Manual Bacteriologia

MANUAL PRÁCTICO DE BACTERIOLOGÍA MÉDICA por Miguel F. Torres

Portada interna: Microfotografía electrónica de Salmonella typhi en división. Muestra los flagelos, las fimbrias y la pared celular de la bacteria que causa la fiebre tifoidea. Inserto: dibujos de bacterias de la microbiota oral, por A. van Leeuwenhoek, siglo XVII.

© 1996, Miguel Francisco Torres Rubín Químico Biólogo graduado de la Universidad de San Carlos de Guatemala. Posee Maestría en Microbiología Médica de la Universidad de Duke, Carolina del Norte, Estados Unidos. Fundador del Laboratorio Microbiológico de Referencia (LAMIR) y catedrático titular de Enfermedades Infecciosas, Departamento de Microbiología, Escuela de Química Biológica, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, Universidad de San Carlos de Guatemala. Por muchos años fue microbiólogo del Instituto Guatemalteco de Seguridad Social (IGSS) y del Hospital Militar en la ciudad de Guatemala. Es miembro de la Academia de Ciencias Médicas, Físicas y Naturales de Guatemala, y fundador de la Academia Guatemalteca de Historia de la Medicina. Los criterios expresados en esta publicación son de la exclusiva responsabilidad del autor e incluyen su experiencia personal. Impreso en Editorial Serviprensa C.A. 3a. avenida 14-68, zona 1 Tels. 232-5424, 232-9025 Fax: 232-0237 Guatemala, Guatemala, 1996

ÍNDICE PRESENTACIÓN / 11 AGRADECIMIENTOS / 13 PRÓLOGO / 15 Foto: Antonio van Leeuwenhoek. Foto: Luis Pasteur. Foto: Roberto Koch. CAPÍTULO 1: BREVE INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA / 21 El Nombre Correcto de los Microorganismos. Recomendaciones de Bioseguridad para el Laboratorio de Microbiología. Medidas de Bioseguridad. Métodos de Esterilización o Desinfección. Descontaminación. Antisepsia. Uso efectivo de Antisépticos, Desinfectantes y Procedimientos de Esterilización. Resistencia de Microorganismos a Germicidas Químicos. CAPÍTULO 2: INTRODUCCIÓN A LA BACTERIOLOGÍA / 29 Cómo Organizar el Area de Trabajo de Bacteriología. Fig. 1 Mesa de Trabajo para Bacteriología. La Coloración de Gram. Foto: Hans Gram. Fórmulas: Reactivos para la Coloración de Gram. Fig. 2 Clases de Asas Microbiológicas y su Uso, 1 Asas para Bacteriología, 2 Asas para Micología y Micobacterias. Fig. 3 Inoculación de Medios Sólidos por Estrías. CAPÍTULO 3: COPROCULTIVO / 41 Propósito. Muestra. Procedimiento. Fig. 4 Marcha Bacteriológica para Coprocultivo. Interpretación de Resultados. Fig. 5 Observación y Señalamiento de Colonias Sospechosas. Fig. 6 Técnica para tomar Inóculo de Colonias Individuales. Reacciones de varias Enterobacterias en TSI/LIA. Diferenciación de las Especies del Género Shigella. Diferenciación de las Especies del Género Salmonella. Informe. Procedimiento para Cultivo de Cuerdas Encapsuladas (Enterotest) para Colección de Muestras Duodenales. La Epidemiología y Etiología de la Diarrea. Patógenos Frecuentemente Identificados en Niños con Diarrea Aguda, Atendidos en Centros de Tratamiento, en Países en Desarrollo.

CAPÍTULO 4: COPROCULTIVO PARA CÓLERA / 63 Propósito. Muestra. Procedimiento. Interpretación de Resultados. Fig. 7 Marcha Bacteriológica Acortada para Aislamiento de Vibrio cholerae 01. Informe. Fórmulas: 1 Agua Peptonada Alcalina (APA), 2 Medio de Transporte Cary-Blair. CAPÍTULO 5: COPROCULTIVO PARA Campylobacter jejuni / 71 Propósito. Muestra. Condiciones necesarias. Procedimiento. Interpretación de Resultados. Informe. CAPÍTULO 6: INVESTIGACIÓN DE Helicobacter pylori / 75 Propósito. Muestra. Observación Directa. Prueba de Ureasa. Cultivo. Informe. CAPÍTULO 7: UROCULTIVO / 79 Propósito. Manifestaciones Clínicas y Microorganismos Asociados con Varios Tipos de Infecciones Urinarias. Toma de la Muesta. Toma de Urocultivo en el Hombre. Toma de Urocultivo en la Mujer. Toma de Urocultivo en Niños Pequeños. Punción Supra-púbica (PSP). Procedimiento. Foto: Biplaca para Urocultivo. Fig. 8 Marcha Bacteriológica para Urocultivo. Interpretación de Resultados. Informe. Detección de Bacteriuria por la Coloración de Gram de Orina no Centrifugada. CAPÍTULO 8: CULTIVO DE GARGANTA / 91 Propósito. Muestra. Procedimiento. Fig. 9 Marcha Bacteriológica para Cultivo de Garganta/Exudado Faríngeo. Interpretación. Foto: Interpretación de la Prueba de Bacitracina. Identificación Presuntiva de Streptococcus agalactiae (Grupo B), Prueba de CAMP. Fig. 10 Siembra e Interpretación de la Prueba de CAMP. Características Físicas, Hematológicas y Químicas de la Sangre de Carnero. Ventajas del Uso de la Sangre de Carnero en el Laboratorio Clínico. CAPÍTULO 9: CULTIVOS DE GARGANTA ESPECIALES / 105 Propósito. Investigación de Corynebacterium diphtheriae. Muestra y Procedimento. Interpretación de Resultados. Informe. Investigación de Neisseria meningitidis en Cultivos de Garganta de Contactos. Muestra y Procedimiento. Interpretación. Informe.

CAPÍTULO 10: CULTIVO DE ESPUTO / 121 Propósito. Muestra. El Frote Gram de Esputo. Interpretación del Frote Gram de Esputo. Cultivo de Esputo. Interpretación de Resultados e Informe. Etiología y Sintomatología de Neumonía y Bronquitis. CAPÍTULO 11: HEMOCULTIVO / MIELOCULTIVO / 129 Propósito. Muestra. Procedimiento. Observaciones en Hemocultivos que Orientan el Diagnóstico Bacteriológico. Interpretación de Resultados. Etiología y Sintomatología de Septicemia. Informe. CAPÍTULO 12: SECRECIONES DIVERSAS / 137 Propósito. Muestra. 1 Piel. Etiología y Sintomatología de Heridas Infectadas. 2 Ojos. Etiología y Sintomatología de Infección Ocular. 3 Oídos. Etiología y Sintomatología de Otitis Media. 4 Misceláneos. Procedimiento. Interpretación de Resultados e Informe. Principales Pruebas para la Diferenciación de Tres Especies del Género Staphylococcus de Origen Humano. CAPÍTULO 13: SECRECIONES GENITALES / 147 Propósito. Diagnóstico de Gonorrea. Foto: Neisseria gonorrhoeae, Frote Gram de Pus Uretral Masculino. Diferenciación de Dos Especies de Neisseria de Importancia Clínica. Diagnóstico de Chancro Blando (Chancroide). Diagnóstico Directo de la Sífilis. Foto: Treponema pallidum, Campo Oscuro de Chancro. Agentes Infecciosos del Tracto Genital Femenino. Introducción. Vaginitis. Cervicitis. Otros Agentes Etiológicos. CAPÍTULO 14: LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO Y FLUIDOS CORPORALES / 163 Propósito. Muestra. Etiología y Sintomatología de Infección Osea y Articulaciones. Procedimiento. Fig. 11 Marcha Bacteriológica para Líquido Cefalorraquídeo (LCR). Interpretación de Resultados. Informe. CAPÍTULO 15: TEJIDOS Y BIOPSIAS / 171 Propósito. Muestra. Procedimiento. Interpretación de Resultados e Informe.

CAPÍTULO 16: PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD (ANTIBIOGRAMA) / 177 Propósito. Medio de Cultivo. Procedimiento. Esquema: Jarro Gas-Pak. Fig. 12 Marcha Bacteriológica para Antibiograma. Antibióticos Aprobados (FDA-USA) que deben Usarse Rutinariamente para Pruebas de Susceptibilidad en Varios Grupos Bacterianos. 1 Enterobacterias, 2 Pseudomonas aeruginosa y otros Bacilos gramnegativo no de la Familia Enterobacteriaceae, 3 Sthapylococcus spp. Interpretación de Resultados. Interpretación de los Diámetros de las Zonas de Inhibición (mm) para Miembros de la Familia Enterobacteriaceae. Interpretación de los Diámetros de las Zonas de Inhibición (mm) para Staphylococcus spp. Control de Calidad. Límites Aceptables de los Halos de Inhibición (mm) que Deben Obtenerse con las Cepas Control. Fuentes Comunes de Error. CAPÍTULO 17: ANAEROBIOS / 193 Propósito. Muestra. Toma de Muestra para Cultivo de Anaerobios. Transporte de las Muestras al Laboratorio. Procedimiento. Interpretación de Resultados. Características Morfológicas de Algunos Bacilos Anaerobios Gram-negativo de Importancia Médica. Interpretación del Cultivo. Morfología Microscópica. Fig. 12 Diversas Morfologías Bacterianas. Informe. CAPÍTULO 18: MICOBACTERIAS / 203 Propósito. Muestras. 1 Esputo, 2 Lavado Gástrico, 3 Orina, 4 Otro Tipo de Muestras. Procedimiento. Procedimiento de la Coloración de Ziehl-Neelsen. Fórmulas: Reactivos para Ziehl-Neelsen. Coloración de Kinyoun. Fórmulas: Reactivos para Kinyoun. Interpretación e Informe de Baciloscopías. Reporte de Frotes para Micobacterias. Cultivo para Micobacterias. Digestión y Descontaminación de Esputos. Método de Digestión y Descontaminación con N-acetil-levo-cisteína (NALC). Fórmulas. Digestión y Descontaminación de Esputos por el Método Convencional de Hidróxido de Sodio. Fórmulas. Procedimiento de Digestión/ Descontaminación para Esputos de Pacientes cuyas muestras están constantemente contaminadas con Pseudomonas sp. o Proteus sp. Procedimiento para Lavados Gástricos. Procedimiento para Orina. Procedimiento para Hisopo Faríngeo. Procedimiento para Tejido o Piel. Procedimiento para Otros Fluidos Corporales. Interpretación del Cultivo. Prueba de Niacina. Grupos de Runyon (Micobacterias “Atípicas”). BIBLIOGRAFÍA / 223

ÍNDICE DE FIGURAS Fig.1 / 34 MESA DE TRABAJO PARA BACTERIOLOGÍA Fig.2 / 39 CLASES DE ASAS MICROBIOLÓGICAS Y SU USO 1 Asas para Bacteriología 2 Asas para Micología Fig.3 / 40 INOCULACIÓN DE MEDIOS SÓLIDOS POR ESTRÍAS Fig.4 / 45 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA COPROCULTIVO Fig.5 / 46 OBSERVACIÓN Y SEÑALAMIENTO DE COLONIAS SOSPECHOSAS Fig.6 / 48 TÉCNICA PARA TOMAR INÓCULO DE COLONIAS INDIVIDUALES Fig.7 / 67 MARCHA BACTERIOLÓGICA ACORTADA PARA AISLAMIENTO DE Vibrio cholerae 01 Fig.8 / 84 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA UROCULTIVO Fig.9 / 94 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA CULTIVO DE GARGANTA FIG.10 / 100 SIEMBRA E INTERPRETACIÓN DE LA PRUEBA DE CAMP Fig. 11 / 166 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO (LCR)

Fig.12 / 181 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA ANTIBIOGRAMA Fig.13 / 201 DIVERSAS MORFOLOGÍAS BACTERIANAS

Nota: Al centro del libro, a partir de la página 111 aparecen 32 fotografías a color y sus explicaciones correspondientes.

Guatemala, agosto de 1996

PRESENTACIÓN Las enfermedades infecciosas continúan siendo la principal causa de morbimortalidad en Mesoamérica. Entre las variadas infecciones que afectan la salud pública de nuestros pueblos, las infecciones de origen bacteriano son unas de las más frecuentes. Por este motivo, cualquier esfuerzo orientado a capacitar personal de salud en diagnóstico bacteriológico, incide directamente en su mejor tratamiento y control. La Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos de Guatemala, se complace en presentar el siguiente MANUAL PRÁCTICO DE BACTERIOLOGÍA MÉDICA a la comunidad científica de Guatemala y Centroamérica. Como su título lo indica, se trata de un libro fácil de leer, comprender y aplicar, dirigido a profesionales, estudiantes y técnicos que estudian o trabajan directamente la bacteriología en los laboratorios clínicos privados o estatales. El autor es catedrático titular desde hace 22 años en el Departamento de Microbiología, Escuela de Química Biológica de esta Casa de Estudios. Durante estos años, ha tenido a su cargo la enseñanza de la bacteriología médica a los estudiantes de Química Biológica. Cuenta con una gran trayectoria profesional dentro y fuera de la Universidad de San Carlos de Guatemala. Se ha destacado no sólo como catedrático e investigador a través de sus múltiples publicaciones en revistas científicas nacionales e internacionales, sino también a lo largo de los años ha demostrado su empeño por mejorar la microbiología en nuestro medio. Uno de sus principales logros fue la creación del Laboratorio Microbiológico de Referencia -LAMIR- en 1991. La experiencia de Miguel F. Torres en la docencia e investigación en bacteriología, parasitología y micología, aunados a sus conocimientos y experiencia adquiridos durante varios años de servicio como microbiólogo clínico del Instituto Guatemalteco de Seguridad Social y del Hospital Militar, garantizan el contenido del manual. Esta obra fue completada por el autor durante su año sabático de la Universidad de San Carlos. Constituye un valioso libro de texto para los estudiantes de diversas carreras. Por este motivo, no dudamos en recomendarlo y desearle muchos éxitos. Atentamente, Lic. Jorge Rodolfo Pérez Folgar Decano Lic. Gerardo Arroyo Catalán Director de la Escuela de Química Biológica

Licda. Heidi Logemann Lima Jefe del Departamento de Microbiología

AGRADECIMIENTOS El autor desea patentizar sus agradecimientos a los siguientes destacados bacteriólogos de Centroamérica y el Caribe, por su valiosa colaboración al haber revisado el manuscrito de este libro. Los distinguidos colegas efectuaron valiosos comentarios y sugerencias, los cuales dada su gran experiencia y prestigio, enriquecen la obra. Licda. Floridalma Cano Granados Supervisora del Laboratorio de Bacteriología y Parasitología Intestinal Laboratorios de Microbiología “Dr. Leonardo J. Mata” Instituto de Nutrición de Centroamérica y Panamá Guatemala Dr. Edmundo E. Poujol Ex-Director del Departamento de Microbiología Universidad Nacional Autónoma Honduras Dr. Jaime Guevara R. Jefe de la Sección de Laboratorios Dirección Técnica de Servicios de Salud Caja Costarricense de Seguro Social Costa Rica Dra. Marion C. de Martin Vice-decana de la Facultad de Medicina Universidad Nacional Panamá Dr. Gerardo F. Martínez Jefe del Departamento de Bacteriología / Micología Sub-Dirección de Microbiología Instituto de Medicina Tropical “Dr. Pedro Kourí” Cuba A los personeros del Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social de Guatemala que brindaron su apoyo para lograr el financiamiento de 250 copias de la Segunda Edición del presente Manual. Ellos permitieron hacer llegar nuestro mensaje académico y guía de trabajo a profesionales, técnicos de laboratorio y estudiantes. Actualizar y estandarizar la bacteriología médica en nuestros países, debe ser la meta. Estas labores deben ser dinámicas y constantes.

PRÓLOGO A LA SEGUNDA EDICIÓN Las tres diferentes formas que presentan las bacterias fueron observadas por primera vez por Antonio van Leeuwenhoek en Delft, Holanda, en el siglo XVII. Sin embargo, la bacteriología médica surgió como tal hacia fines del siglo XIX, con los geniales descubrimientos de Pasteur en Francia y Koch en Alemania. Por primera vez en la historia, en 1876, Roberto Koch propagó una bacteria patógena en cultivo puro fuera del cuerpo. Al aislar Bacillus anthracis no sólo estableció ésta bacteria como causa del ántrax en el ganado vacuno, sino inauguró un método de investigación de las infecciones, actualmente vigente. Hoy en día, la bacteriología clínica ha avanzado enormemente y en la última década del siglo XX es muy extensa y diversa. Por este motivo, se hace necesario extraer de la literatura actualizada los conocimientos, técnicas y criterios interpretativos necesarios para efectuar adecuadamente los análisis bacteriológicos más frecuentes, y ordenarlos de manera simple y comprensible. Estos son los propósitos fundamentales de la presente publicación. Este MANUAL PRÁCTICO DE BACTERIOLOGÍA MÉDICA no es un texto exhaustivo de la materia, ni mucho menos un tratado de taxonomía bacteriana. Es una guía simplificada de trabajo, orientada hacia la obtención de resultados lo más rápido posible y con el mayor significado clínico. Al final del libro, se seleccionan las referencias bibliográficas más relevantes. Anteriormente se aceptaba que el buen bacteriólogo clínico era aquel capaz de identificar hasta especie todas las bacterias presentes en determinado cultivo. Hoy en día este concepto ha cambiado y el buen bacteriólogo clínico es quien discrimina efectivamente los microorganismos potencialmente patógenos de la microbiota normal, los identifica total o presuntivamente lo más pronto posible y emite un informe claro y correcto. Por este motivo, en el presente manual práctico se hace énfasis en los criterios actualizados de interpretación. El estudio de la Historia de la Humanidad, permite comprender la realidad presente y proyectarse mejor hacia el futuro. En el caso de la bacteriología médica, los inspiradores escritos, sus retratos y el ejemplo de tres pioneros de esta ciencia, que aparecen al principio del libro, van dedicados al amable lector. 15

Es imperativo hacer mención del gran aporte que el invento del microscopio representó para las ciencias biológicas. Antonio van Leeuwenhoek durante el siglo XVII fue el primer humano que observó las bacterias. Este personaje longevo, no sólo efectuó grandes descubrimientos con sus microscopios de “lente de gota”, sino también nos legó su ejemplo del valor de la palabra científica escrita. El microscopio compuesto que usamos hoy en día fue inventado posteriormente por los hermanos Hans y Zacarías Janssen, en Middleburg, Holanda. Luego fue perfeccionado por Galileo Galilei y Johannes Kepler. Durante el siglo XVIII, estos refinados instrumentos fueron curiosa entretención para científicos y aficionados, incluyendo a las ilustradas damas de las cortes europeas. No fue sino hasta el siglo XIX, que los grandes titanes de la bacteriología, Luis Pasteur en Francia y Roberto Koch en Alemania, efectuaron los descubrimientos básicos que han permitido el desarrollo de la bacteriología médica moderna. Los logros de estos dos pioneros fueron múltiples, por lo que es muy difícil sumarizarlos. Conviene recordar que el increíble avance de la bacteriología en las postrimerías del siglo XX, y el que vivirán nuestros descendientes en el próximo milenio, se fundamentan en sus descubrimientos y los de sus discípulos. La Primera Edición de este MANUAL PRÁCTICO DE BACTERIOLOGÍA MÉDICA, fue patrocinada por la compañía farmacéutica Pfizer, en septiembre de 1996. Esta edición se agotó rápidamente entre profesionales y estudiantes de laboratorio clínico en Centroamérica. Hasta la fecha, este libro ha sido adoptado como referencia del trabajo rutinario en bacteriología clínica en múltiples laboratorios y es libro de texto en varias universidades. En 1999, el Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social de Guatemala, ha reconocido la necesidad de patrocinar una Segunda Edición, la cual llegará a todos los profesionales y técnicos de la Red Nacional de Laboratorios Clínicos, ahora como norma obligatoria a observar en bacteriología médica. El autor ha plasmado en el presente libro, treinta años de experiencia en la materia, de manera simplista y expresando lo mínimo que es necesario efectuar en los laboratorios clínicos de Mesoamérica. Miguel F. Torres, Q.B., M.A. Ciudad de Guatemala, 25 de octubre de 1999

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El ojo humano es incapaz de visualizar objetos menores de 30 micras. Por este motivo, antes de la invención del microscopio, el hombre desconoció la vida microscópica y la estructura celular de los tejidos. Antonio van Leeuwenhoek fue un comerciante de telas, nacido en 1632 en Delft, Holanda. Fabricó ingeniosos microscopios con pequeños lentes fundidos en placas de diversos metales. Con los cientos de microscopios que hizo personalmente a lo largo de su vida, fue el primer ser humano que observó las bacterias, los protozoos, los glóbulos rojos y los espermatozoides. Durante 50 años, informó periódicamente sus maravillosos hallazgos en detalladas cartas dirigidas a la Real Sociedad de Londres. A partir de preparaciones de material interdental, dibujó y reportó por primera vez los tres tipos de formas bacterianas. 17

Carta a sus hermanas: “La voluntad es algo grande, pues la acción y el trabajo generalmente siguen a la voluntad y casi siempre el trabajo se acompaña del éxito. Estas tres cosas, trabajo, voluntad y éxito, llenan la existencia humana. La voluntad abre la puerta al éxito, ambos brillantes y felices, el trabajo pasa estas puertas y al final del viaje el éxito corona nuestros esfuerzos”. LOUIS PASTEUR, 1841 (Besançon, Francia) 18

Roberto Koch fue un médico rural alemán, nacido en 1843. Sus aportes a la bacteriología médica fueron enormes. Primero cultivó la bacteria causante del ántrax en humor vítreo de buey. Luego desarrolló gradualmente técnicas bacteriológicas fundamentales, como el uso del agar extraído de algas marinas para solidificar los medios de cultivo y así poder observar colonias. Con su discípulo Paul Ehrlich, aplicó los colorantes derivados de la anilina a la coloración de microorganismos. Descubrió las bacterias causantes de el cólera, la tuberculosis (bacilo de Koch) y el protozoo causante de la enfermedad del sueño. 19

CAPÍTULO 1 BREVE INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA La microbiología es la ciencia que estudia a los seres vivos microscópicos, es decir que sólo pueden observarse con ayuda del microscopio. Los pequeños organismos microscópicos son llamados vulgarmente “microbios”, pero la palabra correcta para designarlos es microorganismos. La microbiología se aplica no sólo a la ciencia médica, sino también a la veterinaria, a la agronomía y a la industria, por lo que forma parte del plan de estudios de varias carreras universitarias. Existen muchas clases de microorganismos, los cuales se clasifican según su estructura, manera de reproducirse y muchas otras características. Los grupos más importantes de microorganismos son: los virus, las bacterias, los protozoos y los hongos. Los virus son los microorganismos más pequeños, se reproducen únicamente dentro de las células y tienen forma similar a cristales. La palabra microorganismo abarca grupos de seres vivos muy diferentes entre sí. La microbiología se sub-divide en varias disciplinas que estudian cada grupo taxonómico de microorganismos. Algunos no son propiamente microorganismos, pero su estudio se basa en estructuras microscópicas. Microbiología

Bacteriología (bacterias) Micología (hongos) Virología (virus) Parasitología Protozoología (protozoos) Helmintología (helmintos) Entomología (insectos, ácaros, otros)

La mayoría de los microorganismos no son capaces de causar enfermedades en el hombre y se les llama por esta razón “saprófitos” o “saprobios”. Sin embargo, algunos causan enfermedades en el hombre, llamadas infecciones. Cuando un microorganismo es capaz de producir infección, se dice que es “patógeno”; la “virulencia” es la cuantificación de la patogenicidad. La inmunología nació ligada a la microbiología como el estudio de los mecanismos de defensa contra los microorganismos. Ahora su campo de acción se ha extendido mucho y es una ciencia biológica independiente. 21

En todos los ambientes que rodean al hombre existen microorganismos. Las bacterias y los hongos son los más abundantes; prácticamente todos los objetos que vemos y tocamos están cubiertos de ellos. El cuerpo humano, especialmente donde hay membranas mucosas (intestino, vagina, boca, etc.), está cubierto de bacterias. De los microorganismos que viven constantemente en el hombre, se dice que forman parte de alguna “microbiota”. Por microbiota se entiende aquel conjunto de diversos microorganismos que normalmente convive con el hombre sin causarle ningún daño. La palabra “flora” no es correcta, y por lo tanto no debe utilizarse. Se dice que los microorganismos de las microbiotas “colonizan”, no infectan, aunque eventualmente pueden hacerlo y en este caso se les llama “oportunistas”. EL NOMBRE CORRECTO DE LOS MICROORGANISMOS: Todos los nombres científicos de los seres vivos, de acuerdo con el sistema binario de Linneo, se componen de dos palabras: la primera que indica un gran grupo, es el género y siempre se escribe la primera letra con mayúscula. El segundo nombre es la especie y siempre se escribe con letras minúsculas. Casi todos los nombres científicos de los microorganismos se derivan del griego o del latín, por esta razón: a) b)

Siempre se subrayan discontinuamente o se escriben con letra cursiva Nunca se tildan

Ejemplos: Staphylococcus aureus (bacteria) Escherichia coli (bacteria) Streptococcus pyogenes (bacteria) Pseudomonas aeruginosa (bacteria) Entamoeba histolytica (parásito, protozoo) Giardia lamblia (parásito, protozoo) Ascaris lumbricoides (parásito, helminto) Trichophyton rubrum (hongo) Microsporum canis (hongo) Además del nombre científico, en algunos casos existe un nombre de uso común o vulgar. El uso de este tipo de nombres debe evitarse. Los nombres vulgares más conocidos son los siguientes: 22

Nombre correcto:

Nombre vulgar:

Escherichia coli Streptococcus pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Enterobius vermicularis Trichuris trichiura Entamoeba histolytica Entamoeba coli Hymenolepis nana Candida albicans

colibacilo (bacteria) neumococo (bacteria) gonococo (bacteria) oxiuro (parásito, helminto) tricocéfalo (parásito, helminto) ameba histolítica (parásito, protozoo) ameba coli (parásito, protozoo) tenia nana (parásito, helminto) monilia (hongo)

Si se desea hacer referencia a todas las especies de un género se usa la abreviatura para especies: “spp.” y no se subraya. Si sólo se refiere a una especie no determinada de un género dado, se usa: “sp.” abreviatura de especie. Ejemplos: Streptococcus spp. = todos los estreptococos que existen. Shigella sp. = una especie no determinada del género Shigella.

Tomado de:

RECOMENDACIONES DE BIOSEGURIDAD PARA EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Dr. Miguel F. Torres y Dra. Margarita Paz de Ramírez Laboratorio Microbiológico de Referencia (LAMIR) y Depto. de Citohistología. Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, Universidad de San Carlos.

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MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18.

Lavarse las manos frecuentemente Usar gabacha Usar guantes de caucho en buen estado cuando es necesario Usar mascarilla cuando es necesario Rotular adecuadamente todo el material y los reactivos No comer en el área de trabajo No almacenar comida en el área de trabajo No fumar Usar adecuadamente los desinfectantes Usar detergentes y desinfectantes adecuados para cada tipo de material Clasificar los desechos Descontaminar el material biológico antes de descartarlo Esterilizar o incinerar el material contaminado Destruir el material descartable o no reusable No utilizar materiales inflamables cerca del mechero Conocer el uso y manejo de los extinguidores Neutralizar los desechos químicos Descontaminar el material radioactivo antes de su descarte

Equipo necesario: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Campana bacteriológica Campana de flujo laminar cuando es necesario Lámpara de pie Mechero o incinerador Incubadora bacteriológica Autoclave Horno esterilizador Agitador de tubos Centrífuga

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Equipo de seguridad necesario en un laboratorio de investigación: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Extinguidores en lugares accesibles Basureros cerrados Lava-ojos Extractor de vapores Incinerador Recipientes con desinfectantes y descontaminantes Campana de flujo laminar y/o de bioseguridad Equipo adecuado para descarte de material contaminado y de solventes Recipientes plomados MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN O DESINFECCIÓN

Método ESTERILIZACIÓN: Calor Húmedo (autoclave) Seco (horno)

Concentración o nivel

Gas Oxido de etileno Líquido Glutaraldehido Peróxido de hidrógeno Formaldehido Dióxido de cloro

121° C a diferentes intervalos de tiempo 171° C por 1 hora; 160° C por 2 horas; 121° C por 16 horas 450-500 mg/litro a 55-60° C variable 6-30% 6-8% variable

DESINFECCIÓN Calor Húmedo (incluye pasteurización) Líquido glutaraldehido peróxido de hidrógeno formaldehido compuestos clorinados alcoholes (etanol, isopropílico) compuestos fenólicos compuestos yodados

75-100° C variable 3-6% 1-8% 500-5,000 mg de cloro libre/litro 70% 0.5-3% 0.1-0.2%

ANTISEPSIA alcoholes yodóforos hexaclorofeno

70% 1-2 mg de yodo libre/litro 1-3%

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Actividad

alta alta-media alta-media alta-media intermedia intermedia media-baja media-baja

DESINFECCIÓN: Proceso generalmente menos letal que la esterilización. Elimina virtualmente todos los microorganismos patógenos pero no necesariamente todas las formas microbianas (esporas). El procedimiento de desinfección carece del margen de seguridad que se logra por los procedimientos de esterilización. Factores: 1. 2. 3. 4.

Naturaleza y número de microorganismos contaminantes. El tipo y configuración del material a desinfectar. Tipo y concentración del germicida químico usado. Tiempo y temperatura de exposición.

DESCONTAMINACIÓN: Es un término usado para describir un proceso o tratamiento aplicado a una superficie ambiental o a un instrumento de trabajo. Este término abarca desde lavado con agua y jabón hasta la desinfección o esterilización. ANTISEPSIA: Un antiséptico es definido como un germicida usado sobre piel o tejido vivo con el propósito de inhibir o destruir microorganismos. USO EFECTIVO DE ANTISÉPTICOS, DESINFECTANTES Y PROCEDIMIENTOS DE ESTERILIZACIÓN Factores para la elección de desinfectantes y procedimientos de esterilización. 1. 2. 3.

