Manual de Hematologia I-4

 

Fac. Cs. Qs. Dpto. De ANÁLISIS CLÍNICOS LABORATORIO DE HEMATOLOGÍA I Q.F.B

BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO ÁREA ESPECÍFICA DE ANÁLISIS CLÍNICOS

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO

ASIGNATURA DE: CÓDIGO:  FECHA DE ELABORACIÓ:  NIVEL EN EL MAPA CURRICULAR:  TIPO DE ASIGNATURA: 

HEMATOLOGÍA I LQFB 406L MARZO 2006 FORMATIVO CB

PROFESORES QUE PARTICIPARON EN SU ELABORACIÓN: M. C.. SILVIA GARCÍA GONZÁLEZ M. C.. MIGUEL ANGEL VILLEGAS GONZÁLEZ

HORAS PRÁCTICA. 2

TOTAL DE CRÉDITOS:  0

 

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ÍNDICE PRESENTACIÓN E INTRODUCCIÓN

3

PRÁCTICA 1 TOMA DE MUESTRAS SANGUÍNEAS

4

PRÁCTICA 2 CONTROL DE CALIDAD EN HEMATOLOGÍA

7

DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA, HEMATOCRITO, PRÁCTICA 3 VSG, CUENTA DE ERITROCITOS E ÍNDICES ERITROCITARIOS 

10

PRÁCTIC 4

PRÁCTICA 5

CUENTA DE LEUCOCITOS Y REALIZACIÓN DE EXTENDIDO SANGUÍNEO (TINCIÓN DE WRIGHT Y GIEMSA) CON VALORES ABSOLUTOS Y RELATIVOS.

22

CUENTA DE RETICULOCITOS Y FRAGILIDAD ERITROCITARIA A SOLUCIONES HIPOTÓNICAS

31

FORMA PRÁCTICA 6 CITOMETRÍA HEMÁTICA COMPLETA DE FORMA MANUAL PRÁCTICA 7 CITOMETRÍA HEMÁTICA AUTOMATIZADA

36 38

PRÁCTICA 8

SEMINARIO SOBRE INTERPRETACIÓN DE HISTOGRAMAS

41

PRÁCTICA 9

CITOMETRÍA HEMÁTICA Y SU INTERPRETACIÓN EN DIVERSAS PATOLOGÍAS

42

PRÁCTICA 10 OBSERVACIÓN DE LAMINILLAS CON DE ANEMIAS MICROCÍTICAS, NORMOCÍTICAS Y MACROCÍTICAS.

43

PRÁCTICA 11 OBSERVACIÓN DE LAMINILLAS CON DE ANEMIAS HEMOLÍTICAS

45

PRÁCTICA 12 OBSERVACION DE MEDULA OSEA NORMAL.

48

PRÁCTICA 13 RESOLUCIÓN DE CUADROS CLÍNICOS

51

PRÁCTICA 13 EVALUACIÓN FINAL

51

PREPARACIÓN DE REACTIVOS

52

CUESTIONARIO

54

BIBLIOGRAFÍA

57

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INTRODUCCIÓN Siglos atrás la sangre fue considerada como el líquido esencial para la vida y se le atribuía ser la fuente que mantenía el equilibrio en el organismo, sin embargo la composición celular de la sangre no se reconoció hasta la invención del microscopio, siendo Leeuwenhoek el primero en observar los glóbulos rojos, no fue hasta años después cuando se logró realizar exploraciones de los elementos que constituyen a la sangre, definiéndose ésta como un órgano polisistemático constituido por eritrocitos, leucocitos,  plaquetas y plasma. La complicada composición de la sangre provocó el interés para realizar estudios sobre las células que la constituían, siendo K. Vierordt quién realizó los primeros análisis cuantitativos de éstas, pero fue hasta los años treinta que se intentó relacionar el número de células sanguíneas con algunas patologías, métodos cada vez mejores y conocimientos más  profundos sobre so bre la fisiología ssanguínea anguínea permitió una relación estrecha con el cuadro clínico  presentado por diferentes difere ntes pacientes. En la actualidad se han desarrollado técnicas cualitativas y cuantitativas de los componentes celulares, que en conjunto constituyen la CITOMETRÍA HEMÁTICA: Determinación de hemoglobina y hematocrito, cuenta de eritrocitos, leucocitos, plaquetas, observación del frotis sanguíneo y cálculos de los índices eritrocitarios. La Citometría hemática es sin lugar a dudas el primer paso para el diagnóstico, dado que numerosos trastornos se acompañan de alteraciones en las células por lo cual es importante hacer la diferenciación. Las células pueden sufrir alteraciones no sólo en su forma sino también en su cantidad y su función, que pueden ser secundarias a algunas alteraciones fisiopatológicas, enfermedades crónicas, terapias con medicamentos, déficit de algún componente, neoplasias, etc., lo cual lleva a alterar las funciones que desempeñan como es: defensa contra infecciones, aporte de oxígeno. etc. Actualmente se cuenta con aparatos automatizados para la determinación de la citometría hemática, día a día han sustituido a la forma manual, ya que los valores son más  precisos; sin embargo el Químico Farmacobiólogo debe estar preparado para realizar esta  prueba por ambos métodos.

OBJETIVOS. 1.  El alumno conocerá el funcionamiento de un laboratorio de hematología, así como las medidas de precaución para su protección personal en cuanto al manejo de las muestras de sangre, al ser considerarlas potencialmente infecto-contagiosas. 2.  El alumno conocerá y aprenderá a manejar el material y equipo más común que se utiliza en la realización de la citometría hemática. 3.  El alumno aprenderá a analizar y correlacionar el resultado de la citometría hemática con las manifestaciones clínicas que presente el paciente. 4.  El alumno conocerá las alteraciones morfológicas más frecuentes que se presentan en las anemias.

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PRÁCTICA No. 1 TOMA DE MUESTRA SANGUÍNEA S ANGUÍNEA OBJETIVO: El alumno conocerá y aprenderá a realizar una punción venosa para obtener muestra de sangre. 1.

MÉTODOS DE EXTRACCIÓN SANGUÍNEA. Las determinaciones de la Citometría Hemática, de preferencia se realizan con sangre venosa, ya que la extracción es más fácil, se obtiene una cantidad adecuada como  para repetir cuantas veces sea necesario, la manipulación y el pipeteo es mucho más fácil, sin embargo también se puede utilizar sangre capilar o arterial. 1.1.

OBTENCIÓN DE SANGRE CON JERINGA. La extracción se realiza con jeringa de plástico y aguja desechable. En las tomas de muestra el operador debe adoptar una actitud de confianza y seguridad para que el paciente  pueda ser tranquilizado y colabore de forma eficaz. 1.1.1 MATERIAL A UTILIZAR POR EQUIPO. 1 Torniquete por equipo 1 Frasco con torundas con alcohol etílico al 70 %, como antiséptico. 2 Tubos de ensayo de 13x75 mm con tapón de color lila. 1 Frasco con 10 ml con solución de etilen-diamino-tetra-acetato de sodio al 10 % (EDTA). 1.1.2 PROCEDIMIENTO. 1)  En un tubo de ensayo de 13x75 mm se coloca una gota del anticoagulante, en la etiqueta se escribe en el nombre del paciente, fecha y análisis deseado. 2)  El paciente cómodamente sentado, coloca el brazo en posición horizontal, se palpan las venas, (venas cefálica media y basílica) al mismo tiempo se le solicita que abra y cierre el puño con la finalidad de hacerlas más evidentes. 3)  Una vez seleccionada la vena en la que se efectuará la punción, se sujeta el brazo del paciente tensando la piel, se limpia la zona en forma circular y de dentro hacia afuera, con el antiséptico, se deja secar, sin soplar. 4)  Se aplica el torniquete a 7 cm. por arriba del pliegue codo, no apretándolo demasiado y aproximadamente sólo el tiempo necesario, para delevitar la hemoconcentración. 5)  Se toma la jeringa de manera que el bisel de la aguja se encuentre hacia arriba, se coloca paralela al trayecto de la vena, se introduce a la piel y vena con una punción directa y única. 6)  Cuando la aguja ha penetrado en la vena, se ve el flujo de la sangre en la jeringa. 7)  Jalar suavemente el émbolo de la jeringa para obtener la cantidad de sangre deseada, hacer esta operación despacio para evitar la hemólisis. 8)  Se suelta el torniquete y se retira la aguja suavemente aplicando la torunda sobre el sitio de la punción, indicándole al paciente que flexione el codo suavemente con el  puño abierto, con la finalidad de evitar hemorragias hemorr agias o hematomas. 9)  Se quita con mucho cuidado la aguja de la jeringa con la ayuda de su funda, con movimiento de torsión, y lasesangre lentamente por las paredes tubo que contiene el anticoagulante, tapa ysesevacía mezcla suavemente, durante un del minuto. 4

 

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1.2

OBTENCIÓN DE SANGRE CON SISTEMA VACUTAINER.

El fundamento es la aspiración directa de la sangre en tubos al vacío que contienen el tipo y cantidad apropiada de anticoagulante.

1.2.1 MATERIAL A UTILIZAR POR EQUIPO. 1 Torniquete 1 Soporte Vacuntainer 2 Agujas Vacuntainer de calibre 20x25mm (Bisel corto) y/o 20x32mm (bisel largo) 2 Tubos al vacío con EDTA (Tapón color lila) 1 frasco con Torundas con alcohol al 70 % por sección 1 par de guantes de látex desechables por persona 1.2.2 PROCEDIMIENTO (Presentación de video) 1) Preparar el sistema: La aguja se gira para romper el sello de esterilidad, se atornilla al soporte, se quita la capucha, quedando lista para la punción, el tubo debe estar rotulado con el nombre del paciente, estudio y fecha de realización. 2)  El paciente cómodamente sentado coloca el brazo en posición horizontal, se palpan las venas, (venas cefálica media y basílica) al mismo tiempo se le solicita que abra y cierre el puño con la finalidad de hacerlas más evidentes. 3)  Una vez seleccionada la vena en la que se efectuará la punción, se sujeta el brazo del paciente tensando la piel, se limpia la zona en forma circular y de dentro hacia afuera, con el antiséptico, se deja secar, sin soplar. 4)  Se aplica el torniquete a 7 cm. aproximadamente por arriba del pliegue del codo, no apretándolo demasiado y sólo el tiempo necesario, para evitar la hemoconcentración. 5) Sujetar firmemente el soporte con la mano derecha e introducir la aguja con el bisel hacia arriba en la vena elegida, se sujetará el brazo del paciente con la mano izquierda, y con el pulgar se sostendrá el soporte vacuntainer para evitar que se mueva la aguja. 6) Empuje el tubo vacutainer hasta el final del soporte, perforando completamente el tapón. 7) Dejar fluir libremente llaa sangre hasta que se acabe el vacío. 8) Retire el torniquete suavemente. 9) Jalar el tubo vacuntainer hacia afuera del soporte y sin quitar el tapón mezcle suavemente la sangre con el anticoagulante lentamente sin sacudir. (aprox. 60 veces) 10) A continuación retire la aguja colocando la torunda en el sitio de la punción, indicándole al paciente que flexione el brazo suavemente.

1.2.3

PRECAUCIONES:

1.  Verificar que el material sea estéril, para evitar la transmisión de VIH y HEPATITIS, entre otras, se debe utilizar guantes durante la extracción sanguínea  para protección personal. 2.  Debe evitarsehematomas una malay punción o zona exceso de presión ya que puede provocar hemorragias, dolor en la de punción. 5

 

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3.  Evitar la permanencia prolongada de agujas dentro de las venas, ya que en ocasiones puede provocar “flebitis”. 4.  En el momento de la punción asegurarse que la aguja penetre en la luz del vaso,  para evitar la formación de hematomas. 5.  Si por algún motivo la extracción de sangre se realiza en vena femoral, se debe tener la precaución que la aguja no penetre demasiado para evitar lesión vascular.

