Manual de Microbiologia Alimentos

 

 

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Índice 1. Preparação de Amostras..................... ........................................... ............................................. ............................................. .............................. ........ 2 2. Soluções Genéricas ........................................... .................................................................. ............................................ ..................................... ................ 4 3. Coloração de bactérias –  Método de gram................... ......................................... ............................................ ........................... ..... 5 4. Contagem padrão em placas ........................................ .............................................................. ............................................. ........................... .... 7 5. Contagem de mofos e leveduras ...................... .............................................. .............................................. ................................... ............. 10 6. Bolores e leveduras osmofílicos ................... .......................................... ............................................. ....................................... ................. 11 7. Coliformes ...................... ............................................. .............................................. ............................................ ............................................ ........................... 11 8. Coliformes Fecais .................................................... ........................................................................... ............................................. ............................ ...... 12 9. Staphylococcus aureus ...................... ............................................ ............................................. ............................................. ............................ ...... 17 10. Bacillus cereus ..................... ............................................ .............................................. ............................................. ....................................... ................. 19 11. Salmonella sp. ................... .......................................... ............................................. ............................................ ........................................... ..................... 23 12. Viabilidade da flora flora bacteriana do do iogurte ( número relativo de Streptococcus thermophilus

e Lactobacillus bulgaricus ) ..................... ........................................... ............................................. ........................... 31 13. Esporos Mesófilos..................... ........................................... ............................................. ............................................ ................................... .............. 32 14. Esporos Termófilos ..................................... ........................................................... ............................................. ........................................ ................. 32 15. Lipolíticos .............................................................. ..................................................................................... ............................................. ............................ ...... 33 16. Proteolíticos ...................... ............................................ ............................................. ............................................. ........................................... ..................... 34 17. Teste de esterilidade comercial –  Exame  Exame de alimentos enlatados ............................ ............................ 35 18. Halofílicos............................................... ...................................................................... ............................................. ........................................... ..................... 42 19. Clostrídios Sulfito Redutores...................... ............................................ ............................................. ........................................ ................. 43 20. Teste de Segurança Biológica - Esterilidade..................................................... Esterilidade.............................................................42 ........42

 

 

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1.  Preparação de Amostras As amostras devem ser analisadas o mais breve possível, de preferência assim que chegam ao laboratório. -1

Pesar quantidade adequada para preparar uma diluição 10 , perto do fogo, usando material estéril para não contaminar a análise. Pesar juntamente com o material para ser analisado, uma porção para contra-prova que deverá ficar na geladeira (o recipiente também deve ser estéril). Diluente

g de amostra

90 mL

10g

99 mL

11g

225 mL

25g

O diluente usado para preparar a amostra, como para as diluições decimais é a água  peptonada 0,1% (usa-se (usa-se peptona peptona de caseína caseína ou lactopeptona). lactopeptona). 1. Produtos sólidos sólidos e em pó (queijos, (queijos, embutidos, embutidos, cortes cortes de frango, frango, alimentos  preparados, pudins, pudins, etc) -  Descongelar Descongelar produtos que foram congelados em refrigerador de 2 a 10°C por no máximo 18 horas antes da análise; -  Com o auxílio de pinças e bisturis estéreis, cortar e pesar assepticamente, 25g da amostra; -  Adicionar 225 ml de água peptonada 0,1%, preparada conforme descrito no COM 013; -  Homogeinizar por 30 segundos em liquidificador com copo triturador esterilizado ou em stomacker, usando velocidade média para não aquecer a mistura; -  Preparar as diluições necessárias para realizar o trabalho desejado, conforme o tipo de análise e amostra a analisar; -  Expressar os resultados obtidos da contagem com UFC/g de produto. 2. Água e produtos líquidos -  Homogeinizar a amostra agitando-a por no mínimo 25 vezes; -  Preparar as diluições sucessivas sucessivas necessárias para realizar as análises do ttrabalho rabalho desejado, considerando o nível de contaminação. As diluições são preparadas, transferindo-se 1 ml da amostra para um tubo contendo 9 ml de água peptonada 0,1%. Para preparar a diluição seguinte, retirar 1 ml deste tubo e transferir para outro tubo que contenha 9 ml de água peptonada 0,1%; -  Expressar os resultados por ml de produto.

 

 

3

 

 

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Genéricas  2. Soluções Genéricas  Álcool iodado

Iodo metalóide

Tintura de iodo a 2%

2,0 g

Iodeto de K

6,0 g

Água destilada

10 mL

Álcool 96 qsp

100 mL

Diluir o iodeto com H2O, acrescente o Iodo e por ultimo o álcool. Álcool Iodado = 20 mL da tintura de iodo a 2% em 1 litro de álcool 70 .

Vaspar Derreter e misturar juntos quantidades iguais de vaselina sólida e parafina. Distribuir em frascos de boca larga e esterilizar em autoclave a 121 C por 15 min. Obs.: Parafina líquida estéril pode ser usada, mas não permitirá detecção de produção de gás. Solução Salina

Solução fisiológica 0,85% NaCl  NaCl

0,85 g

H2O

100 Ml

Esterilizar em autoclave a 121 C por 15 min.

 

 

5

3. Coloração de bactérias –  Método  Método de gram   Com auxílio de alça de platina, coletar parte de uma colônia de bactérias e transferir



 para lâmina de vidro; vidro;   Fixar o esfregaço pelo calor, aproximando-o da chama do bico de Bunsen;



  Corar o esfregaço com uma solução de cristal violeta, por 1 min;   Lavar com água para retirar o excesso do corante e cobrir com lugol por 1 min;





  Lavar com água corrente;



  Diferenciar com etanol absoluto ou uma solução de etanol-acetona(1:1), etanol-acetona(1:1), 30 s;



  Lavar com água corrente;



  Corar com fucsina ou safranina;



  Lavar com água corrente;



  Secar e levar ao microscópio.



Interpretação resultados -  Gram dos positivo: A parede celular das bactérias é desidratada pala ação do álcool, diminuindo sua permeabilidade, com isso o complexo iodo-cristal violeta não é removido e no microscópio observa-se coloração púrpura. -  Gram negativo: A alta concentração de lipídios aumenta a permeabilidade da  parede celular das bactérias gram negativas, facilitando a extração do d o completo iodo-cristal, assim, essas bactérias aparecem tingidas apenas pelo tratamento com fuccina fenicada, apresentando portanto, coloração rósea. Exemplo: Pseudomonas,, Escherichia coli. Pseudomonas Solução Cristal Violeta Cristal Violeta

1,0 g

Etanol Fenol

10,00 mL 2,0 mL

H2O destilada

100,0 mL

Dissolver o corante no álcool. Juntar lentamente o fenol e após a água, também lentamente, misturando até obter homogeinidade. Deixar em repouso por 24 horas e após filtrar.

 

 

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Solução de Lugol Iodo

1,0 g

Iodeto de Potássio

2,0 g

H2O destilada

300,0 mL

Solução de Fuccina Fenicada Fuccina

0,3 g

Etanol

10,0 mL

Fenol

5,0 mL

H2O destilada

95,0 mL

Dissolver o corante no álcool. Juntar lentamente o fenol e após a água, também lentamente, misturando até obter homogeinidade. Deixar em repouso por 24 horas e após filtrar.

