Manual de Microbiologia Alimentos
July 28, 2022 | Author: Anonymous | Category: N/A
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Índice 1. Preparação de Amostras..................... ........................................... ............................................. ............................................. .............................. ........ 2 2. Soluções Genéricas ........................................... .................................................................. ............................................ ..................................... ................ 4 3. Coloração de bactérias – Método de gram................... ......................................... ............................................ ........................... ..... 5 4. Contagem padrão em placas ........................................ .............................................................. ............................................. ........................... .... 7 5. Contagem de mofos e leveduras ...................... .............................................. .............................................. ................................... ............. 10 6. Bolores e leveduras osmofílicos ................... .......................................... ............................................. ....................................... ................. 11 7. Coliformes ...................... ............................................. .............................................. ............................................ ............................................ ........................... 11 8. Coliformes Fecais .................................................... ........................................................................... ............................................. ............................ ...... 12 9. Staphylococcus aureus ...................... ............................................ ............................................. ............................................. ............................ ...... 17 10. Bacillus cereus ..................... ............................................ .............................................. ............................................. ....................................... ................. 19 11. Salmonella sp. ................... .......................................... ............................................. ............................................ ........................................... ..................... 23 12. Viabilidade da flora flora bacteriana do do iogurte ( número relativo de Streptococcus thermophilus
e Lactobacillus bulgaricus ) ..................... ........................................... ............................................. ........................... 31 13. Esporos Mesófilos..................... ........................................... ............................................. ............................................ ................................... .............. 32 14. Esporos Termófilos ..................................... ........................................................... ............................................. ........................................ ................. 32 15. Lipolíticos .............................................................. ..................................................................................... ............................................. ............................ ...... 33 16. Proteolíticos ...................... ............................................ ............................................. ............................................. ........................................... ..................... 34 17. Teste de esterilidade comercial – Exame Exame de alimentos enlatados ............................ ............................ 35 18. Halofílicos............................................... ...................................................................... ............................................. ........................................... ..................... 42 19. Clostrídios Sulfito Redutores...................... ............................................ ............................................. ........................................ ................. 43 20. Teste de Segurança Biológica - Esterilidade..................................................... Esterilidade.............................................................42 ........42
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1. Preparação de Amostras As amostras devem ser analisadas o mais breve possível, de preferência assim que chegam ao laboratório. -1
Pesar quantidade adequada para preparar uma diluição 10 , perto do fogo, usando material estéril para não contaminar a análise. Pesar juntamente com o material para ser analisado, uma porção para contra-prova que deverá ficar na geladeira (o recipiente também deve ser estéril). Diluente
g de amostra
90 mL
10g
99 mL
11g
225 mL
25g
O diluente usado para preparar a amostra, como para as diluições decimais é a água peptonada 0,1% (usa-se (usa-se peptona peptona de caseína caseína ou lactopeptona). lactopeptona). 1. Produtos sólidos sólidos e em pó (queijos, (queijos, embutidos, embutidos, cortes cortes de frango, frango, alimentos preparados, pudins, pudins, etc) - Descongelar Descongelar produtos que foram congelados em refrigerador de 2 a 10°C por no máximo 18 horas antes da análise; - Com o auxílio de pinças e bisturis estéreis, cortar e pesar assepticamente, 25g da amostra; - Adicionar 225 ml de água peptonada 0,1%, preparada conforme descrito no COM 013; - Homogeinizar por 30 segundos em liquidificador com copo triturador esterilizado ou em stomacker, usando velocidade média para não aquecer a mistura; - Preparar as diluições necessárias para realizar o trabalho desejado, conforme o tipo de análise e amostra a analisar; - Expressar os resultados obtidos da contagem com UFC/g de produto. 2. Água e produtos líquidos - Homogeinizar a amostra agitando-a por no mínimo 25 vezes; - Preparar as diluições sucessivas sucessivas necessárias para realizar as análises do ttrabalho rabalho desejado, considerando o nível de contaminação. As diluições são preparadas, transferindo-se 1 ml da amostra para um tubo contendo 9 ml de água peptonada 0,1%. Para preparar a diluição seguinte, retirar 1 ml deste tubo e transferir para outro tubo que contenha 9 ml de água peptonada 0,1%; - Expressar os resultados por ml de produto.
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Genéricas 2. Soluções Genéricas Álcool iodado
Iodo metalóide
Tintura de iodo a 2%
2,0 g
Iodeto de K
6,0 g
Água destilada
10 mL
Álcool 96 qsp
100 mL
Diluir o iodeto com H2O, acrescente o Iodo e por ultimo o álcool. Álcool Iodado = 20 mL da tintura de iodo a 2% em 1 litro de álcool 70 .
Vaspar Derreter e misturar juntos quantidades iguais de vaselina sólida e parafina. Distribuir em frascos de boca larga e esterilizar em autoclave a 121 C por 15 min. Obs.: Parafina líquida estéril pode ser usada, mas não permitirá detecção de produção de gás. Solução Salina
Solução fisiológica 0,85% NaCl NaCl
0,85 g
H2O
100 Ml
Esterilizar em autoclave a 121 C por 15 min.
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3. Coloração de bactérias – Método Método de gram Com auxílio de alça de platina, coletar parte de uma colônia de bactérias e transferir
para lâmina de vidro; vidro; Fixar o esfregaço pelo calor, aproximando-o da chama do bico de Bunsen;
Corar o esfregaço com uma solução de cristal violeta, por 1 min; Lavar com água para retirar o excesso do corante e cobrir com lugol por 1 min;
Lavar com água corrente;
Diferenciar com etanol absoluto ou uma solução de etanol-acetona(1:1), etanol-acetona(1:1), 30 s;
Lavar com água corrente;
Corar com fucsina ou safranina;
Lavar com água corrente;
Secar e levar ao microscópio.
Interpretação resultados - Gram dos positivo: A parede celular das bactérias é desidratada pala ação do álcool, diminuindo sua permeabilidade, com isso o complexo iodo-cristal violeta não é removido e no microscópio observa-se coloração púrpura. - Gram negativo: A alta concentração de lipídios aumenta a permeabilidade da parede celular das bactérias gram negativas, facilitando a extração do d o completo iodo-cristal, assim, essas bactérias aparecem tingidas apenas pelo tratamento com fuccina fenicada, apresentando portanto, coloração rósea. Exemplo: Pseudomonas,, Escherichia coli. Pseudomonas Solução Cristal Violeta Cristal Violeta
1,0 g
Etanol Fenol
10,00 mL 2,0 mL
H2O destilada
100,0 mL
Dissolver o corante no álcool. Juntar lentamente o fenol e após a água, também lentamente, misturando até obter homogeinidade. Deixar em repouso por 24 horas e após filtrar.
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Solução de Lugol Iodo
1,0 g
Iodeto de Potássio
2,0 g
H2O destilada
300,0 mL
Solução de Fuccina Fenicada Fuccina
0,3 g
Etanol
10,0 mL
Fenol
5,0 mL
H2O destilada
95,0 mL
Dissolver o corante no álcool. Juntar lentamente o fenol e após a água, também lentamente, misturando até obter homogeinidade. Deixar em repouso por 24 horas e após filtrar.
