Manual de Bioprocesos.

Facultad de Ciencias Químicas INGENIERIA EN ALIMENTOS

Dr. Enrique Flores Andrade I.B.Q. Delia Araujo Morales

Agosto – Noviembre 2011

ÍNDICE

TEMA:

PÁGINA:

Introducción

3

Seguridad en el laboratorio

4

Lineamiento de las prácticas

5

PRÁCTICAS: 1. Fermentación alcohólica

12

2. Extracción de ADN a partir de bazo bovino

15

3. Extracción de ADN a partir de levadura

17

4. Elaboración de yogurt y determinación de ácido láctico

19

5. Cultivo de hongos comestibles

22

6. Medio de cultivo y obtención de cepas

25

7. Actividad enzimática producto de microorganismos

27

8. Biotransformación de la leche por acción enzimática

30

9. Producción de hongos comestibles

32

10. Biorreactores

36

11. Sistemas de control de biorreactores

38

INTRODUCCIÓN El uso de microorganismos para transformar materiales biológicos a fin de producir bebidas y alimentos fermentados tiene sus orígenes en la Antigüedad. Desde entonces, se han perfeccionado bioprocesos para producir una enorme variedad de productos comerciales, desde materiales relativamente baratos como el alcohol industrial y los solventes orgánicos, hasta productos químicos finísimos y carísimos como los antibióticos, proteínas terapéuticas y vacunas. Las enzimas y células vivas que se emplean en la industria —como las levaduras de panadería y cervecería— son también productos comerciales de bioprocesos. (Doran, 1995) Las aplicaciones de los microorganismos han estado presentes desde tiempos inmemorables, ya sea en el campo de la salud, permitiendo la producción de vacunas y antibióticos o en la producción de alimentos mediante procesos de fermentación. El hombre hizo uso de ellos sin saber que éstos existían desde que descubrió la manera de hacer cerveza, vinagre, vino o pan. (Bojorquez, 2011) Los sistemas biotecnológicos son sistemas complejos y difíciles de controlar; pero obedecen a las leyes químicas y físicas y están sujetos al análisis ingenieril. La intervención de la ingeniería es esencial en muchos aspectos de los bioprocesos; por ejemplo, el diseño y la operación de biorreactores, el diseño de esterilizadores y equipo de recuperación de productos, el perfeccionamiento de sistemas de automatización y control de operaciones, o el diseño de plantas de fermentación seguras y eficientes. (Doran, 1995) Debido a que el éxito o fracaso de un proceso fermentativo comienza con el microorganismo utilizado, en la elección del mismo se deben tener en cuenta ciertos criterios generales que se indican a continuación: 1. El microorganismo debe poder obtenerse en forma de cultivo puro 2. La cepa a utilizar debe ser genéticamente estable. 3. Su velocidad de crecimiento deberá ser alta. 4. Sus requerimientos nutricionales deben ser satisfechos a partir de medios de cultivo de costo reducido y si es posible que no necesite de factores de crecimiento. 5. Debe ser de fácil conservación por largos períodos de tiempo, sin pérdida de sus características particulares. 6. Debe llevar a cabo el proceso fermentativo completo en un tiempo corto. 7. Si el objetivo del proceso es un producto, éste debe ser de alto rendimiento y de fácil extracción del medio de cultivo. 8. Debe poder desarrollarse en cultivos a gran escala

9. De preferencia debe producir esporas u otra forma de reproducción para su fácil inoculación. 10. Ser inocuo, es decir, no representar peligro para el ser humano, plantas y animales. 11. Ser susceptible a modificación genética. (Bojorquez, 2011) Cualquier proceso biotecnológico de nivel industrial tiene que pasar por las siguientes escalas de operación: laboratorio, planta piloto e industrial; ya que todo proceso industrial nace en un laboratorio, donde se hacen los cálculos precisos, pero el proyecto del proceso en una planta de producción debe prever aspectos que no se consideran en un laboratorio antes de la puesta en marcha de un proceso de producción. El biorreactor puede considerarse como el corazón de todo proceso biotecnológico, ya que se lleva a cabo la transformación de la materia prima al producto de interés y su operación deberá de garantizar la maximización en la conversión, por lo que su funcionamiento es de vital importancia en la rentabilidad del bioproceso, sobre todo en aquellos catalogados como de “altos volúmenes de producción y bajo valor agregado”. (Vázquez, 2010) Este manual de práctica tiene como propósito proporcionarle al ingeniero en alimentos los elementos básicos para entender los procesos fermentativos relacionados con los bioprocesos de la industria de los alimentos y asimismo los aspectos ingenieriles del manejo de los biorreactores. El primer aspecto está comprendido en la primera parte de este manual y la segunda parte se relaciona con el manejo de biorreactores, los elementos que deben tomarse en consideración para su funcionamiento y sus usos.

BIBLIOGRAFÍA: Bojórquez Velázquez, Esaú; Manual de prácticas de procesos industriales de fermentación, Universidad de Los Mochis, 2011. Doran, Pauline; Bioprocess Engineering Principles; Ed. Elsevier Science & Technology Books, 1995. Vázquez Gurrola, Dynora et. Al; Manual de prácticas Laboratorio de Biorreactores; ENCB, IPN, 2010.

REGLAMENTO INTERNO LABORATORIO DE BIOPROCESOS Laboratorio 104 I.

CONTROL DE ASISTENCIA.  Todas las sesiones de trabajo se ajustarán al horario establecido por la Secretaría Académica de la Facultad y el Calendario escolar del Período vigente.  Todos los alumnos deben correspondiente y enmicado.

presentar gafete

de

identificación en

el formato

 Se dará un margen máximo de 10 minutos para poder asistir con retardo. El alumno debe tener presente que se evaluará su asistencia y puntualidad según el porcentaje indicado en los parámetros de evaluación de cada maestro titular, considerando que NO hay semana de recuperación, y que a pesar de tener derecho a un 20% de inasistencias justificadas según el reglamento de los Alumnos, debe cumplir de manera presencial el 100% de las prácticas del Programa.  Durante la práctica, los alumnos no podrán salir del laboratorio a excepción de enfermedad, estricta necesidad y con permiso del maestro. Se recomienda preparar el material necesario desde antes de entrar, para no interrumpir ni retrasar el trabajo programado para cada sesión.  Todos los integrantes de cada gaveta, deberán contar con una copia de la llave del candado que asegura la misma, pues de faltar alguno, no se acreditará la práctica correspondiente a todos los integrantes. II.

SEGURIDAD CONTRA PÉRDIDAS DE MATERIAL.  Cada integrante de la gaveta, debe hacerse responsable de contribuir en la compra de un candado de buena calidad y SEGURO. Al término de cada sesión la gaveta debe quedar cerrada debidamente.  Los integrantes de cada gaveta se harán responsables de marcar adecuadamente todo su material al inicio del Curso y contar con una copia del listado del material solicitado al Almacén, incluyendo una lista de material adicional.  Se prohíbe estrictamente la entrada al laboratorio para sacar material fuera del horario que le corresponde y en ausencia de sus compañeros de gaveta.

 Se prohíbe abrir cualquier gaveta que no sea la propia, aun cuando le hayan prestado la llave.  El material, equipo y reactivos del Laboratorio 104 son exclusivos para el uso y servicio del Laboratorio de Bioprocesos.  Los alumnos que sean sorprendidos abriendo gavetas que no sean las propias o sustrayendo cualquier otro tipo de material dentro del Laboratorio, serán sancionados mediante la desacreditación de la práctica y se harán acreedores a las sanciones establecida por las Autoridades Administrativas y Académicas correspondientes. Se exhorta a mantener un ambiente de mutuo respeto, honestidad y disciplina. III.- PREVENCIÓN DE ACCIDENTES.  Queda estrictamente prohibido consumir alimentos y bebidas en el Laboratorio.  Se prohíbe fumar.  Deberá mantenerse el orden y la disciplina dentro del Laboratorio evitando juegos, música y TODO distractor de la atención requerida.  Todo alumno deberá contar con su bata blanca de algodón, larga, de mangas largas; cubre bocas, guantes latex (de cirugía) y lentes de seguridad. Debe evitarse el uso de zapato abierto y pantalones cortos.  Usar el cabello recogido y cubrecabellos.  Manipular con mucho cuidado el material de vidrio.  Tener a la mano toalla, franela y/o jerga, para evitar quemaduras, cortaduras o rompimiento del mismo con riesgos inherentes a la naturaleza de los reactivos.  Para cortar o preparar conexiones de vidrio, debe manejarse el tubo con una franela, usar una lima metálica y lentes protectores.  Procure no apoyarse sobre las palmas de sus manos para colocar las conexiones o forzar su entrada en los tapones, protéjase las manos con la jerga o franela.  Use como punto de apoyo la mesa o soporte metálico cuando horade tapones.

