Manual de Laboratorio

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PATOLOGIA INFECCIOSA

Manual del Laboratorio de prácticas

DEPARTAMENTO DE MEDICINA UNIVERSIDAD DE PAMPLONA

Elaborado por: Dra. María Victoria Figueroa Ramírez Dra. Claudia Rocío Chia Argote

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INDICE

Práctica 01 Bioseguridad, Técnicas de desinfección y esterilización Práctica 02 Principios básicos de pruebas inmunológicas Práctica 03 Medio de cultivo Práctica 04 Siembras y aislamientos Práctica 05 Tipo de muestras útiles en microbiología, estructuras micóticas, hongos ambientales, toma de muestra Práctica 06 Protozoos intestinales, coprológico, coproscópico Práctica 07 Morfología bacteriana Cocos Gram Positivos Práctica 08 Enterobacterias, Antibiograma Práctica 09 Tuberculosis Práctica 10 Diagnóstico de infecciones de piel, tejidos blandos y análisis de Liquido Cefalo-raquideo Práctica 11 Diagnóstico de infecciones del tracto genito-urinario Práctica 12 Urocultivo, Coprocultivo, Hemocultivo Práctica 13 Diagnostico de dengue, hepatitis B, VIH

Práctica 01 Bioseguridad, Técnicas de desinfección y esterilización Elaborado por: Dra. María Victoria Figueroa Ramírez Dra. Claudia Rocío Chia Argote

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BIOSEGURIDAD Y ESTERILIZACION OBJETIVOS GENERALES: Dar a conocer las normas de bioseguridad y los procesos de desinfección y esterilización en el ámbito clínico. OBJETIVOS ESPECIFICOS Determinar los conceptos que definen las normas de bioseguridad y su aplicación en el desempeño profesional en las instituciones de salud. Identificar y reconocer los principios para seleccionar los métodos adecuados de desinfección y esterilización. NORMAS GENERALES PARA EL TRABAJO DE LABORATORIO 1. El acceso al laboratorio estará limitado solo personal autorizado. 2. El personal que trabaje en laboratorio debe responsabilizarse con el cumplimiento de las normas de bioseguridad. 3. Todas las áreas estarán debidamente marcadas con la señal de riesgo biológico y el nivel de contención. 4. Ingrese al laboratorio con bata manga larga, abotonada, y limpia, una vez ingrese, coloque los abrigos, libros, y demás en localizaciones especificadas pero nunca sobre los bancos o mesones. 5. Lave sus manos al entrar y al terminar cada sesión, limpie la superficie de trabajo con una solución desinfectante. 6. El personal con cabello largo debe recogerlo para trabajar dentro del laboratorio así como usar: bata, cofia, tapaboca, guantes y demás equipos de barrera de protección según el nivel según el riesgo biológico. 7. El laboratorio debe permanecer limpio y ordenado, durante el trabajo o al término del mismo coloque el material contaminado o limpio en sus respectivos lugares pero nunca sobre los mesones. 8. Comer, beber, fumar aplicarse cosméticos (en especial pestañina, pues esta acelera el deterioro delo oculares del microscopio) y usar lentes de contacto es una actitud prohibida dentro del laboratorio. Es necesario el uso de zapato cerrado durante el trabajo de laboratorio igualmente como mantener las uñas cortas y limpias y sin esmalte. 9. Está prohibido pipetear con la boca, para ello emplee los dispositivos adecuados. 10. Emplear los equipos según las instrucciones o P.O.E (procedimientos operativos estandarizados) al igual que emplear los protocolos correspondientes a las prácticas. No manipular ni operar equipos sin la autorización respectiva o si no tiene claro los P.O.E. 11. El transporte de muestras dentro o entre laboratorios se realizara de tal manera que en caso de caída, no se produzcan salpicaduras. Lo recomendable es hacerlo en cajas herméticas o neveras transportables, las cuales deberán ser rígidas y resistentes, contar con materiales absorbentes en su interior, de fácil desinfección y no ser utilizadas con otros fines. 12. Todo personal debe poner especial cuidado en evitar contacto con la piel con materiales potencialmente infecciosos. Con este fin, debe usarse guantes para la manipulación de muestras o cultivos que contengan posibles patógenos. Los guantes siempre serán desechados antes de salir del área de trabajo.

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13. Informar todos los derrames y accidentes al supervisor de forma inmediata y al jefe del laboratorio. 14. Usar gafas protectoras y mascaras faciales si existe riesgo de salpicaduras y/o aerosoles. 15. Cada estudiante debe contar con su equipo básico de trabajo, el cual incluirá entre otros laminas portaobjetos, laminas cubreobjetos, jabón, tijeras, cinta de enmascarar, lápiz, marcador de vidrio permanente, papel absorbente, algodón, alcohol, asas bacteriológicas, guantes. MARCO TEORICO. DEFINICION Se entiende por bioseguridad a toda una disciplina encargada de prevenir accidentes biológicos, valiéndose de un conjunto de medidas y controles destinados a prevenir al máximo la exposición a agentes potencialmente infecciosos o patógenos en los sitios de trabajo donde exista dicho riesgo. Principios de bioseguridad Se describen métodos seguros para manejar materiales infecciosos en el laboratorio bien sea para manipulación o conservación; dicha descripción se conoce como CONTENCION, su aplicación fundamental es la reducción y/o eliminación de la exposición de cualquier persona trabajador ó no, como también al medio ambiente externo de agentes peligrosos. Contención primaria, propende por la protección del personal y del medio ambiente propio e inmediato del laboratorio de la exposición a agentes infecciosos, mediante la utilización correcta de las técnicas necesarias, los equipos indispensables y con un uso apropiado. La vacunación del personal que labora en los laboratorios. Contención secundaria, se aplica en referencia al medio externo y la combinación entre la aplicación de las practicas operativas, y un adecuado diseño de la planta física, permite la consecución de su objetivo. Se debe evaluar el riesgo de trabajo con agentes específicos para lograr la combinación de los tres elementos de contención que son: técnicas y practicas en le laboratorio, equipos de seguridad, y el diseño de la instalación. Los trabajadores deben conocer los riesgos potenciales y tener experiencia en las prácticas y técnicas indispensables en la manipulación de material infeccioso, debe existir una persona que organice y capacite adecuadamente al personal. Los laboratorios están obligados a elaborar e implementar un manual de operaciones que identifique los posibles riesgos prácticas y operaciones. Dicho manual debe ser socializado para su correcta aplicación. Es necesario implementar medidas adicionales cuando las prácticas estándar no son suficientes para controlar los riesgos, es indispensable que el director del laboratorio seleccione este tipo de prácticas, en relación a los riesgos tanto con los agentes o los procedimientos. BARRERAS PRIMARIAS Son aquellas que ofrecen niveles significativos de protección al personal y al medio ambiente brindando protección contra la contaminación externa de los materiales (cultivos celulares, stocks microbiológicos). Ej.: Gabinetes de

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seguridad biológica (BSCs), recipientes cerrados, cubetas de centrifugas. También se incluyen elementos de protección personal, tales como guantes, delantales batas, cobertores de zapatos, botas respiradores, cofias, tapa bocas, anteojos de seguridad y mascaras faciales. BARRERAS SECUNDARIAS Son las que contribuyen en la protección de quienes trabajan en el laboratorio y la comunidad evitando el escape de agentes infecciosos al medio ambiente. Se refieren al diseño y construcción de la planta física, sistemas de descontaminación del sitio de trabajo y del personal, dichas características incluyen procesos de ventilación especializados para asegurar el flujo del aire direccional, zonas de acceso controladas. GRUPOS DE RIESGO BIOLOGICO GRUPO DE RIESGO 1 Microorganismos que representan escaso riesgo para el individuo y la comunidad, tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser humano o los animales por Ejemplo agentes como: Naegleria gruberi, Bacillus subtilis, entre otros. GRUPO DE RIESGO 2(GR2) Microorganismos que representan riesgo moderado para el individuo y limitado o bajo para la comunidad; pueden provocar enfermedades humanas o animales pero tienen bajas probabilidades de entrañar un riesgo grave para el personal de laboratorio, la población, el ganado o el medio ambiente. La exposición en el laboratorio puede provocar una infección grave, pero existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces y el riesgo de propagaciónes limitado por ejemplo existe disponibilidad de tratamiento y medidas preventivas y el riesgo de diseminación está limitado, por ejemplo agentes como; Micobacterium (excepto M. Boris y M. tuberculosis), Helicobacter, Salmonella, E. coli, Shigella, Streptococcus, Staphilococcus, HIV, virus de la hepatitis A, B, C, D y E, entre otros. GRUPO DE RIESGO 3 (GR3): Microorganismos que representan riesgo elevado para el individuo y escaso para la comunidad; usualmente causan enfermedades serias a humanos y animales que resultan en importantes consecuencias económicas, la diseminación no es ordinaria y depende del contacto casual de un individuo a otro, puede haber disponibilidad de medidas preventivas y terapéuticas eficaces, por ejemplo agentes como; Micobacterium tuberculosis. M. bovis, M. leprae, Histoplasma capsulatum, virus de la Influenza incluyendo HPAI (H7 y H5), Virus del Nilo, entre otros. GRUPO DE RIESGO 4 (GR4): Microorganismos que representan riesgo elevado para el individuo y para la comunidad; causa serias infecciones a humanos o animales, en ocasiones sin tratamiento y puede transmitirse fácilmente de un individuo a otro, o de un animal a humano o viceversa directa o indirectamente o por contacto casual; normalmente no existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces, por ejemplo agentes como; Ebola, Hanta, virus de la rabia de murciélagos, Nipah, Junin, entre otros. GRUPO DE RIESGO 5 (GR5):

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Agentes que desarrollan enfermedades que no están reportadas en el país (exóticas); su introducción y presencia están reglamentadas por leyes sanitarias locales, por ejemplo agentes como; Enfermedad de Aujeszky, CAE, virus de la hepatitis en patos, Nairobi, enfermedad Teschen, virus serotipo BT, enfermedad del caballo africano, entre otros.

NIVELES DE BIOSEGURIDAD Las recomendaciones de la CDC describen cuatro niveles de bioseguridad que constan de combinaciones de prácticas y técnicas de laboratorio, equipos de seguridad e instalaciones, representando las condiciones bajo las cuales el agente pueda manipularse de una forma segura. La adopción de los diferentes se efectúa de forma dinámica, y se clasifica de acuerdo: -Grupo de microorganismos infectantes - Técnicas y prácticas de laboratorio -Equipos de seguridad. -Tipo de laboratorio. Nivel 1: Representa un sistema básico empleado en prácticas microbiológicas estándar, sin ninguna barrera primaria y secundaria. Nivel 2: es adecuado cuando se trabaja con sangre humana fluidos corporales, tejidos, etc., donde puede existir la presencia de un agente infeccioso desconocido Nivel 3: Trabajo con agentes exóticos con potencial de transmisión respiratoria que puede provocar una infección grave o potencial mente letal, se enfatizan barreras primarias y secundarias. Nivel 4: trabajo con agentes peligrosos o tóxicos que representa un alto riesgo individual de enfermedades que ponen en peligro la vida, para las cuales no existen vacunas o terapias disponibles. EQUIPOS DE SEGURIDAD. Es un hecho aceptado que una buena parte de las infecciones adquiridas en los laboratorios son debidas, además de los accidentes que pueden tener lugar (roturas, salpicaduras, cortes y pinchazos), a la inhalación de aerosoles con potencialidad infectiva que se generan en las diversas operaciones del laboratorio clínico. Se debe implementar una medida donde para la correcta manipulación de materiales peligrosos. Es evidente que la eliminación de materiales peligrosos debe conllevar a la evolución del fundamento de las tradicionales campanas de humos, las cuales precisan la protección del producto manipulado como la del trabajador, sumándose a esta necesidad la protección del medio ambiente laboral y comunitario. CABINAS DE SEGURIDAD BIOLÓGICA.

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Son equipos que proporcionan una barrera de contención para trabajar de forma segura con agentes infecciosos. Presenta diversos nombres tales como cabinas de seguridad, campanas microbiológicas, o campanas de flujo laminar.

Figura 1. Cabina de seguridad biológica Estos equipos han sido diseñados para mantener un área denominada zona de trabajo libre de partículas y de contaminantes tales como bacterias que puedan alterar el producto con el cual se trabaja, al trabajador o al medio ambiente. La protección se logra mediante la combinación de elementos electromecánicos/electrónicos (motor, ventilador, filtro, ductos, eliminación, etc.) y procesos físicos (flujo laminar, diferencias de presiones) que impulsan el aire a través de unos filtros especiales de gran superficie, estratégicamente ubicados que tienen una eficiencia mínima de retención de partículas de 99,99%, estos filtros son conocidos como FILTROS HEPA y resultan adecuados para retener aerosoles que se generan cuando se realizan procedimientos experimentales con agentes biológicos como agitación, centrifugación o mezcla. ESTERILIZACION MARCO TEORICO Es la eliminación de toda forma de vida de un medio o material, utilizando, medios físicos como la filtración, y el calor, medios químicos como alcoholes, fenoles, desinfectantes. ASEPSIA: se define como la eliminación de material orgánico extraño de la superficie de los objetos, se logra con la acción manual directa o mecánica con el uso de agua y jabón o soluciones detergentes y algunos germicidas. Etapas del proceso de esterilización

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Limpieza y descontaminación: es la remoción de toda materia extraña en la superficie de objetos inanimados mediante el uso de agua y soluciones jabonosas. La descontaminación disminuye la carga microbiana de los materiales dejándolos seguros para su manipulación. Inspección: corresponde a la evaluación visual de los artículos lavados buscando desperfectos o suciedad que pueda interferir en los métodos de esterilización. PREPARACION /EMPAQUE Se debe preparar, empaquetar los artículos facilitando su uso y evitando daños y deterioro del material. ESTERILIZACION ALMACENAMIENTO Los artículos se conservan hasta su uso asegurándose la esterilidad o proceso de desinfección ENTREGA DE MATERIALES Es la distribución de los elementos de trabajo en sus aéreas correspondientes, teniendo en cuenta la cantidad y la calidad necesaria para su utilización. Tipo de material Procedimiento Material critico: aquel Esterilización que entra en contacto con tejidos estériles o con el sistema vascular. Material semicríticos: Desinfección aquellos que están en nivel contacto con membranas, mucosas y piel no intacta

Material no critico: aquel que entra en contacto con piel intacta no con membranas mucosas

de

alto

Desinfección de nivel intermedio o bajo

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Ejemplo Instrumental quirúrgico Implantes Aparatos de endoscopias Catéteres, sondas, drenajes, agujas Aparatos de endoscopia Endoscopios flexibles Maquinas de diálisis Otoscopio, sinuscopio Equipos de terapia respiratoria Especulo vaginal Termotetos rectales Termómetros de axila Orinales planos Fonendoscopios Desfibriladores Manguitos de tensión arterial.