1.2.4  VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE AMBOS MÉTODOS.  

El método de extracción por sistema Vacutainer no requiere tanta preparación.

 

Se pueden obtener varias muestras en una sola punción, en cambio con jeringa sólo se obtiene el volumen indicando en ésta.

 

En el sistema Vacutainer existe una gran variedad de tubos tanto en volumen como en el tipo de anticoagulante que contienen, además sólo se extrae la cantidad exacta de sangre con relación a la cantidad de anticoagulante.

TIPO DE TUBO ANTICUAGULANTE EDTA Heparina Oxalato de litio, de potasio y sodio. Citrato de sodio. Sin anticoagulante.

Tapón morado Tapón verde Tapón gris Tapón azul Tapón rojo

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PRÁCTICA No. 2 CONTROL DE CALIDAD EN HEMATOLOGÍA OBJETIVO: El alumno conocerá los sistemas de control de calidad interno y externo que se utilizan en el laboratorio hematológico para garantizar al paciente resultados precisos y exactos.

La citometría hemática, es sin duda uno de los estudios de laboratorio más solicitados y la interpretación correcta supone el análisis exacto, preciso y confiable de cada uno de los  parámetros que se informan. Sin embargo, a pesar de realizar cuidadosamente las determinaciones analíticas, es habitual que se produzcan pequeños errores durante el desarrollo de las técnicas, siendo imposible reproducir exactamente mediciones sucesivas de una misma muestra aún contando con tecnología de punta. De ahí que sea necesario contar con sistemas de control de calidad interno y externo que garantice a su vez el control de las variables que pueden ser causa de error durante el trabajo diario de laboratorio. Si consideramos el trabajo de laboratorio como un proceso continuo desde la recepción del  paciente hasta la emisión de resultados, podemos dividir el trabajo de laboratorio en tres grandes fases: 1. Pre-analítica, 2.Analítica y 3. Post-analítica, en las cuales se pueden estar introduciendo errores que deben ser detectados por nuestro sistema de control de calidad  para realizar las acciones correctivas cor rectivas necesarias. Los errores que se pueden presentar en el trabajo diario de laboratorio son: Burdos.- este tipo de error solo se presenta por descuido del personal de laboratorio, ya que como su nombre lo dice son errores muy graves que no se pueden detectar por ningún sistema de control de calidad. Por ejemplo cambio de una muestra por otra, deun reactivo  por otro, de una cantidad por otra, otra , etc. Sistemáticos.- este tipo de error es el que produce dentro del sistema o método de prueba, afectando gravemente la precisión de nuestros resultados y se presentan como consecuencia de procedimientos de calibración incorrecta, funcionamiento defectuoso o falta de precisión de alguna parte del proceso. Éstos a su vez pueden ser constantes o proporcionales. Aleatorios.- este tipo de error se produce como su nombre lo indica sin predicción ni regularidad, afectando gravemente la exactitud de nuestros resultados Así pues, el control estadístico de calidad tiene como finalidad monitorear en forma continua mediante técnicas estadísticas, la estabilidad del proceso, y mediante los gráficos de control de este análisis detectar en forma visual la variabilidad de nuestras mediciones, las cuales probablemente se pueden atribuir a alguna causa específica que se podrá investigar y corregir.

CONTROL DE CALIDAD INTERNO Los programas de control de calidad interno comprende el análisis de muestras de control  junto con las muestras de de pacientes la evaluación estadística los resultados para determinar la aceptabilidad la corriday analítica. Con éste trabajo sedeevalúa y controlan la 7

 

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 precisión y el sesgo debido al análisis de un método de prueba, pero no la exactitud. Una muestra control es una muestra especial insertada en el proceso de comprobación y tratada como si fuera la de un paciente. Debe tener concentraciones apropiadas en niveles significativos, para que el médico pueda utilizarlos para tomar decisiones acerca del tratamiento. Debe hacerse una distinción entre los controles y los calibradores o los estándares, los dos últimos se utilizan para ajustar la instrumentación o definir una curva estándar para el análisis. Además de tener un valor asignado con precisión que ya se probó según un método de referencia, el calibrador debe tener las mismas características que el método control.  Los materiales de calibración y control no son intercambiables. El control debe ser independiente por completo del proceso de calibración para poder detectar errores sistemáticos causados por el deterioro del calibrador o un cambio en el proceso analítico. Las propiedades de un material de control ideal para hematología, según Bachner son las siguientes:  

Económica

 

Estabilidad prolongada

 

Probados directamente

 

Que se suspenda con facilidad y no se aglutine

 

Características de flujo similar a la de la sangre

 

Proporciones ópticas y eléctricas similares a las de la sangre

 

Tamaño y forma de las partículas similares a los de la sangre

 

Evaluable por métodos independientes

Sin embargo, la mayoría de los productos de control para hematología disponibles en el comercio no son muy buenos, pero tienen varias ventajas sobre las muestras de pacientes conservadas.

CONTROL DE CALIDAD EXTERNO. Con un programa de control de calidad externo puede evaluarse la exactitud de un  procedimiento, así como el rendimiento de cada laboratorio o participante sobre una muestra idéntica o compararlo con el rendimiento de laboratorios con métodos iguales o similares. Estos programas de control obligatorios pueden ser inspecciones estatales o nacionales. Se considera que la media del grupo o el resultado consensuado del grupo es el “valor verdadero” o exacto. Así, el rendimiento del laboratorio se evalúa por la proximidad de sus resultados en comparación con los de la opinión promedio del grupo.

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CAPACITACIÓN CONTINUA. Un laboratorio de hematología que pretenda tener un nivel elevado constante, deberá contar con un programa activo de capacitación continua para su personal. Es de suma importancia  programar talleres sobre identificación celular en sangre periférica periférica,, lecturas y seminarios de citogramas e histogramas de recuento diferencial automatizado y su correlación con las anormalidades que puedan hallarse en los extendidos de sangre periférica, solo así podrá detectarse variables espurias relacionadas con la muestra que pueden producir resultados inexactos en los valores obtenidos en hematología automatizada. “El contar con profesionales clínicos bien capacitados y concientes son la mejor forma de  prevenir errores en e n el laboratorio de hematología.” Debe diseñarse un plan que identifique los aspectos necesarios para garantizar la calidad,  junto con los mecanismos y las personas que los evalúen e informen. Las características generales de cualquier plan deben incluir las metas, los objetivos, las fuentes de autoridad, la definición del alcance de servicios, la selección de temas, un calendario de actividades supervisado, las acciones correctivas, la evaluación periódica y los métodos de comunicación. El objetivo de la garantía de calidadconfiables, del laboratorio es yverificar calidad de alos servicios contribuya con resultados exactos precisosque quela coadyuven la  prestación global globa l de aten atención ción médica de excelencia. Esto implica, que el laboratorio deberá d eberá supervisar todos los aspectos de la atención, desde la solicitud de las pruebas hasta el uso de los resultados de la prueba

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PRÁCTICA No. 3 DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA, HEMATOCRITO, VSG, CUENTA DE ERITROCITOS E ÍNDICES ERITROCITARIOS OBJETIVO: El alumno conocerá y realizará los métodos básicos de la fórmula roja para aprender a calcular los índices eritrocitarios. 1.  DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA  1.1  EL MÉTODO DE CIANOMETAHEMOGLOBINA. CI ANOMETAHEMOGLOBINA. En la Citometría hemática una de las determinaciones es la hemoglobina la cual se expresa en g/dl. El método de la Cianometahemoglobina es el más empleado, debido a que es colorimétrico, es barato y permite medir todas las hemoglobinas presentes en la sangre (HbO2, Hb-CO2, Hb-H a excepción de la Hb-S).

FUNDAMENTO. Para convertir la Hb-O2 en Hb-CN se utiliza el Reactivo de Drabkin, el cual contiene ferricianuro de potasio K 3Fe(CN)6  que convierte el Fe ++  en Fe+++ convirtiéndose en metahemoglobina. Luego el KCN del mismo mismo reactivo se combina para formar la Cianometahemoglobina, cuyo pico máximo de absorción es de 540nm con un rango de 530 a 550 nm.

MATERIAL 2 Tubos de ensayo de 13x100 mm por equipo 1 Pipeta de Salhí por equipo 2 Pipeta de 5 ml por equipo 1 Micropipeteador o boquilla por equipo. 1 Perilla por equipo. 1 Espectrofotómetro por sección. REACTIVOS: 10ml de reactivo de Drabkin por equipo PROCEDIMIENTO: 1) Se marcan 2 tubos de ensayo, uno como blanco (B) y otro como problema (P) y se colocan 5 ml. del Reactivo de Drabkin en cada uno. 2) Con la pipeta de Shali, se tom tomaa 0.02 ml ml (20µl) de sangre limpiando  perfectamente la pipeta por fuera con un segmento de papel desechable humedecido con solución salina, se pasan al tubo, lavando la pipeta 2 o 3 veces, por aspiración y expulsión del reactivo dentro de la misma. 3) Se mezcla vigorosamente con cuidado. Dejar reposar la mezcla por 5 minutos. Pasar a las celdas. 4) Ajustar el espectrofotómetro a cero de absorbancia con el blanco de reactivo (B) a 540 nm. y se lee la absorbancia del tubo problema. 5) Calcular la concentración de la Hemoglobina, a partir de la Ley de Beer o bien extrapolando en la Curva de calibración.

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  Ley de Beer

A= a.b.c.

[m] = Abs m [St] Abs St

[m] = concentración de la muestra Abs m = Absorbancia de la muestra c St = concentración del estandard Abs St = Absorbancia del estándar

CURVA DE CALIBRACIÓN. La curva de calibración se realiza de la siguiente manera: a) Marca 5 tubos de ensaye de 13x100 mm: Blanco (B), 5, 10, 15, 20 g/dl  b) Pipetear con precisión, de la solución so lución valorada de cianometahemoglobina (St) de concentración de 20 g/dl y del Reactivo de Drabkin, en cada uno de los tubos correspondientes y mezclar bien. CONCENTRACIÓN HEMOGLOBINA

B

5

10

15

20 g/dl

Cianometahemoglobina

0.0 ml

1.25 ml

2.5 ml

3.75 ml

5.0 ml

Reactivo de Drabkin

5.0 ml

3.75 ml

2,5 ml

1.25 ml

0.0 ml

Estándar de

c) Medir la absorbancia de cada dilución en el espectrofotómetro a 540 nm, contra el blanco (B). d) Graficar en papel milimétrico, en las ordenadas (Y) las absorbancias y en las abscisas (X) las concentraciones. e) Trazar una línea perpendicular que parta del vértice (O) y toque el mayor número de puntos. f)  Extrapola las absorbancias de las muestras problema.

PRECAUCIONES. 1.  Se debe de utilizar guantes para la protección del estudiante. 2.  El reactivo de Drabkin contiene cianuro, es necesario emplear la perilla auxiliar,  prohibido pipetear con la boca. 3.  Es muy importante que las mediciones de las soluciones sean exactas, eso favorecerá que la línea línea perpendicular pase por todos los puntos de intersección. 4.  Verificar antes de iniciar, que el espectrofotómetro esté prendido, se encuentre ajustado a CERO de absorbancia en la longitud de onda de 540 nm.

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VENTAJAS. 1.  El método de Cianometahemoglobina posee ciertas ventajas, ya que la mayoría de las formas de hemoglobina que se puedan encontrar en la sangre (a excepción de Hb S) se convierten a cianometahemoglobina con la adición del reactivo de Drabkin. 2.  La máxima absorción de la cianometahemoglobina a 540 nm, permite la utilización de fotómetros con rangos de lectura cortos.

