Manual de Microbiologia Agricola

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H O A V IN E A i

U N IV E R SID A D N A C IO N A L AG RAR IA LA M O LIN A

MANUAL DE , MICROBIOLOGIA AGRICOLA

RH IZO BIU M , PGPRs, IN D IC A D O R ES D E FER TILID A D E IN O C U ID A D DORIS ELIZABETH ZÚÑIGA DÁVILA

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RHIZOBIUM, PGPRs,

INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD

DORIS ELIZABETH ZÚÑIGA DÁVILA

2012

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

Dr. JESÚS ABEL MEJÍA MARCACUZCO Rector Dr. JORGE LUIS ALIAGA GUTIÉRREZ Vicerrector Académico Mg.Sc. EFRAÍN DONALD MALPARTIDAINOUYE Vicerrector Administrativo Mg.Sc. MARÍA BEATRIZ OLAYA MORALES Jefe de EDIAGRARIA

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RHIZOBIUM, PGPRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD © Doris Elizabeth Zúñiga Dávila © Universidad Nacional Agraria La Molina Av La Universidad s/n La Molina Derechos reservados ISBN: N° 978-612-4147-04-3 Hecho el Depósito Legal en la Biblioteca Nacional del Perú: Registro: N° 201206340 Primera Edición: mayo del 2012 - Tiraje: 1 000 ejemplares Impreso en Perú - Printed in Perú Editor: M aría Beatriz Olaya Morales Diseño, diagramación e impresión: Q & P Impresores S.R.L Av. Ignacio Merino 1546 Lince Telf. 470-1788 - www.qypimpresores.com Queda terminantemente prohibida por la Ley del Perú la reproducción total o parcial de esta obra por cualquier medio, ya sea electrónico, mecánico, químico, óptico, incluyendo sistema de fotocopiado, sin autorización escrita de la Universidad Nacional Agraria La Molina y la autora. Todos los conceptos expresados en la presente obra son responsabilidad de la autora.

PRESENTACIÓN

ice el lema de la Universidad, “quiero cultivar al hombre y al cam po”, como una forma de expresar la interrelación entre la cultura y la naturaleza; sabia combinación que garantiza la existencia de la sociedad. Para que ésta se optimice, el hombre ha creado la ciencia, perenne y constante preocupación por su entorno, que garantiza el desarrollo y progreso de los pueblos del mundo.

D

La Universidad Nacional Agraria La M olina, es el espacio donde se desarrollan estas preocupaciones y retos en un ambiente de debate y consolidación de la técnica, la ciencia y las humanidades. Sus profesores son los principales agentes de la investigación, cuyos resultados son m ateria de las clases en aulas, y fuera en ella, en foros académicos, donde sale a la luz su excelente preparación e idoneidad experimental. Bajo estos preceptos y antecedentes, me complace presentar este libro “Manual de Microbiología Agrícola RMzobium, PGPRs, Indicadores de Fertilidad e Inocuidad” de Doris Elizabeth Zúñiga Dávila, destacada docente de nuestra universidad, quien en este trabajo demuestra la agudeza de sus investigaciones y comparte sus resultados, como una forma de optimizar el papel de la Universidad para la com unidad universitaria y la sociedad en general.

D r . J esús A bel M ejía M arcacuzco R ector

A la Memoria de mis queridos padres Celia y Francisco por iluminar siempre m i sendero.

A mis hijos E th ely Eduardo por todo su cariño

A m i nietecita Adriana Sol de m i vivir

COLABORADORES: Laboratorio de Ecología M icrobiana y Biotecnología M arino Tabusso - UNALM Blga. Elena Ram os Vásquez Blgo. M inora M atsubara Bautista Blga. Katty Ogata Gutiérrez Bach. Blga. Stefany Cépeda Gonzáles Blga. N atalia Kohashikawa Takaezu Blga. Pam ela Calvo Vélez Centro de Ciencias Genómicas - UNA M (Cuernavaca, México) Dr. Ernesto Orm eño Orrillo Coordinador de la Red Biofag - CYTED, España Dr. Juan Sanjuán Pinilla (CSIC-EEZ, Granada)

Fotografías y diagrama de la portada

Fotografías laterales (D. Zúñiga, E. Ramos y R. Santos) 1. 2. 3. 4. 5.

Efecto de la inoculación de cepas de Azotobacter en plantas de papa. Control de Rhizoctonia por cepas de Bacillus sp. Producción de ácido indol acético por cepas aisladas de frijol. Perfiles de amplificación BOX-PCR de Bacillus aislados de papas amargas. Semillas germinadas de Phaseolus lunatus.

Diagrama central (D. Zúñiga) “Señales moleculares de la interacción Rhizobium -leguminosa”

INDICE

PRÓLOGO I.

13

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE RHIZOBIOS

1. 2. 2.1. 2.2. 2.3. 3. 3.1. 3.2.

Recolección de nodulos Aislamiento de rhizobios Tratamiento de nodulos Aislamiento de rhizobios a partir de nodulos Mantenimiento y conservación de rhizobios aislados Pruebas de pureza Crecimiento en agar levadura lactosa (LLA) Crecimiento en agar peptona - glucosa con indicador púrpura de bromocresol (PGPBC) 3.3. Crecimiento en agar Luria Bertani (LB) 4. Autenticación de las cepas de rhizobios 4.1. Desinfección de semillas 4.2. Evaluación de la germinación 4.3. Preparación del inoculo 4.4. Trasplante de semillas a tubos con solución nutritiva 4.5. Inoculación de las plántulas 5. Caracterización fenotípica de cepas de rhizobios 5.1. Caracterización morfológica de colonias 5.2. Producción de acidez o alcalinidad en medio LMA con azul de bromotimol (LMA-ABT) al 0.5% 5.3. Efecto de los agentes físico-químicos sobre el crecimiento de las cepas de rhizobios 5.4. Tolerancia a iones metálicos Cu2+, Zn2+, Al3+, Mn2+ 5.5. Crecimiento en diferentes fuentes de carbohidratos y aminoácidos 5.6. Sensibilidad a antibióticos en disco

II. 6. 6.1. 6.2. 6.3. 6.4. 7. 7.1. 7.2. 7.3. 7.4.

17 17 17 17 18 19 19 19 19 20 20 20 20 20 21 22 22 22 23 24 26 26

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE BACTERIAS PGPR Aislamiento de bacterias promotoras de crecimiento (PGPR) Procesamiento de las muestras de rizósfera Aislamiento de Bacillus sp. Aislamientos de Azotobacter sp. Aislamiento de actinomicetos Pruebas para bacterias promotoras de crecimiento Detección de acido indol acético (ALA.) Detección de bacterias solubilizadoras de fosfato Pruebas de antagonismo contra hongos fitopatógenos Efecto de la inoculación con PGPRs en la germinación de diferentes cultivos.

31 31 31 31 32 32 33 34 34 36

III. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR E INTERPRETACIÓN DE DATOS MEDIANTE AMPLIFICACIÓN BOX-PCR Introducción '8. Notas generales para hacer PCR 9. Extracción de DNA por lisis alcalina 10. Verificación de la calidad del DNA extraído (Control de calidad) 11. Amplificación BOX-PCR 12. Agrupamiento de perfiles BOX-PCR semejantes 13. Amplificación del gen ribosomal 16s 14. Purificación del producto de PCR 15. Secuenciamiento 16. Elaboración de árboles filogenéticos

39 39 40 41 42 45 46 47 47 50

IV. PRODUCCIÓN Y CONTROL DE CALIDAD DE BIOFERTILIZANTES 17. 17.1. 17.2. 17.3. 18. 18.1. 18.2.

Producción de biofertilizantes Producción de biomasa del rhizobio Preparación del soporte sólido Presentación del biofertilizante Control de calidad del biofertilizante Recuento de células viables de bacterias fijadoras de nitrógeno Capacidad infectiva y efectiva de los inoculantes en plántulas de leguminosas 18.3. Recuento de microorganismos contaminantes del biofertilizante 18.4. Análisis físico-químico 19. Enumeración de bacterias simbióticas fijadoras de nitrógeno por número más probable

53 53 53 55 56 56 56 56 56 58

V. INDICADORES DE LA FERTILIDAD BIOLOGICA DEL SUELO Introducción 20. Preparación de muestras y diluciones 21. Recuento de bacterias 21.1. Recuento de bacterias aerobias mesófilas viables 21.2. Recuento de heterótrofos 22. Recuento de hongos totales 23. Recuento de bacterias anaerobias mesófilas 24. Recuento de actinomicetos 25. Enumeración de bacterias fijadoras de nitrógeno de vida libre 26. Actividad microbiana 26.1 Determinación de la respiración de los microorganismos del suelo 26.2 Determinación de la actividad deshidrogenasa de los microorganismos del suelo

63 65 66 66 66 69 70 71 72 73 73 73

VI. INDICADORES DE INOCUIDAD DE AGUA Y SUELO Introducción 27. Enumeración de coliformes totales 27.1. Enumeración de coliformes totales (ICMSF, 2000) 27.2. Enumeración de coliformes totales (Standard Methods, 1998) 28. Enumeración de coliformes fecales 28.1. Enumeración de coliformes fecales (ICMSF, 2000) 28.2. Enumeración de coliformes fecales (Standard Methods, 1998) 29. Enumeración de Escherichia coli 29.1. Técnica para el aislamiento y purificación de cultivos 29.2. Técnica para la prueba del indol 29.3. Técnica para la prueba del rojo de metilo 29.4. Técnica para la prueba de Voges-Proskauer 29.5. Técnica para la prueba del citrato sódico 30. Determinación de Salmonella 30.1. Enriquecimiento no selectivo de salmonelas 30.2. Enriquecimiento selectivo de salmonelas 30.3. Siembra en medios de agar selectivo para salmonelas 30.4. Bioquímica de Salmonella 30.5. Serología somática REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS N° 1: Medios de cultivo y reactivos N° 2: Ensayos de sensibilidad a diferentes antibióticos N° 3: Tablas de número más probable N° 4: Material de biología molecular

79 81 81 83 86 86 88 90 90 90 90 90 91 92 92 92 92 92 93 95 99 100 106 107 111

A B R E V IA T U R A S AP APT EC LMC CG Brilla CL LST SC T-VB TSC CT TY M M - ABT SS

Agua peptonada Agua peptonada tam ponada Caldo EC Caldo extracto de levadura - m anitol Caldo glucosa Caldo lactosa bilis (2 %) verde brillante Caldo lactosado Caldo lauril sulfato triptosa Caldo selenito cistina Caldo tetrationato verde brillante Caldo tripticasa de soya Caldo triptona Caldo triptona - extracto de levadura M edio mineral sin nitrógeno con indicador azul de bromotimol Solución salina 0.85 %

PRÓLOGO a fertilidad del suelo generalmente está relacionada con la cantidad de nutrientes disponibles para las plantas y los microorganismos juegan un rol importante en el reciclaje de todos estos elementos nutricionales que muchas veces no se comprende. A nivel mundial existen muchas investigaciones relacionadas con la dinámica de la microflora de diferentes suelos y su relación con la producción de diferentes cultivos, pero estos análisis resultan aún muy costosos.