Grado de muerte microbiana requerida. Naturaleza del material o la superficie a ser tratada. Costo y disponibilidad de los agentes germicidas.

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ESTERILIZACIÓN: Uso de procedimiento físico o químico para destruir toda la vida microbiana, incluyendo grandes cantidades de endosporas bacterianas altamente resistentes. Tipos de esterilización: Calor húmedo: autoclave de vapor Calor seco: horno esterilizador Gas de óxido de etileno Esterilizantes químicos: germicidas basados en glutaraldehido. RESISTENCIA RESISTENCIADE DEMICROORGANISMOS MICROORGANISMOSAAGERMICIDAS GERMICIDASQUÍMICOS QUIMICOS(*) (*) ESPORAS BACTERIANAS Bacillus subtilis Clostridium sporogenes MICOBACTERIAS Mycobacterium tuberculosis var. bovis VIRUS PEQUEÑOS O NO LIPÍDICOS Poliovirus - Coxsackievirus - Rhinovirus HONGOS Trichophyton sp.-Cryptococcus sp.-Candida sp. BACTERIAS VEGETATIVAS Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Salmonella choleraesuis VIRUS DE MEDIANO TAMAÑO O LIPÍDICOS Herpes simplex - Cytomegalovirus Virus sincitial respiratorio Virus de Hepatitis B Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) (*) En orden descendente de resistencia

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CAPÍTULO 2 INTRODUCCIÓN A LA BACTERIOLOGÍA Las bacterias son microorganismos formados por una sola célula muy simple, que en condiciones ideales realiza funciones de alimentación y reproducción. Son uno de los grupos microbianos más frecuentes y abundantes en casi todos los ambientes. La reproducción de las bacterias ocurre por simple partición de una célula en dos células hijas, y ocurre en un tiempo muy corto en comparación con la reproducción de otros seres vivientes. Algunas tienen la capacidad de producir esporas que son estructuras de resistencia. Las bacterias pueden ser móviles o inmóviles. Cuando tienen movimiento, lo hacen por medio de flagelos o filamentos largos que agitan en forma de látigo. Para que las bacterias puedan reproducirse in vitro, es decir en las condiciones de laboratorio, debe proporcionárseles todas las sustancias nutritivas que requieren (proteínas, azúcares, vitaminas, etc.). Estos nutrientes se encuentran en los medios de cultivo. El pH es muy importante y debe mantenerse estable y regulado según cada medio de cultivo. Las bacterias se clasifican en base a diversas características. Según sus requerimientos de oxígeno, las bacterias pueden ser: a.

Aerobias: Crecen bien en la atmósfera que respiramos, es decir en presencia de oxígeno, el cual requieren para su sobrevivencia.

b.

Microaerofílicas: Crecen mejor en presencia de pocas cantidades de oxígeno. Para disminuir la concentración de oxígeno en el microambiente en el cual se incuban cultivos de bacterias, se recomienda introducirlos en jarros de vidrio con una candela encendida, lo que enriquece con un 5 al 10 % de anhídrido carbónico (CO2).

c.

Anaerobias: Son incapaces de crecer en presencia de oxígeno, el cual les es sumamente tóxico e impide su crecimiento.

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d.

Facultativas: Son capaces de crecern en ausencia de oxígeno y tienen la facultad de también crecer en aerobiosis.

Según la temperatura óptima de crecimiento, las bacterias pueden ser: a.

Mesófilas: Crecen a temperaturas intermedias, semejantes a la temperatura del cuerpo humano o a la temperatura del ambiente. En este grupo se incluyen todas las bacterias patógenas, por esta razón la temperatura a la cual deben mantenerse constantemente las incubadoras bacteriológicas es de 36 grados centígrados.

b.

Termófilas: Crecen a altas temperaturas (calor).

c.

Criófilas: Crecen a bajas temperaturas (frío).

d.

Psicrotróficas: Crecen a temperaturas de refrigeración.

Según su forma, las bacterias se clasifican en tres grupos: a.

Cocos: Son bacterias de forma esférica o redondeada. Ejemplo, Foto A página siguiente: Microfotografía de Staphylococcus aureus en división.

b.

Bacilos: Son bacterias alargadas, de forma similar a una salchicha o bastoncillo. Ejemplo, Foto B página siguiente: bacilos en división.

c.

Espiroquetas: Son bacterias alargadas y retorcidas en forma de resorte o espiral. Ejemplo, Foto C página siguiente: Microfotografía de bacterias de la microbiota oral; Treponema sp. (espiroquetas), bacilos y cocos.

Dependiendo de su forma de agrupación los cocos pueden clasificarse así: a.

Diplococos: Agrupación de bacterias esféricas en grupos de dos, o parejas (ejemplos: Streptococcus pneumoniae y Neisseria gonorrhoeae).

b.

En cadenas. Ejemplo: estreptococos (Streptococcus spp.)

c.

En racimos. Ejemplo: estafilococos (Staphylococcus spp.)

Este tipo de clasificación no se aplica a los bacilos ni a las espiroquetas.

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A

B

C 31

CÓMO ORGANIZAR EL ÁREA DE TRABAJO DE BACTERIOLOGÍA Para poder trabajar bacteriología médica, se requiere del siguiente material y equipo básico, según se ilustra en la figura 1 (pág. 34). 1. Una superficie lisa del alto de un escritorio de oficina (76 a 78 cm de alto), material liso, blanco o negro mate, lavable, tipo fórmica. El lugar de trabajo debe estar lejos de ventanas que permitan corrientes de aire, lavatrastos o basureros. Contar con una silla cómoda, giratoria, con respaldo, y ajustable al alto adecuado. 2. Un mechero quemador de gas propano tipo Meker, Bunsen o “Touch-OMatic”. Ajustar la entrada de aire a manera de obtener una llama azul y translúcida (no amarilla). Debe tenerse presente que solamente es estéril el aire que está un pie (30 cm) alrededor del mechero encendido, por lo que se debe trabajar lo más cerca posible. Situarlo al frente ligeramente hacia la derecha. También puede usarse incinerador. 3. Una campana bacteriológica de madera o fibra de vidrio para aislar el área de trabajo, la cual debe desinfectarse diariamente antes de iniciar el trabajo. Frotarla por dentro con formol al 10 por ciento, fenol al 1 por ciento, o por lo menos con alcohol al 70 por ciento. La campana no es indispensable; puede trabajarse sin ella, si se hace con cuidado, es decir sobre una superficie desinfectada y cerca del mechero. 4. Un autoclave para esterilizar con calor húmedo a presión, material y medios de cultivo, “matar” material contaminado y cultivos (esterilizar previo descarte o limpieza). Puede ser pequeño, tipo olla de presión. Calibrarlo a manera de autoclavear siempre por 15-20 minutos a 121o C y 15 libras de presión por pulgada cuadrada. 5. Un soporte de asas, que puede ser de madera forrada con fórmica, con las siguientes asas de “nichrome” (aleación de níquel y cromo), según se ilustra en la figura 2 (pág. 39): dos en anillo (no calibrada), dos en aguja, y una asa calibrada de platino puro en anillo pequeño para tomar 0.001 ml (para inocular urocultivos). Para trabajar Micología (hongos) debe contarse también con asa espatulada, asa en “L” y dos agujas de disección. Las asas bacteriológicas deben ponerse rectas y limpiarse diariamente. Esto se hace fácilmente haciéndolas rodar en el suelo deslizando el zapato a manera que rueden y luego hacer el anillo con el cabo de otra asa. Debe trabajarse siempre con dos asas en anillo, cuando una se forma, se usa la que ya está fría. 32

6. Una lámpara de mesa de pie corto (tipo escritorio) o de “cuello de ganso”; colocarla al frente, ligeramente hacia la izquierda, de manera que ilumine fuertemente el área sobre la mesa, pero que la luz no dé directamente a los ojos. 7. Microscopio óptico binocular de buena calidad, con condensador de campo oscuro. 8. Lupa o de preferencia microscopio estereoscópico para observar bien las colonias. 9. Incubadora bacteriológica que debe mantenerse constantemente a 36o C exactos (no a 37o C ó a 35o C). Debe mantenerse siempre cerrada y pegarle una hoja de control diario de temperatura. 10. Balanza para pesar medios de cultivo. 11. Hornilla eléctrica de dos discos y temperatura graduable. 12. Refrigerador con congelador. 13. Frascos grandes de boca ancha, de los que se usan para dulces en las tiendas, con tapadera metálica de rosca que cierre bien. Tener suficientes veladoras (velas gruesas) de parafina. Alternativamente usar jarra Gas-Pak con sobres microaerofílicos. 14. Jarro Gas-Pak (BBL) o similar, sobres generadores de anaerobiosis, catalizadores e indicadores para incubar cultivos anaerobios. 15. Agitador de tubos tipo “vortex”. 16. Colorantes, soluciones y medios de cultivo según se describe en cada capítulo. 17. Gradillas para colocar tubos con medios de cultivo o muestras.

33

Fig. 1 MESA DE TRABAJO PARA BACTERIOLOGÍA

34

LA COLORACIÓN DE GRAM Las bacterias son microorganismos incoloros, por este motivo deben teñirse para poder observarlos con ayuda del microscopio. Por esta razón, a continuación se describe la técnica más importante que debe usarse para diferenciar bacterias: la coloración de Gram. Se recomienda usar la modificación de Hucker según Bartholomew, de acuerdo con la bibliografía que aparece al final de este manual. a)

Preparación de frotes:

Hans Gram

La coloración de Gram puede aplicarse a frotes extendidos sobre portaobjetos de vidrio (también llamados frotis) de todo tipo de muestras clínicas, o a frotes de suspensiones de cultivos. Frotar la muestra suavemente y sin revolver mucho sobre la superficie de un portaobjetos limpio y seco. Esperar que seque sobre una superficie lisa o flamear muy levemente. Rotular adecuadamente con crayón graso por detrás de la lámina. Una vez que el frote ya está seco, fijar pasando levemente por la llama del mechero dos veces, sin que se caliente excesivamente (que no queme al ponerlo sobre la piel del dorso de la mano). Dejar que el frote se enfríe antes de colorearlo, pues si se colorea caliente precipitan los colorantes. Si la muestra que se va a colorear contiene mucha sangre, el frote debe hemolizarse con agua. Proceder así: dejarlo secar y fijar con calor, cubrir completamente con agua del chorro un minuto, y luego proceder a colorearlo con Gram. Este tratamiento permite destruir los eritrocitos y poder observar las bacterias. b)

Técnica de la coloración de Gram:

1. Cubrir el frote ya fijado y frío con cristal violeta, dejar el colorante por un minuto (ver preparación de colorantes adelante). Enjuagar en un chorro suave de agua corriente. Escurrir muy bien. 2. Cubrir con lugol de Gram y dejar por un minuto. Enjuagar de nuevo suavemente con agua corriente, escurrir bien. 3. Aplicar gota a gota el decolorante alcohol-acetona por 4 ó 5 segundos, hasta que ya no salga más cristal violeta. Este paso es crucial y debe ser muy breve en frotes delgados y más prolongado en frotes gruesos. 35

4. Cubrir el frote con safranina sólo por 30 segundos. Enjuagar suavemente con agua, escurrir y dejar secar. El frote puede secarse dentro de la incubadora a 36° C, o flamear muy levemente, si es urgente. Otra alternativa es secarlo con aire obtenido de una pera de hule o un secador para manos. 5. Examinar en el microscopio con el lente de inmersión, con aceite especial de viscosidad adecuada. c)

Resultados:

Bacterias gram-positivo: morado-azul obscuro. Bacterias gram-negativo: rojo. La diferencia de coloraciones se debe al grosor de la pared celular, que es más “delgada” en las bacterias gram-negativo. Esta coloración sólo es válida para cocos y casi todos los bacilos (excepto micobacterias), no es válida para espiroquetas. Si el frote es de material clínico, es decir de muestras de pacientes, debe quedar rojo a simple vista después de colorearlo. Si hay leucocitos presentes en la muestra éstos deben ser rojos (gram-negativo) y si hay levaduras deben verse azul-morado (gramnegativo), lo que sirve para evaluar si el frote se decoloró adecuadamente. d)

Informe:

El reporte correcto de una bacterioscopía (observación de bacterias) con Gram debe contener los siguientes elementos y en este orden: 1. Identificación del paciente (apellidos, nombres, número de registro o afiliación, servicio y fecha). 2. Título que indique el tipo de muestra examinada y el sitio anatómico de donde proviene. Por ejemplo: Secreción de úlcera en miembro inferior derecho. Coloración de Gram: 3. Mencionar primero las bacterias observadas. Empezar por la clase más freuente en la muestra, indicar agrupación y cantidad (muy escaso, escaso, regular cantidad, abundante o muy abundante ó +, ++, +++, ++++). Por ejemplo: cocos gram-positivo en cadenas cortas: abundantes; bacilos gram-negativo: regular cantidad, diplococos gram-negativo: muy escasos. Usar siempre positivo y negativo

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en singular con respecto al Gram, nunca gram-positivos o gram-negativos en plural. 4. Luego es muy importante para el médico saber si hay glóbulos blancos en la muestra, su clase y cantidad. Por ejemplo: Leucocitos polimorfonucleares: abundantes. Este dato indica que hay verdadera infección y que la muestra era purulenta. Si se observan bacterias dentro del citoplasma de los leucocitos, mencionar “intracelular” en el reporte, lo que es de especial interés clínico en los frotes de secreciones uretrales masculinas. La presencia de linfocitos indica infección crónica o viral (no purulenta). 5. Indicar siempre la presencia y cantidad de levaduras o micelio de hongos (gram-positivo); de células epiteliales, de especial interés en frotes de esputo (se miran gram-negativo aplanadas con citoplasma grande, transparente y núcleo pequeño redondo u ovalado). Aunque no es crucial, indicar la presencia de fibrina, que se mira en forma de hebras gram-negativo alargadas e irregulares. 6. Cuando es necesario, con experiencia y cautela podrán incluirse al final comentarios sobre la calidad de la muestra, indicar que la morfología observada es compatible con una especie de bacterias o recomendaciones de tratamiento (con mucha prudencia). Reactivos para la coloración de Gram: (Modificación de Hucker según Bartholomew) 1.

CRISTAL VIOLETA: Solución “A”: Cristal violeta (certificado) ............................................... 2 gramos Alcohol etílico al 95 % ....................................................... 20 ml Solución “B”: Oxalato de amonio ............................................................ 0.8 gramos Agua destilada ................................................................... 80 ml

Mezclar ambas soluciones, para preparar 100 ml. Guardar (en oscuridad) 24 horas antes de usarse y filtrar con papel filtro directamente al frasco de coloración. 2.

LUGOL DE GRAM: Cristales de yodo ............................................................... 1 gramo Yoduro de potasio .............................................................. 2 gramos 37

Agua destilada ................................................................... 300 ml Moler en un mortero el yodo y el yoduro. Agregar el agua destilada (en probeta) poco a poco. Continuar moliendo para disolver completamente; agregar el agua a manera de ir lavando el mortero, hacia una botella de vidrio oscuro (ámbar). Sólo dura una semana. 3. ALCOHOL-ACETONA (Decolorante): Mezclar volúmenes iguales de acetona pura (para análisis) y alcohol etílico al 95 %. 4.

SAFRANINA: Solución stock (concentrada): Safranina-0 (certificada) .................................................... 2.5 gramos Alcohol etílico al 95 %. ...................................................... 100 ml Solución de trabajo: Diluir 1:10 la solución stock (concentrada), así: Solución stock .................................................................... 10 ml Agua destilada ................................................................... 90 ml

Solución anticorrosiva para desinfectar bisturíes: Formaldehido (Formol) .................................................... 8 % Alcohol etílico .................................................................... 60-70 % Nitrito de sodio .................................................................. 0.2 % Para preparar un litro: En un balón aforado de 1,000 ml (1 litro), colocar 2 gramos de nitrito de sodio, luego agregar 700 ml de etanol absoluto y 200 ml de formaldehido al 40 %. Luego aforar con 100 ml de agua destilada. Los bisturíes con sus mangos deben mantenerse constantemente sumergidos en esta solución, dentro de un recipiente de acero inoxidable con tapadera.

38

Fig . 2 CLASES DE ASAS MICROBIOLÓGICAS Y SU USO ASAS PARA BACTERIOLOGÍA:

1.

Asa en argolla o anillo, no calibrada. Generalmente de almbre de nichrome. Sirve para siembra por estrías e inoculaciones en general.

2.

Asa recta o en hilo. Sirve para trasladar una sola colonia a medios de identificación, o subcultivo.

3.

Asa de platino en anillo. Calibrada para tomar 0.001 ml, para urocultivo.

ASAS PARA MICOLOGÍA Y MICOBACTERIAS:

4.

Asa espatulada, para manipular colonias duras y tomar muestras.

5.

Asa de almbre grueso en "L", para purificar colonias de hongos y procedimientos especiales.

6.

Aguja de disección con punta aguda, para purificar colonias pequeñas y distribuir las preparaciones de hongos en fresco.

39

Fig . 3 INOCULACIÓN DE MEDIOS SÓLIDOS POR ESTRÍAS 1. Con asa o hisopo estéril, estriar inóculo original de aproximadamente 0.5 cm, en el borde de la caja de Petri.

2. Flamear primera vez al terminar el inóculo original.

3. Segunda estría cruzada, debe tocar ligeramente el inóculo original.

4. Flamear segunda vez, al terminar la segunda estría.

5. Tercera estría. Debe tocar ligeramente la segunda estría, y cubrir toda la superficie libre del medio sin tocar al final el inóculo original.

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CAPÍTULO 3 COPROCULTIVO PROPÓSITO: Demostrar por medio de cultivo, la presencia de bacterias enteropatógenas, es decir que infectan el intestino penetrando o no su mucosa. Esto causa diarrea, dolor abdominal, fiebre y a veces la muerte. Las principales especies enteropatógenas que se buscan en el coprocultivo, en orden de importancia en Guatemala son: -

Shigella flexneri Salmonella typhi Shigella sonnei Salmonella enteritidis Shigella dysenteriae tipo 1

-

Shigella boydii Salmonella choleraesuis Arizona hinshawii Edwardsiella tarda Yersinia enterocolitica

(Shigella grupo B) (agente de fiebre tifoidea) (Shigella grupo D) (Shigella A-1 o “Bacilo de Shiga”, causa severa disentería epidémica) (Shigella grupo C, rara en Guatemala) (rara) (muy rara) (muy rara)

Las bacterias de la familia Enterobacteriaceae, normalmente habitan en el intestino humano, por lo que se conocen comúnmente como “enterobacterias”. Forman aproximadamente el uno por ciento de la microbiota fecal, el resto son bacterias anaerobias. Por esta razón es muy importante que el laboratorio esté en capacidad de aislar, diferenciar e identificar correctamente los enteropatógenos de la lista anterior. MUESTRA: Para efectuar un coprocultivo pueden inocularse las siguientes muestras: -

heces frescas (la mejor muestra) hisopo rectal (cuando no se obtienen heces)

41

-

material obtenido por proctoscopía biopsia de mucosa intestinal

Las muestras deben tomarse antes de iniciar tratamiento con antibióticos. Las heces deberán procesarse lo más pronto posible, de preferencia antes de 2-3 horas de ser emitidas; no es necesario que el paciente esté en ayunas. El hisopo rectal es una buena toma de muestra (en caso de no ser posible obtener muestra de heces reciente) porque arranca las bacterias que se encuentran dentro de la mucosa. En los adultos, introducir con cuidado en el ano un hisopo estéril 4 centímetros, dar 3 vueltas a la derecha y 3 vueltas a la izquierda. En los niños, introducir el hisopo 2.5 centímetros y dar la misma cantidad de vueltas. En el adulto es más fácil tomar el hisopo rectal, con el paciente acostado de lado y él mismo separándose los glúteos. Los niños deben acostarse boca arriba y con la mano izquierda tomar ambos pies, presionar a manera de flexionar las rodillas hacia abajo y luego introducir el hisopo. Cuando las heces, que se encuentran a 37° C dentro del intestino, son colectadas y permanecen a temperatura ambiente (aproximadamente a 20° C), el pH baja considerablemente (acidez) y hace que las bacterias especialmente Shigella spp. pierdan su viabilidad (capacidad de reproducirse en cultivo). Por esta razón si la muestra de heces no se procesa con la velocidad ya indicada, debe colocarse en un medio de transporte bufferado que evite los cambios bruscos de pH. Para este propósito colocar con hisopo estéril una porción anormal de las heces (con moco, sangre o pus) aproximadamente del tamaño del hisopo bien cargado en tubos o viales con 3 ml del siguiente medio de transporte: glicerol-salino bufferado, (especialmente para Shigella), o caldo Hajna GN (Gram-negativo). Probablemente el mejor medio de transporte para enterobacterias sea Carry-Blair. El caldo GN es de enriquecimiento, por lo que debe incubarse a 36°C por aproximadamente 18 horas antes de sembrarse, pero puede usarse como transporte alternativo en ausencia de glicerol-salino bufferado. Glicerol salino bufferado Para transporte de coprocultivos Cloruro de sodio ...................................................................... 4.2 gramos Fosfato dipotásico (anhidro) ..................................................3.1 gramos Fosfato monopotásico (anhidro) ...........................................1.0 gramos Rojo fenol .................................................................................. 0.003 gramos Agua destilada .........................................................................700 ml Glicerina ...................................................................................300 ml 42

El pH final debe ser 7.2. Medir 3 ml en viales o tubos con tapón de rosca y luego autoclavear a 121°C por 10 a 15 minutos. Descartar si el medio se acidifica y vira a color amarillo. Otros caldos de enriquecimiento como Selenito-F o Tetrationato con yodo no deben usarse excepto en encuestas especiales para buscar Salmonella spp., ya que su uso retrasa 24 horas el resultado del coprocultivo, lo que disminuye considerablemente su utilidad clínica. La coloración de Gram de heces nunca debe practicarse por carecer de significado clínico, excepto en los siguientes casos: colitis pseudomembranosa causada por Staphylococcus aureus donde predominan en el frote cocos gram-positivo, o en caso de candidosis intestinal, donde predominan en el Gram las levaduras (gram-positivo). PROCEDIMIENTO: Debe conocerse la edad del paciente, anotar si es niño menor de 6 meses. Para efectuar el coprocultivo deben usarse medios que sean selectivos (contienen inhibidores, por lo que sólo permiten el crecimiento de bacilos gram-negativo) y diferenciales (contienen lactosa e indicadores de pH que viran cuando se produce ácido, lo que hace cambiar el color de las colonias y así las diferencia). Algunos de estos medios contienen sales de hierro que precipitan en forma de sulfuro ferroso de color negro intenso si las bacterias producen ácido sulfhídrico. El coprocultivo debe efectuarse en dos medios selectivos/diferenciales diferentes, de preferencia uno más inhibidor que otro. Se recomienda usar rutinariamente agar MacConkey y agar XLD o agar SS (Salmonella y Shigella). En caso de heces con moco y sangre (disentería) debe incluirse adicionalmente el medio de Hektoen, lo mismo que para material obtenido por biopsia intestinal y proctoscopía. El color original y los virajes producidos por el crecimiento bacteriano, en estos tres medios que contienen el azúcar lactosa (como agente diferencial) es el siguiente:

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MEDIO

COLOR ANTES DE INOCULAR

COLONIAS LACTOSAPOSITIVO

COLONIAS LACTOSANEGATIVO

COLONIAS CON ÁCIDO SULFHÍDRICO

MacConkey

rosado

rojo (rosado)

incoloras

no cambian

SS

rosado ligeramente amarillento

rojo

incoloras

negro

Hektoen

verde claro

anaranjadosalmón

verde azuladas

negro

XLD

rojo

amarillas

rojas

negro

Efectúe el coprocultivo así: 1-

Inocular una porción anormal de heces (con moco, sangre o pus) o de muestra similar, directamente en una caja de MacConkey y una caja de SS. El inóculo se coloca con asa en anillo (flameada y fría) o con hisopo en las cajas de ambos medios. Inocular sólo 1/2 cm en un extremo en el MacConkey y 1 cm en el SS. El Hektoen se inocula igual que el MacConkey.

2-

Diseminar el inóculo utilizando dos asas en anillo. Flamear una de las asas mientras la otra se enfría (ver figura 3, pág. 40).

3-

Ya diseminadas de esta manera las muestras en la superficie de las cajas, incubar a 36°C por 18 a 24 horas, en la incubadora, con esa temperatura controlada diariamente (ver figura 4, pág. 45).

44

Fig. 4 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA COPROCULTIVO

Muestras:

Heces frescas Hisopo rectal Sedimento de enema salino INOCULAR Rutina

MacConkey

Material de proctoscopía, biospia intestinal

XLD ó SS

Medios:

Diseminar por estrías, incubar a 36o C

Seleccionar colonias según el caso, trasladar a TSI/LIA/urea 45

Opcional

Hektoen

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: 1-

Después de incubadas, observar cuidadosamente las dos o tres cajas de cada paciente simultáneamente. Debe contarse con una luz de lámpara que ilumine las cajas por detrás y observarlas utilizando una lupa corriente. Marcar por detrás con un círculo de crayón graso cada tipo diferente de colonias sospechosas así: Primero escoger en el MacConkey una colonia por cada tipo de colonias lactosa-negativo (incoloras), empezando por las colonias más pequeñas (más o menos 1 mm de diámetro). Si el paciente es un niño menor de un año, se marcará adicionalmente en el MacConkey una colonia típica de Escherichia coli (roja, brillante y de bordes lisos pero no mucosa), de la parte de la caja donde las colonias están más separadas y ponerle con crayón graso por detrás “C” al lado. Examinar el SS de la misma forma. En este medio el crecimiento será más escaso pues es más inhibidor. Marcar por detrás una colonia por cada tipo de colonias lactosa-negativo (incoloras) empezando por las más pequeñas, e incluyendo una colonia con centro negro (ácido sulfhídrico) si las hay. Si se inoculó Hektoen, marcar una colonia pequeña verde azulado (lactosa-negativo).

CR

AY Ó

N

GR

AS

O

Fig. 5 OBSERVACIÓN Y SEÑALAMIENTO DE COLONIAS SOSPECHOSAS

Marcar colonias sospechosas por detrás de la caja de Petri

46

2-

El laboratorio debe contar con un microscopio estereoscópico para hacer los sub-cultivos con asa en aguja o recta así: Colocar las cajas con las colonias previamente marcadas bajo el microscopio estereoscópico y enfocar. Usar un par de asas en hilo bien rectas, flameadas y frías, acostúmbrese a usarlas según se indica a continuación: apoyándose en el borde del microscopio con los dedos meñique y anular de la mano derecha (izquierda si es zurdo), tome el asa recta a manera de lápiz y bájela lentamente hasta que aparezca en el campo del microscopio y sólo toque la superficie de la colonia seleccionada, con cuidado de no pincharla o pasar tocando otras colonias cercanas. Con cuidado de no contaminar la punta del asa que ya tocó la colonia sospechosa, destape un tubo (13X100) de TSI (medio rojo) con el dedo meñique de la mano derecha, flamee bien la boca del tubo y luego pinche el medio en el centro y hasta el fondo a manera de tocar exactamente el centro del fondo del tubo, retire el asa sin salir del tubo de TSI y luego haga un estriado rápido y parejo en la superficie inclinada. Sin flamear y con la misma asa, inocule el medio LIA (morado) pinchando esta vez tres veces y luego estriar la superficie y con la misma asa sin flamear, haga una estría en un tubo de agar urea de Christensen (mejor tomar una nueva colonia de igual morfología). Si no cuenta con microscopio estereoscópico proceda así: Tome la caja ya marcada de MacConkey, XLD o SS Hektoen entre los dedos pulgar, índice y medio de la mano izquierda (retraiga los dedos anular y meñique). Colóquela verticalmente a manera que la luz pase por detrás a través de la caja, tome su asa recta agarrada como un lápiz con la mano derecha, apoye firmemente los dedos anular y meñique en la palma de su mano izquierda que sostiene la caja. Acerque cuidadosamente el asa y toque con mucho cuidado la colonia seleccionada sin pincharla ni tocar otras colonias cercanas. (ver figura 6, pág. 48). Inocule simultáneamente una pareja de TSI/LIA y urea agar según ya se describió. Estos tres medios en tubo deben tener 2.5 cm de fondo y 3.8 cm de superficie inclinada para que funcionen correctamente, Rotular ambos tubos y colocarlos por pareja en gradillas. Si el MacConkey sólo presenta colonias lactosa-positivo (rojas) descártelo. Lo mismo se hará con el Hektoen que sólo presenta colonias lactosa-positivo (anaranjado salmón), o el XLD que sólo presenta colonias amarillas. Reincube la caja de SS otras 24 horas a temperatura ambiente para investigar la presencia de Yersinia enterocolitica.

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Fig. 6 TÉCNICA PARA TOMAR INÓCULO DE COLONIAS INDIVIDUALES

3-

Incube a 36°C la gradilla con las parejas TSI/ LIA y urea, de manera que no quede duda de qué tubo de TSI corresponde a su LIA. Deben permanecer en incubación de 18 a 24 horas. Los tapones de rosca deben quedar ligeramente flojos para permitir la entrada de oxígeno. Las colonias marcadas “g” (E. coli, niños menores de un año) pueden pasar sólo a TSI, para ahorrar LIA y urea.