 

 

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placas  4. Contagem padrão em placas  Os métodos de contagem padrão em placas oferecem o número de microorganismos viáveis no alimento, pela utilização do meio de cultivo adequado, de maneira a promover o crescimento do mais amplo espectro de microorganismos  presentes na amostra amostra sob análise. Alguma Alguma seletividade será será exercida pela temperatura temperatura de incubação. Em muitos casos, como nos alimentos processados, a contagem padrão demonstra o nível geral de higiene durante a fabricação, condições de armazenamento armazenamento e transporte, etc, daquele alimento, enquanto os produtos não processados podem ser indicados pela qualidade do alimento. A precisão do método pode ser limitada pela incapacidade de alguns microorganismos formarem colônias visíveis no meio e condições utilizáveis, como também, pela presença de substâncias inibidoras produzidas  por microorganismos do próprio alimento durante o crescimento crescimento no ágar. ágar. Quando presentes em números elevados, os psicotróficos podem causar uma variedade de alterações em produtos conservados sob refrigeração. A maioria dos organismos psicotróficos são destruídos pelo calor. Assim, sua presença pode indicar subprocessamento térmico ou contaminação pós-processamento em produtos  pasteurizados; a elevação do seu número está associada a uma estocagem prolongada sob refrigeração ou manutenção a frio inadequada, ou ainda, pode significar risco de alteração tanto para produtos processados como não processados. Microorganismos termófilos são aqueles que podem sobreviver de forma significativa ao tratamento térmico. Usualmente o tratamento térmico inclui temperaturas de pasteurização ou superiores. A presença de termófilos em grande quantidade está relacionada com a qualidade higiênica da matéria-prima ou  processamento térmico insuficiente. Meios utilizados Água peptonada 0,1% Peptona de caseína

0,1 g

H2O dest.

100 mL  pH - 7,0  0,2

 

 

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Ágar padrão para contagem (PCA) Extrato de levedura

2,5 g

Triptona

5,0 g

Glicose

1,0 g

Ágar

15 g

H2O dest.

1000 mL  pH - 7,0  0,1

Técnica   Psicotróficos



Semeadura de 0,1 mL das diluições sobre a superfície do ágar previamente distribuído em placas.   Mesófilos eTermófilos



Adicionar o PCA fundido e resfriado a 50 C nas placas de Petry contendo1 mL da diluição adequada, misturar e deixar solidificar. Contar as placas com 25 a 250 colônias. Incubação: Termófilos - 55C por 48 horas. Mesófilos –  35  35 C por 48 horas. Psicrotróficos –  7  7 a 10 C por 7 a 10 dias.

 

 

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1 mL

10-1

1mL

1mL

1 mL

10-2

10-3

(9 mL)

(9 mL )

1mL

1mL

1mL

1mL

 

 

10

5. Contagem de mofos e leveduras Os mofos e leveduras estão presentes no meio ambiente e podem fazer parte da flora do alimento. As vezes podem ser responsáveis pela deterioração de muitos tipos de alimentos, os quais, pelas suas características de baixo pH e de atividade de água, conteúdo de sal ou açúcar e estocagem em baixa temperatura, favorecem o seu desenvolvimento. Alguns podem causar problemas nos alimentos devido a sua resistência ao calor, congelamento, antibióticos e irradiação, além de formação de toxinas. Podem também transformar substratos impróprios em favoráveis ao desenvolvimento desenvolv imento de bactérias patogênicas. Meios utilizados Água peptonada 0,1% Ágar batata glicosado Glicose

20 g

Ágar Água destilada

15 g 1000 mL

 No momento da utilização, fundir, resfriar a 45 C e acidificar até pH 3,5 (1 mL do ácido para 100 ml do meio) com ácido tartárico a 10 % estéril. Não aquecer após a adição do ácido. Técnica: 1 mL

10-1 1 mL

1 mL

1 mL

1 mL

10-2

10-3

(9 mL)

(9 mL )

1 mL

1 mL

1 mL

 

 

11

Adicionar o ágar, misturar e deixar solidificar. Incubar as placas invertidas de 3 a 5 dias a 25 C. Contar as placas com 10 a 150 colônias. 6. Bolores e leveduras osmofílicos  No caso de amostras de mel, e outros produtos com alta concentração de açúcares, contar bolores e leveduras osmofílicos em paralelo ao ágar batata normal. Usar: Ágar batata + 20% de glicose (ágar normal + 18 g de glicose para 100 ml de meio). Diluente água peptonada 0,1% + 20% de glicose. 7. Coliformes Coliformes são bastonetes Gram negativos, aeróbios e facultativamente anaeróbios, que fermentam a lactose com formação de gás em 48 horas a 35 C. A especificação do meio e da temperatura é crítica para a interpretação dos resultados. Com base nas evidências disponíveis, 20 ou mais espécies representativas atendem aos critérios que definem o grupo coliforme. O grupo coliforme, que não identifica os membros individualmente, tem menor valor interpretativo que o único organismo c oli, bem como o grupo coliforme de origem fecal, pois o grupo coliforme índice, a  E. coli

 pode conter alguns alguns membros não não entéricos como o gênero gênero Serratia e Aeromonas. Meios utilizados: Água peptonada a 0,1%

Caldo Lauril Sulfato Triptona

20 g

 

 

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Lactose

5,0 g

 NaCl

5,0 g

Lauril Sulfato de Sódio

0,1 g

K 2HPO4 

2,75 g

KH2PO4 

2,75 g

H2O dest.

1000 mL  pH –  6,8  6,8  0,1

Caldo Verde Brilhante Bile 2% Lactose Lactose Peptona

10 g

Lactose

10 g

Bile concentrado

20 g

Verde brilhante

0,0133 g

H2O dest.

1000 mL  pH –  7,4  7,4  0,1

Técnica:   Semear as diluições em série de 3 tubos de caldo lauril;



  Incubar a 36



  1 C por 48 horas e separar os tubos positivos (gás no tubo de



Durham);  



Tubos positivos = inocular no Caldo verde brilhante bile 2%;

  Incubar a 36  1 C por 48 horas;



  Calcular o NMP de colônias através do número de tubos positivos, consultando



tabela específica;   Resultado = (NMP) por g ou mL.



8. Coliformes Fecais

 

 

13

A separação dos coliformes de origem fecal daqueles de origem não fecal é feita através de testes baseados em incubação à temperaturas elevadas. Tais testes são usados internacionalmente com algumas variações. Entretanto estes métodos não são absolutos. O termo coliforme de origem fecal não pretende identificar, mas apenas indicar, a  presença de E. coli, não separando esta bactéria das demais, geralmente considerada consideradass de  pouco ou nenhum significado em saúde pública. Por outro lado, a presença de microrganismos do grupo de origem fecal no alimento pode ser atribuído a uma contaminação pelo ambiente e não necessariamente a uma contaminação fecal direta, e o seu número pode estar associado ao desenvolvimento no próprio produto. Como para os demais coliformes, a tolerância ou não para este grupo, depende do tipo de produto  para análise, e das condições necessárias de higienização e sanitização nos locais de estocagem, fabricação e processamento de alimentos. Sua interpretação e tolerância,  portanto, tem mais mai s sentido quando da comparação dos resultados obtidos em função da  padronização da da metodologia analítica. analítica. Meios utilizados Caldo EC Peptona de caseína

20 g

Lactose

5,0 g

Sais biliares

1,5 g

K 2HPO4 

4,0 g

KH2PO4 

1,5 g

 NaCl

5,0 g

H2O dest.

1000 mL  pH –  6,9  6,9  0,2

Ágar EMB –  Seg.  Seg. Levine Peptona de carne

10 g

Lactose

10 g

 

 

14

K 2HPO4 

2,0 g

Eosina amarela

0,4 g

Azul de metileno

0,065 g

Ágar

15 g

H2O dest.

1000 mL  pH –  7,0  7,0  0,2 Caldo triptona

Triptona

10 g

 NaCl

5,0 g

H2O dest.

1000 mL  pH –  6,9  6,9  0,2

Proteose peptona

Caldo VM-VP

7,0 g

Glicose

5,0 g

K 2HPO4 

5,0 g

H2O dest.