L

En el primer manual Fertilidad Biológica del Suelo con énfasis en el estudio del Rhizobium editado en Junio del 2006 fue utilizado dentro del I Curso Internacional de Fertilidad Biológica del Suelo, auspiciado por la Red Biofag (Cyted España). Después de una revisión e incorporación de nuevas técnicas como el aislamiento de bacterias promotoras de crecimiento (PGPR) y pruebas de actividad microbiana investigados en nuestro laboratorio, se propuso darle el título de Microbiología Agrícola: Rhizobium, PGPR, indicadores de fertilidad e inocuidad, puesto que los ensayos se enfocan principalmente en el estudio de los suelos para la producción de diversos cultivos de manera sostenible. Por otro lado, en los últimos años se ha incrementado la demanda de análisis microbiológicos en suelos, agua de riego y residuos orgánicos, que nos indican la riqueza natural de estos sustratos; y mas aún por empresas que trabajan a nivel de exportación de cultivos, cuyas exigencias se basan en las normas de Eurepgap, son mayores cuando se trata de productos orgánicos. Estas involucran las buenas prácticas agrícolas, seguridad alimentaria, protección del ambiente y salud. Pero además, los pequeños agricultores cuya proyección es ofrecer productos nativos manejados de manera tradicional, también requieren de estas técnicas y conocimientos. El presente manual se organiza en 6 capítulos con un total de 30 temas. En primer lugar se describe todo lo relacionado con el Rhizobium aislados de nodulos de diferentes leguminosas, es decir, desde su aislamiento, purificación, y autenticación en plántulas hasta su caracterización fenotípica: morfológica y bioquímica. En segundo lugar, se presentan las técnicas de aislamiento de bacterias promotoras de crecimiento con énfasis en Bacillus y Azotobacter no presentadas en el manual anterior de Fertilidad Biológica. Así también se describen algunas técnicas para evaluar la capacidad promotora de crecimiento (PGPR), como solubilización de fosfato y producción de ácido indol acético (AIA). En la presente obra, también se incluyen dos pruebas importantes como es la capacidad antagónica de fitopatógenos y efecto de las bacterias en la germinación de semillas. Todas estas pruebas, nos permite conocer no solo el potencial de la fijación simbiótica de nitrógeno en diferentes ecosistemas, sino también diferentes bondades de las bacterias PGPR que favorecen significativamente la producción de leguminosas y otros cultivos. 13

La caracterización molecular que aparece como tercer capítulo permite determinar la diversidad intra e interespecíficas de cepas bacterianas con énfasis en rhizobios, pero que pueden ser aplicadas o adaptadas a bacterias PGPRs. Estas herramientas moleculares son muy importantes para conocer con qué cepas bacterianas estamos trabajando y poderlas aplicar sin riesgo para el agricultor, el ambiente y el consumidor. Como cuarto capítulo, se muestra la metodología de producción de inoculantes en soportes sólidos a nivel de laboratorio y algunas de las técnicas para evaluar su control de calidad: número de células viables en el soporte, capacidad infectiva y efectiva en el cultivo entre otras. En el quinto, se presentan algunos métodos para la determinación de la actividad microbiana y poblaciones microbianas, como indicadores de la fertilidad del suelo. En el último capítulo se describen las técnicas de análisis de coliformes y Salmonella, las cuales son útiles para determinar el estado sanitario del suelo, residuos orgánicos, compost, bioles, lodos y agua de riego. Es necesario resaltar que el LEMYB Marino Tabusso está realizando investigaciones para validar estos métodos ya que no existen todavía normas estandarizadas en nuestro país y en otros, aún están en proceso de discusión. Esperamos que el contenido de este segundo manual, resultado también de mucha dedicación y de investigación sea útil para diferentes investigadores, profesores, alumnos y todas aquellas personas relacionadas con la agricultura, interesadas en incursionar en el fascinante mundo de las bacterias fijadoras de nitrógeno y otros microorganismos promotores de crecimiento que son clave en el manejo sustentable de los suelos. Finalmente, quiero agradecer a todas las personas del laboratorio que hicieron posible la publicación del presente manual, en especial a Elena Ramos y Minoru Matsubara. Así también al Dr. Juan Sanjuan, coordinador de la Red Biofag (Cyted España) y Dr. Ernesto Ormeño, del Centro de Ciencias Genéricas UNAM (México).

Doris Zúñiga

14

I. AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE RHIZOBIOS

1. R eco lecció n de n o d u lo s 2. A islam ien to de rh izo b io s 3. P ru eb a s de p u re z a 4. A u te n tic a c ió n de las cepas de rh izo b io s 5. C ara c te riz a c ió n fen o típ ica de cepas de rh izo b io s

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RHIZOBIUM, PGPRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD

1.

RECOLECCION DE NODULOS

Esta metodología se realiza de acuerdo al m anual del CIAT (1988).

2.

1.

Con ayuda de una lampa, extraer la planta que presente mejor aspecto. Luego colectar entre 10 y 20 nodulos de la raíz (Figura 1.1).

2.

Colocar los nodulos en frascos con silica gel y algodón para su posterior conservación, asignándoles a cada muestra un código de acuerdo al lugar de muestreo y núm ero de planta. Se recom ienda un tiempo máximo de 3 meses de almacenamiento bajo esta condición.

3.

Posteriormente se trasladan al laboratorio para su tratam iento y procesamiento respectivo.

AISLAMIENTO DE RHIZOBIOS

2.1. Tratamiento de los nodulos *

Seleccionar 3 nodulos de cada frasco con silica gel.

■

Colocarlos en sobres de papel de filtro estéril e hidratarlos en agua destilada tam bién estéril durante 30 m in (en caso que los nodulos estén secos).

■

Desinfectar con alcohol al 70 % por espacio de 1 min en u n recipiente estéril.

*

Trasladar a otro recipiente que contenga lejía (hipoclorito de sodio) al 3 % y dejar reposar durante 3 min (Figura 2.1)

■

Enjuagar con agua destilada estéril durante 6 veces hasta que no se perciba el olor a lejía.

2.2. Aislamiento de rhizobios a partir de nodulos *

Con ayuda de pinzas estériles, abrir los sobres que contienen los nodulos.

■

Colocar los nodulos en placas Petri estériles y con ayuda de una pipeta agregar una gota de agua destilada estéril a cada uno.

■

Con una bagueta proceder a la m aceración del nodulo (es necesario que por cada nodulo se utilice una bagueta).

17

D O RIS ELIZA B ETH Z Ú Ñ IG A DÁ V ILA

■

El macerado se siembra en placas Petri con medio agar levadura manitol con rojo congo (LMA-RC) por estrías paralelas.

■

Incubar las placas a 28 °C por 24 - 72 horas (Rhizobium sp.) o 5 - 7 días (Bradyrhizobium sp.).

*

U na vez observado el crecimiento, se procede a elegir las colonias de los posibles rhizobios teniendo en consideración las características típicas de estos (Tema 5.1). Posteriormente se reaíslan de 2 - 3 veces en placas Petri con LMA-RC hasta obtener colonias aisladas con crecimiento homogéneo.

2.3. Mantenimiento y conservación de rhizobios aislados *

Sembrar a partir de una sola colonia en medio LMA, incubar a 28 °C por 3 - 1 0 días, y luego conservar a 4 °C. Realizar el mismo procedimiento cada 6 meses.

■

Para tener cultivos stocks, hacer crecer las cepas en Caldo Extracto de Levadura - M anitol sin rojo congo (LMC) hasta una población de aproxim adam ente 108 cel/m L.

■

M ezclar 1 mL de este cultivo con 0,5 mL de glicerol al 87 % y guardar a -80 °C.

Desinfección: alcohol al 70 % x 1 min.

Desinfección: hipoclorito de sodio 3 % x 3 min.

I Enjuague: 5 - 6 veces con H20

EfEEEzEE3 Triturado del nodulo y siembra por estría en medio LMA-RC. Incubar a 28 °C por 24 - 72 h ó 5 - 7 días

Reaislamiento del rhizobio en medio LMA-RC. Incubar a 28 °C por 24 - 72 h ó 5 - 7 días T

Conservación de cepas a 4 °C

FIGURA 2.1. Aislamiento de rhizobios a partir de nodulos 18

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RHIZOBIUM, PGPRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD

3.

PRUEBAS DE PUREZA

Las pruebas de pureza siguen la metodología em pleada por el CIAT (1988). 3.1. Crecimiento en agar - levadura - lactosa (LLA) ■ ■ ■ ■

Sembrar los cultivos aislados en placas con LLA por estrías paralelas. Incubar a 28 °C por 2 - 1 0 días (según sea Khizobium sp. o Bradyrhizobium sp). Observar el crecimiento de la bacteria. Adicionar 5 m L del reactivo de Benedict, e incubar a tem peratura ambiente por 10 min .

■

Observar el cambio de coloración, de blanquecino a amarillento (Figura 3.1).

El cambio de color en el reactivo de Benedict a amarillo se debe a la producción de a-cetolactosa, característico del género Agrobacterium y no de rhizobios. 3.2. Crecimiento en agar peptona - glucosa con bromocresol (PG-PBC)

indicador púrpura de

■

Sembrar los cultivos en medio PG-PBC mediante estrías paralelas.

■

Incubar a 28 °C por 2 - 1 0 días (según sea Rdiizobium sp. o Bradyrhizobium sp.).

■

Observar el crecimiento y cambio de coloración (Figura 3.1).

Generalmente los rhizobios no crecen o crecen poco virando ligeramente a amarillo el medio de cultivo. Resultados diferentes a los antes descritos indicarían el crecimiento de un microorganismo contaminante. 3.3. Crecimiento en agar Luria Bertani (LB) ■

Sembrar los cultivos en medio LB mediante estrías paralelas.

■

Incubar a 28 °C por 2-10 días.

Cepas de rhizobios

éEEEEEj

Í5EEEE3

Siembra por estría Medio PG-PBC

Siembra por estría Medio LLA

Siembra por estría Medio LB

Incubar a 28 °C por 2 -10 días

Agregar 5 mL de reactivo de. Benedict e incubar Evaluar crecimiento y viraje de color

Evaluar crecimiento Evaluar crecimiento Rvo. Benedict.

FIGURA 3.1. Pruebas de pureza

19

D O R IS EL IZA B ETH Z Ú Ñ IG A D Á V ILA

■

Observar crecimiento (Figura 3.1).

AI igual que en el medio PG-PBC, en este medio no se observa un buen crecimiento de los rhizobios. Se ha observado excepcionalmente el crecimiento de las cepas de Rhizobium tropici de frijol. 4.

AUTENTICACIÓN DE LAS CEPAS DE RHIZOBIOS

4.1. Desinfección de semillas ■

Escoger las semillas de interés para realizar la autenticación.

■

Desinfectar utilizando hipoclorito de sodio al 2 % durante 5 min (de acuerdo a la sensibilidad de la semilla).

■

Enjuagar con agua destilada estéril varias veces cada 5 min.

■

La hidratación de las semillas se realiza colocándolas en vasos de precipitación con 400 mL de agua destilada estéril. Las semillas grandes (mayor a 1 cm) se dejan hidratar por 3 - 4 h y las semillas pequeñas durante 1 - 2 h.

■

Con ayuda de pinzas estériles se tom an 10 semillas de cada variedad.

■

Colocar en placas Petri con la base recubierta de papel de filtro estéril hum edecido (Figura 4.1).

■

Cubrir las placas con papel para proteger de la luz.

■

Llevar a una estufa a 24 °C por 24 - 72 h. (según el tipo de semilla).

4.2.

Evaluación de la germinación La germinación de las semillas se evalúa cada doce horas, teniendo en consideración los siguientes parámetros: porcentaje de germinación, número de radículas con punta roma, número de radículas con punta fina.

4.3.

Preparación del inoculo *

De las cepas de rhizobios conservadas en refrigeración, tom ar una asada.

■

Sembrar en caldo levadura manitol.

■

Incubar a 28 °C por 2 - 7 días (según la bacteria) con la finalidad de obtener una población de bacterias de 108 U F C /m L .

4.4.

Transplante de semillas a tubos con solución nutritiva ■

Para la autenticación se escogen las semillas que presentaron radículas con punta fina.

■

Las semillas pequeñas germinadas (trébol, alfalfa) se transfieren a tubos de ensayo que contienen material de polipropileno, papel de filtro y aproxim adam ente 10 mL de solución nutritiva (Figura 4.2).

■

Las semillas grandes (pallar, frijol) colocarlas en placas Petri. Con ayuda de un bisturí y pinzas quitar el pericarpio.

■

Luego, transferirlas a tubos grandes con 25 m L de solución nutritiva o a jarras Leonard.

■

Los tubos que contienen las semillas se cubren con un papel en la parte externa inferior para proporcionarle la oscuridad necesaria a la raíz. 30

MANUAL P E MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RHIZOBIUM, PGPRS, INDICADORES P E FERTILIDAD E INOCUIDAD

■

Colocarlos en gradillas y trasladarlos a u n a cám ara de crecimiento, proporcionándoles 12 h de luz blanca y directa (utilizándose dos fluorescentes de 40 watts cada uno) y 12 h de oscuridad, a u n a tem peratura de 1 8 - 2 2 °C.

4 .5 .Inoculación de las plántulas ■

R ealizar la inoculación de las plántulas a los 7 dias.

■

C olocar 1 m L del inoculo bacteriano cerca de la plántula.

■

Regar las plántulas con la solución nutritiva cada 3 o 5 días (si fuera necesario).

■

O bservar la aparición de nodulos, cada 7 días, por cinco sem anas aproxim adam ente.

radícula de cada

L a pru eb a de autenticación confirm a que la colonia aislada de Rhizobium es capaz de n o d u lar (nod +). Desinfección de semillas con hipoclorito de sodio 2 % durante 5 min

1

Enjuagar las semillas con agua destilada estéril cada 5 min ( 5 - 7 veces)

Hidratar las semillas de leguminosa en agua estéril Semilla pequeña: 1.5 - 2 h

Semilla grande: 3 - 4 h

i Colocar las semillas en placas con papel filtro humedecido con agua destilada estéril Semilla grande: 6 mL Semilla pequeña: 2 mL

i Cubrir las semillas en placas y llevarlas a incubar a 24 °C

l Evaluación de la germinación

FIGURA 4.1. Desinfección y germinación de semillas de leguminosas 21

D O RIS ELIZA B ETH ZÚ Ñ IG A DÁVILA

Semillas de leguminosa pre germinadas

Transplante de las sem illas a tubos de ensayo con solución nutritiva

Llevar a cámara de crecimiento de 18 a 22 °C

Inoculo de plántulas a los 7 días con cepas de rhizobios (108 UFC/mL)

Observar la aparición de nodulos cada 7 días por cinco semanas.

