores microbiológicos, que como es conocido, permite tomar medidas inmediatas para la protección y/o recuperación de las condiciones naturales. El presente Manual, resume las técnicas y metodologías de microbiología marinas más utilizadas para abordar los aspectos siguientes: • • • • • •

evaluación de la calidad del agua de uso recreativo, desde el punto de vista higiénico sanitario, evaluación de la calidad ambiental de las aguas y sedimentos en los diferentes ecosistemas marinos (arrecifes, manglares, pastos marinos, playas), determinación de microorganismos indicadores del grado de contaminación tanto orgánica, como por la presencia hidrocarburos, en la zona costera marina, velocidad de autodepuración de las aguas marinas (importante para inferir la capacidad de recuperación), parámetros microbiológicos útiles en estudios de factibilidad para situar granjas para cultivo de organismos marinos, indicadores microbiológicos necesarios para hacer “líneas bases” en sitios de desarrollo turístico, en aquellos donde se sitúen plataformas petroleras u otras industrias.

• Además de los indicadores de calidad ambiental, se incluyen técnicas para aislar microorganismos de peces, crustáceos, algas y otros organismos marinos con diversos fines, y de interés biotecnológico como: • •

técnicas para aislar microorganismos marinos productores de sustancias biológicamente activas (tensoactivos, polisacáridos y luciferasa), técnicas para estudiar la diversidad de hongos marinos en playas, manglares, y arrecifes.

El Manual ofrece también detalles explícitos y recomendaciones prácticas para facilitar el montaje de las técnicas e interpretación de los resultados, y constituye un basamento adecuado para estudios de pre y postgrado de microbiólogos y biólogos marinos. Se merece destacar que es una importante contribución para el Programa Integral de Playas Limpias en México, en el cual participa el H. Ayuntamiento del Municipio de Solidaridad, a través del Comité Local de Playas Limpias de la Zona Norte del Estado de Quintana Roo.

Editores

PRÓLOGO La historia evolutiva de los microorganismos se remonta a más de 3 mil 500 millones de años y una parte importante de ésta ha ocurrido en el medio marino. Desde entonces, los microorganismos constituyen un componente esencial de las redes tróficas de los ecosistemas marinos, con una gran abundancia y biomasa, contribuyendo a la regeneración de nutrientes e interactuando con una amplia gama de organismos. Los microorganismos marinos juegan un papel importante en los ciclos biogeoquímicos de carbono, el nitrógeno, el azufre, el fósforo, el hierro y los metales trazas, pero además constituyen nuevas fuentes de producción de sustancias biológicamente activas de interés para las industrias médico-farmacéutica, petrolera, alimenticia, etc. Este Manual de Técnicas de Microbiología Marina, está dirigido a estudiantes, docentes y especialistas de América Latina que se proponen a estudiar e investigar diferentes aspectos relacionados con las bacterias y los hongos que habitan en el ecosistema marino. Su principal ventaja es que en él se han recopilado técnicas y metodologías de trabajo muy utilizadas en esta especialidad, que se encuentran dispersas en diferentes publicaciones en otros idiomas, lo que facilita al usuario de habla hispana su consulta en un único documento. Otro aspecto importante de este documento, es que sirve de apoyo a los profesores en la preparación y desarrollo de los programas dre educación superior relacionados con las ciencias marinas, y a los jóvenes graduados que se inician en los trabajos de ecología microbiana marina. El manual se ha conformado dividido en seis capítulos. En el primero se abordan aspectos teóricos generales sobre la distribución e importancia de los microorganismos marinos en el ecosistema y algunas generalidades de los principales biotopos que caracterizan nuestra región. El segundo capítulo reune algunas de las técnicas más utilizadas de enumeración de bacterias heterótrofas, sulfatoreductoras y coliformes, de suma importancia en estudios de contaminación orgánica y fecal en aguas marino costeras, así como las técnicas de aislamiento de bacterias degradadoras de hidrocarburos y productoras de tensioactivos, productoras de polisacáridos, bacterias luminicentes, bacterias asociadas a peces invertebrados marinos, y bacterias asociadas a macroalgas y fanerógamas marinas. En el tercer capítulo se describen técnicas y metodologías de aislamiento de hongos marinos de playas, pastos marinos, manglares, y hongos asociados a gorgónidos, haciéndose referencia a las claves más actualizadas de identeificación de estos microorganismos. El cuarto capítulo explica los métodos que se utilizan para la conservación de bacterias y hongos en el laboratorio, brindando referencias que permiten profundizar en detalles específicos para cada caso. En el capítulo quinto se describen las técnicas de conteo total de mecroorganismos empleando microscopía de epifluorescencia, la determinación de bimasa a partir del