1000 mL  pH –  7,0  7,0  0,2 Ágar Citrato –  Seg.  Seg. Simons

 NH2PO4

1,0 g

K 2HPO4   NaCl

1,0 g 5,0 g

Citrato de sódio

2,0 g

MgSO4. 7H2O

0,2 g

Azul de Bromotimol

0,08g

gar

15 g

H2O dest.

1000 mL  pH –  6,9  6,9  0,1

Reagentes: Reativo de Kovacs

 

 

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Paradimetilaminobenzaldeído Paradimetilaminobenz aldeído

5,0 g

Álcool isoamílico

75 mL

HCl conc.

25 mL

Dissolver o benzaldeído em álcool e após adicionar o HCl. Acondicionar em frasco escuro em geladeira. Alfa Naftol Alfa-naftol

5,0 g

Etanol

100 mL

Estocar em frascos escuro e sob refrigeração. refri geração. Evitar contato.

Hidróxido de potássio KOH

40 g

H2O dest.

100 mL

Técnica:   Tubos positivos de lauril repicar para Caldo EC;



  Incubar em banho-maria 44,5  0,2 C por 24 horas;



  Controle teste: + E.coli , - E. aerogenes;



 



Considerar o resultado confiável quando os controles confirmarem.

  Resultado em NMP.



10-1 

10-2 Caldo Lauril

10-3

 

 

16

48 h a 36C Tubos positivos

Brilha Broth

Caldo EC

48 h a 36C

24 h a 44,5C

Coliformes totais

Continua com testes bioquímicos os Tubos com resultados positivos TESTES BIOQUÍMICOS

24h a 37C 

C. Triptona (24h)

C. VM(48h)-VP(5 dias)

Ágar citrato (24h)

Interpretação dos resultados:   Produção de indol  –   no no caldo Triptona adiciona-se 0,3 mL do reagente de Kovacs.



 E. coli = coloração vermelha no vermelha  no álcool.

  Vermelho de metila –  1  1 mL do meio VM-VP + 3 gotas de vermelho de metila



 E. coli = coloração vermelha.  E. aerogenes = amarelo.

 

 

17

  Vogues –  Proskauer  Proskauer –  meio  meio VM-VP + 0,3 mL m L de alfa-naftol + 0,1 ml de KOH 4% +



gotas de creatina a 5% em NaOH 0,1 N.  E. coli = sem alteração.  E. aerogenes = coloração vermelha.

  Citrato



 E. coli = sem alteração.  E. aerogenes = meio fica azul azul..

9. Staphylococcus aureus  O S. aureus  representa um risco para a saúde pública pela produção de enterotoxina estafilocócica, agente causal de intoxicação alimentar. A determinação de S. aureus é importante para:   Confirmar intoxicação causada pelo mesmo;



  Identificar alimentos veiculadores desta bactéria;



  Demonstrar contaminação pós-processamento por manipulação humana.



 No que se refere às matérias-primas, deve-se considerar a possibilidade de sobrevivência durante o processo de transformação das mesmas. A presença de S. aureus  em produtos fermentados pode indicar fermentação imprópria. Meios utilizados Água peptonada a 0,1%

Ágar Baird –  Parker  Parker Extrato de carne

5,0 g

Triptona

10 g

Extrato de levedura

1,0 g

Piruvato de sódio

10 g

Glicina

12 g

 

 

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Cloreto de lítio

5,0 g

Ágar

20 g

H2O dest.

1000 mL  pH –  6,8  6,8  0,2

Antes do uso, fundir e resfriar a 50 C. Adicionar:   95 mL do meio base;



  4,8 mL de emulsão de gema de ovo (50%);



  1,0 mL de telurito de potássio 1%.



Caldo cérebro coração Infusão de cérebro de terneiro

12,5 g

Infusão de coração de boi

5,0 g

Peptona

10 g

 NaCl

5,0 g

 Na2HPO4 

2,5 g

Glicose

2,0 g

H2O dest.

1000 mL  pH –  7,4  7,4  0,1

Técnica:  



Semear em superfície de Ágar Baird-Parker, 0,1 mL de cada dil., espalhar o inóculo  pela superfície com bastão bastão em L; L;

  Incubar a 36C por 48 horas.



  Contar as col. típicas ( negras, com 2 halos: um opaco e um translúcido) e atípicas.



TESTES BIOQUÍMICOS Isolar 5 colônias ou a raiz do número contado e transferir para ágar nutriente inclinado. Incubar a 36 C por 24 horas.

Coagulase   Inocular uma alçada para caldo BHI; 

 

 

19

  36C por 24 horas;



  Retirar 0,3 mL para tubo estéril;



  0,5 mL de plasma de coelho



  Resultado = positivo para S. aureus  –  –  coágulos.   coágulos.



Gram Apresentam-see como coccus Gram positivos agrupados em cachos. Apresentam-s Catalase Em lâminas de vidro colocar uma porção da cultura + 1 gota de água oxigenada (H2O2) 10 volumes. Resultado = Staphylococcus –   –  todos  todos positivos. 0,1 ml em Baird - Parker 37C/48 horas ágar nutriente 37C/24 horas Testes Bioquímicos BHI

Catalase

Gram

(37C/4-24 h) 0,3 ml +0,5 plasma coágulos (+) 10. Bacillus cereus  O  Bacillus cereus  é um bastonete, gram-positivo, esporulado, aeróbio e anaeróbio facultativo. É comum no solo, vegetais, alimentos crus e processados. processados. Alimentos com contagens superiores a 10 6 UFC/g podem produzir intoxicação alimentar. Normalmente os alimentos implicados em intoxicações foram submetidos a um tratamento pelo calor, porém não foram esfriados com rapidez, nem conservados em

 

 

20

temperaturas de refrigeração, permitindo deste modo que os poucos esporos que sobreviveram ao tratamento térmico, germinassem e posteriormente multiplicassem  produzindo enterotoxinas. enterotoxinas. Meios utilizados Água peptonada 0,1 % Ágar Bacillus cereus, Seg. Holbrook   Peptona 

1,0 g

Manitol

10 g

 NaCl

2,0 g

MgSO4. H2O

0,1 g

 Na2HPO4 

2,5 g

KH2PO4 

0,25 g

Azul de metileno

0,12 g

Piruvato de sódio

10 g

Agar

14 g

H2O dest.

1000 mL  pH –  7,1  7,1  0,1

Antes do uso, fundir e resfriar a 50 C, adicionar:   95 mL meio base;



  5 mL de emulsão de gema de ovo 50%;



  0,4 mL de sulfato de polimixina B 0,1% esterilizada por filtração.



Ágar Nutriente  Extrato de levedura 

2,0 g

Extrato de carne

1,0 g

Peptona

5,0 g

 NaCl

5,0 g

Agar

15 g

H2O dest.

1000 mL

 

 

21

 pH –  7,0  7,0  0,2 Gelatina Nutriente  Extrato de carne 

3,0 g

Peptona

5,0 g

Gelatina

120,0 g

H2O dest.

1000 mL  pH –  6,9  6,9  0,1 Ágar Nitrato + Motilidade 

Extrato de levedura 

3,0 g

Peptona

5,0 g

KNO3

1,0 g

 Na2HPO4  Galactose

2,5 g 5g

Glicerina

5 mL

Agar

7g

H2O dest.

1000 mL

Ágar amido

Fazer placas com ágar nutriente e após solidificar, fazer uma sobrecamada com ágar amido (AN + 1% de amido)

Hugh & Leifson (ensaio OF)   Peptona de caseína 

2,0 g

Extrato de levedura

1,0 g

 NaCl 

5,0 g

K 2HPO4 

0,2 g

Azul de bromotimol

0,08 g

 

 

22

Agar

2,5 g

H2O dest.