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placas 4. Contagem padrão em placas Os métodos de contagem padrão em placas oferecem o número de microorganismos viáveis no alimento, pela utilização do meio de cultivo adequado, de maneira a promover o crescimento do mais amplo espectro de microorganismos presentes na amostra amostra sob análise. Alguma Alguma seletividade será será exercida pela temperatura temperatura de incubação. Em muitos casos, como nos alimentos processados, a contagem padrão demonstra o nível geral de higiene durante a fabricação, condições de armazenamento armazenamento e transporte, etc, daquele alimento, enquanto os produtos não processados podem ser indicados pela qualidade do alimento. A precisão do método pode ser limitada pela incapacidade de alguns microorganismos formarem colônias visíveis no meio e condições utilizáveis, como também, pela presença de substâncias inibidoras produzidas por microorganismos do próprio alimento durante o crescimento crescimento no ágar. ágar. Quando presentes em números elevados, os psicotróficos podem causar uma variedade de alterações em produtos conservados sob refrigeração. A maioria dos organismos psicotróficos são destruídos pelo calor. Assim, sua presença pode indicar subprocessamento térmico ou contaminação pós-processamento em produtos pasteurizados; a elevação do seu número está associada a uma estocagem prolongada sob refrigeração ou manutenção a frio inadequada, ou ainda, pode significar risco de alteração tanto para produtos processados como não processados. Microorganismos termófilos são aqueles que podem sobreviver de forma significativa ao tratamento térmico. Usualmente o tratamento térmico inclui temperaturas de pasteurização ou superiores. A presença de termófilos em grande quantidade está relacionada com a qualidade higiênica da matéria-prima ou processamento térmico insuficiente. Meios utilizados Água peptonada 0,1% Peptona de caseína
0,1 g
H2O dest.
100 mL pH - 7,0 0,2
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Ágar padrão para contagem (PCA) Extrato de levedura
2,5 g
Triptona
5,0 g
Glicose
1,0 g
Ágar
15 g
H2O dest.
1000 mL pH - 7,0 0,1
Técnica Psicotróficos
Semeadura de 0,1 mL das diluições sobre a superfície do ágar previamente distribuído em placas. Mesófilos eTermófilos
Adicionar o PCA fundido e resfriado a 50 C nas placas de Petry contendo1 mL da diluição adequada, misturar e deixar solidificar. Contar as placas com 25 a 250 colônias. Incubação: Termófilos - 55C por 48 horas. Mesófilos – 35 35 C por 48 horas. Psicrotróficos – 7 7 a 10 C por 7 a 10 dias.
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1 mL
10-1
1mL
1mL
1 mL
10-2
10-3
(9 mL)
(9 mL )
1mL
1mL
1mL
1mL
10
5. Contagem de mofos e leveduras Os mofos e leveduras estão presentes no meio ambiente e podem fazer parte da flora do alimento. As vezes podem ser responsáveis pela deterioração de muitos tipos de alimentos, os quais, pelas suas características de baixo pH e de atividade de água, conteúdo de sal ou açúcar e estocagem em baixa temperatura, favorecem o seu desenvolvimento. Alguns podem causar problemas nos alimentos devido a sua resistência ao calor, congelamento, antibióticos e irradiação, além de formação de toxinas. Podem também transformar substratos impróprios em favoráveis ao desenvolvimento desenvolv imento de bactérias patogênicas. Meios utilizados Água peptonada 0,1% Ágar batata glicosado Glicose
20 g
Ágar Água destilada
15 g 1000 mL
No momento da utilização, fundir, resfriar a 45 C e acidificar até pH 3,5 (1 mL do ácido para 100 ml do meio) com ácido tartárico a 10 % estéril. Não aquecer após a adição do ácido. Técnica: 1 mL
10-1 1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
10-2
10-3
(9 mL)
(9 mL )
1 mL
1 mL
1 mL
11
Adicionar o ágar, misturar e deixar solidificar. Incubar as placas invertidas de 3 a 5 dias a 25 C. Contar as placas com 10 a 150 colônias. 6. Bolores e leveduras osmofílicos No caso de amostras de mel, e outros produtos com alta concentração de açúcares, contar bolores e leveduras osmofílicos em paralelo ao ágar batata normal. Usar: Ágar batata + 20% de glicose (ágar normal + 18 g de glicose para 100 ml de meio). Diluente água peptonada 0,1% + 20% de glicose. 7. Coliformes Coliformes são bastonetes Gram negativos, aeróbios e facultativamente anaeróbios, que fermentam a lactose com formação de gás em 48 horas a 35 C. A especificação do meio e da temperatura é crítica para a interpretação dos resultados. Com base nas evidências disponíveis, 20 ou mais espécies representativas atendem aos critérios que definem o grupo coliforme. O grupo coliforme, que não identifica os membros individualmente, tem menor valor interpretativo que o único organismo c oli, bem como o grupo coliforme de origem fecal, pois o grupo coliforme índice, a E. coli
pode conter alguns alguns membros não não entéricos como o gênero gênero Serratia e Aeromonas. Meios utilizados: Água peptonada a 0,1%
Caldo Lauril Sulfato Triptona
20 g
12
Lactose
5,0 g
NaCl
5,0 g
Lauril Sulfato de Sódio
0,1 g
K 2HPO4
2,75 g
KH2PO4
2,75 g
H2O dest.
1000 mL pH – 6,8 6,8 0,1
Caldo Verde Brilhante Bile 2% Lactose Lactose Peptona
10 g
Lactose
10 g
Bile concentrado
20 g
Verde brilhante
0,0133 g
H2O dest.
1000 mL pH – 7,4 7,4 0,1
Técnica: Semear as diluições em série de 3 tubos de caldo lauril;
Incubar a 36
1 C por 48 horas e separar os tubos positivos (gás no tubo de
Durham);
Tubos positivos = inocular no Caldo verde brilhante bile 2%;
Incubar a 36 1 C por 48 horas;
Calcular o NMP de colônias através do número de tubos positivos, consultando
tabela específica; Resultado = (NMP) por g ou mL.
8. Coliformes Fecais
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A separação dos coliformes de origem fecal daqueles de origem não fecal é feita através de testes baseados em incubação à temperaturas elevadas. Tais testes são usados internacionalmente com algumas variações. Entretanto estes métodos não são absolutos. O termo coliforme de origem fecal não pretende identificar, mas apenas indicar, a presença de E. coli, não separando esta bactéria das demais, geralmente considerada consideradass de pouco ou nenhum significado em saúde pública. Por outro lado, a presença de microrganismos do grupo de origem fecal no alimento pode ser atribuído a uma contaminação pelo ambiente e não necessariamente a uma contaminação fecal direta, e o seu número pode estar associado ao desenvolvimento no próprio produto. Como para os demais coliformes, a tolerância ou não para este grupo, depende do tipo de produto para análise, e das condições necessárias de higienização e sanitização nos locais de estocagem, fabricação e processamento de alimentos. Sua interpretação e tolerância, portanto, tem mais mai s sentido quando da comparação dos resultados obtidos em função da padronização da da metodologia analítica. analítica. Meios utilizados Caldo EC Peptona de caseína
20 g
Lactose
5,0 g
Sais biliares
1,5 g
K 2HPO4
4,0 g
KH2PO4
1,5 g
NaCl
5,0 g
H2O dest.
1000 mL pH – 6,9 6,9 0,2
Ágar EMB – Seg. Seg. Levine Peptona de carne
10 g
Lactose
10 g
14
K 2HPO4
2,0 g
Eosina amarela
0,4 g
Azul de metileno
0,065 g
Ágar
15 g
H2O dest.
1000 mL pH – 7,0 7,0 0,2 Caldo triptona
Triptona
10 g
NaCl
5,0 g
H2O dest.