4-

Examine las reacciones coloreadas en el TSI/LIA simultáneamente; tome ambos tubos juntos hacia abajo con la mano derecha y obsérvelos contra la luz. Interprete resultados de acuerdo a la siguiente tabla. 48

Reacción ya ya Reacción incubada incubada A=ácido K=alcalino

R=rojo

N=neutro

Gas (g) (-a+++)

Medio sin Medio sin inocular inocular

ácido sulfhídrico (h) (-a+++)

TSI (rojo)

Amarillo

rojo

no aplicable

no aplicable

burbujas o rupturas

negro

LIA (morado)

Amarillo

violeta

Superficie roja

antre amarillo y morado

burbujas o rupturas

negro

Urea de Christensen: (amarillo ligeramente anaranjado), positivo = rosado fuerte; negativo = no hay cambio

Para expresar en clave y abreviadamente las reacciones en TSI o LIA use las abreviaturas A, K, R, N, -, +, g, h, según la tabla anterior en este orden: superficie/ fondo, gas, ácido sulfhídrico. Por ejemplo las reacciones de Escherichia coli en TSI; LIA se expresan así: TSI;LIA = A/A, g+; h-/ K/K, g+, h- o TSI;LIA = K/A, g-; h-/K/N, g-, hLas reacciones coloreadas en TSI/LIA, son muy útiles para la identificación de los enterobacterias, por lo que en el laboratorio debe contarse con una tabla actualizada de reacciones en TSI/LIA y pruebas bioquímicas en general. Reacciones a las cuales debe ponerse especial atención: Bacteria

TSI

LIA

UREA

Shigella spp.

K/A,g-,h-

K/A (N),g-,h-

-

Salmonella sp.

K/A,g+,h++

K/K,g+,h+

-

Yersinia enterocolitica

A/A,g-,h-

A (K)/A,g-,h-

+

49

5-

Los tubos de TSI, marcados “g” y que corresponden a coprocultivos de niños menores de un año deben aglutinarse para investigar Escherichia coli enteropatógena (“pools” A, B y C) (Según Dr. Myron Levine, U. de Maryland VI Congreso C.A. de Microbiología, comunicacion personal). El informe final deberá reportarse así: “Se aisló Escherichia coli enteropatógena del grupo ___ ” . Debe hacerse notar que aunque el valor cIínico de esta prueba ha sido puesto en duda, ya que también existen E. coli invasivas y productoras de toxinas que no se investigan, actualmente debe realizarse la aglutinación para demostrar la presencia de serotipos clásicos enteropatógenos en los niños pequeños. Inocule una asada pequeña en caldo tripticasa soya o caldo BHI (infusión de cerebro y corazón de buey), proceda efectuar la prueba de susceptibilidad antimicrobiana según el método de Bauer-Kirby, descrito más adelante. Si no se observa ninguna aglutinación, ni se aisla Shigella o Salmonella apunte en el libro de trabajo la clave N-SSE, y el informe final debe redactarse así: “Negativo para Shigella, Salmonella y Escherichia coli enteropatógena”. (Sólo para niños menores de un año). Las claves sugeridas para registro en los libros de trabajo evitan escritura innecesaria, facilitan y aceleran el trabajo.

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REACCIONES DE VARIAS ENTEROBACTERIAS EN TSI Y LIA

Enterobacteria

LIA

TSI

UREA

Escherichia coli

A(K)/A, g+ (-), h-

K/KóN, g-ó+, h-

-

Shigella spp.*

K/A, g-, h-

K/A, g-, h-

-

Salmonella typhi*

K/A, g-, h++- (poco)

K/K, g-, h-(+)

-

Salmonella spp.*

K/A, g-, h+++(-)

K/KóN, g-, h+ (-)

-

Arizona hinshawii*

K(A)/A, g+, h+++

K/KóN, g-, h+ (-)

-

Yersinia enterocolitica*

A/A, g-, h-

A(K)/A, g-, h-

+

Citrobacter sp.

K(A)/A, g+, h+++(-)

K/A, g-ó+, h+ó-

Edwarsiella tarda

K/A, g+, h+++ (indol +)

K/K, g-ó+, h+

Klebsiella sp.

A/A, g++, h(mucosidad ++)

KóN/KóN, g+ó, h-

Enterobacter sp.

A/A, g++, h-

KóN/KóN, g+(-), h-

-(+)

Serratia sp.

KóA/A, g-, h-

KóN/KóN, g-, h-

-ó+

Proteus vulgaris

A(K)/A, g+, h+++

R/A, g-, h-(+)

+

Proteus mirabilis

K(A)/A, g+, h+++

R/A, g-, h-(+)

+

Morganella morganii (antes Proteus morganii)

K/A, g-(+), h-

KóR/A, g-, h-

+

Providencia sp.

K/A, g+ ó-, h

R/A, g-, h-

-

+ó-

+

Nota Importante: Solamente reportar como coprocultivo positivo las enterobacterias marcadas con * el resto es microbiota normal y no debe reportarse nunca. Reacciones menos probables entre paréntesis. Todas las reacciones con reacción roja (R) en la superficie de LIA, presuntivamente son Proteus sp., Morganella sp. o Providencia sp., no tienen importancia clínica en coprocultivos y no deben tomarse en cuenta. Esta tabla es sólo una guía, que debe actualizarse constantemente.

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DIFERENCIACIÓN DE LAS ESPECIES DEL GÉNERO SHIGELLA: TSI y LIA = K/A,g-,hOler el medio de TSI sin tocarlo con nariz o boca, el olor a “semen” es característico de Shigella spp., especialmente de Shigella grupo B (Shigella flexneri), la más frecuente en Guatemala. El fondo de los tubos de TSI y LIA no presentan gas, ni ácido sulfhídrico y tienen un color “amarillo canario”. La reacción K (alcalino) de la superficie del TSI es roja de un tono fresa no muy intenso. Aglutinar el crecimiento del TSI sospechoso, o del LIA así: Utilice la tapadera limpia y seca de una caja de Petri, ráyela con crayón graso por detrás a manera de hacer rayas paralelas y perpendiculares que formen cuadritos de aproximadamente un centímetro cuadrado. Coloque todas sus parejas TSI/LIA con reacción sospechosa de Shigella, en orden numérico en una gradilla. En la misma gradilla pero en otro extremo ordene en pares los TSI/LIA con reacción sospechosa de Salmonella y los TSI marcados “C” (Escherichia coli) para proceder a aglutinar. Por cada pareja sospechosa de Shigella (K/A,g-,h-; K/A,g-,h-) coloque en el centro de un cuadrito una gotita de antisuero “Shigella grupo B” (Shigella flexneri). Aglutine tomando una porción pequeña del crecimiento en TSI (puede ser también del LIA) con asa en anillo estéril; coloque el crecimiento sobre la caja (mueva el asa en óvalo pequeño sin tocar la gota), luego suspenda bien el crecimiento en la gota a manera de obtener una suspensión ligeramente lechosa. Observe inmediatamente después de inclinar la tapadera de la caja hacia adelante y hacia atrás la aparición de aglutinación franca y obvia. Sólo tomar en cuenta aglutinaciones que ocurren antes de 1 minuto después de mezclar. Si aglutina reportar Shigella B en el libro de trabajo. Si no aglutina siga aglutinando pero siempre en este orden para ahorrarse trabajo y anti-sueros, que son muy caros: 1234-

Shigella flexneri, grupo B Shigella sonnei, grupo D

- La más frecuente en Guatemala - La segunda más frecuente en Guatemala Shigella dysenteriae, grupo A - Rara pero grave y epidémica, debe darse alerta al médico. Shigella boydii, grupo C - Muy rara vez se aisla en el país.

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DIFERENCIACIÓN DE LAS ESPECIES DEL GÉNERO SALMONELLA: La taxonomía moderna del género Salmonella ha cambiado, sin embargo para fines prácticos de diagnóstico y de investigación, se recomienda usar la clasificación antigua simplificada así: -

Salmonella typhi:

causa fiebre tifoidea con diseminación generalizada de la bacteria (puede aislarse de heces, médula ósea, sangre, orina, etc).

-

Salmonella enteritidis:

causa infección intestinal y puede diseminarse a la sangre.

-

Salmonella choleraesuis:

rara, causa infección en animales y rara vez en el hombre.

Salmonella typhi presenta en TSI dos características muy importantes para su identificación, las que se complementan con LIA, citrato de Simmons y aglutinación: 12-

345-

No produce gas. Produce poco ácido sulfhídrico (una pequeña mancha negra, a veces difícil de apreciarse en el área del tubo donde empieza el inclinado). Generalmente, el LIA es todo morado (K/K,g-,h-(+) Es citrato-negativo. Aglutina con el antisuero anti-antígeno Vi.

El agar inclinado de citrato de Simmons es un medio verde que se prepara inclinado con las mismas medidas del TSI/LIA. Debe inocularse con una asada del crecimiento de los tubos TSI o LIA sospechosos de Salmonella, luego se incuba a 36°C de 18 a 24 horas y los cambios de color se interpretan así: verde = negativo azul = positivo

53

Diferencie presuntivamente las especies del género Salmonella con estas tres pruebas sencillas:

Prueba Especie

Gas (TSI)

Ácido sulhídrico (TSI)

Citrato

Salmonella typhi

-

+ débil

-

Salmonella enteritidis

+

+++

+

Salmonella choleraesuis

+

+ (sólo 60%)

(+)

(+) = positivo lento, más de 3 días de incubación. En resumen, para diferenciar e identificar Salmonella siga estos pasos: 1-

Identifique las reacciones sospechosas en TSI/LIA de Salmonella typhi y Salmonella spp. según la tabla. Es muy importante notar la reacción toda morado-violeta en el LIA (K/K), es decir el medio no cambia de color lo cual es típico del género Salmonella. Anote la cantidad de ácido sulfhídrico en el TSI.

2-

Ordene sus TSI/LIA/urea en la gradilla de tubos para aglutinación y, según ya se explicó, aglutine todos los TSI con una gota de antisuero comercial polivalente de Salmonella.

3-

Si la reacción es positiva, inocule un tubo de citrato de Simmons e incube, simultáneamente inocule la prueba de susceptibilidad antimicrobiana.

4-

Si el laboratorio cuenta con el set de antisueros de grupo de Salmonella, aglutine sólo los tubos con aglutinación franca en el antisuero polivalente a Salmonella en los antisueros de grupo. Algunos grupos frecuentes en Guatemala son B, G, y C1. Salmonella typhi pertenece al grupo D, por lo que aglutinación positiva a este grupo, además de las otras pruebas sencillas confirma esta especie. Si se investiga el grupo, éste debe informarse, por ejemplo: Se aisló Salmonella enteritidis del grupo B. Idealmente el laboratorio podrá confirmar con más seguridad y mayor 54

trabajo las especies de enterobacterias con sistemas de múltiples pruebas bioquímicas miniaturizadas, por ejemplo API, según las condiciones de trabajo. INFORME: El informe del coprocultivo debe constar de 3 partes: 1-

Título: coprocultivo, cultivo de biopsia colónica, etc. De preferencia debe escribirse con mayúsculas y centrado.

2-

Resultado: Para ahorrar tiempo y trabajo, debe apuntarse el resultado en clave, en el libro de trabajo y luego la secretaria del laboratorio lo deberá transcribir con el texto correcto, según la próxima tabla. Incluir el grupo de Salmonella si se efectuó. En el caso de Shigella no es necesario poner el grupo, sólo la especie, par ejemplo: Se aisló Shigella flexneri.

3-

Prueba de susceptibilidad antimicrobiana (S/A): con los antibióticos de utilidad clínica para tratar infecciones por enterobacterias. Utilice la siguiente tabla para registrar e informar el resultado del coprocultivo:

RESULTADO

CLAVE en libro de trabajo (técnico)

TEXTO (Secretaria)

Coprocultivo negativo de adulto

NP

No se aislan enteropatógenos, desarrollan bacterias de la microbiota normal

Coprocultivo negativo de niño menor de un año

N-SSE

Negativo para Shigella, Salmonella y Escherichia coli enteropatógena

Coprocultivo positivo

Shigella A

Se aisló Shigella dysenteriae. S/A

Shigella B

Se aisló Shigella flexneri. S/A

Shigella C

Se aisló Shigella boydii. S/A

Shigella D

Se aisló Shigella sonnei. S/A

Salmonella typhi

Se aisló Salmonella typhi. S/A

Salmonella grupo ____

Se aisló Salmonella enteritidis del grupo ____. S/A

Salmonella choleraesuis

Se aisló Salmonella choleraesuis. S/A

Arizona

Se aisló Arizona hinshawii. S/A

Yersinia

Se aisló Yersinia enterocolitica. S/A

S/A = susceptibilidad antimicrobiana.

55

PROCEDIMIENTO PARA CULTIVO DE CUERDAS ENCAPSULADAS (ENTEROTEST) PARA COLECCIÓN DE MUESTRAS DUODENALES El objetivo de este procedimiento es obtener una muestra de la bilis del paciente para cultivar específicamente Salmonella typhi; también puede usarse para examinar en fresco su contenido para trofozoitos de Giardia lamblia, huevos de Clonorchis sinensis, o larvas de Strongyloides stercoralis. El pH de la parte distal de la cuerda debe ser alcalino, si llegó al duodeno. El procedimiento consiste en dar al paciente (en ayunas) una cuerda de nylon absorbente (de 90 a 140 cm para adulto y 67 cm para niños) dentro de una cápsula, la cual debe tragarse con agua. Un extremo de la cuerda se pega por fuera a la cara del paciente con cinta adhesiva y el otro distal debe llegar hasta el duodeno, donde permanece cuatro horas para empaparse de bilis. El paciente sólo debe beber agua, mínimo un vaso por hora. Procedimiento: 1-

El médico debe extraer (usar guantes) la cuerda de la boca mediante una tracción rápida pero suave. Luego cortar con tijeras estériles la punta de la cuerda (amarilla por la bilis), a manera de que caiga asépticamente en un tubo o botellita con caldo tetrationato.

2-

El caldo tetrationato sirve para enriquecer la muestra para el aislamiento de Salmonella. Agitar e incubar 24 horas a 36° C.

3-

Después de la incubación, inocular por estrías una asada del caldo tetrationato (agitado) en MacConkey y SS. Incubar 18 a 24 horas aeróbicamente a 36° C.

4-

Trasladar las colonias lactosa-negativo (incoloras) a TSI, LIA, urea y citrato, incubar 18 a 24 horas a 36° C.

5-

Identificar Salmonella typhi por medio de sus reacciones en TSI, LIA, urea y citrato. Aglutinar con anti-suero polivalente de Salmonella, antígeno Vi y grupo D, según ya se explicó.

Medio de cultivo: Preparar el caldo de tetrationato adicionado con yodo y verde brillante según las instrucciones en el frasco de la base en polvo, así: 56

Suspender 17.5 gramos de la base en polvo en 500 ml de agua destilada, calentar hasta que hierva. Dejar enfriar a menos de 45° C y luego agregar: 10 ml de solución de yodo (yodo: 6 g, yoduro de potasio: 5 g, agua destilada: 20 ml.) y 5 ml de solución acuosa de verde brillante al 0.1 %. Medir 10 ml en frasquitos estériles (de los que vienen con el medio Thayer Martin) o tubos estériles con tapón de rosca. El medio debe quedar verde con precipitado blanco.

LA EPIDEMIOLOGÍA Y ETIOLOGÍA DE LA DIARREA Adaptado de:

World Health Organization. 1992. Control of Diarrheal Diseases Program. Readings on Diarrhea, Student Manual, Unit I The Epidemiology and Etiology of Diarrhea. Geneva. Usualmente se define a la diarrea como la eliminación de tres o más evacuaciones intestinales líquidas o blandas en un período de 24 horas. Existen tres tipos de diarrea: Diarrea aguda, líquida Disentería Diarrea persistente El problema que representan las enfermedades diarréicas La diarrea es una de las causas principales de enfermedad y muerte en los niños menores de 5 años de los países en desarrollo, en donde ocurren aproximadamente 1.3 mil millones de episodios y 3.2 millones de muertes al año por diarrea. En promedio, estos niños padecen 3.3 episodios de diarrea por año, pero en algunas áreas, el promedio pasa de nueve episodios por año. Es común que donde los episodios son frecuentes, los niños pasen el 15% de sus vidas con diarrea. Dentro de este grupo de edad, los niños menores de dos años, son los que sufren la mayor morbilidad y mortalidad. Se estima que aproximadamente 80-90% de las muertes por diarrea ocurre en niños menores de dos años. La causa principal de muertes por diarrea aguda es la deshidratación, la cual resulta por la pérdida de líquidos y electrolitos. Otras causas importantes de muerte son disentería, desnutrición y otras infecciones serias, como neumonía.

57

Disentería Esta forma de diarrea se caracteriza por la presencia de sangre visible en las heces fecales y frecuentemente presencia de moco. Sus efectos importantes incluyen anorexia, pérdida de peso rápida y daños a la mucosa intestinal causados por la bacteria invasora. La mayoría de los casos de disentería aguda en niños, son causados por Shigella spp. Otras causas son Campylobacter jejuni y menos frecuentemente Escherichia coli entero invasora (EIEC) y Salmonella. El protozoo Entamoeba histolytica, puede causar disentería seria en adultos jóvenes, pero es una causa muy rara en niños. En alrededor de 90% de los casos de infección intestinal por Entamoeba histolytica, las cepas no son virulentas. Los pacientes con disentería causada por Shigella dysenteriae tipo 1 (Bacilo de Shiga), están a menudo clínicamente muy enfermos. Este síndrome clínico casi siempre incluye fiebre alta, síntomas tóxicos y cólicos abdominales intensos y tenesmo. Ocasionalmente se registran convulsiones. A veces se acompaña de complicaciones graves, como el síndrome hemolítico urémico. Pueden presentarse epidemias de gran magnitud causadas por este enteropatógeno. Esto ocurrió en Centroamérica en los años 1969 y 1970. La terapia antimicrobiana apropiada aminora significativamente la gravedad y duración de la disentería y de la fiebre, así como la excreción del patógeno. EPIDEMIOLOGÍA Transmisión de los agentes que causan diarrea Los agentes infecciosos que causan diarrea generalmente se diseminan por la ruta fecal-oral, lo cual incluye la ingestión de agua o alimentos contaminados fecalmente, y el contacto directo con heces fecales. Varios comportamientos específicos de las personas contribuyen a la propagación de los enteropatógenos y por consiguiente incrementan el riesgo de sufrir diarrea. Estos incluyen: -

Falta de lactancia materna exclusiva durante los primeros 4-6 meses de vida. 58

-

-

Usar biberones para alimentar a los niños. Guardar alimentos a temperatura ambiente. Beber agua contaminada con bacterias fecales. No lavarse las manos después de defecar, después de desechar las heces de los niños o de limpiar los pañales y antes de preparar o servir alimentos. No desechar higiénicamente las heces (incluyendo las de los lactantes).

Epidemias En las áreas tropicales, la diarrea por rotavirus ocurre todo el año, aumenta su frecuencia durante los meses secos y más fríos, mientras que las diarreas bacterianas aumentan durante la estación lluviosa y más cálida. La incidencia de diarrea persistente sigue el mismo patrón estacional de la diarrea aguda líquida. Hay dos enteropatógenos Vibrio cholerae y Shigella dysenteriae tipo 1 que provocan grandes epidemias en las que la morbilidad y mortalidad en todos los grupos de edad son altas. Desde 1961, el cólera causado por el biotipo Eltor de V. cholerae 01 se ha diseminado a países de Asia, el Mediterráneo Oriental, Africa, y a algunos países de Europa. Desde 1991, ha causado epidemias en prácticamente todos los países de América Latina y casos sin diseminación secundaria en los Estados Unidos. Durante el mismo período de tiempo Shigella dysenteriae tipo 1 ha ocasionado grandes epidemias de disentería grave en Centro América (69-70) y, más recientemente, en Africa Central y Sur de Asia. ETIOLOGÍA Enteropatógenos importantes: Virus: Rotavirus Bacterias: Escherichia coli enterotoxigénica Shigella spp. Campylobacter jejuni Vibrio cholerae 01 Salmonella spp. Protozoos: Cryptosporidium parvum

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Patógenos frecuentemente identificados en niños con diarrea aguda, atendidos en centros de tratamiento, en países en desarrollo Patógeno

Porcentaje de casos

Antimicrobianos recomendados en base clínica*

Virus

Rotavirus

15-25

Ninguno***

Bacterias

Escherichia coli enterotoxigénica

10-20

Ninguno

Shigella

5-15

Trimetoprimsulfametoxazol, Ácido nalidíxico

Campylobacter jejuni

10-15

Ninguno

Vibrio cholerae 01

5-10**

Tetraciclina, Doxiciclina, otros

Salmonella (no tifoidea)

1-5

Ninguno***

Escherichia coli enteropatógena

1-5

Ninguno

Cryptosporidium parvum

5-15

Ninguno***

20-30

Ninguno***

Protozoos Ningún patógeno aislado

* ** ***

Para cepas sensibles En áreas endémicas; puede ser más alto durante epidemias Ningún antimicrobiano efectivo

60

Otros patógenos, cuya importancia como causa de diarrea aguda en niños en los países en desarrollo es mínima, o no está bien definida. Estos incluyen: Virus: agente Norwalk adenovirus entéricos Bacterias: Aeromonas hydrophila Escherichia coli enteroagregativa Escherichia coli enteroinvasora Escherichia coli enterohemorrágica Plesiomonas shigelloides Vibrio cholerae que no es 01 Vibrio parahaemolyticus Yersinia enterocolitica Protozoos: Giardia lamblia Entamoeba histolytica Isospora belli Cyclospora cayetanensis Mecanismos Patogénicos de los Agentes Etiológicos de Diarrea Los enteropatógenos causan diarrea por varios mecanismos, algunos de los cuales se revisan a continuación. Virus Los rotavirus se replican dentro de las células epiteliales maduras que cubren la porción superior de las vellosidades intestinales, causando destrucción celular y acortamiento de las vellosidades. Bacterias Adherencia a la mucosa Producción de toxinas que causan secreción intestinal Invasión de la mucosa Protozoos Adherencia a la mucosa Invasión de la mucosa

61

Shigella Shigella es la causa más importante de disentería, encontrándose en alrededor de 60% de todos los episodios y en prácticamente en todos los episodios graves de esta forma de diarrea; también pueden causar diarrea líquida. S. flexneri es la especie más prevalente en países en desarrollo, sin embargo, S. dysenteriae tipo 1 que causa epidemias regionales es responsable de la disentería más grave. La destrucción tisular y posiblemente la diarrea líquida son producidas en parte por la extremadamente potente toxina de Shiga, que es producida en cantidades relativamente grandes por S. dysenteriae tipo 1. Shigella se disemina principalmente por la transmisión de persona a persona. El tratamiento efectivo contra Shigella spp. se hace con antimicrobianos a los cuales son susceptibles, pero es común la resistencia antimicrobiana. Puede haber resistencia a múltiples antimicrobianos especialmente en las cepas de S. dysenteriae tipo 1. Los antimicrobianos más útiles son trimetoprim-sulfametoxazol y ácido nalidíxico; en algunas áreas también es efectiva la ampicilina.

62

CAPÍTULO 4 COPROCULTIVO PARA CÓLERA PROPÓSITO: Demostrar por medio de cultivo la presencia de Vibrio cholerae 01, la bacteria causante del cólera. Esta bacteria se adquiere por ingestión de bebidas o alimentos contaminados. Llega al intestino delgado, donde se adhiere a la mucosa y, debido a la producción de una potente toxina, causa la salida masiva de agua y electrolitos. En un bajo porcentaje de los pacientes infectados, se produce el colera gravis, la forma clínica del cólera agudo, con muy abundante diarrea acuosa (semejante a “agua de arroz”) y vómitos. Esto provoca en el paciente deshidratación severa que puede causar la muerte, si no se instituye tratamiento de rehidratación y antibióticos. El cólera ha sido endémico en la India y en otros países desde la más remota antigüedad. En 1961 se inició la séptima pandemia en Indonesia. En enero de 1991 apareció en Perú y a partir de allí se ha diseminado a varios países de Latinoamérica, donde ahora es una infección endémica, más frecuente durante la época lluviosa. Vibrio cholerae 01 (01 indica que pertenece al serogrupo 1 según su antígeno somático), se subdivide en tres serotipos: Inaba, Ogawa, y el serotipo Hikojima que aún no se ha detectado en Latinoamérica. Generalmente si la epidemia se inicia con el serotipo Inaba, después de algún tiempo se transforma en Ogawa, debido a cambio de antígenos. Esta clasificación sólo tiene interés epidemiológico. Existen dos biotipos de V. cholerae 01: eltor y clásico. En Latinoamérica, durante la presente pandemia, el biotipo presente es eltor, el cual se caracteriza por causar epidemias con pocos casos graves (aproximadamente 2%) y muchos casos leves o asintomáticos; también sobrevive más tiempo en el medio ambiente, y es más resistente a los agentes químicos. El tratamiento principal del cólera es evitar la muerte por deshidratación, por medio del pronto reemplazo de agua y electrolitos. Debe hacerse por vía oral y si es necesario por vía intravenosa. El tratamiento con antibióticos ayuda a la recuperación, pues elimina los vibrios y acorta la diarrea, además evita portadores de la bacteria. En adultos se recomienda la tetraciclina, y en niños el trimetoprimsulfametoxazol (cotrimoxazol). En el caso de mujeres embarazadas se indica la furazolidona. 63

El diagnóstico definitivo de cólera se establece sólo por la demostración de V. cholerae 01 por medio de cultivo. El frote Gram directo de las heces puede ser indicativo de cólera, pero no se considera un procedimiento diagnóstico exacto. MUESTRA: Las muestras adecuadas para efectuar el diagnóstico bacteriológico de el cólera son: heces diarréicas (principalmente con apariencia de “agua de arroz”), hisopo rectal o vómitos. Deben recolectarse de preferencia dentro de las primeras 24 horas de la enfermedad y previo a la administración de antibióticos. Si las muestras de heces frescas van a ser procesadas en un tiempo adecuado (antes de dos horas), deben recolectarse en un recipiente de vidrio o plástico bien limpio, de preferencia estéril, y enviarse inmediatamente al laboratorio. En caso contrario deben inocularse dos hisopos con material fecal en el medio de transporte Cary-Blair, que debe enviarse al laboratorio de referencia sin necesidad de refrigeración. En el medio hospitalario no es necesario usar inútilmente el medio de transporte Cary-Blair, ya que la muestra de heces frescas debe remitirse al laboratorio para su cultivo directo inmediato. PROCEDIMIENTO: Existen muchas variantes en la marcha bacteriológica a seguir para el aislamiento e identificación de Vibrio cholerae 01. La marcha simplificada propuesta es, en la experiencia del autor, efectiva y sencilla (ver figura 7, pág. 67). V. cholerae 01 puede aislarse directamente de las heces, pero se logran resultados mucho mejores si previamente se hace un enriquecimiento en el caldo selectivo alcalino llamado agua pepto nada alcalina o APA. En este caldo el agente etiológico del cólera prolifera en la superficie, pues resiste la alcalinidad extrema del medio (pH 9.0 a 9.2), y otras bacterias de la microbiota fecal se destruyen, por lo que se obtienen cultivos casi puros. 1.

Inocular masivamente un tubo con 5 ml de agua peptonada alcalina, con un hisopo estéril bien cargado de heces o vómito. Sacar el hisopo y agitar muy bien el tubo, luego incubar verticalmente y con el tapón ligeramente suelto, solamente por 5 a 8 horas a 36° C.

2.

Si se trata de heces, inocular directamente cajas de agar MacConkey, XLD o SS e idealmente Hektoen para el aislamiento de Shigella y Salmonella, ya que las infecciones intestinales causadas por estos dos géneros, clínicamente pueden semejar cólera. 64

3.

Después del tiempo crítico de incubación del APA, retirar el tubo cuidadosamente de la incubadora y colocarlo verticalmente en una gradilla o soporte. Destaparlo despacio, sin que se agite, y con el asa en anillo, tomar verticalmente una asada de la superficie del caldo (no más de 5 mm de profundidad). Inocular una caja de agar TCBS y una de agar sangre de carnero al 5%. Incubar aeróbicamente 18 a 24 horas a 36° C.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: El agar TCBS (tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa) contiene elevadas concentraciones de tiosulfato de sodio y citrato de sodio. La fuerte alcalinidad del medio de cultivo TCBS, inhibe considerablemente las enterobacterias; la bilis de buey y el colato inhiben sobre todo a los enterococos. Los coliformes que eventualmente puedan crecer, no fermentan la sacarosa (sinónimo: sucrosa). Contiene dos indicadores de pH: azul de timol y azul de bromotimol, que viran al color amarillo en presencia de acidez. Vibrio cholerae es sacarosa positivo, por lo que produce colonias amarillas. Vibrio fluvialis, V. furnissii y V. alginolyticus, también producen colonias amarillas en TCBS; estos vibrios son de muy poca importancia epidemiológica. Algunas cepas de enterococos, Proteus y Klebsiella sacarosa-positivo, también pueden producir colonias amarillas, pero de morfología distinta a las que produce V. cholerae 01. 1.

Vibrio cholerae 01 produce en TCBS el crecimiento masivo y puro de colonias grandes (de 2 a 3 mm de diámetro), de color amarillo canario (sacarosa-positivo), aplanadas o de bordes delgados. Este tipo de colonias en TCBS, en grandes cantidades debido al enriquecimiento selectivo en APA, son muy indicativas de la presencia de la bacteria.

2.

Si hay crecimiento típico en TCBS, en el agar sangre de carnero se desarrollará un crecimiento masivo y casi puro de colonias grandes incoloras, brillantes, de bordes aplanados y no hemolíticas. En el área de la caja donde el crecimiento es confluente, generalmente aparece una zona de decoloración del medio que semeja hemólisis; probablemente se debe al metabolismo de la bacteria, reminiscencia de la hemólisis específica a los eritrocitos de carnero, que presentaba originalmente V. cholerae 01 del biotipo eltor; en todo caso, es una característica adicional que ayuda a sospechar la presencia de la bacteria en este medio.

3.

Aglutinar las colonias típicas y aisladas del agar sangre de carnero, con antisuero polivalente anti-V. cholerae 01. Al hacerlo, evitar tomar de las 65

colonias pequeñas o blancas que pueden aparecer, ya que el medio no es inhibitorio. Nunca debe aglutinarse del TCBS, pues en este medio las colonias son “chiclosas”, muy adherentes al medio, y no se pueden suspender bien en el antisuero, por lo que la aglutinación sólo es confiable a partir del crecimiento en agar sangre de carnero. 4.