volumen celular y el conteo total y varios métodos para determinar la productividad bacteriana. También, se presentan las técnicas para determinar la productividad bacteriana. También, se presentan las técnicas para determ,inar la fotosíntesis, producción primaria y respiración, aspectos sumamente importantes en los estudios sobre el funcionamiento del medio marino, y por último, se describen las técnicas para determinar la intensidad de los procesos de descomposición aerobia y anaerobia de la materia orgánica, respectivamente, empleando métodos que no requieren de una infraestructura compleja y recursos sofisticados. El capítulo sexto y final, brinda la composición de los medios de cultivo que se han citado en los capítulos dos y tres, lo que permite disponer de toda la información técnica necesaria para realizar las técnicas descritas. Las técnicas que se describen en este manual han sido probadas con éxito en el Laboratorio de Microbiología Marina del Instituto de Oceanía de Cuba y en el Laboratorio de Ascomicetos del Instituto de Biología de la Universidad Nacional Autónoma de México. Resulta meritorio el empeño colectivo de las autoras de poner a disponer del alumnos y profesores el resultado de sus experiencias para contribuir al conocimiento del mundo marino. Esperamos que el noble propósito de las autoras les permita a los lectores seguir los caminos de los nuevos conocimientos para habitar un mundo más sano y mejor.

Dra. Lina Domínguez Acosta Viceministro Ministerio de Ciencia , Tecnología y Medio Ambiente de Cuba

“Hay más microorganismos en el mar que estrellas en el universo” Copley, J. 2002. All at sea. Nature 415: 572-574.

ÍNDICE PREFACIO PRÓLOGO CAPÍTULO 1. Introducción. 1.1. Distribución de los microorganismos en el mar ........................................................ 1.2. Importancia de los microorganismos marinos ............................................................ 1.3. Características de los Ecosistemas marinos ............................................................... CAPÍTULO 2. Técnicas de Bacteriología. 2.1. Enumeración de bacterias heterótrofas aerobias mesófilas ........................................ 2.2. Enumeración de bacterias sulfatoreductoras .............................................................. 2.3. Enumeración de Coliformes totales y fecales ............................................................ 2.4. Enumeración de Estreptococos fecales ...................................................................... 2.5. Aislamiento de bacterias degradadoras de hidrocarburos .......................................... 2.6. Aislamiento de bacterias productoras de sustancias tensioactivas ............................. 2.7. Aislamiento de bacterias productoras de polisacáridos extracelulares ....................... 2.8. Aislamiento de bacterias luminiscentes ...................................................................... 2.9. Aislamiento de bacterias asociadas a organismos marinos ........................................ 2.10. Aislamiento de bacterias asociadas a macroalgas y fanerógamas marinas............... CAPÍTULO 3. Técnicas Micológicas. 3.1. Aislamiento de hongos en las playas .......................................................................... 3.2. Aislamiento de hongos de los pastos marinos ............................................................ 3.3. Aislamiento de hongos asociados al mangle .............................................................. 3.4. Aislamiento de hongos asociados a organismos marinos ........................................... CAPÍTULO 4. Métodos de Conservación. 4.1. Bacterias ..................................................................................................................... 4.2. Hongos ........................................................................................................................ CAPÍTULO 5. Técnicas y Métodos en Ecología microbiana. 5.1. Conteo Directo del Número Total de microorganismos ............................................. 5.2. Determinación de biomasa ......................................................................................... 5.3. Determinación de la Productividad bacteriana ........................................................... 5.4. Determinación de la Fotosíntesis, la Producción primaria y la Respiración ............... 5.5. Determinación de la intensidad del proceso de mineralización aerobia de la materia orgánica ..................................................................................................... 5.6. Determinación de la intensidad del proceso de mineralización anaerobia de la materia orgánica en los sedimentos ................................................................... CAPÍTULO 6. Medios de Cultivo. 6.1. Bacterias ..................................................................................................................... 6.2. Hongos ........................................................................................................................