DESVENTAJAS. 1.  La única desventaja es que se trabaja con pequeños volúmenes de sangre (20 µl) por lo que aumenta la probabilidad de error. VALORES DE REFERENCIA. HOMBRES 15 a 20 g/dl MUJERES 12.5 a 16.5 g/dl

9.3 a 12.4 mmol/l 7.5 a 10.33 mmol/l

2.  MÉTODO DE WINTROBE PARA SEDIMENTACIÓN GLOBULAR Esta sencilla prueba se emplea universalmente como un indicador de la presencia de enfermedades activas, “ya que permite conocer las características físicas del ambiente en el que se encuentran los eritrocitos”. FUNDAMENTO: Consiste en dejar que la sangre sedimente por la acción de la gravedad formando un  paquete más o menos compacto separad separadoo del plasma, ello depe depende nde de varios factores como son: a.  Factores plasmáticos: En donde los niveles elevados en la concentración de fibrinógeno y/o de globulinas originan la disminución del potencial Z de los eritrocitos, favoreciendo la formación del fenómeno de “Rouleaux”.  b.  Factores eritrocitarios: Cuando aumenta tamaño de los eritrocitos (macrocitos), se sedimentan más rápido que los de tamaño normal (normocitos) o los de menor tamaño (microcitos). c.  En los pacientes con anemia se disminuye la relación “eritrocitos/plasma”, lo que favorece el apilamiento de los eritrocitos y el aumento de la VSG.

MATERIAL. 1 Pipeta Pipeta Pasteur por equipo 1 Tubo de Wintrobe por equipo 1 Soporte para tubos de Wintrobe por sección PROCEDIMIENTO. 1.  Mezclar bien el tubo que contiene la sangre. 2.  Llenar la pipeta Pasteur de sangre, después introducir la punta hasta el fondo del tubo de Wintrobe e ir vistiendo lentamente evitando la formación de burbujas, hasta llegar a la marca de “0”. 12

 

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3.  Colocar el tubo verticalmente en la gradilla (fijarse que este nivelada) durante una hora. 4.  Leer la altura de la columna de plasma que aparece en la parte superior, en la escala que va del 0 al 10 cada raya equivale a un mm y se reporta en mm/hora.

PRECAUCIONES. a) El tubo de Wintrobe deberá llenarse desde el fondo hasta la marca cero, evitando la formación de burbujas.  b) Durante el proceso de reposo repo so deberá verificarse que se encuentre exactamente vertical, de lo contrario el valor determinado será erróneo. c) Verificar que el reposo del tubo de Wintrobe este exento de vibraciones. d) La sangre debe de estar perfectamente mezclada para evitar un cambio en la relación, eritrocitos-plasma. VENTAJAS. a) Pequeña cantidad de muestra.  b) Es sencillo. c) Puede calcularse el valor del hematocrito con la misma preparación después de haber determinado la velocidad de sedimentación globular. (VSG). DESVENTAJAS. Se altera fácilmente con movimientos, vibraciones y sangres hemolizadas. VALORES DE REFERENCIA. HOMBRES 0 a 7 mm/hr. MUJERES 0 a 15 mm/hr. 3.  DETERMINACION DE HEMATOCRITO. El hematocrito es un parámetro indispensable para poder calcular los índices eritrocitarios y se define como “el volumen que representa el paquete globular en el total del volumen sanguíneo”. El hematocritodeenhemoglobina porcentaje (%) tres es veces valor adeuno la concentración y surepresenta valor será aproximadamente siempre fraccionario, decirelmenor (en el sistema internacional de unidades). Para reportar dicho vvalor alor se hará como porcentaje o como fracción celular, para su determinación se utiliza el método Wintrobe (macro método) o bien el micro método (en un tubo capilar) que posee menos errores inherentes.

3.1  MACROHEMATOCRITO. MATERIAL. 1 Pipeta Pasteur por equipo 1 Tubo de Wintrobe por equipo 1 Centrifuga por sección PROCEDIMIENTO. 13

 

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Después de haber determinado la VSG con el tubo Wintrobe. a) Calcule el hematocrito, centrifugando el tubo a 3500 r.p.m. durante 30 minutos. En caso de no contar con esta preparación efectuar el procedimiento (2). Procedimiento (2). a) Con una pipeta Pasteur llénese de sangre el tubo Wintrobe hasta la marca de “0” cero.  b) Centrifúguese el tubo A 3500 r.p.m. durante d urante 30 minutos.

LECTURA: En la graduación en la que el “0” cero está en el fondo del tubo, léase a que nivel está el límite superior de la columna roja (la sangre se ha separado en cuatro capas: roja formada  por los eritrocitos, blanca grisácea por leucocitos, amarillenta cremoso por plaquetas y la última líquida formada por plasma habitualmente de color amarillento.). 3.1 MICROHEMATOCRITO. MATERIAL. 2 Capilares por equipo 1 Mechero de Buncen por sección 1 Lector para hematocrito por sección 1 Micro centrífuga por sección PROCEDIMIENTO. a) Llenar con sangre capilar o venosa un tubo capilar aproximadamente tres cuartas partes del total de su longitud.  b) Cierre el extremo del tubo capilar distante de la sangre acercándolo a la flama del mechero y rotándolo, también se puede sellar con plastilina (cerciórese de que el cierre de dicho extremo haya sido completo). c) Centrifúguese en la centrífuga para microhematocrito durante 5 min. d) Leer en el lector del microhematocrito. PRECAUCIONES. a) En ambos se debeexcede de evitar la hemoconcentración de la muestra durante la obtención. Si métodos el hematocrito de 50 % centrifugar nuevamente el capilar o tubo utilizado Para la determinación, durante 5 minutos.  b) En el caso del micro método si el sellado es con mechero cuídese que la sangre sangr e no llegue al extremo calentado del tubo ni quede al nivel de la flama. c) En el caso del macro método el tubo de Wintrobe se debe aforar exactamente a cero y no deben de quedar burbujas de aire entre columna de sangre o en el fondo. e) se debe de mezclar la sangre perfectamente antes de llenar los tubos de Wintrobe o capilares.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS. a) El micro método es el más empleado debido a que requiere menos tiempo de centrifugación, y cantidad de muestra, se puede utilizar sangre capilar o venosa en comparación con el macro método.

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 b) Se prefiere p refiere el micro método debido a que existen diferentes difer entes marcar ccomerciales omerciales de tubos de Wintrobe para el macro método con lo que se obtienen diferentes resultados del hematocrito. c) La cantidad de plasma atrapado es mayor en el macro método dando valores más elevados.

VALOR DE REFERENCIA. HOMBRES 46 a 56 % MUJERES 39 a 50 %

100%

0%

Lector de microhematocrito 4. RECUENTO CELULAR ERITROCITARIO

INTRODUCCIÓN. El recuento de glóbulos en la sangre es una práctica habitual en el laboratorio clínico, en el cual se determina el número de eritrocitos, leucocitos y plaquetas por mm 3 de sangre, con la ayuda de la cámara de Neubauer o hemocitómetro. La cámara de Neubauer o hemocitómetro es un grueso portaobjetos de vidrio, en el centro de su superficie se encuentra un cuadrado de 3 mm de lado dividido en 9 cuadros grandes cada uno de 1 mm, los cuadros marcados con la letra L son utilizados para el recuento de leucocitos y se encuentran divididos por 16 cuadros más pequeños. El cuadro central esta dividido en 25 cuadros los marcados con la letra E son utilizados para el recuento de eritrocitos y los marcados con P para plaquetas. Fig. (1) Cada uno de estos cuadros se divide en 16 cuadros más pequeños dando un total de 400 en el cuadro central. Fig.(2) Área total = 9 mm2.  Área de cada cuadro marcado como L = 1 mm 2. Área de cada cuadro marcado como e y P = 0.04 mm 2 2

Área total de los cincomarcado cuadros centrales 0.2 mmmm . 2. de cada cuadrito como “e”E= 0 0.0025 15

 

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L

E P

8 mm P

E P E P

E

L

P E

L

L e 

0.05mm.

2mm

Fig. (2) Amplificación de un cuadro de eritrocitos.

16

1 mm

 

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CUIDADOS DE LA CÁMARA. a.  Deberán utilizarse cubreobjetos especiales ya que los convencionales poseen superficie irregular. a.  Se debe lavar la cámara con agua tibia o un paño suave empapado en alcohol.  b.   No se deberá deb erá tocar el rayado de la cámara con los dedos ya que manchan la cámara y puede provocar errores de apreciación c.  Evitar usar lienzos rígidos que puedan arañar el rayado sensible de la cámara. Tomarla únicamente por sus bordes MÉTODO DE CONTEO. El conteo se inicia por la parte superior de izquierda a derecha y luego de derecha a izquierda sucesivamente, teniendo la precaución de contar las células que tocan una de cualquiera de las tres líneas como si estuvieran en los cuadros y teniendo la precaución de no contar una célula dos veces. Figura (3)

0.05 mm

.2 mm

Fig. (3) Método de conteo, amplificación de un cuadro de eritrocitos.

MATERIAL. 1 Pipeta de Thoma para glóbulos rojos por equipo 1 Cámara de Neubauer o Hemacitómetro por equipo 1 Boquilla o micropipeteador por equipo Reactivos: 1 frasco con 100ml. de Líquido diluyente de Gower para eritrocitos por sección PROCEDIMIENTO. a) Con la ayuda de la boquilla o el micropipeteador, se aspira sangre homogeneizada con la pipeta de Thoma para eritrocitos hasta la marca de 0.5  b) Aspirar luego el líquido diluyente de eritrocitos hasta la marca mar ca 101.

17

 

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c) Se debe de evitar la formación de burbujas. Agitar la pipeta suavemente para mezclar o bien mezcle por medio de agitador electrónico si es que cuenta con él. d) Eliminar de 4-5 gotas de la pipeta y con la siguiente llenar por capilaridad la cámara de Neubauer previamente preparada. e) Dejarla reposar por dos minutos, colocarla bajo el objetivo seco fuerte (40x) y contar los eritrocitos presentes en los cinco cuadros marcados con la letra E, utilizando el método señalado. f) Una vez concluido el conteo, lavar la cámara con el agua de la llave, agua destilada y finalmente con alcohol. Secar con un paño limpio, suavemente y utilizar jabón si es necesario.  NOTA: Llenar ambos lados de la cámara de Neubauer, sacar un promedio de los conteos y calcular el número de eritrocitos 7 mm3  multiplicando por el factor de 10000 mm3  Reportar el número de eritrocitos por milímetro cúbico de sangre.

CÁLCULOS: El factor 10,000 esta dado por: - 1.5 que corresponde a la fracción de la cámara en la que se cuentan los eritrocitos (los 25 cuadros centrales). - 1/10 es la profundidad de la cámara de Neubauer. 1/200 es la dilución realizada a la sangre con la pipeta de Thoma. ( 1/5 ) ( 1/10 ) ! 1/200 ) = ( 1/19,000 mm 3 ) Esto será valido en el caso de que la dilución inicial haya sido 1:200 y se cuenten los cinco cuadros marcados con la letra E.

CONCENTRACIONES. El líquido diluyente de Gower para eritrocitos es isotónico y actúa como fijador para  preservar la forma celular. VALORES DE REFERENCIA EN EL S.I

3

HOMBRES: 5.5 a 6.3 Millones / mm   o µl

5.5 a 6.3 x 1012  /1

MUJERES: 4.1 a 5.73 =Millones 1 mm 1 µl / mm   o µl

4.1 a 5.7 x 10   /1

3

12

5. VOLUMEN VOLUMEN CORPUSCULAR MEDIO. Este parámetro nos indica el tamaño promedio de los eritrocitos en un paciente y se calcula de la siguiente manera.

Hematocrito (Hto) VCM =  ________________________________   x 10 = u3  #  de eritrocitos / ul

18

 

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  La obtención de un VCM inferior a los valores de referencia, indicará la presencia de eritrocitos pequeños o microcíticos. La obtención de un VCM que cae entre los valores de referencia, indicará que se tienen eritrocitos de tamaño normal o normocitos. La obtención de un VCM mayor a los valores de referencia, indicará la presencia de eritrocitos grandes o macrocitos.