Si se obtiene una reacción de aglutinación positiva, franca e inmediata, generalmente con presencia de grumos grandes, se ha demostrado la presencia de V. cholerae 01. Proceder a aglutinar el crecimiento típico del agar sangre de carnero en antisueros anti-serotipo Inaba y anti-serotipo Ogawa; generalmente la aglutinación es más fina, pero evidente. Esto último no es crucial, pero si deseable. La prueba de oxidasa es positiva; debe hacerse en caso de duda o confirmación.

5.

Si el laboratorio no cuenta con antisuero polivalente anti-V. cholerae 01, se deberá seleccionar una colonia típica del TCBS, y subcultivar en TSI y LIA. En estos medios la reacción después de 18 a 24 horas de incubación, generalmente es TSI: K/A (A/A); LIA: K/K-N, sin gas ni ácido sulfhídrico en ambos tubos. El tubo de TSI debe remitirse al laboratorio de referencia donde se efectúa la confirmación.

6.

Efectuar prueba de susceptibilidad a los antibióticos, según el método de Bauer-Kirby. Sólo deben colocarse los siguientes discos: tetraciclina y trimetoprim-sulfametoxazol, son indispensables; ampicilina o algún otro antibiótico, son optativos. Interpretar los diámetros de los halos de inhibición igual que para enterobacterias. Es deseable, pero no indispensable, colocar en el centro de la caja de agar Mueller-Hinton, un disco con 50 UI de polimixina-B. La resistencia con ausencia de zona de inhibición a este antibiótico, indica que la cepa aislada de V. cholerae 01, pertenece al biotipo eltor. Esto es de esperarse en Latinoamérica, ya que el biotipo clásico no está actualmente presente. Si se detecta una cepa susceptible a polimixina-B, debe remitirse al laboratorio nacional de referencia pertinente, para que confirme este hallazgo de interés nacional. El biotipo eltor presenta una prueba de Voges-Proskauer positiva.

66

Fig. 7 MARCHA BACTERIOLÓGICA ACORTADA PARA AISLAMIENTO DE Vibrio cholerae 01 Muestras:

Heces líquidas

Hisopo rectal

Vómitos

1. Inocular con hisopo estéril bien cargado un tubo con APA, descartar el hisopo y agitar o 2. Incubar 5-6 horas a 36 C Vibro cholerae en la superficie del APA

APA

3. Tomar inóculo de la superficie del APA 4. Sembrar TCBS y agar sangre de carnero (ASC) 5. Incubar 18-24 horas o a 36 C

No agitar

6. Interpretar simultáneamente TCBS

Colonias: - Amarillas - Grandes - Planas

Sembrar antibiograma

ASC

Colonias: - Grandes - No hemolíticas

Hacer frote Gram: bacilos gram-negativo, algunos curvos. Aglutinar, si positivo dar informe STAT STAT: Vibrio cholerae 01

Nota: El diagnóstico definitivo se puede obtener en 24 horas 67

INFORME: En el caso de cólera el reporte debe ser inmediato, ya que en los casos graves la vida del paciente puede depender de este resultado. Por este motivo se justifica plenamente usar una técnica simplificada y evitar pruebas innecesarias, para ahorrar tiempo. Nunca debe esperarse el resultado del antibiograma para hacer el reporte de un cultivo positivo. Se recomienda informar así, lo más pronto posible, y al lugar más indicado: 1.

Inmediatamente después de una prueba de aglutinación franca a partir del agar sangre de carnero: Se aisló Vibrio cholerae O1.

2.

Después de aglutinación positiva con antisuero polivalente anti-V. cholerae 01 y luego aglutinación positiva con antisuero de serotipo Ogawa o Inaba: Se aisló Vibrio cholerae 01, serotipo Inaba (u Ogawa).

3.

Después de interpretar la prueba de susceptibilidad, pero posteriormente a haber enviado un reporte preliminar: Se aisló Vibrio cholerae 01, serotipo Ogawa (o Inaba), biotipo eltor. Susceptible a: ... ; Resitente a: ...

FÓRMULAS: 1. AGUA PEPTONADA ALCALINA (APA): Peptona ...................................................................... 10 gramos Cloruro de sodio. ...................................................... 10 gramos Agua destilada .......................................................... 1,000 ml Ajustar pH final a 9.0-9.2 con hidróxido de sodio 1N. Distribuir 5 ml en tubos 13x100 o de mayor volumen con tapón de rosca. Autoclavear 15 minutos a 121° C (15 libras de presión por pulgada cuadrada).

68

2. MEDIO DE TRANSPORTE CARY-BLAIR: Tioglicolato de sodio ................................................ 1.5 gramos Fosfato dibásico de sodio ........................................ 1.1 gramos (Na2HPO4) Cloruro de sodio ....................................................... 5.0 gramos Agar. ........................................................................... 5.0 gramos Agua destilada .......................................................... 991.0 ml Disolver los ingredientes en el agua por calentamiento, y con agitación constante. Enfriar a 50 grados centígrados, y adicionar 9 ml de cloruro de calcio al 1%, recientemente preparado (0.1 gramos de cloruro de calcio + 10 ml de agua). Ajustar pH a 8.4 con hidróxido de sodio 1N, y distribuir 6 ml en tubos de 13x100 con tapón de rosca, a manera de dejar un pequeño espacio de aire entre el tapón y el medio. Autoclavear a 100 grados centígrados en Baño de María hirviendo, por 15 minutos. Enroscar bien el tapón y almacenar en refrigeración y oscuridad.

69

CAPÍTULO 5 COPROCULTIVO PARA Campylobacter jejuni PROPÓSITO: Demostrar por medio de cultivo, la presencia de Campylobacter jejuni. A partir de 1977, se considera a esta bacteria como un importante agente causal de diarrea humana. C. jejuni es más frecuente que Shigella y Salmonella en coprocultivos. Estudios efectuados por el autor en Guatemala, revelan que en heces de niños menores de cinco años de edad con diarrea, esta bacteria se aisla aproximadamente en el 10 por ciento. Estos resultados son comparables con otros estudios similares en Latino-américa; la frecuencia mundial de aislamiento a partir de coprocultivos varía del 4 al 30 por ciento. Sin embargo, debido a que su aislamiento requiere de un medio de cultivo y condiciones de incubación especiales, su búsqueda no se efectúa rutinariamente, lo cual debería hacerse debido a su importancia epidemiológica. Campylobacter jejuni es un bacilo gram-negativo, curvo, en espiral o en forma de “S”. Presenta dos flagelos, uno en cada extremo de la célula, lo que le proporciona un movimiento rápido y helicoidal, que lanza a la bacteria a manera de dardo. Es una bacteria estrictamente microaerofílica, oxidasa-positivo, que no fermenta ni oxida los carbohidratos. Crece a 36 grados centígrados, pero se utiliza su capacidad diferencial (termófila) de crecer mejor a 42 grados centígrados, para su aislamiento. La infección intestinal por este bacilo causa diarrea con dolor abdominal, fiebre y ocasionalmente vómitos. Puede haber sangre macroscópica en las heces, especialmente en las muestras pediátricas. La infección se adquiere por vía oral, al consumir agua o alimentos contaminados, especialmente carne mal cocinada y leche no pasteurizada. La infección puede adquirirse de otro humano, o ser una zoonosis, pues también puede adquirirse de los animales. C. jejuni es muy frecuente en animales domésticos y mascotas. Especialmente coloniza pollos y otras aves; causa enteritis en ganado bovino, y aborto en ovejas. En el humano, además de enteritis, ocasionalmente causa septicemia, artritis séptica, meningitis y otras infecciones. El diagnóstico de campilobacteriosis puede efectuarse presuntivamente por la observación directa de bacterias con “movimiento de dardo” en las heces con 71

campo oscuro o contraste de fases. Un frote coloreado con Gram, muestra abundantes bacilos gram-negativo curvos. El diagnóstico definitivo se establece por medio del aislamiento e identificación de C. jejuni. MUESTRA: En vista que para el aislamiento de C. jejuni se deben aplicar procedimientos especializados, las muestras deben ser heces frescas, que deben procesarse antes de dos horas de haber sido emitidas. Las heces no deben estar contaminadas con orina. También puede utilizarse hisopo rectal, si la inoculación se efectúa inmediatamente. CONDICIONES NECESARIAS: El procedimiento para el aislamiento eficaz de esta bacteria, debe incluir los siguientes aspectos: 1.

Un agar sangre de carnero selectivo, recientemente preparado. Se recomienda el Agar Skirrow modificado, que contiene como inhibidores: vancomicina (10 mg/lt), polimixina-B (2,500 UI/lt) y trimetoprim (5 mg/lt). Idealmente debe prepararse con la siguiente base: Blood Agar Base No. 2 (Oxoid), adicionada de 10% de sangre de carnero desfibrinada/estéril. La sangre de carnero remueve formas tóxicas de oxígeno en el medio de cultivo. La mezcla de antibióticos que hacen al medio selectivo para C. jejuni puede obtenerse comercialmente.

2.

Incubación en microaerofilia estricta. Idealmente: 5% de oxígeno, 10% de anhídrido carbónico y 85% de nitrógeno. La forma más fácil y efectiva de lograr esta atmósfera, es usar el jarro Gas-Pak (BBL), sin catalítico ni indicador. Según las instrucciones del productor, usar el sobre rojo generador de anaerobiosis (BBL). La incubación en jarro con candela no es adecuada, pues proporciona una atmósfera con demasiado oxígeno (12%-17%) para permitir el crecimiento de C. jejuni.

3.

Incubación a 42° C por 48 horas. Inhibe la microbiota intestinal, y permite el crecimiento termófilo de Campylobacter jejuni, C. coli y C. laridis.

72

PROCEDIMIENTO: 1.

Analizar microscópicamente la muestra fecal, para buscar la presencia de leucocitos polimorfonucleares. Si no los hay, no vale la pena efectuar el cultivo para C. jejuni, pues las posibilidades de aislarlo son muy bajas.

2.

Analizar macroscópicamente la muestra fecal, y tomar con asa o hisopo estéril, las porciones con moco, sangre o pus. Inocular por estrías dos cajas de Agar Skirrow, y una de agar chocolate.

3.

Inmediatamente colocar las tres cajas en atmósfera microaerofílica, por medio del jarro Gas-Pak sin catalítico ni indicador, con sobre generador de anaerobiosis (BBL). Es necesario quitar la canastilla con paladio iridiado (catalítico) del jarro.

4.

Incubar a 42 grados centígrados exactos, por no menos de 48 horas.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: 1.

Retirar las cajas de la incubadora y del jarro Gas-Pak. Con microscopio estereoscópico, o al menos con lupa, examinar detenidamente las colonias aisladas. Buscar colonias con la siguiente morfología típica: húmedas o ligeramente mucosas, muy aplanadas, blanco-grisáceas o incoloras, no hemolíticas, rodeadas de un “velo” de crecimiento que se esparce sobre el agar circundante a la colonia, bordes irregulares y poco perceptibles. Menos frecuentemente las colonias son más secas, convexas y amarillentas; con incubación prolongada se transforman en rugosas. Si no se encuentran colonias típicas, incubar por otras 24 a 48 horas antes de descartar el cultivo como negativo.

2.

De una colonia aislada con morfología típica, hacer inmediata y cuidadosamente un frote (de preferencia del “velo” circundante), en una pequeña gota de agua. Colorear con Gram (dejar la safranina por tres minutos, pues la bacteria se tiñe pálidamente), o con fuchsina básica al 1% por 10 a 20 segundos, después de fijar al calor.

3.

Si el frote presenta bacilos gram-negativo curvos, algunos en forma de “gaviota”, en forma de “S”, o en espiral (ondulante), presuntivamente se ha aislado Campylobacter jejuni. Reportar este hallazgo de inmediato. En los cultivos expuestos al aire predominan las formas cocoides. 73

4.

De otra colonia típica, subcultivar con el asa en hilo a otra caja de Agar Skirrow, y a una caja de agar sangre de carnero, e inocular un tubo de agar TSI. Estriar e incubar los tres medios en atmósfera microaerofílica a 42° C, según ya fue descrito.

5.

El cultivo puro que resulta del subcultivo en Skirrow o agar sangre de carnero generalmente es una “capa” blanquecina de crecimiento; sirve para confirmar de nuevo la morfolofía bacteriana típica, y efectuar las siguientes pruebas confirmativas: -

Oxidasa y catalasa: ambas deben ser positivas, y se consideran como suficientes. Campylobacter jejuni, C. coli y C. laridis dan ambas pruebas positivas.

-

El tubo de TSI debe ser K/K, sin gas, y sin ácido sulfídrico.

-

No es indispensable, pero si existen facilidades, hacer la prueba de hidrólisis del hipurato. Es positiva para C. jejuni, y negativa para C. coli.

-

C. jejuni es susceptible a un disco de 30 microgramos de ácido nalidíxico, mientras que C. laridis es resistente; esta diferenciación tampoco se considera indispensable.

-

Eventualmente algunas cepas de Pseudomonas aeruginosa pueden crecer en el medio Skirrow microaerofílico/termófilo, sin embargo, éstas se diferencian por su pigmento verdoso y su olor característico.

INFORME: Al detectar la morfología bacteriana típica en las colonias que desarrollan a las 48 horas de incubación, informar: Se aisló Campylobacter jejuni, confirmación pendiente. Al efectuar las pruebas confirmatorias, reportar: Se aisló Campylobacter jejuni, se recomienda considerar el tratamiento con eritromicina. 74

CAPÍTULO 6 INVESTIGACIÓN DE Helicobacter pylori PROPÓSITO: Demostrar por medio de observación, cultivo, o la técnica indirecta de ureasa, la presencia de Helicobacter pylori. Esta bacteria se ha reconocido recientemente como agente causal de gastritis crónica activa tipo B, y predispone a la producción de úlceras pépticas. Anteriormente se clasificaba en el género Campylobacter, pero debido a varias diferencias en su estructura, composición y susceptibilidad antimicrobiana, a partir de 1989, se clasifica en el género Helicobacter. Es un bacilo gram-negativo helicoidal o espiral, que presenta movilidad en forma de dardo debida a sus flagelos. Es una bacteria microaerofílica, cuyo crecimiento óptimo es a 36° C. Se observa o aisla a partir de biopsias de la mucosa gástrica. Su detección tiene actualmente mucha importancia clínica. El mecanismo más probable para explicar la patología gástrica que causa, es su gran actividad sobre las células parietales del estómago, lo que induce la producción de gran cantidad de ácido clorhídrico. Además, la potente enzima ureasa que produce H. pylori, degrada la mucina del moco gástrico y libera gran cantidad de amonio. En Latinoamérica en general, la gastritis es una enfermedad muy frecuente. Se sabe que el 70 por ciento la población guatemalteca sufre de infección gástrica asociada a H. pylori, lo que indica la importancia de su búsqueda en nuestro medio. Esta bacteria es susceptible a eritromicina, tetraciclina, penicilina, gentamicina, cefalotina, clindamicina, ciprofloxacina y otros antibióticos; también es susceptible a las sales de bismuto que contienen varios medicamentos contra la gastritis. Es resistente a las sulfonamidas, ácido nalidíxico y trimetoprim-sulfametoxazol. MUESTRA: La muestra siempre debe ser obtenida por el gastroenterólogo por medio de gastroscopía. Las biopsias, cepillados o aspirados, se toman por el gastroscopio, de antro pilórico, de cuerpo y de fondo del estómago. Las biopsias producen los resultados más confiables. También puede usarse la técnica de la cuerda encapsulada o Enterotest para extraer moco gástrico. 75

OBSERVACIÓN DIRECTA: Puede efectuarse por medio de la observación de la bacteria en fresco (en preparaciones con solución salina), con microscopía de contraste de fases (o campo oscuro), o en frotes coloreados. En el caso de la observación en fresco y contraste de fases, se buscan bacilos curvos muy móviles con el típico movimiento en forma de dardo. La coloración de Gram no se considera adecuada para teñir H. pylori. Lo más usado es la detección de la bacteria en el laboratorio de Patología, donde se preparan cortes y frotes por aposición de la biopsia, y se tiñen con Giemsa modificado, hematoxilina-eosina o la compleja impregnación con sales de plata según Warthin-Starry. Se buscan abundantes bacilos curvos o helicoidales directamente sobre la mucosa. PRUEBA DE UREASA: H. pylori produce abundante ureasa, enzima que actúa sobre el sustrato urea, con producción de abundante amoníaco, lo cual alcaliniza el medio. Es una prueba indirecta de la presencia de H. pylori en la muestra, por lo tanto se considera presuntiva. Proceder así: 1.

Macerar asépticamente la biopsia, idealmente en macerador pequeño de vidrio, con 0.3 ml de solución estéril de glucosa al 20%.

2.

Inocular masivamente un tubo de caldo urea, o agar urea de Christensen.

3.

Incubar a 36 grados centígrados por pocas horas.

4.

Se considera como una prueba positiva cuando el medio vira rápidamente a color rosado fuerte, al alcalinizarse.

CULTIVO: El aislamiento de H. pylori por medio de cultivo, constituye la confirmación definitiva de este diagnóstico bacteriológico. Para efectuarlo, se recomienda proceder así: 1.

Macerar la biopsia con 0.3 ml de solución estéril de glucosa al 20%.

2.

Inmediatamente inocular 0.03 ml del macerado en dos cajas de agar chocolate y dos cajas de Agar Skirrow. Diseminar por estrías. 76

3.

Introducir las cajas en un jarro Gas-Pak (BBL), sin catalítico en la tapadera, ni indicador de anaerobiosis. Introducir según las instrucciones del productor, un sobre rojo generador de anaerobiosis. Sin el catalítico presente, proporciona una atmósfera microaerofílica adecuada para el cultivo de H. pylori.

4.

Incubar a 36 grados centígrados por cinco días.

5.

Después de la incubación prolongada, buscar con ayuda del microscopio estereoscópico o lupa, colonias con las siguientes características: muy pequeñas (0.5 mm de diámetro, no mayores de 2 mm), circulares, translúcidas y no pigmentadas. Efectuar observación en fresco con contraste de fases o campo oscuro y/o frote Gram modificado (fucsina básica al 1% como contraste). Si se observan bacterias con el típico movimiento en forma de dardo y bacilos gram-negativo curvos o espirales, el cultivo es compatible con H. pylori.

6.

Las pruebas confirmatorias a partir del cultivo puro son las siguientes: -

Ureasa: positivo fuerte. Catalasa: positivo Oxidasa: positivo Acido sulfhídrico en TSI: negativo (optativo) Otra prueba muy específica pero no indispensable es la hidrólisis del indoxil acetato.

INFORME: 1.

Si la observación directa arroja los resultados esperados, informar: Se observan abundantes bacilos de morfología compatible con Helicobacter pylori.

2.

Si la prueba de ureasa es positivo fuerte en pocas horas, informar: Prueba de ureasa rápida: positivo fuerte, muy indicativa de la presencia de Helicobacter pylori.

3.

Si el cultivo presenta los resultados de observación directa y pruebas confirmatorias con los resultados esperados, informar: Se aisló Helicobacter pylori.

77

CAPÍTULO 7 UROCULTIVO PROPÓSITO: El cultivo de orina que ha sido colectada adecuadamente o urocultivo se efectúa para demostrar la presencia de un número significativo de bacterias. En condiciones normales, la orina dentro del cuerpo es estéril, pero siempre se contamina con bacterias al obtener la muestra. Por esta razón, el criterio para interpretar el crecimiento es cuantitativo. De acuerdo con el llamado “criterio de Kass”, un número de bacterias mayor o igual a 100,000 UFC/ml (unidades formadoras de colonia por mililitro de orina) se considera infección urinaria verdadera, es decir, es un recuento significativo. A diferencia de otros cultivos bacteriológicos, las bacterias que causan la infección urinaria, se limitan a unos pocos microorganismos de crecimiento rápido. Las principales bacterias que infectan el sistema urinario son las enterobacterias (bacilos gram-negativo). Escherichia coli es sin duda la bacteria que con más frecuencia se aisla de urocultivos positivos, luego: Klebsiella spp. Enterobacter spp. Proteus spp. Pseudomonas aeruginosa (no es enterobacteria) De menor importancia son los cocos gram positivo: Enterococcus spp. Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes y Streptococcus sp. (raros) Staphylococcus epidermidis (puede ser contaminación) Staphylococcus saprophyticus (puede ser contaminación) Las infecciones mixtas causadas por dos o más especies bacterianas son raras, por lo que el crecimiento con varios tipos de colonias indica contaminación. La demostración de la piuria (presencia de leucocitos polimorfonucleares en el sedimento urinario) y la bacteriuria (bacterias en la orina), son ambos de gran importancia para establecer el diagnóstico de infección urinaria. 79

80

*Escherichia coli Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrhoeae Staphylococcus saprophyticus Trichomonas vaginalis (protozoo) Virus Herpes simplex tipo 2 Candida albicans (hongo) *Bacilos gram-negativo Ureaplasma urealyticum Chlamydia trachomatis

Sintomático: disuria, frecuencia Asintomático Disuria, frecuencia

Agudo: fiebre, calofríos, dolor de espalda

Tracto urinario inferior: cistitis

Uretritis

Prostatitis

Mayor o igual a 100

Mayor o igual a 100

Mayor o igual a 100,000 (criterio de Kass)

Mayor o igual a 100,000 (criterio de Kass)

CONTEO SIGNIFICATIVO (UFC/ml)

Tomado de: Pezzlo, M. 1992. Urine Culture Procedure. In: Isenberg, H.D. (Editor in Chief). Clinical Microbiology Procedures Handbook. Two volumes. American Society for Microbiology. Washington, D.C., USA.

*Escherichia coli *Otros bacilos gram-negativo Enterococcus spp. Staphylococcus coagulasa-negativo

Agudo: fiebre, calofríos, dolor de cintura posterior, náusea, vómitos, cilindros leucocitarios, invasión tisular Crónico: asintomático, moderado o agudo, lesiones, cilindros leucocitarios

Tracto urinario superior: pielonefritis

* Aislamiento común.

*Bacilos gram-negativo Staphylococcus aureus Staphylococcus coagulasa-negativo Candida spp. (hongo) Mycobacterium spp. Mycoplasma hominis

MANIFESTACIONES CLÍNICAS

TIPO DE INFECCIÓN

MICROORGANISMOS ASOCIADOS CON LA INFECCIÓN

MANIFESTACIONES CLÍNICAS Y MICROORGANISMOS ASOCIADOS CON VARIOS TIPOS DE INFECCIONES URINARIAS

TOMA DE LA MUESTRA: Si en algún examen bacteriológico la toma de la muestra es crucial, para obtener un resultado de cultivo con correlación clínica, es en el urocultivo. El meato urinario, o sea el agujero de salida de la uretra (tubo que desagua la vejiga), está siempre colonizado por bacterias saprófitas, tanto en el hombre como en la mujer. Por esta razón, los genitales deben desinfectarse antes de tomar la muestra, según se explica a continuación. Tomar la muestra de orina para urocultivo después de dos horas sin que el paciente haya orinado. Si la muestra se toma antes, la orina no ha pasado suficiente tiempo en la vejiga, para alcanzar cantidades significativas. TOMA DE UROCULTIVO EN EL HOMBRE: 1.

Desinfectar bien la punta del pene del paciente con una gasa estéril empapada en jabón antiséptico no irritante. Remover el jabón con otra gasa estéril, empapada en agua estéril.

2.

Pedir al paciente que orine directamente en la taza del sanitario.

3.

Después de transcurridos unos 3 a 5 segundos, destapar rápidamente pero con cuidado un frasco estéril de boca ancha y tomar “al vuelo” una muestra de orina de la parte central de la micción. Se deja correr la primera porción de orina para que remueva las bacterias de la parte anterior del meato urinario, que contaminaría el urocultivo. Tapar rápidamente el frasco.

4.

Si no es posible inocular el urocultivo antes de una hora de obtenida la muestra, refrigerarla (no congelar). La muestra conservada en refrigeración se mantiene en buenas condiciones para ser inoculada, por un máximo de 48 horas.

TOMA DE UROCULTIVO EN LA MUJER: En el caso de la mujer, debe observarse especial cuidado en la toma de la muestra, ya que sus genitales no están expuestos y están abundantemente colonizados por bacterias. Proceder así: 1.

Solicitar a la paciente que se coloque sobre la taza del inodoro con las piernas abiertas. Con los dedos índice y medio de la mano izquierda debe separarse los labios genitales mayores. 81

2.

Con una gasa empapada en jabón antiséptico no irritante limpiar bien toda el área y luego remover el jabón con otra gasa empapada en agua estéril.

3.

Obtener la muestra de orina “al vuelo” dejando al igual que en el caso del hombre, que corra el chorro de orina unos segundos y luego tomar de la porción central de la micción. Tapar rápidamente.

4.

Sembrar antes de una hora o refrigerar la muestra.

TOMA DE UROCULTIVO EN NIÑOS PEQUEÑOS: Con los niños que aún no saben hablar para comprender instrucciones y orinar a voluntad, debe procederse así: 1.

En los niños varones desinfectar bien, con jabón antiséptico no irritante, todo el pene y el área genital. En las niñas desinfectar bien los labios mayores y el área genital que los rodea. Quitar bien el jabón con gasa y agua estéril, luego secar finalmente con una gasa estéril seca.

2.

Pegar una bolsita de plástico estéril y descartable, especial para tomar urocultivos infantiles. En los niños tener la precaución de introducir todo el pene en el orificio del llenado y en las niñas que el agujero de la bolsita quede pegado al centro por donde saldrá la orina. Colocar los pañales en su lugar y fijar la bolsita en su lugar con tiras de “masking-tape”.

3.

Generalmente se le pide a la madre o a quien lleve al niño al laboratorio, que espere hasta que orine. Algunos procedimientos que aceleran la micción son: dar bebidas (agua, leche, etc.), aplicar presión sobre la vejiga. También se puede estimular al niño según el reflejo de Castañeda: cargar al niño boca abajo con la mano derecha y con el ángulo que forma el dedo pulgar doblando de la mano izquierda hacer presión en forma de rayas en la parte baja de la espalda del niño.

PUNCIÓN SUPRA-PÚBICA (PSP): Es la obtención de la muestra de orina por medio de punción directa a la vejiga, con una aguja larga. Por ser un procedimiento delicado que conlleva algunos riesgos debe hacerse sólo por el pediatra. Se debe efectuar sólo en estos casos: 82

-

Malformación anatómica que evite la micción normal del niño, causando contaminaciones. Urocultivo aerobio negativo varias veces, continúan los síntomas, el sedimento urinario presenta leucocitos y se sospecha de una infección urinaria causada por bacterias anaerobios.

Nota importante: Jamás introduzca sonda para tomar el urocultivo. Hace varios años que esta técnica cayó en desuso, pues introduce a la vejiga bacterias que están colonizando el meato urinario. Recuerde que de ser posible debe tomarse la primera orina de la mañana, generalmente esto no es posible, por lo que debe esperarse un mínimo de dos horas sin que el paciente orine antes de obtener el urocultivo para que las bacterias tengan suficiente tiempo para reproducirse hasta números significativos dentro del sistema urinario. PROCEDIMIENTO: 1.

Ya que la muestra ha sido colectada siguiendo estrictamente las instrucciones anteriores, sembrar la orina en dos medios de cultivo según la técnica del asa calibrada usada en la Clínica Mayo (Rochester, Minnesota, EUA). Los dos medios de cultivo a utilizar son: Agar sangre de carnero al 5%: crecen la mayoría de bacterias. MacConkey: crecen sólo bacilos gram-negativo aerobios (enterobacterias) pues es selectivo y diferencial. Alternativamente usar solamente el medio CLED si el microbiólogo a cargo conoce su interpretación, la cual puede ser confusa, por lo que no se recomienda.

2.

Para sembrar, usar una asa calibrada de platino (95% platino, 5% rodio) que tome 0.001 ml. Agitar el frasco de orina (de preferencia con agitador “vortex”, abrir delante del mechero y flamear la boca del mismo. Introducir verticalmente el asa flameada y fría en la orina, justamente por debajo de la superficie.

3.

Inocular primero el agar sangre deslizando el asa una sola vez a lo largo de la caja y pasando por el centro. Flamear e inocular en igual forma el MacConkey. Alternativamente, sembrar una biplaca de agar sangre de carnero y MacConkey, con 83

Agar sangre carnero MacConkey

Biplaca para urocultivo

Fig. 8 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA UROCULTIVO Muestra Orina colectada “al vuelo”

1. Agitar 2. Tomar 0.001 ml con asa calibrada de platino, verticalmente y justamente por debajo de la superficie Ó

INOCULAR DE RUTINA

BIPLACA

ASC

MacConkey Medios: 1o: Agar sangre de carnero (ASC)

2o. MacConkey

3. En ambos medios, primero una estría longitudinal con asa de platino calibrada (0.001 ml)

4. Con asa corriente flameada y fría, estriar perpendicularmente toda la caja

Idealmente, incubar el agar sangre en jarro con candela a 36o C

Incubar aeróbicamente a 36o C 84

0.001 ml en cada mitad según la foto. Esto permite el ahorro de cajas de Petri. 4.

Inmediatamente estriar con asa corriente en anillo el inóculo de orina, por ambas cajas, haciendo estrías tupidas y perpendiculares a la estría dejada por el asa calibrada.

5.

Con el objeto de ahorrar cajas de Petri, alternativamente puede usarse una caja dividida por la mitad o biplaca, con agar sangre de carnero en un lado y MacConkey en el otro; estriar de la misma manera.

5.

Idealmente, incubar el agar sangre a 36° C en jarro de boca ancha con un trozo de papel absorbente húmedo y una veladora o candela encendida, cerrar bien.

6.

Incubar el MacConkey sin jarro en la incubadora a 36° C.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: 1.

Después de incubar ambas cajas durante 18 a 24 horas, interpretar resultados de ambas cajas simultáneamente y con buena luz.

2.