4 6 9 21 28 32 40 46 51 56 60 64 73 79 84 88 92 99 405 111 117 123 131 137 142 147 160

Capítulo 1 Introducción

INTRODUCCIÓN Microorganismo es un término que incluye distintas formas de vida que comparten la característica común de tener un tamaño menor de 200 µm (Tabla 1). Estas formas de vida pueden pertenecer a cualquiera de los tres dominios de la vida que existen en nuestro planeta, Archaea, Bacteria y Eukarya (Woese et al. 1990), e incluye desde procariotas (bacterias y arqueas) hasta eucariotas (algas y protistas fagotrofos), tanto autótrofos como heterótrofos. Asimismo, dentro del ámbito de estudio de la Microbiología se incluyen los virus y otros agentes subvíricos que no presentan estructura celular (López y Zaballos, 2005). Recientemente, se ha propuesto un nuevo dominio biológico denominado Akamara para incluir estas formas de vida (Hurst, 2000). Dentro de este nuevo dominio se propone incluir dos reinos, Euviria (virus verdaderos) y Viroidia (viroides y virusoides), y una organización en phyla, clases, órdenes, géneros y especies similar a la del resto de seres vivos (Hurst, 2000). Tabla 1. Diferentes categorías en que se agrupan los microorganismos de acuerdo a su tamaño (Tomado de Sherr, E. y Sherr, B. 2000. Marine microbes: an overview. En: Microbial Ecology of the Oceans. Ed. D.L. Kirchman, Wiley-Liss, New York. 13-46).

Categoría

Grupo Microbiano

Tamaño (µm)

Femtoplancton

Viruses

0.01-0.2

Picoplancton

Procariotes Bacterias Fotoautótrofos Proclorofitas Cianobacterias cocoides Cianobacteriasfilamentosas

0.5 – 1.0 0.5 – 2.0 1.0 – 2.0 7-10 ancho 2mM SO42-), por tanto, predomina la respiración anaerobia mediante sulfatos como aceptor de electrones, pudiendo llegar a representar el 50% de la mineralización de carbono orgánico. Las BSR juegan un papel importante en el ciclo del azufre en el océano removiendo la mayor parte del sulfato (aproximadamente 1011 kg) que llega al mar cada año por el aporte de los ríos debido al escurrimiento terrígeno (Battersby, 1988). Objetivo: Determinar el número de bacterias sulfatoreductoras en muestras de aguas y sedimentos marinos por el método de Número Más Probable. Materiales, reactivos, medio de cultivo y equipos empleados. Materiales. Frascos de vidrio de 150 mL de capacidad. Frascos de vidrio de 50 mL de capacidad. Pipetas estériles de 10 y 1 mL. Tubos con tapas de rosca.