FIGURA 4.2. Autenticación

5.

CARACTERIZACION FENOTIPICA DE CEPAS DE RHIZOBIOS

La caracterización fenotípica se realiza en base a los protocolos recomendados por Somasegaran y Hoben (1985), CIAT (1988), M atos et al. (1998) y Hungría et al. (2001). 5.1. Caracterización morfológica de colonias "

Sembrar las cepas en el medio LM A - RC.

■

Incubar a 28 °C por 2 - 1 0 días.

■

M edir diámetro, forma, apariencia y color de la colonia, así como la cantidad, textura y consistencia de la gom a producida.

■

D e acuerdo a las- características evaluadas, las cepas en estudio pueden agruparse en distintos géneros de rhizobios (Tabla 5.1).

5.2. Producción de acidez o alcalinidad en medio LMA con azul de bromotimol (LMA - ABT) al 0.5% ■

Sembrar las cepas de rhizobios en el medio LM A con azul de bromotimol (ABT) al 0.5 %. 22

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RKZOBIUM, PGPRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD

*

Incubar a 28 °C por 2 - 12 días (Figura 5.1).

■

El cambio de color de verde a amarillo o a azul depende del género del rhizobio en estudio (Tabla 5.1).

TABLA 5.1. Características morfológicas de rhizobios en medio LMA (modificado de W ang y M artinez-Romero, 2005). LMA-ABT

TIEMPO

DIÁMETRO

TEXTURA

APARIENCIA

COLOR

GOMA

A z o rh iz o b iu m

2 d ías

> 2 mm

C re m o s o

Translúcidas

B la n co

R e g u la r

B ra d y rh iz o b iu m

5-7 d ía s

< 2 mm

Opacas

B la n co

P oco a re g u la r

(Á lc a li)

M e s o rh iz o b iu m

3-7 d ía s

2 -4 m m

C re m o s o

Semitranslúcidas

B la n co

R e g u la r a

A m a rillo

L ig o so /

Semitranslúcidas u opacas

B la n co

R h iz o b iu m

2-5 d ía s

L ig o so / c re m o so

2 -4 m m

cre m o s o

ó b eige

a b u n d a n te A b u n d a n te

A zu l (Á lc a li) A zu l

(Á cid o ) A m a rillo (Á cid o )

Cultivo de rhizobios de 3 - 1 0 dias

i Sembrar por estría en medio LMA con azul de bromotimol

1

Incubar a 28 °C x 3 -1 2 días

I Evaluar viraje del medio: amarillo: acidez / azul: alcalinidad F IG U R A 5.1. Producción de acidez o alcalinidad

5.3.

Efecto de los agentes físico - químicos sobre el crecimiento de las cepas de rhizobios ■ Para realizar los siguientes ensayos es necesario tener las cepas previamente crecidas en caldo LM C a una población de aproximadamente 106- 108 U F C /m L (cultivos de rhizobios de 3 días ó de bradyrhizobios de 5 días) 23

D O RIS EL IZA B ETH Z Ú Ñ IG A D Á V ILA

■

Luego, tom ar 5 pL con u n pipetor autom ático y colocarlo en la placa con medio LM A a las diferentes condiciones a ensayar (pH, concentraciones de NaCl). En caso de no contar con un pipetor, usar una asada del cultivo líquido y realizar una pequeña estría (Figura 5.2).

■

Cada placa Petri de 1 0 x 9 m m se divide en cuadrantes y sirve para 9 cepas de rhizobios ó 16 de bradyrhizobios. 5.3.1. •

Crecimiento a varios niveles de pH

Sembrar las cepas en medio LM A a diferentes pH (4, 5, 8 y 9).

■ Incubar a 28 °C y evaluar elcrecimiento de las cepas cada 24 o 48 h por 10 días para los rhizobios y 15 días para los bradyrhizobios. 5.3.2.

Crecimiento a diferentes concentraciones de NaCl

■ Sembrar las cepas en medio LM A con diferentes concentraciones de N aCl (0.25, 0.5, 1, 2 % a más). ■ Incubar a 28 °C y evaluar el crecimiento de las cepas en estudio cada 24 o 48 horas por 10 días para Rhizobium y 10 - 15 días para Bradyrhizobium. 5.3.3.

Crecimiento en diferentes temperaturas

* Sembrar las cepas en medio LMA. ■ Incubar a diferentes temperaturas: 8, 28, 37 y 40 °C, y evaluar el crecimiento de las cepas en estudio cada 24 o 48 horas por 10 días para Rhizobium y 15 días para Bradyrhizobium. Luego, a los 15 y 20 días como evaluación final. 5.4. Tolerancia a iones metálicos Cu2+, Zn2+, AP+, Mn2+ ■

Sembrar las cepas en medio LM A con diferentes concentraciones de Cu2+ y Zn2+ (10, 20 y 40 pg/m L); Al3+ (0.625, 1.25 y 2.5 pg/m L) y M n2+ (0.3125, 0.625 y 1.25 pg/m L). Los iones metálicos se obtienen a partir de C uS0 4.5H20 y ZnSO4.7H20, A1C13.6H20 y M n S 0 4.H20.

■

Incubar a 28 °C.

*

Evaluar el crecimiento de las respectivas cepas cada 24 horas por 12 días (Figura 5.3).

24

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RHIZOBIUM, PGPRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD

/ Cultivo de rhizobios de 24 a 48 h

1 Inoculo (5 j jL d e lO 6 UFC/mL)

LMA con diferentes concentraciones de NaCI (0.5, 1 y 2 %)

LMA con diferentes niveles de pH (4, 5, 8, 9)

Incubar a 28 °C x 3 a 15 días

LMA

Incubar a 8, 28, 37 y 40 °C por 3 a 20 días

Reportar el crecimiento: Abundante (++++), bueno (+++), regular (++), escaso (+) y no crecimiento (-).

FIGURA 5.2. Crecimiento en diferentes niveles de NaCI, pH y temperatura

Cultivo de rhizobios de 24 a 48 h

LMA con diferentes LMA con diferentes LMA con diferentes LMA con diferentes concentraciones de concentraciones de concentraciones de Al concentraciones de Zn (40, 20,10 pg/mL) Cu (40, 20, 10 pg/mL) Mn (1.5, 0.625, (2.5, 1.25, 0.625 pg/mL) 0.3125 pg/mL)

Incubar a 28° C x 3 -1 2 días

Reportar el crecimiento: abundante (++++), bueno (+++), regular (++), escaso (+) y no crecimiento (-).

FIGURA 5.3. Tolerancia a metales

25

D O RIS FJ.TZAHETH ZÚ Ñ IG A DÁV tLA

5.5.

Crecimiento en diferentes fuentes de carbohidratos y aminoácidos ■

Inocular una asada del cultivo fresco en el medio base de Bergersen descrito por Somasegaran (1985) con el carbohidrato (1%) o aminoácido (0.1%) en estudio.

■

Incubar a 28 °C por 2 a 10 días (Figura 5.4).

■

Evaluar cambio de color del medio:*Si vira a color amarillo la reacción es positiva (metabolismo del carbohidrato o aminoácido). La turbidez del medio también indica reacción positiva).

Cultivo fresco de rhizobios de 24 a 48 h

i Transferir una asada del cultivo fresco ai medio base con el carbohidrato o aminoácido de interés

i Incubar a 28 °C x 2 a 10 días

i Evaluar viraje del medio:

Amarillo: fermentación del carbohidrato o aminoácido Evaluar crecimiento: Turbidez: crecimiento positivo

FIGURA 5.4. Crecimiento en diferentes fuentes de carbohidratos y aminoácidos

5.6.

Sensibilidad a antibióticos en disco

*

Sembrar las cepas de interés, por duplicado, en medio LMA, esto se puede realizar con la ayuda de una espátula de vidrio o por el m étodo de incorporación. El inoculo de rhizobios es de 106 U F C /m L .

■

Colocar los discos sobre el medio sembrado (de 2 a 4 discos por placa).

*

Los antibióticos pueden ser: rifampicina, penicilina, carbenicilina, sulfatrimetropin, doxiciclina, lincomicina, cloramfenicol, eritromicina, ceñxima, kanamicina, norñoxacina, tetraciclina, estreptomicina (León, 1998). 26

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RHIZOBIUM, PGPRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD

■

Incubar las placas a 28 °C durante 3 a 10 días y evaluar el halo formado alrededor del disco, medir el diámetro del halo en milímetros (Figura 5.5).

Siembra de Rhizobium y Bradyrhizobium en caldo Levadura Manitol

I Incubar a 28 °C por 2 -1 0 días

X

/

Siembra del inoculo (10° cel/ml) en medio LMA

Colocación de discos de antibióticos 4 discos por placa (2 repeticiones)

1 Incubar a 28 °C por 2 - 1 2 días

i Evaluación de la sensibilidad o resistencia de las cepas FIGURA 5.5. Sensibilidad a antibióticos en disco

27

II. AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE BACTERIAS PGPR 6. A islam iento de bacterias prom otoras de crecim iento (PG PR ) 7. Pruebas para bacterias prom otoras de crecimiento.

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RHIZOBIUM, PGPRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD

6.

AISLAMIENTO DE BACTERIAS PROMOTORAS DE CRECIMIEN­ TO (PGPR)

6.1. Procesamiento de las muestras de rizósfera El procesamiento se realiza de acuerdo al Tema 20, con la diferencia de que la muestra es tom ada de la porción de suelo que se encuentra alrededor de las raíces (rizósfera). 6.2. Aislamiento de Bacillus sp. Para este ensayo se aplica la metodología A PH A (1992) y M erck (1994), pue­ de realizarse un pre-tratamiento térmico para eliminar la microflora no deseada, quedándonos únicamente con las esporas bacterianas. El tratam iento térmico consiste en calentar el frasco con la muestra a la dilución (-1) por 30 min en baño m aría a 80 °C. Después del tiempo indicado, se procede a realizar las diluciones de m anera rutinaria. ■

Sembrar en placas Petri 1 m L de las diluciones (-2) hasta (-5) e incorporar agar glucosa triptona extracto de carne (TGE) fundido tem perado a 45 °C, hom ogenizar bien e incubar a 28 °C por 48 h.

■

Seleccionar colonias características de Bacillus y sembrar por estría en una placa con medio TGE. Repetir este procedimiento por aproximadamente 2 veces hasta obtener un cultivo puro.

■

Para confirmar la pureza se debe realizar una tinción Gram. Se debe observar la morfología al microscopio para verificar la presencia de bacilos Gram posi­ tivos.

■

U na vez obtenidos los aislamientos se deben guardar en agar TGE inclinado a 4 °C para su m antenim iento hasta un máximo de 6 meses.

Las colonias del género Bacillus sp. se caracterizan por ser blanquecinas mucosas o secas con bordes irregulares. Algunas colonias van a presentarse más compac­ tas y otras más dispersas dado que el microorganismo es mótil y pueden hallarse colonias muy invasivas. 6.3. Aislamientos de Azotobacter sp. El procesamiento de la muestra se realiza de igual m anera que en el Tema 20 y se realizan diluciones para el aislamiento del microorganismo según Zapater (1975). ■

Colocar 1 mL de las diluciones (-2) hasta (-5) en tubos que contienen medio mineral sin nitrógeno con el indicador azul de bromotimol (ABT) al 0.5% y por triplicado.

■

Incubar a 28 °C por 7 - 1 0 días.

■

Los tubos se reportan como positivos cuando hay viraje de color a amarillo, presencia de turbidez y formación de un velo en la superficie del caldo.

■

Tomar una alícuota de los tubos positivos y estriar en una placa que contiene medio mineral sin nitrógeno.

■

Incubar a 28 °C por 3 - 5 días.

■

Repetir este procedimiento por 2 veces hasta obtener un cultivo puro.

■

Para confirmar la pureza, se debe realizar una tinción G ram y observar la 31

D O RIS ELIZA B ETH ZU N IG A D A V ILA

morfología al microscopio para verificar la presencia de Azotobacter spp. que son gram negativos. ■

U na vez obtenidos los aislamientos se deben guardar en cuñas con medio mineral sin nitrógeno a 4 °C para su mantenimiento hasta un máximo de 6 meses.