Teóricamente cada bacteria origina una colonia en la superficie del medio, pero esto no es estrictamente cierto, pues cadenas o grupos de bacterias también pueden originar una sola colonia. Por esta razón se deben contar y reportar “unidades formadoras de colonias” o UFC. La cantidad de colonias, en el agar sangre debe ser igual o muy similar en el MacConkey. Si en el MacConkey crece una enterobacteria, en el agar sangre también deberá aparecer, es decir, debe haber correlación entre ambas cajas. De allí se deriva la importancia de interpretar el crecimiento de ambas cajas simultáneamente y de usar un medio selectivo/diferencial y otro rico no inhibidor, cuando se trata de una bacteria grampositivo, sólo crece en agar sangre.

3.

Contar el número de colonias presentes y multiplicar por 1000, si se usó el asa calibrada de 0.001 ml. Multiplicar por 100 si se utilizó una asa calibrada de 0.01 ml. Ejemplos con asa de 0.001 ml:

85

No. colonias contadas 25 78 100 en adelante 4.

UFC/ml de orina 25,000 78,000 más de 100,000

En la mayoría de urocultivos positivos, se observa el crecimiento de 100 más o colonias rojas (lactosa-positivo), brillantes pero no mucosas en la superficie del MacConkey, con correlación en el agar sangre.

En este caso informar presuntivamente: CLAVE : (en libro de registros)

TEXTO DEL INFORME:

E. coli más de 100,000 UFC /ml. S/A (susceptibilidad antimicrobiana)

Se aisló Escherichia coli, más de 100,000 UFC /ml. Infección urinaria verdadera, según el criterio de Kass. S/A.

De una colonia típica, inocular un TSI, LIA, MIO y Citrato de Simmons para confirmar la identificación presuntiva de E. coli y al mismo tiempo inocular de la misma colonia y otras idénticas, la prueba de susceptibilidad antimimicrobiana o antibiograma, según la técnica de Bauer-Kirby descrita. Pueden aislarse cepas de E. coli fermentadoras lentas de lactosa y deberán identificarse con TSI y LIA, no presentan diseminación en cepas en el agar sangre. Si las colonias en el MacConkey son rojas (lactosa positivo) pero mucosas, informar: CLAVE:

TEXTO:

Klebsiella-Enterobacter más de 100,000 UFC /ml. S/A.

Se aisló Klebsiella-Enterobacter más de 100,000 UFC ml. Infección urinaria verdadera, según el criterio de Kass. S/A.

Inocular TSI y susceptibilidad. La diferenciación de estos dos géneros y de las enterobacterias en general debe hacerse por medio de pruebas bioquímicas, de preferencia con el sistema API-ATB/VITEK (Bio Merièux) o SENSIDENT (Merck). 6.

Si las colonias en MacConkey son lactosa-negativo (incoloras), hay correlación en el agar sangre (donde las colonias son grandes, beta 86

hemolíticas y de color verdoso), y los cultivos huelen a perraje o güipil nuevo (telas típicas de Guatemala, olor semejante a uvas), inocular para confirmar TSI y LIA y susceptibilidad, informar: CLAVE:

TEXTO:

Pseudomonas aeruginosa más de 100,000 UFC /ml. S/A.

Se aisló Pseudomonas aeruginosa, más de 100,000 UFC/ml. Infección urinaria verdadera, según el criterio de Kass. S/A.

Si las colonias son lactosa-negativo (incoloras) en MacConkey, no huelen a perraje o güipil nuevo, y en el agar sangre de carnero presentan diseminación en capas, inocular TSI, LIA y urea y susceptibilidad, informar: CLAVE:

TEXTO:

Proteus sp. más de 100,000 UFC ml. S/A.

Se aisló Proteus sp. más de 100,000 UFC ml. Infección urinaria verdadera, según el criterio de Kass. S/A.

Después de 18 a 24 horas de incubación a 36° C de las pruebas de identificación interpretar para confirmar su reporte inicial con las reacciones en TSI, LIA y urea según el Capítulo del coprocultivo. Notar reacción roja (R) en la superficie de LIA y urea positivo para el género Proteus. 8.

Los cocos gram-positivo no crecen en MacConkey, por lo que aparecen formando colonias sólo en el agar sangre. Para tomarlos en cuenta y reportarlos como agentes causantes de infección urinaria deben aparecer en cultivos puros en el agar sangre. Identifique así:

Primero notar la presencia de hemólisis alrededor de cada colonia. Hemólisis es la acción causada por algunas sustancias producidas por las bacterias que destruyen total o parcialmente los eritrocitos del medio. Hay dos tipos de hemólisis, los cuales se discuten en detalle en el Capítulo 8: TIPO DE HEMÓLISIS

SE OBSERVA

Alfa

Un halo verde

Beta

Un halo claro, del color del medio

87

Staphylococcus aureus: colonias grandes (1 a 2 mm de diámetro), pueden o no ser hemolíticas (no importante), a veces presentan pigmento amarillo. Coloración de Gram: cocos gram-positivo, bien redondos, agrupados en racimos. Identificar con dos pruebas específicas descritas en el Capítulo 8: coagulasa y manitol-sal. Inocular prueba de susceptibilidad con discos de antibióticos para gram-positivo según la tabla del capítulo correspondiente. Staphylocccus epidermidis (coagualasa y manitol-negativos). Generalmente es contaminante. Tomarlo en cuenta y reportar sólo si está presente en cantidad significativa y en cultivo puro. Streptococcus pyogenes: colonias pequeñas (1 mm o menos), la hemólisis es beta, ésta característica es muy importante. Coloración de Gram: cocos gram-positivo ligeramente alargados y agrupados en cadenas cortas o parejas. Identificación específica: ver prueba de inhibición por disco de bacitracina en próximo capítulo. Streptococcus sp. alfa hemolítico, sólo debe tomarse en cuenta si se presenta en conteos altos y en cultivo puro. 9.

Si no se observa ningún crecimiento a las 24 horas de incubación, descarte las cajas y reporte así los urocultivos negativos: CLAVE:

TEXTO:

N-24

Urocultivo negativo a las 24 horas de incubación a 36° C.

No se debe perder tiempo y esfuerzo en reincubar los urocultivos rutinarios hasta las 48 horas, porque las bacterias cuasantes de infección urinaria son aerobios de crecimiento rápido. En casos especiales pueden efectuase urocultivos para anaerobios, hongos o micobacterias. INFORME: Deben establecerse los siguientes criterios para reportar o no los crecimientos de los urocultivos así:

88

UFC/ml

CRITERIO PARA REPORTAR

10,000 - 10,000 *

Negativo a las 24 horas de incubación a 36° C

10,000 - 50,000

Sugerir repetir cultivo. Revisar condiciones de toma de muestra y correlación de leucocitos en el sedimento urinario.

50,000 - 100,000

Se aisló _________ , _____ ,000 UFC/ml. S/A (reportar el número de UFC contado y la especie bacteriana con su S/A).

100,000 o más

Se aisló_________ , más de 100,000 UFC/ml. Infección urinaria verdadera de acuerdo con el criterio de Kass. S/A.

*30 a 50 por ciento de mujeres con infección vesical y/o uretral con disuria, urgencia y frecuencia (síndrome uretral agudo) no llenan el criterio de Kass. En estos casos, 100 UFC/ml de orina debe ser el límite para hacer diagnóstico correcto, en asociación íntima con el médico tratante. (Según Jacobo Sabbaj K., VI Congreso Centroamericano de Microbiología, Guatemala, 5-9 de diciembre de 1983). DETECCIÓN DE BACTERIURIA POR LA COLORACIÓN DE GRAM DE ORINA NO CENTRIFUGADA: En aquellos laboratorios en donde no es posible efectuar urocultivo, este método fácil y barato lo sustituye. La coloración de Gram de orina puede detectar tanto la presencia de bacterias como de leucocitos. Proceder así: 1.

En un porta-objetos de vidrio (limpio) colocar 10 µl (una gota) de orina no centrifugada bien mezclada.

2.

Dejar secar al aire, fijar con calor, marcar por detrás con un círculo de crayón graso y colorear cuidadosamente con Gran.

3.

Observar con aceite de inmersión.

4.

Informar la cantidad de bacterias por campo en inmersión.

5.

La presencia de una o más bacterias por campo de inmersión correlaciona bien con un urocultivo mayor o igual a 100,000 UFC/ml (criterio de Kass). 89

6.

La presencia de muchas células epiteliales (citoplasma grande y claro, núcleo pequeño) y diferentes tipos de bacterias indican contaminación y el examen debe repetirse.

90

CAPÍTULO 8 CULTIVO DE GARGANTA

PROPÓSITO El cultivo de garganta, se efectúa para demostrar la presencia de Streptococcus pyogenes (Streptococcus que pertenece al grupo “A” de Lancefield y es beta hemolítico). No debe llamarse “orocultivo”, pues este término significa literalmente cultivo de boca. Algunas otras bacterias mucho menos importantes en infecciones de la faringe, son: Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae Staphylococcus aureus Klebsiella pneumoniae Otras enterobacterias Pseudomonas aeruginosa Estos microorganismos sólo deben reportarse si predominan sobre la microbiota normal de la garganta, que es abundante y muy variada. Streptococcus agalactiae del grupo B y los estreptococos de los grupos C, F y G de Lancefield también son beta hemolíticos (generalmente presenta poca hemólisis beta). Pueden ser agentes etiológicos de faringitis, por lo que debe identificarse adecuadamente. Los síntomas frecuentemente asociados a infecciones de la faringe por Streptococcus pyogenes son: dolor de garganta, ganglios linfáticos del cuello agrandados, dolor de cabeza, náusea, vómitos y dolor abdominal. La infección de la faringe causada por virus provoca tos, secreción nasal y nariz tapada. Sin embargo, con mucha frecuencia no es posible establecer diagnóstico sólo en base a observaciones clínicas. MUESTRA: No es necesario que el paciente esté en ayunas; sin embargo, conviene dejar pasar 1 a 2 horas para que se vuelva a formar la secreción que fue deglutida. Debe tomarse siempre antes de iniciar el tratamiento con antibióticos. El cultivo de garganta debe tomarse con sumo cuidado. Es indispensable examinar bien las le-

91

siones en la garganta del paciente en el laboratorio para tomar la muestra del lugar preciso. Siga al pie de la letra las siguientes instrucciones: 1.

Colocar al paciente sentado y pedirle que trague saliva fuertemente dos veces.

2.

Pedir al paciente, viendo hacia arriba que abra la boca, saque la lengua y diga aahh.

3.

Con un bajalenguas, presionar fuertemente la lengua hacia abajo y simultáneamente iluminar bien el fondo de la garganta (detrás de la úvula o campanilla), con una lámpara portátil de baterías o “flash light”.

4.

Localizar en el fondo de la garganta y en las amígdalas (que se encuentran a los lados), las siguientes lesiones: Inflamación (enrojecimiento) Pus (secreción blanquecina o amarillenta) Úlceras blanquecinas

5.

Con un hisopo estéril frotar firmemente las lesiones con sumo cuidado de no tocar la lengua, la campanilla, la pared interna de los carrillos (cachetes) o los labios, al retirar el hisopo.

PROCEDIMIENTO: 1.

Inocular inmediatamente una caja (o placa) de agar sangre de carnero al 5%; hacer dos cortadas en el agar durante la siembra. Las cortadas deben ser aproximadamente de 1 cm de largo y el asa debe llegar al fondo de la caja; orientar las cortadas de la orilla de la caja al centro. En este caso no flamear el asa entre cada estría (ver figura 9, pág. 90). El propósito de las cortadas es introducir las bacterias dentro del agar para alejarlos del oxígeno atmosférico y así incrementar la hemólisis tipo beta. Anteriormente se acostumbraba enriquecer previamente por 2 horas en caldo Todd-Hewitt, pero los resultados indican que no vale la pena.

2.

Con el objeto de obtener cultivos evidentes de Streptococcous pyogenes, sin necesidad de hacer sub-cultivos, proceder así: Con pinza flameada y fría, colocar en la zona de más fuerte inoculación en el agar sangre de carnero (primera estría), un disco de 30 mcg de neomicina. A unos 8-10 mm de distancia, colocar un 92

disco de 0.04 unidades de bacitracina. Streptococcus pyogenes y Streptococcus pneumoniae son resistentes al antibiótico neomicina, por lo que crecen en cultivo casi puro alrededor de este disco. Como el disco de bacitracina (también llamado taxo A) se encuentra muy cerca frecuentemente puede acelerarse la identificación presutiva. Las colonias que crecen alrededor del disco de neomicina (N-30) pueden usarse para hacer sub-cultivos y antibiogramas (según: Maxted, W. R.: J. Clin. Path. 6: 224, 1953). Este método sencillo que clarifica la interpretación, puede aplicarse para facilitar el aislamiento, y efectuar la identificación presuntiva rápida de Streptococcus pneumoniae. 3.

Introducir la caja en un frasco de vidrio de boca ancha, poner en el fondo una toalla de papel húmeda, colocar la caja con el medio arriba y luego introducir sobre una tapa de caja de Petri una veladora o candela corta encendida. Cerrar el frasco bien, sellarlo con “masking-tape”. La vela se apagará sola. Es conveniente aplicar (una vez a la semana) un poco de cera a la boca del frasco y a la rosca interna de la tapadera, para que sellen bien.

4.

Incubar por 18 a 24 horas a 36° C. Es indispensable el uso del jarro con candela y humedad, para obtener reacciones hemolíticas correctas. Si no se usa, la recuperación de Streptococcus pyogenes será mucho menor.

El propósito de usar sangre de carnero en el medio, es aumentar la beta hemólisis característica e inhibir a Haemophilus haemolyticus que puede confundirse con Streptococcus pyogenes. Con sangre de carnero se obtiene una excelente diferenciación entre alfa y beta hemólisis, entre otras ventajas (ver pág. 103). Evitar el uso de sangre humana vencida de banco de sangre en todos los cultivos bacteriológicos ya que puede ser inhibitoria al crecimiento bacteriano por contener anticoagulantes, anticuerpos o antibióticos, además del peligro potencial de la transmisión del virus del SIDA, hepatitis B, etc. No hacer frotes Gram directos de faringe, pues su interpretación es muy difícil debido a lo abundante de la microbiota y no tiene significado clínico.

93

Fig. 9 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA CULTIVO DE GARGANTA/EXUDADO FARÍNGEO 1.

Muestra: Tomar un hisopo faríngeo con buena luz y bajalenguas

Úvula Amígdala Farínge posterior

2. Inocular una caja de agar sangre de carnero por estrías, con dos cortadas de 1 cm, sin flamear entre cada estría 3. Colocar sobre la primera estría, un disco de bacitracina de 0.04 unidades y un disco de 30 mcg de neomicina, separados 8-10 mm entre sí 4. Incubar en jarro con candela y humedad a 36o C

Cortada 1 Disco de bacitracina Disco de neomicina

A N 30

Cortada 2

5. Después de 18-24 horas de incubación, interpretar con buena luz. Buscar e identificar colonias beta hemolíticas 94

INTERPRETACIÓN: La microbiota de la faringe es sumamente variada; predominan Streptococcus sp. alfa hemolíticos (hemólisis verde) llamados por esta razón “grupo viridans” y neisserias no patógenas. Estos grupos bacterianos nunca deben reportarse. Con el objeto de no perderse en la interpretación de este cultivo, que siempre presenta muchos tipos de colonias, utilice los siguientes criterios: 1.

Tener presente que el patógeno más importante es Streptococcus pyogenes que es beta hemolítico. Tomar la caja de agar sangre de carnero con la mano izquierda entre los dedos pulgar y medio sosteniendo por detrás de la caja con el dedo índice.

2.

Con una lupa en la mano derecha examinar cuidadosamente la caja con buena luz transmitida (por detrás), según la foto. En primer lugar notar si hay o no hemólisis beta (clara) en las cortadas (ver fotografía en la portada de este manual). Si la hay, buscar con cuidado colonias separadas beta hemolíticas pequeñas y brillantes, sospechosas de Streptococcus pyogenes. Aunque sólo se observe una de estas colonias, debe tomarse en cuenta.

3.

Con una asa recta estéril y siguiendo la técnica ilustrada en la figura 6, pág. 46, trasladar una sola colonia típica al centro de otra caja de agar sangre de carnero. Sólo tocar la superficie del medio rotando el asa (no pinchar el medio). Luego con una asa en argolla estriar en tres direcciones opuestas y luego colocar con pinzas estériles en el centro del inóculo un disco de bacitracina de 0.04 unidades (“taxo A”, o “disco B” según la marca). La bacitracina es un antibiótico originalmente aislado de Bacillus licheniformis. La prueba presuntiva de la inhibición selectiva por este antibiótico tiende a ser sustituida por otras pruebas. Sin embargo, se sigue usando debido a su facilidad y alto porcentaje de exactitud.

4.

Si las colonias beta hemolíticas no están aisladas, hacer una purificación así: con una asa recta o aguja de disección flameada, tomar las colonias beta hemolíticas con cuidado, aunque se tome de otras colonias que estén muy cercanas o adyacentes. De preferencia hacer esto bajo el microscopio estereoscópico. Trasladar el inóculo dos o tres veces a un extremo de una caja de agar sangre de carnero y luego con dos asas en 95

anillo, estriar en toda la caja con dos cortadas, al igual que el cultivo inicial. Colocar con pinzas estériles un disco bacitracina en el inicio de la segunda estría. 5.

Tipo de hemólisis

Apariencia de halo

Alfa

Verde (incompleta)

Beta

Claro, del color del medio (completa)

6.

*

Para interpreter correctamente los crecimientos de cultivos de exudados faríngeos memorizar esta tabla:

Interpretar resultados sólo para Streptococcus beta hemolíticos así:

Inhibición por disco de bacitracina

Reportar

+ (si produce halo), ver foto abajo

* Se aisló Streptococcus pyogenes beta hemolítico del grupo “A” de Lancefield.

- (no inhibición)

Streptococcus sp. beta hemolítico no del grupo “A” de Lancefield (hacer prueba de CAMP).

La inhibición por el disco de bacitracina identifica a S. pyogenes con 95% de certeza. Cualquier diámetro de halo de inhibición se considera significativo. Efectuar simultáneamente susceptibilidad a un disco de trimetoprim-sulfametoxazol; S. pyogenes es resistente a este antibiótico, lo que aumenta la certeza de la identificación, junto con la prueba de CAMP negativa (técnica adelante).

Interpretación, con buena luz transmitida por detrás del sub-cultivo en agar sangre de carnero. Se observa el halo de inhibición del crecimiento alrededor del disco de bacitracina (halo oscuro sin hemólisis). 96

7.

8.

Aparte de las causadas por Streptococcus pyogenes, son raras las infecciones de la garganta ocasionadas por otras bacterias. Reportar las bacterias que se citan a continuación solamente cuando predominan por encima de la microbiota normal. Examinar la última estría que presenta colonias separadas. Con mucho cuidado y con lupa, observar si hay más colonias que Streptococcus sp. alfa hemolítico y Neisseria sp., de: –

Streptococcus pneumoniae (neumococo): coco gram-positivo ovalado o lanceolado, agrupado en parejas. Colonias alfa hemolíticas aplanadas o ligeramente mucosas (debido a la presencia de cápsula). Al pasarlo a otro agar sangre de carnero es inhibido por el disco de optoquina “Taxo P” o “Disco N”). Ver tabla adelante en número 8. Esta bacteria es parte de la microbiota normal de la garganta, en bajas concentraciones.

–

Staphylococcus aureus: coco gram-positivo esférico, en racimos, coagulasa positivo; crecimiento amarillo en agar manitol-sal. No causa frecuentemente faringitis como erróneamente se cree.

–

Enterobacterias: principalmente Klebsiella sp., Enterobacter sp. y Escherichia coli.

–

Pseudomonas aeruginosa: bacilo gram-negativo aerobio, colonias grandes, generalmente beta hemolíticas con pigmento verdoso y olor característico. TSI/LIA no viran (no fermentador), y el pigmento que se nota en la superficie del crecimiento fluorece bajo la luz ultravioleta.

–

Haemophilus influenzae: bacilo gram-negativo muy corto y fino, pleomórfico (es decir formas cocobacilares y formas largas juntas). Crece en agar chocolate con jarro con candela y en agar sangre de carnero colonias muy pequeñas sólo alrededor de colonias de Staphylococcus aureus, a lo que se llama ”satelitismo”.

Para diferenciar en cultivo de garganta o en cualquier otro cultivo bacteriológico (L.C.R., hemocultivo, esputo, secreciones oculares, etc.) las colonias alfa hemolíticas planas que crecen en el agar sangre de carnero, memorizar esta tabla:

97

Inhibición por disco de optoquina

Informar

+ (presencia de halo)*

Se aisló Streptococcus pneumoniae

- (no inhibe)

Streptococcus sp. alfa hemolítico **

*

Si se usa un disco impregnado de optoquina de 6 mm de diámetro, se considera significativa una zona de inhibición sólo si es mayor de 14 mm de diámetro.

**

En cultivo de garganta es microbiota normal, no informarlo.

9.

El cultivo de garganta negativo es aquel que: no presenta colonias beta hemolíticas no presenta beta hemólisis en las cortadas no predomina ninguna de las bacterias citadas el crecimiento consiste principalmente de colonias alfa hemolíticas no aplanadas y pequeñas colonias amarillentas que se desprenden fácilmente del agar con el asa (Neisseria, Branhamella.)

Informar cultivos de garganta negativos así: Clave

Informar

NP (en libro de registro)

No se aislan patógenos, desarrollan bacterias de la microbiota normal.

10.

En la garganta pueden existir Streptococcus sp. beta hemolíticos no del grupo “A” de Lancefield. A los Streptococcus pyogenes del grupo “A” de Lancefield no se les debe hacer prueba de susceptibilidad, ya que por lo general son muy susceptibles a la penicilina que es el antibiótico de elección. Por el contrario, a los Streptococcus sp. beta hemolíticos no del grupo “A” de Lancefield sí debe efectuarse prueba presuntiva de susceptibilidad a la penicilina, con un disco del antibiótico en agar sangre de carnero. Además, debe hacerse la prueba de CAMP para Streptococcus sp. beta hemolíticos no del grupo “A” de Lancefield. Existen procedimientos de agrupamiento serológico, los cuales pueden usarse dependiendo de los recursos del laboratorio.

98

ETIOLOGÍA Y SINTOMATOLOGÍA DE INFECCIONES RESPIRATORIAS SUPERIORES SIGNOS Y SÍNTOMAS Sinusitis/Rinitis:

BACTERIA POTENCIALMENTE ASOCIADA Streptococcus pneumoniae

Cefalea

Streptococcus pyogenes (grupo A)

Dolor/eritema en región malar

Staphylococcus aureus

Rayos-X: Consolidación, nivel de líquido, engrosamiento de la pared de los senos

Haemophilus influenzae Klebsiella spp. y otras enterobacterias Bacteroides spp. y otros anaerobios (sinusitis)

Garganta y faringe:

Streptococcus pyogenes (grupo A)

Eritema y edema de mucosas

Corynebacterium diphtheriae

Pus en amígdalas

Neisseria gonorrhoeae

Pseudomembranas

Bordetella pertussis

Edema de la úvula Lengua con cubierta grisácea Linfadenitis cervical

IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA DE Streptococcus agalactiae (GRUPO B). PRUEBA DE CAMP: 1.

Esta bacteria es resistente al disco de 0.04 unidades de bacitracina. Es indispensable contar con agar sangre de carnero al 5% para hacer la prueba de CAMP. En una caja de este medio hacer con el asa en argolla una estría recta a lo largo de toda la caja con una cepa de Staphylococcus aureus productor de doble zona de beta hemólisis.

2.

Luego con sumo cuidado, hacer una estría con el Streptococccus beta hemolítico a identificar, perpendicular a la estría de S. aureus pero que no la toque (A). Generalmente S. agalactiae presenta un halo pequeño de hemólisis beta, el cual puede disminuir al sub-cultivar.

3.

Incubar en jarro con candela y humedad de 18 a 24 horas a 36° C. Interpretar como Streptococcus agalactiae del grupo “B” de Lancefield si se produce una “flecha” de intensa beta hemólisis que apunta hacia la estría de Staphylococcus aureus (B). 99

Fig. 10 SIEMBRA E INTERPRETACIÓN DE LA PRUEBA DE CAMP

Strepto.

Strepto.

Flecha

Staph.

Staph.

A. Siembra prueba de CAMP

B. Flecha de beta hemólisis indica B: prueba de CAMP positiva

4.

Hacer la prueba con un control positivo (cepa conocida de S. agalactiae) y un control negativo (cepa conocida de S. pyogenes). Estas cepas control y la cepa de S. aureus de doble zona de beta hemólisis, deben conservarse suspendiendo masivamente cultivos puros en aproximadamente 3 ml de sangre de carnero pura, en tubos estériles y congelar.

5.

Streptococcus agalactiae es un agente etiológico de vaginitis y meningitis neonatal, por lo que también debe buscarse cultivando en agar sangre de carnero al 5% las secreciones vaginales y líquidos cefalorraquídeos.

100

Tomado de:

CARACTERÍSTICAS FÍSICAS, HEMATOLÓGICAS Y QUÍMICAS DE LA SANGRE DE CARNERO Miguel F. Torres, Q.B., M.A.

La sangre desfibrinada y estéril de diversos animales, se ha utilizado desde el siglo XIX como enriquecimiento para el cultivo de diversas bacterias patógenas. El agar sangre como se utiliza hoy en día, fue introducido por primera vez en Francia en 1903, por Bezançon y Griffon. Posteriormente en 1919, Brown demostró la exactitud de la sangre ovina para clasificar al género Streptococcus según el tipo de hemólisis. En vista de la comprobada utilidad de la sangre de carnero en la bacteriología del Laboratorio Clínico actualizado, es conveniente conocer las características de la sangre en la especie Ovis aries (oveja/carnero). Para este propósito, debe compararse con la sangre humana. La revisión de literatura especializada, indica que el peso específico, viscosidad relativa, presión osmótica y punto de congelación son idénticos a la sangre humana. Las principales características hematológicas de la sangre de carnero completa, son: hemoglobina 9-15 g/dl (promedio: 11.5); hematocrito 27-45% (promedio: 35); glóbulos rojos 9-l5 millones/mm3 (promedio: 12); leucocitos

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4,000-12,000/mm 3 (promedio: 8,000); linfocitos 62%; velocidad de sedimentación 0.5 mm/hr. Los valores de hemoglobina y hematocrito disminuyen con la edad y se elevan cuando el animal está excitado. Los glóbulos rojos ovinos son más pequeños que los humanos. La membrana celular de los pequeños eritocitos de carnero es muy susceptible a la acción de las hemolisinas bacterianas. Esto es especialmente cierto en el caso de las estreptolisinas O y S de Streptococcus pyogenes. Esta característica aunada a su fragilidad ligeramente mayor en comparación a los eritrocitos humanos, hace que los eritrocitos ovinos sean excelentes indicadores de hemólisis in vitro. La sangre de carnero presenta velocidad de sedimentación mucho menor en comparación con la sangre humana. Esta característica es deseable, ya que los eritrocitos de la sangre desfibrinada, suspendidos en su propio suero y almacenados en refrigeración durante menos de 21 días, no se compactan tanto como en el caso de la sangre humana. Esto permite que se preserven mejor. Se sabe que el aumento de glucosa en el suero de la sangre desfibrinada utilizada para enriquecer medios de cultivo sólidos, es inversamente proporcional al diámetro de los halos de hemólisis. Por este motivo su bajo contenido de glucosa es la característica bioquímica que hace a la sangre ovina ideal para demostrar los amplios y típicos halos de hemólisis alrededor de las colonias productoras de hemolisinas. Los valores normales se encuentran en el rango de 30 a 57 mg/dl. El resto de los valores químicos es muy similar a la sangre humana, excepto en el caso del ácido úrico, que es muy bajo en los carneros. El rango normal de esta sustancia oscila entre 0.05 y 1.9 mg/dl.

Tomado de:

¿POR QUÉ SANGRE DE CARNERO EN EL LABORATORIO CLÍNICO? Por Miguel F. Torres, QB, MA. Guatemala, 1992.

102

VENTAJAS DEL USO DE LA SANGRE DE CARNERO EN EL LABORATORIO CLÍNICO La palabra hemólisis deriva del griego ηαιµα (haima=sangre) y λψσισ (lysis=disolver). Se refiere a la acción de ciertas bacterias sobre los glóbulos rojos. La ruptura eritrocítica la provocan toxinas protéicas llamadas por su efecto hemolisinas. Muchas bacterias producen hemolisinas, pero probablemente la única que provoca hemólisis in vivo sea la toxina alfa de Clostridium perfringens, la cual es una alfa lecitinasa que causa lisis de la lipoproteína de la membrana celular del eritrocito humano (aparte de la hemólisis causada por anticuerpos o drogas en presencia de complemento). En Streptococcus pyogenes, una citolisina thiol-activada, llamada estreptolisina -O (oxígeno lábil), altera la permeabilidad de la membrana eritrocítica al unirse con el colesterol. Esto provoca destrucción completa de los eritrocitos, y su efecto macroscópico es llamado hemólisis beta. La estreptolisina -S (oxígeno estable) también causa hemólisis beta en presencia de oxígeno en la superficie del agar sangre. Las reacciones hemolíticas, así como los crecimientos bacterianos típicos y exuberantes, son fundamentales en el diagnóstico bacteriológico. Debe usarse sangre de carnero para preparar el agar al 5% y obtener las siguientes ventajas técnicas:

1 2 3

Debido a que los eritrocitos de la especie Ovis aries (carnero: macho, oveja: hembra y cría: cordero) son sumamente susceptibles a la acción de las hemolisinas bacterianas, se incrementan considerablemente las hemólisis de tipo beta. Se evitan reacciones hemolíticas dudosas, que dificultan la interpretación de los cultivos, pues en agar sangre de carnero se diferencian perfectamente las hemólisis verdosas de tipo alfa, de las reacciones de hemólisis completa tipo beta. En los cultivos de garganta es muy importante su uso, pues la sangre de carnero por su bajo contenido de nucleótidos de piridina (factor V) es inhibitoria para Haemophilus haemolyticus, que produce colonias idénticas a Streptococcus pyogenes, por lo que evita falsos positivos.