 EVITE cortaduras o accidentes que requieran su traslado a URGENCIAS en el Hospital.  Procurar tener actualizado su Seguro Facultativo para cualquier atención Médica que, como estudiante, llegara a requerir, realizar a tiempo los trámites en la Secretaría de la Facultad y, si tiene algún padecimiento que requiera atención especial, comunicarlo a sus maestros para poder auxiliarlo en su debido caso.  Usar vidrio de reloj y espátula metálica para manipular reactivos sólidos, en especial los corrosivos, evitando derramarlos sobre las mesas o las balanzas o el piso.  NUNCA tratar de oler ningún reactivo químico, pegando directamente la nariz al recipiente, sino a distancia prudente, atraer con la mano el olor que despida, si es que no se trata de una mezcla o reactivo ácido o básico tóxico, que despida vapores irritantes.  NUNCA probar ningún reactivo, ya que todos conllevan algún riesgo para la salud. OJO: Cualquier incidente debe comunicarse al maestro para aplicar las medidas pertinentes oportunamente.

 Todo MATERIAL BIOLÓGICO debe manipularse con mucho cuidado:       

Al entrar al laboratorio deberá portar su bata blanca de manga larga, guantes de látex (de cirugía), cubre bocas, cubre cabellos, lentes de seguridad, zapato cerrado y ropa adecuada. Al salir del laboratorio deberá quitarse las protecciones en el siguiente orden: Primero lavar los guantes con benzal y alcohol, antes de quitárselos. Secarlos con serviitoallas y meterlos en papel de estraza para esterilizarlos. Lavarse las manos y desinfectarlas. Quitarse el cubre bocas y cubre cabellos y guardarlo en bolsa nylon para posteriormente lavarlo con agua y cloro en su casa. Los lentes de protección los limpiará con alcohol. Si se llegara a contaminar algún material, éste deberá esterilizarse.

 Los tubos de cultivo que contengan microorganismos deberán guardarse en el refrigerador y cuando ya no se necesiten deberán someterse a esterilización.  La mayoría de los solventes orgánicos son inflamables, evite calentarlos directamente, use baño maría o calentamiento indirecto con arena o glicerina, si requiere mayores temperaturas, de acuerdo a los puntos de ebullición constantes que caracterizan a cada compuesto.

 No llene demasiado con el reactivo el recipiente que va a calentar, y controle el calentamiento. Evite acercar a la flama del mechero, reactivos inflamables. 

Procure usar sólo las cantidades indicadas por el maestro y no sacar del Laboratorio ningún reactivo, ya que se cuenta con un Inventario de los mismos para que estén siempre disponibles en sus prácticas y además, porque implica riesgos innecesarios.

 Evite derramar reactivos en los lavaderos, a menos que haya seguido un tratamiento previo a los residuos, indicado por el maestro. Todo residuo sólido, no tóxico, debe tirarse en los botes de basura, para no tapar los lavaderos ni contaminar (desechos de papel, vidrio, plástico, metal, hule, etc.)  Residuos: Todo residuo de las prácticas del curso se vaciará en un recipiente marcado con el nombre de la práctica y que se encontrará en la mesa cerca de las ventanas, al frente del laboratorio. Por ninguna razón lo vierta en el desagüe, a menos que el titular o el técnico de laboratorio lo autorice.  NO TIRE cerillos al piso, ni los apague contra el plástico que protege las mesas, no los tire en las canaletas de las mesas ni en los lavaderos, hay botes de basura, asegúrese de tirarlos apagados.  Todas las instalaciones del Laboratorio han sido dispuestas con el mayor esfuerzo y mejor atención de las Autoridades y, reciben mantenimiento para que el estudiante tenga un mejor aprovechamiento académico al cumplir sus programas prácticos de laboratorio, evite deteriorar o dañar las mismas, también podrán usarlas futuras generaciones. Cuidarlas habla del uso consciente y responsable de cada estudiante, demostrando sus valores familiares y la educación que, privilegiadamente, recibe en una Universidad Pública.  Antes de iniciar cada sesión de trabajo, cheque que todo esté en buenas condiciones: su mechero, las mangueras, los tapones, las conexiones, ajuste correcto de pinzas universales y estabilidad segura de los aparatos montados, así como tener etiquetados debidamente todos los contenedores y contar con cerillos o encendedor, evitando las tiras papel.  Apague todo equipo utilizado, cuando haya terminado de usarlo o vigile que no exceda el tiempo de uso para evitar que se deteriore o se queme y no se pueda seguir aprovechando, por ejemplo, la campana de extracción, la estufa, la parrilla, el microscopio y la bomba de vacío.  VIGILE que no haya fugas de gas, y/o de disolventes dentro de los contenedores que usa en su aparato.

 Cerciórese antes de entrar al laboratorio de haber leído y comprendido lo que va a realizar en su práctica, investigue antes las constantes físicas y propiedades químicas, dibuje un Diagrama de Flujo que le permita visualizar de manera general los pasos de su trabajo y organice su participación en el equipo con el que trabaja.  Registre todas sus observaciones de manera oportuna (al momento de realizarse la práctica), completa y fidedigna en su bitácora. esta bitácora es imprescindible en todo investigador y profesional de la Ciencia, le asegura el éxito en todo intento de mejorar, proponer o repetir cualquier proyecto o descubrimiento. Cuente siempre con su técnica persona, debidamente protegida.  Evite temores innecesarios que no le permitan trabajar con la seguridad que se requiere en cada práctica y en la que seguramente tendrá éxito si la realiza con planeación, responsabilidad y preparación preliminar de su material, equipo, conocimiento de la técnica y fundamento teórico de la misma.  Procure trabajar con una actitud positiva, responsable y honesta considerando la puntualidad para entrar y salir de cada sesión de trabajo en el laboratorio.  Si usted considera cada punto de este reglamento para realizarlo le felicitamos por defender su vocación con profesionalismo. Enhorabuena.

NO CORRA RIESGOS INNECESARIOS 1) Los reactivos son extremadamente peligrosos, al grado de ser letales; por lo tanto, antes de iniciar una práctica, el alumno debió haber consultado la reactividad química de los reactivos de laboratorio ante el contacto con la piel, ojos, garganta, pulmones y agua; así como las medidas más apropiadas en circunstancias de contacto. 2) Etiquetar apropiadamente las soluciones utilizadas en la práctica. 3) Evitar desperdicios innecesarios. 4) Al manejar soluciones o lavar material, evitar salpicar.

LINEAMIENTOS GENERALES PARA LOS REPORTES DE LAS PRÁCTICAS 1. El reporte escrito de la práctica deberá realizarse a computadora con las siguientes características:  Márgenes superior e inferior de 2.5, izquierdo y derecho de 3  Letra Arial tamaño 12 e interlineado 1.5.  Sin sangrías. 2. En la investigación para conocer el fundamento de la práctica (o introducción) debe hacer referencia a la fuente que consultó en cada párrafo. Por ejemplo: … éstos son sistemas de reacción bajo condiciones básicas (Adam y Sevcik, 1998). 3. Forma de escribir las referencias de su investigación:  Las referencias, al final de la práctica, deberán ser escritas siguiendo la forma: Revista científica: Tsami, E.; Katsioti, M. Drying kinetics for some fruits: Predicting of porosity and colour during dehydration. Drying Technology 2000, 18 (7), 1559–1581. Libro: Lachman, L.; Lieberman, H.A.; Kanig, J.L. The Theory and Practice of Industrial Pharmacy; Lea & Febiger; Philadelphia, 1974. Capítulo de libro: Epstein, N.; Grace, J.R.; Spouting of particular solids. In Handbook of Powder Science and Technology; Fayed, M.E., Otten, L., Eds.; Van NostrandReinhold Co.: New York, 1997; 509–536. Conferencia: Lerici, C.R.; Dalla Rosa, M.; Pinnavia, G. Direct osmotic as pre-treatment to fruit drying. In Proceedings of European Conference on Food Chemistry, Rome, Italy, March 15–18, 1983; 287–296. Internet: Orihuela, J. L. "Nuevos paradigmas de la comunicación" , en Chasqui, No 77, Revista Latinoamericana de Comunicación, edición de Internet, sección Opinión, marzo de 2002, http://comunica.org/chasqui/77/orihuela77.htm, consultada 2 de abril de 2002. 4. Figuras, gráficas y tablas:  Las figuras deberán estar bien explicadas. En la parte de abajo de la figura se debe indicar el número de figura y una breve descripción de la misma (ejemplo: “Figura 3. Contenido de humedad en granos de maíz como función de la actividad de agua”).  Si se tratase de una gráfica, los ejes y símbolos deben tener leyendas apropiadas. No olvide anotar la fuente, si es parte de su investigación.  En el caso de las tablas, en la parte de arriba se indicará el número de la tabla y una breve descripción de la tabla (ejemplo: “Tabla 2. Constantes cinéticas a diferentes temperaturas de experimentación”).