En los tubos que contienen el medio sin nitrógeno es muy importante verificar la formación de velos que son estructuras en forma de película o aspecto filamento­ so entrelazados (observar al microscopio para no confundir con micelio de hon­ gos). Además de la formación de turbidez en el medio, los tubos positivos serán aquellos que presenten velo y /o turbidez. Dado que el medio de cultivo no contiene nitrógeno, es bastante selectivo y solo per­ mite que las bacterias que son fijadoras Ubres de nitrógeno puedan crecer. Las colo­ nias de Azotobacter spp. en placa presentan en general una morfología característica, son traslúcidas, de consistencia mucosa, superficie húmeda y poco convexas. 6.4. Aislamiento de actinomicetos Los actinomicetos son un grupo de bacterias filamentosas G ram positivas. Como resultado de un adecuado crecimiento y ramificación, se forma una estructura ramificada de filamentos, denom inada micelio, el mismo que aún siendo de di­ mensiones bacterianas es análogo al micelio que forman los hongos filamentosos. M uchos actinomicetos forman esporas por esta razón. Las colonias son fáciles de reconocer por presentar una forma redondeada a m anera de costra; el color suele ser muy variable: blancas, verdes, rojas, moradas, grises, marrones, entre otros y su aspecto es espolvoreado en la superficie. Adicionalmente las placas que con­ tienen actinomicetos suelen presentar un olor característico a mohoso o a tierra de campos recién arados. Se sigue la metodología del APHA-AWWA-WPCF (1998). *

El procesamiento de la muestra se realiza de igual m anera que en el Tema 20 y se realizan diluciones sucesivas para el crecimiento del microorganismo y su posterior aislamiento.

■

Sembrar por incorporación, lm L de las diluciones (-2) hasta (-5) en placas con medio de almidón-caseína suplementado con fluconazol (al 0.25 % para inhi­ bir el crecimiento de hongos), homogenizar e incubar a 28 °C por 6 - 7días.

■

Seleccionar una colonia característica de Actinomiceto y sembrar por estría en una placa con medio alm idón - caseína. Repetir este procedimiento por 2 veces hasta obtener un cultivo puro.

■

Para confirmar la pureza se debe observar el microscopio las colonias selec­ cionadas y visualizar las estructuras características.

■

U na vez obtenidos los aislamientos se deben guardar en agar triptona glucosa (TGA) inclinado a 4 °C para su mantenimiento hasta un máximo de 6 meses.

7.

PRUEBAS PARA BACTERIAS PROMOTORAS D E CRECIMIENTO

Las siguientes pruebas: producción de ácido indol-acético, solubilización de fos­ fato, antagonismo contra hongos fitopatógenos y ensayos de prom oción de la germinación, son utilizadas para determ inar las capacidades prom otoras de cre­ cimiento (PGPR), que en nuestro caso, se han utilizado de m anera eficiente en Rhizobium, Bacillus y Azotobacter.

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RH1ZOBIUM, PGPRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD

7.1.

Detección de Ácido Indol Acético (AIA)

Se utiliza la metodología para bacterias del grupo de Pseudomonas seguida por N aik y Sakthivel (2005) y m odificada para cepas de Rhizobium y otros m icroorga­ nismos PGPR. ■

Reactivar las cepas en estudio.

■

Sembrar una colonia de cada cepa en tubos con medio líquido específico para cada microorganismo y suplementado con 5 mM de L-triptofano.

■

Incubar aproximadamente por 5 - 7 días a 28 °C.

■

Emplear controles positivos con cepas productoras de AIA y controles nega­ tivos.

Evaluación *

Tomar una alícuota de 100 pL del caldo bacteriano respectivo y adicionar 400 pL del reactivo de Salkowski

*

Homogenizar con cuidado.

■

Incubar en oscuridad por 30 min.

■

Se reporta como positivo si el medio vira de amarillo claro a tonos rojizos (Figura 7.1).

Reactivar las ceDas

Sembrar en un tubo con medio apropiado + 5 mM L- triptófano Incubar a 28 °C por 5 días y tom ar 100 jjL del cultivo

Agregar 400 pL reactivo Salkowski,

del

Incubar en oscuridad y observar cambio de coloración

FIGURA 7.1. Método de detección del ácido indol acético 33

D O RIS ELIZA B ETH Z Ú Ñ IG A DÁ V ILA

7.2.

Detección de bacterias solubilizadoras de fosfato

La metodología de solubilizadores de fosfatos se tom ó en base al protocolo utili­ zado por Nautiyal (1999). ■

Reactivar las cepas en estudio.

■

Sembrar por estría en el medio de cultivo National Botanical Research Institute’s phosphate growth médium (NBRIP) con fosfato bicalcico o tricalcico.

■

Incubar las placas por 5 - 1 5 días a 28 °C

Evaluación ■

Se tom arán como positivas las cepas que crezcan en el medio de cultivo y muestren presencia de un halo transparente alrededor de la estría (Figura 7.2).

Cultivo en estudio

i Sembrar la cepa con una estría en el medio para solubilizadores de fosfatos

1

Observar crecimiento de la cepa y formación de halo alrededor.

FIGURA 7.2. Método de detección de bacteria solubilizadoras de fosfato

7.3.

Prueba de antagonismo contra hongos fítopatógenos

Esta metodología puede ser adaptada a las bacterias que se deseen probar, los ensayos se realizan de acuerdo a A hm ed et al. (2005). * ■

Reactivar las cepas de bacterias que se van a utilizar. Dividir una placa con agar papa dextrosa (PDA) en un máxim o de 4 cuadran­ tes m arcando el punto central de la placa y una línea equidistante del centro en cada cuadrante.

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RJHIZOBIUM, PGFRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD

■

En cada una de las líneas se sembrarán las diferentes cepas a probar y se incubarán a 28 °C hasta obtener su crecimiento (puede variar según él genero de bacteria a utilizar).

■

Simultáneamente se hará crecer en una placa con medio PDA el hongo fitopatógeno hasta obtener un crecimiento del micelio que llegue a cubrir toda la placa.

■

Con un sacabocado de 1 cm. de diámetro retirar una porción del micelio del hongo ya crecido y colocarla boca abajo en el centro de la placa que contiene las bacterias.

■

Se debe utilizar una placa control donde solo se sembrará el hongo sin bac­ teria y placas donde se prueben cepas como controles positivos y negativos. Todo el ensayo se realiza por duplicado.

■

Incubar a la tem peratura óptima del hongo.

■

Evaluar si hay inhibición del crecimiento del hongo por las bacterias después de que la placa control haya completado su crecimiento (Figura 7.3).

■

M edir las áreas de inhibición alrededor de cada cepa bacteriana.

Micelio del hongo en placa de PDA

Reportar como cepas positivas aquellas que presenten un halo evidente alrededor de la bacteria

Placa control con micelio del hongo.

FIGURA 7.3. Prueba de antagonismo contra hongos fitopatógenos 35

1

D O RIS ELIZA B ETH Z Ú Ñ IG A D Á V ILA

7.4. Efecto de la inoculación con PGPRs en la germinación de diferentes cul­ tivos. Desinfección de semillas e inoculación •

Se utilizan semillas de diferentes cultivos a las que se les hace una prueba de germinación previa.

■

Las semillas se desinfectan en alcohol de 96 ° por 2 - 5 minutos dependiendo del tam año (Figura 4.1).

■

Se enjuagan con agua destilada estéril hasta eliminar los residuos de alcohol.

■

Se procede a embeber las semillas con los inóculos que contenga una pobla­ ción bacteriana de 106 cel/m L.

■

El tiempo de inhibición va a depender de cada tipo de semilla por ejemplo para tom ate se inbebe por dos horas y para frijol por tres.

■

Con ayuda de pinzas estériles se tom an 20 semillas y se colocan en placas Petri de 18 x 140 m m con papel filtro y papel toalla, esterilizados. La cantidad de semillas por placa depende del tam año de la semilla.

■

U na vez colocadas las semillas en la placa asegurarse que el papel este hú­ medo, para eso se puede adicionar con pipeta agua destilada estéril sobre el papel.

■

El número de repeticiones recomendadas es de 4 placas por tratamiento.

■

Es im portante tener un control solo con agua destilada estéril y otro con el medio de cultivo sin bacteria.

■

Las placas se envuelven en papel y se colocan en una cám ara temperada, la tem peratura adecuada va a depender de los requerimientos fisiológicos de cada semilla.

Evaluación de la germinación La germinación de semillas se evalúa cada 24 horas por un periodo determinado de germinación para cada tipo de semilla, teniendo en cuenta el porcentaje de germinación y la forma y tam año de la radícula. Se siguió la metodología de M ishra (1998).

36

III. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR E INTERPRETACIÓN DE DATOS MEDIANTE AMPLIFICACIÓN BOX - PCR 8.

N o ta s generales p a ra h a c e r P C R

9.

E x trac ció n de A D N p o r lisis alcalin a

10. V erificación de la ca lid ad del A D N extraído (co n tro l de calidad) 11. A m p lificació n B O X - P C R 12. A g ru p a m ie n to de perfiles B O X - P C R sem ejantes 13. A m p lificació n del gen rib o so m al 16s 14. P u rificació n del p ro d u c to de P C R 15. S ecu en ciam ien to 16. E la b o ra c ió n de árboles filogenéticos

INTRODUCCIÓN Los microorganismos del suelo presentan un rol relevante para el m antenim ien­ to de la vida, la fertilidad, la calidad y el equilibrio en el ecosistema. Estudiar su diversidad resulta importante, porque estos microorganismos forman parte de comunidades muy complejas y dinámicas conformadas por numerosas especies. Para entender la función e interacción de cada uno de los miembros que confor­ m an estas comunidades en los nichos específicos es esencial la identificación de los mismos. La técnica de reacción de la cadena polimerasa dirigida a rDNA 16s ha sido uti­ lizada ampliamente en el estudio de la diversidad en procariotas. El m étodo de rep-PCR es utilizado en bacterias y proporciona un fingerprint de la estructura cromosómica, la cual es considerada variable entre cepas y por comparación, se pueden detectar diferencias a nivel intra e interespecíficas.

8. NOTAS GENERALES PARA HACER PCR 1. Trabajar siempre en un lugar limpio y de preferencia con guantes. Cualquier contam inante puede ser una fuente de ADN. 2. Usar puntas (tips) nuevas y estériles. 3. Cambiar de punta siempre que se vaya a agregar el siguiente reactivo. 4. Los volúmenes de los reactivos para las reacciones de P C R dependen de las concentraciones de las soluciones stocks disponibles. De m anera que siempre se m antengan las concentraciones especificadas en las condiciones de amplifi­ cación. 5. Incluir siempre un control positivo con un A D N en buen estado y un control negativo sin ADN. 6. Usar agua de grado molecular autoclavada tres veces y dispensadas en alícuo­ tas de 1.5 mL en tubos eppendorf. 7. Cuando se preparan las mezclas para PCR, m antener todos los reactivos, in­ cluyendo las muestras, en hielo picado. G uardar los reactivos a -20 °C lo más rápido posible después de utilizarlos. 8. Si se tienen dos tampones de PCR [KC1 y S 0 4(NH4)2]. Usar por defecto en reacciones rutinarias el que trae KC1. El otro se usa para amplificaciones que empleen mayores concentraciones de MgClr 9. Seguir el siguiente orden al m om ento de agregar los reactivos a los tubos para hacer PCR: a. Agua milli-Q. Agua desionizada ultra pura. b. Buffer KC1. Otorga las condiciones óptimas para la actividad de la Taq A D N polimerasa.

39

D O RIS EL IZA B ETH Z Ú Ñ IG A D Á V ILA

c. MgCl,. Influye en la fuerza de la interacción entre los primers y el A D N molde. d. Dimetil sulfóxido (DMSO) -si es que es necesario-. Inhibe la formación de estructuras secundarias en el A D N molde o primers. e. Desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs). Son las bases de nucleótidos que la Taq A D N polimerasa utiliza para la extensión de las cadenas de ADN. f. M uestra g. Primer(s). Fragmentos cortos de una cadena simple de A D N (15-30 nucleó­ tidos) que son complementarios a las secuencias que flanquean la región de A D N de interés. El propósito de los primers PCR es proveer un grupo libre 3’-OH para que la A D N polimerasa pueda añadir dNTPs. h. Taq A D N polimerasa. Aislada de la bacteria Thermus aquaticus. Puede sinteti­ zar A D N de m anera eficiente bajo condiciones de calor intenso. 10. Cuando se trabajen más de 3 muestras, es posible realizar una sola mezcla de reacción. Se multiplican todos los volúmenes de los reactivos listados en el punto anterior, por el núm ero de muestras que se vayan a ensayar, más una adicional. Luego de repartir la mezcla en los tubos para PCR, se agrega la muestra respectiva. 11. Después de adicionar todos los reactivos necesarios y la muestra en el tubo, se dan unos ligeros golpes al tubo para homogeneizar la mezcla de reacción, evitar formar burbujas y centrifugar por 15 segundos a 13000 rpm. Finalmente colocar los tubos en el termociclador. 9. EXTRACCIÓN DE A D N POR LISIS ALCALINA El aislamiento del A D N genómico se basa en su liberación a través de lisis celular y el aislamiento de proteínas, polisacáridos y lípidos. El método se desarrolla se­ gún lo establecido por Herrera-Cervera et al. (1999) y modificado por M atsubara (2010). (Método para lisis de bradyrhizobios). A . Materiales y equipos Cultivo microbiano de la noche anterior, crecido en caldo Triptona - Extracto de levadura (TY) ■

M icrocentrífuga a 12000 rpm

■

Refrigeradora a 4 °C

■

Baño de agua a 80 °C

■

Baño de agua a 37 °C

■

Vortex

■

N aO H 0.05 M

■

Dodecil sulfato de sodio (SDS) 0.25 %

■

2 (iL, 1 - 10 pL, 10 -100 pL y de 100 - 1000 pL

■

Tips de 10 pL, 100 pL y 1000 pL (estériles y de prim er uso)

■

Microtubos de 2 mL

40

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RHIZOBIUM, PGPRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD

B. Procedimiento 1.

Tomar con un palillo estéril masa bacteriana “fresca” crecida en placa.