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Principales métodos de esterilización MÉTODOS QUÍMICOS: Estos métodos provocan la perdida de viabilidad de los microorganismos.

1) OXIDO DE ETILENO: Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrógenos lábiles como los que tienen grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos, hidroxilos, etc. Es utilizado en la esterilización gaseosa, generalmente en la industria farmacéutica. Destruye todos los microorganismos incluso virus. Sirve para esterilizar material termosensibles como el descartable (goma, plástico, papel, etc.), equipos electrónicos, bombas cardiorrespiratorias, metal, etc. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo, y además cancerígeno. 2) ALDEHIDOS: Son agentes alquilantes que actúan sobre las proteínas, provocando una modificación irreversible en enzimas e inhiben la actividad enzimática. Estos compuestos destruyen las esporas. 3) GLUTARALDEHIDO: Consiste en preparar una solución alcalina al 2% y sumergir el material a esterilizar de 20 a 30 minutos, y luego un enjuague de 10 minutos. Este método tiene la ventaja de ser rápido y ser el único esterilizante efectivo frío. Puede esterilizar plástico, goma, vidrio, metal, etc. 4) FORMALDEHIDO: Se utilizan las pastillas de paraformaldehido, las cuales pueden disponerse en el fondo de una caja envueltas en gasa o algodón, que después pueden ser expuesta al calor para una rápida esterilización (acción del gas formaldehído). También pueden ser usadas en Estufas de Formol, que son cajas de doble fondo, en donde se colocan las pastillas y se calienta hasta los 60° C y pueden esterilizar materiales de látex, goma, plásticos, etc. Las pastillas de formalina a temperatura ambiente esterilizan en 36 hs. 5) GAS PLASMA DE PEROXIDO DE HIDROGENO: Se usa la forma en gel del peróxido de hidrogeno usado a baja temperatura es biocida, no deja residuos tóxicos se convierte en agua y oxigeno su actividad se logra entre 54 y 75 minutos, su utilización es muy costosa. Posee como ventajas: No deja ningún residuo tóxico. Se convierte en agua y oxígeno al final del proceso. El material no precisa aireación. El ciclo de esterilización dura entre 54 y 75 minutos. Desventajas: No se pueden esterilizar objetos que contengan celulosa, algodón, líquidos, humedad, madera o instrumental con lúmenes largos y estrechos. Es el método de esterilización más caro de entre los descritos. MÉTODOS FÍSICOS: 1.CALOR: la efectividad de este método depende del tiempo de exposición y la temperatura debido a que todos los microorganismos son susceptibles a diferentes grados de temperaturas provocando desnaturalización de

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proteínas, desorganización de las membranas irreversibles.

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y procesos oxidantes

2. CALOR HÚMEDO: produce desnaturalización y coagulación de proteínas debido a que el agua genera reacciones en estructuras biológicas debido a que posee un coeficiente de calor mucho mas elevado que el aire, presentando como ventajas rápido calentamiento y penetración, destruye las bacterias y esporas en corto tiempo, sin dejar residuos tóxicos, hay un bajo deterioro del material expuesto y es económico 2.1.AUTOCLAVE : Se realiza la esterilización por el vapor de agua a presión utilizando 120 º (estas condiciones pueden variar) durante 20- 30 minutos, constituido por una caldera de cobre sostenida por una camisa externa mecánica recibiendo calor por combustión de gas o por una resistencia eléctrica que se cierra por una tapa en bronce en la parte superior presentando tres orificios uno para el manómetro, otro para el escape de vapor y el tercero para una válvula de seguridad que funciona como resorte, se debe colocar agua en la caldera si alcanzar los objetos que se encuentra en la rejilla de metal, se cierra asegurando la tapa, si ajustar las grapas, dejando abierta la válvula de escape hasta que libere todo el vapor en forma de chorro continuo y abundante. 2.2. TYNDALIZACION: esterilización por acción discontinua del vapor de agua, aplicando el principio TYNDAL, donde las bacterias son destruidas por la repetición de la misma operación con intervalos separados y en varias sesiones, efectuándose por medio del autoclave, dejando abierta la válvula de escape, es decir funcionando a la presión normal, también puede realizarse a temperatura menores como 56 º- 80º evitando la descomposición de las sustancias a esterilizar. Ventajas del calor húmedo:  Rápido calentamiento y penetración  Destrucción de bacterias y esporas en corto tiempo  No deja residuos tóxicos  Hay un bajo deterioro del material expuesto  Económico Desventajas:  No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua  Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metálicos 3. CALOR SECO: Produce desecación de las células debido a los elevados niveles de electrolitos y fusión de membranas mediante la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos la acción destructiva del calor sobre proteínas y lípidos requiere mayor temperatura cuando el material esta seco o la actividad del medio son bajos. La utilidad del calor seco no permite una actividad corrosiva en metales e instrumentales, permitiendo la esterilización de sustancias en polvo y no acuosas, viscosas y no volátiles. 3.1. ESTUFAS

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Se mantiene una temperatura estable mediante termostato de metal que al dilatarse por el calor cortan el circuito eléctrico generando una resistencia la cual circula por la cavidad principal y por el espacio entre ambas cámaras, a temperaturas de 170º para el instrumental metálico. Ventajas del calor seco:  No es corrosivo para metales e instrumentos.  Permite la esterilización de sustancias en polvo y no acuosas, y de sustancias viscosas no volátiles. Desventajas:  Requiere mayor tiempo de esterilización, respecto al calor húmedo, debido a la baja penetración del calor. 3.2. LLAMA DIRECTA Se usa para esterilizar asas bacteriológicas, agujas de disección y se realiza a través del mechero. 4. RADIACIONES: su acción depende de: tipo de radiación, tiempo de exposición y la dosisi. Se utilizan en salas de cirugía. 4.1. IONIZANTES: Producen iones y radicales libres que alteran las bases de los ácidos nucleicos, estructuras proteicas y lipídicas, y componentes esenciales para la viabilidad de los microorganismos. Tienen gran penetrabilidad y se las utiliza para esterilizar materiales termolábiles (termosensibles) como jeringas descartables, sondas, etc. Se utilizan a escala industrial por sus costos. 4.2. RAYOS ULTRAVIOLETAS: Afectan a las moléculas de DNA de los microorganismos. Son escasamente penetrantes y se utilizan para superficies, se utilizan para la esterilización en quirófanos. 4.3. RAYOS GAMMA: Su empleo está basado en los conocimientos sobre la energía atómica. Este tipo de esterilización se aplica a productos o materiales termolábiles y de gran importancia en el campo industrial. Puede esterilizar antibióticos, vacunas, alimentos, etc. 5. FILTRACIÓN Se usan membranas filtrantes con poros de un tamaño determinado. El tamaño del poro dependerá del uso al que se va a someter la muestra. Los filtros que se utilizan no retienen virus ni micoplasmas, estos últimos están en el límite de separación según el diámetro de poro que se utilice. La filtración se utiliza para emulsiones oleosas o soluciones termolábiles. Su usa para esterilizar aceites, algunos tipos de pomadas, soluciones oftálmicas, soluciones intravenosas, drogas diagnósticas, radiofármacos, medios para cultivos celulares, y soluciones de antibióticos y vitaminas. Materiales Estufa Autoclave Horno esterilizador Cámara de flujo laminar

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Mecheros Cajas de petri Papel kraft Cinta de enmascarar CONSULTA 1. Mencione las diferencias entre un laboratorio de microbiología y un laboratorio convencional. 2. Mencione los pasos a seguir cuando un cultivo líquido bacteriano se derrama sobre una superficie. 3. ¿Qué características de un material o sustancia se requieren conocer para elegir el método adecuado de esterilización?

Práctica 02 Principios básicos de pruebas inmunológicas OBJETIVOS GENERALES: Comprender el fundamento y la utilidad de los diferentes tipos de enzimoinmunoensayos. OBJETIVOS ESPECIFICOS Establecer diferencias entre los diversos tipos de pruebas serológicas. Conocer el mecanismo de acción y las propiedades de las enzimas y sustratos empleados en los enzimoinmunanalisis. Realizar el procedimiento para la reacción antígeno-anticuerpo. MARCO TEORICO. El sistema inmune es aquel conjunto de estructuras y procesos biológicos que en el interior de organismo genera una protege contra enfermedades identificando y matando células patógenas y cancerígenas. 1Detecta una amplia variedad de agentes, desde virus hasta parásitos intestinales 23 y necesita distinguirlos de las propias células y tejidos sanos del organismo para funcionar correctamente. El sistema inmune está compuesto de leucocitos, anticuerpos, citoquinas, macrófagos, entre otros componentes que ayudan a su funcionamiento. La detección es complicada ya que los patógenos pueden evolucionar rápidamente, produciendo adaptaciones que evitan el sistema inmunitario y permiten a los patógenos infectar con éxito la célula huésped. Sin embargo, existen técnicas de laboratorio que han sido diseñadas para evidenciar bajo diversas formas la reacción antígeno-anticuerpo. PRUEBAS DE AGLUTINACION DE PARTICULAS. Es una reacción serológica clásica que comprende la aglomeración de una suspensión celular mediante un anticuerpo específico. Este fenómeno se puede observar cuando antígenos corpusculares, como las células sanguíneas o bacterias se exponen a un anticuerpo específico en condiciones adecuadas. Las reacciones con antígenos solubles se pueden adaptar a las pruebas de aglutinación mediante el recubrimiento o

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acoplamiento covalente del antígeno o del anticuerpo especifico o un transportador corpuscular, es decir, eritrocitos, partículas de látex, etc. En esta reacción primero se une el anticuerpo con el antígeno y luego se produce la aglutinación, el anticuerpo recibe la denominación de completo. Si el anticuerpo se une a un antígeno específico de los hematíes sin producir aglutinación se trata de un anticuerpo incompleto. Estos se determinan a través de la prueba de antiglobulina donde se produce la aglutinación de los eritrocitos en solución salina cuando la mezcla contiene 20-30% de concentración de albumina o las células rojas han sido tratadas con ciertas enzimas proteolíticas. Presenta como ventaja el alto grado de sensibilidad y la gran cantidad de antígenos que se pueden detectar mediante el uso de partículas recubiertas de antígeno o anticuerpo. Las reacciones de aglutinación se pueden clasificar en directas, indirectas (pasivas) o antiglobulinas. Precipitación. Se trata de la mezcla de un anticuerpo con un antígeno homologo, estando ambos en solución, conduciendo a la formación de un precipitado frecuentemente referido como precipitado inmune. Presentan un alto índice de sensibilidad y pueden ser cualitativas y cuantitativas. Clases de inmunoanalisis. Los inmunoanalisis son técnicas para detectar y cuantificar los antígenos o los anticuerpos. Pueden emplearse reactivos marcados o sin marcar. Los inmunoanalisis sin marcar presentan limitaciones en cuanto a su sensibilidad, ya que para conseguir la detección deben formarse grandes complejos antígenos-anticuerpo. Ej.: inmunoprecipitacion, de aglutinación y de dispersión lumínica, para detectar dichos complejos por técnicas de equilibrio o cinéticas empleándose en el análisis de proteínas. Las técnicas de inmunología clínica son de naturaleza variable técnicas como la fijación del complemento que hoy son consideradas obsoletas van siendo reemplazadas por técnicas más finas como el análisis inmunoenzimatico y nefelometría , por esto es indispensable estar familiarizados con la nueva tecnología existente y emergente lo que conlleva a mejorar la atención del paciente . RADIOINMUNOANALISIS (RIA) Consiste en le marcaje de antígenos o anticuerpos con isotopos radiactivos para la detección del Ac o Ag correspondiente en la muestra del paciente, este método presenta alta sensibilidad y especificidad donde pueden ser usadas para dosificación de hormonas, fármacos, Antígenos y Anticuerpos. Ejemplo cuantificación de hormona del crecimiento, tiroideas, testosterona, marcadores tumorales, y PSA. Estas técnicas pueden ser de tipo en Sandwich, competitivo. INMUNOFLUORESCENCIA Se utiliza para demostrar la presencia de Ag o Acs específicos buscando visualizar la unión Ag-Ac con la ayuda de sustancias fluorescentes (isotiocianato de fluoresceína). Se utilizan dos variantes: directa e indirecta, las cuales permiten detectar Chlamydia tracomatis, y Bordetella pertusis, Acs antinucleares, antimitocondriales.