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4 5

La sangre de carnero desfibrinada asépticamente, no contiene anticoagulantes (como la sangre vencida de Banco), ni anticuerpos contra las bacterias patógenas del hombre o antibióticos, por lo que en general permite mejores crecimientos. Se evita manipular volúmenes considerables de sangre humana, por lo que se anula el riesgo de contraer SIDA, hepatitis B y otras infecciones humanas, durante la preparación del agar sangre.

Referencia: Torres, M.F. 1986. Estandarización de la Bacteriología Médica en Guatemala (Conferencia magistral). En: Memorias, III Congreso Nacional de Microbiología, página 20. Guatemala 2-6 diciembre.

104

CAPÍTULO 9 CULTIVOS DE GARGANTA ESPECIALES PROPÓSITO: Demostrar por medio de cultivo la presencia de dos bacterias que solamente deben investigarse en casos especiales y justificados: 1.

Corynebacterium diphtheriae: es la bacteria causante de la difteria. Debe investigarse solamente en pacientes cuya sintomatología clínica es compatible con esta infección. Los síntomas de la difteria laríngea son: formación de pseudo-membranas (pellejos) de color gris en la garganta, que sangran mucho al desprenderse, fiebre y el paciente se encuentra severamente intoxicado (debido a la potente toxina que produce la bacteria). Actualmente en Latinoamérica la difteria es muy rara, debido a la efectividad de la vacuna llamada “triple” o DPT (difteria, pertusis, tétanos).

2.

Neisseria meningitidis: es la bacteria causante de severa y muy contagiosa meningitis (infección de las membranas que cubren el cerebro), y por lo tanto se investiga principalmente en líquido cefalorraquídeo. Su presencia debe investigarse por cultivo de garganta en parientes, médicos, enfermeras, o técnicos de laboratorio que han estado en contacto directo con pacientes (generalmente niños) con meningitis meningocóccica. A estas personas se les llama “contactos”. El propósito fundamental es erradicar la bacteria de la garganta de los contactos con tratamiento antibiótico adecuado, para evitar la diseminación de la infección que puede llegar a ser epidémica. INVESTIGACIÓN DE Corynebacterium diphtheriae:

MUESTRA Y PROCEDIMIENTO: El diagnóstico de la difteria es primordialmente clínico. De ninguna manera es aceptable que el médico delegue esta responsabilidad en el laboratorio de microbiología, por medio de un frote de exudado faríngeo coloreado con Gram. C. diphtheriae es un bacilo gram-positivo en forma de “maza” (un extremo más 105

ancho que otro). En el frote Gram de material tomado directamente de las pseudo-membranas de la garganta. No puede diferenciarse de otros “difteroides” de igual morfología. Proceder a tomar la muestra así: 1.

Debe contarse con buena iluminación (lámpara portátil de mano), para poder examinar bien la garganta. Deprimir la lengua con bajalenguas de madera estéril, y buscar áreas necróticas o grisáceas (pseudo-membranas). Con un hisopo estéril, frotar firmemente las lesiones descritas. Retirar el hisopo de tal manera que no toque las paredes internas de los carrillos, ni la lengua.

2.

Inocular con el hisopo, un tubo de medio inclinado de Loeffler (suero animal más caldo glucosado, coagulado). Este medio debe ser color crema pálido. Incubar aeróbicamente a 36° C durante 18 a 24 horas.

3.

Tomar de nuevo muestra con otro hisopo, e inocular una caja de agar chocolate-telurito de potasio. Incubar aeróbicamente a 36° C por 18 a 24 horas.

4.

Tomar un tercer hisopo de las pseudo-membranas, e inocular directamente una caja de agar sangre de carnero al 5%, con cortadas, para investigar la presencia de Streptococcus pyogenes. Incubar en jarro húmedo con candela a 36° C.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: El objeto del medio de Loeffler es permitir que C. diphtheriae crezca más abundantemente que la microbiota de la garganta, sólo durante las primeras ocho horas de incubación, y sobre todo con su morfología típica. Proceder así: 1.

Después de incubar el tubo de Loeffler solamente de dos a ocho horas a 36° C, preparar dos frotes del leve crecimiento. Al efectuar los frotes, tratar de remover lo menos posible el escaso crecimiento al suspenderlo en una pequeña gota de agua, pues es necesario preservar la forma de agrupación típica de C. diphtheriae.

106

2.

Colorear un frote con Gram. Fijar el otro frote con calor leve a la llama, y teñirlo un minuto con azul de metileno de Ziehl-Neelsen.

3.

Buscar en el frote Gram: bacilos gram-positivo pleomórficos y en forma de maza. Se agrupan en forma de “letras chinas” o en ángulos en forma de “V” o “Y”. No se agrupan en empalizadas (paralelos) como otros difteroides.

4.

En el frote coloreado con azul de metileno, se observa el mismo tipo de agrupación y además coloración discontinua en forma de bandas azules causada por los corpúsculos metacromáticos de polimetafosfato, que son reservas alimenticias de la bacteria.

5.

Después de 18 a 24 horas de incubación, C. diphtheriae forma en el medio agar chocolate-telurito colonias de color negro intenso. Un frote Gram de estas colonias revela bacilos gram-positivo pleomórficos. No descartar como negativo antes de 48 horas de incubación. Si la morfología de las colonias negras no es muy típica en el agar chocolate-telurito, pero si las hay en el Loeffler, hacer un pasaje de una asada del crecimiento en Loeffler a otra caja de chocolate-telurito para confirmar.

6.

C. diphtheriae es catalasa y nitratos positivo. Para efectuar estas pruebas, subcultivar las colonias negras del chocolate-telurito, a agar sangre de carnero. Al obtener cultivo puro con morfología compatible en Gram, suspender sobre un porta objetos una asada del crecimiento en una gota de agua oxigenada, y observar la aparición de burbujas de oxígeno. Debe tenerse la precaución de tomar solamente del crecimiento y no del medio de cultivo, pues sangre o suero dan reacciones positivas falsas de catalasa. La prueba de reducción de nitratos a nitritos, puede hacerse en caldo nitratado, si se cuenta con él y los reactivos necesarios, pero no es indispensable.

INFORME: 1.

Si la morfología del crecimiento en Loeffler (incubado sólo de 2 a 8 horas) es muy típica, y no se cultivó en chocolate-telurito, informar: Se aisló un bacilo gram-positivo, de morfología compatible con Corynebacterium diphtheriae.

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2.

Si la morfología microscópica del crecimiento en Loeffler es típica y hay colonias negras en chocolate-telurito, reportar: Se aisló Corynebacterium diphtheriae. Identificación preliminar, pendiente de demostrar la producción de toxina in vitro o in vivo.

INVESTIGACIÓN DE Neisseria meningitidis EN CULTIVOS DE GARGANTA DE CONTACTOS: MUESTRA Y PROCEDIMIENTO: Neisseria meningitidis sobrevive pobremente en el medio ambiente y su único hospedero es el hombre, por lo tanto los portadores humanos son el principal reservorio. La transmisión ocurre por contacto directo con secreciones respiratorias, o por pequeñas gotas suspendidas en el aire, que acarrean la bacteria. El porcentaje promedio de portadores de N. meningitidis en la orofaringe y nasofaringe es de 5 a 15 por ciento, y usualmente sólo durante algunas semanas en cada individuo. En un pequeño porcentaje de personas, la bacteria se disemina de la nasofaringe hasta el torrente circulatorio, y produce meningococcemia, meningitis, o ambas. Además de los síntomas de meningitis, en el 75 por ciento de los casos, hay profundos efectos vasculares, que provocan petequias o exantema purpúrico, lo que ayuda al diagnóstico clínico, que debe ser confirmado siempre por Bacteriología. El cultivo de garganta/nasofaringe para el aislamiento de N. meningitidis, debe obtenerse exclusivamente de “contactos” (personas que han tenido contacto directo con algún paciente en el cual se ha demostrado la presencia de la bacteria en su líquido cefalorraquídeo). Se logra mayor porcentaje de aislamientos si la muestra se obtiene de la nasofaringe en lugar de la garganta. De ninguna manera es un procedimiento de rutina. Proceder así: 1.

Con hisopo estéril y buena iluminación, frotar firmemente el fondo de la garganta. Si es posible, usar un hisopo largo y curvo, que llegue lo más profundo posible. Con otro hisopo delgado y curvo, tomar muestra de la nasofaringe (por la nariz).

2.

Con cada hisopo por separado, inocular un tubo del medio ThayerMartin; estriar bien la superficie del medio con el mismo hisopo.

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3.

Introducir los tubos, con el tapón de rosca ligeramente flojo, dentro de un jarro con candela encendida y humedad. Incubar por 18 a 24 horas a 36° C.

INTERPRETACIÓN: 1.

Después del período de incubación, observar el crecimiento de colonias pequeñas, grises, brillantes y ligeramente mucosas.

2.

Con el asa en hilo, y con mucho cuidado, hacer un pequeño frote Gram de las colonias sospechosas; deben observarse diplococos gram-negativo en forma de “granos de café”, agrupados en parejas.

3.

Para obtener un cultivo puro, subcultivar las colonias que presentan esta morfología microscópica a una caja de agar chocolate (sin inhibidores), e incubar en jarro con candela por 18 a 24 horas.

4.

Efectuar la prueba de oxidasa, ya sea agregando el reactivo directamente sobre la caja, o frotar las colonias con palillo de madera sobre discos húmedos con el reactivo de oxidasa. La aparición de coloración morado oscuro-negro, indica una prueba positiva. Si este es el caso, proceder a efectuar la prueba de oxidación de maltosa y sacarosa, según se indica en el capítulo de secreciones genitales. N. meningitidis oxida la maltosa, pero no la sacarosa (sucrosa). Neisseria lactomica que también crece en el medio Thayer-Martin y tiene interés clínico, debe identificarse con la oxidación positiva de la lactosa.

5.

Desde el punto de vista epidemiológico, es muy conveniente saber a cual grupo pertenece el aislamiento (A,B,C,D,X,Y,Z, y otros). Por este motivo, si el laboratorio no cuenta con los antisueros de tipificación, debe remitir el cultivo en agar chocolate (bien sellado) al laboratorio nacional de referencia correspondiente.

INFORME: Si todas las pruebas anteriores son positivas, y se está seguro que no se trata de una Neisseria sp. o Branhamella catarrhalis, tan frecuentes en la microbiota normal de la garganta, informar: Se aisló Neisseria meningitidis. Si se cuenta con los antisueros de tipificación, realícela e informe: Se aisló Neisseria meningitidis del grupo __. (según el que haya aglutinado) 109

Fotografías a Color

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FOTOGRAFÍAS Foto 1. Listeria monocytogenes, en contraste de fases. Los bacilos aparecen incoloros y brillantes . No es una coloración, ésta técnica de observación en fresco proporciona excelente contraste. Foto: CDC, Atlanta, Georgia, EUA. Foto 2. Listeria monocytogenes, coloración de Gram. Aislamiento de líquido cefalorraquídeo. Bacilos regulares de coloración sólida. Presentan el típico color morado negruzco las bacterias gram-positivo. Foto: Walter Reed Institute, Washington, D.C., E.U.A. Foto 3. Staphylococcus aureus, coloración de Gram de cultivo puro obtenido de secreción de herida infectada. Son cocos esféricos de una micra de diámetro, agrupados en forma de racimos. Foto: Walter Reed Institute, Washington, D.C., E.U.A. Foto 4. Streptococcus pyogenes, frote Gram de secreción de oreja necrótica. Presenta abundantes cocos gram-positivo pequeños y ligeramente ovalados, sueltos, en parejas y cadenas cortas. Infección infantil mortal, Laboratorio de Microbiología, Hospital General del IGSS zona 9, agosto de 1982. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala. Foto 5. Streptococcus pneumoniae, frote Gram de esputo purulento de paciente con neumonía lobar. Imagen típica de esta bacteria: cocos gram-positivo agrupada en parejas. Foto: Institut Pasteur, París, Francia. Foto 6. Streptococcus pneumoniae, frote de sedimento de líquido cefalorraquídeo (LCR) de paciente con meningitis grave. Presenta abundantes cocos gram-positivo ovalados; se insinúa la cápsula como un halo claro difuso alrededor de las células. Aparecen dos leucocitos polimorfonucleares (gram-negativo). Foto: Rubén Mayorga Peralta, Guatemala. Foto 7. Escherichia coli, frote Gram de cultivo puro obtenido de urocultivo positivo. Bacilos gram-negativo, regulares, de coloración sólida y bordes redondeados. Esta morfología es típica en las enterobacterias. Foto: Walter Reed Institute, Washington, D.C., E.U.A. Foto 8. Bacteroides fragilis, coloración de Gram de cultivo puro. Presenta coloración rojo pálido (típica de los anaerobios gram-negativo) y pleomorfismo. Foto: Anaerobe Laboratory, Virginia Politechnic Institute, Blacksbourg, E.U.A. Foto 9. Shigella flexneri, Salmonella enteritidis y Escherichia coli en Agar Hektoen Enterics. Este medio selectivo para bacilos gram-negativo, brinda buena diferenciación. Las colonias de bacterias lactosa-positivo como E. coli presentan color salmón; las lactosa-

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negativo como Shigella spp. dan colonias puntiformes color verde pálido. Las colonias productoras de ácido sulfhídrico como Salmonella spp. manifiestan color negro en la colonia. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala. Foto 10. Arizona hinshawii y Escherichia coli en MacConkey (izquierda) y Hektoen (derecha). Cultivo mixto de miositis necrotizante severa en un paciente pediátrico, Hospital General del IGSS zona 9, 1982. Este cultivo semeja un coprocultivo positivo a Salmonella enteritidis. En MacConkey las colonias lactosa-positivo son rojas y las lactosanegativo incoloras. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala. Foto 11. Reacciones típicas de Salmonella enteritidis en TSI/LIA. TSI (abajo): superficie alcalina (rojo), fondo ácido (amarillo, oculto por el precipitado negro), presenta abundante gas (burbuja y fondo separado) y ácido sulfhídrico (negro). El LIA (arriba) es alcalino/alcalino (violeta), lo que indica descarboxilación del aminoácido lisina, también presenta precipitado negro debido al ácido sulfhídrico. Foto: CDC, Atlanta, E.U.A. Foto 12. Reacciones típicas de Shigella flexneri en TSI/LIA. TSI (abajo): superficie alcalina (rojo), fondo ácido (amarillo), no presenta gas ni ácido sulfhídrico. El LIA (arriba) es alcalino/ácido (K/A), sin gas ni ácido sulfhídrico. En Shigella spp. frecuentemente el color del fondo de ambos tubos es amarillo canario y el TSI huele a semen. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala. Foto 13. Reacciones de tres enterobacterias en TSI. De izquierda a derecha: medio no inoculado (K/K), Escherichia coli (A/A,++,-), Salmonella enteritidis (K/A, +,+++) y Salmonella typhi (K/A,-,+poco). Foto: CDC, Atlanta, E.U.A. Foto 14. Vibrio cholerae 01 en agar TCBS. Cultivo de heces de paciente guatemalteco con cólera enriquecido en agua peptonada alcalina (APA), luego sembrada en TCBS. Colonias típicas: grandes, aplanadas y amarillas (sacarosa-positivo). Foto: Miguel F. Torres, Guatemala. Foto 15. Efecto del enriquecimento de coprocultivo en APA para el aislamiento de Vibrio cholerae 01. Izquierda: cultivo en TCBS de enriquecimiento en APA, muestra crecimiento puro y masivo. Derecha: cultivo de heces sembradas directamente en TCBS, sin enriquecimiento, presenta crecimiento más escaso de cultivo mixto. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala. Foto 16. Prueba de susceptibilidad según el método de Bauer-Kirby. El biotipo eltor de Vibrio cholerae 01 es resistente al disco de 50 UI de Polimixina-B, que se observa en el centro. Fotografía: Miguel F. Torres, previamente publicada en Torres, M. et al. 1991. Etiología y Diagnóstico de Laboratorio de el Cólera. OPS/OMS, Guatemala.

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Foto 17. Urocultivo positivo a Klebsiella pneumoniae, más de 100,000 UFC/ml, en agar MacConkey sembrado con de 0.001 ml de orina con asa calibrada de platino. Muestra colonias grandes y muy mucosas debido a la presencia de cápsula. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala. Foto 18. Urocultivo positivo a Escherichia coli, más de 100,000 UFC/ ml, en agar MacConkey. Esta imagen es la más frecuente en urocultivos positivos. Las incontables colonias son rojas, brillantes y de bordes enteros. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala. Foto 19. Streptococcus pyogenes, sub-cultivo sobre agar sangre de carnero al 5%, con un disco de bacitracina. Este cultivo fué incubado en jarro húmedo con candela a 37 grados centígrados por 24 horas. Se observa claramente la inhibición del crecimiento provocada selectivamente por este antibiótico, como un halo rojo (sin destrucción de los eritrocitos ovinos) alrededor del disco. En el crecimento de esta bacteria se observa intensa hemólisis de tipo beta. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala. Foto 20. Streptococcus pyogenes, prueba de CAMP negativa; siembra sobre agar sangre de carnero. Las estrías verticales de Staphylococcus aureus de doble zona de beta hemólisis presentan crecimiento blanco. Las estrías perpendiculares de varias cepas de S. pyogenes son beta hemolíticas, pero la hemólisis no se incrementa en forma de flecha donde el crecimiento de ambas bacterias se acerca sin tocarse. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala. Foto 21. Crecimiento de Streptococcus pneumoniae, cultivo de LCR en agar sangre de carnero. Las colonias típicas son pequeñas, redondas, planas, de bordes enteros y francamente alfa hemolíticas. Las colonias jóvenes son elevadas; a medida que el cultivo envejece, las colonias se aplastan y su centro se deprime debido a la acción de enzimas autolíticas; esto no ocurre con otros estreptococos viridans.La típica hemólis alfa se incrementa al incubar en microaerofilia con jarro húmedo con candela. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala. Foto 22. Sub-cultivo del crecimiento original de la foto anterior con disco de optoquina. El halo de inhibión mayor de 14 mm de diámetro, identifica presuntivamente a Streptococcus pneumoniae. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala. Foto 23. Cultivo de esputo en agar sangre de carnero, de paciente guatemalteco con neumonía lobar causada por Streptococcus pyogenes. Las cepas muy virulentas que poseen cápsula gruesa, presentan colonias mucosas como las de éste caso. Las colonias confluentes presentan la típica hemólisis tipo alfa. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala. Foto 24. Sub-cultivo del crecimiento mucoso de la foto anterior, con un disco de optoquina. Se observa un amplio halo de inhibición del cultivo por el hidrocloruro de

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etil cupreína (optoquina, derivado de la quinina). Las cepas mucosas dan también las reacciones típicas de inhibición y alfa hemólisis. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala. Foto 25. Haemophilus influenzae, prueba de satelitismo de sub-cultivo de aislamiento de LCR. Paciente guatemalteco de un año con meningitis mortal. H. influenzae crece sólo muy cerca de la estría de Staphylococcus aureus. En el agar sangre de carnero el factor V (nucleótidos de piridina o nicotinamida adenina dinucleótido) se encuentra dentro de los eritrocitos, el factor X (hemina) sí se encuentra libre en el medio. S. aureus libera factor V, por lo que causa satelitismo de ciertos Haemophilus spp. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala. Foto 26. Shigella dysenteriae tipo 1 (Bacilo de Shiga). Prueba de susceptibilidad según el método de Bauer-Kirby, de una cepa aislada en INCAP (Instituto de Nutrición de Centroamérica y Panamá, Guatemala) durante la epidemia de shigellosis 1969-70. Foto: Leonardo J. Mata, Costa Rica. Foto 27. Demostración del método para preparación de frotes de esputo entre dos portaobjetos. M. Torres y sus estudiantes en el curso Bacteriología II, Laboratorio de Microbiología, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, USAC, 1979. Foto: anónima. Foto 28. Mycobacterium tuberculosis en frote de esputo coloreado con la técnica de ZiehlNeelsen. Los bacilos alcohol-ácido resistentes aparecen teñidos de color rojo. La coloración de Kinyoun da los mismos resultados. Foto: Gillies R.R. y T.C. Dodds, Inglaterra. Foto 29. Colonias de Mycobacterium tuberculosis, acercamiento con microscopio estereoscópico. Este tipo de colonias rugosas y de bordes irregulares, son llamadas “eugónicas”. No presentan pigmento. Foto: CDC, Atlanta, E.U.A. Foto 30. Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, con factor cordón. Las cepas más virulentas de M. tuberculsis manifiestan esta característica. Se observa el crecimiento en forma de cordones sinuosos. Foto: Rubén Mayorga Peralta. Foto 31. Mycobacterium kansasii, crecimiento eugónico en el medio de Lowenstein-Jensen. Fué cultivado en la oscuridad por varias semanas, con el tubo cubierto por papel negro de manera que no tuviera contacto con la luz. No presenta pigmento. Foto: CDC, Atlanta, E.U.A. Foto 32. Mycobacterium kansasii, cultivo en Lowenstein-Jensen después de exposición a la luz. Es fotocromógeno, es decir que presenta pigmento anaranjado fuerte sólo en presencia de luz. Foto: CDC, Atlanta, E.U.A.

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CAPÍTULO 10 CULTIVO DE ESPUTO PROPÓSITO: Demostrar por medio de frote coloreado con Gram y cultivo, la presencia de bacterias causantes de infección respiratoria inferior. La neumonía bacteriana, o infección del pulmón causada por bacterias puede ser de dos tipos: a. b.

Neumocóccica: causada por Streptococcus pneumoniae. No neumocóccica: causada por Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae, y ocasionalmente por otras bacterias.

MUESTRA: La infección bacteriana de tráquea y bronquios produce abundante esputo. Debe obtenerse el primer esputo de la mañana, pues es más espeso y no está contaminado por comida. Indicar al paciente que al despertar, se enjuague la boca con agua corriente (sin usar antisépticos ni pasta dental) y luego acostado en su cama (boca abajo) debe desgarrar esputo con fuerza, y depositarlo directamente en un recipiente estéril de boca ancha proporcionado por el laboratorio. Para este propósito, el laboratorio debe contar con recipientes estériles de plástico, descartables. Si no se cuenta con este material, deben esterilizarse suficientes frascos de vidrio, pequeños y de boca ancha. En el caso del cultivo de esputo, para obtener resultados confiables, es crucial la obtención de una buena muestra. Si el cultivo se efectúa de material inadecuado como saliva, el resultado confundirá al médico tratante porque no se detectó el verdadero patógeno, o se recuperó de la microbiota de la saliva un patógeno potencial que no es el agente etiológico primario de la neumonía. Por este motivo, el laboratorio deberá rechazar sin vacilar las muestras que se consideren insatisfactorias, según los criterios que aparecen más adelante. Aproximadamente 1 a 3 ml de esputo mucopurulento son suficientes para efectuar el frote Gram y cultivo de rutina, pero son insuficientes para el cultivo de

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micobacterias (BK). Si la muestra no se va a procesar de inmediato, debe refrigerarse por no más de tres horas. Debe ponerse atención en el color, olor y consistencia del esputo. Las muestras hialinas y completamente líquidas deben rechazarse de inmediato pues no son esputo, son saliva. Una muestra de esputo muy tenaz y adherente puede indicar la presencia de Klebsiella pneumoniae. Mal olor indica la presencia de anaerobios, pero el esputo nunca debe cultivarse para anaerobios, pues siempre van a estar presentes por el paso de la muestra a través de la boca, donde son muy abundantes. En caso de sospecharse infección pulmonar por anaerobios, debe obtenerse muestra por punción trans-traqueal. Al laboratorio pueden remitirse otras muestras que provienen del aparato respiratorio inferior, las cuales se procesan de manera similar al esputo, en busca de las mismas bacterias y además anaerobios (en caldo tioglicolato). Estas muestras obtenidas por técnicas invasivas, siempre son obtenidas por el médico neumólogo: aspirado traqueal, lavado bronquial, cepillado bronquial, biopsia bronquial, lavado bronco-alveolar, aspirado trans-traqueal, aspirado pulmonar, y biopsia pulmonar. Al procesar estas muestras, que frecuentemente son pequeñas, debe tomarse en cuenta su importancia y la dificultad de su obtención, por lo que con frecuencia son imposibles de repetir. EL FROTE GRAM DE ESPUTO: En primer lugar debe procederse a evaluar la calidad de la muestra, es decir determinar si es adecuada y confiable para ser cultivada o no. Proceder así: 1.

Vertir asépticamente el esputo en una caja de Petri estéril y colocarla sobre un fondo obscuro.

2.

Quebrar los extremos de dos aplicadores de madera estériles. Con ayuda de las puntas irregulares, seleccionar las partículas anormales: con pus (blanquecino), o sangre (rojizo).

3.

Con cuidado, colocar la partícula anormal en el extremo de un porta-objetos. Con otro porta-objetos, presionar la muestra varias veces a manera de “cortar” el esputo, y luego deslizar ambos porta-objetos uno sobre otro, para obtener dos frotes delgados.

4.

Seleccionar el mejor de los dos frotes. Dejar secar, y luego fijar con calor 122

sobre el mechero. Colorear el frote seleccionado con Gram y el otro con Ziehl-Neelsen, si así fue solicitado por el médico. 5.

Observar varios campos en el microscopio con un aumento de 100X (seco débil). Descartar el esputo si presenta: a. b.

Más de 10 células epiteliales/campo, y Menos de 25 leucocitos/campo (criterio de la Clínica Mayo, de Murray y Washington, y de Van Scoy).

En el verdadero esputo, se observan en fresco abundantes leucocitos y macrófagos alveolares. 6.

Si el esputo es aceptable para ser cultivado, ponerle una gota de aceite y observarlo con lente de inmersión, según los siguientes criterios.

INTERPRETACIÓN DEL FROTE GRAM DE ESPUTO: 1.

Al interpretar un frote de esputo coloreado con Gram, debe tenerse en cuenta que esta muestra siempre va a presentar bacterias de la microbiota de la boca. Sin embargo, deben reportarse cuantitativamente todas las bacterias observadas, según los criterios que aparecen en este manual, en la técnica e informe de la coloración de Gram.

2.

No debe sobre interpretarse la presencia de bacterias. Es muy importante detectar y reportar principalmente el tipo de bacterias que predomina. Los cocos gram-positivo usualmente se localizan alrededor de las células epiteliales.

3.

El predominio de un tipo de bacterias, permite distinguir simple colonización de infección verdadera. El médico debe relacionar estos datos con las observaciones clínicas.

4.

La morfología bacteriana observada en el esputo nunca identifica la especie (Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, etc.), el hacerlo causa errores en el tratamiento del paciente. Sin embargo, la presencia de abundantes cocos gram-positivo lanceolados, solos, en pares o cadenas cortas, cuya cápsula se insinúa pero no se tiñe con Gram, y abundantes leucocitos polimorfonucleares, permite sospechar la presencia 123

de Streptococcus pneumoniae (neumococo) como agente causante de la neumonía. 5.

Observar cuidadosamente la presencia de pequeños cocobacilos gramnegativo (Haemophilus influenzae), hongos filamentosos que son grampositivo, y filamentos gram-positivo delgados y ramificados (Nocardia asteroides o Actinomyces israelii). Los hongos intracelulares deben detectarse con la coloración de Giemsa.

6.

Los cristales de Charcot-Leyden, que provienen de los gránulos de los eosinófilos, son alargados y terminados en punta. Deben reportarse si se observan.

CULTIVO DE ESPUTO: El esputo vertido en una caja de Petri estéril (para poder seleccionar mejor la fracción de la muestra a analizar), debe procesarse así: 1.

Seleccionar con las puntas irregulares de dos aplicadores estériles de madera, las partículas anormales (con pus y/o sangre). Pasar estas partículas y unirlas en un espacio seco de la caja de Petri.

2.

Tomar la muestra seleccionada con el asa en argolla (flameada y fría) y estriar con cortadas en la superficie de una caja de agar sangre de carnero al 5%.

3.

Si aún queda muestra de la partícula seleccionada, inocular una caja de MacConkey. Si esto no es posible, seleccionar otra partícula anormal.

4.

Si el frote coloreado con Gram indica la posible presencia de Haemophilus influenzae, debe inocularse también agar chocolate.

5.

Incubar el agar sangre de carnero y el agar chocolate en jarro húmedo con candela, y el MacConkey aeróbicamente, por 18 a 24 horas a 36° C.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS E INFORME: 1.

Examinar las cajas simultáneamente, con lupa y buena luz o microscopio estereoscópico. En primer lugar, buscar en el agar sangre de carnero colonias de Streptococcus pneumoniae, con las siguientes características: 124

alfa hemolíticas (hemólisis verdosa), planas (deprimidas en el centro y con los bordes ligeramente más elevados), brillantes, transparentes, y pequeñas (menos de un milímetro de diámetro). Algunas veces las colonias de S. pneumoniae no son típicas, y pueden ser grandes (hasta 4 mm), convexas y muy mucosas (debido a la cápsula). Siempre presentan la hemólisis verdosa (alfa) característica. 2.

Con la técnica ya indicada para sub-cultivar Streptococcus beta hemolítico en cultivos de garganta, trasladar con el asa en hilo, una o dos colonias a una caja de agar sangre de carnero. Estriar en varias direcciones, y con pinzas flameadas colocar en el centro un disco de optoquina (Taxo “P” o disco “O”). Incubar en jarro con candela a 36° C por 18 a 24 horas, e interpretar así: a.

b.

Inhibición positiva (si hay halo); sólo se considera significativa una zona de inhibición mayor de 14 mm de diámetro. Reportar: Se aisló Streptococcus pneumoniae. Inhibición negativa (no hay halo); se trata de un Streptococcus alfa hemolítico (grupo viridans), no debe reportarse pues es microbiota normal.

Se ha demostrado que aproximadamente en el 45 por ciento de pacientes con neumonía neumocóccica, no se aísla la bacteria responsable. Por este motivo, un cultivo de esputo negativo, no descarta definitivamente la presencia de esta infección. 3.