2.

Resuspender los microorganismos en un microtubo conteniendo 20 pL de una solución NaO H 0.05 M y SDS 0.25 %. Hom ogeneizar haciendo uso de un vortex.

3.

Colocar en baño de agua a 80 °C por 15 min.

4.

Colocar en baño de hielo por 10 min y homogeneizar con vortex.

5.

Agregar 200 pL de agua milli-Q estéril. Homogeneizar.

6.

Centrifugar 5 min a 12000 revoluciones por minuto (rpm).

7.

Trasvasar el sobrenadante a un microtubo limpio y conservar a 4 °C.

10.

VERIFICACIÓN DE LA CALIDAD DE A D N EXTRAÍDO (CONTROL DE CALIDAD)

A . Materiales y equipos ■

Balanza digital de 200 g de capacidad

■

Horno microondas

■

Probetas de 100 y 1000 mL

■

Micropipetas de 0.1 - 2 pL y 1 - 10 pL

■

Tips de 10 pL

■

Cámaras electroforéticas con bandejas para gel de agarosa de 15 x 10 cm

■

Fuente de poder de voltaje y tiempo regulable

■

Transluminador de luz UV

■

Cám ara digital

■

Buffer de carga (6X D N A Loading dye, Fermentas Inc. USA)

■

M arcador molecular Lam bda A D N 500 pg, Fermentas Inc. USA

-

Buffer tris-borato-EDTA (TBE) IX

*

Agarosa

■

Solución acuosa de bromuro de etidio (0.5 pg/m L)

■

Agua destilada

B. Procedimiento B .l Preparación del gel de agarosa 1% 1.

Pesar 0.75 g de agarosa y mezclar con agua destilada (c.s.p. 75 mL).

2.

Licuar el horno m icroondas hasta la completa disolución de los cristales de agarosa.

3.

Temperar a 50 °C y vertir en una bandeja electroforética de 15 x 10 cm, pre­ viamente nivelada.

4.

Colocar el peine que marca los pocilios de la bandeja.

5.

Dejar solidificar, evitando la formación de burbujas.

6.

Retirar las paredes de goma de la bandeja del gel y el peine, teniendo cuidado de no dañar los pocilios de vertido de la muestra. 41

3 Q R IS ELIZA B ETH ZÚK 1G A D Á V ILA

B.2 Corrida electroforética de las muestras 7.

Transferir la bandeja con el gel a la cámara de electroforesis.

8.

La cámara de electroforesis es cargada con buffer TBE IX, hasta cubrir los pocilios de muestra.

9.

M ezclar 1 pL de buffer de carga con 5 pL de la muestra.

10. M ezclar 1 pL del m arcador molecular con 1 pL de buffer de carga y 4 pL de agua milli-Q. 11. Cargar las mezclas realizadas con una micropipeta de 1 - 10 pL, dispensando cada muestra en un pocilio del gel. 12. Cerrar la cámara de electroforesis y conectar los cables en sus electrodos co­ rrespondientes. 13. Se programa la fuente de poder a 80 V por 60 min. 14. Iniciar la corrida. B.3 Tinción del gel 15. Concluido el tiempo de corrida, trasladar cuidadosamente el gel a una ban­ deja de solución acuosa de bromuro de etidio (0.5 pg/m L), dejando reposar durante 15 min. 16. Trasladar el gel de agarosa a la bandeja con agua destilada y dejar reposar durante 10 min para su lavado. 17. Colocar el gel sobre el translum inador y encender la luz UV. 18. El gel revelado es observado a través el fotodocumentador. 11.

AMPLIFICACIÓN BOX - PCR

A . Materiales y equipos *

Termociclador

■

Micropipetas de 0.1 - 2 pL, 1 - 10 pL, 10 - 100 pL y de 100 - 1000 pL

■

Tips de 10 pL, 100 pL y 1000 pL (estériles y de prim er uso)

■

M icrotubos de 1.5 mL

■

Tubos para PCR de 0.2 mL (estériles y de prim er uso)

■

Buffer de carga (6X DN A Loading dye, Fermentas)

■

Primer BOX A IR (5’ - CTA CG G CA A G G CG A CG CTG A CG - 3’) 10 pm ol/ mL

■

Buffer Taq KC1 10X

•

Dimetil sulfóxido (DMSO) 100%

■

MgC12 25 mM

■

dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP 10 m M cada uno)

■

Taq A D N polimerasa 5U /pL

■

Agua milli-Q

42

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RHIZOBIUM, PGPRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD

B. Procedimiento B. 1 Mezcla de Reacción 1.

Se realiza un master mix, multiplicando todos los volúmenes requeridos (Ta­ bla 11.1) por el núm ero de muestras a ensayar más una adicional.

2.

Dispensar la mezcla obtenida en cada uno de los tubos de PCR.

3.

Se procede a colocar el volumen respectivo de A D N y agua milli-Q (c.s.p. 25 pL de reacción).

NOTA: La cantidad de A D N depende de la concentración del mismo en el eluente de extracción, el cual se evalúa previamente en la verificación del ADN.

TABLA 11.1. Mezcla para reacciones de amplificación BOX-PCR Reactivos

Buffer KC1 (X) MgCl2 (mM) DMSO (%) dNTPs (mM) Primer BOX AIR (pmol/mL) Taq ADN Polimerasa (U/pL) ADN (pL) Agua milli-Q (pL)

Concentración Concentración

Volumen

Inicial

Final

(25 pL)

10 25 100 25 10 5

1,00 7,50 10,00 1,25 0,80 0,08

2,50 7,50 2,50 1,25 2,00 0,40 5 -8 c.s.p. 25,00

B.2 Reacción de amplificación BOX-PCR 4. Introducir los tubos para PCR en el termociclador, previamente programado para la reacción de amplificación BOX (Versalovic et al., 1991). 5. El perfil de temperaturas para el termociclador se muestra en la Tabla 11.2. TABLA 11.2. Perfil de temperaturas para las reacciones de amplificación BOX-PCR Desnaturalización inicial 25 ciclos

95 °C por 3 min desnaturalización

93 °C por 45 segundos

annealing

53 °C por 1 min

extensión

65 °C por 8 min

Extensión final

65 °C por 16 min

43

DORJS EL IZ A B E TH Z Ú Ñ IG A DÁVILA

B.3 Comprobación de la amplificación por electroforesis Materiales ■

y

equipos

Balanza digital de 200 g de capacidad

■

Probetas de 100 y 1000 mL

■

M icropipetas d e 0 . 1 - 2 p L y l - 1 0 p L

■

Tips de 10 pL

*

Cám aras electroforéticas con bandejas para gel de agarosa de 15 x 15 cm

■

Fuente de poder de voltaje y tiempo regulable

■

Translum inador de luz UV

■

Cám ara digital

■

Buffer de carga (6X D N A Loading dye, Fermentas)

■

M arcador m olecular Gene Ruler 1 kb A D N Ladder Plus (Fermentas Inc., USA)

■

Buffer TBE IX

■

Agarosa

■

Solución acuosa de bromuro de etidio (0.5 pg/m L)

■

Agua destilada

■

Agua milli-Q

Procedimiento 1. Preparar agarosa al 1.5 % en buffer TBE IX y vertir en una bandeja electroforética para gel de 15 x 15 cm. 2. Introducir el gel dentro de la cámara de electroforesis conteniendo la misma solución buffer. 3. M ezclar 1 pL del buffer de carga con 5 pL del amplificado. 4. M ezclar 1 pL del m arcador Gene Ruler 1 kb A D N Ladder Plus con 1 pL de buffer de carga y 4 pL de agua milli-Q. 5. Se carga cada uno de los pocilios con los amplificados, colocando los marca­ dores moleculares a los extremos del gel. 6. Se cierra la cámara de electroforesis y se conectan los cables en sus electrodos correspondientes. 7. Las muestras son corridas a 80 V por 180 min. 8. El gel es revelado y observado a través del fotodocumentador.

44

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RHIZOBIUM, PGPRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD

12.

AGRUPAMIENTO DE PERFILES BOX-PCR SEMEJANTES

A . Materiales -

Fotografías de los geles electroforéticos revelados con los productos de ampli­ ficación BOX-PCR

-

Software de edición fotográfica.

B. Procedimiento 1. Alinear las imágenes de los geles en función a los marcadores de peso molecular. 2. Com parar los perfiles BOX de cada una de las cepas ensayadas, buscando bandas en com ún que muestren un mismo peso molecular. 3. Form ar agrupamientos de alta similitud, de m anera que los patrones de los diferentes grupos obtenidos se diferencien unos de otros. 4. Para hacer comparaciones entre geles, se alinean las bandas de los marcadores con un mismo peso molecular Extracción del ADN bacteriano

1 Verificación de la calidad de ADN extraído

1

Am plificación BOX - PCR Prim er BOX A1R (5’-CTA CGG CAA GGC GAC GCT GAC G-3')

Gel de Agarosa al 1.5 %

Com probación de la am plificación por electroforesis Revelado con Bromuro^de etidio, 0.5 pg/mL

1

Exposición al translum inador y tom as fotográficas Agrupam iento de perfiles sim ilares

FIGURA 9. Caracterización molecular de cepas bacterianas 45

D O RIS EL IZ A B E TH Z Ú Ñ IG A DÁVILA

13.

AMPLIFICACIÓN DEL GEN RIBOSOMAL 16s

La reacción de amplificación del gen ribosomal 16s se realiza con el fm de secuenciarlo y determ inar la identidad de las cepas ensayadas. A. Materiales y equipos ■

Termociclador Eppendorf

■

M icropipetas de 0.1 - 2 pL, 1 -1 0 pL, 10 -100 pL y de 100 - 1000 pL

■

Tips de 10 pL, 100 pL y 1000 pL (estériles y de prim er uso)

■

M icrotubos de 1.5 mL

■

Tubos para PCR de 0.2 mL (estériles y de primer uso)

■

Buffer de carga (6X A D N Loading dye, Fermentas)

■

Primers:

■

fD 1: 5’ - CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG - 3’

■

rD l:

5’ - CCCGG GATCCAAGCTTAAG GAGG TGATCCAGCC - 3’

-

Buffer Taq KC110X

-

M gCl2 25 mM

■

dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP 10 m M cada uno)

■

Taq A D N polimerasa 5U /pL

■

Agua milli-Q

B. Procedimiento B .l Mezcla de Reacción 1.

Rotular debidamente los tubos de PCR.

2.

Preparar una mezcla de reacción de 25 pL para cada una de las muestras a ensayar. E n la Tabla 13.1 se detalla la formulación de la misma. TABLA 13.1 Mezcla para reacciones de amplificación 16S

Reactivos

Concentración

Concentración

Volumen

Inicial

Final

(25 pL)

10 25 10 10 10 5

1,00 1,50 0,50 0,50 0.50 0.50

2,50 1,50 0,20 0,20 0,20 0,10 5 c.s.p. 25,00

Buffer KC1(X) MgCl2 (mM) dNTPs (mM) Primer fDl (pmol/mL) Primer rDl (pmol/mL) Taq ADN Polimerasa (U/pL) ADN (pL) Agua milli-Q (pL) B. 2 Reacción de amplificación 3.

Introducir los tubos para PC R en el termociclador previamente programado para la reacción de amplificación del gen ribosomal 16s. 46

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RHIZOBIUM, PGPRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD

4. El perfil de temperaturas para el termociclador se muestra en la Tabla 13.2. TABLA 13.2 Perfil de temperaturas para las reacciones de amplificación del gen ribosomal 16s Desnaturalización inicial 30 ciclos

93 °C por 2 min desnaturalización

93 °C por 45 segundos

annealing

62 °C por 45 segundos

extensión

72 °C por 2 min.

Extensión final

72 °C por 5 min.