VALORES DE REFERENCIA. HOMBRES MUJERES

En el S. I. 84 a 95 f1 78 a 103 f1

3

84 a 95 u   79 a 103 u3 

6. CONCENTRACION MEDIA DE HEMOGLOBINA CORPUSCULAR.  Este índice eritrocitario da una idea de la coloración de los eritrocitos en base a su contenido de hemoglobina, ya que determina la concentración promedio de hemoglobina en todos lo eritrocitos. Su determinación se realiza de la siguiente manera: Hemoglobina ( g/100 ml)

CMHC =

 _______________________  ___________ ________________________ ____________________  ________ 

  x 100 = g/dl

Hematocrito (%) La obtención de una concentración media de hemoglobina corpuscular (CMHC) menor a los valores de referencia indicará la presencia de eritrocitos con un bajo contenido de hemoglobina o hipocrómicos. La obtención de un valor mayor o menor a los valores de referencia, indicará la  presencia de eritrocitos hipercrómicos. Sin embargo debe de usarse rara vez este término, ya que el único eritrocito hipercrómico es el esferocito. Un valor de CMHC que cae entre los valores de referencia indicará la presencia de eritrocitos con contenido normal de hemoglobina o normocrómicos.

VALORES DE REFERENCIA. En el S. I. HOMBRES. 32 aa 34 MUJERES. 30 32 g/dl g/dl

9.85 18.61 aa 21.10 21.10 m m mol/1 mol/1

7. HEMOGLOBINA CORPUSCULAR MEDIA ( CMH ). Este último índice eritrocitario nos indica el promedio de hemoglobina en cada eritrocito y se calcula de la manera siguiente. Hemoglobina ( g/dl )

CMH =

 ________________________  _____________ ______________________ _______________  ____ 

  x 10 = pg

# de eritrocitos / ul

Es importante comprender que las células microcíticas “no” son hipocrómicas en forma obligada, y los macrocitos “no” son por lo general hipercrómicos, esto hace que la 19

 

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hemoglobina corpuscular media (CMH) sea demasiado inútil, ya que no toma en cuenta el tamaño de la célula-

VALORES DE REFERENCIA. EN HOMBRES Y MUJERES

27 a 31 pg (también en el S.I)

8. FORMA DE REPORTAR LOS RESULTADOS.   El diagnóstico de una anemia está basado en el historial clínico del paciente, el examen físico y la investigación por parte del laboratorio. El médico examinará el informe de los resultados proporcionados por el laboratorio, aquí el Químico toma una gran importancia, ya que en él cae la responsabilidad de ayudar a diagnosticar trastornos hematológicos en un  paciente. Los datos más importantes que debe reportar el laboratorio en la biometría hemática son los siguientes: FECHA:___________________ PACIENTE:_______________________________________________________________ DOCTOR(A):______________________________________________________________ EXAMEN:________________________________________________________________ VALORES DE REFERENCIA RESULTADO ERITROCITOS (millones) m/ml HEMOGLOBINA (g/dL) HEMATOCRITO (%) HCM (pg) CmHb (%)

HOMBRES 5.5 - 6.3 15 - 20 46 - 56 27 - 34 32- 34

VCM mm VGM (fl) VSG (mm/hr)

840 - 95 7

 3

MUJERES. 4.1 - 5.7 12.5 - 16.5 39 - 50 27 - 34 30 - 34 780 -- 103 13

VALORES DE REFERENCIA RESULTADO

HOMBRES MUJERES. 0.5 - 1.5 0.5- 1.5 150,000 - 450,000 4,000 - 12000

RETICULOCITOS (%) PLAQUETAS (x mm 3 ) ml LEUCOCITOS (x mm 3 ) ml

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FORMULA DIFERENCIAL MIELOCITOS METAMIELOCITOS EN BAMDA SEGMENTADOS  NEUTROFILLOS EOSINOFILOS BASOFILOS LINFOCITOS MONOCITOS

CIFRAS RELATIVAS (%) 0 0–2 0 – 11 40 – 74 40 – 85 0–7 0–3 12 – 46 1 – 13

CIFRAS ABSOLUTAS (Células/ µL) 0 10-500 100-800 2 000-6 000 1 500-7 000 100 -200 10-20 1 000 -4 200 100-800

OBSERVACIONES: Anormalidades de eritrocitos: Anormalidades de leucocitos: Anormalidades de plaquetas:

ATENTAMENTE  _________________________________  __________________________ _______

21

 

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PRÁCTICA No. 4 CUENTA DE LEUCOCITOS Y REALIZACIÓN DE EXTENDIDO SANGUÍNEO (TINCIÓN DE WRIGHT Y GIEMSA) CON VALORES ABSOLUTOS Y RELATIVOS. OBJETIVO: El alumno realizará la cuenta de leucocitos y un extendido de sangre periférica paradeidentificar la morfología de cada una absolutos de las células y aprenderá fundamentos las tinciones y a obtener valores de cada uno d los leucocitos. 1. CUENTA DE LEUCOCITOS INTRODUCCIÓN. El recuento de glóbulos en la sangre es una práctica habitual en el laboratorio clínico, en el cual se determina el número de eritrocitos, leucocitos y plaquetas por mm 3 de sangre, con la ayuda de la cámara de Neubauer o hemacitómetro. La cámara de Neubauer o hemacitómetro es un grueso portaobjetos de vidrio, en el centro de su superficie se encuentra un cuadrado de 3 mm de lado dividido en 9 cuadros grandes cada uno de 1 mm, los cuadros marcados con la letra L son utilizados para el recuento de leucocitos y se encuentran divididos por 16 cuadros más pequeños. El cuadro central esta dividido en 25 cuadros los marcados con la letra E son utilizados para el recuento de eritrocitos y los marcados con P para plaquetas. Fig. (1) Cada uno de estos cuadros se divide en 16 cuadros más pequeños dando un total de 400 en el cuadro central. Fig.(2) Área total = 9 mm2.  Área de cada cuadro marcado como L = 1 mm 2. Área de cada cuadro marcado como e y P = 0.04 mm 2 Área total de los cinco cuadros centrales E= 0.2 mm 2. Área de cada cuadrito marcado como “e” 0 0.0025 mm2.

CUIDADOS DE LA CÁMARA. 2.1. Deberán utilizarse cubreobjetos especiales ya que los convencionales poseen superficie irregular. 2.2  Se debe lavar la cámara con agua tibia o un paño suave empapado en alcohol. 2.3  No se deberá tocar el rayado de la cá cámara mara con los dedos ya que manchan la cámara c ámara y  puede provocar errores errore s de apreciación 2.4 Evitar usar lienzos rígidos que puedan arañar el rayado sensible de la cámara. Tomarla únicamente por sus bordes MÉTODO DE CONTEO. El conteo se inicia por la parte superior de izquierda a derecha y luego de derecha a izquierda sucesivamente, teniendo la precaución de contar las células que tocan una de cualquiera de las tres línea como si estuvieran en los cuadros y teniendo la precaución de no contar una célula dos veces. Figura (3)

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1 mm

8 mm

L

E P P

E P E P

E

L

P E

L

L 0.05 mm

.2 mm

Fig. (3) Método de conteo, amplificación de un cuadro de leucocitos

23

 

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MATERIAL: 1 Pipeta de Thoma para glóbulos blancos por equipo 1 Cámara de Neubauer o hemacitómetro por equipo 1 Boquilla o micropipeteador por equipo 1 Microscopio por equipo Reactivos: Diluyente para leucocitos (TURK)

PROCEDIMIENTO. a) Llenar de sangre homogenizada la pipeta de leucocitos hasta la marca 0.5 aforando exactamente.  b) Limpiar con papel absorbente absorben te el exterior de la pipeta. c) Aspirar líquido diluyente de leucocitos leucocitos hasta la marca 11. d) Tapar los extremos de la pipeta y agitar manualmente. La agitación podrá hacerse con el agitador mecánico de pipetas si se cuenta con el. e) Limpiar la cámara, el cubreobjetos y colocar éste sobre aquella. f) Eliminar las cinco gotas de la pipeta y con la siguiente llenar por capilaridad la cámara. g) Después de dos minutos observar a seco débil, 1/10x) localizar el área correspondiente para contar leucocitos (cuadros L ) , y proceder a contarlos. h) El número de leucocitos contados en los cuadros grandes se multiplican por el factor 50, donde el número de leucocitos por milímetro cúbico de sangre. i) Si existe leucopenia es decir un número de leucocitos inferior a 2000, repetir la cuenta de acuerdo con las siguientes indicaciones. Llenar la pipeta con sangre hasta la marca 1 y aforar hasta 11 con el diluyente, llenar la cámara y contar nueve cuadros, el resultado se multiplica por 11.1; si las cifras son de 2000 a 4000 se hace una dilución 1:20, se cuentan nueve cuadros y se multiplica por 22.2 Si hay leucocitosis (más de 50000 leucocitos/ mm3 ) se emplean pipetas de Thoma  para eritrocitos, las diluciones son de 1/100 1 /100 a 1:200. Con dilución 1:100, los factores de multiplicación serían 1000, 500, 333, 250 y 111, si se cuentan 1,2,3,4,y 9 cuadros de la cámara. Con dilución 1:200, los factores de multiplicación serán 2000, 1000,500, 222 si se cuentan 1,2,4, y 9 cuadros. CÁLCULOS. Para conocer el número de leucocitos por mm3 de sangre se aplica la siguiente fórmula. 3

 Número de leucocitos / mm =

 Número de células contadas.

 ________________________  ____________ _______________________ ______________________  ___________ 

 

Volumen Volumen = Dilución x profundidad de la1:20 cámara x el área contada. Las diluciones para leucocitos son 1:10, 24

 

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La profundidad de la cámara es de 1/10 mm El área contada en leucocitos es: 4 mm 2  ( 4 cuadrados contados ) Por ejemplo: Leucocitos contados 500 Cuadros L utilizados 4 Dilución 1:20 Sustituyendo la formula: V = ( 1/20 ) ( 1:10 ) ( 4 ) = 4/ 4/200 200 = 1/50 mm3

 Número de células contadas. Leucocitos / mm =  ___________________________________ =  Volumen

500

3

_______ 

 

1

 _______ 

  50 mm3 

500 x 50 mm3  25,000 / mm3

= = En leucocitosis: Dilución realizada Profundidad de la cámara Cuadros utilizados Leucocitos contados

1/100 1/10 2 80

Volumen = Dilución x profundidad x área contada. Volumen = ( 1/100 ) ( 1/10) ( 2 ) = 2/1000  Número de células contadas   Volumen

3

 ______________________  __________ _______________________  ___________ 

 Número de Leucocitos/mm =

80

=

80 x 1000

 ______

  _______________ 

=

2  ____ 1000

2

80000

=

 

 ___________

2 25

= 40000/ mm3 

 

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  CONSIDERACIONES. El líquido diluyente de leucocitos lisa eritrocitos y es isotónica para los leucocitos.

VALORES DE REFERENCIA. EN HOMBRES Y MUJERES: EN EL SISTEMA INTERNACIONAL:

4000 - 12000 Leucocitos/ mm3 4 - 12 X 109 leucocitos/L.