1000 mL pH – 6,9 6,9 0,2
Proteose peptona
Caldo VM-VP
7,0 g
Glicose
5,0 g
K 2HPO4
5,0 g
H2O dest.
1000 mL pH – 7,0 7,0 0,2 Ágar Citrato – Seg. Seg. Simons
NH2PO4
1,0 g
K 2HPO4 NaCl
1,0 g 5,0 g
Citrato de sódio
2,0 g
MgSO4. 7H2O
0,2 g
Azul de Bromotimol
0,08g
gar
15 g
H2O dest.
1000 mL pH – 6,9 6,9 0,1
Reagentes: Reativo de Kovacs
15
Paradimetilaminobenzaldeído Paradimetilaminobenz aldeído
5,0 g
Álcool isoamílico
75 mL
HCl conc.
25 mL
Dissolver o benzaldeído em álcool e após adicionar o HCl. Acondicionar em frasco escuro em geladeira. Alfa Naftol Alfa-naftol
5,0 g
Etanol
100 mL
Estocar em frascos escuro e sob refrigeração. refri geração. Evitar contato.
Hidróxido de potássio KOH
40 g
H2O dest.
100 mL
Técnica: Tubos positivos de lauril repicar para Caldo EC;
Incubar em banho-maria 44,5 0,2 C por 24 horas;
Controle teste: + E.coli , - E. aerogenes;
Considerar o resultado confiável quando os controles confirmarem.
Resultado em NMP.
10-1
10-2 Caldo Lauril
10-3
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48 h a 36C Tubos positivos
Brilha Broth
Caldo EC
48 h a 36C
24 h a 44,5C
Coliformes totais
Continua com testes bioquímicos os Tubos com resultados positivos TESTES BIOQUÍMICOS
24h a 37C
C. Triptona (24h)
C. VM(48h)-VP(5 dias)
Ágar citrato (24h)
Interpretação dos resultados: Produção de indol – no no caldo Triptona adiciona-se 0,3 mL do reagente de Kovacs.
E. coli = coloração vermelha no vermelha no álcool.
Vermelho de metila – 1 1 mL do meio VM-VP + 3 gotas de vermelho de metila
E. coli = coloração vermelha. E. aerogenes = amarelo.
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Vogues – Proskauer Proskauer – meio meio VM-VP + 0,3 mL m L de alfa-naftol + 0,1 ml de KOH 4% +
gotas de creatina a 5% em NaOH 0,1 N. E. coli = sem alteração. E. aerogenes = coloração vermelha.
Citrato
E. coli = sem alteração. E. aerogenes = meio fica azul azul..
9. Staphylococcus aureus O S. aureus representa um risco para a saúde pública pela produção de enterotoxina estafilocócica, agente causal de intoxicação alimentar. A determinação de S. aureus é importante para: Confirmar intoxicação causada pelo mesmo;
Identificar alimentos veiculadores desta bactéria;
Demonstrar contaminação pós-processamento por manipulação humana.
No que se refere às matérias-primas, deve-se considerar a possibilidade de sobrevivência durante o processo de transformação das mesmas. A presença de S. aureus em produtos fermentados pode indicar fermentação imprópria. Meios utilizados Água peptonada a 0,1%
Ágar Baird – Parker Parker Extrato de carne
5,0 g
Triptona
10 g
Extrato de levedura
1,0 g
Piruvato de sódio
10 g
Glicina
12 g
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Cloreto de lítio
5,0 g
Ágar
20 g
H2O dest.
1000 mL pH – 6,8 6,8 0,2
Antes do uso, fundir e resfriar a 50 C. Adicionar: 95 mL do meio base;
4,8 mL de emulsão de gema de ovo (50%);
1,0 mL de telurito de potássio 1%.
Caldo cérebro coração Infusão de cérebro de terneiro
12,5 g
Infusão de coração de boi
5,0 g
Peptona
10 g
NaCl
5,0 g
Na2HPO4
2,5 g
Glicose
2,0 g
H2O dest.
1000 mL pH – 7,4 7,4 0,1
Técnica:
Semear em superfície de Ágar Baird-Parker, 0,1 mL de cada dil., espalhar o inóculo pela superfície com bastão bastão em L; L;
Incubar a 36C por 48 horas.
Contar as col. típicas ( negras, com 2 halos: um opaco e um translúcido) e atípicas.
TESTES BIOQUÍMICOS Isolar 5 colônias ou a raiz do número contado e transferir para ágar nutriente inclinado. Incubar a 36 C por 24 horas.
Coagulase Inocular uma alçada para caldo BHI;
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36C por 24 horas;
Retirar 0,3 mL para tubo estéril;
0,5 mL de plasma de coelho
Resultado = positivo para S. aureus – – coágulos. coágulos.
Gram Apresentam-see como coccus Gram positivos agrupados em cachos. Apresentam-s Catalase Em lâminas de vidro colocar uma porção da cultura + 1 gota de água oxigenada (H2O2) 10 volumes. Resultado = Staphylococcus – – todos todos positivos. 0,1 ml em Baird - Parker 37C/48 horas ágar nutriente 37C/24 horas Testes Bioquímicos BHI
Catalase
Gram
(37C/4-24 h) 0,3 ml +0,5 plasma coágulos (+) 10. Bacillus cereus O Bacillus cereus é um bastonete, gram-positivo, esporulado, aeróbio e anaeróbio facultativo. É comum no solo, vegetais, alimentos crus e processados. processados. Alimentos com contagens superiores a 10 6 UFC/g podem produzir intoxicação alimentar. Normalmente os alimentos implicados em intoxicações foram submetidos a um tratamento pelo calor, porém não foram esfriados com rapidez, nem conservados em
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temperaturas de refrigeração, permitindo deste modo que os poucos esporos que sobreviveram ao tratamento térmico, germinassem e posteriormente multiplicassem produzindo enterotoxinas. enterotoxinas. Meios utilizados Água peptonada 0,1 % Ágar Bacillus cereus, Seg. Holbrook Peptona
1,0 g
Manitol
10 g
NaCl
2,0 g
MgSO4. H2O
0,1 g
Na2HPO4
2,5 g
KH2PO4
0,25 g
Azul de metileno
0,12 g
Piruvato de sódio
10 g
Agar
14 g
H2O dest.
1000 mL pH – 7,1 7,1 0,1
Antes do uso, fundir e resfriar a 50 C, adicionar: 95 mL meio base;
5 mL de emulsão de gema de ovo 50%;
0,4 mL de sulfato de polimixina B 0,1% esterilizada por filtração.
Ágar Nutriente Extrato de levedura
2,0 g
Extrato de carne
1,0 g
Peptona
5,0 g
NaCl
5,0 g
Agar
15 g
H2O dest.
1000 mL
21
pH – 7,0 7,0 0,2 Gelatina Nutriente Extrato de carne
3,0 g
Peptona
5,0 g
Gelatina
120,0 g
H2O dest.
1000 mL pH – 6,9 6,9 0,1 Ágar Nitrato + Motilidade
Extrato de levedura
3,0 g
Peptona
5,0 g
KNO3
1,0 g
Na2HPO4 Galactose
2,5 g 5g
Glicerina
5 mL
Agar
7g
H2O dest.
1000 mL
Ágar amido
Fazer placas com ágar nutriente e após solidificar, fazer uma sobrecamada com ágar amido (AN + 1% de amido)
Hugh & Leifson (ensaio OF) Peptona de caseína
2,0 g
Extrato de levedura
1,0 g
NaCl
5,0 g
K 2HPO4
0,2 g
Azul de bromotimol
0,08 g
22
Agar
2,5 g
H2O dest.