5. Reporte de prácticas. Los puntos a considerar en el reporte de las prácticas son los siguientes:      

Nombre y número de la práctica. Objetivos. Introducción (investigación). Resultados. Discusión de resultados y conclusiones. Referencias.

6. Observaciones note que: 1) Las prácticas son individuales. Mismos resultados pero diferente investigación, discusión y conclusión. Los alumnos que copian y que se dejan copiar serán sancionados. 2) Las prácticas se entregan cada semana y tienen el valor de la asistencia. 3) El 20% de inasistencia equivale a no tener derecho a presentar el trabajo final de laboratorio. 4) Se considerará como inasistencia aquella práctica que presente alguna de las siguientes faltas: no cubra los requisitos establecidos en el reporte de la práctica, calidad de la presentación, escrito deficiente y mala actitud. 5) La entrega de excelentes prácticas al final del curso equivale al 25% de la calificación total y es el derecho al examen de teoría.

Evaluación

%

Desempeño

40

Bitácora

15

Reporte de práctica

25

Examen

20

PRÁCTICA 1 Fermentación alcohólica OBJETIVO: Demostrar la producción de alcohol etílico por organismos anaerobios, a partir de diversos sustratos ricos en azúcares. FUNDAMENTO DE LA PRÁCTICA: Investigación antes de la sesión de laboratorio. 1. Tipo de organismo y características de Saccharomyces cerevisiae. 2. ¿Qué es la fermentación? 3. Tipos de fermentación. 4. Identifica los requisitos del proceso de fermentación. MATERIAL:                  

Matraz Erlenmeyer de 250 ml. Tapón de hule monohoradado. Manguera de hule. Tubo de vidrio. Matraz de destilación. Refrigerante recto. Soportes universales. Pinzas universales. Vasos de precipitado de 100 ml (2) y de 250 ml (1). Agitador de vidrio Tubos de ensayo (2). Gradilla. Pipetas graduadas de 5 ml y de 10 ml. Vidrio de reloj. Cápsula de porcelana. Mechero de bunsen (o en su defecto parrilla eléctrica). Portaobjetos. Cristalizador.

REACTIVOS:  Solución de hidróxio de bario al 2%.  Solución de hidróxido de potasio al 20%.  Solución de Lugol (iodo/ioduro de potasio).  Solución de ácito cítrico al 5%.  Papel indicador universal.  Solución alcohólica de azul de metileno al 0.1%.

Diversos:  

Levadura seca en gránulos. Sustrato (miel, jugo de caña, jugo de frutas).

TÉCNICA: Parte I (primera sesión) 1) Pesar 10 g de levadura seca e hidratar en un vaso de precipitado de 100 ml con 50 ml de agua corriente. 2) Luego de unos 10 minutos tomar una gota con una varilla de vidrio, efectuar un frotis en un portaobjetos y dejar secar. 3) Verter el colorante de azul de metileno sobre el frotis y dejar teñir por 30 segundos, enjuagar con agua corriente y dejar secar. 4) Observar al microscopio compuesto y dibujar. 5) Colocar en el matraz Erlenmeyer el sustrato elegido. Si se tratara de glucosa diluir hasta los 150 ml con agua corriente. En caso de usar algún jugo de frutas se empleará puro. Agregar la levadura hidratada, agua casi hasta el cuello del matraz y ajustar el pH con la solución de ácido cítrico hasta que quede entre 4 y 5. 6) Tapar perfectamente y conectar la manguera al trozo de tubo de vidrio que se habrá puesto a través del tapón. 7) La manguera se conectará en el otro extremo a otro trozo de tubo de vidrio y se colocará dentro de un tubo de ensayo lleno de agua e invertido sobre un cristalizador a modo de cámara hidroneumática. 8) Luego de una hora, observar la formación de burbujas que desplazan el agua del tubo de ensayo. Con cuidado, retirar del agua, agregar 5 ml de solución de hidróxido de bario, agitar y anotar lo observado. Dejarlo reposar 24 h. Parte II (siguiente sesión) Una vez que se haya terminado la fermentación (que dependerá del sustrato y de la temperatura a la cual tenga lugar) continuar con la parte siguiente. 1) Decantar con cuidado el líquido del matraz y pasarlo al matraz de destilación. 2) Destilar y recoger los primeros 15 ml de líquido. Indicar olor y características. 3) Colocar 5 ml de destilado en una cápsula de porcelana y acercar un cerillo.

4) En un tubo de ensayo, a 5 ml de destilado agregarle 10 ml de solución de lugol. Luego añadirle gota a gota la solución de hidróxido de potasio hasta que se decolore. Calentar a baño María unos 5 minutos. Una vez frío pasar a un vidrio de reloj y observar al microscopio de disección. Dibujar lo observado. Anote la forma, el color y el olor de los cristales si los hubiera. Parte III: Análisis del destilado 1) Mide 10 ml en una probeta con el destilado. Anótalo 2) Mide el volumen exacto del destilado. 3) Determina la masa del destilado. (Masa de la probeta con el destilado menos la masa de la probeta vacía). Calcula la densidad. Este método es bueno para dos “figuras” (masa/volumen). 4) Usando la siguiente tabla, determina el porcentaje de la composición por peso de etanol en el destilado de la densidad de tu muestra. La purificación del etanol y el agua es limitada debido a que el etanol y el agua forman un azeótropo. Porcentaje de etanol por peso Densidad a 20°C Densidad a 25°C (g/mL) (g/mL) 75 80 85 90 95 100

0.856 0.843 0.831 0.818 0.804 0.789

0.851 0.839 0.827 0.814 0.800 0.785

Cuando elabores el reporte de la práctica acuérdate de anotar:     



Nombre y número de la práctica. Objetivos. Introducción (investigación). Resultados con los siguientes puntos: Esquemas y/o fotos. Discusión de resultados y conclusiones. o Explique el proceso de fermentación de sus muestras empelando un lenguaje bioquímico. Escriba las fórmulas completas del proceso metabólico que conduce desde glucosa hasta el etanol y el , junto con el balance de energía. Referencias.

PRÁCTICA 2 Extracción de ADN a partir de levadura OBJETIVO: Obtener ADN de una muestra biológica y que el alumno perciba la relación entre biología molecular e ingeniería genética.

FUNDAMENTO DE LA PRÁCTICA: Investigación antes de la sesión de laboratorio. 1. Elabore un esquema de un bioproceso que tenga relación con ADN recombinante. 2. Mencione algunos productos alimenticios que hagan uso de levaduras modificadas genéticamente MATERIAL:       

Levadura seca comercial. Tubos de ensayo. Probetas de 10 y 50 ml. Pipetas de 5 ml. Pipeta Pasteur. Mortero y pistilo. Agitador.

REACTIVOS:     

Solución de NaOH 0.2M con 1% de Dodecil sulfato de sodio. Perclorato de sodio en cristales. Solución de cloroformo-alcohol isoamílico Solución de NaCl 1M. Etanol absoluto.

 

Centrífuga. Balanza granataria.

EQUIPO:

TÉCNICA: 1) Pese 15 g de muestra biológica y colóquela en un mortero. 2) Agregue 50 ml de la solución de NaOH 0.2M con 1% de Dodecil sulfato de sodio.