2. TINCIONES HEMATOLÓGICAS 2.1. TINCION DE WRIGHT. El recuento diferencial es una parte importante de la valoración hematológica y consiste en reconocer las distintas variedades de glóbulos blancos y las posibles anormalidades celulares en un frotis de sangre teñido con el colorante de Wright. Debido a que el colorante de Wright se trata de una solución de eosina y una mezcla de tiacinas que incluyen el azul de metileno, el citoplasma de las células se tiñen con el colorante ácido (eosina) ya que en él, se encuentran los componentes básicos de la célula, por otro lado, el núcleo de la célula se tiñe con los colorantes básicos (azul de metileno) ya que en el se encuentran los componentes ácidos de la célula. MATERIAL. 1Puente de tinción por sección 2 Portaobjetos por equipo 1 Microscopio por equipo 1 Contador de células por sección Agua destilada. Aceite de inmersión. REACTIVOS. Colorante de Wright Buffer pH = 7.0 Para el recuento diferencial el frotis no deberá ser tan fino no tan grueso de tal manera que las células estén juntas pero no apiladas. La extensión que se prepare deberá secarse inmediatamente.

MÉTODOS PARA PREPARAR EXTENDIONES SANGUINEAS. 1.- Método de los dos portaobjetos o de la cuña. a)  Colocar la gota de sangre de un tamaño regular (2 a 3 mm de diámetro) aproximadamente a un centímetro centímetro del extremo de un portaobjetos.  b)  Tomar otro portaobjetos con el dedo índice y pulgar de la mano derecha. c)  Colocar el borde libre sobre la gota de sangre y dejar que esta se extienda a lo largo del borde libre. El segundo portaobjetos deberá hacer un ángulo de 30 a 45 º con el primer portaobjetos. Con movimiento suave pero firme y a velocidad constante desplazar el segundo  portaobjetos a lo largo del primer portaobjetos. 26

 

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Es una buena extensión, los leucocitos no están demasiado juntos y los eritrocitos no están apilados. El secado de la extensión debe de hacerse con movimientos laterales y verticales repetidos al aire o con un ventilador. ventilador. Marcar los frotis con lápiz graso o de  plomo para su correcta identificación. 2.- Método de los dos cubreobjetos. Es un método que requiere mayor práctica y no es tan usual. 3.- Método de centrifugación. Es un método casi automatizado, brinda mejores resultados pero debido a lo anterior no es tan utilizado comúnmente. 4.- Método transversal. Es el más empleado en la actualidad y su técnica es la siguiente:

1

2

3

4

27

 

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Se coloca una gota de sangre en el borde del portaobjetos colocado horizontalmente, y se llena por capilaridad en su borde inferior el otro portaobjetos colocado a 45 º, la sangre se extiende en forma transversal hacia el otro extremo del portaobjetos, en el paso siguiente se unen ambos para que la sangre se extienda homogéneamente a lo ancho de la superficie del fondo, después se desliza el portaobjetos de arriba para retirar el exceso de sangre, quedando una película delgada que se secará con movimientos vigorosos de arriba hacia abajo quedando la preparación lista para ser teñida; se contarán de 100 a 200 células si el número de leucocitos es de 2 000 - 10 000 leucocitos/mm 3 , y de 200 - 400 células si la cifra de leucocitos/ mm3 es superior a 10 000. La lectura se hará con un microscopio de luz, realizando una observación primera a 40x  para tener una panorámica de la distribución de las células, después a 100x para estudiara fondo la morfología de las células.

FIJACIÓN. Es necesaria una fijación de la extensión sanguínea para evitar la pérdida de muestra en el portaobjetos. Existen dos tipos de fijación.   Química.- Ésta se hace cubriendo la extensión sanguínea por uno a dos minutos con metanol puro o alcohol absoluto, o bien, quince minutos en alcohol absoluto-éter 1:1, también se puede usar una solución de HgCl 2  al 1 % o solución al 1 % de formalina en alcohol.   Calor.- Casi no se usa debido a las alteraciones que causa en la muestra. Algunos colorantes fijan y tiñen a la vez como por ejemplo el colorante de Wright que contiene metanol como fijador, y existen así mismo otras soluciones fijadoras especiales. PROCEDIMIENTO a) Realice un frotis sanguíneo por el método transversal y se deja secar al aire sobre el puente de tinción.  b) Cubra la extensión ccon on un exc exceso eso de colorante de Wright durante 2 minutos, esto tiene como finalidad evitar la evaporación del colorante y la formación de precipitados. c) Transcurrido el tiempo, añada una cantidad igual de solución amortiguadora. d) Soplar suavemente sobre la superficie de la mezcla con la finalidad de homogenizar. e) Se deja reposar exactamente 4 minutos. f) Sin tirar la mezcla, lave con agua destilada hasta que el agua que escurra no lleve colorante. g) Secar al aire y añadir una gota de aceite de inmersión para observar en el microscopio a inmersión. h) Para la fórmula diferencial debe de contarse 100 células y deberá hacerse la diferenciación entre monocitos, linfocitos, basófilos, eosinófilos, neutrófilos, y simultáneamente, ver el número de mielocitos, bandas, metamielocitos, y segmentados que existen entre neutrófilos, si hay otro tipo de células como por ejemplo blastos, deberán incluirse en el total.

28

 

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CONCLUSIONES:  

 

     

Se deben obtener extensiones de sangre bien niveladas para un trabajo exacto. Los portaobjetos deben estar perfectamente limpios y sin grasa para que no se deformen las células. Si el frotis se realiza del pulpejo del dedo, su elaboración debe ser rápida antes de que inicie la coagulación y sin exprimir el dedo para evitar la hemodilución. En casos graves de anemia hay que preparar extensiones delgadas y secarlas al momento. El borde del portaobjetos extensor debe de ser liso para evitar zonas con abundantes leucocitos.

METODO DE CONTEO: El recuento diferencial se realiza recorriendo el largo de la preparación de izquierda a derecha hasta contar 100 células, identificando cada una de ellas, si no basta un solo recorrido, se elige un nuevo campo y se hace completar el número de células. (Fig. 12)

Fig. ( 12 )

2.2  TINCION MAY GRÜNWALD-GIEMSA: Es una tinción que también se usa de rutina en muchos laboratorios, pero es un poco más tardada, sin embargo mediante esta tinción se pueden diferenciar mucho mejor las estructuras intercelulares. Contiene azur II-eosina y eosinato azul de metileno aunque actualmente el colorante se vende por separado el mercado por lo que seguiremos la siguiente técnica.

PROCEDIMIENTO: a) Cubrir la extensión con 10 gotas a 15 gotas de May Grünwald tres minutos.  b) Añadir la misma cantidad de agua destilada procurando procur ando que se mezclen por un minuto. c) Escurrir el líquido y " sin previo lavado " añadir la solución diluida de Giemsa recién preparada dejándola actuar por 30 min. d) Lavar, secar y observar a inmersión.

29

 

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2.4 TINCION DE AZUL DE PRUSIA: Se utiliza para la identificación de gránulos de hierro (Fe) en el citoplasma de los eritrocitos que se presentan en casos de ciertas anemias refractarias, después de una esplenectomía u otros casos. Los gránulos de hierro no están unidos al grupo heme sino a la apoferritina (proteína) constituyendo a la ferritina (en forma de gránulos). En médula ósea se presentan con mayor frecuencia en el caso de los normoblastos aunque recordemos que su presencia es normal debido a la síntesis de la hemoglobina. Estos gránulos no se observan en casos de anemias  por deficiencia de hierro. Los gránulos g ránulos aparecen de color azul. az ul.

PROCEDIMIENTO PARA EXTENSIONES DE SANGRE PERIFÉRICA: a ) Preparar una extensión sanguínea fina, secarla al aire.  b) Fijar por 5 a 10 min. en metanol absoluto, secar. sec ar. c) Introducir la extensión en una mezcla mezcla de K 3  Fe (CN)6  -HCl 1:1 por 10 minutos. d) Lavar con agua destilada. e) Contrastar con eosina acuosa al 0.1 % por uno a dos minutos o solución de safranina, f) Lavar, secar al aire y observar a inmersión.

PROCEDIMIENTO PARA EXTENSIONES DE MÉDULA ÓSEA: 1.  Aspirar 3.0 ml de una solución e EDTA (1 mg/ml) en una jeringa de plástico, tomar de 20 ml junto con 3.0 ml de sangre y médula ósea aspirados. 2.  Depositar el contenido de la jeringa en un vidrio e reloj grande e identificar las  partículas de médula ósea. 3.  Extender las partículas de médula ósea. 4.  Fijar la extensión en metanol por 10 min. 5.  Lavar en agua destilada. 6.  Contrastar con eosina acuosa al 0.1 % o solución de safranina por uno o dos 7.  minutos. Lavar con agua destilada, secar y observar a inmersión.

2. 5 FORMA DE REPORTAR. MIELOCITOS METAMIELOCITOS. EN BANDA. SEGEMTNADO.  NEUTROFILOS. EOSINOFILOS BASOFILOS. LINFOCITOS. MONOCITOS.

VALOR OBTENIDO ________________ ________________ ________________ ________________ ________________ ________________ ________________ ________________ ________________

30

* VALOR DEW REF. (%) 0 0 0 - 11 40 - 74 40 85 0 -7 0 -3 12 - 46 1 - 13

 

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PRÁCTICA No. 5 CUENTA DE RETICULOCITOS Y FRAGILIDAD ERITROCITARIA A SOLUCIONES HIPOTÓNICAS OBJETIVO: El alumno aprenderá a realizar la cuenta de reticulocitos y su importancia en la valoración de la eritropoyesis en la médula ósea. 1. CUENTA DE RETICULOCITOS. INTRODUCCIÓN: Los eritrocitos anucleados que contienen organelos y un sistema ribosómico extenso para sintetizar hemoglobina, se conocen como reticulocitos, los cuales son retenidos de dos a tres días en médula ósea y después permanecen otro día en la circulación periférica, indicando la actividad eficaz de la médula ósea para producir eritrocitos. MATERIAL. 2 Tubos de ensayo por equipo 1 Baño maría por equipo 1 Termómetro por equipo Aceite de inmersión. 1 Microscopio por equipo REACTIVOS: Azul cresil brillante

PROCEDIMIENTO: 1.  En el tubo de ensaye colocar 2 gotas de azul de cresil brillante con dos gotas de sangre homogenizada y mezclar nuevamente. 2.  Incubar la mezcla por 10 min. en el baño María a 37 º C 3.  Transcurrido el tiempo preparar una extensión por el método transversal de la siguiente manera:  

Coloque unaportaobjetos. gota de la siguiente preparación de 2 a 3 mm de diámetro en el  borde de un   Coloque el otro portaobjetos sobre la gota en un ángulo de 45ª y deje que se distribuya por capilaridad.   Extienda la sangre en forma transversal hacia el otro extremo de portaobjetos.   Una ambos portaobjetos para que la sangre se extienda homogéneamente a lo ancho de la superficie.   Deslice el portaobjetos de arriba para retirar el exceso de sangre quedando una  película delgada.   Secar y observar a inmersión.

4.  Los reticulocitos s observarán de color azul, con material reticular citoplasmático de color azul intenso. 5.  Contar 1000 eritrocitos y los reticulocitos que se encuentran entre ellos, o bien, contar el número de reticulocitos que hay en 10 campos 31

 

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CALCULOS.   Número de reticulocitos contados

 _______________________  __________ ________________________ ______________________ ______________  ___ 

% de reticulocitos =

  x 100

 Número de células contadas.

% de reticulocitos

 Número de reticulocitos contados  ________________________  ___________ ________________________ ______________________ ______________  ___  =    Número de campos recorridos (10) ( 10) % de reticulocitos.

 No. absoluto de restis.

=

 ______________________  __________ ______________ __

( Número de eritrocitos / mm3 ).

100

PRECAUCIONES:  

Agregar la cantidad de sangre y colorante indicadas para evitar dificultad al examinar las preparaciones.



Asegurarse quelos lascampos células tengan en el frotis se encuentran distribuidas    para evitar que un número confuso de eritrocitos.homogéneamente    No se debe de contar dos veces vec es la misma célula.   La sangre a utilizar debe mezclarse perfectamente para no alterar el resultado.