1000 mL

Para 100 mL de meio + 1 mL m L de glicose 10 % Técnica:   Semear 0,1 mL em placas de ágar polimixina gema de ovo azul de bromotimol;



  Espalhar com bastão em L ou alça de Drigalski;



  Incubar a 30C por 24-48 horas;



  Contar colônias características;



  Passar para NA (30C por 24h).



TESTES BIOQUÍMICOS Gram Bastonetes curtos, gram-positivos. Esporos centrais ou sub-terminais. Catalase Em lâmina de vidro colocar uma porção de cultura + 1 gota de H 2O2 10 vol. –  positivo. Resultado = B. cereus  –   positivo.

Gelatinase Em ágar gelatina nutriente inocular uma cultura em picada e incubar a 20 C por 5 dias. Resultado = B. cereus - positivo (gelatina líquida). Hidrólise de amido Fazer estrias em ágar amido e incubar a 30 C por 48 horas. Revelar com 5 a 10 mL de Lugol. cereus –  positivo. Resultado = negativo - azul escuro / B. cereus –   positivo.

Redução de nitratos e motilidade 

Semear em agulha e incubar a 30 C por 24 horas, ler motilidade. Para nitratos:

 

 

23

Adicionar 0,5 mL de alfa-naftil-amina + 0,5 mL de ác. Sulfanílico.  B. cereus). Resultado = Positivo –  rosa. ( rosa. ( B.

Ensaio de Oxidação-Fermentação Oxidação-Fermentação   Semear em agulha em duplicata no meio Hugh-Leifson; Hugh- Leifson;



  Em um tubo selar com vaspar ou glicerol estéril;



  Incubar a 30C por 5 dias;



amarelo..   Positivo = meio amarelo



Fermentativo = positivo no tubo fechado. Oxidativo = positivo no tubo aberto.  B. cereus  –  –  oxidativo  oxidativo e fermentativo.

Reagentes:   Alfa-naftil amina



Alfa-naftol amina

0,5g

Ác. Acético 5N

100 mL

  Ácido sulfanílico



Ácido sulfanílico

0,8 g

Ácido acético 5N

100 mL



 

Ácido acético 5N 

HAC Água

28,75 mL 71,25 mL

Podem ser feitos outros testes:   Vogues –  Proskauer;  Proskauer;



  Citrato;



  Coloração com negro Sudão.



11. Salmonella sp.

 

 

24

Os membros do gênero Salmonella são agentes de infecções intestinais humanas e de animais. Dentre os agentes de doenças veiculadas por alimentos o gênero Salmonella

é um dos dos principais responsáveis responsáveis por casos fatais e por complicações

clínicas dos afetados. Desta forma, além da alta taxa de mortalidade, sua incidência no homem e animais implica em gastos significativos com medicamentos e hospitalizações. As atividades de inspeção e fiscalização fi scalização de alimentos tem, como objetivo crítico, o controle e a prevenção dos membros deste grupo e das implicações de sua presença nos alimentos, assim como da observância de boas práticas de manufatura e dos  programas de controle que devem incluir a certificação da adequacidade adequacidade das medidas adotadas, em especial para este gênero ou bactéria. Os métodos laboratoriais para a sua  pesquisa incluem um etapa de pré-enriquecimento, visando minimizar os efeitos do  processo tecnológico de obtenção do alimento capaz de promover a injúria fisiológica, sem inativá-la biologicamente. A presença de Salmonella é determinada em 25 g ou ml da amostra sob análise, no mínimo. O resultado positivo para esta pesquisa é interpretado considerando o risco  potencial que apresenta, o que significa impropriedade ao consumo do produto em questão. Meios de Cultura

Água peptonada 1% tamponada  Peptona de carne 

10 g

 NaCl

5g

 Na2HPO4

9,0 g

KH2PO4 

5,0 g

H2O dest.

1000 mL 

 pH –  7,2  0,2

 

 

25

Caldo Selenito Cistina Triptona

5,0 g

L(-) cistina

0,01 g

Lactose  

4,0 g

 Na2HPO4 . 2H2O

2,0 g

Bi-selenito de sódio

4,0 g

H20 dest.

1000mL

 pH –  7,0  7,0  0,2 –   NÃO NÃO AUTOCLAVAR  

Caldo Rappaport –  Vassiliadis  Vassiliadis Peptona de soja 

5,0 g

 NaCl

8,0 g

KH2PO4

1,6 g

MgCl2 . 6 H2O

40 g

Verde malaquita

0,04 g

H2O dest.

1000 mL  pH –  5,2  5,2  0,2

Ágar verde brilhante, vermelho de fenol lactose sacarose (BPLS) Peptona de carne 

5,0 g

Peptona de caseína

5,0 g

Extrato de levedura

3,0 g

Lactose

10 g

Sacarose

10 g

 NaCl

5,0 g

 Na2HPO4 

2,0 g

Verde malaquita

0,0125 g

Vermelho de fenol

0,08 g

Ágar

12 g

 

 

26

H2O dest.

1000 mL  pH –  6,9  6,9  0,1

  Para 100 mL do meio fundido e resfriado a 50 C adicionar 1 mL de novobiocina 0,4



% estéril Ágar para enterobactérias de Hektoen Proteose peptona 

12 g

 NaCl

5,0 g

Extrato de levedura

3,0 g

Lactose

12 g

Sacarose

12 g

Salicina

2,0 g

 Na2S2O3 

5,0 g

Citrato de ferro e amônio

1,5 g

Sais biliares

9,0 g

Azul de bromotimol

0,064 g

Fucsina ácida

0,04 g

Ágar

13,5 g

H2O dest.

1000 mL

 pH –  7,5  7,5  0,1 - NÃO - NÃO AUTOCLAVAR AUTOCLAVAR Ágar xilose-lisina-desoxico xilose-lisina-desoxicolato lato Extrato de levedura   NaCl

3,0 g 5,0 g

D(+) xilose

3,5 g

Lactose

7,5 g

Sacarose

7,5 g

L(+) lisina

5,0 g

Desoxicolato de sódio

2,5 g

 Na2S2O3 

6,8 g

Citrato de ferro e amônio

0,8 g

Vermelho de fenol Ágar

0,08 g 13,5 g

 

 

27

H2O dest.

1000 mL

 pH –  7,4  7,4  0,2 –   NÃO NÃO AUTOCLAVAR  

Caldo Uréia Extrato de levedura 

0,1 g

KH2PO4 

9,1 g

 Na2HPO4

9,5 g

Vermelho de fenol

0,01 g

H2O dest.

1000 mL  pH –  6,8  6,8  0,1

  Após esterilizar, esfriar e adicionar 5 mL de uréia 40 % (por litro de meio).



Distribuir 10 mL em tubos.

Ágar lisina ferro (LIA) Peptona  Extrato de levedura

5,0 g 3,0 g

Glicose

1,0 g

L-lisina

10 g

Citrato de férrico amoniacal

0,5 g

 Na2S2O3 

0,04 g

Púrpura de bromocresol

0,02 g

Ágar

15 g

H2O dest.

1000 mL  pH –  6,7  0,1

 

 

28

Ágar tríplice açúcar ferro (TSI) Extrato de carne 

3,0 g

Extrato de levedura

3,0 g

Peptona de caseína

15 g

Peptona de carne

5,0 g

Lactose

10 g

Sacarose

10 g

D(+)Glicose

1,0 g

Citrato de ferro e amônio

0,5 g

 NaCl

5,0 g

 Na2S2O3 

0,3 g

Vermelho de fenol

0,024 g

Ágar

12 g

H2O dest.