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ANALISIS INMUNOENZIMATICO (ELISA) Esta técnica dispone de un gran número de Acs monoclonales al desarrollo de Ags recombinantes específicos, para muchas enfermedades infecciosas y autoinmunes. Han tomado el lugar del radioinmunoanálisis ofreciendo una sensibilidad comparable, sin los problemas de disponibilidad y corta vida media asociada con materiales radioactivos aparte de la contaminación con estas sustancias, estas pruebas tienen la ventaja de permitir procesar un gran número de muestras en corto tiempo determinando la concentración de un Ag o Ac por medio del uso de uno de ellos en fase solida y el otro en solución, detectándose posteriormente el complejo Ag- Ac mediante una enzima catalizada por un sustrato (fosfatasa alcalina, peroxidasa, glucosa oxidasa ). Existen diversos tipos de ELISA: Análisis inmunoenzimatico indirecto, competitivo. NEFELOMETRIA Esta técnica se basa en la detección de los complejos Ag-Ac, por la refracción que dichos complejos producen sobre rayos de luz que se hacen pasar por el tubo con el antígeno y el anticuerpo correspondiente. Habitualmente se utilizan rayos láser y se establece una relación entre la cantidad de luz que llega y la cantidad de complejos formados. INMUNODIFUSION Es la detección de complejos inmunes antígeno-anticuerpo visualizado por precipitación en una placa de agar pueden ser sencillas o dobles. FIJACION DE COMPLEMENTO Permite detectar una gran variedad de anticuerpos, el suero del paciente es sometido a diluciones a las que se le agrega cantidades constantes del antígeno correspondiente si hay presencia de anticuerpos en el suero se presenta la formación de complejos inmunes. Al adicionar complemento ala reacción dichos complejos fijan el complemento y lo consumen. Como paso final se agregan a la reacción glóbulos rojos de carnero sensibilizados con un Anticuerpo específico (hemolisina). Que requiere del complemento para producir lisis celular CITOMETRIA DE FLUJO Es un método que permite la determinación simultanea de múltiples características físicas de una célula, mientras pasan a través del instrumento de medición formando una sola fila a una velocidad de 5004000 células por segundo permitiendo estimar el tamaño de la célula las características de su superficie y citoplasma y su contenido de DNA. RADIOINMUNOELECTROFORESIS Es desarrollada usando antígenos o haptenos marcados con radioisótopos para la investigación de anticuerpos. El suero en ensayo es recorrido por una capa de gel en la canaleta longitudinal se coloca una mezcla de antígeno radioactivo y antisuero contra la fracción globulìnica del suero en ensayo. El antígeno se combina con el anticuerpo específico formando complejos que luego son precipitados por el suero antigammaglobulina. Después el precipitado es lavado para eliminar las proteínas no precipitadas, el preparado es secado y previa coloración o

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sin ella las placas son puestas en contacto con una película sensible a rayos X. después de la exposición conveniente la película es revelada. WESTERN-BLOT Esta técnica es de gran ayuda en la identificación de muchos autoanticuerpos que reaccionan con complejos antigénicos relacionados, y que por fluorescencia dan patrones de tinción muy similares difíciles de diferenciar , comienza con la degradación del DNA a través de una electroforesis en el cual se evidencian las bandas luego se transfieren a una membrana de nitrocelulosa o nailon agregando sondas marcadas con fluorocromos la cual es complementaria a la secuencia evidenciándose a través de rayos x. CONSULTA. 1.- Defina que es la inmunoquimica? 2.- defina que es un anticuerpo, antígeno, precipitar y aglutinar. 3.- que son anticuerpos monoclonales y policlonales.de ejemplo de cada uno de ellos. 4.- defina hemoaglutinación directa e indirecta y de ejemplos.

Práctica 03 Medio de cultivo OBJETIVOS GENERALES: Reconocer los diferentes medios de cultivo existentes para el crecimiento de microorganismos y aplicar los conceptos básicos de el diagnostico microbiológico (coloraciones, aislamiento, e identificación bacteriana). OBJETIVOS ESPECIFICOS Conocer las coloraciones más utilizadas en microbiología. Analizar la definición, clasificación y propiedades de los medios de cultivo. Determinar la descripción microscópica de las bacterias. MARCO TEORICO. Como todos los organismos vivos, microorganismos requieren ciertos nutrientes básicos y factores físicos para el mantenimiento de su vida, estas necesidades varían según el tipo de microorganismo y es necesario conocerlas para cultivarlos en el laboratorio.las necesidades nutricionales básicas pueden suministrarse en el laboratorio por la variedad de medios de cultivo; estos en general suministran: 1) Fuente de carbono 2) Fuente de nitrógeno

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3) Elementos no metálicos 4) Elementos metálicos 5) Vitaminas 6) Agua 7) Energía Las necesidades físicas involucran factores como la temperatura, PH, gases los cuales se encuentran en un rango óptimo especifico para cada microorganismo generando una variación que acelere o disminuya su crecimiento. De manera general estos medios pueden ser artificiales o químicamente definidos en el cual los microorganismos toman sus requerimientos nutricionales a partir de la composición de estos medios. Medios de cultivo Es una solución acuosa en las que están presentes todas las sustancias necesarias para el crecimiento de un determinado microorganismo. PROPIEDADES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO La humedad: indispensable para el crecimiento de microorganismos, su carencia (desecación) puede llevar a la muerte del microorganismo. Fertilidad: Se refiere a los elementos o compuestos básicos que permiten el crecimiento bacteriano. PH: Es la condición optima para el desarrollo bacteriano indispensable para su aislamiento; variaciones acidas ó alcalinas pueden inhibir su crecimiento. Transparencia: Permite la observación bacteriológica, evidenciar morfológica y físicamente su crecimiento en medios de cultivo adecuado. CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVOS SEGÚN SU ESTADO FISICO    

Sólidos = 1.5-2.0 % de agar-agar. Semisólidos = 0.5% de agar-agar. Líquidos = no contienen agar. Bifásicos = Contienen fase solida y fase liquida/ listos para utilizar.

SEGÚN SU NATURALEZA O COMPOSICION   

Naturales = utilizados para cultivar m.o tal y como se encuentran en la naturaleza, se usan con base a la experiencia y no a su composición. Ej. sangre diluida, leche, jugos vegetales. Sintéticos = de composición exactamente conocida. Los más utilizados son los medios deshidratados comerciales. Vivos = contienen células u organismos vivos, como las células de riñón de mono o huevos embrionados.

SEGÚN SU PROPOSITO 

Medios enriquecidos = Con adición de sangre, suero o extractos de tejidos de animales o plantas al caldo o agar, proporcionando

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sustancias nutritivas complementarias para el crecimiento de m.o exigentes. Medios selectivos = con adición de algunas sustancias que no permiten el desarrollo de un grupo de m.o sin afectar el desarrollo de los grupos de interés. En principio se pueden seleccionar los m.o que se desarrollan en medios orgánicos poco comunes, caso en el cual se omiten otros compuestos de carbono. Medios diferenciales = contienen reactivos químicos que traen como resultado determinado tipo de crecimiento bacteriano después de la incubación (observación de hemolisis y coloraciones de las colonias). Medios para identificación = para determinar el tipo de crecimiento producido por los microorganismos así como la capacidad para producir cambios químicos, se utiliza de manera convencional una amplia variedad de medios de cultivo.

Existen medios que pueden cumplir funciones mixtas en la cual favorece el aislamiento del microorganismo y muestra una reacción o cambio químico especifico del metabolismo cumpliendo una función de medios selectivos y diferenciales al tiempo. La presentación comercial de los medios sintéticos y deshidratados puede ser en polvo o granulados. En l mercado se pueden encontrar medios listos para fundir o medios servidos en placas Petri o tubos. ALMACENAMIENTO Y CONSERVACION. Los medios de cultivo deshidratados se deben conservar en un lugar seco, protegidos contra la luz, a una temperatura entre 15-30 C y en envase bien cerrados. Después de haber sido retirada una cantidad de medio en los envases, estos debes cerrarse firmemente. Los medios de cultivo preparados y esterilizados listos para su uso son utilizables por tiempos cortos, máximo de una semana y lo más conveniente es almacenarlos a temperatura de refrigeración (máximo 4 C), aunque algunos medios que contienen tioglicolato se conservan mejor a temperatura ambiente, y protegidos de la luz por un tiempo máximo de 4 días. Bajo condiciones óptimas de almacenamiento los medios deshidratados conservan sus cualidades el tiempo indicado de caducidad impreso en la etiqueta del recipiente. A los medios de cultivos se les realiza Test de esterilidad, ya sea cuando están deshidratado (ecomètrico), o preparados. En el último caso se toma del lote una muestra no inferior al 5% incubándose estas muestras a 37C/24 horas. Finalizado el tiempo de incubación se observa si presenta crecimiento microbiano con el fin de descartar los medios contaminados. PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO 1.-DISOLUCION DEL MEDIO DE CULTIVO DESHIDRATADO. Se debe emplear agua limpia, recién destilada o desmineralizada y con pH lo mas cercano posible al neutro. Los recipientes a usar deben ser lo suficientemente grandes para que el medio sea agitado con facilidad.

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Inicialmente, se añade la mitad de agua y se agita y se agita suficientemente para conseguir una suspensión homogénea; después se incorpora la cantidad de agua restante. Todo tipo de medio de cultivo es sensible al calentamiento, no debe calentarse más de lo estrictamente necesario. Leer siempre la etiqueta del envase, en caso de que no deba ser sometido a esterilización en autoclave, es imprescindible prestar atención en su disolución completa, esto se conforma cuando al agitar no se adhiere a la pared interna del recipiente ninguna partícula de agar o medio y la solución resbala libremente. 2.- ESTERILIZACION Antes de su esterilización y después de su completa disolución se debe repetir el medio de cultivo en los recipientes definitivos o en los que se lleva a cabo el trabajo de investigación, excepto si corresponde a cajas de Petri. La esterilización, si así lo indica la etiqueta, se lleva a cabo en el autoclave 121 ºC a 15 libras de presión por 15 minutos. Tras la esterilización y después de haber alcanzado el equilibrio de presiones (válvula abierta) y para evitar la sobrecarga térmica del medio de cultivo, este debe sacarse enseguida del autoclave y enfriar los recipientes rápidamente a temperatura de vertido entre 45-50C, evitando la alteración del medio de cultivo. 3.-VERTIDO EN PLACA. Remover previamente el medio de cultivo oscilando el recipiente en sentido circular para entremezclarlo de manera uniforme. Verter el medio a las cajas de Petri a la temperatura de vertido evitando la formación de humedad en la tapa de la caja de Petri. Las burbujas de aire en la superficie de la placa se eliminan abanicando brevemente con la llama no luminosa de un mechero de bunsen. 4.-TUBOS DE AGAR INCLINADO Y SIN INCLINADO. Los tubos llenos de medio de cultivo esterilizado, todavía líquido, se colocan en una posición inclinada de tal forma que se forme una placa de aproximadamente 3cm y una superficie inclinada de iguales dimensiones. (Agar inclinado en pico de flauta). En los casos en los cuales se requiere el medio sin inclina, estos deben dejarse solidificar en posición vertical sobre una gradilla. POSIBLES DEFECTOS EN LA MANIPULACION Y PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO 

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Apelmazamiento de los medios de cultivo deshidratados. Se debe a una conservación en ambiente exclusivamente húmedo, puede ser la causa de envase abierto por tiempo prolongado o dejar mal cerrado el envase después de su uso o por ultimo que el medio de cultivo este pasado de fecha. Se recomienda después de usarlos, cerrarlos muy bien y almacenarlos en posición horizontal. Desviación del pH causado por utilización de agua no neutra, envase mal cerrado, sobrecalentamiento del medio de cultivo durante su preparación o medio pasado de fecha.

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Turbidez, precipitación causada por uso de recipientes incorrectamente limpios, sobrecalentamiento, pérdida de agua por evaporación del medio. Escasa estabilidad del gel. Debido a la proporción inadecuada del medio de cultivo deshidratado, mala disolución, ineficiencia en la agitación. Medios de cultivo contaminados por esterilización deficiente o contaminación en su preparación. Colonias incorrectas o desleídas causada por superficie del medio húmeda y por demasiado inoculo en la siembra.

CLASES DE MEDIO DE CULTIVO MEDIOS SIMPLES Son aquellos que poseen los componentes mínimos para que pueda producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio más conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar común, que resulta de la adición de agar al caldo nutritivo.  Agar nutritivo = contiene extracto de carne, peptona, agar.  Caldo nutritivo = contiene extracto acuoso de carne adicionado de peptona al 1% y cloruro de sodio al 0.5% EJ. BHI (brain heart infusión), TSB (caldo de soya tripticasa).  Blood Agar base o Trypticasa soya Agar = medio solido que contiene peptona, enriquecido con sangre desfibrinada de conejo al 7% usando para el desarrollo de todo tipo de bacterias y especialmente para observar la actividad hemolítica. MEDIOS ENRIQUECIDOS Son aquellos que, además de las sustancias nutritivas normales, incorporan una serie de factores indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se hace por adición de sangre u otros productos biológicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis, etc.) que aportan dichos factores. En ocasiones es posible añadir suplementos artificiales a los medios para producir un enriquecimiento del mismo (p. ej. Polivitex, Isovitalex, etc)El gonococo, por ejemplo, necesita cistina y cisteína para su crecimiento. Estas sustancias son aportadas por la sangre calentada adicionada al medio de cultivo (agar chocolate).  

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Agar sangre = al medio Blood agar sangre se le añade sangre de conejo desfibrinada al 7 % estéril cuando este tenga una temperatura de 45C luego de su esterilización. Agar chocolate = consiste en un agar sangre que antes de su solidificación se lleva a 100C por 1 minuto (ebullición) rompiendo los glóbulos rojos tomando un color marrón. Se usa para el aislamiento de Haemophillus y Neisseria. Medio Tioglicolato = permite el aislamiento de aerobios tolerante y anaeróbicos. Debe conservarse en la oscuridad, en tubos tapa rosca, de manera que la anaerobiosis se mantenga en el fondo y la aerobiosis en la superficie.

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MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALES Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias contenidas en una población polimicrobiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una población microbiana específica. Un ejemplo de medio selectivo es el caldo selenito, que se utiliza para favorecer el crecimiento de salmonellas y frenar el del resto de enterobacterias. Medios diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia características bioquímicas que ayuden a diferenciar géneros o especies. La adición de un azúcar fermentable o un sustrato metabolizable se utilizan para este fin. El medio MacConkey es un medio diferencial porque permite distinguir los gérmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen. También lo son el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa -), el agar sangre (tipo de hemólisis), el SS (que es doblemente diferencial), etc.  Agar Mac Conkey = medio selectivo para el crecimiento de enterobacterias. Contiene peptona, sales biliares, lactosa, y rojo neutro.  Agar SS = contiene sales biliares en mayor concentración que el Agar Mac Conkey y verde brillante que impide el crecimiento de bacterias coliformes pero permite el crecimiento de Salmonella y Shigella.  Agar EMB (eosina azul de metileno) = contiene colorante que impide el crecimiento de bacterias Gram positivas, las colonias de E. coli generan un brillo metálico característico. MEDIO DE TELURITO Permite el crecimiento de Corynebacterias, Staphylococcus, Listeria. El telurito de potasio al 2% es reducido por las Corynebacterias reductoras apareciendo colonias de color gris-negro. Medio de Sabouraud = contiene dextrosa peptona o maltosa agar, pH entre 5-5.5 inhibiendo el desarrollo de microorganismos que no sean hongos. MEDIOS DE TRANSPORTE Mantienen viables los microorganismos de una muestra antes de que se procesen, las conservas evitando su multiplicación y su muerte. 

Medio de Stwart = se utiliza para transportar muestras de materiales purulentos recogidos con escobillón estéril, contiene un medio de buffer glicerinado, permitiendo el transporte de muestras de materia fecal para coprocultivos manteniendo la viabilidad de la Shigella.