VENTAJAS:  

Es un método económico.   La preparación del complejo RNA-colorante no requiere temperatura estrictamente controlada.   El método utilizado para la realización del frotis asegura una distribución más uniforme que cualquier otro método.

DESVENTAJAS:   Debido a número de eritrocitos que se deben de contar el error es relativamente grande.   Si no se eligen adecuadamente los campos se pueden contar un mayor o menor número de reticulocitos. VALOR DE REFERENCIA. HOMBRES Y MUJERES

VALOR RELATIVO. 0.5 a 1.5 %

32

EN EL S.I. 0.005 a 0.015

 

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2. FRAGILIDAD A LAS SOLUCIONES HIPOTÓNICAS FUNDAMENTO: Al estar los eritrocitos a concentraciones cada vez menores de sal, estos se van llenando con agua y se lisan. Eritrocitos que tengan una estructura defectuosa de su membrana, se lisaran primero o antes del testigo que tiene una estructura normal. Éste análisis es parte de un estudio para anemias hemolíticas hereditarias. ESPECÍMEN. De 4 a 5ml de sangre con EDTA con anticoagulante al 7.5%. Debe tomarse un testigo para la buena interpretación de los resultados. REACTIVOS Y EQUIPO: Solución salina (cloruro de sodio) al 0.85% y 0.9%, espectrofotómetro, tubos y pipetas. TÉCNICA: 1.  En una gradilla poner 15 tubos de 15 x 100mm. En el primero pipetear 2ml de solución salina, en el segundo 2.5ml, aumentar 0.5ml en cada tubo, en el tubo 14  poner 8.5ml de solución salina solamente, en el tubo 15 poner 8.5ml de solución salina al 9.0%. 2.  Completar a 8.5ml. el volumen de cada tubo con agua destilada desionizada. La concentración final de NaCl y los volúmenes se ven en la siguiente tabla: TUBO 1 2 3 4 5

SOL. SALINA (ml) 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0

H2O 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5

CONC. NaCl (%) 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40

67 8 9 10 11 12 13 14 15

4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 8.5

4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0,0

0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90

3.  Colocar en la misma gradilla y por delante de los tubos anteriores, dos series de tubos de 15 x 100mm. Numerar los tubos del 1 al 12 y marcar T para el testigo y P  para el problema.

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4.  Pasar de la serie de tubos de la mezcla con agua y solución salina, 3ml al tubo correspondiente. 5.  Con una pipeta Pasteur, poner una gota de sangre en cada tubo, la sangre deberá estar mezclándose continuamente antes de agregar la gota (T para testigo, P para  problema). 6.  Agitar cada tubo con las manos, con golpes laterales. Dejar los tubos en reposo a temperatura ambiente durante 30-60min. 7.  Centrifugar los tubos a 1500rpm, durante 3 minutos, cuidando de no darle a los tubos movimientos bruscos después de centrifugar. 8.  Leer tanto en la serie testigo y en la problema, en que tubo se inicia la hemólisis (hemólisis inicial) y en cual ya no existe el botón de eritrocitos (hemólisis completa). Ver en el cuadro anterior a que concentración de NaCl pertenece, tanto la hemólisis inicial como la completa. Ejemplo: HEMÓLISIS INICIAL 0.50% 0.60%

TESTIGO PROBLEMA

VALORES DE REFERENCIA: 0.45% - 0.50%

HEMÓLISIS FINAL 0.30% 0.45%

0.30% - 0.40%

Si se requiere ser más preciso, puede leerse en el espectrofotómetro a 420nm. La absorbancia y graficar la hemólisis como en las graficas anexas. Usar solución salina como  blanco. Gráfica de preferencia p referencia el porcentaje de hemólisis contra la concentración concentra ción en gramos (% de NaCl).

120 100 80 60 40 20 0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

34

0.7

0.8

0.9

1.0

 

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PRÁCTICA No. 6 CITOMETRÍA MANUAL

HEMÁTICA COMPLETA DE FORMA

OBJETIVO: El alumno realizará una citometría hemática completa en forma manual e interpretará los resultados obtenidos, detectando posibles causas de error en sus resultados. REPORTE DE RESULTADOS: FECHA: ____________ ___________________ _______ PACIENTE: ___________ _______________________ ________________________ _________________________ ________________________ ______________ ___ DOCTOR(A): ____________ _________________________ ________________________ _______________________ _________________________ _____________ EXAMEN: ____________ _________________________ _________________________ ________________________ ________________________ ______________ __ VALORES DE REFERENCIA RESULTADO

HOMBRES 5.5 - 6.3 15 - 20 46 - 56 27 - 34 32- 34 84- 95 0- 7

Eritrocitos (millones) m/ml Hemoglobina (g/dL) Hematócrito (%) HCM (pg) CmHb (%) VCM mm 3 VGM (fl) VSG (mm/hr)

MUJERES. 4.1 - 5.7 12.5 - 16.5 39 - 50 27 - 34 30 - 34 78 - 103 0 - 13

VALORES DE REFERENCIA

RESULTADO

HOMBRES MUJERES 0.5 - 1.5 0.5- 1.5 150,000 - 450,000 4,000 - 12000

Reticulocitos (%) Plaquetas (x mm 3 ) ml Leucocitos (x mm 3 ) ml

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FORMULA DIFERENCIAL

RESULTADOS (%)

CIFRAS RELATIVAS (%)

MIELOCITOS METAMIELOCITOS EN BAMDA SEGMENTADOS

0 0–2 0 – 11 40 – 74

 NEUTROFILLOS EOSINOFILOS BASOFILOS LINFOCITOS MONOCITOS

040––785 0–3 12 – 46 1 – 13

FORMULA DIFERENCIAL

RESULTADOS (Células/ µL)

CIFRAS ABSOLUTAS (Células/ µL)

MIELOCITOS METAMIELOCITOS EN BAMDA SEGMENTADOS  NEUTROFILLOS

0 10-500 100-800 2 000-6 000 1 500-7 000

EOSINOFILOS BASOFILOS LINFOCITOS MONOCITOS

100 -200 10-20 1 000 -4 200 100-800

OBSERVACIONES: Anormalidades de eritrocitos: Anormalidades de leucocitos: Anormalidades de plaquetas:

ATENTAMENTE

 _________________________________  __________________________ _______

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PRÁCTICA No. 7 CITOMETRÍA HEMÁTICA AUTOMATIZADA. OBJETIVO: El alumno realizará una citometría hemática por métodos automatizados y hará la interpretación de sus resultados W. Coulter describió su método "El instrumento emplea un sistema de medición no óptico que provee un rango de medición que excede las 6.000 células individuales por segundo con un intervalo de conteo de 15 segundos. Una suspensión de células sanguíneas es pasada a través de un pequeño orificio simultáneamente con una corriente eléctrica. Las células sanguíneas individuales pasando a través del orificio producen un cambio de impedancia (resistencia) en el orificio el cual está determinado por el tamaño de la célula. El sistema cuenta las células individuales y provee distribución de tamaños. El número de células contadas por muestra es aproximadamente 100 veces mayor que los recuentos microscópicos, reduciendo el error estadístico aproximadamente 10 veces"(1) • 

El Coulter Counter Model S fue el primer instrumento que de manera automática  procesó datos multiparamétricos en sangre. sangre .

• 

El número de pulsos eléctricos indica la cantidad de partículas que pasan a través de la apertura y el tamaño  de los pulsos  es proporcional al volumen de las partículas(2,3,4,5) •  Los contadores modernos aún siguen usando este método, el cual es el método de referencia para recuentos de células

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• 

Los contadores COULTER realizan este recuento por triplicado  para eritrocitos, leucocitos y plaquetas •  Este sistema es actualmente el método de referencia para el recuento de células y es usado por todos los fabricantes de contadores celulares

Algunas limitaciones del Método Las limitaciones de este método están relacionadas con los tipos de partículas a medir, como condición básica las partículas en estudio deben ser menos conductoras de electricidad que el medio en que están disueltas, el tamaño de las partículas a medir debe estar entre el 2 y el 60 % de el diámetro de la apertura ¿Como se diferencian los Eritrocitos, Leucocitos y Plaquetas? Los sistemas COULTER poseen 2 baños, uno de eritrocitos y otro de leucocitos, en el baño de eritrocitos se encuentra una apertura de 50µm y en el de los leucocitos otra de 100 µm En cada apertura se realizan 3 recuentos de 4 segundos y se obtiene el promedio (en el caso de STKS y GEN-S, estos poseen 3 aperturas de eritrocitos y 3 de leucocitos por lo que la lectura sólo dura 4 segundos y se obtiene el promedio de las 3 aperturas) En el baño de los eritrocitos el sistema identifica los eritrocitos como aquellas partículas que poseen un o mayor que 36 (femtolitro), se realiza el recuento de volumen plaquetasigual las cuales tienen un fL volumen entre en 2 yeste 20 mismo fL, en baño los contadores COULTER si existe un recuento pequeño de plaquetas, el tiempo de recuento se extiende  por 4 segundos más, a fin de tener un mayor valor estadístico. En el baño de leucocitos posterior a la dilución con diluyente isotónico, se aplica agente lisante, el cual destruye la membrana citoplasmática de eritrocitos y leucocitos,  permaneciendo los núcleos intactos. Es así que las partículas que midan 35 fL o más son contadas como leucocitos. Hay que hacer notar que los núcleos de eritroblastos si existiesen también son contados, por lo que si el instrumento señala sospecha de su presencia se deben  buscar en el frotis y de tener un número considerable, se debe corregir el recuento de leucocitos. Posterior al recuento de leucocitos y utilizando la reacción química del lisante con la hemoglobina libre en la mezcla, se mide un complejo químico estable a 525 nm, el cual dependiendo del instrumento, flujo especialmente diseñada. puede ser realizado en el mismo baño o en una cubeta de Consecuentemente los parámetros medidos son: Eritrocitos (RBC), Leucocitos (WBC), Plaquetas (PLT) y Hemoglobina (Hgb) Los parámetros derivados de las mediciones de volumen: Volumen corpuscular medio (VCM), Ancho de distribución eritrocitaria (ADE) y Volumen plaquetario medio (VPM) Los parámetros calculados son: Hematocrito (Hct), Hemoglobina corpuscular media (HCM) y concentración corpuscular media (CHCM

¿Como se obtienen los histogramas de leucocitos, eritrocitos y plaquetas? Como se mencionaba anteriormente el analizador mantiene una estadística de los volúmenes celulares, y luego realiza una distribución de cantidad relativa versus volumen de estas tres poblaciones, la separación de volúmenes se hace con una resolución de 256 canales para cada parámetro 39

 

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PRÁCTICA No, 8 SEMINARIO SOBRE INTERPRETACIÓN DE HISTOGRAMAS OBJETIVO: El alumno conocerá las diferentes distribuciones de células en los histogramas para aprender a interpretarlos correctamente. 