3) Homogenice bien con el pistilo. 4) Vierta 4 ml del homogenizado en un tubo de centrífuga. 5) Agrege 0.1 g de perclorato de sodio y mezcle bien. 6) Agregue 5 ml de cloroformo-alcohol y mezcle bien. 7) Centrifuge por 20 min a 3000 rpm. 8) Separe el sobrenadante y colóquelo en otro tubo de centrífuga. 9) Agregue una cantidad igual de cloroformo-alcohol al sobrenadante. 10) Centrifuge por 20 min a 3000 rpm. 11) Colóque el sobrenadante en una probeta de 10 ml. 12) Agregue NaCl 1M (frío). El volumen de NaCl será la décima parte del volumen del sobrenadante en la probeta. Mezcle bien. 13) Agregue etanol absoluto 2.5 veces del volumen obtenido en el paso 12. 14) Mezcle bien con una varilla de vidrio y observe.

No olvides anotar en tu reporte de esta práctica:      

Nombre y número de la práctica. Objetivos. Introducción (investigación). Resultados con los siguientes puntos: Esquemas y/o fotos. Discusión de resultados y conclusiones.  Explique la función de los reactivos en la práctica. Referencias.

PRÁCTICA 3 Elaboración de yogurt y determinación de ácido láctico OBJETIVO: Construir una curva de crecimiento que incluya las fases de latencia, logarítmica, estacionaria y de muerte.

FUNDAMENTO: Investigación antes de la sesión de laboratorio. 1. ¿Qué es un yogurt? 2. Investigue el proceso de elaboración de yogurt. Describa cada etapa y elabore un diagrama de flujo o utilice esquemas. 3. Teniendo en cuenta que el yogurt se elabora a partir de leche cruda, que contiene una cantidad de grasa variable (dependiendo del tipo de alimentación que recibe la vaca, la época del año, etc.) ¿cuál será el objetivo de “estandarizar” el contenido de grasas de la leche? 4. Teniendo en cuenta que el deterioro de los alimentos se debe a la presencia de microorganismos que se alimentan de ellos, ¿cuál será el objetivo de realizar un tratamiento térmico al procesar un alimento? 5. ¿Qué es starter o iniciador en la industria alimenticia? MATERIAL:          

Cubre bocas. 4 Pipetas de 1ml. 1 paquete de Algodón. Gasas. Tijeras Papel de estraza. 3 Matraz Erlenmeyer de 250 ml. Termómetro. 1 bureta. Soporte y pinzas para bureta.

REACTIVOS:  Agua estéril.  Benzal.  NaOH 0.1N.  Fenolftaleína.

EQUIPO:     

Mechero Bunsen. Estufa de incubación a 42ºC (en su defecto un termo). Parrilla eléctrica con control de temperatura. Autoclave. Agitador orbital.

OJO: El alumno deberá conseguir: (la cantidad debe ser estimada a partir de la técnica) leche entera en polvo (nido Nestlé), leche descremada en polvo (Svelty, Nestlé), 20 g de azúcar, 50 ml de yogurt entero o descremado (comercial) y cucharas de plástico. También deberá traer una bandeja con hielo. TÉCNICA: 1) Esterilizar el material (pipetas, matraces, etc) en autoclave a 121ºC por 15 min. 2) Las siguientes medidas serán por cada matraz. Mezclar en seco 2.5 g de leche nido y 17.5 g de Svelty con 80 ml de agua hervida a 80 °C. Esta combinación provee un contenido del 2% de grasa. La mezcla debe ser realizada en un ambiente estéril. 3) La mezcla se homogeniza de 65-70 °C con agitación constante. 4) La pasteurización se realiza a 85 °C por 30 min e inmediatamente colocar el matraz en baño de hielo hasta que la mezcla adquiera una temperatura de 45 °C. 5) Se utiliza como cultivo iniciador 3 cucharadas de yogurt comercial. 6) Medir el pH inicial. 7) Se incuba a 42ºC por 8 horas y posteriormente refrigerar hasta su utilización (4ºC). 8) Medir el pH (deberá estar alrededor de 4.5). 9) La determinación de ácido láctico: a) Coloque 9 ml de yogurt en un matraz Erlenmeyer, unas gotas de fenolftaleína. b) Titular con una solución de NaOH 0.1N. c) Detener la titulación hasta el cambio de color. NOTA: Para calcular la cantidad de ácido láctico presente recuerde que 1 ml de NaOH es igual a 0.009g de ácido láctico, por lo tanto los ml de NaOH gastados serán igual a

los gramos de ácido láctico presente, multiplicar los gramos por 100 y expresarlos en % de ácido láctico. En su reporte de la práctica incluya:     



Nombre y número de la práctica. Objetivo. Introducción (investigación). Resultados con los siguientes puntos: Esquemas y/o fotos. Discusión de resultados y conclusiones.  ¿Cuál será el objetivo y el resultado de incubar la leche a 43 ºC luego de adicionar las bacterias lácticas? ¿tendrá esta etapa el mismo objetivo que el tratamiento térmico a 90ºC? Justificar la respuesta.  ¿Cómo se produce el ácido láctico a partir del ácido pirúvico (estructuras químicas) y qué usos posee en alimentos?  Explique a qué se debe el pH y consistencia del yogurt obtenido. Referencias.

Práctica 4 Aislamiento de bacterias productoras de amilasa INTRODUCCIÓN Las amilasas son enzimas extracelulares que hidrolizan el almidón y que se pueden obtener a partir de fermentación por diferentes microorganismos, entre ellos bacterias y hongos. Estas enzimas tienen diferentes aplicaciones en diferentes industrias como la de alimentos, panadera, cervecera, etc. Muchos microorganismos se estudian para determinar cuál sería el microorganismo ideal para la producción industrial de enzimas a través de bioprocesos. En esta práctica se utilizarán bacterias aisladas del suelo que presenten capacidad para la producción de amilasa. FUNDAMENTO: Investigar:  Principales enzimas industriales  Pasos en la producción de enzimas industriales  ¿Qué son las enzimas?  Enzimas intracelulares y extracelulares  Cinética de actividad enzimática  Tipos de bioreactores usados en la producción industrial de enzimas MEDIO SÓLIDO DE CULTIVO MATERIAL Muestra de suelo Matraz de Erlenmeyer Solución salina Tubos de ensayo Cajas Petri Pipeta Espátula de Digralsky

Se prepara ingredientes: Peptona

con

los

5g

Extracto de carne 3 g Almidón

10 g

Agar

20 g

Agua destilada 1000 ml

siguientes

PROCEDIMIENTO: Preparación del medio de cultivo. 1. Preparar el medio de cultivo por equipo (150 ml) y esterilizar. 2. Preparar tubos por dilución serial con solución salina estéril (1 tubo de ensayo con 10 ml de solución salina y 5 tubos de ensayo con 9 ml de solución salina) y esterilizar. 3. También esterilizar pipetas y cajas Petri. Preparación de muestras por dilución serial. 4. Se toma un gramo de la muestra de suelo que se va a analizar y se vierte en un tubo de ensayo que contiene 10 ml de solución (dilución de 10-1). 5. Agitar para que los microorganismos se repartan homogéneamente y dejar reposar unos instantes. 6. Se continúa haciendo diluciones; tomamos un ml de la dilución anterior y se vierte en un tubo de ensayo que contenga 9 ml de solución salina (dilución 10-2). 7. Repita el procedimiento hasta alcanzar una dilución de 10-4. Sembrado. 8. Vaciar aproximadamente 15 ml de medio de cultivo esterilizado en cada caja Petri y permitir solidificar. 9. Después de que solidifique el agar, agregue 0.1 ml de las muestras de las diluciones 10-2 y 10-4 en el centro del agar de dos cajas Petri debidamente etiquetadas. 10. Inmediatamente extienda las muestras encima de la superficie del agar con la ayuda de la espátula de Digralsky o una cuchara o espátula estéril. 11. Incubar de 35 a 37° C y checar el crecimiento cada 24 horas. 12. Después de formación de colonias, vaciar con mucho cuidado la solución de yodo sobre la caja Petri hasta cubrir completamente la superficie del agar. Las zonas en las que aún queda el almidón se teñirán de un color entre azul y negro. Si las bacterias han degradado el almidón, aparecerán zonas de color claro alrededor de las colonias. 13. Resembrar a partir de las colonias que muestran un halo de color claro en el medio de cultivo, en tubos de agar inclinado e incubar entre 35 y 37° C. 14. Después de que haya crecido la cepa, almacenar en refrigeración hasta el próximo experimento. 15. Reporte sus resultados con dibujos, diagramas o fotografías.