MATERIALES Y EQUIPOS    

CAJAS DE PETRI TUBOS DE ENSAYO PIPETAS ERLENMEYER

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AUTOCLAVE CINTA DE ENMASCARAR GASA ALGODÓN MEDIOS DE CULTIVO DESHIDRATADOS MECHERO DE BUNSEN ESTUFA ELECTRICA BALANZA ESPATULAS AGUA DESTILADA PROBETAS PAPEL FILTRO FRASCOS TAPA AZUL 250 ML

PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO  Hacer el cálculo correspondiente para la preparación del medio de acuerdo con las indicaciones del profesor.  Medir el volumen de agua destilada según los cálculos  Teniendo en cuenta el volumen de agua que debe utilizar, hacer la relación de medio a pesar de acuerdo a lo especificado por la etiqueta del medio.  Pesar la cantidad de medio necesario de acuerdo a sus cálculos.  Mezclar el medio deshidratado con la mitad del agua, agitar suficientemente y agregar el agua restante. Llevar a ebullición si es necesario (en el caso de agares).  Esterilizar en autoclave según las indicaciones que menciones la casa comercial  Finalizada la esterilización servir asépticamente aproximadamente 15 o 20 ml del agar en la caja de petri o el volumen adecuado según el tamaño de los tubos. COLORACIONES APLICADAS EN MICROBIOLOGIA. Las bacterias o procariotas, son microorganismos unicelulares que se reproducen por fisión binaria (división simple). Muchos tienen vida libre. Contienen información genética, sistemas de producción de energía y sistemas biosintéticos necesarios para el crecimiento y reproducción. Las bacterias se presentan con una morfología definida que está determinada por su pared rígida. Se pueden presentar como esféricas, ovaladas, denominándose cocos. Si la forma es cilíndrica se denominan bacilos o bastones. Estos bastones pueden ser rectos, curvos o con forma de espiral, en este último caso les llamamos espirilos. TINCION DE GRAM La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleada en microbiología para la visualización de bacterias,

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sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose bacterias gram positivas a las bacterias que se visualizan de color moradas y bacterias gram negativas a las que se visualizan de color rosa o rojo. El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas) a través de la pared bacteriana. El lugol es un compuesto formado por I 2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual está presente para solubilizar el yodo, y actúa de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. El I 2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta. La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo I 2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen. Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fuscina. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules. La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al término del protocolo, las Gram positivas se verán azulvioláceas y las Gram negativas, se verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina).

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PROCEDIMIENTO COLORACION DE GRAM 1.-Agregar reactivo cristal violeta sobre la lámina durante 1 minuto, lavar y escurrir la lamina. 2.- Adicionar reactivo de lugol sobre la lámina por 1 minuto, lavar y escurrir. 3.- Adicionar alcohol cetona por 30 segundos o hasta decolorar la lamina. 4.- Agregar fuscina sobre la lámina por un minuto, lavar y escurrir. C

CULTIVO SÓLIDO

E B

CULTIVO LÍQUIDO F D

CONSULTA

Preparación y fijación de frotis.

1. ¿Por qué es necesario esterilizar los medios de cultivo y realizar controles a cada lote que se fabrica? 2. Método de esterilización utilizado para la esterilización de placas de Petri de plástico. 3. ¿Cómo puede determinar si la colonia que se eligió para aislar es un cultivo puro? 4. Escriba el fundamento de las siguientes coloraciones también aplicadas en el campo de la microbiología.  Coloración Ziehl Neelsen  GIEMSA  Tinta china.

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Práctica 04 Técnicas de Siembras y aislamientos OBJETIVOS GENERALES: Que el alumno aplique diferentes técnicas de siembra y aislamiento de cultivos de bacterias en medios sólidos. OBJETIVOS ESPECIFICOS Realizar coloración de Gram para determinar la morfología de las bacterias utilizadas y para adquirir destreza en la elaboración del frotis. MARCO TEORICO. El cultivo de microorganismos es una actividad que requiere del conocimiento de técnicas de siembra o inoculación y de aislamiento para transferirlos de un medio a otro, o mantener su crecimiento y actividad. Es indispensable para realizar diversos estudios morfológicos, de identificación, bioquímicos, de patogenicidad y ecológicos, entre otros. El proceso de colocar las bacterias en medios de cultivo recibe el nombre de SIEMBRA, esta la podemos realizar a partir de muestras biológicas (orina, pues, secreciones, etc.), o de un cultivo bacteriano a otro denominado subcultivo o repique. Para el estudio de las bacterias es necesario conocer tanto su morfología microscópica como macroscópica a partir de su crecimiento en medios de cultivos; estas se observan en las colonias bacterianas; se puede evaluar el comportamiento de ellas frente a los diferentes compuestos nutritivos o proporcionales a aquellos nutrientes que favorezcan su desarrollo. Los elementos importantes para realizar la siembra son: el mechero, asa bacteriológica y los medios de cultivo incubados y atemperados a 37C en la incubadora, contando con estos implementos podemos realizar la siembra. TIPOS DE SIEMBRA. SIEMBRA POR AGOTAMIENTO EN CAJA DE PETRI. Mediante ella se busca obtener colonias separadas a partir de un inoculo para ello se toma con el asa previamente esterilizado al mechero. La muestra; se coloca en un área periférica de la caja de petri haciendo movimientos circulares para homogenizar el inoculo, precediéndose a usar estrías horizontales con el asa de argolla hasta la mitad o una tercera parte de la caja de petri. Recordar la constitución del medio, por lo tanto, deslizar el asa con suavidad y sin romper el agar. Gire la caja de petri hacia la izquierda y realizar el mismo procedimiento hasta lograr el objetivo final.

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SIEMBRA EN TUBO INCLINADO. Para la siembra en tubos con medio solido inclinado en bicel, se realiza movimiento en zic-zac deslizando el asa sobre la superficie y marcando surcos o estrias. Para este tipo de siembras aunque se puedan utilizar los dos tipos de asa bacteriológicas se prefiere el asa recta. Es importante mantener siempre el tubo inclinado para evitar contaminación por bacterias ambientales que proceden de la muestra. Los tapones de algodón o las tapas roscas de los tubos deben manipularse con el dedo meñique y anular de la mano derecha y nunca dejarlo sobre los mesones, ellos pueden contaminar la siembra. Es importante flamear el asa antes de tomar la muestra, y flamear la boca del tubo, no tocar las paredes del tubo con la muestra y devolver el asa a su lugar previamente esterilizada después de haber realizado el procedimiento. SIEMBRA POR PICADURA EN TUBO. Se realiza con el asa recta en medio solido generalmente sin inclinar aunque puede ser en agar inclinado en algunas ocasiones. Se introduce el asa con el inoculo por el centro de la superficie del medio de cultivo y hasta el fondo. No olvidar inclinar el tubo, flamear la boca junto al mechero y manipular correctamente los tapones.

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SIEMBRA MIXTA EN TUBO. Se realiza en forma combinada en picadura hasta el fondo del tubo y deslizando el asa por la superficie del agar en bisel marcando estrías. SIEMBRA EN MEDIO LIQUIDO EN TUBO. Se puede utilizar el asa bacteriológica, pipetas estériles, escobillones. Si se utilizan asas bacteriológicas, inocular el asa en el medio liquido haciéndola rotar. Se debe marcar las cajas los tubos con sus respectivos nombres y fechas. Luego de realizar la siembra se debe proporcionar la temperatura y el tiempo adecuado para la proliferación o crecimiento bacteriano disponiendo de la incubadora o en dado caso un lugar adecuado a temperatura ambiente. Recuerda que las cajas de petri se incuban invertidas para evitar que la condensación que pueda formarse en la tapa de la caja caiga sobre el medio y disperse el crecimiento bacteriano. La morfología de las colonias es un parámetro importante en el proceso de identificación bacteriana siendo las características comunes entre cada género bacteriano. Sin embargo esta morfología puede alterarse por tiempo de incubación, composición del medio de cultivo excesiva desecación de humedad etc. OBSERVACION MACROSCOPICA DE CRECIMIENTO BACTERIANO. Se realiza a través de las características de las colonias aisladas, evaluándose de la siguiente manera: Tamaño= grande, mediano, pequeño, puntiforme. REDONDEADO

ESPICULADO

PLANA

ACUMINADA

PUNTIFIORME

IRREGULAR

ONDULADO

FILAMENTOSO

PLANO CONVEXA

UMBONADA

CIRCULAR

RIZOIDE

LOBULADO

RIZOIDE

CONVEXA

PAPILALDA

FILAMENTOSA

FUSIFORME

PLANA

ACUMINADA

REDONDEADO ESPICULADO

PUNTIFIORME

IRREGULAR

PLANO CONVEXA

UMBONADA

ONDULADO

CIRCULAR

RIZOIDE

FILAMENTOSO

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CONVEXA

PAPILALDA

Forma

LOBULADO

RIZOIDE

Borde

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FILAMENTOSA

FUSIFORME

Elevación

 Superficie = lisa o rugosa.  Consistencia = blanda, dura o mucoide.  Aspecto = brillante u opaco, traslucido.  Pigmento= amarillo, rojo, verde, etc.  hemolisis= parcial o alfa, total o beta, no hemolisis o gamma. PROCEDIMIENTO. 1.-Limpiar y desinfectar el área de trabajo. 2.- Realizar el frotis para la coloración. 3.- Sembrar por agotamiento en las respectivas cajas de medios de cultivo. 4.- Observar macroscópicamente el crecimiento bacteriano: tamaño, forma, borde, color, hemolisis. Consulta 1. ¿Cuáles son las fuentes de error más frecuentes en la preparación y fijación de frotis? 2. ¿Cuáles son las fuentes de error más frecuentes en la tinción de Gram? 3. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de la técnica de estría cruzada o por agotamiento? Proponga otras técnicas de aislamiento en medios sólidos que se aplican en microbiología. 4. fundamento de los medios de cultivo EMB, AN, MAC CONKEY Y TSI.

Práctica 05 Tipo de muestras útiles en microbiología, estructuras micóticas, hongos ambientales, toma de muestra. OBJETIVOS GENERALES: Reconocer morfológicamente las estructuras microscópicas de los diversos hongos. OBJETIVOS ESPECIFICOS Reconocer las estructuras propias de los hongos filamentosos o mohos. Conocer e identificar las diversas formas de toma de muestra y su correspondiente transporte en el área de microbiología. Observar diferentes cultivos de hongos ambientales identificar su aspecto, color y pigmento. Reconocer las estructuras de reproducción de los hongos ambientales con las cuales se pueden hacer su caracterización en el laboratorio. MARCO TEORICO. TOMA DE MUESTRAS MICROBIOLOGICAS. La calidad diagnostica del laboratorio de microbiología clínica depende de la calidad de la muestra recibida y su optima recolección y transporte, debido a que un error en estos parámetros conlleva a errores diagnósticos y un posterior tratamiento inadecuado.

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La muestra debe cumplir las siguientes indicaciones: 1.-nombre completo 2.-documento identidad 3.-género. 4.- paciente hospitalizado = piso, sala, cama. 5.- solicitud de examen 6.- impresión diagnostica. CRITERIOS DE RECHAZO DE LAS MUESTRAS  Inconsistencia en la identificación del paciente  Muestra enviada en un frasco no estéril o con conservante.  Muestras con pérdidas o derrames  Muestra con cantidad insuficiente  Muestras con evidencia de contaminación MUESTRAS PROCESADAS EN MICROBIOLOGIA. 1.-TRACTO RESPIRATORIO SUPERIOR  EXUDADO FARINGEO  CAVIDAD OROFARINGEA  SENOS PARANASALES  EXUDADO NASAL

2.- MUESTRAS DE OIDO.  CONDUTO AUDITIVO EXTERNO  OIDO MEDIO TIMPANOCENTESIS. 3.- MUESTRAS OCULARES  EXUDADO CONJUNTIVAL  RASPADOS CORNEALES 4.- MUESTRAS DEL TRACTO RESPIRATORIO INFERIOR  EXPECTORACION  ASPIRADO TRAQUEAL  SECRECIONES TRAQUEALES.  PUNCION TRANSTRAQUEAL 5.- MUESTRAS OBTENIDAS A TRAVES DEL FIBROBRONCOSCOPIO. ESTRUCTURAS MICOTICAS Los hongos ambientales son contaminantes que circulan en la atmosfera de cualquier lugar, contaminan medios de cultivo, dentro de sus beneficios participan en el control biológico de plagas, degradan desechos orgánicos, se utilizan en la producción de alimentos antibióticos y químicos.

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Dentro de su forma de condición encontramos: blastoconidias, hialinos septados, aseptados y dematiaceos.

mohos

ESTRUCTURAS SOMATICAS DE LOS MOHOS  Conidióforo  Esterigma  Vesículas  Microconidias  Metula  Esporangioforo  Esporangio  Esporangiosporas  Columnela  Rizoide  Fialides  Macroconidias. ESTRUCTURAS MICOTICAS DE LAS LEVADURAS.  BLASTOCONIDIAS. HONGOS TELEOMORFOS = reproducción sexual, se encuentran ascos con ascosporas basidios con basiodiosporas. HONGOS ANAMORFOS = REPRODUCCION ASEXUAL artroconidos, blastoconidias, clamidoconidias, dictioconidios, aleurioconidios. HONGOS HOLOMORFOS reproducción.

PERFECTOS = tienen los dos tipos de

PROCEDIMIENTO 1.- Observar y describir la morfología micótica. 2.-montaje y observación de los hongos. 3.- descripción de los elementos observados. 4. realizar subcultivos de otros cultivos micoticos en agares sólidos. CONSULTA 1. medios de cultivo utilizados para el aislamiento de hongos 2. Técnicas de laboratorio utilizadas para la identificación de hongos 3. mencione 5 hongos ambientales (género y especie) y dibuje su estructura clave de identificación.

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Práctica 06 Protozoos intestinales, coprológico, coproscópico OBJETIVOS GENERALES: Identificar la morfología de los diversos parásitos que causan alteraciones intestinales en el organismo. OBJETIVOS ESPECIFICOS Reconocer los equipos, materiales, reactivos que se utilizan en el laboratorio de parasitología, y recordar los principios fundamentales de trabajo en el laboratorio. Describir las características macroscópicas y microscópicas de las muestras de materia fecal utilizadas en el coprológico. Visualizar e identificas estructuras parasitarias en el microscopio. MARCO TEORICO. El diagnostico de las enfermedades parasitarias no siempre es posible hacerlo por medio de la clínica y aun cuando este sea posible, siempre es necesario comprobarlo por la demostración del agente etiológico o por la comprobación de las reacciones que puede presentar el organismo parasitado. Así pues los métodos de diagnostico parasicológico en el laboratorio se puede dividir en: Métodos directos = permiten ver al parasito, o sus estructuras (quiste, huevos, larvas, trofozoito).