Buscar colonias beta hemolíticas en el agar sangre de carnero. Si las hay, proceder de acuerdo con las recomendaciones para la identificación de Streptococcus pyogenes en el capítulo de cultivo de garganta. No efectuar antibiograma a esta bacteria, por su susceptibilidad prácticamente uniforme a la penicilina, que es el tratamiento de elección.

4.

Haemophilus influenzae crece bien en agar chocolate, presenta colonias pequeñas (frecuentemente menos de un milímetro de diámetro), brillantes y circulares. En agar sangre de carnero crece solamente alrededor de las colonias de otras bacterias (Staphylococcus aureus, etc.), a lo que se conoce como satelitismo natural, el cual de preferencia, pero no necesariamente, debe observarse con microscopio estereoscópico. Si hay duda, sub-cultivar en otra caja de agar sangre de carnero, con una estría de Staphylococcus aureus , para observar el satelitismo artificial (creci125

miento sólo muy cerca de la estría de S. aureus). El frote Gram del crecimiento de las pequeñas colonias satélites presenta predominio de cocobacilos gram-negativo, con algunas formas filamentosas. Es oxidasapositivo. 5.

Buscar en el MacConkey colonias lactosa-positivo (rojo-rosado) mucosas (bacterias capsuladas), indicativas de la presencia de Klebsiella pneumoniae. Si el crecimiento predominante son este tipo de colonias grandes, francamente mucosas, trasladar con el asa en hilo a TSI, LIA, MIO, urea y citrato e interpretar según las indicaciones en el capítulo de coprocultivo. Si las pruebas son compatibles, reportar: Se aisló Klebsiella pneumoniae.

6.

En el caso de Streptococcus pneumoniae: debe efectuarse prueba de susceptibilidad antimicrobiana a la penicilina. Cada vez aparecen más reportes en la literatura de cepas de S. pneumoniae resistentes a penicilina por la producción de beta lactamasa. Hacer la prueba para determinar la susceptibilidad a la penicilina en agar Mueller-Hinton + 5% de sangre de carnero en jarro con candela, con un disco de 1 µg de oxacilina; se interpreta como susceptible la presencia de un halo de inhibición mayor o igual a 20 mm (NCCLS, M100-56, 1995). Si es posible, detectar la producción de beta lactamasa por un método confiable. En el caso de Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, otras enterobacterias o Haemophilus influenzae (en este caso en agar chocolate), sí efectuar prueba de susceptibilidad.

7.

Debe tomarse en cuenta que en los cultivos de esputo, rara vez se obtienen cultivos puros. Identificar otras bacterias que pueden causar neumonía humana, solamente si su crecimiento predomina.

8.

El cultivo de esputo para aislar Legionella pneumophila, debe efectuarse por procedimientos especiales, y sólo en casos plenamente justificados. Para este propósito, deberá consultarse literatura especializada.

9.

Si en la interpretación del cultivo de esputo no se toman en cuenta los criterios anteriores, es un examen inútil que puede conducir a graves errores en el tratamiento del paciente. Si no se aisla S. pneumoniae o S. pyogenes (aunque sea escaso), u otras bacterias predominantes sobre la microbiota, reportar: No se aislan patógenos, desarrollan bacterias de la microbiota normal. 126

ETIOLOGÍA Y SINTOMATOLOGÍA DE NEUMONÍA Y BRONQUITIS SIGNOS Y SÍNTOMAS

BACTERIA POTENCIALMENTE ASOCIADA

Tos

Streptococcus pneumoniae

Dolor toráxico

Haemophilus influenzae

Disnea

Staphylococcus aureus

Consolidación pulmonar

Klebsiella pneumoniae y otras enterobacterias

Sonidos anormales

Legionella spp.

Disminución de sonido respiratorio

Mycobacterium spp.

Infiltrado (Rayos-X)

Fusobacterium nucleatum

Matidez a la percusión

Bacteroides melaninogenicus

Cavitación

y otros anaerobios

Empiema

127

CAPÍTULO 11 HEMOCULTIVO / MIELOCULTIVO PROPÓSITO: El hemocultivo o cultivo de sangre, sirve para detectar las bacterias que se están reproduciendo en la sangre, lo que provoca septicemia. El mielocultivo es el cultivo de médula ósea y sirve para detectar bacterias en esta muestra, especialmente Salmonella typhi. La septicemia es una de las enfermedades infecciosas más graves, por esta razón la detección efectiva y rápida de la bacteria causante, constituye una de las funciones más importantes del diagnóstico bacteriológico. La detección de bacterias en sangre o médula ósea tiene importancia diagnóstica y pronóstica. En el caso de fiebre tifoidea, causada por S. typhi, su hallazgo en la sangre, o más efectivamente en médula ósea, constituye el diagnóstico de ésta severa infección, y permite instituir tratamiento con el delicado antibiótico de elección (cloranfenicol). En condiciones normales no se detectan bacterias en la sangre. Las bacterias penetran hacia el torrente circulatorio desde sitios extravasculares, por los vasos linfáticos. Cuando las bacterias se multiplican a una velocidad que excede la capacidad del sistema reticulo-endotelial para removerlas de la sangre, ocurre la septicemia. Se diferencia de la bacteremia, que es la presencia transitoria de bacterias en el torrente circulatorio, la cual ocurre cotidianamente durante el cepillado dental, contacto sexual, etc. Actualmente existe la tendencia por usar estos dos términos (septicemia y bacteremia) indistintamente Usualmente causa septicemia una sola especie bacteriana. Sin embargo, la septicemia polimicrobiana se presenta con una frecuencia no despreciable. MUESTRA: Los síntomas del paciente que indican la necesidad de obtener un hemocultivo son: aumento súbito del pulso y la temperatura, cambios sensoriales, calofríos, postración y presión baja. La recuperación de las bacterias de la sangre depende de estos factores:

129

1.

La cantidad de sangre que se cultiva. En niños debe ser al menos 2.5 ml y en adultos usualmente 5 ml, aunque sería preferible cultivar 10 ml.

2.

La relación entre sangre y caldo de cultivo debe ser siempre 1:10, es decir sangre al diez por ciento en caldo, con el objeto de evitar la coagulación de la sangre.

3.

La presencia de inhibidores bacterianos en el suero, tales como anticuerpos, complemento o antibióticos.

4.

Los métodos de cultivo en el laboratorio de microbiología.

5.

La característica de la bacteria de ser “fastidiosa”, es decir que requiere un medio de cultivo enriquecido y complejo.

El hemocultivo debe obtenerse siempre antes de iniciar el tratamiento con antibióticos. No es crucial obtener la muestra de sangre cuando sube la temperatura del paciente; si es posible, deberá tomarse antes del alza esperada de temperatura o inmediatamente después del calofrío. En algunos casos, se justifica obtener varias muestras del paciente, en tiempos y de sitios diferentes, es decir “seriado”. Los hemocultivos seriados, obtenidos antes de la antibioticoterapia, son especialmente útiles en el caso de sepsis aguda, meningitis, osteomielitis, neumonía bacteriana, pielonefritis y endocarditis. Debido a que la piel humana normal está constantemente cubierta de abundante microbiota, es muy importante tomar la muestra con precauciones especiales. Para obtener la muestra no es necesario utilizar “campo estéril”, pero sí observar todas las indicaciones necesarias para la toma aséptica de la muestra. Al obtener la sangre para hemocultivo, deben seguirse cuidadosamente las siguientes instrucciones: 1.

Destapar el frasco con caldo de hemocultivo, para descubrir el tapón de hule perforable. Dejar la tapadera a un lado, y con un algodón empapado en solución de yodo al 3 por ciento en alcohol (tintura), limpiar bien el tapón perforable. Dejar secar mientras se atiende al paciente.

2.

Colocar la ligadura en el brazo del paciente, luego palpar la vena y localizar con precisión el sitio donde se va a puncionar.

3.

Es una buena práctica rutinaria lavar con agua y jabón el brazo del 130

paciente, antes de aplicar desinfectantes. Limpiar el sitio exacto con un algodón empapado en tintura de yodo al 3 por ciento. Dejar secar y luego limpiar el sitio de punción con un algodón empapado en alcohol, con movimientos circulares en forma de espiral que se inicia en el sitio de punción. Después de esta prepación no se debe volver a tocar la vena. 4.

Con aguja y jeringa estériles, puncionar la vena y obtener asépticamente 5 ml o más de sangre.

5.

Nunca debe cambiarse aguja después de obtener la sangre, excepto cuando se falla en el intento de hacerlo, y se punciona en otro sitio. Inyectar exactamente 5 ml de sangre en el frasco que contiene 45 ml de caldo, o 10 ml en un frasco con 90 ml de caldo. En los hemocultivos pediátricos, inyectar 2.5 ml de sangre en 25 ml de caldo.

6.

El caldo preparado comercialmente que debe usarse, es el caldo thiol, especialmente diseñado para efectuar hemocultivos de pacientes que pudieran haber recibido penicilina, estreptomicina o sulfonamidas. El caldo debe contener de 0.025 por ciento a 0.05 por ciento de polianetol sulfonato de sodio (SPS). Esta sustancia actúa como anticoagulante, y además inhibe la actividad bactericida del suero y la fagocitosis de los leucocitos, inactiva el complemento y neutraliza lisozimas y antibióticos aminoglucósidos. También debe tener vacío parcial y atmósfera enriquecida con anhídrido carbónico. Los frascos comerciales deben mantenerse en la oscuridad y a temperatura ambiente.

7.

En caso de no contarse con frascos o botellitas comerciales para hemocultivo, éstas pueden prepararse en el laboratorio, en recipientes de vidrio esterilizables y con doble tapón, el interno perforable. Los caldos BHI (infusión de cerebro y corazón de buey) o Tripticasa-soya dan buenos resultados. Usualmente el hemocultivo para anaerobios no se efectúa, a menos que se cuente con botellitas anaerobias comerciales; sin embargo, algunos anaerobios aerotolerantes eventualmente pueden crecer.

8.

Agitar suavemente las botellas ya inoculadas, e incubar a 36° C.

9.

Las muestras de médula ósea para efectuar el mielocultivo siempre deben ser obtenidas por el médico, quien puncionará el esternón o la cresta

131

ilíaca. Esta muestra debe procesarse exactamente igual que el hemocultivo. PROCEDIMIENTO: 1.

Incubar los hemocultivos y mielocultivos a 36° C por siete días, excepto en casos especiales en los cuales debe prolongarse la incubación, por ejemplo para el aislamiento de Brucella spp.

2.

Con mucho cuidado para que el caldo no se agite, examinar diariamente los frascos contra la luz, para buscar alguno de los siguientes signos visibles que indican crecimiento bacteriano, los cuales orientan hacia el tipo de bacteria que está creciendo: OBSERVACIONES EN HEMOCULTIVOS QUE ORIENTAN EL DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO Signo visible

Posible bacteria

Turbidez

Bacilos gram-negativo aerobios Staphylococcus spp. Bacteroides spp.

Hemólisis

Streptococcus spp. Staphylococcus spp. Listeria spp. Clostridium spp. Bacillus spp.

Formación de gas

Bacilos gram-negativo aerobios Anaerobios

Colonias visibles como “motas de algodón”

Staphylococcus spp. Streptococcus spp.

Formación de película

Pseudomonas spp. Bacillus spp. Levaduras

Formación de coágulo gelatinoso

Staphylococcus aureus

Coloración verdosa (raro)

Pseudomonas aeruginosa

132

3.

En caso de observar cualquiera de estas características, agitar suavemente, limpiar el tapón perforable con algodón y alcohol, puncionar con jeringa y aguja estériles (puede ser de tuberculina) y aspirar una pequeña cantidad del caldo. Inocular una gota, y luego estriar con asa sobre una caja de agar sangre de carnero y una caja de agar chocolate; incubar ambas cajas en jarro con candela. Es aconsejable sembrar tres gotas del hemocultivo, pero sólo estriar una. Si no se observa crecimiento en las gotas no rayadas y lo hay en las estrías, posiblemente se trata de contaminación. Simultáneamente, dejar secar dos gotas del caldo sobre un porta-objetos; colorear con Gram.

4.

Observar cuidadosamente el frote Gram con lente de inmersión, pues la observación de las bacterias es la base de su caracterización. Además, algunas bacterias como Haemophilus influenzae no producen signos visibles en el caldo. Si se observan bacilos o cocobacilos gram-negativo, inocular adicionalmente una caja de agar MacConkey; incubar aeróbicamente. Esto es especialmente importante para el aislamiento e identificación de Salmonella typhi.

5.

Si se observan cocos gram-positivo esféricos y con tendencia a agruparse en racimos, inocular una caja de agar manitol-sal, para facilitar el aislamiento e identificación de Staphylococcus aureus. Si se observan diplococos o cadenas cortas de cocos gram-positivo ovalados, aplicar los discos de optoquina y bacitracina sobre la segunda estría del agar sangre de carnero, para acelerar la identificación presuntiva de Streptococcus pneumoniae y Streptococcus pyogenes.

6.

Rutinariamente, revisar los hemocultivos y mielocultivos aparentemente negativos. Proceder así: hacer asépticamente un frote Gram del caldo a las 48 horas, y también al séptimo día de incubación. La incubación prolongada puede producir una leve turbidez de fibrina.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS; 1.

Con siete días de incubación a 36° C se recupera el 95 por ciento de las bacterias clínicamente significativas. Identificar los crecimientos bacterianos según el caso, con las técnicas descritas. Si se observa en MacConkey el crecimiento de colonias lactosa-negativo sospechosas de Salmonella typhi, aglutinar inmediatamente el crecimiento en agar sangre de carnero, con antisuero polivalente anti-Salmonella, anti-Salmonella 133

grupo D, y anti-antígeno Vi. Si hay aglutinación franca, reportar inmediatamente la presencia de Salmonella typhi. 2.

Algunas bacterias frecuentes en hemocultivos positivos, son las siguientes: -

3.

Salmonella typhi Escherichia coli Streptococcus pneumoniae Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Pseudomonas aeruginosa Haemophilus influenzae

Algunas bacterias que frecuentemente crecen en hemocultivos, como contaminantes provenientes de la microbiota de la piel, son los siguientes bacilos gram-positivo: -

Bacillus sp. (esporulado) Corynebacterium sp. (no esporulado, difteroide) ETIOLOGÍA Y SINTOMATOLOGÍA DE SEPTICEMIA

SIGNOS Y SÍNTOMAS

BACTERIA POTENCIALMENTE ASOCIADA

Fiebre en picos

Streptococcus pyogenes (grupo A) en todas las edades

Calofríos

Streptococcus alfa hemolítico (endocarditis)

Murmullo cardíaco (endocarditis) Streptococcus grupos A, B y D neonatos Petequias en piel y mucosas

Staphylococcus aureus

Hemorragia puntiforme en uñas

Streptococcus pneumoniae

Malestar

Salmonella typhi (fiebre tifoidea) Escherichia coli Bacteroides fragilis y otros anaerobios Pseudomonas aeruginosa Listeria monocytogenes Haemophilus influenzae

134

INFORME: 1.

Los hemocultivos deben reportarse como negativos si no se observan bacterias en el segundo control por coloración de Gram, a los siete días de incubación, nunca antes. Reportar así: Negativo a los siete días de incubación a 36° C.

2.

Si el hemocultivo presenta crecimiento a cualquier tiempo de incubación, reportar cuanto antes la bacteria aislada, identificada si es posible hasta especie, aunque la identificación sea presuntiva. Reportar así: Se aisló ___________ , susceptibilidad pendiente.

3.

En el caso del aislamiento e identificación de Streptococcus pneumoniae o Streptococcus pyogenes de hemocultivo, reportar así: Se aisló Streptococcus ___________ , se recomienda tratamiento con penicilina. Si se trata de S. pneumoniae si hacer la prueba de susceptibilidad a la penicilina.

4.

Después de interpretar los resultados de la prueba de susceptibilidad antimicrobiana, enviar otro reporte, así: Se aisló: ___________________ Susceptible a: ______________ Intermedio a: ______________ Resistente a: _______________

Si el laboratorio tiene capacidad económica suficiente, es conveniente utilizar el sistema para detección de bacterias por lisis-centrifugación (ISOLATOR, Laboratorios Wampole), o algún sistema automatizado para efectuar hemocultivos (por ejemplo BACTEC, Becton Dickinson).

135

CAPÍTULO 12 SECRECIONES DIVERSAS PROPÓSITO: Detectar por medio de frote Gram y cultivo aerobio, la presencia de bacterias que causan infecciones con presencia de pus en la piel, ojos, oídos, tejido subcutáneo, heridas infectadas y otros sitios anatómicos diversos. A las bacterias que provocan la formación de pus se les llama piógenas. En este tipo de infecciones, son de especial interés los llamados “cocos piógenos gram-positivo”, que son los siguientes: -

Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae

Menos frecuentemente pueden aislarse de este tipo de lesiones, otras bacterias tales como: -

Pseudomonas aeruginosa (de importancia en quemaduras infectadas) Escherichia coli Haemophilus influenzae Haemophilus aegyptius (en infecciones oculares) Neisseria gonorrhoeae Salmonella typhi (raro) Mycobacterium tuberculosis (raro)

MUESTRA: La muestra deberá obtenerse según el sitio anatómico, siempre con material estéril y antes de tratamiento con antibióticos. En la mayoría de los casos puede usarse hisopo estéril (envuelto en papel individual, no dentro de frasco). Cuando la cantidad de pus es muy escasa, tomar la muestra con el extremo puntiagudo y delgado de un aplicador de madera estéril que ha sido quebrado por los extremos. También puede usarse la punta de una asa espatulada flameada y fría, bisturí pequeño (número 15), o una lanceta estéril.

137

Debe considerarse como regla general indispensable, hacer siempre un frote para Gram, sobre un porta-objetos limpio. Es de vital importancia observar las bacterias en el frote, especialmente cuando deben interpretarse cultivos con alguna microbiota normal además de algún patógeno. 1. PIEL: Si no hay apertura por donde salga el pus, escoger una lesión intacta y “madura”, de preferencia con punta blanquecina. Limpiar el área de donde se tomará la muestra para frote Gram y cultivo, con algodón empapado en alcohol y exprimido. Limpiar bien pero con cuidado de no sacar el pus, luego con lanceta estéril o bisturí pequeño, puncionar a manera de evitar que salga sangre. Si es necesario (usar guantes de hule estériles) presionar a los lados de la lesión, hacia el centro, para “exprimir” el pus hacia afuera. Tomar una pequeña gota de pus con el asa espatulada estéril, punta de aplicador de madera estéril (quebrado) o hisopo estéril, e inocular siempre los siguientes medios de cultivo, en este orden: Primero: Agar sangre de carnero al 5% Segundo: Agar chocolate Tercero: Agar manitol-sal (en caja de Petri) Cuarto: Agar MacConkey Luego hacer un frote Gram delgado, sin frotar mucho sobre el porta-objetos. Los medios de cultivo deben inocularse con una asada de pus, en un extremo de la caja. El objeto de hacerlo en el orden indicado, es evitar el acarreo de inhibidores del MacConkey y manitol-sal, hacia el agar sangre de carnero y el agar chocolate, que no son inhibitorios. ETIOLOGÍA Y SINTOMATOLOGÍA DE HERIDAS INFECTADAS SIGNOS Y SÍNTOMAS

BACTERIA POTENCIALMENTE ASOCIADA

Secreción serosa o purulenta

Staphylococcus aureus

Absceso: subcutáneo o submucoso

Streptococcus pyogenes

Eritema y edema

Clostridium spp., Bacteroides spp. y otros anaerobios

Crepitación (gas en tejidos)

Enterobacterias

Dolor

Pseudomonas aeruginosa

Ulceración y formación de fístulas

Enterococos

138

2. OJOS: Tomar la muestra con hisopo estéril, así: bajar el párpado inferior, haciendo presión hacia abajo, a manera de exponer la conjuntiva enrojecida y purulenta (usar guantes de hule estériles). Frotar la conjuntiva al mismo tiempo que se rota el hisopo hacia afuera, con mucho cuidado de no raspar el globo del ojo. Inocular agar sangre de carnero, agar chocolate, agar manitol-sal y agar MacConkey, en ese orden. Descartar el hisopo, y con un segundo hisopo estéril, tomar más muestra. Hacer un frote pequeño sobre un porta-objetos limpio, con cuidado de no frotar excesivamente. En los cultivos oculares es muy importante incluir siempre agar chocolate, para lograr el crecimiento de las bacterias fastidiosas (difíciles de cultivar) que causan conjuntivitis. Si en el frote Gram se observan diplococos gram-negativo, inocular un tubo de medio Thayer-Martin, selectivo para N. gonorrhoeae. ETIOLOGÍA Y SINTOMATOLOGÍA DE INFECCIÓN OCULAR SIGNOS Y SÍNTOMAS Secreción conjuntival serosa o purulenta Hiperemia ocular Dolor ocular

BACTERIA POTENCIALMENTE ASOCIADA Haemophilus spp., especialmente H. aegyptius Moraxella lacunata Neisseria gonorrhoeae Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Pseudomonas aeruginosa (reportar stat)

3. OÍDOS: En los casos de otitis media, generalmente no es necesario que el médico otorrinolaringólogo puncione el tímpano (timpanocentesis). Este procedimiento jamás debe practicarse por el personal del laboratorio. Proceder así: con un hisopo empapado en alcohol, y luego exprimido con papel absorbente, limpiar bien el oído externo. Introducir en el canal auditivo otro hisopo estéril, despacio y sin tocar el pabellón de la oreja, con cuidado de no llegar al tímpano. No debe haber sangrado. Con el hisopo empapado en pus, inocular los siguientes medios: agar sangre de carnero, agar chocolate, agar manito-sal y agar MacConkey, en ese or139

den. Con un segundo hisopo estéril, tomar más muestra y sin frotar mucho, hacer un pequeño frote sobre porta-objetos limpio. ETIOLOGÍA Y SINTOMATOLOGÍA DE OTITIS MEDIA SIGNOS Y SÍNTOMAS Secreción ótica purulenta

BACTERIA POTENCIALMENTE ASOCIADA Agudo:

Dolor agudo en oído y mandíbula

Streptococcus pneumoniae

Cefalea pulsátil

Haemophilus influenzae

Tímpano rojo y abultado

Crónico: Pseudomonas aeruginosa Proteus spp. Anaerobios

4. MISCELÁNEOS: Antes de obtener la muestra, debe ponerse especial cuidado en desinfectar bien las áreas que se espera estén colonizadas por abundante microbiota. El objeto de esta operación, es evitar contaminaciones innecesarias que dificultan la interpretación del frote Gram y el cultivo. El material para tomar las muestras debe ser estéril. La toma de muestra debe ser agresiva pero cuidadosa; un hisopo frotado descuidadamente sobre una lesión seca y no de un sitio representativo, es completamente inútil. El sangrado debe evitarse en la medida de lo posible. Para la toma de muestras difíciles o invasivas, que representen peligro para el paciente, debe solicitarse la intervención del microbiólogo o del médico. Los líquidos acuosos y de volumen grande, deben centrifugarse y luego hacer frote Gram y cultivo del sedimento. Inocular el medio de Thayer-Martin si se sospecha la presencia de Neisseria gonorrhoeae, y el medio de Lowenstein-Jensen si se sospecha la presencia de Mycobacterium tuberculosis. En el capítulo 17 sobre Anaerobios, se explica que tipo de muestras deben sembrarse en anaerobiosis y como deben procesarse.

140

PROCEDIMIENTO: Teñir el frote con la coloración de Gram, según el capítulo correspondiente. Las muestras obtenidas siguiendo las instrucciones anteriores, y que fueron inoculadas directamente en un extremo de cada caja, deben diseminarse asépticamente en la superficie de los medios de cultivo. Para este propósito, usar dos asas en argolla (bien rectas y con la argolla circular y cerrada). Mientras una asa se flamea, la otra se enfría en el soporte que la mantiene vertical. Según se indicó, trabajar cerca del mechero encendido y con buena luz. Si en el frote Gram de una secreción purulenta (especialmente de piel), se observan abundantes cocos gram-positivo, ligeramente ovalados, con tendencia a agruparse en pares o cadenas cortas y acompañados de abundantes leucocitos polimorfonucleares, inocular el agar sangre de carnero con cortadas (igual que el cultivo de garganta). Luego colocar con pinzas flameadas un disco de bacitracina de 0.04 unidades en la segunda estría, para acelerar y facilitar el aislamiento e identificación de Streptococcus pyogenes. Incubar el agar sangre de carnero y el agar chocolate a 36° C en jarro con candela encendida y humedad (papel absorbente húmedo en el fondo del jarro). La boca del jarro, donde enrosca la tapadera, debe frotarse esporádicamente con la misma candela, para que la cera o parafina forme un sello. Cerrar bien el jarro, y luego sellar con “masking tape”. Incubar el agar manitol-sal y MacConkey aeróbicamente. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS E INFORME: Es importante observar el frote lo más pronto posible, ya que en base a este resultado se puede iniciar tratamiento preliminar. Observar los frotes Gram con aceite y el lente objetivo de inmersión. Es de gran importancia observar cual es la bacteria que predomina en el frote. Informar la cantidad de bactrias observadas, la cantidad de leucocitos y de qué tipo son. En el frote, los leucocitos deben observarse gram-negativo (rojos); si aparecen gram-positivo (morados), falta decoloración y debe aplicarse más alcohol-acetona. Examinar los cultivos después de 18 a 24 horas de incubación, con microscopio estereoscópico o lupa y buena luz. En el agar sangre buscar colonias pequeñas beta hemolíticas; si las hay, identificar un subcultivo en agar sangre de carnero con discos de bacitracina y trimetoprim-sulfametoxazol y prueba de CAMP. Si hay co-

141

lonias planas alfa hemolíticas (hemólisis verdosa), identificar un sub-cultivo en agar sangre de carnero con disco de optoquina para Streptococcus pneumoniae. De diversas secreciones, pueden aislarse Enterococcus spp. alfa hemolíticos o no hemolíticos, que pertenecen al grupo D de Lancefield. Son llamados “enterococos” por su probable origen fecal, y los más importantes son: E. faecalis, E. faecium, E. durans y E. avium. Sub-cultivar a agar bilis-esculina; un color negro a las 24 horas de incubación a 36° C indica hidrólisis de la esculina positiva. Debe tomarse en cuenta que esta reacción también la dan positiva E. bovis y E. equinus, que no son enterococos. Para identificar correctamente a los enterococos, debe sembrarse en un caldo con 6.5% de cloruro de sodio y observar el crecimiento halófilo (soporta la sal), antes de 48 horas de incubación, con viraje del púrpura al amarillo y turbidez. El caldo con cloruro de sodio al 6.5%, se prepara fácilmente así: Caldo tripticasa soya ......................................15 gramos Cloruro de sodio .............................................. 32.5 gramos Agua destilada .................................................50 ml Servir 6 ml en tubos con tapón de rosca, esterilizar en autoclave a 121° C por 15 minutos. Enterococcus spp. son cocos gram positivo, catalasa-negativo, se agrupan en pares y cadenas (no en racimos o tétrodos), y son halófilos (turbidez en el caldo con 6.5% de cloruro de sodio). Si se observa crecimiento de colonias grandes (más de 1 mm de diámetro), blancas o amarillentas (tanto en el agar sangre de carnero como en el manitol-sal), identificar a Staphylococcus aureus por medio de la prueba de coagulasa. Colocar en porta-objetos o caja de Petri, una gota de plasma humano citratado (del que se usa para tiempo de protrombina). Suspender allí una asada pequeña del cultivo en agar sangre de carnero. Si se observa franca aglutinación, la prueba de coagulasa es positiva; reportar: Se aisló Staphylococcus aureus, y efectuar la prueba de susceptibilidad. Si la prueba de coagulasa en lámina es dudosa, pero hay coloración amarilla alrededor de las colonias en el agar manitol-sal (acidificado por la fermentación del manitol), debe efectuarse la prueba en tubo. Proceder así: en un pequeño tubo de hemólisis, medir 0.5 ml de plasma citratado, suspender allí una asada del cultivo en agar sangre, incubar de 4 a 24 horas a 36° C. Un coágulo bien formado indica prueba positiva de coagulasa en tubo. Observar la presencia de coágulo a las 4 horas de incubación a 36° C; si no lo hay, reincubar a temperatura ambiente, para evitar la lisis del coágulo por la enzima estreptokinasa. La prueba de coagulasa en 142

tubo es más sensible y confiable, pero si la reacción da positiva en lámina es suficiente para identificar a Stapylococcus aureus, pues hay aproximadamente 96 por ciento de correlación. Si la prueba de coagulasa es negativa, y la fermenteción del manitol también es negativa (colonias rosadas en manitol-sal), puede reportarse presuntivamente Staphylococcus epidermidis o Staphylococcus coagulasa-negativo. Hacer el reporte de esta bacteria con prudencia, ya que en la gran mayoría de los casos no causa infección, pero se aisla con frecuencia pues es miembro importante de la microbiota de la piel. Si la coagulasa es negativa y la fermentación del manitol positiva, puede tratarse de Staphylococcus saprophyticus, hacer susceptibilidad a un disco con novobiocina, que debe presentar inhibición. Si es necesario, hacer pruebas adicionales según la tabla a continuación. En caso de cocos gram-positivo con agrupación en pares, paquetes o grupos de cuatro bacterias, descartar Micrococcus sp. por la prueba de OF-glucosa, es oxidativo. PRINCIPALES PRUEBAS PARA LA DIFERENCIACIÓN DE TRES ESPECIES DEL GÉNERO Staphylococcus DE ORIGEN HUMANO*

*

PRUEBA

S. aureus

S. epidermidis

S. saprophyticus

Coagulasa

+

-

-

Fermentación del manitol (producción de ácido)

+

-

+/-

DNAsa

+

-

-

Resistencia a novobiocina

-

-

+

Crecimiento en anaerobiosis

+

+

-

Hemólisis

+

-

-

Tomado de: Isada, C.M. et al.: Infectious Diseases Handbook, 1995-96.