1000 mL  pH –  7,4  7,4  0,1

Meio SIM Peptona de caseína 

20 g

Peptona de carne

6,6 g

Citrato de amônio e ferro III

0,2 g

 Na2S2O3 

0,2 g

Ágar

3,0 g

H2O dest.

1000 mL  pH –  7,3  7,3  0,1

Ágar Citrato de Simmons

 

 

29

Caldo Dulcitol –  Base:  Base: Triptona 

5,0 g

Peptona de carne

5,0 g

 NaCl

5,0 g

Vermelho de fenol

0,018 g

H2O dest.

1000 mL  pH –  7,4  7,4  0,1

  Adicionar 2,5 mL Dulcitol 20% ( esterilizado por filtração).



 



Caldo Malonato –  fenilalanina  fenilalanina Extrato de levedura 

1,0 g

(NH4)2 SO4 

2,0 g

K  HPO  

0,6 g

2

4 KH2PO4 

0,4 g

 NaCl

2,0 g

Malonato de sódio

3,0 g

Azul de bromotimol

0,025 g

Fenilalanina

1,0 g

H2O dest.

1000 mL  pH –  6,6  6,6  0,1

Técnica: 25 g de amostra + 225 mL APT 1% 24h / 35C 1 mL

1 mL

 

 

30

24h / 36C

Colônias Típicas para ágar nutriente 24h / 36C

Caldo Uréia 24h / 36C Dos tubos (-) para urease, repicar em: 

amarela com H2S.   TSI base amarela com   LIA violeta com violeta com H2S.



  SIM motilidade (+) H2S (+).



  Malonato-fenilalanina (-).



  Citrato (+).



  Dulcitol (+).



Sendo necessário, fazer sorologia.   Malonato = degradação do malonato pela viragem do indicador.



 



amarela.   Fenilalanina = gotas de HCl 0,1 N até amarela. 3-4 gotas de FeCl3 10 % amarela (-)

 

 

31

verde  (+) verde    Dulcitol = vermelho (-) vermelho (-) e amarela (+)



12. Viabilidade da flora bacteriana do iogurte iogurte ( número relativo de Streptococcus thermophilus

e Lactobacillus bulgaricus )

Meios utilizados Água Peptonada 0,1% Ágar Lee Triptona 

2,0 g

Extrato de Levedura Levedura

2,0 g

Lactose

1,0 g

Sacarose

1,0 g

CaCO3 

0,6 g

KH2PO4 

0,1 g

Ágar

3,6 g

H2O dest.

1000 mL

Após esterilizar, adicionar adicionar 2 ml de sol. estéril de Púrpura de bromoc bromocresol resol 0,2%. Técnica   Diluir o iogurte;



  Inocular 0,1 mL das diluições adequadas por espalhamento em superfície;



  Incubar por 48 horas a 37C.



  Resultados:



S. thermophilus  –  amarelo amarelo..  L. bulgaricus

- brancos.

Proporção normal 1:1.

 

 

32

13. Esporos Mesófilos 25g + 225 mL água peptonada 0,1 % Liquidificador 10 mL em 100 mL de ágar BPC 90C por 15 min c/agitação constante resfriamento rápido ( 50C) Distribuir em 6 placas Incubar a 37C por 24-48 horas Obs: contar todas as placas.

Ágar BPC Triptona 

10 g

Glicose

5,0 g

Púrpura de bromocresol 0,2%

10 mL

Ágar

15 g

H2O dest.

1000 mL  pH –  7,0  7,0

14. Esporos Termófilos Termófilos  

20 mL da dil. + 100 mL de ágar BPC

 

 

33

Vapor fluente por 30 min

Distribuir em 6 placas (50C)

Incubar a 55C por 24-48 horas Flat Sour : colônias amarelas. amarelas. Resultado x 5 = esporos por 10 g. ( esporos sempre por 10 g do produto).

15. Lipolíticos As gorduras dos alimentos são suscetíveis á hidrólise e oxidação, o que pode ser causado por bactérias, bolores e leveduras, como também por processos químicos. A deterioração hidrolítica e oxidativa das gorduras levam a alterações do odor e diminuição da qualidade. Os alimentos mais freqüentes envolvidos em problemas de lipólise são os cremes de leite, manteigas, margarinas e outros produtos com grande  proporção de gorduras. A temperatura e umidade durante o armazenamento armazenamento podem  proporcionar condições de desenvolvimento desenvolvimento de microrganismos lipolíticos. Os gêneros  Pseudomonas, Alcaligenes, Staphylococcus possuem espécies lipolíticas.

As lipases são relativamente ativas em baixa atividade de água (congelados, alimentos em pó) embora o aumento nas condições de atividade de água aumente a ação enzimática. As lipases são enzimas exocelulares podendo estar atuando na gordura do alimento mesmo após a destruição da célula microbiana por processos tecnológicos.

 

 

34

Meios utilizados Água peptonada 0,1% Ágar Tributirina Peptona 

5,0 g

Extrato de levedura

3,0 g

Ágar

15,0 g

H2O dest.

1000 mL  pH –  7,5  7,5  0,1

Aquecer o meio  80C e acrescentar 10 g de tributirina neutra a 80 C. Esterilizar.

Técnica:   Semear em superfície 0,1 mL das diluições diluiç ões adequadas.



  Incubar a 22C por 5 dias.



  Contar colônias com halo transparente.



16. Proteolíticos Alterações no sabor e odor podem ser produzidas por microrganismos  proteolíticos. Alguns psicrotróficos, causando alterações indesejáveis em produtos cárneos, laticínios e pescado. Em alguns alimentos, o número de proteolíticos pode  projetar o tempo de vida do produto estocado sob refrigeração e avaliar o  processamento tecnológico. Proteases termorresistentes são produzidas por algumas espécies de Pseudomonas e podem alterar leites esterilizados. Espécies proteolíticas são comuns entre os gêneros Bacillus, Clostridium, Pseudomonas e Proteus. As colônias de bactérias proteolíticas no ágar leite apresentam-se rodeadas por uma zona clara como resultado da conversão da caseína em compostos nitrogenados solúveis. Como o meio é opaco, utiliza-se um precipitante químico para detectar a

 

 

35

 proteólise. Após o tratamento com o precipitante químico, as colônias não podem ser usadas para outras análises. Meios utilizados Água peptonada 0,1% Ágar leite Peptona de carne

5,0 g

Extrato de Levedura Levedura

3,0 g

Ágar

12 g

Água dest.

0,9 L

 Na hora de utilizar, acrescentar ao meio estéril, fundido e resfriado 100 mL de leite desnatado reconstituído (10%), estéril. Técnica:   Semear em superfície de ágar leite l eite 0,1 mL das diluições adequadas.



  Incubar a 22C por 72 horas.



  Cobrir o ágar com sol. de ácido clorídrico a 1% ou ácido acético 10% por 1 min.



Retirar o excesso de líquido e contar as colônias rodeadas por um halo transparente.

17. Teste de esterilidade comercial –  Exame  Exame de alimentos enlatados  enlatados  A incidência de deterioração em alimentos enlatados é muito baixa, mas quando ocorre é importante saber como proceder com a investigação. A deterioração microbiana ou o hidrogênio liberado na reação dos ácidos com o metal das latas pode  produzir deformações na lata. l ata. Temperaturas de verão e altas altitudes al titudes acentuam o grau de estufamento. Nem todos os microrganismos microrganismos que podem crescer em alimen alimento to enlatado causam anormalidades. Existe a presença de microrganismos sem o estufamento das latas, por exemplo o C. botulinum. A

deterioração

de

alimentos

subprocessamento subprocess amento ou vazamento.

enlatados

pode

ser

ocasionada

por

 

 

36

Subprocessamento  –   Este termo é usado para indicar que durante a esterilização, o tratamento térmico foi insuficiente para destruir os microrganismos capazes de desenvolverem desenvolv erem posteriormente no alimento. Pode ocorrer por: (1)  subcozimento deliberado visando preservar o “frescor” do produto;  (2)  falhas na operação do autoclave ( incluindo termômetros, medidores de pressão e controles); (3)  contaminação excessiva para a qual o processo normalmente utilizado torna-se insuficiente; (4)  Operação inadequada do autoclave. Quando uma lata contém um produto deteriorado e nenhum microrganismo viáv viável, el, a deterioração pode ter

ocorrido antes do processamento processamento ou os microrganismos microrganismos

causadores da deterioração podem ter morrido durante o armazenamento.