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Métodos indirectos = se investigan las reacciones citológicas o humorales del organismo parasitado (presencia de anticuerpos, estados alérgicos, etc.) estos métodos tienen un valor diagnostico inferior al de los métodos directos. Técnicas comunes para detectar parásitos intestinales.  Coprológico.  Coproscópico (sangre oculta-azucares reductores)  Técnicas de concentración  Ziehl neelsen modificado.  Método de Graham. INTERPRETACION DEL COPROSCOPICO: Este examen incluye, además de un examen coprológico corriente, las siguientes pruebas: leucocitos, pH y azúcares reductores. El pH fecal puede ser útil para la determinación etiológica, pH ácidos indican EDA de tipo viral y pH alcalinos indican EDA invasivas. El pH fecal está alterado en la intolerancia de los azúcares, porque la reducción de los azúcares por las bacterias en el colon produce ácido. Los micelios nos indican EDA producida por hongos (las levaduras no tienen importancia). Los azucares reductores están representados principalmente por lactosa y glucosa. Se consideran como indicadores de infecciones virales, infecciosas o indeterminadas en los niños. Interpretación: Reacción intensa cualitativa a la lactosa es compatible con diarrea bacteriana tóxica. A la glucosa, con diarrea viral. La deficiencia de discaridasa manifestada por no desdoblar la lactosa de la leche materna, da intensa reacción positiva a la lactosa. Los leucocitos están presentes en las heces en enfermedades intestinales inflamatorias, esto puede ser el resultado de una EDA bacteriana o parasitaria, es así que entre 10-20 leucocitos (principalmente polimorfonucleares) indican EDA bacterianas invasivas 24. Preparación del material a observar.  La solución salina se usa para la investigación de todos los parásitos intestinales y de sus formas derivadas (trofozoito-huevos- larvas) y en ella podemos ver sus movimientos, y realizar su respectiva caracterización. Los huevos inmóviles se ven con su morfología específica que ayudan a reconocerlos, los quistes de los protozoarios se verán refringentes, incoloros y muchas veces no es posible determinar a qué especie pertenecen.  Con el lugol, los quistes de protozoarios y los huevos se colorean detallando sus estructuras, los núcleos, flagelos, membrana, etc. Recolección. Las muestras fecales deben recogerse durante las deposiciones en un recipiente limpio, seco, de boca ancha y tapa hermética que mantenga la humedad. En el caso del Coproscópico se debe evitar comer carnes rojas, tomates, remolachas debido a que pueden ocasionar interferencias en la lectura de sangre oculta. El uso de laxantes y antibióticos debe suspenderse

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porque puede inhibir o bloquear momentáneamente la aparición de los parásitos. EXAMEN FISICO. En este examen se describen los siguientes aspectos:  Cantidad  Color  Consistencia Cantidad = normalmente se excretan aproximadamente 100gr de materia fecal en 1 día. Este varía según el estado del aparato digestivo y la ingestión de alimentos. Color = debido a la presencia de urobilina, los alimentos, medicamentos y patologías varían. Normalmente van de pardo claro a pardo oscuros, observándose a veces de color amarillo, negro, blanco, verdoso, etc. Se presentan variaciones de color por enfermedades como la hepatitis, TBC, gastritis erosivas. Consistencia = Normalmente son blandas pero moldeadas, según la consistencia se clasifican en:  Liquidas o acuosas en diarreas  Blandas  Pastosas  Duras o formadas en estreñimiento  Mucoide. Residuos alimenticios de origen animal.  Fibras musculares = tienen forma rectangular, color amarillo y estrías transversales y longitudinales. Con lugol toman color rojizo.  Grasas = gotas refringentes de diferentes tamaños amarillas o transparentes, con bordes netos de color negro y se tiñen con el lugol de amarillo claro.

Residuos alimenticios de origen vegetal.  Almidón = tienen forma irregular, en solución salina son transparentes y en el lugol se colorean, cuando están no digeridos toman un color violeta o negro y los parcialmente digeridos toman un color morado o rojo.  Células o fibras vegetales = en ocasiones se ven formando un retículo en forma de panal, las fibras, a veces, se presentan como estructuras alargadas de doble pared con un canal central marcado o en forma de espiral.  Pelos vegetales = se parecen a las larvas de algunos parásitos, pero un examen cuidadoso permite diferenciarlos con facilidad por su falta de movilidad: su pared es muy refringente y homogénea y además poseen un conducto central que recorre toda su longitud. PRODUCTOS DE IRRITACION DE LA MUCOSA INTESTINAL.

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Cuando se presentan patologías a nivel intestinal, de cualquier origen, puede observarse microscópicamente diferentes estructuras propias de la mucosa intestinal irritada, que son de gran ayuda para establecer el diagnostico de dichas patologías. Estas pueden ser:       

Células epiteliales = indican irritación solo cuando se encuentran muy aumentadas en materia fecal. Moco = cuando es abundante se aprecia a simple vista, debe confirmarse con otras estructuras como leucocitos, hematíes, etc. Bacterias = constituyen el 30% del volumen de la materia fecal son de importancia cuando se encuentran aumentadas o disminuidas. Hematíes = estructuras pequeñas, redondeadas, que solo aparecen en materia fecal cuando la lesión se halla en la parte baja del intestino, ya que se desintegran rápidamente. Leucocitos = son de mayor tamaño que los eritrocitos, en ocasiones es posible observar su núcleo. Generalmente están asociados con moco y son de ayuda para diferenciar el tipo de diarrea. Levaduras y micelios = normalmente se observan algunas levaduras en las muestras de materia fecal presentan forma ovalada cuando están aumentadas presentan importancia clínica. Blastocystis hominis = presenta un corpúsculo interno homogéneo o finalmente granuloso y un citoplasma granular rodeado de una capsula delgada con núcleos alrededor de la periferia.

Protozoos = son organismos unicelulares en forma y tamaño variable, poseen diferentes organelos de locomoción, flagelos, cilios, y pseudópodos. Los protozoos existen en dos formas: la vegetativa o trofozoito que es la forma patógena y la quística o quiste que es la forma infectante. Los quistes son resistentes y sobreviven en el medio a condiciones adversas. Entamoeba histolytica. Este protozoo presenta 4 estadios: trofozoito, prequiste, metaquiste, quiste, puede causar abscesos hepáticos. Trofozoito = se observa en materias fecales frescas es la forma móvil de la amiba, tamaño de 20-60 micras. Ectoplasma y endoplasma claramente separados. Ectoplasma = hialino, transparente, refringente. Endoplasma = granuloso Pseudópodos = se originan en el ectoplasma, son delgados, digitiformes y rápidos, tienen movimiento unidireccional. Fagocitan glóbulos rojos. Quiste = es la forma mas frecuente utilizada para hacer el diagnostico de amibiasis, se observan mejor en lugol. Forma = redondeada, bien delimitada por la membrana. Tamaño = 10-20 um Núcleos = de 1-4 Amebas no patógenas.

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Entamoeba coli = mide de 15-50 micras, con pseudópodos gruesos, cortos, y emergen de manera lenta, fagocitan bacterias y otros materiales nunca glóbulos rojos. Trofozoito = se observa en materia fecales frescas son muy lábiles a los agentes externos, es la única forma móvil de la ameba. Quiste = es de forma redondeada, de 10-30 micras, de 1-8 núcleos. Endolimax nana. Los trofozoitos son muy pequeños miden de 6-26 micras, fagocita bacterias y nunca glóbulos rojos, el núcleo no presenta cromatina periférica y el cariosoma es grande irregular y colocado excéntricamente en su interior. Tiene una forma oval y elipsoide presenta de 1-4 núcleos membrana poco aparente y tiene una coloración más pálida que las otras amebas. Iodamoeba bustchlii. Presenta dos estadios: trofozoito y quiste presenta una vacuola de glucógeno la cual se tiñe de oscuro y presenta sus contornos bien definidos mide de 10-20 micras. Giardia lamblia = se asocia a cuadros diarreicos en niños y menos frecuente en adultos, el trofozoito tiene 8 flagelos y una ventosa centras con la que se fija a la mucosa. Chilomastix mesnili = habitante normal del ciego, en donde los trofozoitos viven a expensas de bacterias entéricas y se multiplica por fisión binaria. MATERIALES  Lugol parasitológico  Solución salina fisiológica  Microscopios  Laminas y laminillas  Marcador vidrio  Cajas de palillos  Jabón liquido  Gasas PROCEDIMIENTO    

Cada estudiante debe realizar el informe completo del examen físico de la muestra suministrada. Hacer las preparaciones en fresco de la materia fecal. Observar al microscopio y diferenciar restos de origen animal y vegetal, flora bacteriana, presencia o ausencia de parásitos intestinales. Consignar en el cuaderno de informes lo visto en la práctica, haciendo gráficos de lo observado.

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CONSULTA 1) ¿A que se le llama Periodo de invasión parasitaria? 2) Examen de guayacol en heces explicar metodología e interpretación clínica. 3) Nombre las amebas que pueden producir disentería? 4) Explique cómo se realiza el test de Graham.

Práctica 07 Morfología bacteriana Cocos Gram Positivos OBJETIVOS GENERALES: Diferenciar el género Staphylococcus de Streptococcus, y determinar la capacidad de las bacterias para producir enzimas que degradan moléculas, invaden tejidos, colonizar o evadir sistemas de defensa de hospederos. OBJETIVOS ESPECIFICOS Identificar algunas enzimas producidas por bacterias realizando pruebas in vitro. Interpretar y reportar las reacciones bioquímicas que ocurren en cada prueba de forma tal que se articulen a esquemas para identificación bacteriana. Observar morfología macroscópica y microscópica de Staphylococcus y Streptococcus. Realizar las pruebas de coagulasa, catalasa. MARCO TEORICO. Genero Staphylococcus. Formado por organismos patógenos y no patógenos, comprende cocos gran positivos agrupados irregularmente, mesofilicos no formadores de esporas generalmente resistentes a desecación especialmente en materia orgánica como sangre, pues y fluidos, pueden sobrevivir fuera del cuerpo humano hasta por varios meses. Son microbiota de la piel y las mucosas del tracto respiratorio superior, tienen importancia medica: Staphylococcus aureus, S. epidemidis, S saprophyticus. Crecen con facilidad en medios líquidos como caldo nutritivo y BHI, y medios solidos como agar sangre, nutritivo y agar chocolate. Se necesita una incubación de 18-24H para un crecimiento optimo en atmosfera de aerobiosis se recomienda dejar hasta 96H los cultivos de muestras clínicas cuando hay presencia de pacientes con terapia antibiótica. El Staphylococcus aureus puede presentar hemolisis en agar sangre lo cual demuestra la actividad metabólica por la producción de hemolisinas. Ciertas características metabólicas nos permiten identificar el género (catalasa) y la especie (coagulasa).

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Los estafilococos que se desarrollan en aerobiosis producen la enzima catalasa, para no obtener falsos positivos la prueba de catalasa no se debe realizar en colonias que crecen en agar sangre porque los glóbulos rojos presentan esta enzima. La identificación de los estafilococos esta basada en sus características macroscópicas y microscópicas, producción de enzima como la catalasa, coagulasa, DNAsa y fermentación del manitol, donde esta ultima permite diferenciar especies de S. aureus que utilizan esta fuente de carbohidratos. Streptococcus sp. Son gran positivos no esporulados catalasa, oxidasa negativo, con temperatura optima de crecimiento de 37 grados, colonias puntiformes circulares, de translucidas a opacas, con requerimientos nutricionales exigentes los cuales son ofrecidos por el agar sangre al 5% permitiendo evidenciar la producción de hemolisinas. Son anaerobios facultativos creciendo en atmosfera de dióxido de carbono en una concentración entre el 5-10%. Los estreptococos se pueden clasificar principalmente por dos puntos de vista: 1) Según su hemolisis a) Alfa hemolisis = hemolisis incompleta, una zona verdosa alrededor de la colonia a este pertenecen Streptococcus viridans, Streptococcus pneumoniae. b) Beta hemolisis = destrucción completa de los glóbulos rojos y a estos pertenecen Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae. c) Gamma hemolisis = no presentan hemolisis alrededor de las colonias. PRUEBAS PRESUNTIVAS DE BETAHEMOLITICOS. 1) Prueba de susceptibilidad a la bacitracina 2) Resistencia al trimetopin sulfa (SXT) 3) Prueba d CAMP. 4) Determinación de polisacárido de grupo.

IDENTIFICACION

PARA

PRUEBAS PRESUNTIVAS DE IDENTIFICACION ALFA HEMOLITICOS. 1) Prueba de Optoquina. PRUEBAS CONFIRMATORIAS PARA STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE 1) Solubilidad en bilis. 2) Fermentación de la inulina. PRUEBAS PRESUNTIVAS DE IDENTIFICACION GAMMA HEMOLITICO. 1) Prueba de hidrólisis de la bilis esculina 2) Prueba de tolerancia al NACL al 6.5%. MATERIALES Y EQUIPOS. Laminas portaobjetos (estudiante) Cubreobjetos (estudiante) Asas bacteriológicas (estudiante) Palillos de dientes (estudiante)

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Cepas: Staphylococcus sp, Streptococcus sp. Agar sangre, Agar nutritivo, Agar manitol. Solución salina al 0.9%. PROCEDIMIENTO. A partir de las cepas de Staphylococcus sp realice: 1) Pruebas catalasa 2) Pruebas coagulasa 3) Coloración de gran 4) Siembras en agar sangre y salado manitol. A partir de cepas de Streptococcus sp realice: 1) Siembra en agar sangre 2) Coloración de gran 3) Prueba de catalasa 4) Pruebas confirmatorias según la hemolisis. CONSULTA 1) Investigue la utilidad del medio salado manitol. 2) Metodología e interpretación clínica de la prueba de CAMP 3) Metodología e interpretación clínica de la prueba DNAsa.