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PRÁCTICA No. 9 CITOMETRÍA HEMÁTICA Y SU INTERPRETACIÓN EN DIVERSAS PATOLOGÍAS OBJETIVO: El alumno aprenderá a interpretar y correlacionar la alteración de los parámetros de la citometría hemática con diversas patologías. INTRODUCCIÓN La anemia  es una alteración causada por disminución del número de glóbulos rojos y disminución de la hemoglobina bajo los parámetros estándares. Rara vez se registra en forma independiente una deficiencia de uno solo de estos factores. Los rangos de normalidad son muy variables en cada población, dependiendo de factores ambientales (nivel sobre el mar) y geográficas. A nivel del mar encontraremos valores mínimos, y a gran altura los valores deberán ser más altos (la menor presión parcial de O2 obliga al organismo a optimizar su transporte). Además, vemos variaciones de sexo, observando valores menores en mujeres (posiblemente por la pérdida de eritrocitos y contenido sanguíneo en cada ciclo menstrual). En general puede establecerse como normal para un hombre un hematocrito entre 40 y 50%, hemoglobina entre 13 y 18 g%, y para una mujer: hematocrito entre 37 y 40%, y hemoglobina entre 12 y 16 g%. Los síntomas y signos de la anemia se correlacionan con su intensidad, su rapidez de instalación y el sitio donde se  produce. En cuanto c uanto a su ra rapidez pidez de instalación puede ser aguda o crónica, siendo la primera más dramática, ya que la crónica permite una paulatina adaptación. Otros factores influyentes en el cuadro sintomático son la edad, el estado nutritivo, cardiovascular y respiratorio. Los síntomas que se observan en la anemia aguda se denominan síndrome anémico, e incluyen: palidez, astenia, adinamia, palpitaciones y disnea de esfuerzo. Frecuentemente y sobre todo en las anemias severas se observa esplenomegalia, hepatomegalia, petequias, equimosis, ictericia. También puede incluir síntomas propios de otros sistemas, como cardiovascular (taquicardia, disnea de esfuerzo marcada, angor, claudicación intermitente), digestivo (dispepsia, disfagia, anorexia, diarrea) o neuropsiquiátrico (parestesias, mareos, depresión, cambios de carácter como irritabilidad, mal humor). Para ser capaz de tratar exitosamente un síndrome anémico, debe caracterizarse, y establecerse su etiología, y para ellos se bede estudiar a fondo las características de los glóbulos rojos, de los reticulocitos, leucocitos y plaquetas que circulan en la sangre mediante un hemograma, y las características de las series hematopoyéticas mediante un mielograma. Éste no es indispensable, generalmente un médico capacitado logra clasificar una anemia sólo con el cuadro sindromático y el hemograma. De acuerdo a todos los factores mencionados, las anemias pueden clasificarse en diferentes grupos.

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PRÁCTICA No. 10 OBSERVACIÓN DE LAMINILLAS CON DE ANEMIAS MICROCÍTICAS, NORMOCÍTICAS Y MACROCÍTICAS. OBJETIVO: El alumno revisará las alteraciones morfológicas que se presentan en los eritrocitos en las anemias microcíticas, normocíticas y macrocíticas. INTRODUCCIÓN: La anemia puede definirse como una disminución de los eritrocitos, hemoglobina y hematocrito, sin embargo no se considera como una enfermedad, sino más bien como la expresión de un trastorno o enfermedad subyacente. Las primeras manifestaciones muestran algunos síntomas como debilidad, hipoxia, fatiga, cefalea, vértigo, todo esto debido a la falta de oxigeno. Existen varias formas de clasificar a las anemias, una de ellas es, utilizando los índices eritrocitarios, entre éstas tenemos a la anemia microcítica hipocrómica, normocítica normocrómica y las macrociticas.

1. ANEMIA MICROCITICA HIPOCROMICA. Es una de las más comunes en la actualidad, se caracteriza porque el volumen corpuscular medio (VCM) y la concentración media de hemoglobina (CMHC) son menores a los valores de referencia, por tanto en un frotis de sangre periférica el eritrocito es menor en tamaño, presenta un halo central de gran tamaño y el grado de poiquilocitosis poiquilocitosis (cambios de la forma) depende de la gravedad del paciente. Las causas que dan origen a este padecimiento son:  

Deficiencia en la ingestión de hierro.   Una pérdida excesiva de sangre.   Mala absorción del hierro.   Defectos de maduración citoplasmática.

2. ANEMIA NORMOCITICA NORMOCROMICA. Esta se caracteriza porque el número de eritrocitos, la hemoglobina y el hematocrito disminuyen proporcionalmente, por lo tanto, el frotis de sangre periférica se observa normal ya que el VCM y CMHC se encuentran dentro de los valores de referencia. Este tipo de anemia puede aparecer en las siguientes condiciones:  

Poco después de una hemorragia masiva.   En el descenso de la producción de sangre, por ejemplo en las anemias aplásticas (por agentes químicos, uremia, radiaciones, causas desconocidas, tejido maligno en médula ósea.   Anemias hemolíticas (ya que por lo general son normocíticas normocrómicas).  

En el aumento del volumen sanguíneo (principalmente en el embarazo).

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3. ANEMIAS MACROCITICAS. Las anemias macrocíticas se caracterizan porque el VOLUMEN CORPUSCULAR MEDIO (VCM) es mayor al de referencia, dando origen a eritrocitos grandes. Esta anemia se clasifica en dos grupos, las que se asocian con un tipo de megaloblasto de maduración de eritrocitos en la médula ósea y las que no lo hacen. 1).- En la anemia macrocitica megaloblástica existe una interrupción en la síntesis nuclear, que trae como consecuencia un defecto en la maduración del núcleo en el seguimiento de la megaloblastocis, la causa principal que origina esta anemia es la deficiencia de vitamina B   12 y ácido fólico que funcionan como coenzimas en la síntesis del ácido nucleico. DEFICIENCIA DE ACIDO FOLICO. 1) Ingestión dietética inadecuada. 2) Requerimiento mayor. 3) Mala absorción en el intestino delgado. 4) Inhibición de medicamentos. DEFICIENCIA DE VITAMINA B 12 1) del factor intrínseco. 2) Carencia Mala absorción. 3) Ingestión dietética inadecuada. Esta anemia se caracteriza porque el frotis sanguíneo presenta la siguiente triada: macrocitos ovales, neutrófilos hipersegmentados (con más de cinco lóbulos) y los cuerpos de Howell-Joly, la anisocitosis es moderada y la poiquilocitosis es más grave cuando la anemia es más intensa. 2) Anemias macrocíticas no megaloblásticas aún no se define la causa de su origen, pero es  posible que se relacione con un incremento de los lípidos membranales. Esta anemia se caracteriza porque se presenta acompañando las siguientes enfermedades: Alcoholismo. Reticulocitosis. Enfermedad hepática. Insuficiencia respiratoria. El frotis de sangre periférica presenta macrocitos no tan grandes como la anemia megalobástica, los cuales son redondos con membranas delgadas, no hay neotrófilos hipersegmentados, la cuenta de lecuocitos y plaquetas son normales generalmente. La poiquilocitosis es el término que se utiliza para descubrir una variación en la forma de los eritrocitos mientras que la anisocitosis denota una variación del tamaño celular, ambos se reportan como leve, moderada o acentuada. Los cuerpos de Howell-Jolly, son gránulos constituidos por fragmentos nucleares (DNA), en forma redonda y de color púrpura obscuro o violeta que se presentan por lo general solo en los eritrocitos.

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PRÁCTICA No. 11 OBSERVACIÓN DE LAMINILLAS CON DE ANEMIAS HEMOLÍTICAS

OBJETIVO: El alumno revisará las alteraciones morfológicas que se presentan en los eritrocitos en las anemias hemolíticas. INTRODUCCIÓN: Se denomina hemólisis al proceso de destrucción de glóbulos rojos que determina una disminución de la supervivencia de los mismos, acompañado de incapacidad de la médula ósea de realizar el aumento compensatorio. (Una médula ósea estimulada al máximo puede aumentar la eritropoyesis entre 6 a 8 veces su capacidad normal, y la vida media del eritrocito puede disminuir hasta 15 a 20 días sin llegar a anemia). Esta disminución de la vida eritrocitaria determina: - un aumento de la formación de glóbulos rojos a nivel medular: aumento de eritropoyesis. -rojos un aumento del catabolismoydedetermina la hemoglobina. La hemoglobina liberada de los glóbulos sufre metabolización un aumento de la bilirrubina indirecta, que determina clínicamente la aparición de ictericia (coloración amarillenta de piel y mucosas). El lugar de máxima remoción por fagocitosis es el bazo.  Nos encontramos frente a un caso de hemólisis crónica cuando este proceso de destrucción acelerada de glóbulos rojos se mantiene en el tiempo, causando los síntomas y signos características del síndrome hemolitico (véase más adelante).

1.1 Clasificación de las anemias hemolíticas: • 

De acuerdo al sitio de hemólisis: intra o extravascular.

• 

Patogénica: corpusculares (intrínsecas) o extracorpusculares (extrínsecas).

• 

Etiológica: heredadas o adquiridas.

La mayor parte de las alteraciones intrínsecas son hereditarias, y la mayor parte de las extrínsecas son adquiridas. Excepciones a esta regla son la hemoglobinuria paroxística nocturna*, el déficit de G6PD y el daño térmico. En investigación, el diagnóstico diferencial de estas patologías se hace por transfusiones cruzadas.

1.1.1 Clasificación según su sitio: La hemólisis puede ser extravascular o intravascular. Cuando ocurre un proceso de hemólisis extravascular los eritrocitos fagocitados sufren ruptura de su membrana. La hemoglobina es degradada por enzimas lisosomales y se recupera fierro y aminoácidos. El fierro es transportado a la médula ósea para nueva producción de hematíes. A su vez, cuando ocurre hemólisis intravascular la hemoglobina libre se disocia en dímeros alfa y  beta, los que se unen hap haptoglobina toglobina u oxidan a metahemoglobina. Luego estas moléculas se 45

 

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disocian y liberan el grupo Hemo para unirse a la albúmina y hemopexina, lo que permite la captación del Hemo por los hepatocitos para recuperar el fierro y para producir bilirrubina. La hemólisis intravascular se manifiesta por: Hemoglobinuria, Metahemalbuminemia, Ictericia, Hemoglobinemia, Hemosiderinuria, Hemosiderinuria. El paso final de la hemólisis intra y extravascular será la conjugación de bilirrubina por el hepatocito, excreción de ella ay la conversión de laenbilis por parte de la flora intestinal en urobilinógeno y urobilina, porbilis, último la excreción la orina y heces. En la hemólisis extravascular, al excederse la capacidad del sistema monocítico macrofágico aparecen alteraciones morfológicas de los hematíes como microesferocitosis, células mordidas, eritrocitos fragmentados y con inclusiones citoplasmáticas. Además la regurgitación de hemoglobina libre al plasma provoca disminución de la haptoglobina. En tanto, en la hemólisis intravascular con destrucción de 20 a 40 ml de eritrocitos al día aparece una reducción de la haptoglobina a niveles detectables y disminución de la hemopexina. La depleción en ambos sistemas (intra y extravascular) provoca aparición de hemoglobina libre en el suero y orina, y aumento de la metalbúmina.

1.1.2 Clasificación patogénica: CORPUSCULARES:  aquí el defecto está en los glóbulos rojos, al ser defectuosos son eliminados de la circulación. El defecto puede ser: 1. Enzimático:  alteración cuantitativa o cualitativa de enzimas que intervienen en el metabolismo del glóbulo rojo; son poco frecuentes.  

Déficit de enzimas de la glicólisis: déficit de piruvato kinasa.

 

Anomalías del metabolismo de nucleótidos: déficit de pirimidin 5´nucleotidasa.

 

Déficit de enzimas de shunt pentosas y metabolismo del glutatión: G6PD, glutatión sintetasa, glutatión reductasa.

2. Hemoglobina: hay una alteración en la molécula de la hemoglobina. Aquí entran las hemoglobinopatías y las talasemias.  

Existen varias hemoglobinopatías; la hemoglobinopatía más frecuente es la anemia de células falciformes o hemoglobinopatías, también llamada Drepanocitosis. Aquí hay un aminoácido cambiado en la hemoglobina (hemoglobina S) que altera la estructura del glóbulo rojo adoptando forma de hoz. Estos glóbulos rojos llamados falciformes aumentan la viscosidad sanguínea determinando mayor de oclusión de vasos pequeños que determina microinfartos. Se manifiesta clínicamente por anemia crónica con episodios de crisis hemolíticas, crisis vasoclusivas (las más graves son aquellas que ocluyen vasos cerebrales y óseos, pero puede afectarse cualquier órgano).