17.1 - EXAME PRELIMINAR a.  Remover os rótulos identificando toda a informação e codificar com números correspondentes;  b.  Anotar o tamanho e a quantidade das latas, os códigos, o produto, as condições da lata, defeitos mecânicos, perfurações e manchas de ferrugem; c.  Classificar cada lata de acordo com o que segue: c1) plana ( flat  flat  )  –  a   a lata na qual ambas as extremidades são e permanecem planas quando invertidas e colocadas bruscamente sobre uma superfície plana; c2) saliência flutuante ( flipper   )) –  a  a lata que normalmente parece plana, mas quando quando colocada bruscamente sobre uma superfície plana mostra abaulamento em uma extremidade. Aplicando pressão nesta extremidade a saliência desaparece desaparece e a lata torna torna-se plana;  a lata com uma extremidade permanentemente abaulada. c3) abaulada ( springer   ))  –  a Quando colocada bruscamente sobre uma superfície plana pela extremidade abaulada, esta torna-se plana plana mas forçará abaulamento abaulamento da extremidade oposta; swell )  )  –  a  a lata abaulada em ambas as extremidades, mas não tão c4) estufada ( soft swell firmemente que não possa ser pressionada de alguma maneira com o dedo;

 

 

37

c5) altamente estufada ( hard swell ) –  a  a lata abaulada em ambas as extremidades de maneira que a pressão do dedo não modifica o formato abaulado. Com o aumento da  pressão interna acaba-se rompendo rompendo e o vazamento vazamento ocorre na recravação. recravação. 17.2 - PRÉ –  INCUBAÇÃO  INCUBAÇÃO As latas, embaladas cartonadas e vidros hermeticamente fechados são colocados sobre papel filtro a fim de constatar-se possíveis microfugas e incubados. Incubar 1 amostra na temperatura de 35C por 14 dias e 1 a 55 C por 10 dias. Os produtos já bombeados (tufados) na chegada ao laboratório deverão ser analisados imediatamente, dispensando dispensando a prova de estufa.

17.3 - ABERTURA DAS LATAS - Lavar as latas com água e sabão e esterilizar a extremidade a ser aberta adicionando álcool e flambando.  NÃO FLAMBAR   latas altamente estufadas. Apenas passar um  pano esterilizado embebido embebido em álcool. álcool. - A abertura da lata é feita com abridor previamente flambado em álcool. 17.4 - Produtos ralos como leite ou sopa Retirar quantidades de 50 mL do produto com auxílio de pipeta estéril e com ponta cortada. Destes 50 mL: (a)  20 mL são transferidos para um tubo estéril estéril o qual qual

é mantido em

refrigerador para referência futura; (b)  adicionar 1 a 2 mL a cada um dos tubos de meios de cultura indicados; (c)  o resto é utilizado para o teste de pH. 17.5 - Produtos semi-sólidos semi-sólidos como pudins. pudins. Retirar cerca de 30 mL do produto com auxílio de pipetas de ponta larga esterilizadas e transferir para frasco contendo 70 mL de água destilada esterilizada. Para alguns produtos é recomendável colocar-se algumas pérolas de vidro com a água estéril. Agitar vigorosamente e usar a mistura resultante da mesma maneira que o

 

 

38

 produto ralo. ( Quando usar pérolas de vidro use tampa de borracha estéril para fechar o recipiente ). 17.6 - Produtos sólidos sólidos como carne.  Neste caso fazer uma abertura em toda a tampa da lata. A amostra é então removida utilizando-se de amostrador de queijo, colheres, etc que tenham sido  previamente esterilizados. A amostra é coletada primeiro no centro da lata e depois nas laterais em 3 ou 4 direções . Transferir a amostra para frascos contendo 70 mL de água estéril ( contendo pérolas de vidro ). Fechar o frasco com tampa de borracha e agitar vigorosamente. A mistura é utilizada da mesma maneira que o produto ralo.

17.7 - TÉCNICA DE DE CULTIVO

 

Produtos de baixa e media acidez ( pH > 4,5 ) De cada lata ou outro conteiner, inocular 4 tubos de caldo de carne cozida

(cooked meat medium) ou caldo de fígado picado (chopped liver broth) previamente aquecido a 100C e resfriado a temperatura ambiente. Inocular também 4 tubos de caldo dextrosado púrpura de bromocresol. Inocular cada tubo com 1-2 mL do produto líquido ou da mistura aquosa do produto, ou 1-2 gramas do material sólido.  

Incubar como segue: Meio

Tubos

T C

Tempo(h)

Teste para:

Carne cozida*

2

37

96

Anaeróbios

(ou fígado) Carne cozida*

Putrefativos 2

55

24-72

(ou fígado) PBC

Anaeróbios Termófilos

2

55

24-48

Termófilos

 

 

39

Tipo FLAT SOUR PBC

2

37

96

Devido a Vazamento

*os meios para anaeróbios devem ser estratificados com uma camada de Vaspar (partes iguais de vaselina sólida e parafina) de cerca de 2 cm de espessura. Verificar a presença ou ausência de crescimento em cada tubo e aqueles que mostrarem evidência de crescimento ( turbidez, mudança de coloração do indicador ), fazer coloração de Gram ou colorir com azul de metileno. Observe os tipos morfológicos. Quando a inoculação do alimento ocasiona turbidez no meio, a presença ou ausência de crescimento deve ser determinada por exame microscópico. Também é recomendável repicar, por estriamento, os tubos que apresentarem indícios de crescimento em placas com ágar nutritivo nutriti vo ou ágar cérebro-coração e incubar  por 24 horas nas mesmas condições de temperatura, em aerobiose ou anaerobiose, anaerobiose, conforme os tubos de origem.  

Teste de catalase Quando o tubo de origem for aquele incubado em anaerobiose e ocorrer

 presença de bastonetes Gram positivos, positivos, realizar prova de catalase. A prova de catalase  positiva indica a presença de  Bacillus sp. E a negativa indica a presença de Clostridium  sp..