1000 mL
Para 100 mL de meio + 1 mL m L de glicose 10 % Técnica: Semear 0,1 mL em placas de ágar polimixina gema de ovo azul de bromotimol;
Espalhar com bastão em L ou alça de Drigalski;
Incubar a 30C por 24-48 horas;
Contar colônias características;
Passar para NA (30C por 24h).
TESTES BIOQUÍMICOS Gram Bastonetes curtos, gram-positivos. Esporos centrais ou sub-terminais. Catalase Em lâmina de vidro colocar uma porção de cultura + 1 gota de H 2O2 10 vol. – positivo. Resultado = B. cereus – positivo.
Gelatinase Em ágar gelatina nutriente inocular uma cultura em picada e incubar a 20 C por 5 dias. Resultado = B. cereus - positivo (gelatina líquida). Hidrólise de amido Fazer estrias em ágar amido e incubar a 30 C por 48 horas. Revelar com 5 a 10 mL de Lugol. cereus – positivo. Resultado = negativo - azul escuro / B. cereus – positivo.
Redução de nitratos e motilidade
Semear em agulha e incubar a 30 C por 24 horas, ler motilidade. Para nitratos:
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Adicionar 0,5 mL de alfa-naftil-amina + 0,5 mL de ác. Sulfanílico. B. cereus). Resultado = Positivo – rosa. ( rosa. ( B.
Ensaio de Oxidação-Fermentação Oxidação-Fermentação Semear em agulha em duplicata no meio Hugh-Leifson; Hugh- Leifson;
Em um tubo selar com vaspar ou glicerol estéril;
Incubar a 30C por 5 dias;
amarelo.. Positivo = meio amarelo
Fermentativo = positivo no tubo fechado. Oxidativo = positivo no tubo aberto. B. cereus – – oxidativo oxidativo e fermentativo.
Reagentes: Alfa-naftil amina
Alfa-naftol amina
0,5g
Ác. Acético 5N
100 mL
Ácido sulfanílico
Ácido sulfanílico
0,8 g
Ácido acético 5N
100 mL
Ácido acético 5N
HAC Água
28,75 mL 71,25 mL
Podem ser feitos outros testes: Vogues – Proskauer; Proskauer;
Citrato;
Coloração com negro Sudão.
11. Salmonella sp.
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Os membros do gênero Salmonella são agentes de infecções intestinais humanas e de animais. Dentre os agentes de doenças veiculadas por alimentos o gênero Salmonella
é um dos dos principais responsáveis responsáveis por casos fatais e por complicações
clínicas dos afetados. Desta forma, além da alta taxa de mortalidade, sua incidência no homem e animais implica em gastos significativos com medicamentos e hospitalizações. As atividades de inspeção e fiscalização fi scalização de alimentos tem, como objetivo crítico, o controle e a prevenção dos membros deste grupo e das implicações de sua presença nos alimentos, assim como da observância de boas práticas de manufatura e dos programas de controle que devem incluir a certificação da adequacidade adequacidade das medidas adotadas, em especial para este gênero ou bactéria. Os métodos laboratoriais para a sua pesquisa incluem um etapa de pré-enriquecimento, visando minimizar os efeitos do processo tecnológico de obtenção do alimento capaz de promover a injúria fisiológica, sem inativá-la biologicamente. A presença de Salmonella é determinada em 25 g ou ml da amostra sob análise, no mínimo. O resultado positivo para esta pesquisa é interpretado considerando o risco potencial que apresenta, o que significa impropriedade ao consumo do produto em questão. Meios de Cultura
Água peptonada 1% tamponada Peptona de carne
10 g
NaCl
5g
Na2HPO4
9,0 g
KH2PO4
5,0 g
H2O dest.
1000 mL
pH – 7,2 0,2
25
Caldo Selenito Cistina Triptona
5,0 g
L(-) cistina
0,01 g
Lactose
4,0 g
Na2HPO4 . 2H2O
2,0 g
Bi-selenito de sódio
4,0 g
H20 dest.
1000mL
pH – 7,0 7,0 0,2 – NÃO NÃO AUTOCLAVAR
Caldo Rappaport – Vassiliadis Vassiliadis Peptona de soja
5,0 g
NaCl
8,0 g
KH2PO4
1,6 g
MgCl2 . 6 H2O
40 g
Verde malaquita
0,04 g
H2O dest.
1000 mL pH – 5,2 5,2 0,2
Ágar verde brilhante, vermelho de fenol lactose sacarose (BPLS) Peptona de carne
5,0 g
Peptona de caseína
5,0 g
Extrato de levedura
3,0 g
Lactose
10 g
Sacarose
10 g
NaCl
5,0 g
Na2HPO4
2,0 g
Verde malaquita
0,0125 g
Vermelho de fenol
0,08 g
Ágar
12 g
26
H2O dest.
1000 mL pH – 6,9 6,9 0,1
Para 100 mL do meio fundido e resfriado a 50 C adicionar 1 mL de novobiocina 0,4
% estéril Ágar para enterobactérias de Hektoen Proteose peptona
12 g
NaCl
5,0 g
Extrato de levedura
3,0 g
Lactose
12 g
Sacarose
12 g
Salicina
2,0 g
Na2S2O3
5,0 g
Citrato de ferro e amônio
1,5 g
Sais biliares
9,0 g
Azul de bromotimol
0,064 g
Fucsina ácida
0,04 g
Ágar
13,5 g
H2O dest.
1000 mL
pH – 7,5 7,5 0,1 - NÃO - NÃO AUTOCLAVAR AUTOCLAVAR Ágar xilose-lisina-desoxico xilose-lisina-desoxicolato lato Extrato de levedura NaCl
3,0 g 5,0 g
D(+) xilose
3,5 g
Lactose
7,5 g
Sacarose
7,5 g
L(+) lisina
5,0 g
Desoxicolato de sódio
2,5 g
Na2S2O3
6,8 g
Citrato de ferro e amônio
0,8 g
Vermelho de fenol Ágar
0,08 g 13,5 g
27
H2O dest.
1000 mL
pH – 7,4 7,4 0,2 – NÃO NÃO AUTOCLAVAR
Caldo Uréia Extrato de levedura
0,1 g
KH2PO4
9,1 g
Na2HPO4
9,5 g
Vermelho de fenol
0,01 g
H2O dest.
1000 mL pH – 6,8 6,8 0,1
Após esterilizar, esfriar e adicionar 5 mL de uréia 40 % (por litro de meio).
Distribuir 10 mL em tubos.
Ágar lisina ferro (LIA) Peptona Extrato de levedura
5,0 g 3,0 g
Glicose
1,0 g
L-lisina
10 g
Citrato de férrico amoniacal
0,5 g
Na2S2O3
0,04 g
Púrpura de bromocresol
0,02 g
Ágar
15 g
H2O dest.
1000 mL pH – 6,7 0,1
28
Ágar tríplice açúcar ferro (TSI) Extrato de carne
3,0 g
Extrato de levedura
3,0 g
Peptona de caseína
15 g
Peptona de carne
5,0 g
Lactose
10 g
Sacarose
10 g
D(+)Glicose
1,0 g
Citrato de ferro e amônio
0,5 g
NaCl
5,0 g
Na2S2O3
0,3 g
Vermelho de fenol
0,024 g
Ágar
12 g
H2O dest.
1000 mL pH – 7,4 7,4 0,1
Meio SIM Peptona de caseína
20 g
Peptona de carne
6,6 g
Citrato de amônio e ferro III
0,2 g
Na2S2O3
0,2 g
Ágar
3,0 g
H2O dest.