B.3 Comprobación de la amplificación por electroforesis Materiales y equipos * Lo requerido en la sección 11 - B.3, con la siguiente variante en la bandeja de electroforesis y m arcador molecular: ■ Cámaras electroforéticas con bandejas para gel de agarosa de 15 x 10 cm ■ M arcador m olecular Ladder A D N m arker (300 - 10000 pb), Fermentas Inc. USA Procedimiento 1. Preparar un gel de agarosa al 1 % en buffer TBE IX, en una bandeja electroforética para gel de 15 x 10 cm. Colocar el peine y dejar solidificar. 2. Proceder como lo señalado en el Tema 11, B.3 3. M ezclar 1 pL del m arcador molecular con 1 pL de buffer de carga y 4 pL de agua milli-Q. 4. Cargar las muestras en los pocilios del gel y los marcadores moleculares a los extremos del gel. 5. Cerrar la cámara de electroforesis y conectar los cables en sus electrodos co­ rrespondientes. 6. Correr las muestras a 60 V por 150 m in aproximadamente o hasta que la ban­ da más oscura del buffer alcance la m itad del largo del gel. 7. Revelar el gel con bromuro de etidio, enjuagarlo y observarlo a través del trasluminador. 14. PURIFICACIÓN DEL PRODUCTO DE PCR Puede hacerse uso de kits comerciales de purificación de productos de PCR, los cuales se basan en el empleo de columnas que contienen resinas con alta selectivi­ dad y recuperación de fragmentos de ADN. Remueve los primers no constituidos (< 50 nucleótidos), enzimas y mononucleótidos o sin marcar. 15. SECUENCIAMIENTO Para la identificación por secuenciamiento del gen ribosomal 16s, las muestras son enviadas a un laboratorio especializado en dichos servicios. En la Figura 15.1 se muestra un cromatograma proporcionado como resultado del secuenciamiento. 47

DO RIS ELIZA B ETH Z Ú Ñ IG A DÁ V ILA

190 170 180 G C T T G 7 T T G .... CC GC. T G G T i C . . . C . . T . ' . . . ■

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10 290 300 G G ..G G G T G T C G G C C »CACT 3G G

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32 CTG . G ..C

330

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L J s lM ¿ u ^ h 420

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M

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440

430

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I ^

M

FIGURA 15.1. Sección de nucleótidos proporcionados por un cromatograma Tras el envío de las secuencias, se procede de la m anera siguiente: Se adquiere un banco de secuencias de las posibles especies a la que pertenece el microorganismo en cuestión: “N ational Center for Biotechnology Inform ation” (http://w w w .ncbi.nlm .nih.gov/). Lim piar y unir las secuencias dadas por cada Prim er (fD l y rD l), empleando los programas BioEdit versión 7.0.5.3 y Chromas Lite versión 2.01, así como el banco de secuencias. Los programas BioEdit y Chromas Lite son utilizados para alinear las secuen­ cias de las muestras con secuencias de especies ya conocidas y detectar posibles errores en el cromatograma (Figuras 15.2 a 15.4), ya que muchas veces este tiene bases solapadas o extras y la corrección ayuda a la definición de las posibles espe­ cies con mayor afinidad.

FIGURA 15.2 Secuencias del banco de genes (genebank, NCBI) y cepa en estudio. Tras la obten­ ción de secuencias similares a las secuencias en estudio por medio de la NCBI, se procede a limpiar las secuencias por medio de los programas BioEdit (arriba) y CHROMAS Lite (abajo), el primero se emplea para comparar la semejanza entre las bases de la secuencia de la muestra con las secuen­ cia extraídas de la NCBI y el segundo para corroborar esta información con el cromatograma, ya que en este se pueden observar los posibles errores de secuenciamiento. 48

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RHIZOBIUM, PGPRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD

FIGURA 15.3 Aplicación de ClustalW para la alineación de secuencias. La aplicación ClustalW permite alinear todas las secuencias en el archivo, permitiendo así la comparación entre estas.

FIGURA 15.4 Secuencias alineadas para la corrección de posibles errores. El programa CHROMAS, es determinante al momento de realizar las correcciones necesarias, ya que el cromatograma permite determinar si la diferencia en una base es real o si existe un error en la lectura de este.

49

D O RIS ELIZA B ETH Z Ú Ñ IG A D Á V ILA

16. ELABORACIÓN DE ÁRBOLES FILOGENÉTICOS 1. Se obtienen los datos de las secuencias del gen ribosomal 16s de distintas ce­ pas patrón del género en estudio. 2. Las secuencias obtenidas son alineadas con las secuencias limpias de las muestras. La aplicación ClustalW Múltiple Alignment del program a BioEdit (Figura 16.1) es un sistema empleado para alinear secuencias homologas de nucleótidos. Para la alineación de múltiples secuencias, ClustalW utiliza mé­ todos de alineación progresiva, donde las secuencias más parecidas se alinean primero y luego los grupos de secuencias cada vez más distantes hasta obtener una alineación global. 3. Alineadas las secuencias, se cortan los extremos para que todas las secuencias tengan la misma longitud. 4. Posteriormente se emplea el program a M E G A versión 4, en la opción “Phylogeny” se selecciona el m étodo estadístico “N EIG H B O R JO IN IN G ”, el cual es empleado en estudios de evolución basados en técnicas moleculares. Este tiene la capacidad de m anejar un amplio conjunto de datos, por lo que es uno de los pocos métodos que permite la rápida inclusión de todas las secuencias homologas en un solo árbol. En resumen este m étodo utiliza una matriz de distancias, la cual va agrupando en parejas según la divergencia promedio hasta llegar a una base. 5. Para evaluar la fidelidad del árbol filogenético construido, se emplea el test de filogenias inferidas “bootstrap” , el cual crea un núm ero arbitrario de posi­ bles dendogramas por medio de cambios puntuales en diferentes bases de las secuencias y elige uno de consenso, así, en cada divergencia se muestra un porcentaje el cual representa el núm ero de ramas que se han repetido del total de árboles creados.

FIGURA 16.1 Alineación de cepas de referencia y cepas en estudio para la creación del dendograma. Se empleó nuevamente el programa BioEdit para la alineación de todas las secuencias en estu­ dio corregidas y las secuencias de cepas tipo o de referencia para la construcción del dendograma.

50

IV. PRODUCCIÓN Y CONTROL DE CALIDAD DE BIOFERTILIZANTES

17.

P ro d u c c ió n de b iofertilizantes

18.

C o n tro l de ca lid ad del b io fertilizan te

19.

E n u m e ra c ió n de bacterias sim bióticas fijadoras de n itró g en o p o r n ú m e ro m ás probable

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RHIZOBIUM, PGPRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD

17. PRODUCCION DE BIOFERTILIZANTES De acuerdo a las necesidades, se pueden producir inoculantes líquidos o en so­ portes sólidos. Estos soportes pueden ser o no esterilizados. El LEMYB M arino Tabusso produce inoculantes en soportes sólidos según Orm eño y Zúñiga (1999a) y recientemente inoculantes líquidos. La producción del inoculante sólido consta de dos partes, la prim era incluye el incremento de biom asa celular del rhizobio en un medio líquido de bajo costo (Ormeño y Zúñiga, 1998) y la segunda incluye la preparación del soporte sólido y la respectiva incorporación de la población bacteriana en este. 17.1. Producción de biomasa del rhizobio ■

Reactivar la cepa correspondiente en el medio LMA

■

Sembrar 2 asadas en 100 m L de caldo LM A e incubar en agitación a 100 rpm a 28 °C por 24 a 48 h (cepa rápida) o 72 - 98 h (cepa lenta). Debe alcanzar una concentración de 108 cel/m L aproximadamente (fase logarítmica).

■

Tomar 1 - 5 mL del caldo anterior y sembrar en matraces de 1000 o 5000 mL conteniendo el medio modificado según Orm eño y Zúñiga (1998) e incubar de la misma m anera que el paso anterior.

■

Com probar la pureza de la cepa (observación al microscopio) y concentra­ ción de las células por densidad óptica o núm ero de células viables (Figura 17.1).

17.2. Preparación del soporte sólido ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■

Secar el sustrato (suelo, compost, entre otros) a 60°C por 24 horas. Tam izar el sustrato en malla de 2.25 mm. M ezclar los sustratos en la proporción 2:3 (compost: suelo) y homogenizar. Colocar 250 g de la mezcla en bolsas de polietileno. Esterilizar tres veces consecutivas la bolsa con el soporte a 121°C y 15 Ib de presión por 30 m in (modificado de Orm eño y Zúñiga (1999a). Inocular el sustrato con el cultivo líquido de rhizobios (106 - 109 cel/m L). Incubar a 28°C por 6 - 8 días. Usar inm ediatam ente o refrigerar hasta su uso (4 - 8°C) (Figura 17.1).

Cantidad de inoculante 250 g

Cantidad de semilla 35 kg (semilla mediana: frijol)

53

Diluyente (agua) 600 mL

D O R IS E L IZ A B E TH ZÚ Ñ 1G A D Á V ILA

Cepa de Rhizobium

I

Siem bra en m edio líquido

Siem bra en m ayor volum en Em pacado en bolsas de 250 g

Esterilizar a 121° C x 30 min por dos días

108- 109 cei/mL, agitación

I M aduración a 28 °C por 7 días

I Alm acenam iento a 4o C por 3 a 6 m eses

agitación

FIGURA 17.1. Producción de biofertilizantes

54

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RHIZOBIUM, PGPRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD

17.3

Presentación del biofertilizante

17.3.1. Preparación de la ficha técnica Deben considerarse los siguientes puntos para la presentación del fertilizante 1. Nom bre del producto: ECORIZO, inoculante para leguminosas de grano 2. Bondades: Las bacterias simbióticas fijadoras de nitrógeno interaccionan con diversas leguminosas formando nodulos en las raíces y que son capaces de transform ar el nitrógeno atmosférico en amonio. Este nutriente es asimilado directamente por la planta favoreciendo su crecimiento, rendimiento y cali­ dad de grano. Este inoculante disminuye los costos de producción, porque reemplaza el uso de fertilizantes químicos y disminuye la contam inación del ambiente. 3. Nom bre del cultivo sobre el cual puede aplicarse el producto: En este caso los inoculantes son específicos para cada cultivo, por ejemplo: cultivo de pallar, cultivo de frijol, cultivo de arveja holantao, cultivo de haba, cultivo de soya. 4. Lugar: Los inoculantes pueden ser específicos dependiendo de la zona de cul­ tivo, así, pueden haber inoculantes específicos para el cultivo de pallar en la región de lea y otros para la región de Barranca; de m anera similar existen cepas para frijol en zonas de costa que difieren de zonas altoandinas. 5. Presentación: inoculantes en soporte sólido de 250 g y líquidos de 40 mL con una concentración de 108 células/g ó 108 células/m L respectivamente. 17.3.2. Etiquetado Debe m encionar el lote, fecha de producción y fecha de vencimiento

E C O R IZ O - I n o c u la n te s s a lu d a b le s p a r a c u ltiv o s L a b o r a to r io d e E c o lo g ía M ic r o b ia n a y B io te c n o lo g ía M a r in o T a b u s s o - U N A L M I N O C U L A N T E P A R A A R V E JA H O L A N T A O

^ .

¿ í'

P r e s e n ta c ió n

F r a s c o x 4 0 m L , r in d e p a r a 3 0 k g d e s e m illa

C o n c e n tr a c ió n d e r h iz o b io s

10s c el/ m L

A p lic a c ió n

M e z c la r u n if o r m e m e n te el in o c u la n te c o n 2 0 0 g d e s u e lo y la s e m i­ lla. D e ja r s e c a r p o r 30 m in u to s b a jo la s o m b r a . S e m b ra r. C o n s e r v a r e n re fr ig e r a c ió n h a s ta s u u s o . N o e x p o n e r las s e m illa s

P r e c a u c io n e s

tr a ta d a s al s o l n i a v ie n to s d e s e c a n te s . U tiliz a r t o d o el p r o d u c to e n el m o m e n to . U s a r g u a n te s p a r a la a p lic a c ió n .

L o te

003

F e c h a d e P r o d u c c ió n

1 5 -0 1 -2 0 1 2

F e c h a d e V e n c im ie n to

1 5 -0 3 -2 0 1 2

DO RIS EL IZ A B E TH Z Ú Ñ IG A D Á V ILA

18. CONTROL D E CALIDAD DEL BIOFERTILIZANTE 18.1 Recuento de células viables de bacterias fijadoras de nitrógeno Se utilizó la metodología según Ormeño y Zúñiga (1999b). ■

Suspender 10 g del inoculante en un m atraz conteniendo 90 m L de diluyente: solución salina al 0.85% (dilución I d 1). Agitar vigorosamente por dos m inu­ tos.

■

Con una pipeta estéril tom ar una alícuota de 1 mL de la suspensión anterior y transferir a un tubo con 9 m L del diluyente (dilución 10'2). Realizar diluciones sucesivas, hasta llegar a la dilución 10'8 (Figura 18.1).