 

Ocorrendo a presença de bastonetes termófilos repicar maciçamente em ágar para

esporulação. Incubar a 55 C por 2-10 dias. A partir do segundo dia verificar a presença de esporos através de esfregaço com coloração específica (verde malaquita). Lavar a cultura a 80C, por 10 min. Após o choque térmico, semear 2 tubos com caldo PBC, incubar 1 tubo a 35C e outro a 55 C por 2-4 dias. 17.8 –  Produtos  Produtos ácidos ( pH ( pH < 4,5 ) 4,5 ) Verificar a possível presença de hidrogênio em latas deformadas:

 

 

40

Quando as latas estão estufadas e apresentam apresentam uma contagem baixa de microrganismo, e conveniente analisar os gases para investigar estufamento por hidrogênio. Este tipos de deterioração, de origem não bacteriana, da origem a um gás combustível e o interior da lata apresenta-se corroído, enquanto que nos gases resultantes da ação bacteriana  predomina o dióxido de carbono. A natureza combustível desse gás pode ser demonstrada fazendo m pequeno orifício na lata enquanto a mesma é mantida junto a uma chama diferencial em um analisador de gás. De cada container, inocular 4 tubos de caldo ácido e 2 tubos de caldo extrato de malte com 1-2 mL ou 1-2 g do produto. Incubar como se segue:

Meio

Tubos

T C

Tempo(h)

Teste para:

Caldo ácido

2

55

48

Termófilos FLAT SOUR

Caldo ácido*

2

37

72

Anaeróbios

Caldo ácido

2

30

96

Leveduras, Leveduras, mofos, Lactobacilos

Caldo estrato de

2

30

96

malte

Leveduras, Leveduras, mofos, Lactobacilos

*Estratificar com ágar simples. Em alguns casos, a deterioração de produtos tais como tomates, peras , figos e abacaxis é causada por Clostridium pasteurianum, um anaeróbio esporulado que produz gás e odor de ácido butírico. EXAME MICROSCÓPICO  

Prepare um esfregaço (filme) do conteúdo de cada lata após o subcultivo;

 

Seque, fixe e core com azul de metileno;

 

Se o produto for gorduroso, adicione xileno ( com conta gota ) ao filme quente e fixado; passe pela água e core.

 

 

41

PRODUTO

35C (14 dias)

2g am 2 tubos com caldo carne +

55C (10 dias)

2g am 2 tubos com caldo PBC

Vaspar 35C/ 5d

2g am

2g am

2 tubos com

2 tubos com

caldo vaspar +

caldo PBC

Vaspar 35C/5d

55C/ 5d

cresc.

cresc.

35C/24 h

35C/24 h

55C/24 h

anaerobiose

aerobiose

anaerobiose

aerobiose

Gram

Gram

Gram

cresc.

Gram Catalase

55C/ 5d cresc.

55C/24 h

Catalase Estrias em tubo com ágar p/espor. 55C/2-10 d Lavar a cultura c/água est. Choque térmico 80C/10 min Tubos BCP

35C/2-4d

55C/2-4d

 

 

42

18. Halofílicos Microrganismos que precisam de sal para crescer são chamados de halofílicos. Em geral, eles precisam de outros sais, não somente o NaCl, como por exemplo: K +  e Mg2+. Os níveis de sal que o microrganismo precisa varia muito. Entretanto, o tipo microbiano associado a um alimento salgado em particular depende da concentração e do tipo de sal sal e do tipo de de alimento. A classificação mais prática de halofílicos é aquela baseada no nível de sal:  

Fracamente halofílicos = 2  –  5%  5% de sal.

 

Moderadamente halofílicos = 5 –  20  20 % de sal.

 

Extremamente halofílicos = 20 –  30  30 % de sal.

Também existem muitos halotolerantes que crescem tanto em meio sem sal quanto em meios em que a conc. de sal excede 5%. Muitos microrganismos estão envolvidos na deterioração de alimentos salgados, salgados, entretanto entretanto outros, como o Staphylococcus aureus, são pategos. Bolores e leveduras, e outros microrganismos osmofílicos estão envolvidos na deterioração de alimentos com baixo valor de aw, inclusive alimentos salgados. salgados. Meios utilizados (para veg. e carnes) Água peptonada 0,1% + NaCl 5% Peptona de caseína

1,0 g

 NaCl

50 g

H2O

1000 mL  pH final 6,9  0,2 Trypticase soy ágar + NaCl 5%

Triptona

15 g

Peptona de soja

5,0 g

 NaCl

50 g

ágar

15 g

H2O

1000 mL  pH final 7,3  0,2

 

 

43

Técnica:  

Realizar as diluições adequadas;

 

Colocar 1 mL em placa de Petry;

 

Verter o ágar fundido e deixar solidificar;

 

Incubar as placas invertidas por 4 dias a 25C;

 

Contar as placas.

Obs: Dependendo da amostra o diluente, o meio, a temperatura de incubação e o tempo de incubação devem ser alterados. 19. Clostrídios Sulfito Redutores Bastonetes Gram-positivos, esporulados, imóveis produtores de toxina patogênica. É anaeróbio-aerotolerante. anaeróbio-aerotoleran te. O pH de crescimento varia de 5,5 a 8,0 na faixa de temperatura de 20 a 50C. Seu hábitat natural: solo, águas residuais, poeira, fezes do homem e dos animais. Meios utilizados Água peptonada 0,1%

Ágar seletivo para C. perfringens Seg. Angelotti ou ágar SPS Peptona de caseína

15 g

Extrato de levedura

10 g

Citrato férrico

0,5 g

ágar

15 g

H2O

1000 mL  pH final 7,0  0,2

 

 

44

Dissolver os componentes em água destilada. Autoclavar a 121 C/ 15 min. Após esterilizar, adicionar as seguintes soluções, esterilizadas por filtração por litro de meio: Sulfito de sódio 10% -------------------------------- 5,0 mL Sulfato de polimixina B 0,2%---------------------- 10 mL Sulfadiazina sódica ---------------------------------- 10 mL  Na forma desidratada desidratada proceder conforme conforme instruções do fabricante. Técnica:  

Semear 1 ml das diluições em ágar SPS (pour plate) fazer sobrecamada; sobrecamada;

 

Incubar a 46C/ 48 horas;

 

Contar as colônias médias e negras.

Obs: A incubação deve ser anaeróbia. Para tanto colocar as placas invertidas em jarra apropriada, adicionada de Gaspak ou anaerogen, conforme instruções do fabricante. Esterilidade  20. Teste de Segurança Biológica - Esterilidade  Os testes são aplicados a insumos farmacêuticos, medicamentos e correlatos que, de acordo com a Farmacopéia, devem ser estéreis, e são adequados para revelar a  presença de bactérias e fungos fungos nos mesmos. mesmos. Meios utilizados Os meios mais usados atualmente para o teste de esterilidade são: Meio de caseína-soja e Tioglicolato Fluido; o primeiro para fungos e aeróbios e o segundo para anaeróbios, embora haja crescimento de aeróbios e até mesmo fungos no tioglicolato. Água peptonada 0,1% Peptona de carne

0,1 g

H2O dest.

100 mL  pH após esterilização - 7,1  0,2

 

 

45

Meio de Tioglicolato Fluido L-Cistina

0,5 g

Cloreto de sódio

2,5 g

Dextrose

5,5 g

Extrato de levedura

5,0 g

Caseína de digestão pancreática

15,0 g

Tioglicolato de sódio ou

0,5 g

Ácido tioglicólico

0,3

Solução de resarzurina sódica (1:1000)

1,0 mL

Ágar

0,75 g

H2O dest.

1000 mL  pH após esterilização - 7,1  0,2

Meio de Caseína-Soja Caseína de digestão pancreática

17,0 g

Farinha de soja de digestão pancreática

3,0 g

Cloreto de sódio

5,0 g

Fosfato de potássio dibásico

2,5 g

Dextrose

2,5 g

H2O dest.