1000 mL pH – 7,3 7,3 0,1
Ágar Citrato de Simmons
29
Caldo Dulcitol – Base: Base: Triptona
5,0 g
Peptona de carne
5,0 g
NaCl
5,0 g
Vermelho de fenol
0,018 g
H2O dest.
1000 mL pH – 7,4 7,4 0,1
Adicionar 2,5 mL Dulcitol 20% ( esterilizado por filtração).
Caldo Malonato – fenilalanina fenilalanina Extrato de levedura
1,0 g
(NH4)2 SO4
2,0 g
K HPO
0,6 g
2
4 KH2PO4
0,4 g
NaCl
2,0 g
Malonato de sódio
3,0 g
Azul de bromotimol
0,025 g
Fenilalanina
1,0 g
H2O dest.
1000 mL pH – 6,6 6,6 0,1
Técnica: 25 g de amostra + 225 mL APT 1% 24h / 35C 1 mL
1 mL
30
24h / 36C
Colônias Típicas para ágar nutriente 24h / 36C
Caldo Uréia 24h / 36C Dos tubos (-) para urease, repicar em:
amarela com H2S. TSI base amarela com LIA violeta com violeta com H2S.
SIM motilidade (+) H2S (+).
Malonato-fenilalanina (-).
Citrato (+).
Dulcitol (+).
Sendo necessário, fazer sorologia. Malonato = degradação do malonato pela viragem do indicador.
amarela. Fenilalanina = gotas de HCl 0,1 N até amarela. 3-4 gotas de FeCl3 10 % amarela (-)
31
verde (+) verde Dulcitol = vermelho (-) vermelho (-) e amarela (+)
12. Viabilidade da flora bacteriana do iogurte iogurte ( número relativo de Streptococcus thermophilus
e Lactobacillus bulgaricus )
Meios utilizados Água Peptonada 0,1% Ágar Lee Triptona
2,0 g
Extrato de Levedura Levedura
2,0 g
Lactose
1,0 g
Sacarose
1,0 g
CaCO3
0,6 g
KH2PO4
0,1 g
Ágar
3,6 g
H2O dest.
1000 mL
Após esterilizar, adicionar adicionar 2 ml de sol. estéril de Púrpura de bromoc bromocresol resol 0,2%. Técnica Diluir o iogurte;
Inocular 0,1 mL das diluições adequadas por espalhamento em superfície;
Incubar por 48 horas a 37C.
Resultados:
S. thermophilus – amarelo amarelo.. L. bulgaricus
- brancos.
Proporção normal 1:1.
32
13. Esporos Mesófilos 25g + 225 mL água peptonada 0,1 % Liquidificador 10 mL em 100 mL de ágar BPC 90C por 15 min c/agitação constante resfriamento rápido ( 50C) Distribuir em 6 placas Incubar a 37C por 24-48 horas Obs: contar todas as placas.
Ágar BPC Triptona
10 g
Glicose
5,0 g
Púrpura de bromocresol 0,2%
10 mL
Ágar
15 g
H2O dest.
1000 mL pH – 7,0 7,0
14. Esporos Termófilos Termófilos
20 mL da dil. + 100 mL de ágar BPC
33
Vapor fluente por 30 min
Distribuir em 6 placas (50C)
Incubar a 55C por 24-48 horas Flat Sour : colônias amarelas. amarelas. Resultado x 5 = esporos por 10 g. ( esporos sempre por 10 g do produto).
15. Lipolíticos As gorduras dos alimentos são suscetíveis á hidrólise e oxidação, o que pode ser causado por bactérias, bolores e leveduras, como também por processos químicos. A deterioração hidrolítica e oxidativa das gorduras levam a alterações do odor e diminuição da qualidade. Os alimentos mais freqüentes envolvidos em problemas de lipólise são os cremes de leite, manteigas, margarinas e outros produtos com grande proporção de gorduras. A temperatura e umidade durante o armazenamento armazenamento podem proporcionar condições de desenvolvimento desenvolvimento de microrganismos lipolíticos. Os gêneros Pseudomonas, Alcaligenes, Staphylococcus possuem espécies lipolíticas.
As lipases são relativamente ativas em baixa atividade de água (congelados, alimentos em pó) embora o aumento nas condições de atividade de água aumente a ação enzimática. As lipases são enzimas exocelulares podendo estar atuando na gordura do alimento mesmo após a destruição da célula microbiana por processos tecnológicos.
34
Meios utilizados Água peptonada 0,1% Ágar Tributirina Peptona
5,0 g
Extrato de levedura
3,0 g
Ágar
15,0 g
H2O dest.
1000 mL pH – 7,5 7,5 0,1
Aquecer o meio 80C e acrescentar 10 g de tributirina neutra a 80 C. Esterilizar.
Técnica: Semear em superfície 0,1 mL das diluições diluiç ões adequadas.
Incubar a 22C por 5 dias.
Contar colônias com halo transparente.
16. Proteolíticos Alterações no sabor e odor podem ser produzidas por microrganismos proteolíticos. Alguns psicrotróficos, causando alterações indesejáveis em produtos cárneos, laticínios e pescado. Em alguns alimentos, o número de proteolíticos pode projetar o tempo de vida do produto estocado sob refrigeração e avaliar o processamento tecnológico. Proteases termorresistentes são produzidas por algumas espécies de Pseudomonas e podem alterar leites esterilizados. Espécies proteolíticas são comuns entre os gêneros Bacillus, Clostridium, Pseudomonas e Proteus. As colônias de bactérias proteolíticas no ágar leite apresentam-se rodeadas por uma zona clara como resultado da conversão da caseína em compostos nitrogenados solúveis. Como o meio é opaco, utiliza-se um precipitante químico para detectar a
35
proteólise. Após o tratamento com o precipitante químico, as colônias não podem ser usadas para outras análises. Meios utilizados Água peptonada 0,1% Ágar leite Peptona de carne
5,0 g
Extrato de Levedura Levedura
3,0 g
Ágar
12 g
Água dest.
0,9 L
Na hora de utilizar, acrescentar ao meio estéril, fundido e resfriado 100 mL de leite desnatado reconstituído (10%), estéril. Técnica: Semear em superfície de ágar leite l eite 0,1 mL das diluições adequadas.
Incubar a 22C por 72 horas.
Cobrir o ágar com sol. de ácido clorídrico a 1% ou ácido acético 10% por 1 min.
Retirar o excesso de líquido e contar as colônias rodeadas por um halo transparente.
17. Teste de esterilidade comercial – Exame Exame de alimentos enlatados enlatados A incidência de deterioração em alimentos enlatados é muito baixa, mas quando ocorre é importante saber como proceder com a investigação. A deterioração microbiana ou o hidrogênio liberado na reação dos ácidos com o metal das latas pode produzir deformações na lata. l ata. Temperaturas de verão e altas altitudes al titudes acentuam o grau de estufamento. Nem todos os microrganismos microrganismos que podem crescer em alimen alimento to enlatado causam anormalidades. Existe a presença de microrganismos sem o estufamento das latas, por exemplo o C. botulinum. A
deterioração
de
alimentos
subprocessamento subprocess amento ou vazamento.
enlatados
pode
ser
ocasionada
por
36
Subprocessamento – Este termo é usado para indicar que durante a esterilização, o tratamento térmico foi insuficiente para destruir os microrganismos capazes de desenvolverem desenvolv erem posteriormente no alimento. Pode ocorrer por: (1) subcozimento deliberado visando preservar o “frescor” do produto; (2) falhas na operação do autoclave ( incluindo termômetros, medidores de pressão e controles); (3) contaminação excessiva para a qual o processo normalmente utilizado torna-se insuficiente; (4) Operação inadequada do autoclave. Quando uma lata contém um produto deteriorado e nenhum microrganismo viáv viável, el, a deterioração pode ter
ocorrido antes do processamento processamento ou os microrganismos microrganismos
causadores da deterioração podem ter morrido durante o armazenamento.