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TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA Reactivos y medio de cultivo. Buffer Fosfato. Medio API (Overzil, 1970). Equipos. Incubadora bacteriológica. Jarra mezcladora estéril. Zaranda. Detalles experimentales. La mayoría de las BSR crece bien a temperaturas entre 25 y 35°C, aunque usualmente se cultivan a una temperatura de incubación de 30°C. El sustrato es el factor selectivo determinante para el crecimiento de un tipo u otro de BSR procedente de aguas marinas o de otro medio en particular, por tanto, existen varios medios de cultivos recomendados para los diferentes tipos de BSR. En este acápite se utiliza el medio API (American Petroleum Institute) recomendado por Overzil, (1970), y se emplea la metodología de diluciones seriadas en tubos múltiples para determinar el Número Mas Probable (NMP). Procedimiento. Se inoculan 10, 1 y 0.1 mL de la muestra de agua de mar en series de cinco tubos estériles y posteriormente, se le añade 10 mL de medio API a la primera serie de cinco tubos (muestra sin diluir) y 9 mL a las series siguientes de tubos (diluciones 1/10 y 1/100, respectivamente). Se cierra cada tubo con tapa de rosca y después de rotularlos convenientemente, se incuban a 30°C de 2 a 4 semanas. Debe prepararse un tubo “control” sin inóculo. Se consideran positivos aquellos tubos donde ocurre un cambio de color de rojo a negro. En el caso de que sean muestras de sedimento, se toman 50g de muestra del horizonte seleccionado, y se suspenden en 450 mL de agua de mar estéril o en Buffer Fosfato. Se homogenizan en una jarra mezcladora estéril por 1 a 2 min, o en zaranda por 15 min, obteniéndose de esta forma la dilución 1:10. A partir de esta dilución, se preparan las restantes diluciones decimales: se toma 1 mL de la dilución 1:10 y se lleva a un tubo que contiene 9 mL de agua de mar estéril o Buffer Fosfato, se homogeniza el contenido obteniéndose así la dilución 1:100. Si se requiere mayor número de diluciones se seguirá el mismo procedimiento siempre utilizando una pipeta estéril para cada dilución. Posteriormente, se inoculan series de 5 tubos y se rellenan con medio API. Los primeros 5 tubos inoculados con 10 mL de la dilución 1:10 se les añaden 10 mL de medio API y constituyen las porciones de 1g. Se tomarán 5 alícuotas de 1 mL cada una de la dilución 1:10 y se inocularan en 5 tubos a los cuales se les añaden 10 mL de medio API, éstos constituyen las porciones de 0.1g. Se tomarán 5 alícuotas de 1 mL cada una de la dilución 1:100, 1:1000, 1:10000, así sucesivamente, hasta la última dilución empleada y se inocularán en tubos que se llenan con el medio API, éstos constituyen las porciones de 0.01g, 0.001g, 0.0001g y demás respectivamente. Se incuban los tubos a 30°C Página 29

TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA de 2 a 4 semanas y al igual que en el caso de las muestras de agua, un cambio de coloración del medio de rojo a negro se considera positivo. Conteo y cálculos La densidad de bacterias sulfatoreductoras en las muestras de agua se expresa como el NMP de BSR por 100 mL de muestra, y en el caso de los sedimentos, se puede expresar NMP de BSR/ 100g de peso seco o por gramo de peso húmedo. La Tabla de NMP también puede ser utilizada cuando volúmenes mayores y menores de la muestra son inoculados. En este caso se procesa un código formado por los números de tubos con resultados positivos para BSR obtenidos en las tres series consecutivas inoculadas, verificándose el valor de NMP correspondiente a el. Para el cálculo del NMP de bacterias sulfatoreductoras en los sedimentos, el NMP/100g será dada a través de la siguiente fórmula: NMP correspondiente al código x 10 NMP/100g (peso seco)= ----------------------------------------------------Mayor vol. inoculado seleccionado para conformar el código Ejemplo: Porciones en los tubos inoculados

A B C D E

NMP del Código 530

1g + + + + + 5 0.1g + + + - 3 0.01g - - - - - 0

80

Cálculo NMP/100g

80x10/1 = 800

+ : tubos con cambio de color de rojo a negro - : tubos que no muestran cambio de color del medio NMP/100g (peso húmedo) = 800. NMP/ g (peso húmedo) = 8. Resultado del peso seco obtenido = 0.4g 1g (peso seco) NMP/g (peso seco) = NMP/g (peso húmedo) x ---------------------- Peso seco (g) Por tanto: NMP/g (peso seco) = 8 x 1g/ 0.4 = 20 NMP/g En los casos considerados como negativos (código 000) el resultado se expresará como