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Práctica 5 Caracterización de cepas bacterianas INTRODUCCIÓN La correcta detección e identificación de los microorganismos presentes en muestras es muy importante por varias razones. La identificación de bacterias puede basarse en muchos caracteres como:  Morfología de las colonias (forma, color, consistencia, bordes, etc.)  Morfología celular (forma de bacilos, de cocos, etc., y de agrupamientos en diplococos, estreptococos, etc.)  Tinción (Gram, endoesporas, ácido-alcohol resistente, etc.)  Fisiología (aerobios, anaerobios, anaerobios facultativos)  Condiciones óptimas de crecimiento  Pruebas bioquímicas (presencia o ausencia de una enzima o de toda una ruta metabólica, fermentación de carbohidratos, etc.)  Técnicas moleculares (sendas para hidridación o para amplificación en PCR, análisis filogénico mediante secuenciación de 16 S ARNr)  Métodos de identificación tradicionales:  Aislamiento de cepa en medio sólido  Purificación de cepa bacteriana  Tinción de Gram  Microscopía  Pruebas bioquímicas OBJETIVO El objetivo de la práctica es aplicar algunos métodos de crecimiento, tinción y pruebas bioquímicas para identificar adecuadamente una cepa bacteriana. FUNDAMENTO Investigar:  Morfologías más importantes de los microorganismos más usados en bioprocesos  Técnicas de tinción más usadas en bioprocesos  Pruebas bioquímicas para identificar microorganismos productores de enzimas  Pruebas bioquímicas para identificar microorganismos fermentativos PROCEDIMIENTO: Preparación de observación en fresco a partir de cultivos en medios líquidos

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1. Cargar el asa bacteriológica con una gota de cultivo en medio líquido y depositarla en el portaobjetos. Cubrirla con un cubreobjetos procurando que no queden burbujas de aire. 2. A partir de los cultivos en medio sólidos colocar una gota de agua sobre el portaobjetos con ayuda del asa. Cargar el asa estéril con una pequeña cantidad de bacterias de una colonia y resuspenderla en la gota de agua. 3. Observar bacterias vivas al microscopio con el objetivo de inmersión (asegúrese de añadir una gota de aceite de inmersión, y observar motilidad y características morfológicas. 4. Prepare una tinción de gram de la muestra a partir de cultivos en medio líquido o medio sólido. Proceda como en el caso de la preparación fresca. 5. Extender la suspensión con el asa hasta conseguir una capa fina. 6. Secar la preparación a la llama del mechero, evitando que se caliente demasiado, para no afectar la estructura y forma normal de los microorganismos, puede comprobar con el dorso de la mano que aún no esté caliente. 7. Una vez seca la preparación proceda a fijar la muestra haciendo pasar 3-4 veces por la llama del mechero. La flama debe tocar la parte inferior del portaobjetos. 8. Proceda a la tinción de Gram y posteriormente obsérvela. 9. Reporte sus resultados con ilustraciones o fotografías.

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Práctica 6 Determinación de una curva de crecimiento de bacterias productoras de amilasa INTRODUCCIÓN Las fases de crecimiento de una población bacteriana pueden determinarse midiendo la turbidez del cultivo. Aunque dicha turbidez no es una medida directa del número de células, su incremento es una indicación del crecimiento bacteriano. Para estas determinaciones se utiliza un espectrofotómetro, en el cual la luz pasa a través del cultivo bacteriano hasta alcanzar una célula fotoeléctrica conectada a un galvanómetro. A medida que la concentración celular aumenta, el cultivo se hace más turbio y se reduce la cantidad de luz transmitida hacia la celda fotoeléctrica. El cambio de la intensidad de luz se registra en el espectrofotómetro como porcentaje de transmisión (cantidad de luz transmitida) y absorbancia o densidad óptica (DO). Cuando se inocula una pequeña población bacteriana en un medio de cultivo líquido adecuado, generalmente el crecimiento no comienza inmediatamente, sino que hay un período de latencia. Una vez que empieza el crecimiento, se observa un incremento exponencial en la densidad celular, que corresponde a la fase exponencial de crecimiento. Esta fase es la más significativa en el ciclo de crecimiento de los microorganismos y se caracteriza porque los parámetros cinéticos del crecimiento (µ, q) se mantienen constantes. A medida que el crecimiento avanza, la concentración de los nutrientes esenciales disminuye y se acumulan los productos finales del metabolismo, hasta que el crecimiento llega a detenerse, de modo que el cultivo entra en la fase estacionaria. Después las células lentamente mueren, lisándose en algunos casos, en una última fase de muerte celular. OBJETIVO El objetivo de esta práctica es definir las fases de crecimiento en una cepa bacteriana aislada anteriormente., mediante la absorbancia de la suspensión celular a diferentes tiempos de incubación. FUNDAMENTO Investigar:  Cinética de crecimiento microbiano  Determinación de la velocidad de crecimiento microbiano  Determinación de la densidad celular de los cultivos por métodos directos e indirectos  Determinación de masa celular  Cuantificación de la cinética de crecimiento en lote  Cuantificación de la cinética de crecimiento en cultivos continuos 24

PROCEDIMIENTO: Preparación del inóculo 1. Se siembra un tubo con 10 ml de medio líquido que contenga almidón, con la cepa bacteriana aislada y se incuba a 37°C con agitación de ser posible a 100 r.p.m. durante 15-20 hrs. 2. A partir de ese cultivo reciente, sembrar con una pipeta estéril un volumen determinado en un matraz con 25 ml del mismo medio de cultivo líquido y se mide la DO en el espectrofotómetro. Esta medida corresponde al tiempo 0. 3. Colocar el matraz en una incubadora orbital a 37°C y 180 r.p.m. la DO debe medirse cada 60 minutos por 24 horas, teniendo cuidado de agitar bien el matraz antes de tomar las medidas. Medidas del crecimiento en espectrofotómetro 4. Encender el espectrofotómetro manteniendo 10 minutos de precalentamiento antes de realizar la lectura. 5. Fijar la longitud de onda a 600 nm, para absorbancia máxima de la cepa y mínima del medio de cultivo. 6. Para calibrar el aparato primero fijar la absorbancia en 0 con el testigo de medio de cultivo limpio sin inocular. 7. Para medir las muestras, tomar 3 ml de cultivo bien homogeneizado en un tubo y situarlo en el lugar de las muestras. Anotar la absorbancia. 8. Construir la curva de crecimiento con los datos obtenidos. 9. Reportar sus resultados con dibujos, esquemas, gráficas y fotos. Haga una buena discusión de resultados.

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Práctica 7 Optimización de las condiciones de pH y temperatura para el crecimiento bacteriano INTRODUCCIÓN Las variaciones de pH y temperatura provocan diferentes efectos sobre los microorganismos. Una bacteria sometida a un pH o temperatura superior o inferior a la que normalmente crece, sufre, en primer lugar, daños en sus proteínas y ácidos nucleicos. Estos primeros daños impiden que la bacteria se reproduzca y por consiguiente, formen una colonia sobre el medio de cultivo adecuado. FUNDAMENTO Investigar:  Efecto letal y subletal de los cambios de pH y temperatura y clasificación de los microorganismos de acuerdo a las temperaturas y pH de crecimiento.  Nombres de los principales microorganismos termófilos usados en la industria de alimentos y sus productos.  Métodos de regulación del pH y temperatura en biorreactores de mesa.  Métodos de regulación del pH y temperatura en los biorreactores industriales.  Métodos de determinación de la actividad de la amilasa OBJETIVO Encontrar de forma práctica los rangos de pH y temperatura óptimos para el crecimiento de la cepa bacteriana productora de amilasa. MATERIALES Pipetas estériles Matraces Erlenmeyer Tubos de ensayo Cepa bacteriana productora de amilasa Medio de cultivo usado en la práctica 4 como medio líquido. TECNICA 1. Preparar matraces con el medio de cultivo líquido (por duplicado) y esterilizar. 2. Inocular con la cepa bacteriana. 3. Los equipos del 1 al 3 preparar el medio de cultivo líquido con diferente acidez, (pH = 5, pH = 9, pH = 11). Se incuban a 37°C por 24 horas.