17.1 - EXAME PRELIMINAR a. Remover os rótulos identificando toda a informação e codificar com números correspondentes; b. Anotar o tamanho e a quantidade das latas, os códigos, o produto, as condições da lata, defeitos mecânicos, perfurações e manchas de ferrugem; c. Classificar cada lata de acordo com o que segue: c1) plana ( flat flat ) – a a lata na qual ambas as extremidades são e permanecem planas quando invertidas e colocadas bruscamente sobre uma superfície plana; c2) saliência flutuante ( flipper )) – a a lata que normalmente parece plana, mas quando quando colocada bruscamente sobre uma superfície plana mostra abaulamento em uma extremidade. Aplicando pressão nesta extremidade a saliência desaparece desaparece e a lata torna torna-se plana; a lata com uma extremidade permanentemente abaulada. c3) abaulada ( springer )) – a Quando colocada bruscamente sobre uma superfície plana pela extremidade abaulada, esta torna-se plana plana mas forçará abaulamento abaulamento da extremidade oposta; swell ) ) – a a lata abaulada em ambas as extremidades, mas não tão c4) estufada ( soft swell firmemente que não possa ser pressionada de alguma maneira com o dedo;
37
c5) altamente estufada ( hard swell ) – a a lata abaulada em ambas as extremidades de maneira que a pressão do dedo não modifica o formato abaulado. Com o aumento da pressão interna acaba-se rompendo rompendo e o vazamento vazamento ocorre na recravação. recravação. 17.2 - PRÉ – INCUBAÇÃO INCUBAÇÃO As latas, embaladas cartonadas e vidros hermeticamente fechados são colocados sobre papel filtro a fim de constatar-se possíveis microfugas e incubados. Incubar 1 amostra na temperatura de 35C por 14 dias e 1 a 55 C por 10 dias. Os produtos já bombeados (tufados) na chegada ao laboratório deverão ser analisados imediatamente, dispensando dispensando a prova de estufa.
17.3 - ABERTURA DAS LATAS - Lavar as latas com água e sabão e esterilizar a extremidade a ser aberta adicionando álcool e flambando. NÃO FLAMBAR latas altamente estufadas. Apenas passar um pano esterilizado embebido embebido em álcool. álcool. - A abertura da lata é feita com abridor previamente flambado em álcool. 17.4 - Produtos ralos como leite ou sopa Retirar quantidades de 50 mL do produto com auxílio de pipeta estéril e com ponta cortada. Destes 50 mL: (a) 20 mL são transferidos para um tubo estéril estéril o qual qual
é mantido em
refrigerador para referência futura; (b) adicionar 1 a 2 mL a cada um dos tubos de meios de cultura indicados; (c) o resto é utilizado para o teste de pH. 17.5 - Produtos semi-sólidos semi-sólidos como pudins. pudins. Retirar cerca de 30 mL do produto com auxílio de pipetas de ponta larga esterilizadas e transferir para frasco contendo 70 mL de água destilada esterilizada. Para alguns produtos é recomendável colocar-se algumas pérolas de vidro com a água estéril. Agitar vigorosamente e usar a mistura resultante da mesma maneira que o
38
produto ralo. ( Quando usar pérolas de vidro use tampa de borracha estéril para fechar o recipiente ). 17.6 - Produtos sólidos sólidos como carne. Neste caso fazer uma abertura em toda a tampa da lata. A amostra é então removida utilizando-se de amostrador de queijo, colheres, etc que tenham sido previamente esterilizados. A amostra é coletada primeiro no centro da lata e depois nas laterais em 3 ou 4 direções . Transferir a amostra para frascos contendo 70 mL de água estéril ( contendo pérolas de vidro ). Fechar o frasco com tampa de borracha e agitar vigorosamente. A mistura é utilizada da mesma maneira que o produto ralo.
17.7 - TÉCNICA DE DE CULTIVO
Produtos de baixa e media acidez ( pH > 4,5 ) De cada lata ou outro conteiner, inocular 4 tubos de caldo de carne cozida
(cooked meat medium) ou caldo de fígado picado (chopped liver broth) previamente aquecido a 100C e resfriado a temperatura ambiente. Inocular também 4 tubos de caldo dextrosado púrpura de bromocresol. Inocular cada tubo com 1-2 mL do produto líquido ou da mistura aquosa do produto, ou 1-2 gramas do material sólido.
Incubar como segue: Meio
Tubos
T C
Tempo(h)
Teste para:
Carne cozida*
2
37
96
Anaeróbios
(ou fígado) Carne cozida*
Putrefativos 2
55
24-72
(ou fígado) PBC
Anaeróbios Termófilos
2
55
24-48
Termófilos
39
Tipo FLAT SOUR PBC
2
37
96
Devido a Vazamento
*os meios para anaeróbios devem ser estratificados com uma camada de Vaspar (partes iguais de vaselina sólida e parafina) de cerca de 2 cm de espessura. Verificar a presença ou ausência de crescimento em cada tubo e aqueles que mostrarem evidência de crescimento ( turbidez, mudança de coloração do indicador ), fazer coloração de Gram ou colorir com azul de metileno. Observe os tipos morfológicos. Quando a inoculação do alimento ocasiona turbidez no meio, a presença ou ausência de crescimento deve ser determinada por exame microscópico. Também é recomendável repicar, por estriamento, os tubos que apresentarem indícios de crescimento em placas com ágar nutritivo nutriti vo ou ágar cérebro-coração e incubar por 24 horas nas mesmas condições de temperatura, em aerobiose ou anaerobiose, anaerobiose, conforme os tubos de origem.
Teste de catalase Quando o tubo de origem for aquele incubado em anaerobiose e ocorrer
presença de bastonetes Gram positivos, positivos, realizar prova de catalase. A prova de catalase positiva indica a presença de Bacillus sp. E a negativa indica a presença de Clostridium sp..
Ocorrendo a presença de bastonetes termófilos repicar maciçamente em ágar para
esporulação. Incubar a 55 C por 2-10 dias. A partir do segundo dia verificar a presença de esporos através de esfregaço com coloração específica (verde malaquita). Lavar a cultura a 80C, por 10 min. Após o choque térmico, semear 2 tubos com caldo PBC, incubar 1 tubo a 35C e outro a 55 C por 2-4 dias. 17.8 – Produtos Produtos ácidos ( pH ( pH < 4,5 ) 4,5 ) Verificar a possível presença de hidrogênio em latas deformadas:
40
Quando as latas estão estufadas e apresentam apresentam uma contagem baixa de microrganismo, e conveniente analisar os gases para investigar estufamento por hidrogênio. Este tipos de deterioração, de origem não bacteriana, da origem a um gás combustível e o interior da lata apresenta-se corroído, enquanto que nos gases resultantes da ação bacteriana predomina o dióxido de carbono. A natureza combustível desse gás pode ser demonstrada fazendo m pequeno orifício na lata enquanto a mesma é mantida junto a uma chama diferencial em um analisador de gás. De cada container, inocular 4 tubos de caldo ácido e 2 tubos de caldo extrato de malte com 1-2 mL ou 1-2 g do produto. Incubar como se segue:
Meio
Tubos
T C
Tempo(h)
Teste para:
Caldo ácido
2
55
48
Termófilos FLAT SOUR
Caldo ácido*
2
37
72
Anaeróbios
Caldo ácido
2
30
96
Leveduras, Leveduras, mofos, Lactobacilos
Caldo estrato de
2
30
96
malte
Leveduras, Leveduras, mofos, Lactobacilos
*Estratificar com ágar simples. Em alguns casos, a deterioração de produtos tais como tomates, peras , figos e abacaxis é causada por Clostridium pasteurianum, um anaeróbio esporulado que produz gás e odor de ácido butírico. EXAME MICROSCÓPICO
Prepare um esfregaço (filme) do conteúdo de cada lata após o subcultivo;
Seque, fixe e core com azul de metileno;
Se o produto for gorduroso, adicione xileno ( com conta gota ) ao filme quente e fixado; passe pela água e core.