1000 mL  pH após esterilização - 7,3  0,1

Pré-Incubação e Teste de Sensibilidade dos Meios de Cultura Os meios de cultura devem apresentar esterilidade e capacidade de promover crescimento de microrganismos que devem ser testadas em cada lote antes do teste das amostras ou em paralelo com ele. Após a esterilização os meios de Tioglicolato fluído e Caseína-soja devem ser incubados, respectivamente, respectivamente, a 30-35C e 20-25C, durante 7 dias no mínimo. Não deve ocorrer o crescimento de microrganismos. Efetuar teste para verificar a capacidade dos lotes de meios em promover o crescimento de microrganismos. Os seguintes microrganismos são adequados para realizar o teste: a) 

 Bacillus subtillis ATCC 6633 ou Micrococcus luteus  ATCC 9341

 

 

46

 b) 

Candida albicans ATCC 10.231

c) 

 Aspergillus niger ATCC

d) 

Clostridium sporogenes ATCC 11.437 ou Bacteroides vulgatus ATCC 8482

16.404

Inocular pelo menos 2 tubos de cada meio, com volume de suspensão que contenha 50 a 100 células, conforme conforme a tabela: Meio

Microrganismo

Temperatura incubação

 B. subtilis ou M. luteus

Tioglicolato fluido

30-35C

C. albicans C. sporogenes ou B. vulgatus

 B. Subtilis ou M. luteus

Caseína-soja

20-25C

C. albicans  A. niger

Avaliação da Atividade Bacteriostática ou Fungistática Fungistática Antes de iniciar o teste de esterilidade avaliar seu nível de atividade bacteriostática e/ou fungicida pelo seguinte procedimento: procedimento: Preparar, pelo menos, 4 tubos de meio de cultura a serem empregados no teste de esterilidade. Adicionar a todos os tubos quantidade do produto em análise: Conteúdo do

Volume mínimo

Volume mínimo

recipiente (mL) Menos que 10

de produto (mL) 1mL ou conteúdo total,

de meio (mL)

se menor que 1

15

11 a 50

5

40

51 a 100

10

80

Inocular metade dos tubos com microrganismo aeróbio e a outra metade com anaeróbio conforme indicado na tabela do teste de crescimento dos meios de cultura. Preparar duplicata do conjunto em condições idênticas, idênticas, porém não adicionar o produto a ser testado. Incubar todos os tubos tioglicolato a 30-35 C e a 20-25C, os que contiverem caseína soja. Se houver cresimento normal dos microrganismos mi crorganismos na presença

 

 

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e ausência do produto, o teste de esterilidade pode ser realizado sem modificações. Se o crescimento for pequeno ou nulo, o produto exerce atividade bacteriostática e/ou fungistática e essa atividade deve ser eliminada antes do teste de esterilidade por meio de agentes neutralizantes ou, no decorrer do mesmo, através da diluição do produto. Deve-se repetir o teste até determinar a relação ideal entre volumes do produto e do meio, que não interfira no crescimento de microrganismos. Outra maneira de evitar as atividades bacteriostática e fungistática é empregar o método de filtração por membrana, quando a natureza do produto assim o permitir. Procedimento para o Teste de Esterilidade O teste de esterilidade pode ser realizado de 2 maneiras: através do Método de inoculação do produto diretamente no meio (Método Direto) ou pelo método de filtração por membrana, o qual deve ser empregado sempre que possível. Amostragem O número de amostras de um produto para o teste de esterilidade deve ser, no mínimo, de 20 unidades ou 10% do número de unidades que constituem o lote se este for inferior a 199 unidades. Antes do teste proceder a assepsia das paredes externas dos frascos e ampolas, mergulhando-os em solução anti-microbiana. No caso de artigos cujas as embalagens não resistam a esse tratamento, fazer assepsia das amostras por meio de gaze ou pano estéril, embebido em solução anti-microbiana. Para matérias primas, amostragem satisfatória é baseada na raiz quadrada do número total de recipientes do lote. Método de Inoculação ou Direto a)  Procedimento O teste de esterilidade pelo método de inoculação ou direto consiste na transferência asséptica de quantidade do produto a ser examinado para o meio de tioglicolato fluido e meio de caseína-soja seguida de incubação a 30-35C e 20-25C durante 14 dias.

 

 

48

 b) Líquidos Retirar o líquido do recipiente utilizando pipeta estéril ou seringa e agulha estéreis. Transferir assepticamente o volume indicado de cada amostra para os tubos contendo os meios conforme a tabela do teste de avaliação da atividade bacteriostática ou fungistática. Misturar o líquido com o meio sem arejar excessivamente. excessivamente. c) Sólidos Transferir quantidade de produto na forma de sólido seco (ou de solução ou suspensão do produto preparada pela adição de água peptonada estéril ao recipiente) correspondente a 300 mg de cada recipiente sob análise, ou todo conteúdo se for menor que 300 mg, a volume não inferior a 40 mL dos meios. Misturar e proceder como para líquidos. d) Controle Negativo ou Branco Efetuar constantemente controle negativo simulando teste com o diluente utilizado. O resultado do teste deve ser negativo. e) Observação e Interpretação dos resultados Durante o tempo de incubação, observar os tubos em análise, periodicamente,  para verificar eventual aparecimento aparecimento de crescimento crescimento microbiano. Se, no final do período de incubação, não ocorrer crescimento microbiano, a amostra é considerada satisfatória  para o teste de esterilidade. Se ocorrer crescimento, o produto não corresponde ao teste de esterilidade, a menos que se possa demonstrar o contrário por reteste, ou por meios que comprovem não Ter contaminação com causa relacionada com a amostra (ex.: contaminação ambiente, contaminação de controle negativo). negativo). O reteste deve ser feito de maneira idêntica ao inicial. Se não aparecer evidência de crescimento, a amostra é considerada satisfatória para o teste de esterilidade. Se houver crescimento no reteste, comparar com o primeiro teste. Seo contaminante for o

 

 

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mesmo, a amostra não corresponde ao teste de esterilidade. Se os dois contaminantes forem diferentes, deve ser realizado um segundo segundo reteste. USP XXII, 71- Sterility tests. Pg 1483-1488.

 

 

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS BRASIL. Ministério da Agricultura, do Abastecimento e da Reforma Agrária. Secretaria Nacional de Defesa Agropecuária. Departamento Nacional de Defesa Animal. Coordenação Geral de Laboratório Animal. Métodos de Análise Microbiológica para Alimentos. 2a revisão. 1991/1992. FOOD AND DRUG ADMINISTRATION - FDA. Bacteriological analytical manual. 7 ed. Arlington: AOAC International, 1992. SPECK, M. L. (Ed.). AMERICAN PUBLIC HEALTH HEALTH ASSOCIATION. ASSOCIATION. Compendium of methods for the microbiological examination of foods. 2 ed. Washington: American Public Health Association, 1984.

 

 

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VALORES DE NMP PARA 3 TUBOS INOCULADOS DE 3 DILUIÇÕES DECIMAIS (Demeter, Sauer and Miller, 1933)  No de tubos positivos observados em cada diluição 1a diluição 2a diluição 3a diluição 0 0

0 0

0 1

NMP de microrganismos por ml da 1a diluição < 0,3 0,3

00 0

11 2

01 0

0,3 0,6 0,6

24 4

1 1 1 1 1 1 1 1

0 0 0 1 1 2 2 3

0 1 2 0 1 0 1 0

0,4 0,7 1,1 0,7 1,1 1,1 1,5 1,6

1 3 4 2 4 3 4 4

2 2 2 2

0 0 0 1

0 1 2 0

0,9 1,4 2,0 1,5

1 3 4 2

2 2 2 2 2 2 2 2

1 2 2 2 2 3 3 3

12 0 1 2 3 0 1 2

2,0 3,0 2,0 3,0 3,5 4,0 3,0 3,5 4,0

4 3 4 4 4 4 4 4

3 3 3 3 3 3 3

0 0 0 1 1 1 1

0 1 2 0 1 2 3

2,5 4,0 6,5 4,5 7,5 11,5 16,0

1 2 4 1 2 3 4

33 3 3 3 3 3 3

22 2 2 3 3 3 3

01 2 3 0 1 2 3

9,5 15,0 20,0 30,0 25,0 45,0 110,0 >110,0

21 3 4 1 1 1 -

Resultados das categorias 3 e 4 não devem ser usados como base para decisões sobre a qualidade do alimento.

Categoria 3