■

Transferir a placas Petri, por duplicado, alícuotas de 1 mL de cada una de las diluciones realizadas. Incorporar el medio de cultivo LM A temperado. Dejar solidificar.

*

Incubar las placas a 28 °C por 2-10 días.

■

Transcurrido el tiempo de incubación, realizar el conteo de colonias en pla­ cas que contengan entre 30 y 300 colonias

Esta técnica puede utilizarse para el recuento de bacterias fijadoras de nitrógeno de vida libre así como para bacterias prom otoras de crecimiento considerando el medio de cultivo específico para cada caso. También se puede utilizar la técnica del número más probable para cuantificar bacterias simbióticas fijadoras de nitrógeno (Tema 19). 18.2. Capacidad infectiva y efectiva de los inoculantes en plántulas de legu­ minosas Este ensayo se realiza para com probar que el rhizobio en forma comercial (sopor­ te sólido) mantiene su capacidad de nodular la planta y de fijar nitrógeno. ■

Inocular 1 g del inoculante almacenado durante el periodo de un mes, a cada plántula cultivada en tubos de ensayos según Ormeño y Zúñiga (1999b). Fre­ cuentemente se usan de 8 a 10 tubos. Paralelamente se instalan de 8 a 10 plántulas controles sin inocular.

■

Las plántulas son mantenidas por u n periodo de 30 días con un fotoperiodo de 12 h de luz.

■

Cuidar el riego de dichas plántulas.

■

Evaluar la nodulación semanalmente (infectividad) y la m ateria seca a la co­ secha (efectividad) y com parar los resultados con el control sin inocular.

18.3 Recuento de microorganismos contaminantes del biofertilizante ■

Recuento de bacterias aerobias mesófilas viables (descrito en el Tema 21.1)

"

Recuento de hongos totales (descrito en el Tema 22)

■

Recuento de actinomicetos (descrito en el Tema 23)

18.4 Análisis físico-químico ■

Determ inación de la hum edad, tem peratura y conductividad eléctrica del inoculante.

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RHIZOBIUM, PGPRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD

Inoculante 10 g

10"'

1 mL

Tubos con 9 mL S.S. 0.85%

10“

10“

1 mL r

10-4 ... 1 mL

i'

1 mL ir

Incorporar medio LMA

Incubar a 28 °C por 2 -10 días

1 Elegir las placas con 30 - 300 colonias y realizar el conteo

FIGURA 18.1. Control de calidad de biofertilizantes

57

1(T 1 mL i

DO K IS ELIZA B ETH Z Ú Ñ IG A D Á V ILA

19. ENUMERACIÓN DE BACTERIAS SIMBIOTICAS FIJADORAS DE NITRÓGENO POR NÚMERO MÁS PROBABLE Este m étodo se emplea de acuerdo a Somasegaran y Hoben (1985). ■

Tomar 10 g de suelo o del inoculante y agregar a un m atraz con 90 mL de solución salina al 0.85% (diluyente). Agitar vigorosamente por dos minutos (dilución 10'), con una pipeta estéril tom ar 1 m L de la suspensión y transfe­ rir a un tubo con 9 m L de solución salina al 0.85% (dñución 10'2) y así suce­ sivamente hasta llegar a la dilución 10'5.

■

Tomar 1 mL cada una de las diluciones e inocular a cada uno de los cuatro tubos que contienen plantas de trébol blanco (Trifolium repens) de una semana de crecimiento (Figura 19.1).

■

Incubar las plantas en la cám ara de crecimiento a 18 - 22 °C por 4 semanas.

■

Luego de cuatro semanas evaluar la presencia o ausencia de nodulos en la raíz y utilizar la tabla de N úm ero M ás Probable (NMP) para la cuantificación (Anexo N° 3, Tabla A .3.4).

58

m a n u a l d e m ic r o b io l o g ía a g r íc o l a r h iz o b iu m , pgprs , in d ic a d o r e s d e f e r t il id a d e in o c u id a d

Suelo 10 g 1

'

l \ 10-1

90 mL S.S.0.85%

1 mL 1 mL

1 mL

Tubos con 9 mL S.S. 0.85% 10r3

1 0':

1 mL

10'4

1 mL

...

10'5

1 mL

Inocular cada dilución en cuatro tubos con plántulas

u

u

u i

Incubar a 22 - 24°C

p o r 2 8 d ía s

t Evaluar la presencia de nodulos cada 7 días y contar el número de plantas noduladas

i Expresar los resultados en

N M P /g

FIGURA 19.1 Cuantificación de Rhizobium por numero más p ro b a b le .

59

1 1 mL

V. INDICADORES DE LA FERTILIDAD BIOLOGICA DEL SUELO 20. Preparación de muestras y diluciones 21. Recuento de bacterias 22. Recuento de hongos totales 23. Recuento de bacterias anaerobias mesófilas 24. Enumeración de bacterias fijadoras de nitrógeno de vida libre 26. Actividad microbiana

INTRODUCCIÓN l componente microbiológico del suelo puede ser útil como indicador del estado general del suelo, pues una buena actividad microbiana, es reflejo de condiciones fisicoquímicas óptimas para el desarrollo de procesos metabólicos de microorganismos (bacterias, hongos y actinomicetos) que actúan sobre sustratos orgánicos y cultivos asociados.

E

Para evaluar la calidad del compost como inoculante, también se tom a en cuenta el factor microbiano. El compost term inado debe contener al menos 108 U F C /g de peso seco de bacterias aerobias y estar en relación 10:1o mayor a las bacterias anaerobias. Además, la carga de mohos y levaduras debe estar en 103-104 U F C /g y la de actinomicetos entre 106-108 U F C /g. U n compost de mala calidad puede estar asociado a inm adurez del procesamiento y puede inhibir la germinación de semillas o causar una rápida disminución del nitrógeno del suelo. Por otro lado, la medición de C 0 2 producido es una estimación de la actividad y por tanto de la presencia microbiana. Tal actividad varía en función de muchos factores, como el uso del suelo, mineralogía, cobertura vegetal, prácticas de m ane­ jo, calidad de los residuos que entran al sistema, factores ambientales, entre otros. De esta m anera podem os afirmar que la actividad m icrobiana nos da idea de la biota del suelo y puede ser un parám etro útil para la medición de su fertilidad.

63

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RHIZOBIUM, PGPRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD

20. PREPARACIÓN DE MUESTRAS Y DILUCIONES 20.1. Diluyente M uchos diluyentes pueden ser utilizados, como el agua destilada, la solución sali­ na al 0.85 %, agua tam ponada, entre otros. Un diluyente de uso general es el agua peptonada al 0.1 %.

Agua tam ponada

Disolver 34 g K H 2P 0 4 / L de agua destilada. pH 7.2 ±0. 5. Añadir 1.5 mL de esta solución y 5 m L de una solución de MgCl2 (81.1 g de MgCl2.6H20 / l L ) en 1 L de agua.

Agua peptonada

1 g de peptona/ 1 L de agua destilada

N o deben suspenderse las bacterias en el diluyente por más de 30 m in a tempera­ tura ambiente ya que puede producir la muerte o la multiplicación de las mismas. 20.2 Método La técnica empleada va de acuerdo al Standard M ethods (1998) *

Antes de proceder al estudio rotular cada tubo con el número de dilución correspondiente. ■ Pesar 10 g de muestra sólida ó 10 mL de muestras líquidas y adicionarlo a 90 m L del diluyente, así se obtiene una dilución 1 0 1 (Figura 20.1). ■ M ezclar cuidadosamente las muestras m ediante unos 25 movimientos com ­ pletos de arriba a abajo (y de delante a atrás). También se puede utilizar un agitador mecánico. ■ Tomar 1 mL de la dilución 10'1y adicionarlo en u n tubo que contiene 9 mL del diluyente, obteniéndose una dilución de 10 u Homogenizar. ■ Repetir el paso anterior hasta la dilución conveniente de acuerdo a la muestra. Nota: Al extraer la muestra, las pipetas no se introducen más de 2.5 cm por deba­ jo del nivel de la superficie de la dilución. 1 mL

Muestra

10'1

1 mL

10'2

FIGURA 20.1. Preparación de muestras y diluciones

65

10‘3

DORIS ELIZABETH ZÚÑIGA DÁVILA

21.

RECUENTO DE BACTERIAS

21.1 RECUENTO DE BACTERIAS AEROBIAS MESOFILAS VIABLES El procedimiento empleado (APHA, 1992), se realiza para la estimación de bacte­ rias mesófilas en muestras de suelo, humus, bioles, compost y otros relacionados. ■

Pesar 10 g de suelo y se agregar a un m atraz con 90 m L de solución salina al 0.85% (diluyente). Agitar vigorosamente por dos minutos (dilución 104).

■

Con una pipeta estéril, tom ar lm L de la suspensión y transferir a un tubo con 9 mL de solución salina al 0.85% (dilución 10'2) y así sucesivamente hasta llegar a la dilución 10’6.

■

Transferir alícuotas de 1 mL de las diluciones realizadas a placas Petri esté­ riles (dos placas por dilución) e incorporar el medio de cultivo Píate Count. Homogenizar.

■

Incubar a 28 °C por 48 h.

■

Hacer el recuento de colonias en placas que contengan entre 30 - 300 colonias.

■

Expresar los resultados en U F C /g de suelo seco (Figura 21.1)

21.2 RECUENTO DE HETERÓTROFOS El Standard M ethods (2000) considera el m étodo “Pour píate” (9215B), en la estimación del núm ero de bacterias heterotróficas viables en agua, tratamientos de agua y aguas de piscina. ■

M edir 10 mL de muestra y agregar a un m atraz con 90 m L de agua peptonada 0.1% (diluyente). Hom ogenizar (dilución 104).

■

Con una pipeta estéril, tom ar lm L de la suspensión y transferir a un tubo con 9 mL de solución salina al 0.85% (dilución 10 z) y así sucesivamente hasta alcanzar el núm ero de diluciones necesarias.

■

Transferir alícuotas de 1 m L de las diluciones realizadas a placas Petri estéri­ les (dos placas por dñución). De ser conveniente, de acuerdo a la naturaleza de la muestra, sembrar por duplicado, 1 m L de la muestra original.

■

Incorporar el medio de cultivo Píate Count. Homogenizar.

■

Incubar a 35 °C por 48 h.

■

Hacer el recuento de colonias en placas que contengan entre 30-300 colonias.

■

Expresar los resultados en U F C /m L (Figura 21.2).

66

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RHIZOBIUM, PGPRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD

Muestra 10 g

1 mL

10-1

1 mL

1 mL

9 mL

9 mL

SS 0.85%

SS 0.85%

10-2 1 mL

10-3

9 mL SS 0.85%

10-4

1 mL

1 mL

...

9 mL SS 0.85%

10-6 1 mL

'

T

Incorporar agar píate count

1 Incubar a 28 °C por 48 h

1 Elegir las placas que contengan entre 30 - 300 colonias

I

-

Expresión de resultados: UFC/g suelo seco

FIGURA 21.1. Recuento de bacterias aerobias mesófilas viables

67

D O RIS ELIZA B ETH ZTÍÑIGA D Á V ILA

10 mL

1 mL

1 mL

1 mL

1 mL i

1 mL r

1 mL ' r

▼

lí

Incorporar Agar Píate Count

i Incubar a 35°C por 48 h

i Elegir las placas que contengan entre 30 - 300 colonias

i Expresión de Resultados: UFC/mL

FIGURA 21.2. Recuento de heterótrofos

68

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RHIZOBIUM, PGPRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD

22.

RECUENTO DE HONGOS TOTALES

Se aplica la metodología recom endada por M erck (1994). ■

Pesar 10 g de suelo y colocarlo en un m atraz con 90 mL de solución salina al 0.85 % (diluyente). Agitar vigorosamente por dos minutos (dilución 1 0 1).

■

Con una pipeta estéril tom ar 1 m L de la suspensión y transferir a un tubo con 9 mL de solución salina al 0.85% (dilución 10'2) y así sucesivamente hasta llegar a la dilución 10'5.

■

Transferir alícuotas de lm L de las diluciones realizadas a placas Petri esté­ riles (dos placas por dilución) e incorporar el medio de cultivo Czapeck o papa-dextrosa-agar (PDA). Para inhibir la población bacteriana se recomien­ da bajar el pH del medio a 4 ó adicionar 30 m g / L de estreptomicina.

■

Incubar a 22 °C por 3 - 5 días.

■

Hacer el conteo de colonias en las placas que contengan entre 8 - 8 0 colonias.