41
PRODUTO
35C (14 dias)
2g am 2 tubos com caldo carne +
55C (10 dias)
2g am 2 tubos com caldo PBC
Vaspar 35C/ 5d
2g am
2g am
2 tubos com
2 tubos com
caldo vaspar +
caldo PBC
Vaspar 35C/5d
55C/ 5d
cresc.
cresc.
35C/24 h
35C/24 h
55C/24 h
anaerobiose
aerobiose
anaerobiose
aerobiose
Gram
Gram
Gram
cresc.
Gram Catalase
55C/ 5d cresc.
55C/24 h
Catalase Estrias em tubo com ágar p/espor. 55C/2-10 d Lavar a cultura c/água est. Choque térmico 80C/10 min Tubos BCP
35C/2-4d
55C/2-4d
42
18. Halofílicos Microrganismos que precisam de sal para crescer são chamados de halofílicos. Em geral, eles precisam de outros sais, não somente o NaCl, como por exemplo: K + e Mg2+. Os níveis de sal que o microrganismo precisa varia muito. Entretanto, o tipo microbiano associado a um alimento salgado em particular depende da concentração e do tipo de sal sal e do tipo de de alimento. A classificação mais prática de halofílicos é aquela baseada no nível de sal:
Fracamente halofílicos = 2 – 5% 5% de sal.
Moderadamente halofílicos = 5 – 20 20 % de sal.
Extremamente halofílicos = 20 – 30 30 % de sal.
Também existem muitos halotolerantes que crescem tanto em meio sem sal quanto em meios em que a conc. de sal excede 5%. Muitos microrganismos estão envolvidos na deterioração de alimentos salgados, salgados, entretanto entretanto outros, como o Staphylococcus aureus, são pategos. Bolores e leveduras, e outros microrganismos osmofílicos estão envolvidos na deterioração de alimentos com baixo valor de aw, inclusive alimentos salgados. salgados. Meios utilizados (para veg. e carnes) Água peptonada 0,1% + NaCl 5% Peptona de caseína
1,0 g
NaCl
50 g
H2O
1000 mL pH final 6,9 0,2 Trypticase soy ágar + NaCl 5%
Triptona
15 g
Peptona de soja
5,0 g
NaCl
50 g
ágar
15 g
H2O
1000 mL pH final 7,3 0,2
43
Técnica:
Realizar as diluições adequadas;
Colocar 1 mL em placa de Petry;
Verter o ágar fundido e deixar solidificar;
Incubar as placas invertidas por 4 dias a 25C;
Contar as placas.
Obs: Dependendo da amostra o diluente, o meio, a temperatura de incubação e o tempo de incubação devem ser alterados. 19. Clostrídios Sulfito Redutores Bastonetes Gram-positivos, esporulados, imóveis produtores de toxina patogênica. É anaeróbio-aerotolerante. anaeróbio-aerotoleran te. O pH de crescimento varia de 5,5 a 8,0 na faixa de temperatura de 20 a 50C. Seu hábitat natural: solo, águas residuais, poeira, fezes do homem e dos animais. Meios utilizados Água peptonada 0,1%
Ágar seletivo para C. perfringens Seg. Angelotti ou ágar SPS Peptona de caseína
15 g
Extrato de levedura
10 g
Citrato férrico
0,5 g
ágar
15 g
H2O
1000 mL pH final 7,0 0,2
44
Dissolver os componentes em água destilada. Autoclavar a 121 C/ 15 min. Após esterilizar, adicionar as seguintes soluções, esterilizadas por filtração por litro de meio: Sulfito de sódio 10% -------------------------------- 5,0 mL Sulfato de polimixina B 0,2%---------------------- 10 mL Sulfadiazina sódica ---------------------------------- 10 mL Na forma desidratada desidratada proceder conforme conforme instruções do fabricante. Técnica:
Semear 1 ml das diluições em ágar SPS (pour plate) fazer sobrecamada; sobrecamada;
Incubar a 46C/ 48 horas;
Contar as colônias médias e negras.
Obs: A incubação deve ser anaeróbia. Para tanto colocar as placas invertidas em jarra apropriada, adicionada de Gaspak ou anaerogen, conforme instruções do fabricante. Esterilidade 20. Teste de Segurança Biológica - Esterilidade Os testes são aplicados a insumos farmacêuticos, medicamentos e correlatos que, de acordo com a Farmacopéia, devem ser estéreis, e são adequados para revelar a presença de bactérias e fungos fungos nos mesmos. mesmos. Meios utilizados Os meios mais usados atualmente para o teste de esterilidade são: Meio de caseína-soja e Tioglicolato Fluido; o primeiro para fungos e aeróbios e o segundo para anaeróbios, embora haja crescimento de aeróbios e até mesmo fungos no tioglicolato. Água peptonada 0,1% Peptona de carne
0,1 g
H2O dest.
100 mL pH após esterilização - 7,1 0,2
45
Meio de Tioglicolato Fluido L-Cistina
0,5 g
Cloreto de sódio
2,5 g
Dextrose
5,5 g
Extrato de levedura
5,0 g
Caseína de digestão pancreática
15,0 g
Tioglicolato de sódio ou
0,5 g
Ácido tioglicólico
0,3
Solução de resarzurina sódica (1:1000)
1,0 mL
Ágar
0,75 g
H2O dest.
1000 mL pH após esterilização - 7,1 0,2
Meio de Caseína-Soja Caseína de digestão pancreática
17,0 g
Farinha de soja de digestão pancreática
3,0 g
Cloreto de sódio
5,0 g
Fosfato de potássio dibásico
2,5 g
Dextrose
2,5 g
H2O dest.