Práctica 08 Enterobacterias, Antibiograma Elaborado por: Dra. María Victoria Figueroa Ramírez Dra. Claudia Rocío Chia Argote

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OBJETIVOS GENERALES: Identificar los géneros más representativos de la familia enterobacteriaceae, por observación de sus características macroscópicas, microscópicas y bioquímicas. OBJETIVOS ESPECIFICOS Realizar pruebas bioquímicas en diferentes géneros de Enterobacterias para llevar a una identificación según sea su metabolismo. Determinar la aplicación de los medios de identificación bioquímica. Identificar la clasificación de los antibióticos y el mecanismo de acción en la célula bacteriana. Conocer el fundamento de la técnica de antibiograma de difusión en agar. MARCO TEORICO. La familia enterobacteriaceae está formada por bacilos gram negativos pleomorficos no esporulados aerobios o anaerobios facultativos, fermentan la glucosa con o sin producción de gas, reducen nitratos a nitritos, oxidasa negativo, catalasa positiva, muchos son patógenos para seres humanos, animales o plantas. Su papel como microbiota normal del intestino grueso es el de la síntesis de vitamina k ayudando a la absorción de nutrientes y el de la defensa contra la colonización de otros microorganismos, dependiendo esta de la competencia por nutrientes esenciales de la elaboración activa de sustancias bactericidas y de ácidos grasos de cadena corta, su hábitat es el intestino de allí su nombre, pueden estar presentes en faringe, genitales externos, suelo y agua. Pueden ser divididas en serotipos con base en el análisis antigénico por reacciones de aglutinación o precipitación de tres antígenos, somático O, flagelar H y capsular K. IDENTIFICACION. Las Enterobacterias pueden ser bacilos muy cortos de tamaño medio, cortos o muy largo, depende de la edad del cultivo y de las condiciones de crecimiento. Son muy fáciles de cultivar, se observan una variedad de colonias dependiendo el género y especie a identificar. Para su identificación se emplean medios de cultivo que según su aplicación pueden ser:  Escasa selectividad = Mac Conkey, Eosina Azul de Metileno (EMB),  Moderadamente selectivos = Agar Salmonella-Shigella, Hecktoen Enteric (HE), Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD).  Altamente selectivos = Bismuto Sulfito. PRUEBAS BIOQUIMICAS Posterior al aislamiento en medios diferenciales y selectivos se debe realizar identificación basada en la fermentación de carbohidratos, descarboxilacion o desaminacion de aminoácidos, producción de ciertos metabolitos como el H2S, La utilización de determinados sustratos como única fuente de carbono como el citrato de sodio y la movilidad.

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ANTIBIOGRAMA Es una prueba In Vitro de sensibilidad a los antibióticos cuya finalidad es la orientación médica sobre la sensibilidad o resistencia a un antibiótico de un microorganismo que ha sido aislado de una muestra clínica. SELECCIÓN DE LOS ANTIBIOTICOS De acuerdo a la localización del proceso infeccioso o según el tipo de microorganismo se debe seleccionar el antibiótico a utilizar. En el caso de infecciones urinarias, siempre se deben seleccionar los siguientes antibióticos, trátese de gérmenes Gram positivos o Gram negativos:  Nitrofurantoina  Acido Nalidixico.  Acido Pipemidico.  Norfloxacina.  Acido oxolinico. Estos antibacterianos se utilizan exclusivamente sobre patógenos de vías urinarias ya que solo se concentran adecuadamente a dicho nivel, son conocidos como ANTISEPTICOS URINARIOS. Además de los antisépticos urinarios en los pacientes con cistitis o pielonefritis, se deben incluir los siguientes antimicrobianos.  Trimetopin sulfa  Ampicilina  Aminoglucosidos.  Cefalosporinas de segunda y tercera generación. No incluir discos de tetraciclina y cloranfenicol porque son poco eficaces en la patología urinaria, tampoco incluir penicilinas naturales ni Cefalosporinas de primera generación porque no presentan actividad bactericida contra Enterobacterias que son los gérmenes más comunes e procesos de infección urinaria. Los antibióticos mas utilizados en infecciones de vías urinarias son los Aminoglucosidos, donde se destacan:  Gentamicina  Kanamicina  Amikacina  Netromicina  Streptomicina.  Netilmicina. 

Las Cefalosporinas son betalactamicos que se clasifican en: o Primera generación = cefazolina, cefalotina, cefaclor, cefadroxil, y cefradina. o Segunda generación = cefurozima, cefamandol.

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o o

Tercera generación = cefotaxima, cefoperazona. Cuarta generación = cefepima.

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ceftazidima,

ceftriaxona,

Para la infección de Pseudomona se utiliza independiente de su localización, siempre: Aminoglucosidos, Cefalosporinas de tercera generación (ceftazidima) y una penicilina antipseudomona también llamada ureidopenicilina (como la piperacilina y la combinación de piperacilina y el tazobactam), Cefalosporinas de cuarta generación como el meropenem y imipenem (carbapenem). Cuando se trata de un Staphylococcus nunca debe faltar en el antibiograma una penicilina resistente a la penicilinasa, ejm: oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, Cefalosporinas de primera generación: cefazolina, Aminoglucosidos como Gentamicina y Amikacina. La vancomicina y la teicoplanina (glucopeptidos) son absolutamente necesarios porque son antibióticos de elección porque se utilizan en casos de Staphylococcus aureus meticilino resistentes y se debe utilizar linezolid, daptomicina para las cepas de Staphylococcus aureus resistentes a la vancomicina. En infección por otras bacterias gram positivas debe colocarse penicilina G y eritromicina. En el caso de Salmonella se debe utilizar cloranfenicol, trimetopin sulfa, ampicilina, ciprofloxacina, además el ceftriazone. METODOS DE REALIZACION DE ANTIBIOGRAMA. 1) ANTIBIOGRAMA POR DILUCIÓN = permite cuantificar la sensibilidad del microorganismo frente a diferentes concentraciones de antibiótico determinando la concentración mínima que inhibe el crecimiento bacteriano (CMI). Es importante en procesos infecciosos donde se hace necesario un esquema de dosificación y cuando los resultados del antibiograma en difusión son de dudosa interpretación. 2) ANTIBIOGRAMA POR DIFUSION EN AGAR. Se conoce como antibiograma de disco, procedimiento estandarizado para bacterias comúnmente aisladas y de crecimiento rápido como Enterobacterias y Staphylococcus. MATERIALES Y METODOS.  Asas bacteriológicas redonda y recta.  Coloración de gram  Fósforos  Gradillas  Portaobjetos  Cubreobjetos  Solución salina 0.9%  Lápiz marcador. PROCEDIMIENTO PARA EL PRIMER DIA.

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1) 2) 3) 4)

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Observación y descripción de la morfología de las colonias. Realizar coloración de gram y observar morfología microscópica. Repicar la cepa en los medios de cultivo. Incubar a 37º durante 24 horas.

PROCEDIMIENTO PARA EL SEGUNDO DIA. 1) Observar y describir el aspecto de las colonias en los diferentes medios de cultivo. 2) Revelar, leer e interpretar las pruebas de identificación bioquímica. 3) Identificar género y especie de la cepa. .

RECUERDA AL INFORMAR UNA COLORACION DE GRAM SE DEBE ESCRIBIR LA MORFOLOGIA Y EL TIPO DE TINCION. NO OLVIDAR QUE LOS NOMBRES DE LAS BACTERIAS SE ESCRIBEN SIGUIENDO LAS NORMAS PREESTABLECIDAS. CONSULTA 1) Fundamento de la técnica de Kirby Bauer. 2) En que casos no se deben hacer un antibiograma? 3) Nombre otras técnicas utilizadas para la realización de los antibiogramas. 4) ¿Cuál es la técnica más utilizada en la actualidad para la realización de los antibiogramas y porque?

Práctica 09 Tuberculosis OBJETIVOS GENERALES: Conocer las condiciones para la recolección de muestras en el diagnostico de tuberculosis. OBJETIVOS ESPECIFICOS Conocer los protocolos para el diagnostico de tuberculosis pulmonar y extrapulmonar. Realizar leer e interpretar la baciloscopia. MARCO TEORICO. La tuberculosis es una infección bacteriana crónica, granulomatosa localizada en los pulmones afectando cualquier otro órgano del cuerpo humano. El agente causal en la gran mayoría de los casos es el Mycobacterium tuberculosis presentando características de bacilos acido alcohol resistentes, aerobios estrictos, inmóviles, no forman endosporas, de crecimiento lento con una envoltura de ácidos micolicos, son bacterias intracelulares. Es transmitida de persona a persona principalmente por vía respiratoria.

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La    

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posibilidad de invasión depende de cuatro factores: Características del enfermo. Entorno en que tiene lugar la exposición. Duración de la exposición. Susceptibilidad del receptor.

Los pulmones son los órganos principalmente afectados, sin embargo, es una enfermedad sistémica ocasionando alteraciones en diversos órganos. El derrame pleural puede ocurrir en la primo infección, liberando pequeñas cantidades de proteínas de los bacilos. La tuberculosis miliar se produce por la erosión de un vaso sanguíneo que permite la entrada al sistema circulatorio de gran cantidad de bacilos permitiendo la diseminación a numerosos órganos. Diagnostico bacteriológico Es el método que permite la confirmación de la tuberculosis activa el diagnostico se establece mediante el crecimiento e identificación del Mycobacterium tuberculosis a partir de muestras clínicas dicho estudio debe realizarse en todas las personas con sospechas de tuberculosis activa, en el cual se deben recoger tres muestras de ESPUTO especialmente en la mañana y de ser posible antes de iniciar el tratamiento antituberculoso. Otras muestras orgánicas pueden ser procesadas tales como: orina, LCR, liquido pleural, aspirado ganglionar, pus, sangre. Deben ser recogidas en envases estériles y enviadas al laboratorio lo más pronto posible o conservarlas refrigeradas a 4 grados centígrados hasta el envió. RECOLECCION DE MUESTRAS El envase debe ser desechable, estéril, de cierre hermético, boca ancha. El paciente debe recolectar la muestra de esputo por tres días consecutivos en las horas de la mañana para realizar el examen o proceso de cada día. En caso de que no pueda asistir tres días consecutivos al laboratorio deben platearse las siguientes alternativas:  Debe recolectarse la primera muestra en el momento de la consulta  La segunda al despertar al día siguiente.  La tercera en el momento de entrega de la segunda muestra. ASPIRADO GASTRICO Ideal en los casos donde no se obtiene la muestra ni siquiera en forma inducida, frecuentemente se aplica en los niños, en horas de la mañana con el paciente en posición supina y en ayunas, suele realizarse a pacientes hospitalizados. LAVADO BRONCOALVEOLAR FIBROBRONCOSCOPIA. Es utilizado para obtener una buena muestra del lavado broncoalveolar, del broncoaspirado, cepillado y biopsia transbronquial. ORINA

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Se toma de la misma forma que para urocultivo, procesando mínimos tres muestras de diferentes días. LCR Debe ser recolectado en tubo estéril con tapa rosca. LÍQUIDO PLEURAL, PERITONEAL, PERICARDICO O ARTICULAR. Se deben recolectar en frasco estéril con tapa rosca y añadirle citrato de sodio o heparina al 1% para evitar coagulación. ASPIRADO GANGIONAR, PUS, BIOPSIAS. Se transporta en tubo o frasco estéril con tapa estéril sin añadir ninguna sustancia. BACILOSCOPIA O BK Se utiliza por medio de la coloración de Ziehl Neelsen, basándose en las características de la bacteria por ser acido alcohol resistente, debido a su envoltura lipidica que impide la decoloración del alcohol acido. La muestra se recoge en un frasco de boca ancha, y con un bajalenguas partido por la mitad se procede a tomar el esputo, en el cual se extiende sobre la lámina portaobjetos previamente limpia y totalmente estéril. PROCEDIMIENTO 1.- Realizar el extendido de la muestra sobre la lámina portaobjeto con un baja lenguas partido por la mitad. 2.- Agregar fuschina fenicada por 10 minutos, flamear previamente la lamina y evitar que se seque. Lavar y escurrir. 3.- Agregar alcohol acido al 3% hasta decolorar. Lave nuevamente. 4.- Adicionar azul de metileno por 2 minutos y lave con agua de la llave. 5.- Observar al microscopio.

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MATERIALES  Laminas cubreobjetos.  Laminas portaobjetos.  Marcador de vidrio verde, azul, negro.  Papel kraf.  Bajalenguas. CONSULTA 1) Nombre otras técnicas utilizadas en la identificación de micobacterias. 2) Diga la escala de lectura del cultivo de Ogawa kudoh. 3) Criterios utilizados en el laboratorio clínico para rechazar o aceptar una muestra de esputo.

Práctica 10 Elaborado por: Dra. María Victoria Figueroa Ramírez Dra. Claudia Rocío Chia Argote

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Diagnóstico de infecciones de piel, tejidos blandos y análisis de Liquido Cefalo-raquideo OBJETIVOS GENERALES: Identificar las bacterias asociadas a cuadros infecciosos de piel y tejidos blandos y sus métodos de aislamiento. OBJETIVOS ESPECIFICOS Interpretar la lectura de la baciloscopia para el diagnostico de Lepra. Interpretar los diversos estudios que se realizan en una muestra de LCR. Conocer las diversas tomas de muestra de piel y tejidos blandos. MARCO TEORICO. 1) INFECCIONES EN PIEL Y TEJIDOS BLANDOS. A nivel de piel y estructuras adyacentes se presentan patologías variadas, todas ellas con su etiología, localización y características. Proceso infeccioso Impétigo

Localización

Características

Agentes etiológicos.

Piel

Celulitis

Tejido celular subcutáneo profundo

Vesículas pequeñas con formación de exudado no purulento; las vesículas pueden convertirse en pústulas y sobreinfectarse. Lesiones de tipo eritematoso, hiperemicas y dolorosas de bordes irregulares.

Erisipela

Tejido celular subcutáneo superficial.

Se observan placas rojas, hiperemicas, y dolorosas, de bordes elevados, y regulares, acompañadas de fiebre y escalofrío.

Forunculo sis

Afecta el folículo piloso, es de localización profunda. Vasos linfáticos a nivel subcutáneo.

Pápula enrojecida que progresa en tamaño con exudado purulento.

Streptococcus pyogenes, y en menor proporción por Staphylococcus aureus. Streptococcus pyogenes, Streptococcus beta hemolíticos de los grupos C y G en el adulto y B en el recién nacido. Streptococcus pyogenes, Streptococcus beta hemolíticos de los grupos C y G en el adulto y B en el recién nacido. Staphylococcus aureus.