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4. Los equipos 4 al 6 deben preparar matraces (por duplicado) con medio líquido con un pH de 7 para incubar a diferentes temperaturas: 40°C, 55°C y 60°C. se incuban por 24 horas. 5. (Además todos los equipos deben preparar sus cajas Petri con medio sólido con un pH de 7 para el conteo de la población bacteriana después de cada tratamiento.) 6. Después de 24 horas, tomar 1 ml de muestra y preparar diluciones seriales hasta 10 -6 en solución salina. 7. A partir de la dilución 10-4, 10-5, 10-6, tomar 1 ml de muestra con una pipeta estéril y vaciar en caja Petri estéril (por duplicado). 8. Vaciar aproximadamente 15 ml de medio de cultivo estéril en cada una de las cajas Petri que continen la muestra. 9. Los equipos 1, 2 y 3 deberán incubar a 37 °C y los equipos 4, 5 y 6 deberán incubar a la temperatura que usaron. Pero todos incubarán por 24 horas. 10. Contar las unidades formadoras de colonias y checar el crecimiento a las 24 horas y 48 horas. 11. Reporte sus resultados con esquemas y discusión de resultados. 12. Proponga un método para determinar la actividad de la amilasa.

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PRÁCTICA 8 Cultivo de hongos comestibles

OBJETIVO: Analizar el cultivo de hongo comestible como un ejemplo de biotransformación en sustrato sólido.

FUNDAMENTO: Investigación antes de la sesión de laboratorio. 1. Investigue porqué la producción de hongos comestibles se considera como un bioproceso. 2. ¿Cuáles son las especies de hongos comestibles más utilizadas en México? 3. Describa el ciclo de vida del Pleurotus ostreatus. 4. ¿Qué sustratos se pueden emplear para su cultivo? 5. ¿Qué es el micelio y el micelio activado? 6. ¿Qué es una cepa? MATERIALES:  Báscula granataria.  Autoclave.  Mechero bunsen  Cajas petri.  Papel aluminio.  Papel filtro o papel bond.  Pinzas de disección.  2 Matraces Erlenmeyer de 1 litro.  Agua destilada o purificada.  Vaso de precipitado de 2 litros.  Recipiente de plástico grande con tapa. Material biológico  Tres o cuatro ejemplares frescos de hongo seta

REACTIVOS:  Papa 200 g.  Agar-agar 15 g.  Glucosa 20 g.  Levadura 2 g. 28

EQUIPO:  Estufa con temperatura de entre 25-28ºC.

TÉCNICA: Procedimiento del medio de cultivo (primera parte): 1) Pelar, cortar, lavar y poner a hervir la papa en 500 ml de agua destilada durante 25 min. 2) Se decanta la papa y se extrae el extracto, el cual se filtra. 3) Se agregan los otros ingredientes y se completa el volumen de un litro. 4) Se calienta a fuego lento moviendo constantemente durante 2 min hasta que queden totalmente disueltos. 5) El medio de cultivo se transfiere a los matraces Erlenmeyer y se tapa con papel aluminio. Se esteriliza en autoclave a 15 lb de presión por 15 min. Nota: aproveche y esterilice el papel filtro o bond. 6) En condiciones de asepsia (con ayuda del mechero) el medio de cultivo tibio se vierte a las cajas Petri y se deja solidificar. 7) Se dejan en la estufa a 27ºC por 24 horas y al final seleccionar las cajas no contaminadas. Aislamiento por medio de esporas: 1) El hongo a utilizarse, debe ser lavado con una solución de hipoclorito de sodio al 5%. 2) Con ayuda del mechero y con los materiales esterilizados, se crea una zona de absoluta asepsia. 3) En una caja de Petri y con ayuda de una pinza estéril, se coloca el papel filtro (previamente esterilizado). 4) Se coloca el sombrero del hongo con las láminas hacia abajo sobre el papel para obtener la esporada. 5) Para evitar evaporación y contaminación, el hongo y el papel se tapan con un recipiente limpio y se deja reposar por 8 horas.

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Recuerde que en su reporte de la práctica, debe incluir:    

Nombre y número de la práctica. Objetivos. Introducción (investigación). Resultados con los siguientes puntos: Esquemas y/o fotos.  Discusión de resultados y conclusiones. a. ¿Cómo se clasifican los medios de cultivo y a cuál pertenecería el elaborado en el laboratorio? b. ¿Qué nutrientes o funión aporta la papa, agar-agar, glucosa y levadura? c. ¿Qué microorganismo pueden utilizar éste medio de cultivo? d. ¿Qué es una espora y a qué se le llama esporada?  Referencias.

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PRÁCTICA 9 Actividad enzimática por microorganismos OBJETIVO: Evaluar la presencia de microorganismos en la leche mediante el efecto de su actividad enzimática sobre la reducción de azul de metileno.

FUNDAMENTO: Investigación antes de la sesión de laboratorio. 1. ¿Qué es una enzima? 2. Menciona al menos tres aplicaciones de las enzimas en la industria alimentaria. 3. Define cinética enzimática. 4. Explica el modelo de Michaelis-Menten. 5. Describe la clasificación de las enzimas. 6. Mencionar al menos tres factores que causan MATERIALES  18 tubos de ensayo con tapón de caucho.  Tapones de caucho.  Baño maría.  Vaso de precipitado de 500 ml.  3 Matraces Erlenmeyer de 50 ml.  3 Tapones horadado.  Tubos de vidrio.  Manguera.  3 Pipetas de 10 ml.  Papel aluminio.  Mechero bunsen. Material biológico:  100 ml de leche en caja.  100 ml de leche bronca (refrigerada una noche antes).  100 ml de leche bronca sin refrigerar (una noche antes). REACTIVOS:  Azul de metileno en polvo.  Alcohol 96º  Agua oxigenada de 3 a 4% (Conseguida por el alumno).

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EQUIPO:  Parrilla eléctrica.  Autoclave.  Estufa a 37ºC. TÉCNICA: Actividad de la Reductasa: Método A. 1) Esterilizar todo el material de vidrio y los tapones. 2) Diluya 5 mg de azul de metileno en 100 ml de agua (para todo el grupo). 3) En un tubo de ensayo estéril (se hará por triplicado), se vierte asépticamente 10 ml de leche y 1 ml de solución de azul de metileno. 4) Se tapona el tubo y se calienta a 37ºC durante un tiempo no superior a 5 min. 5) Se realizan varias inversiones del tubo para asegurar la distribución uniforme y se incuba a 37ºC con el tubo en posición vertical y protegido de la luz. 6) Cada media hora se distribuye la muestra por inversión de los tubos, de manera suave para evitar la incorporación de oxígeno. 7) Observe la reducción del azul de metileno al pasar de color azul a incoloro. 8) La toma del tiempo de reducción se hará desde la puesta en incubación hasta que se decolore. La primera observación se hará cada 15 min. Categoría

Calidad de la leche

Tiempo de reducción

I

Buena

Más de 4.5 h

II

Aceptable

2 a 4.5 h

III

Mala

20 min a 2 h

IV

Muy mala

Menos de 20 min

Método B. 1) En 5 ml de alcohol, diluya polvo de azul de metileno hasta saturación. Posteriormente diluya éstos 5 ml en 195 ml de agua destilada (para todo el grupo). 32

2) En un tubo de ensayo estéril (se hará por triplicado), se vierte asépticamente 20 ml de leche y 0.5 ml de solución de azul de metileno. 3) Se tapona el tubo y se calienta a 37ºC durante un tiempo no superior a 5 min. 4) Se realizan varias inversiones del tubo para asegurar la distribución uniforme y se incuba a 37ºC con el tubo en posición vertical y protegido de la luz. 5) Cada media hora se distribuye la muestra por inversión de los tubos, de manera suave para evitar la incorporación de oxígeno. 6) Observe la reducción del azul de metileno al pasar de color azul a incoloro. 7) Los resultados se interpretarán de acuerdo a la siguiente tabla:

Tiempo de Reducción

Calidad de la leche

No. De microorganismos

Más de 7 h

Muy buena

Menos de 20 000

Más de 5 h

Buena

Menos de 50 000

Más de 4 h

Satisfactoria

Menos de 100 000

Más de 2 h

Menos de 1 millón

Mediocre

Menos de 20 min

Menos de 20 millones

Mala

Actividad de la Catalasa: 1) En un matraz se vierte 20 ml de leche y se atempera a en baño maría a 30ºC durante 15 min. 2) Se agrega 5 ml de agua oxigenada y se vuelve a sumergir en el baño. 3) Se coloca un tapón horadado con un tubo de vidrio y conectado a un baño de agua. 4) Analizar en cuál muestra de leche se presenta mayor liberación de oxígeno.