 

Existen dos formas clínicas: la homocigota, que presenta anemia hemolítica y fenómenos vasooclusivos, y la heterocigota (o rasgo drepanocítico), más frecuente, asintomática. En estos últimos sólo se pone de manifiesto la enfermedad en situaciones en que disminuye la presión parcial de oxígeno. 46

 

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Las talasemias son alteraciones en la hemoglobina por falta total o parcial de las cadenas de globina. El 90% de la hemoglobina está formada por el grupo y 4 cadenas de globina (2 alfa y 2 beta). Cuando falta alguna cadena entonces surgen las talasemias. Existen varias talasemias, se deben a mutaciones genéticas según las cadenas afectadas, las llamamos alfatalasemias, betatalasemias.

3. Defectos de membrana: esferocitosis hereditaria, eliptocitosis, acantocitosis y estomatocitosis. Anomalías en la permeabilidad iónica: Hidrocitosis congénita y Xerocitosis congénita.  

La más frecuente de este grupo es la esferocitosis hereditaria. Es una anemia hemolítica crónica de herencia autosómica dominante con morfología eritrocítica característica (esferocito), en la cual la hemólisis es extravascular.

B. EXTRACORPUSCULARES: aquí la destrucción del glóbulo rojo es por presencia de factores externos, del medio en que están. Como causas de esta anemias se debe mencionar: 1. Hiperesplenismo: la función del bazo de retener los glóbulos rojos alterados o viejos se extiende también a los glóbulos rojos normales. En general se debe a otras enfermedades (hepatopatías, linfomas) que al tratarlas disminuye la hemólisis. 2. Anemias hemolíticas inmunes:  aquí el organismo produce anticuerpos que actúan contra los glóbulos rojos determinando la hemólisis. Esto puede ocurrir, por ejemplo, luego de una transfusión en que los glóbulos rojos transfundidos tienen algún antígeno (sustancia que es considerada extraña por el receptor y éste reacciona formando anticuerpos). Otro ejemplo es el de la enfermedad hemolítica del recién nacido, cuando existe una incompatibilidad entre los glóbulos rojos de la madre y el feto. Pero a veces surgen anticuerpos formados por el propio organismo (auto-anticuerpos) por fallas en los mecanismos que regulan el sistema inmune. La formación de anticuerpos  puede ser secundaria secundar ia a otras enfermedades. C. OTRAS CAUSAS DE LA ANEMIA HEMOLÍTICA EXTRACORPUSCULAR SON:  - la causa mecánica  - por ejemplo, los pacientes con válvulas protésicas cardíacas; éstas  pueden lesionar los glóbulos rojos circulantes. c irculantes. - por tóxicos directos:  algunas infecciones, algunos agentes químicos (arsénico, cobre,  plomo), toxinas de animales (arañas, ofidios). - Las drogas: asociadas a hemólisis por oxidantes (que causan déficit de G6PD).

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PRÁCTICA No. 12 OBSERVACION DE MÉDULA ÓSEA NORMAL. OBJETIVO: El alumno revisará extensiones de médula ósea de morfología normal para familiarizarse con los precursores de cada una de las células de la sangre. INTRODUCCIÓN: Solo por experiencia se consigue interpretar bien la citología de médula, que debe considerarse como un método. Por eso el examinador debe informarse con respecto a la naturaleza clínica de la enfermedad del paciente. En general hay dos métodos de examinar una extensión de médula. El primero consistente en observar varios portaobjetos a poco aumento, luego a gran aumento en seco y, finalmente, con el objetivo de inmersión en aceite; y, a base de una experiencia previa, es  posible lograr una impresión respecto al número y la distribución de las células, de modo muy similar a como el patólogo analiza sus cortes de tejido. El segundo consiste en efectuar un recuento diferencial de un gran número de células (300-1000) y calcular el porcentaje de cada tipo de célula. Finalmente se puede emplear una combinación de los dos métodos. El segundo método, un laborioso recuento diferencial, constituye una parte esencial del adiestramiento en este trabajo, sin el cual no es posible llegar a realizar el primero con exactitud. El recuento diferencial proporciona, además, un registro objetivo y útil como referencia para medir ulteriores cambios. El reconocimiento de los tipos celulares, y en  particular de la fase de maduración dentro de cualquier serie dada, tiende a variar de un laboratorio en otro, a pesar de los numerosos esfuerzos realizados para unificar nomenclatura, con descripciones, fotografías y dibujos. No pueden aceptarse como universales ningún promedio ni márgenes normales. La línea de base más válida es la que determina cada laboratorio particular y aun entonces, de no emplear un adiestramiento en grupo, puede haber variaciones notables de un examinador a otro. Por fortuna estas limitaciones del método sólo son graves cuando no se tienen en cuenta. Con práctica y experiencia, los investigadores de laboratorio pueden obtener resultados provechosos y conseguir un alto grado de reproducibilidad en sus recuentos diferenciales de la médula. Es recomendable el siguiente procedimiento para examinar preparaciones de esta clase: 1-  Inspección a simple vista de los portaobjetos, para escoger la extensión que contenga partículas. 2-  Examen a poco aumento (16mm) de las partículas a fin de determinar  previamente si la médula es normoplásica, hipoplásica o hiperplásica. hiper plásica. 3-  Seleccionar de una zona celular, generalmente en la porción caudal de la  película, alrededor a lrededor de las partículas, a la que q ue sigue un estudio minucioso de de los detalles citológicos a gran aumento y con objetivo de inmersión en aceite

CELULARIDAD: El grado de celularidad, si el conjunto de la medula es hiperplásica o hipoplásica, es un aspecto difícil de determinar por el examen de un material aspirado. Si este dato es esencial, solo podemos asegurarnos estudiando cortes histológicos de partículas 48

 

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aspiradas o del material obtenido por biopsia por trocar o por biopsia quirúrgica. Si la aspiración se efectúa de una manera uniforme y si retiran solo cantidades mínimas de material, es posible poder obtener estimaciones útiles, aunque solamente aproximadas, de la celularidad. La celularidad (expresada como relación entre el volumen de células hematopoyéticas en la medula y el volumen total de células más grasa) varia normalmente con la edad del individuo y la zona medular examinada. Por ejemplo a la edad media de 50 años, la celularidad en las vértebras es de un 75%; en el esternón de un 60%; en la cresta iliaca de un 50%, y en las costillas de un 30%. La celularidad normal del hueso iliaco en diferentes edades ha sido muy bien descrita por Hartsock y cols. en 1965. El informe debe comprender los aspectos siguientes: descripción de la celularidad en general, tipo de eritropoyesis, madurez general de las células eritropoyéticas, y cálculo de los cocientes mieloide-eritroide o leucocito idee-eritroide, basados en un recuento de 5001000 células. Un recuento diferencial es útil, especialmente en casos seleccionados, como, por ejemplo, en una leucemia para seguir el efecto de la terapéutica. Pero se suelen conseguir mejores resultados número mayor de preparaciones en el mismo tiempo que se invierte en examinando los recuentos un diferenciales.

RELACIÓN MIELOIDE-ERITROIDE (M:E)  En el adulto normal, la relación M:E viene a ser de 3:1 ó 4:1. Éste término muy, difundido, se refiere a los recuentos diferenciales en que no se han excluido, los granulocitos maduros. La relación M:E al nacer es de 1.85:1 aumenta con rapidez poco después y alcanza el nivel normal máximo de 11:1 en las dos primeras semanas de vida, para descender luego gradualmente hasta un promedio de 3:1 en los primeros 20 años.

INTERPRETACIÓN: Una relación M:E aumentada, por ejemplo, de 6:1 puede significar la respuesta a una infección o a una leucemia, una reacción leucemoide o una hipoplasia eritroide. Cuando esta disminuida, disminuida, esto es, menor de 2:1 puede significar una reducción de leucopoyesis o una hiperplasia eritropoyética. La hiperplasia eritroide normoblástica puede  provenir de una de las muchas formas de anemia, de afecciones hepáticas o de una  pilicitemia, mientras que la mega megaloblástica loblástica pued puedee sser er causada por una de deficiencia ficiencia de ácido á cido fólico o de vitamina B12 como en la anemia perniciosa. Una relación M:E normal no significa necesariamente una medula normal. Por ser irregular la distribución de los diversos tipos de células, los recuentos diferenciales de las células nucleadas de la medula no son más que aproximaciones. Las irregularidades se deben en parte a que los normoblastos, los granulocitos neutrófilos maduros

RECUENTO DIFERENCIAL DE LA MÉDULA: Los datos publicados respecto a los recuentos normales de las células medulares varían según los autores y se echan de menos las cifras normales generalmente aceptadas para la sangre periférica. Esta diversidad refleja la técnica de cada uno de los investigadores, tanto al realizar los recuentos como en la 49

 

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interpretación. Por consiguiente, es mejor que cada uno de establezca sus propios valores normales; de las observaciones nuestras se relacionan en la tabla 1:

RECUENTOS DIFERENCIALES DE LA MÉDULA ÓSEA EN PORCENTAJES DEL TOTAL DE CÉLULAS NUCLEADAS ROSSE (1977) TIPOS CELULARES

ALNACER MEDIA, DE

NORMOBLASTOS

14.48+-7.24

MAUER (1969) 1 MES MEDIA, DE

18 MESE MEDIA, DE

INFANCIA MEDIA, ÍMITES 23.1

JANDI (1987) EDAD ADULTA MEDIA, LÍMITES 21.5(14.2-30.4)

8.04+-5.00

8.21+-3.71

0.02+-0.06 0.10+-0.14 0.24+-0.25 0.34+-0.33 13.06+-6.78 6.90+-4.45 0.69+-0.73 0.54+-1.88 60.37-+-8.66 32.35+-7.68 0.31+-0.31 0.62+-0.50

0.08+-0.13 0.50+-0.34 6.97+-3.56 0.44+-0.49 36.08+-7.40 0.06+-0.08

0.5(0.0-1.5) 1.7(0.2-4.8) 18.2(4.8-34) 2.7(0-7.8) 57.1 1.2(0-3.2)

0.6(0.2-1.4) 2.0)0.7-3.7) 12.4(12.2-24.2) 6.6(2-22.7) 56(45.1-66.5) 1.0(0.5-1.8)

0.76+-0.65 2.50+-1.48

0.64+-0.59 2.49+-1.39

3.4(2.6-4.6) 11.9((8.1-16.9)

METAMIELOCITOS BANDA SEGMENTADOS

19.37+-4.84 11.30+-3.59 28.89+-7.56 14.10+-4.63 7.37+-4.64 3.64+-2.97

12.42+-4.15 14.20+-5.23 6.31+-3.91

1.4(0-4.0) 18.3((8.529.7) 23.3(14-34.2)

EOSINÓFILOS

2.70+-1.27 2.61+-1.40 0.12+-0.20 0.07+-0.16 15.6 49.0 1.18+-1.13 1.95+-0.94 14.42+-5.54 47.05+-9.24 0.00+-0.02 0.02+-0.06 0.88+-0.85 1.01+-0.89 0.06+-0.15 0.05+-0.09

2.70+-2.16 0.10+-0.12 45.5 1.99+-1.00 43.55+-8.56 0.06+-0.08 2.12+-1.59 0.07+-0.12

TOTALES

PRONORMOBLASTOS BASÓFILOS n. POLICROMÁTICOS n. ORTOCROMÁTICOS n. NEUTRÓFILOS TOTALES

MIELOBLASTOS PROMIELOCITOS MIELOCITOS

BASÓFILOS LINFOCITOS TOTALES

DE TRANSICIÓN PEQUEÑOS CÉLULAS PLASMÁTICAS MONOCITOS MEGACARIOCITOS

0.79+-0.91 3.95+-2.93

12.9(4.529.0) 3.6(1.0-9.0) 0.06(0-0.8) 16(4.8-35.8)

4:2

4:0

4:4

3.2(1.2-6.2)