Piel, tejido celular

Exudado purulento, maloliente, mionecrosis, gas con

Linfangiti s.

Gangrena gaseosa

Adenopatías dolorosas a nivel regional con formación de edemas.

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Streptococcus pyogenes. Staphylococcus aureus. Crónica= Nocardia, Micobacterias. Anaerobios: Peptoestreptococcus,

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subcutáneo y musculo

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crepitación al tacto.

Clostridium, Bacteroides. Streptococcus pyogenes.

RECOLECCION Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS. Las muestras de piel deben ser obtenidas de varias de las lesiones que se observan, las cuales son desinfectadas previamente. Si se presenta exudado, debe descartarse el material de la superficie y se utilizan los exudados del interior. Si las lesiones son cerradas la muestra debe ser recolectada por aspirado con una jeringa estéril de insulina, si no es posible obtenerla así, se debe hacer una inyección con solución salina estéril y volver aspirar para obtener la muestra. En procesos de gangrena el exudado purulento debe obtenerse por aspiración profunda en jeringa sellada para estudio de bacterias anoxigenicas. Con las muestras obtenidas se realiza un frotis para colorear con Gram y se siembra en Agar Sangre, agar chocolate, Agar Mac Conkey, y caldo BHI, los cuales se incuban por 24 horas a 37 C en atmosfera de C02 al 5%. El reporte se realiza en base a la coloración de Gram (cantidad de reacción leucocitaria, cantidad morfología y tinción bacteriana). Cultivo: se escribe género y especie del microorganismo de importancia clínica aislado e identificado. Antibiograma: según el microorganismo aislado se realiza o no. ABSCESOS Es un exudado purulento o material necrótico que se genera producto de la inoculación directa del microorganismo a través de un traumatismo o de un proceso quirúrgico, por la extensión de focos adyacentes o por colonización de vía hematogena, originando una respuesta inflamatoria acumulándose secreciones en espacios cerrados o drenaje en casos que tiene vía de salida. Se pueden presentar en diversos órganos como tejidos subcutáneos, musculares, abscesos intrabdominales, hepáticos, esplénicos, perinefríticos. Son polimicrobianos en su gran mayoría predominando bacterias anoxigenicas. La toma de muestra se realiza por punción con jeringa estéril, donde se sella de una vez y se remite rápidamente al laboratorio de microbiología. Debe realizarse frotis de gram, cultivo, antibiograma. LEPRA Enfermedad crónica causada por el Mycobacterium leprae, afecta la piel, produciendo afecciones a nivel de células nerviosas periféricas, riñones, mucosas, parpados, manos, pies, testículos, presenta un periodo de incubación promedio de 10 años, no es hereditaria ni congénita. Se debe realizar la baciloscopia para la clasificación y el control bacteriológico. Para la toma de muestra se realiza de moco nasal y linfa.

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Moco nasal = se toma la muestra con un aplicador sobre los orificios de la nariz. Linfa  Realizar una isquemia sobre el lóbulo derecho e izquierdo de las orejas de tal forma la zona se coloque pálida procediendo a hacer una punción con una lanceta estéril y colocar una gota de linfa en cada área marcada en la lámina.  Hacer presión sobre los codos con la pinza y realizar la punción hasta lograr la isquemia, colocar la gota sobre el área marcada en la lámina portaobjetos.  Fijar la muestra y proceder a hacer la coloración de Zielh Neelsen.

1.2.3.4.5.-

linfa codo izquierdo. linfa codo derecho. linfa lóbulo de oreja izquierda. linfa de lóbulo de oreja derecha. muestra de moco nasal.

INTERPRETACION. Lectura de baciloscopia = es igual empleada en tuberculosis y se procede a elaborar el informe con el cálculo del índice bacilar (IB), este corresponde al promedio aritmético de las cruces encontradas en cada una de las muestras tomadas y leídas. (-) Negativa +(una cruz) ++(dos cruces) +++(tres cruces)

Si no se observan BAAR durante 10 minutos de lectura de cada preparación en 100 campos observados. Si se observan menos de 1 BAAR por campo en promedio, en cien campos observados por cada una de las 5 muestras. Si se observan entre 1 a 10BAAR por campo en promedio, en cincuenta campos observados para cada una de las 5 muestras. Si se observan mas de 10 BAAR por campo en promedio, en 20 campos observados para cada una de las 5 muestras.

Para cada una de las muestras se registra el número de cruces, de acuerdo con la escala. Ej: Moco (+), linfa lóbulo derecho (++), linfa lóbulo izquierdo (++), linfa codo izquierdo (-), linfa codo derecho (+). El cálculo del indicie bacilar para este ejemplo sería el siguiente:

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IB = (1+2+2+0+1)5 = 1.2 El rango del índice bacilar cuando es positivo oscila entre 0.2 (1/5) hasta 3 (15/5), si se emplean las 5 muestras. La clasificación bacteriológica será: Multibacilar (MB): IB > 0 Paucibacilar (PB): índice igual a 0 La presencia de globias en cualquier muestra indica una gran cantidad de bacilos, por lo cual se le asignan (+++). REPORTE CLINICO = debe incluir si es positivo o negativo, indicando el numero de cruces por muestra y el índice bacilar. PROCEDIMIENTO 1) Realizar la toma de muestra de linfa y moco nasal. 2) Realizar la coloración de Zielh Neelsen. 3) Observar la lamina al microscopio. 4) Interpretar los resultados. CONSULTA 1) Cuáles son las pruebas de identificación que se utilizan para bacterias del genero Clostridium. 2) Elabore el esquema de identificación de bacterias anoxigenicas. 3) En qué consiste la prueba de Lisado de Limulus. 4) Que es Xantocromía, y cuando se presenta? 5) Cuál es el mejor método para detectar proteínas en LCR. LIQUIDO CEFALO RAQUIDEO (LCR) Es el tercer líquido importante del cuerpo y proporciona un sistema fisiológico para abastecer de nutrientes al tejido nervioso, eliminando desechos metabólicos, y produciendo una barrera mecánica que amortigua al cerebro y la medula espinal contra traumatismos. Casi 20 ml de liquido se producen cada hora en los plexos coroideos y se reabsorben en las vellosidades aracnoideas para conservar un volumen total de 140-170ml en adultos y 10-60 ml en recién nacidos. La unión apretada entre las células endoteliales de los capilares y los plexos coroideos, restringe la entrada de macromoléculas como proteínas, lípidos insolubles y substancias unidas a las proteínas séricas. El término de barrera hematoencefalica se emplea para representar todos los intercambios bidireccionales entre sangre, LCR y encéfalo. OBTENCION DE LA MUESTRA. Se obtiene mediante la punción lumbar entre la tercera, cuarta o quinta vértebra lumbar. Se debe tener en cuenta la medición de la presión intracraneal y una técnica cuidadosa para evitar la introducción de infeccion o daño al tejido neural. Las muestras se obtienen en tres tubos de ensayos

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estériles etiquetados con numero 1, 2,3, según el orden en el q se extrae el LCR. El tubo numero uno se emplea para pruebas químicas, y serológicas, el tubo dos se usa para microbiología, y el tubo tres se emplea para el conteo celular. Los tubos de química y serología se congelan, los de hematología se refrigeran y los de microbiología se mantienen a temperatura ambiente.

SIGNIFICADO CLINICO DEL ASPECTO DEL LCR. ASP

CAUSA.

SIGNIFICADO PRINCIPAL.

ECTO Transpa rente. Brumoso, turbio, nublado, humeado, lechoso. Aceitoso. Sanguinolento . Xantocromico.

Coagulado. Formación de película.

Normal. Leucocitos, hematíes, microorganismos, proteínas.

Material de radiográfico. Eritrocitos.

Meningitis, hemorragia, punción traumática, transtornos que afectan la barrera hematoencefalica, producción de IgG en SNC.

contraste

Hemoglobina, bilirrubina, mertiolato, carotenos, proteínas.

Proteínas y factores de la coagulación. Proteínas, factores de la coagulación

Hemorragia. Hemorragia antigua, células lisadas por punción traumática, desdoblamiento de eritrocitos, bilirrubina sérica elevada, contaminación, concentración sérica elevada. Introducidos por la punción traumática. Meningitis tuberculosa.

DETERMINACION CELULAR Tipo de célula Linfocito Neutrofilos

Monocitos

Eosinofilos

Significado clínico principal Normal, meningitis viral, tuberculosa, y micotica, esclerosis múltiple. Meningitis bacteriana, casos tempranos de meningitis viral, tuberculosa o micotica, hemorragia cerebral. Meningitis bacteriana crónica, meningitis viral, tuberculosa y micotica, esclerosis múltiple. Infecciones parasitaria, reacciones alérgicas, derivaciones intracraneales (hidrocefalia).

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Hallazgos microscópicos Se pueden encontrar en todas las etapas de desarrollo. Los gránulos pueden ser menos prominentes que en la sangre las células se desintegran rápidamente. Se encuentran mezclados con linfocitos y Neutrofilos Mismo aspecto que en la sangre.

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Macrófagos

Meningitis tuberculosa LCR.

Formas blasticas

Leucemia aguda

Células plasmáticas.

Esclerosis múltiples, reacciones linfocitarias Carcinoma metastasico

Células malignas

Células mesoteliales de la piracnoides.

viral y eritrocitos en

Normal, reacciones mixtas incluyendo Neutrofilos, linfocitos, monocitos y células plasmáticas.

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Pueden contener eritrocitos fagocitados con aspecto de vacuolas vacías o células fantasmas y gránulos de hemosiderina. Linfoblastos o mieloblastos. Se observan formas transicionales y clásicas. Se observan en grupos con fusión de los núcleos y márgenes celulares. Semejan monocitos jóvenes con un núcleo redondo sin muescas.

DIAGNOSTICO DIFERENCIAL DE MENINGITIS. BACTERIANA Leucocitosis. Neutrofilos Aumento importante proteínas Disminución glucosa

VIRAL Leucocitosis Linfocitos de

Aumento moderado proteínas

de

Glucosa normal

Lactato elevada LD4 y LD5 elevadas

de

Lactato normal LD2 y LD3 elevadas.

TUBERCULOSA Leucocitosis Linfocitos y monocitos Aumento moderado a importante de proteínas Disminución de glucosa

MICOTICA Leucocitosis Linfocitos y monocitos. Aumento moderado a importante de proteínas. Glucosa normal o disminuida.

Lactato elevado

Lactato elevado

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Práctica 11 Diagnóstico de infecciones del tracto genito-urinario OBJETIVOS GENERALES: Identificar las principales bacterias asociadas a infecciones genito-urinaria. OBJETIVOS ESPECIFICOS Establecer las condiciones requeridas para la recolección y procesamiento de las secreciones vaginales, endocervicales, y uretrales. Conocer los protocolos de procesamiento de muestras según el agente etiológico del proceso infeccioso a nivel de tracto genito-urinario. MARCO TEORICO. Las infecciones del tracto genital femenino pueden ser causadas por bacterias, hongos, virus, parásitos, el agente etiológico implicado puede ser de tipo exógeno o puede pertenecer a la microbiota normal que bajo ciertas circunstancias puede producir cuadros infecciosos. La microbiota vaginal está conformada por lactobacilos, productores de peróxido de hidrogeno que producen un balance adecuado en la microbiota exigente, pues inhibe el desarrollo de bacterias catalasa negativa como Gardnerella vaginalis, Mobiluncus y otros anaerobios como Bacteroides y Peptoestreptococcus. VAGINOSIS BACTERIANA. Es la asociación de flujo vaginal homogéneo y cambios en la composición bacteriana y bioquímica de la secreción vaginal, tales cambios se evidencian por el aumento del pH por encima de 4.5 disminución de los lactobacilos y del acido láctico, facilitando el aumento de otras bacterias y del acido succínico, generando la aparición de aminas y del fenómeno llamado células guías. Suele ser asintomática cuya etiología es desconocida, se presenta con un cambio de la microbiota vaginal, cuyos lactobacilos disminuyen o desaparecen, ocasionando el crecimiento de microbiota mixta o de Gardnerella vaginalis, (cocobacilos gram variables), o anaerobios

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estrictos (Bacteroides, Peptoestreptococcus, Mobiluncus, Eubacterium, Fusobacterium, y Mycoplasma). El flujo es abundante Mucoide y grisáceo, con aparición de aminas generando un olor desagradable (pescado podrido). DIAGNOSTICO Presencia de células guías, (célula del epitelio vaginal, con borde mal definido de aspecto granuloso por el gran número de cocobacilos unidos a la superficie), y test de aminas positivo. Se realiza un examen directo para observar las células epiteliales leucocitos y le presencia de bacterias. También se realiza una coloración de gram para observar la morfología bacteriana. VAGINITIS Y URETRITIS BACTERIANA. Es un crecimiento anormal en las secreciones vaginales, que se presenta con inflamación de las mucosas vaginales y la mucosa adyacente vulvar. Nesseria gonorrhoae. Afecta los órganos sexuales, anorectal, y faríngea, se produce cervicitis y uretritis gonococcica. Los hombres manifiestan secreción purulenta acompañado de disuria, edema del meato. Como complicación se genera una infeccion persistente crónica, epididimitis, estrechez uretral e infertilidad. Las mujeres pueden ser asintomáticas y presentan una secreción vaginal atípica, acompañada o no de disuria, el 80% son asintomáticas y las complicaciones son severas, ocasionando enfermedad pélvica inflamatoria (EPI), y subsecuentemente la esterilidad y una infeccion diseminada que genera un peligro de muerte. El periodo de incubación en el hombre es de dos a cinco días, y en la mujer antes de diez días. En el embarazo, una infeccion no tratada genera como resultado un parto prematuro, y en los recién nacidos puede causar oftalmia neonatal, ceguera y diseminación de la infeccion. DIAGNOSTICO Se realiza a través de la clínica y pruebas de laboratorio para la identificación de Neisseria gonorrhoeae. En los hombres se observan diplococos gram negativos intra y extracelulares en la secreción uretral y en las mujeres aislamiento por cultivo selectivo, y demostración de colonias morfológicamente típicas, reacción positiva a la oxidasa y gram con la típica morfología de la bacteria. La confirmación de la bacteria se realiza a través del cultivo y métodos bioquímicos o determinación enzimática o de ácidos nucleicos. Infeccion por Chlamydia trachomatis. Es una bacteria gram negativa intracelular, su ciclo de multiplicación es único entre las bacterias, produce cuadros de vaginitis, este proceso se observa principalmente en jóvenes sexualmente activas con flujo discreto, no presentan mal olor, acompañado de un proceso de endocervicitis mucopurulenta ocasionando disuria, infeccion postparto, y dolor pélvico generando una EPI. Las cepas pertenecientes a la especie de Chlamydia trachomatis se clasifican en una serie de serotipos A-K y los pertenecientes al linfogranuloma venéreo (LGV) L1, L2, L3. Estos serotipos se agrupan en biovariedades. En hombres puede ser asintomática, puede haber disuria y