1000 mL pH após esterilização - 7,3 0,1
Pré-Incubação e Teste de Sensibilidade dos Meios de Cultura Os meios de cultura devem apresentar esterilidade e capacidade de promover crescimento de microrganismos que devem ser testadas em cada lote antes do teste das amostras ou em paralelo com ele. Após a esterilização os meios de Tioglicolato fluído e Caseína-soja devem ser incubados, respectivamente, respectivamente, a 30-35C e 20-25C, durante 7 dias no mínimo. Não deve ocorrer o crescimento de microrganismos. Efetuar teste para verificar a capacidade dos lotes de meios em promover o crescimento de microrganismos. Os seguintes microrganismos são adequados para realizar o teste: a)
Bacillus subtillis ATCC 6633 ou Micrococcus luteus ATCC 9341
46
b)
Candida albicans ATCC 10.231
c)
Aspergillus niger ATCC
d)
Clostridium sporogenes ATCC 11.437 ou Bacteroides vulgatus ATCC 8482
16.404
Inocular pelo menos 2 tubos de cada meio, com volume de suspensão que contenha 50 a 100 células, conforme conforme a tabela: Meio
Microrganismo
Temperatura incubação
B. subtilis ou M. luteus
Tioglicolato fluido
30-35C
C. albicans C. sporogenes ou B. vulgatus
B. Subtilis ou M. luteus
Caseína-soja
20-25C
C. albicans A. niger
Avaliação da Atividade Bacteriostática ou Fungistática Fungistática Antes de iniciar o teste de esterilidade avaliar seu nível de atividade bacteriostática e/ou fungicida pelo seguinte procedimento: procedimento: Preparar, pelo menos, 4 tubos de meio de cultura a serem empregados no teste de esterilidade. Adicionar a todos os tubos quantidade do produto em análise: Conteúdo do
Volume mínimo
Volume mínimo
recipiente (mL) Menos que 10
de produto (mL) 1mL ou conteúdo total,
de meio (mL)
se menor que 1
15
11 a 50
5
40
51 a 100
10
80
Inocular metade dos tubos com microrganismo aeróbio e a outra metade com anaeróbio conforme indicado na tabela do teste de crescimento dos meios de cultura. Preparar duplicata do conjunto em condições idênticas, idênticas, porém não adicionar o produto a ser testado. Incubar todos os tubos tioglicolato a 30-35 C e a 20-25C, os que contiverem caseína soja. Se houver cresimento normal dos microrganismos mi crorganismos na presença
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e ausência do produto, o teste de esterilidade pode ser realizado sem modificações. Se o crescimento for pequeno ou nulo, o produto exerce atividade bacteriostática e/ou fungistática e essa atividade deve ser eliminada antes do teste de esterilidade por meio de agentes neutralizantes ou, no decorrer do mesmo, através da diluição do produto. Deve-se repetir o teste até determinar a relação ideal entre volumes do produto e do meio, que não interfira no crescimento de microrganismos. Outra maneira de evitar as atividades bacteriostática e fungistática é empregar o método de filtração por membrana, quando a natureza do produto assim o permitir. Procedimento para o Teste de Esterilidade O teste de esterilidade pode ser realizado de 2 maneiras: através do Método de inoculação do produto diretamente no meio (Método Direto) ou pelo método de filtração por membrana, o qual deve ser empregado sempre que possível. Amostragem O número de amostras de um produto para o teste de esterilidade deve ser, no mínimo, de 20 unidades ou 10% do número de unidades que constituem o lote se este for inferior a 199 unidades. Antes do teste proceder a assepsia das paredes externas dos frascos e ampolas, mergulhando-os em solução anti-microbiana. No caso de artigos cujas as embalagens não resistam a esse tratamento, fazer assepsia das amostras por meio de gaze ou pano estéril, embebido em solução anti-microbiana. Para matérias primas, amostragem satisfatória é baseada na raiz quadrada do número total de recipientes do lote. Método de Inoculação ou Direto a) Procedimento O teste de esterilidade pelo método de inoculação ou direto consiste na transferência asséptica de quantidade do produto a ser examinado para o meio de tioglicolato fluido e meio de caseína-soja seguida de incubação a 30-35C e 20-25C durante 14 dias.
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b) Líquidos Retirar o líquido do recipiente utilizando pipeta estéril ou seringa e agulha estéreis. Transferir assepticamente o volume indicado de cada amostra para os tubos contendo os meios conforme a tabela do teste de avaliação da atividade bacteriostática ou fungistática. Misturar o líquido com o meio sem arejar excessivamente. excessivamente. c) Sólidos Transferir quantidade de produto na forma de sólido seco (ou de solução ou suspensão do produto preparada pela adição de água peptonada estéril ao recipiente) correspondente a 300 mg de cada recipiente sob análise, ou todo conteúdo se for menor que 300 mg, a volume não inferior a 40 mL dos meios. Misturar e proceder como para líquidos. d) Controle Negativo ou Branco Efetuar constantemente controle negativo simulando teste com o diluente utilizado. O resultado do teste deve ser negativo. e) Observação e Interpretação dos resultados Durante o tempo de incubação, observar os tubos em análise, periodicamente, para verificar eventual aparecimento aparecimento de crescimento crescimento microbiano. Se, no final do período de incubação, não ocorrer crescimento microbiano, a amostra é considerada satisfatória para o teste de esterilidade. Se ocorrer crescimento, o produto não corresponde ao teste de esterilidade, a menos que se possa demonstrar o contrário por reteste, ou por meios que comprovem não Ter contaminação com causa relacionada com a amostra (ex.: contaminação ambiente, contaminação de controle negativo). negativo). O reteste deve ser feito de maneira idêntica ao inicial. Se não aparecer evidência de crescimento, a amostra é considerada satisfatória para o teste de esterilidade. Se houver crescimento no reteste, comparar com o primeiro teste. Seo contaminante for o
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mesmo, a amostra não corresponde ao teste de esterilidade. Se os dois contaminantes forem diferentes, deve ser realizado um segundo segundo reteste. USP XXII, 71- Sterility tests. Pg 1483-1488.
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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS BRASIL. Ministério da Agricultura, do Abastecimento e da Reforma Agrária. Secretaria Nacional de Defesa Agropecuária. Departamento Nacional de Defesa Animal. Coordenação Geral de Laboratório Animal. Métodos de Análise Microbiológica para Alimentos. 2a revisão. 1991/1992. FOOD AND DRUG ADMINISTRATION - FDA. Bacteriological analytical manual. 7 ed. Arlington: AOAC International, 1992. SPECK, M. L. (Ed.). AMERICAN PUBLIC HEALTH HEALTH ASSOCIATION. ASSOCIATION. Compendium of methods for the microbiological examination of foods. 2 ed. Washington: American Public Health Association, 1984.
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VALORES DE NMP PARA 3 TUBOS INOCULADOS DE 3 DILUIÇÕES DECIMAIS (Demeter, Sauer and Miller, 1933) No de tubos positivos observados em cada diluição 1a diluição 2a diluição 3a diluição 0 0
0 0
0 1
NMP de microrganismos por ml da 1a diluição < 0,3 0,3
00 0
11 2
01 0
0,3 0,6 0,6
24 4
1 1 1 1 1 1 1 1
0 0 0 1 1 2 2 3
0 1 2 0 1 0 1 0
0,4 0,7 1,1 0,7 1,1 1,1 1,5 1,6
1 3 4 2 4 3 4 4
2 2 2 2
0 0 0 1
0 1 2 0
0,9 1,4 2,0 1,5
1 3 4 2
2 2 2 2 2 2 2 2
1 2 2 2 2 3 3 3
12 0 1 2 3 0 1 2
2,0 3,0 2,0 3,0 3,5 4,0 3,0 3,5 4,0
4 3 4 4 4 4 4 4
3 3 3 3 3 3 3
0 0 0 1 1 1 1
0 1 2 0 1 2 3
2,5 4,0 6,5 4,5 7,5 11,5 16,0
1 2 4 1 2 3 4
33 3 3 3 3 3 3
22 2 2 3 3 3 3
01 2 3 0 1 2 3
9,5 15,0 20,0 30,0 25,0 45,0 110,0 >110,0
21 3 4 1 1 1 -
Resultados das categorias 3 e 4 não devem ser usados como base para decisões sobre a qualidade do alimento.
Categoria 3
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