Elabore su reporte de acuerdo a los lineamientos establecidos.

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PRÁCTICA 8 Biotransformación de la leche por acción enzimática OBJETIVO: Analizar el proceso enzimático involucrado en la biotransformación de la leche a queso.

FUNDAMENTO: Investigación antes de la sesión de laboratorio. 1. Menciona al menos tres ejemplos de microorganismos productores de alguna enzima cuya aplicación haya sido aceptada como aditivo en alimentos. 2. Menciona cuatro ejemplos de enzimas y su actividad enzimática en el área de alimentos. 3. ¿Qué es una enzima inducible y a qué se refiere la represión catabólica? 4. En qué consiste la inmovilización de enzimas y su aplicación en la industria. MATERIALES  12 tubos de ensayo con tapón de caucho.  Baño maría.  Vaso de precipitado de 500 ml. Material biológico  100 ml de leche Ultrapasteurizada.  100 ml de leche pasteurizada.  100 ml de leche Bronca.  Renina (conseguida por el alumno). REACTIVOS  Solución de cuajo al 25% con agua destilada.  Solución de CaCl2 al 20%. EQUIPO:  Parrilla eléctrica.

TÉCNICA: 1) Medida de la actividad coagulante: 2) En un tubo de ensayo se colocan 2 ml de leche, 0.2 ml de Cl 2Ca y un volumen máximo de 0.3 ml de solución de enzima. 34

3) Llevar el tubo a baño maría a 37ºC y medir el tiempo necesario para que comience la coagulación, que se detecta por agitación de la mezcla de incubación con una varilla de vidrio, inclinando el tubo. Se eleva la varilla sobre el nivel del líquido, rozando la pared del tubo y se observa en el líquido que cae sobre la pared, la aparición de pequeños coágulos. Efecto del tratamiento térmico: 1) En tres tubos coloque 8 ml de leche bronca (sin tratamiento térmico), pasteurizada y ultrapasteurizada, respectivamente. 2) Incube en baño maría a 35ºC por 10 min y agregue 0.5 ml de cuajo. 3) Mida el tiempo de coagulación 4) Agregue 0.5 ml de CaCl2 a las muestras que no coagulen y mida el tiempo. Efecto de la temperatura de incubación: 1) En cuatro tubos, coloque 8 ml de leche pasteurizada e incube a 4ºC (tubo 1), 20ºC, 35ºC y 60ºC, por 15 min. 2) Al tubo uno se le agrega 0.5 ml de cuajo y se incuba a 4ºC por hora y media. 3) Después de la incubación, se agrega 0.5 ml de cuajo. 4) Mida el tiempo de coagulación. Efecto de la temperatura de la concentración de enzima: 1) En cuatro tubos coloque 8 ml de leche pasteurizada e incube a 35ºC por 15 min. 2) Posteriormente agregue solución de cuajo en volúmenes de 0.25, 0.75, 1.3 y 1.8 ml, respectivamente. 3) Mida el tiempo de coagulación.

En su reporte, además de los lineamientos generales ya establecidos, discuta los resultados con base en éstas gráficas. 1) Representar el tiempo de coagulación en función del tratamiento térmico. 2) Representar el tiempo de coagulación en función de la temperatura de incubación. 3) Representar el tiempo de coagulación en función de la cantidad de solución de enzima.  Referencias: Tres libros y una fuente de internet. 35

PRÁCTICA 9 Producción de hongos comestibles OBJETIVO: Aprender a preparar dos medios de cultivo para el hongo del género Pleurotus

FUNDAMENTO: Investigación antes de la sesión de laboratorio. 1. Investigue ejemplos de hongos comestibles en el mundo señalando la especie, nombre común y distribución geográfica. 2. Investigue al menos 10 ejemplos de hongos comestibles en México señalando el nombre científico y el nombre común. 3. Con base en la obtención de energía y carbono, explique cómo se clasifican los hongos. 4. De todos los tipos de hongos comestibles, cuáles son los únicos que se cultivan artificialmente. 5. Algunos hongos necesitan un sustrato que debe ser sometido composteo. ¿Qué es el composteo y en qué consisten sus dos fases? MATERIALES:  Algodón, gasa y una coladera de poro chico.  40 tubos de ensayo con tapón de rosca, o de algodón y gasa, ó unos 40 frascos de penicilina. REACTIVOS:  100 g de papas.  25 g de Dextrosa.  100 g de grenetina o 100 g de agar.  1500 ml de agua hervida, electropura o filtrada.  30 g de harina de maíz. EQUIPO:  Autoclave  Parrilla de calentamiento.

TÉCNICA: Procedimiento del medio de cultivo papa-dextrosa-agar: 1) Pelar y cortar en rodajas 100 g de papa. Posteriormente ponerla a hervir en 250 ml de agua durante 50 min. 36

2) Dejar asentar las papas y colar a través de 2 capas de algodón con gasa o con una coladera de poro chico. 3) En 250 ml de agua disolver 50 g de grenetina ó 20 g de agar en caliente. Agregue poco a poco la grenetina hasta que se disuelva. 4) Mezcle las soluciones de los pasos 2 y 3. Mezclar perfectamente. 5) Agregue 10 g de dextrosa y agitar hasta disolución total. 6) Agregue agua al matraz hasta que se tenga un volumen final de 500 ml. En caliente. 7) Vierta la solución del paso 6 en frascos de penicilina o tubos de ensayo a la mitad de su capacidad antes de que la solución empiece a solidificar. Verter tantos frascos o tubos como le sean posibles. 8) Tapar los frascos con pequeños tapones hechos de algodón. 9) Prepare la autoclave y esterilice los viales a 15 libras de presión por 15 min. Procedimiento del medio de harina de maiz 1) En 500 ml de agua, diluir 30 g de harina y hervir a fuego lento de 30 a 60 min. 2) Colar la solución con algodón y gasa o con una coladera de poro chico. 3) Agregue 20 g de grenetina ó 7.5 g de agar y disuelva perfectamente. Agregue poco a poco. 4) Agregue 10 g de dextrosa y disuleva perfectamente. 5) Agregue agua al matraz hasta que se tenga un volumen final de 500 ml. En caliente. 6) Vierta la solución del paso 5 en frascos de penicilina o tubos de ensayo a la mitad de su capacidad antes de que la solución empiece a solidificar. Verter tantos frascos o tubos como le sean posibles. 7) Tapar los frascos con pequeños tapones hechos de algodón. 8) Prepare la autoclave y esterilice los viales a 15 libras de presión por 15 min. Una vez que han sido esterilizados, se retiran los viales y se colocan dentro de bolsas de polietileno (para evitar su desecación) en un lugar limpio (aséptico) procurando que estos queden inclinados. Dejar enfriar a temperatura ambiente para su utilización.

Reporte de la práctica: Será hasta que se complete la parte dos. 37

PRÁCTICA 9 (Parte dos) Producción de hongos comestibles OBJETIVO: Realizar el aislamiento de cepa mediante el método vegetativo. MATERIALES:  Mechero bunsen.  Bisturí o navaja de punta fina.  Viales con medio de cultivo y tapón de algodón.  Etiquetas adhesivas. Material biológico 

Dos ejemplares frescos de hongo seta (especialmente el sombrero ó cuerpo fructífero), recolectados el mismo día o dos días antes pero mantenidas dentro de bolsas de polietileno y en el refrigerador.