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secreción uretral escasa de aspecto Mucoide. Complicaciones más frecuentes, epididimitis e infertilidad, también es responsable entre un 50% de la uretritis no gonocócica, presentándose frecuentemente en países desarrollados y son indistinguibles de la infeccion gonococcica. Se caracteriza por la secreción purulenta, disuria. En las mujeres presenta secreción mucopurulenta en el endocervix la cual va ascendiendo por las estructuras pélvicas ocasionando endometritis, salpingitis, generando una EPI. Complicaciones = uretritis aguda, infeccion durante el embarazo (2-37%), EPI, esterilidad, infertilidad, endometritis postparto, embarazo ectópico, aborto, ruptura de membranas, mortinatos, infeccion neonatal. DIAGNOSTICO Identificación, aislamiento y confirmación de la bacteria en secreción cervical, rectal, uretral, por medio de técnicas de laboratorio: Inmunofluorescencia directa, EIA, cultivo celulares, PCR. Cándida albicans Los síntomas aparecen cuando estos organismos proliferan en grandes cantidades, está asociado en el embarazo, personas diabéticas, y pacientes sometidas a tratamiento con inmunosupresores y personas con SIDA. Se caracteriza por una secreción blanquecina, de moderada cantidad aspecto grumoso, viscoso, adherido a las paredes vaginales, acompañado de eritema, prurito vulvar y compromete la región perianal. Cuando la cándida se vuelve infecciosa están presentes las hifas y las pseudohifas, identificándose en el frotis directo de flujo vaginal. Trichomona vaginalis La única especie patógena de los protozoos flagelados del género Trichomona, se reproduce en las mucosas de las vías urinarias y genitales en forma de trofozoito, la transmisión del parasito ocurre durante el acto sexual o muy pocas veces por contacto de artículos contaminados. Produce vaginitis en la mujer y uretritis en el hombre donde se presenta un curso asintomático. Se manifiesta por una secreción vaginal profusa, espumosa, amarilloverdosa, maloliente, acompañada de disuria, eritema, y prurito vulvar, cérvix edematososo con petequias “signo de cérvix en fresa” fácilmente sangrante. En el hombre la infeccion cursa asintomática y es autolimitada. DIAGNOSTICO Se establece por el cuadro clínico y los hallazgos en la exploración clínica, y la determinación del parasito en solución salina o a través del sedimento urinario. Vaginitis no especificas Otro grupo de microorganismos que deben tenerse en cuenta para su aislamiento e identificación como productores de vaginitis son: Emterococcus faecalis, streptococos del grupo B, enterobacterias, y Ureaplasma. Para considerarlos como agentes etiológicos debe tenerse en cuenta el cuadro clínico de la paciente, presentando una verdadera descarga vaginal, presencia de PMN, en el frotis directo coloreado con gram

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y un crecimiento en cultivo monomicrobiano, con un desplazamiento casi total de la microbiota normal. Uretritis no gonocóccicas Es un síndrome causado por varios agentes sexualmente transmitidos. El 50% de los casos se dan por Chlamydia trachomatis. Otros agentes etiológicos son Ureaplasma urealyticum, virus Herpes, Moraxella uretralis, Enterococcus faecalis, Corynebacterium genitalicum. El diagnostico se establece por la exclusión del hallazgo de los diplococos gram negativos en el examen de gram, se deben realizar pruebas de ELISA y de IF para Chlamydia y pruebas microbiológicas para los microorganismos mencionados. INFECCIONES ULCERATIVAS Son causadas por bacterias y virus y generan ulceras alrededor del sistema genito urinario, la sífilis, el chancro blando, linfogranuloma venéreo, son producidas por bacterias el herpes tipo 2 es producido por un virus, el condiloma es un tipo de lesión tumoral producido por el virus de papiloma humano VPH. SÍFILIS Es causada por la Treponema pallidum, enfermedad de evolución crónica, comprometiendo muchas partes del cuerpo, se caracteriza por la aparición de un chancro de bordes definidos indoloro que dura de 10-14 días y desaparece con o sin tratamiento, luego al implantarse en la piel y las mucosas se multiplica localmente y pasa a los ganglios linfáticos, de ahí se distribuye a todos los tejidos del cuerpo. Entre dos y cuatro semanas después aparecen las lesiones secundarias en la piel, que pueden ir desde erupciones mucocutaneas a pápulas, nódulos o ulceraciones superficiales, las cuales pueden continuar por cuatro años en 25% de los casos no tratados. Se clasifica en sífilis primaria, secundaria, terciaria, se presenta también la sífilis congénita. DIAGNOSTICO En el laboratorio se emplean técnicas serológicas para presumir y confirmar el diagnostico, se dispones de los siguientes exámenes:  Campo oscuro  Pruebas de VDRL o RPR  Pruebas de FTA-abs y la fracción IgM para la sífilis congénita. Se puede disponer de pruebas treponemicas y no treponemicas:  Pruebas no treponemicas = no son especificas para los anticuerpos de la infeccion, sin embargo son altamente sensibles y practicas: VDRL o RPR.  Pruebas treponemicas: son mas especificas y se emplean para confirmar la infeccion, FTA-abs y la fracción IgM para la sífilis congénita. Chancro blando Es conocido como cancroide, se caracteriza por la presencia de ulceras grandes, bordes irregulares, muy dolorosa, acompañando de un ganglio ulcerado o bubón, es producido por Haemophilus ducreyi, bacteria gram

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negativa con un periodo de incubación de tres a seis días. Está asociado a una coinfeccion por sífilis o herpes genital. Se presentan en el sitio de la infeccion una o varias ulceras dolorosas con fondo plano que sangra fácilmente al limpiar el exudado necrótico, que se expande por autoinoculacion, en la mujer casi siempre ocurre en los labios mayores y menores y región perianal, y en el hombre en el prepucio, glande y región perianal. En dos a tres semanas evoluciona la enfermedad, presentándose adenopatía inguinal, inflamatoria, casi siempre unilateral, los ganglios pueden ablandarse, hasta formar un absceso (bubón), que puede abrir al exterior y formar una fistula que drena líquido purulento. DIAGNOSTICO Se realiza mediante los siguientes criterios: el paciente tiene una o más ulceras genitales sin evidencia de infeccion por Treponema pallidum, presencia clínica de linfoadenopatía regional y prueba negativa para virus del herpes genital. El diagnostico definitivo de cancroide requiere de identificación de Haemophilus ducreyi por medio de cultivo especifico o por PCR. LINFOGRANULOMA VENEREO Chlamydia trachomatis tipo L1,L2,L3 es el agente causal, presenta un periodo de incubación de 5-35 días, la lesión primaria aparece en el sitio de la inoculación, luego de adquirir una infeccion que inicia con una sola lesión papovesicular, pequeña, e indolora que en ocasiones pasa inadvertida y desaparece sola, en el varón ocurre con más frecuencia en el surco balanopapular, frenillo, pene, uretra, glande, y escroto, y en la mujer se presenta en la pared posterior de la vagina, la horquilla, el labio posterior del cérvix, y la vulva, solo en 20-30% de las mujeres presentan el síndrome inguinal debido al drenaje de los ganglios pélvicos. Entre cuatro días y cuatro meses posteriores a la lesión primaria, ocurre una adenopatía inguinal, unilateral, que involucra los ganglios linfáticos y produce la tumefacción inicial, estos ganglios se adhieren a la piel la que se torna de color rojo oscuro, formando ulceras grandes, hemorrágicas, y dolorosas, la curación puede durar meses o años, dejando cicatriz retráctil con transtornos linfáticos obstructivos resultando en edema de pene y escroto en el hombre, y en la mujer del periné y miembros pélvicos.

TOMA DE MUESTRA REQUISITOS  No estar recibiendo tratamiento con antibióticos.  No estar menstruando  No haber realizado duchas vaginales, ni aplicación de óvulos, jaleas, etc.  No haber tenido relaciones sexuales 24 horas antes del examen.  No haber orinado 2 horas antes de la toma de muestra. MUESTRA VAGINAL

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En tres hisopos de algodón estériles se recoge la muestra a través de los labios vaginales, en el cual en uno se realiza el extendido de la lamina, el otro se coloca en un tubo de ensayo con solución salina, y el otro en un tubo de ensayo con KOH al 10%, se realiza la observación microscópica entre lamina y laminilla, y se realiza la coloración gram para la identificación de morfología bacteriana. MUESTRA ENDOCERVICAL Se obtiene para el diagnostico especifico de Neisseria gonorrhoae y Chlamydia trachomatis, se introduce en la vagina el especulo con un escobillón estéril, se introduce en el endocervix rotándolo suavemente y permitiendo que permanezca allí por unos segundos. Se retira inmediatamente y se siembra sobre los medios específicos como Thayer Martin, y frotis directo para la coloración de gram. MUESTRAS URETRALES En el hombre con cuadro clínico de uretritis aguda, con exudado uretral purulento y abundante, se introduce un escobillón muy fino y húmedecido con solución salina fisiológica estéril 1-2cm en el canal uretral, imprimiendo un movimiento suave de rotación, la muestra se debe sembrar inmediatamente en Agar Thayer Martin y a continuación hacer un frotis para colorear el gram. MUESTRAS DE CHANCROIDE Cuando un paciente presenta una lesión cancroide es importante limpiar perfectamente la lesión con una torunda de algodón impregnada con solución salina estéril desechando cualquier cascara o absceso formado, tomar luego la muestra con un hisopo impregnado con solución salina estéril o con un asa de argolla tratando de raspar la superficie de la lesión para realizar cultivo y frotis directo para colorear con gram. MATERIALES  Láminas y laminillas.  2 tubos de ensayo  Hisopos de algodón estéril  Marcador de vidrio  Solución salina y KOH al 10%.

PROCEDIMIENTO 1) Realizar la toma de muestra de frotis de flujo vaginal o secreción uretral. 2) Hacer el extendido de la muestra sobre la lámina portaobjetos, y colocar los hisopos con la muestra obtenida en los tubos de ensayo correspondientes con solución salina y KOH al 10%. 3) Realizar la coloración de GRAM. 4) Observar al microscopio.

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CONSULTA 1) Cuáles son las características clínicas y agentes etiológicos del herpes genital y el condiloma acuminado. 2) Fundamento de las pruebas VDRL, RPR, FTA-abs, y MHT-TP. 3) Cuáles son las alteraciones que puede ocasionar el Mobiluncus sp. 4) Que es el Sarcoptes scabiei y que patología genera.

Práctica 12 Urocultivo, Coprocultivo, Hemocultivo OBJETIVOS GENERALES: Identificar, las diversas técnicas que permiten el aislamientos e identificación bacteriana a partir de muestras de orina, materia fecal y sangre. OBJETIVOS ESPECIFICOS. Establecer condiciones de toma de muestra para el análisis de una muestras de orina, materia fecal, sangre. Conocer los protocolos de procesamientos de muestras según el agente etiológico a nivel gastrointestinal, urinario, sanguíneo. MARCO TEORICO UROCULTIVO Recolección de la muestra. Esta muestra necesita un gran cuidado porque se puede contaminar con flora normal de la uretra y la vagina, existen cuatro métodos para la obtención de la muestra de orina.  Orina de la mitad de la micción espontanea.  Uso de bolsa de plástico estéril (bebes).  Cateterismo.  Punción suprapubica. Se le debe informar al paciente en forma clara y precisa la correcta recolección de la orina. Se debe hacer limpieza del área genitourinaria, recoger la muestra de la mitad de la micción en un frasco previamente estéril y de boca ancha. La punción suprapubica se basa en la aspiración de la orina vesical a través de la piel en la zona suprapubica. EXAMEN DIRECTO. GRAM DE ORINA SIN CENTRIFUGAR.  Homogenizar la muestra de orina.  Colocar una gota de orina sin centrifugar sobre una lamina portaobjeto.  Dejar secar sin extender.  Fijar al calor  Realice tinción de Gram. LECTURA

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Observar la presencia de células epiteliales, leucocitos, bacterias y microorganismos en objetivo de 100x. Reportar el número de polimorfonucleares, morfología bacteriana en la observación microscópica de la coloración de gram. UTILIDAD La presencia de células epiteliales y microbiota mixta indican contaminación con flujo vaginal, determina bacteriuria > 100000 UFC/ml de orina. Brinda orientación sobre la morfología y la reacción leucocitaria, lo cual permite la orientación para el inicio de una terapia antimicrobiana. Determina la presencia o ausencia de piuria. RECUENTO DE COLONIAS. METODO DE KASS. 1) Mezclar la muestra durante tres minutos evitando el derrame. 2) Tome el inoculo con el asa calibrada. 3) Deposite la cantidad de muestra tomada con el asa en el centro del agar y a partir de ahí trazar una línea recta de extremo a extremo de la caja. 4) Con la misma asa y sin tomar mas muestra y sin esterilizar realizar una estriación en zig-zag, de tal manera, intercepte la línea de lado a lado. 5) Incubar a 37º de 18-24H a 37º. 6) Observar el crecimiento bacteriano e interpretar los resultados expresados en UFC/ml. Los parámetros utilizados para obtener el recuento de UFC son:  Si existe crecimiento en todas las líneas de siembra es un recuento mayor a 1OO.OOOUFC/ml.  Si crece en la línea central y en la mitad de las líneas que las intercepta el recuento es de 75000 UFC/ml.  Cuando se tiene crecimiento sobre la línea central corresponde a 50.000UFC/ml.  Cuando no se presenta crecimiento en una línea se hace una aproximación al parámetro que el lector considera más apropiado.

1000 10000 60000

UFC/ml SIGNIFICADO 100- No tiene significado clínico, excepto en punción suprapubica 1000- Presenta contaminación vaginal en cultivo mixto. 10000- Urocultivo dudoso debe repetirse en muestra diferente si no hay sintomatología clínica. >30000 Con crecimiento monomicrobiano y sintomatología clínico debe procesarse. >100000 Presencia de infección urinaria franca.

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Recuento.

< 10000UFC/ml