■

Expresar los resultados en U F C /g de suelo seco (Figura 21.1)

ii

it

ii

ii

ii

|i

i|

Incorporar agar - papa - dextrosa (APD)

i Incubar a 22 °C por 3-5 días

4 Elegir las placas que contengan entre 8 - 8 0 colonias

4 Expresión de resultados: UFC/g suelo seco

FIGURA 22.1. Recuento de hongos totales

69

D O RIS BLIZA BETH Z Ú Ñ IG A DÁVILA

23.

RECUENTO DE BACTERIAS ANAEROBIAS MESÓFILAS

M erck (1994), recomienda la siguiente metodología para el recuento de bacterias anaerobias mesóñlas: ■ ■ ■ * * ■

Pesar 10 g de la m uestra y diluir con agua peptona, agitar por 2 min. Realizar diluciones hasta 10'3. Transferir 1 m L de cada dilución por duplicado, adicionar agar triptona sulfito neom icina (TSN) y homogenizar. Dejar solidificar. Invertir las placas e introducirlas en una jarra de anaerobiosis. Incubar a 35 °C durante 24 horas. Hacer el conteo de colonias en placas que contengan de 30 - 300 colonias. Expresar los resultados como U F C /g de suelo seco (Figura 23.1).

9 mL A P 0 .1%

1 mL

'i.

....

ii

H

ii

ii

ii

In c o rp o ra r m e d io T S N

In c u b a r en ja rra de a n a e ro b io s is a 35 ± 1 °C p o r 2 4 h

I R e a liza r el c o n te o en p la ca s q ue co n te n g a n e n tre 30 — 3 00 c o lo n ia s

i E xp re sió n de R e su lta d o s: U F C /g su e lo seco

FIGURA 23.1. Recuento de bacterias anaerobias mesófilas 70

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRICOLA RHIZOBIUM, PGPRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD

24.

RECUENTO DE ACTINOMICETOS

Se sigue el m étodo descrito en APHA-AWWA-WEF (1998) ■ ■ ■

■ ■

Pesar 10 g de la muestra y diluir con agua peptona, agitar por 2 min. Realizar diluciones hasta 10'5. Transferir 1 m L de cada dilución por duplicado, adicionar 18 mL de agar alm idón - caseína y homogenizar. Sembrar por incorporación usando 1 mL de las diluciones -2 hasta -5 con agar alm idón - caseína suplementado con fluconazol al 0.25 % para inhibir el crecimiento de hongos. Incubar a 28 °C por 6 - 7 días. Hacer el conteo de colonias en placas que contengan de 30 - 300 colonias. Reportar como U F C /gram o de suelo seco (Figura 24.1).

Muestra

Incorporar agar almidón - caseína suplementado con fluconazol 0.25 %

I Incubar a 28 °C por 6 - 7 días

1

Elegir las placas que contengan entre 30 - 300 colonias

i Expresión de resultados: UFC/g suelo seco

FIGURA 24.1. Recuento de actinomicetos

71

D O RIS ELIZA B ETH /.Ú Ñ IG A DÁVILA

25. ENUMERACIÓN DE BACTERIAS FIJADORAS DE NITRÓGENO DE VIDA LIBRE Recuento de Azotobacter sp. * ■ ■ ■

Tomar 10 g de suelo de rizósfera y agregar en un m atraz con 90 mL de solu­ ción salina 0.85 %. Agitar vigorosamente . Se debe colocar lm L de las diluciones -2 hasta -4 en tubos que contienen cal­ do sin nitrógeno (Zapater, 1975). Se consideran 3 tubos por dilución. Se incuba a 28°C por 7 -10 días (Figura 25.1). Se realiza el conteo de los tubos positivos de cada una de las diluciones ob­ servando viraje de color, turbidez y la formación de un velo en la superficie del caldo, se expresa este conteo en N M P /g (gramo de rizósfera seca) (Anexo N° 3, Tabla A .3.1)

Suelo

Tubos con 9 mL AP 0.1 %

1 mL /tb

1 mL /tb

1

I

. |

1 mL /tb

10 mL caldo mineral sin nitrógeno - ABT

Incubar a 28 + 1 °C por 7 - 10 días

1 Viraie de color a amarillo se reoorta como positivos

i Leer los tubos positivos y consultar la tabla de NMP para reportar el resultado final FIGURA 25.1. Enumeración de bacterias fijadoras de nitrógeno de vida libre

72

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RHIZOBIUM, PGPRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD

26. ACTIVIDAD MICROBIANA Pre - tratamiento de la Muestra El suelo colectado debe ser gentilmente aireado, hasta alcanzar una hum edad conveniente para el tamizado. Se procede al retiro de todo material o residuo vegetal de la porción de suelo obtenida. Se realiza el tam izado del suelo a un tam año m áxim o de partícula de 500 gm y se almacena en frascos de vidrio a tem peratura ambiente hasta el análisis respectivo. U na porción de suelo es separada para ensayar el contenido de hum edad gravimétrica. 26.1. Determinación de la respiración de los microorganismos del suelo Este ensayo se realiza de acuerdo a la metodología de Anderson (1982). ■

Los sistemas a instalar consisten en un recipiente plástico de 250 g de capaci­ dad, con 25 g de suelo tam izado (peso húmedo).

■

A cada sistema, se añade 0.5 mL de solución de glucosa al 25%. M ezclar

*

Se introduce un pequeño vial conteniendo 3.5 mL de solución N aO H 1N, inmediatamente se cierra el sistema y se sella con cinta parafilm.

■

Del mismo m odo se instala un recipiente vacío que sirve como blanco.

■

Los sistemas, junto con el blanco, se incuban a 28°C por 24 horas.

■

Cumplido el periodo de incubación, se retira el vial del sistema colector y se trasvasa su contenido y el de su agua de enjuague (agua destilada) hacia un m atraz de 250 mL de capacidad.

■

Añadir 3.5 mL de BaCl2y el N aO H no combinado es titulado con HC10.25N en presencia de fenolftaleína (Figura 26.1).

■

Calcular los resultados:

■

Vol. N aO H convertido en N a ,C 0 3 (mL) = gasto HC1 blanco (mL) - gasto HC1 sistema (mL)

■

C 0 2 (mg) = Vol. N aO H convertido en N a2C 0 3 (mL) x N HC1 x 22

Donde: N: norm alidad del HC1 26.2. Determinación de la actividad deshidrogenasa de los microorganismos del suelo La actividad deshidrogenasa en suelos, se determ ina por reducción de sales tetrazolium, su extracción y cuantificación espectrofotométrica de acuerdo al m étodo descrito por Casida (1977) y modificado para la presente obra (Ramos y Zúñiga, 2007). ■

Se tom an 10 g de suelo tam izado (peso húmedo), que son mezclados con 0.1 g de carbonato de calcio, C a C 0 3.

■

De esta mezcla se pesan 2 g en frascos estériles color ám bar con cierre her­ mético. 73

D O R IS EL IZ A B E TH Z Ú Ñ IG A D Á V ILA

Pesar 25g de suelo tamizado

Adicionar 0.5mL de sol. glucosa 25%

i Incubar a 28°C por 24 horas

i Trasvasar el contenido del vial a un matraz

Adicionar 3.5mL de BaCI2 + fenoftaleína

Titular el NaOH no combinado (hasta el viraje de rosa grosella a blanco)

i Calcular la tasa de C 0 2 producido: mg C 0 2/g*h FIGURA 26.1. Respiración de los microorganismos del suelo

■

Para la instalación del ensayo, se añade 1 m L de solución de extracto de levadura al 0.1% esterilizada por autoclavado y 1 mL de solución de cloruro de trifenil tetrazolium (TTC) al 3% esterilizada por filtración a cada uno de los sistemas; excepto para el suelo blanco, al cual se añade 1 m L de agua destilada estéril en lugar de adicionarle la solución de TTC. Homogeneizar.

■

Cerrar los frascos y sellar con cinta parafilm.

■

Los sistemas son incubados a 37 ± 1 °C por 24 h.

■

Cumplido el periodo de incubación, se extrae el trifenil form azán formado 74

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RHIZOBIUM, PGPRS. INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD

como producto de la reducción microbiana. Se añaden 12 mL de etanol ab­ soluto a cada frasco instalado. Se agita vigorosamente de m anera constante por espacio de 5 minutos. ■

El sobrenadante es separado del suelo por filtración al vacío.

■

Se efectúa la lectura al espectrofotómetro de la solución obtenida contra el sobrenadante del blanco, a una longitud de onda de 485 nm (Figura 26.1).

*

El contenido de la sal reducida es cuantificado con la ayuda de una curva de calibración de formazán, en pg de form azán/ g suelo seco/ 24h. 20 g suelo tamizado + 0.2 g CaC03

i Pesar 2 g

Muestra

1

1

+ 1 mL extracto de levadura 0.1 %

1

1

+ 1 mL agua

+ 1 mL TTC 3 %

Incubar a 37 ± 1°C / 24 horas

i Añadir 12 mL de etanol absoluto y agitar vigorosamente por 5min Filtrar al vacio

i Leer al espectrofotómetro a 485 nm

i Cuantificar la cantidad de formazán haciendo uso de una curva de calibración

i pg de formazán/ g suelo seco/ 24h FIGURA 26.2. Determinación de la actividad microbiana de los microorganismos del suelo

75

VI. INDICADORES DE INOCUIDAD DE AGUA Y SUELO 27. Enumeración de coliformes totales 28. Enumeración de coliformes fecales 29. Enumeración de E sch erich ia 30. Determinación de

co li

S a lm o n ella

sp.

INTRODUCCIÓN as pruebas de inocuidad en suelo y agua son ensayos que se realizan para la determ inación del estado sanitario de muestras de suelo, compost, bioles, agua y otros, para m inim izar los riesgos para la salud hum ana durante su manejo para la producción de cultivos.

L

Tradicionalmente se considera que los microorganismos coliformes y Salmonella, son indicadores de contam inación en el control de calidad de agua y suelo. Su presencia es relevante desde el punto de vista de aporte de contam inación a los alimentos que crecen bajo y al ras del suelo y que son consumidos crudos y que pueden originar enfermedades e infecciones gastrointestinales. En nuestro país, dentro del sistema agrícola de riego, es com ún la utilización de efluentes tratados y aguas residuales. Estos suelen aportar u na alta carga micro­ biana. Así mismo, el uso inadecuado de abonos y compost puede contam inar el suelo. El riesgo sanitaro se encuentra latente y existe la necesidad de norm ar los límites permisibles para cada caso. Por decreto supremo N° 002-2008-MINAM se estableció como parám etros biológicos de agua para riego de vegetales de tallo bajo, la tolerancia no m ayor de 5 x 103 N M P /1 0 0 m L de coliform es totales y 1 x 103N M P /100 mL de fecales, así como la ausencia de Salmonella. En tanto que el riego de vegetales de tallo alto admite hasta 2 x 103 N M P /100 mL coliformes fecales y las mismas especificaciones para los otros parámetros.

79

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RHIZOBIUM, PGPRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD

27.

ENUMERACIÓN DE COLIFORMES TOTALES

27.1.

Enumeración de coliformes totales (ICMSF, 2000)

La metodología para la determinación de los coliformes totales en muestras sólidas se realiza por la técnica del número más probable (NMP) - método norteamericano. ■ ■ * ■ ■ ■ ■

■ ■

Preparar la muestra como lo descrito en el Tema 20, Preparación de muestras. Pipetear 1 mL de cada una de las diluciones en tubos de caldo lauril sulfato triptosa, utilizando tres tubos para cada dilución. Incubar los tubos a 35 - 37 °C durante 24 y 48 horas. Pasadas las 24 primeras horas, anotar los tubos que muestren producción de gas. Volver a la estufa los tubos negativos para su incubación durante 24 horas más. Pasadas las 48 horas, anotar los tubos que muestren producción de gas Confirmar que los tubos de caldo lauril sulfato seleccionados en el paso ante­ rior son positivos de organismos Coliformes, transfiriendo una asada de cada tubo a otro de caldo lactosa bilis (2%) verde brillante. Incubar durante 24-48 horas a 36 + 1°C y observar la producción de gas. La formación de gas confirma la presencia de coliformes (Figura 27.1). Para determ inar el núm ero de microorganismos, consultar la Tabla del N M P (Anexo N° 3, Tabla A .3.1) y reportar como N M P /g.

Expresión de Resultados Elegir la dilución más alta en la que sean positivos de formación de gas los tres tubos de una dilución y tom ar en cuenta las diluciones superiores más próximas. Por ejemplo: N° de tubos positivos Ejemplo 1 2 3 4

-1

-2

-3

-4

3/3 0/3 2/3 3/3

3/3 0/3 2 /3 3/3

1/3 0/3 1/3 3/3

0/3 0/3 1/3 3/3

Para la lectura en la tabla del Núm ero M ás Probable, se tom arían las siguientes combinaciones de tubos positivos: Ejemplo 1 2 3 4

Combinación de positivos 3:1:0 0:0:0 2:1:1 3:3:3

Clave N M P 40