TÉCNICA: 1) Mantenga una área completamente aséptica. 2) Se esteriliza el bisturí a la flama. 3) Se enfría agitando al aire. 4) Se toma el hongo y se parte con las manos cerca de la flama, evitando tocar las partes internas. 5) Se toma un fragmento de la “carne” del hongo con el bisturí, cerca de la flama. 6) Se quita el tapón de algodón del vial –con el medio de cultivo- con el dedo meñique, cerca de la flama. 7) Se introduce el fragmento del hongo en el frasco con el medio de cultivo, sin tocar las paredes del mismo. La inoculación se hace cerca de la flama. 8) Se coloca el tapón de algodón en el vial, flameando previamente la parte del algodón que entrará en el vial. 9) Etiquete el frasco anotando el tipo de medio de cultivo, la fecha de inoculación, el nombre del hongo y la clave de la cepa. 10) Coloque el frasco en un lugar con poca luz (más o menos obscuro) y de temperatura constante (17-23°C) para la incubación.

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11) Observe el crecimiento del micelio cada día por 5 a 15 días. Sin agitar los tubos en demasía, tome fotografías. 12) Si se observan manchas verdes, blancas, cremosas o amarillas sobre el medio de cultivo, éstos deberán desecharse lo más rápido posible y alejarse del resto de los frascos, (nunca deben abrirse en el lugar de incubación y de trabajo). 13) La cepa obtenida en esta práctica servirá para la elaboración del micelio activado en las siguientes prácticas de laboratorio.

No olvide anotar en su reporte de la práctica:      

Nombre y número de la práctica. Objetivos. Introducción (investigación). Resultados con los siguientes puntos: 1) Esquemas y/o fotos. Discusión de resultados y conclusiones. Referencias.

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PRÁCTICA 10 Biorreactores OBJETIVO: Conocer y distinguir por sus características los diferentes tipos de reactores utilizados en la biotecnología. MATERIALES:  Biorreactores de diferente capacidad  Fuentes bibliográficas  Visitas PROCEDIMIENTO: 1. Para la sesión de introducción de esta práctica el alumno deberá haber consultado en todas las fuentes posibles el tipo de biorreactores que se emplean a nivel laboratorio, planta piloto y nivel industrial. 2. Se mostrarán a los alumnos los diversos tipos de biorreactores de nivel laboratorio y planta piloto dentro de las intalaciones de la Facultad de Ciencias Químicas para el estudio de sus componentes. 3. También se propone visitar una planta de tratamiento de agua de la zona. 4. Para el reporte de la práctica, se deberán considerar los siguientes puntos para cada uno de los reactores identificados:         



Tipo de reactor. Capacidad. Características geométricas (incluyendo esquema del biorreactor) Sistema de carga y descarga. Sistema de agitación del líquido de reacción. Patrones de flujo Sistema de aireación. Sistema de control (incluyendo sistema de enfriamiento) Método o forma de esterilización de: o Medios de cultivo o Reactor (incluyendo la limpieza) o Aire o Aditivos de fermentación (ácidos, álcalis, antiespumante, etc.) Métodos de cultivo que se lleve a cabo en el biorreactor: o Lote 40

 

o Lote alimentado o Cultivo continuo Producción. Dispositivo de toma de muestras y de inoculación.

BIBLIGRAFÍA: 1. Bull, D.N., Thoma, R.W., Stinnett, T.E. 1983. Bioreactors for submerged culture. Adv. Biotechnology Process. 1:1.30 2. Charles, M. 1985. Fermentation scale-up: problems and possibilities. Trends in Biotechnology. 3. Sitting, W. 1983 Fermentation reactors. Chem Tech. 13: 606-613. 4. Shuler M.L. y Hargi F. Bioprocess Engineering, Prentice Hall, USA., 2002. 5. Bailey J.E. y Ollis D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, 2nd edition. McGraw-Hill, New York, 1986. 6. Doran, Pauline M. Bioprocess engineering principles. Academic Press, 1995. 7. Scragg A. H. Biotecnología para ingenieros. Sistemas biológicos en procesos tecnológicos. Limusa, México D. F., 2011.

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PRÁCTICA 11 Instrumentación para el seguimiento y control de los biorreactores OBJETIVO: El alumno manejará los sistemas de medición y control de variables de operación de biorreatores de tanque agitados, a través de las determinaciones en línea de la temperatura, pH, oxígeno disuelto y espuma.

MATERIALES:  Biorreactor tipo tanque agitado  Sistema de medición y control de temperatura  Sistema de medición y control de pH  Sistema de medición y control de oxígeno disuelto  Sistema de medición y control de espuma  Tanque de nitrógeno puro con válvula de control de presión y de flujo  Vasos de precipitado de 250 ml, 500 ml y 2000 ml  Probetas de 1000 ml  Mangueras de silicón para bombas peristálticas REACTIVOS:  Solución de NaOH 0.5 N  Solución de HCl 0.5 N  Antiespumante Mazu al 10% v/v en agua  Solución proteica o un detergente PROCEDIMIENTO: 1. Medir las dimensiones de todas las partes del biorreactor. 2. Consultar los manuales de operación tanto del biorreactor como de los equipos de medición y control que se utilizarán. 3. Identificar, en el biorreactor, los sistemas de medición y control de temperatura, pH, oxígeno disuelto y espuma. 4. Llenar el biorreactor con agua de la llave o con una solución proteica o de detergente. 5. Calibrar los electrodos de temperatura, pH y oxígeno disuelto. 6. Establecer las condiciones de operación. (siga las instrucciones del titular) 7. Establecer la velocidad de agitación del biorreactor siguiendo las indicaciones del manual de operación del equipo.

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8. Encender el equipo de medición y control y verificar que el valor del pH que registra el mismo sea igua que el de la muestra tomada del biorreactor y medida fuera de línea. 9. De no ser así ajustar el equipo de acuerdo a las indicaciones del manual. 10. Ajustar el pH a un valor de 5 con una disolución de ácido clorhídrico 0.5 N y establece el valor del Set Point de 5. 11. El equipo de medición y control de pH debe tener acoplado el sistema de adición de álcali de una bomba peristáltica capaz de agregar al biorreactor una solución de NaOH 0.5 N de acuerdo a la señal del controlador. 12. Agregar al biorreactor 10 ml de una disolución de HCl 0.5 N con objeto de simular una biorreacción acidogénica (disminuye el valor del pH conforme pasa el tiempo). Observe como el controlador enviará unaseñal a la bomba peristáltica para adicionar el álcali. La bomba dejará de funcionar (de adicionar el álcali) cuando el pH alcance el Set Point de 5. 13. Agregue al biorreacgtor 1 litro de agua aa temperatura ambiente (25 °C) y establezca una velocidad de agitación de 300 rpm, ayudados por el titular del laboratorio. 14. Verifique que las válvulas del circuito de circulación del agua de enfriamiento a través de la chaqueta estén abiertas y encienda el equipo de medición y control de la temperatura que consta del sensor RTD, cables, medidor y controlador, además de la bomba de agua fría. 15. Establezca en el controlador de temperatura un valor de Set Point de 33°C. 16. Encienda la bomba de circulación del agua y espere hasta que la temperatura en el interior del biorreactor alcance la temperatura del Set Point. 17. Agregue al biorreactor 1 litro de agua a temperatura ambiente (25° C) y establezca una velocidad de agitación de 300 rpm. 18. Establezca un flujo de aire a un valor de 0.5 vvm (verifíquelo con el rotámetro). 19. Encienda el equipo de medición de oxígeno disuelto y espere unos 15 minutos hasta que la lectura permanezca estable. Con este valor establezca en el equipo el 100 % del valor de saturación. 20. Ayudados por el titular, conecte un tanque de nitrógeno puro al sistema de introducción del aire del biorreactor y haga pasar un valor de flujo de nitrógeno tal que no sobrepase los 0.75 vvm totales (verifique con el rotámetro), con el objeto de disminuir la presión parcial de oxígeno en el aire. 21. Esto provocará que la concentración de oxígeno disuelto sea menor cuando se burbujea aire solamente. 22. Cierre completamente el suministro de nitrógeno y observe como regresa al valor de 100% de oxígeno disuelto. 23. Reporte sus resultados.

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No olvide anotar en su reporte de la práctica:      

Nombre y número de la práctica. Objetivos. Introducción (investigación). Resultados con los siguientes puntos: 2) Esquemas y/o fotos. Discusión de resultados y conclusiones. Referencias.

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