Si hay duda entre los géneros Staphylococcus y Streptococcus, hacer la prueba de catalasa, que es positiva en el caso de los estafilococos y negativa en los estreptococos. El género Haemophilus está formado por cocobacilos gram-negativo pleomórficos, que requieren el enriquecimiento de los medios de cultivo con sangre, para poder desarrollarse. Esto se debe a que como su nombre lo indica, requieren de varios factores sanguíneos para su nutrición y reproducción. La mayor parte de los aislamientos clínicos de este género de bacterias, puede identificarse hasta 143

género por medio de la prueba de satelitismo; la diferenciación hasta especie requiere de pruebas más complejas. El crecimiento de Haemophilus spp. se logra en agar chocolate incubado en jarro con candela, pues son microorganismos microaerofílicos. Crece solamente en agar chocolate, y no en agar sangre, pues en el primero los factores de crecimiento se encuentran libres en el medio, y no dentro de los eritrocitos. Hacer la identificación de Haemophilus sp. por medio de la prueba de satelitismo, así: 1.

En agar chocolate se observan colonias muy pequeñas, puntiformes, de menos de un milímetro de diámetro, translúcidas y ligeramente mucosas. Hacer un frote Gram a estas pequeñas colonias, con cuidado de tomar sólo de ellas; predominan cocobacilos gram-negativo pequeños, casi esféricos y escasos bacilos largos y filamentosos (pleomorfismo).

2.

Tomar una asada del crecimiento en agar chocolate y estriarla en el centro de una caja de agar sangre de carnero al 5%, sólo en una dirección.

3.

En sentido perpendicular a la estría efectuada, hacer una estría de Staphylococcus aureus, recta y a lo largo de toda la caja. Esta cepa pura puede provenir de otro cultivo, o de preferencia tener una cepa típica de S. aureus, en cualquier agar inclinado en tubo, conservada en refrigeración.

4.

Incubar el agar sangre de 24 a 48 horas a 36° C en jarro húmedo con candela. Una prueba positiva de satelitismo consiste en el crecimiento de las pequeñas colonias del Haemophilus sólo muy cerca de la estría de S. aureus. Hacer frote Gram a este crecimiento satélite para confirmar la morfología.

Si en el cultivo original también hay colonias de Staphylococcus sp., enterobacterias o algunas otras bacterias, puede observarse el satelitismo natural. Este consiste en el crecimiento de las pequeñas colonias puntiformes de Haemophilus alrededor de colonias grandes. Este fenómeno se aprecia bien con el microscopio estereoscópico o lupa al efectuar la interpretación.

144

Con fines prácticos, es aceptable el reporte de los aislamientos con satelitismo positivo así: Cultivo de ojos, reportar: Se aisló Haemophilus aegyptius. Cultivo de cualquier otra secreción: Se aisló Haemophilus influenzae. Hacer susceptibilidad en agar chocolate. Diseminar sobre toda la superficie de la caja varias asadas del crecimiento en el agar chocolate original, o de colonias satélites, con mucho cuidado de no tocar la estría de S. aureus. Las enterobacterias aisladas de cualquier secreción en cantidad considerable, deben identificarse con medios diferenciales (TSI, LIA, MIO, urea y citrato), o de preferencia con el método API (Bio Merièux). Bacilos gram-negativo no fermentadores pueden eventualmente aislarse de secreciones; efectuarles antibiograma y si es posible identificarlos.

145

CAPÍTULO 13 SECRECIONES GENITALES PROPÓSITO: Demostrar la presencia de microorganismos de varios tipos que infectan los órganos genitales femeninos y masculinos, en especial los siguientes: Neisseria gonorrhoeae Bacteria, causante de la gonorrea. Treponema pallidum Bacteria, causante de la sífilis. Gardnerella vaginalis Bacteria, bacilo gram-negativo causante de vaginosis. Candida albicans Hongo levaduriforme, causante de vulvovaginitis. Trichomonas vaginalis Protozoo, causante de tricomoniasis vaginal. DIAGNÓSTICO DE GONORREA Muestra: La gonorrea es una enfermedad de transmisión sexual que en el hombre generalmente causa el aparecimiento de pus cremoso, amarillento o verdoso que sale de la punta del pene. En la mujer, este síntoma puede no ser evidente, lo que hace más difícil el diagnóstico. El agente causal de la gonorrea es la bacteria Neisseria gonorrhoeae un diplococo gram-negativo (rojo). Las neiserias presentan forma arriñonada y se agrupan en pares que semejan granos de café. El diagnóstico de laboratorio de la gonorrea consiste en la obser-

Neisseria gonorrhoeae, frote Gram de pus uretral masculino.

147

vación de la morfología típica de la bacteria en frotes Gram de pus uretral (sólo en el hombre, no así en la mujer), y en el cultivo de la bacteria Neisseria gonorrhoeae. Puede aislarse de descargas uretrales, vaginales e hisopos rectales; rara vez se aislan de heces, sangre, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, etc. Los niños que nacen de madres con gonorrea, se infectan con la bacteria al pasar por el canal vaginal durante el parto y generalmente presentan conjuntivitis purulenta. En el pus de los ojos de estos niños puede observarse y cultivarse la bacteria. La toma de la muestra es diferente en el hombre y en la mujer. Obtener la muestra antes de tratamiento, así: Hombres: 1-

Tener listo el siguiente material: hisopos estériles, porta-objetos limpios, una caja de agar sangre y una caja o botellita de medio Thayer-Martin.

2-

Pedir al paciente que se ponga de pie y con ambas manos “exprimir” el pene hacia adelante, a manera de forzar a salir el pus de la uretra.

3-

Con hisopo estéril de madera (quebrado) o palillo de dientes, tomar una gota del pus, tratando de no tocar la piel.

4-

Preparar cuidadosamente un frote delgado sobre porta-objetos de vidrio limpio, haciendo rodar el palillo o hisopo sobre la lámina, no frotar. El propósito de preparar el frote con estas precauciones es no romper los leucocitos presentes ni alterar la posición de las bacterias.

5-

Tomar una gota de pus con la punta de algodón de un hisopo estéril. Inmediatamente inocular la caja o botellita de Thayer-Martin; en botellitas frotar el hisopo en la superficie del medio desde el fondo. Simultáneamente sembrar una caja de agar sangre de carnero, para aislar otros patógenos. Transportar las muestras rápidamente al laboratorio.

Mujeres: 1-

Idealmente la muestra debe obtenerse por el ginecólogo, con la paciente acostada en posición y en cama ginecológicas, usando espéculo para separar las paredes vaginales y observar el cuello uterino. Tener listo el mismo material que para la toma de muestra masculina. 148

2-

Con la punta de algodón de un hisopo estéril tomar pus de donde se localice (usar buena luz), es decir del cuello uterino, vagina o uretra. Preparar un frote para Gram haciendo rodar el hisopo sobre un portaobjetos de vidrio.

3-

Tomar más pus con otro hisopo estéril, e inocular una caja o botellita de Thayer-Martin, y una caja de agar sangre de carnero.

Procedimiento: 1-

Colorear los frotes con Gram según la técnica ya explicada.

2-

Con asas flameadas y frías, diseminar por estrías el inóculo sobre toda la superficie de cajas o botellitas.

3-

Incubar tanto el agar sangre como el Thayer-Martin de 24 a 48 horas a 36° C en jarro húmedo con candela encendida. Si el Thayer-Martin está en botellitas, tomar la precaución de dejarlas semi-abiertas, nunca bien cerradas.

Interpretación de resultados: Gram: buscar diplococos adosados en forma de granos de café y gram-negativo (rojos). Anotar si se encuentran adentro de los leucocitos polimorfonucleares (intracelulares), o libres fuera de estas células (extracelulares). En el pus uretral masculino, la presencia de estas bacterias típicas indica gonorrea. Reportar la cantidad y clase de leucocitos observados. En los frotes masculinos, los diplococos gram-negativo intracelulares se asocian a gonorrea aguda; extacelulares se asocian a gonorrea crónica. El frote Gram endocervical es de diagnóstico limitado y correlaciona con el cultivo en Thayer-Martin en 65 por ciento de los casos. En el caso de las mujeres por lo general la imagen microscópica no es típica y se observan muchas clases de bacterias, tanto gram-positivo como gram-negativo, de la abundante microbiota normal de la vagina. Algunas bacterias de esta microbiota pueden ser idénticas a Neisseria gonorrhoeae . Por estas razones el diagnóstico de gonorrea femenina se basa en el cultivo y no en el frote Gram. Cultivo: Después de 24 a 48 horas de incubación a 36° C en jarro con candela, exami149

nar el Thayer-Martin con buena luz. Debido a que el Thayer-Martin contiene sustancias enriquecedoras que favorecen el crecimiento de Neisseria gonorrhoeae, y sustancias inhibidoras de otras bacterias, por lo general sólo crece este microorganismo en cultivo puro. N. gonorrhoeae presenta colonias pequeñas (menos de 1 mm de diámetro), translúcidas, brillantes y de bordes lisos. Hacer una coloración de Gram de las pequeñas colonias en Thayer-Martin, suspenderlas en una pequeña gota de agua destilada o solución salina fijar con calor y luego colorear. Si se observan diplococos gram-negativo, el cultivo es muy sospechoso de N. gonorrhoeae y debe efectuarse la prueba de oxidasa. Esta prueba demuestra la presencia de la enzima indofenol-oxidasa, que da al reactivo (dihidrocloruro de tetrametil-p-fenilendiamina al 1% en agua, 0.1 g en 10 ml de agua) un color morado o negro. La prueba de oxidasa puede efectuarse aplicando directamente el reactivo líquido al cultivo o sobre discos de papel filtro ya impregnados con el reactivo. Para efectuar la prueba en discos de papel, proceder así: con pinzas flameadas, colocar un disco de oxidasa en una caja de Petri vacía. Humedecerlo con una gota de solución salina. Con el asa calibrada de platino o palillo de dientes de madera tomar una o dos colonias típicas frotar este crecimiento sobre el disco húmedo. Si aparece una coloración morado-negruzco antes de 10 segundos en la parte del disco donde se frotaron las colonias, la prueba es positiva. Esta prueba debe interpretarse antes de 10 segundos, pues el oxígeno del aire puede ocasionar falsos positivos. Nunca usar el asa corriente en esta prueba, pues el alambre con hierro o nichrome causa por sí solo una reacción positiva. Efectuar la prueba con el reactivo líquido así: aplicar unas gotas del reactivo recién preparado directamente sobre la caja de Thayer-Martin, si las colonias toman rápidamente un color rosado, luego morado y luego negro, la prueba es positiva. Si se observa este viraje en el color de las colonias, o la prueba en disco es positiva, sub-cultivar inmediatamente una colonia típica sin reactivo, o una colonia al empezar a cambiar de color a una caja de agar chocolate. Incubar 24 horas a 36°C en jarro húmedo con candela. Después de incubar, hacer frote Gram al crecimiento en agar chocolate, que debe presentar diplococos arriñonados gramnegativo. Identificar la especie N. gonorrhoeae por medio de la prueba de oxidación de los tres azúcares: maltosa, glucosa y sacarosa (sucrosa) en el medio base de CTA (cistina-tripticasa agar). El medio CTA es un medio semi-sólido; al medio base estéril se le adiciona el carbohidrato en solución acuosa (esterilizado por filtración) 150

hasta una concentración de 1%. Debe prepararse en tubos 13 X 100 con tapón de rosca, inocular los tres tubos de maltosa, glucosa y sacarosa con dos asadas bien cargadas por tubo. Depositar el crecimiento masivo sólo unos pocos milímetros por debajo de la superficie del medio. Cerrar bien apretado el tapón de rosca e incubar de 48 a 72 horas a 37° C. Una coloración amarilla en la superficie del medio indica reacción positiva. Interpretar resultados según esta tabla: Diferenciación de dos especies de Neisseria de importancia clínica Especie

*

Glucosa

Maltosa

Sacarosa

Neisseria gonorrhoeae

+

-

-

Neisseria meningitidis*

+

+

-

Ver capítulo 14

Las pruebas de CTA frecuentemente dan resultados dudosos, tienen la desventaja que para preparar los medios en tubo se requiere esterilizar por filtración la solución del carbohidrato que debe ser muy puro. Es adecuado usar por lo menos sólo el tubo con maltosa, que diferencia bien las dos especies. En términos generales y según las características del trabajo bacteriológico en nuestro medio, se considera adecuado reportar (aunque sea presuntivamente) como Neisseria gonorrhoeae a aquellos aislamientos de secreciones genitales con morfología típica de Neisseria, oxidasa positivo y un frote Gram de la secreción que indique la presencia de esta bacteria. Efectuar la prueba de susceptibilidad inoculando masivamente la bacteria en cultivo puro, en la superficie de una caja de agar chocolate (base Mueller-Hinton caliente + 5% sangre de carnero). Informe: Tomando en cuenta los procedimientos y comentarios anteriores, si se está seguro aunque sea presuntivamente, reportar la presencia de N. gonorrhoeae. Debe tomarse en cuenta que un reporte de este tipo implica que el o la paciente contrajeron una infección por contacto sexual. Un error del laboratorio puede por lo tanto causar serios problemas conyugales o dejar a un paciente infectado sin tratamiento.

151

DIAGNÓSTICO DE CHANCRO BLANDO (CHANCROIDE) Muestra y Procedimiento: El chancro blando o chancroide es una infección de transmisión sexual causada por una bacteria fastidiosa (difícil de cultivar) llamada Haemophilus ducreyi. Es un bacilo pequeño gram-negativo, que en frotes de lesiones genitales o cultivos se presenta formando cadenas de 5 a 20 bacilos, paralelas entre sí o entrelazadas, por lo que se ha descrito esta agrupación característica como “cardúmenes de peces” o “huella digital”. Las lesiones en los genitales son generalmente úlceras bien circunscritas dolorosas con base necrótica y bordes socavados y blandos. De estas características se deriva el nombre de chancro blando o chancroide (similar al chancro sifilítico típico). Las lesiones rara vez son más grandes de 2 cm de diámetro, pueden haber lesiones múltiples por autoinoculación y en más de la mitad de los casos, los ganglios de la ingle están endurecidos. El diagnóstico del chancro blando se basa en las características clínicas y en el frote Gram directo de la lesión . Para efectuar el diagnóstico de laboratorio del chancro blando, proceder así: Frotar un hisopo estéril en los bordes y el fondo de la lesión y luego rodarlo cuidadosamente sobre un porta-objetos bien limpio, sólo en una dirección para no destruir la agrupación característica de la bacteria. Dejar secar, fijar con calor y colorear con Gram. Interpretación de Resultados e Informe: Observar cuidadosamente el frote Gram del material de la lesión con el lente de inmersión y aceite. Buscar bacilos gram-negativo agrupados en cadenas largas, paralelas o entrelazadas (“cardúmen de peces”), los cuales deben predominar sobre otras formas de bacterias. Si se observa esta morfología típica reportar inmediatamente así: Se observan (escasos, regular cantidad o abundantes) bacilos gram-negativo, agrupados en cadenas largas (o cortas según el caso) de morfología compatible con Haemophilus ducreyi. Esta morfología se considera presuntivamente diagnóstica de chancro blando.

152

DIAGNÓSTICO DIRECTO DE LA SIFILIS La sífilis es una enfermedad que se transmite por contacto sexual. Es causada por Treponema pallidum, una bacteria del grupo de las espiroquetas, con forma alargada, enrollada a manera de “tirabuzón” y muy móvil. T. pallidum no se puede colorear con Gram ni cultivar in vitro, por estas razones es indispensable utilizar técnicas especiales para demostrar su presencia. Generalmente la detección de anticuerpos inespecíficos o “reaginas”, por la prueba de V.D.R.L. (Venereal Diseases Research Laboratory) y la detección de anticuerpos específicos contra esta bacteria por FTA-ABS (Fluorescent Treponemal Antibodies-Absorbed), establecen el diagnóstico de sífilis. Sin embargo, debe transcurrir algún tiempo después del contagio para que las pruebas serológicas se positivicen.

Treponema pallidum, campo oscuro de chancro.

En la mayoría de los casos de sífilis primaria aparece una lesión típica en los órganos genitales, llamada “chancro”. El chancro se caracteriza por ser una úlcera no purulenta, generalmente de forma redondeada y de bordes duros. Es una lesión muy infectiva que contiene muchas espiroquetas, por lo que debe manipularse con guantes. Debido a que T. pallidum es una bacteria muy delgada y que no toma los colorantes de Gram, su presencia debe demostrarse por observación microscópica en fresco con condensador de campo oscuro. Es muy importante que el paciente no haya recibido tratamiento con antibióticos especialmente penicilina, que hace desaparecer rápidamente los treponemas de las lesiones. Para el examen se procede así: 1-

Tener listo el siguiente material: guantes de hule estériles, gotero con solución salina, tubos capilares no heparinizados, bulbo de hule peque153

ño para tubos capilares (de los que vienen en kits de serología), portaobjetos, cubre-objetos, solución salina estéril en frasco, gasa estéril y algodón con alcohol. 2-

Es imprescindible examinar bien al paciente en un cubículo privado con buena luz para localizar bien el chancro más típico. Usar los guantes puestos para este procedimiento, limpiar suavemente la superficie del chancro con gasa estéril seca para causar ligera abrasión. Si hay costra levantarla con cuidado.

3-

Llenar un tubo capilar, aproximadamente un centímetro con solución salina estéril, dejarle puesto el bulbito de hule y tomarlo con la mano derecha.

4-

Con la mano izquierda, tomar la lesión entre los dedos pulgar e índice y presionar fuertemente hasta que brote del fondo de la lesión un líquido translúcido. Este procedimiento es doloroso para el paciente, pero debe soportar el dolor sin anestesia.

5-

Causar leve abrasión con el tubo capilar sin causar sangramiento, rápidamente dejar caer en el centro de la lesión una gota de solución salina del tubo capilar, succionarla. Gotearla de nuevo en la lesión, dos o tres veces más. Debe usarse lo menos posible de solución salina para no diluir la muestra, que debe ser un líquido lechoso ligeramente hemorrágico que queda dentro del tubo capilar. Puede usarse pipeta Pasteur o asa estéril si se considera más fácil de manejar.

6-

Colocar con cuidado una gota de la muestra así obtenida en un portaobjetos limpio, cubrir con cubre-objetos a manera de no dejar burbujas en la preparación en fresco.

7-

Descartar el tubo capilar en un lugar adecuado, tomando en cuenta que es material muy infectivo. Limpiar el bulbito de hule con algodón y alcohol, lo mismo que los guantes antes de quitárselos.

8-

Transportar la muestra con su respectiva solicitud de laboratorio lo más pronto posible, y examinarla inmediatamente con campo oscuro. No debe retrasarse la observación porque las espiroquetas pierden su movilidad típica.

154

9-

Cambiar el condensador de campo claro corriente que se usa en el microscopio, por un condensador especial para campo oscuro. Bajar el condensador de campo oscuro y colocarle dos gotas de aceite de inmersión de buena calidad, de manera que no queden burbujas de aire. Colocar la muestra en la platina con el cubre-objetos hacia arriba. Subir lentamente el condensador hasta que el lente pegue con el aceite por debajo de la lámina (que no queden burbujas). Aumentar la intensidad de la luz del microscopio al máximo, luego enfocar la muestra con seco débil; subir y bajar lentamente el condensador hasta que se obtenga el máximo de contraste, es decir los objetos más brillantes y el campo más oscuro.

10-

Cambiar al lente seco fuerte (de preferencia con diafragma) y enfocar de nuevo con el tornillo micrométrico y la altura del condensador. Una vez claramente enfocado, buscar detenidamente bacterias (ver foto y figura 12) con las siguientes características: a) b) c) d) e) f)

Tamaño ligeramente mayor al diámetro promedio de un eritrocito (8 micras). Muy finas alargadas y en forma de espiroquetas (como saca-corchos). Espiras regulares que no desaparecen al moverse. De 8 a 14 espiras en cada bacteria. Movimiento rápido de flexión en el centro y rotación sobre su eje mayor (en la mayoría de las muestras). Movimiento activo hacia adelante y hacia atrás (especialmente en muestras de chancros bien desarrollados con abundante material mucoide y viscoso).

11-

Dependiendo del estadío de la lesión, puede observarse de un sólo microorganismo en 20 campos hasta 50 por campo.

12-

El procedimiento de campo oscuro también sirve para observar T. pallidum de lesiones en piel de pacientes con sífilis secundaria. Para tomar la muestra forrar ambas ramas de una pinza con tubo de hule. “Morder” la lesión firmemente a manera de forzar la salida de líquido transparente el cual se observa en campo obscuro según el procedimiento descrito.

155

Interpretación de resultados e informe: Debe tomarse en cuenta que espiroquetas de idéntica morfología forman parte de la microbiota de los genitales y la boca, por lo que son indiferenciables y pueden causar falsos positivos. Este factor debe ser tomado en cuenta por el médico e interpretarse según la sintomatología del paciente, no es responsabilidad del laboratorio que debe reportar lo observado. Si la observación en campo obscuro coincide con la mayoría de las características descritas en el punto 10 anterior, reportar así: Campo oscuro: POSITIVO, se observan (escasas, regulares, abundantes) espiroquetas de morfología compatible con Treponema pallidum. En caso que sólo se observen leucocitos y eritrocitos escasos, pero no espiroquetas, reportar así: Campo oscuro: NEGATIVO, no se observan espiroquetas. Los treponemas son bacterias muy delgadas y por lo tanto difíciles de colorear. Antiguamente se utilizaban coloraciones por impregnación con sales de plata para observarlos, con malos resultados. Ninguno de los tratados modernos revisados para la preparación del presente manual menciona este tipo de coloraciones, que han caído en desuso. Puede utilizarse el condensador de contraste de fases, pero los treponemas se observan menos obvios que con campo oscuro. Si no se cuenta con microscopio con campo oscuro, remitir al paciente a una unidad que sí cuente con esta facilidad.

156

AGENTES INFECCIOSOS DEL TRACTO GENITAL FEMENINO Gerardo Arroyo, QB, CMIAC, MSc. Director de la Escuela de Química Biológica Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia Universidad de San Carlos de Guatemala

INTRODUCCION Los procesos infecciosos del tracto genital femenino (TGF) son el motivo de consulta más frecuente en las clínicas de Ginecología. Se manifiestan clínicamente por la presencia de flujo vaginal, prurito, eritema, dispareunia o sangrado anormal (menorragia o metrorragia). Las infecciones del TGF son importantes además de las molestias que causan a la paciente, por las potenciales complicaciones al diseminarse a otros órganos como el útero o las trompas de Falopio y porque representan también un riesgo para el feto en la mujer embarazada. Según el área anatómica afectada por los procesos infecciosos, éstos pueden clasificarse como vaginitis, vulvovaginitis, cervicitis, endometritis, salpingitis, enfermedad pélvica inflamatoria (EPI) o abcesos tubo-ováricos. Esta clasificación brinda las bases para el manejo clínico y también orienta sobre la etiología, epidemiología y tratamiento de los mismos. Es también importante mencionar, que durante las diferentes etapas fisiológicas de la vida de la mujer (niñez, edad reproductiva, postparto o postmenopausia), se presentan con mayor o menor frecuencia algún tipo de microorganismos en particular. VAGINITIS La etiología de la vaginitis depende de la edad y de la etapa fisiológica de la paciente, por lo que debe dividirse en vaginitis en niñas premenárquicas, vaginitis en la mujer en edad reproductiva y vaginitis en la mujer postmenopáusica. Los síntomas y signos clínicos de la vaginitis incluyen flujo vaginal, prurito, eritema de la mucosa vaginal y exocervical y sangrado anormal. Estas manifestaciones son interpretadas de diversas maneras por las pacientes que pueden aceptar condiciones patológicas como normales, o

157

viceversa. Por este motivo, es importante establecer criterios objetivos que permiten determinar cuando se encuentra presente un proceso infeccioso y cuando son situaciones fisiológicas. La vaginitis es definida objetivamente cuando se encuentran trastornos cualitativos o cuantitativos en el flujo vaginal y/o síntomas asociados a la presencia de microorganismos patógenos. Los cambios cualitativos incluyen aumento del pH por arriba de 4.5, prueba de amina positiva y presencia de células clave. 1.

Vaginitis en niñas premenárquicas

La vagina de las niñas después de 30 días de nacidas, es susceptible de infectarse con Neisseria gonorrhoeae y Chlamydia trachomatis, así como por otros microorganismos como Streptococcus spp. y enterobacterias. Las infecciones por Candida spp. son sumamente raras en niñas antes de la pubertad. El origen de las infecciones gonocócicas y clamidiales en niñas, es el abuso sexual; y por el contrario, las infecciones por estreptococos y enterobacterias son por contaminación ano-vaginal. Existen procesos inflamatorios no infecciosos que se diagnostican con mayor frecuencia en niñas e incluyen vaginitis a cuerpo extraño, vaginitis atrófica, (asociada muchas veces a mala higiene perianal), así como cierto número de casos de vaginitis por Enterobius vermicularis. 2.

Vaginitis en la mujer de edad reproductiva

Durante los años de la vida reproductiva de la mujer, la vaginitis se presenta con una frecuencia de hasta 40% en embarazadas, 25% en mujeres de clínicas de planificación familiar y 18% en adolescentes. Más del 80% de los casos de vaginitis infecciosa son causadas por Trichomonas vaginalis (protozoo), Candida spp. (hongo) y la llamada vaginosis bacteriana (VB). Además de estos microorganismos, también pueden aislarse estreptococos, estafilococos y enterobacterias. Otras etiologías incluyen la vaginitis ulcerativa que acompaña al Síndrome de Choque Tóxico, vaginitis asociada al uso de tampones, vaginitis por cuerpos extraños, vaginitis alergica al Nonoxinol-9 (espermicida) y otros tipos de vaginitis idiopática.

158

3.

Vaginitis en mujeres postmenopáusicas

Durante la etapa postmenopáusica, el epitelio atrófico es susceptible de inflamaciones que tienen su origen principalmente en la falta de maduración epitelial por ausencia de estímulo estrogénico. La más común e importante en este grupo de pacientes es la vaginitis atrófica, la cual es en la mayoría de los casos no infecciosa y responde satisfactoriamente al tratamiento local o sistémico con estrógenos. A.

Tricomoniasis

La tricomoniasis es una enfermedad de transmisión sexual, que se presenta clínicamente con flujo vaginal profuso, de color amarillo-verdoso, a veces espumoso, de mal olor, acompañado de prurito, y eritema de la vagina y exocérvix. El eritema del exocérvix ha sido descrito como “cuello en fresa”. El pH del flujo vaginal es arriba de 5.0, la prueba de amina es generalmente positiva y al examen en fresco es posible observar Tropozoitos móviles de Trichomonas vaginalis, con un alto grado de sensibilidad y especificidad. La tricomoniasis ha sido identificada en 10.3% de mujeres embarazadas, 7.3% de mujeres en clínicas de planificación familiar y en 8.5% de mujeres adolescentes (12 a 18 años). B.

Candidosis vulvovaginal

La candidiasis vulvovaginal, generalmente causada por Candida albicans, puede transmitirse sexualmente, la mayoría de los casos se deben a contaminación ano-vaginal. Clínicamente se presenta con prurito, irritación vulvar y un flujo espeso de color blanco espeso que semeja leche cortada y que se adhiere a las paredes vaginales. El pH es muy parecido al normal o menor y la reacción de amina es negativa. El examen en fresco revela la presencia de levaduras, micelio y pseudomicelio asociado a variable cantidad de leucocitos polimorfonucleares. En diferentes grupos de mujeres guatemaltecas se ha reportado una frecuencia de 12.6% en embarazadas, 5.3% en pacientes de planificación familiar y 6.8% en adolescentes.

159

C.

Vaginosis bacteriana

La VB es el tipo más frecuente de vaginitis infecciosa. Se ha reportado en 20.1% de mujeres embarazadas, 13.5% de pacientes en planificación familiar y en 1.7% de adolescentes. Esta enfermedad ha recibido diversos nombres, entre ellos vaginitis inespecífica, vaginitis por Gardnerella y vaginosis inespecífica entre otros, de los cuales el término VB es quizás el más apropiado en vista de que el epitelio escamoso no muestra generalmente infiltración leucocitaria. La VB se define como el sobrecrecimiento de otras bacterias sobre la microbiota normal de bacilos de Döderlein. Entre las bacterias que han sido aisladas de casos de VB se encuentran Gardnerella vaginalis, Bacteroides spp., Eubacterium lentum, Peptococcus spp., Peptostreptococcus spp., Mycoplasma hominis, Mobiluncus curtisii y Mobiluncus mulieri. La presentación clínica incluye secreción vaginal acuosa homogénea, de color blanco grisáceo que se adhiere a las paredes vaginales, con mal olor. El pH del flujo vaginal es generalmente mayor de 5.0, la reacción de amina es positiva y es característica la presencia de células clave. El frote Gram revela la ausencia de bacilos de Döderlein (gram-positivo) y abundantes bacilos pleomórficos gram-negativo. Los frotes Gram son de utilidad cuando se interpretan como presencia de microbiota normal, microbiota mixta o compatibles con VB. El diagnóstico de esta condición se establece cuando se encuentran presentes tres criterios de los antes mencionados, incluyendo entre ellos la presentación clínica característica. Los cultivos in vitro no son útiles para el diagnóstico, en vista de que es posible aislar la mayoría de los microorganismos mencionados en pacientes sanas. CERVICITIS La cervicitis es la inflamación del canal endocervical y las glándulas endocervicales y en la mayoría de los casos, los síntomas son vagos e inespecíficos. Los agentes infecciosos más importantes son Neisseria gonorrhoeae y Chlamydia trachomatis. Además de estos microorganismos son importantes el virus Herpes simplex y por extensión de los procesos infecciosos vaginales, Trichomonas vaginalis y Candida albicans. En nuestro medio se ha reportado cervicitis en un 10.6% de mujeres embarazadas (gonorrea=0.7% y clamidia=5.3%), 9.2% de pacientes en clínicas

160

de planificación familiar (gonorrea=0.3% y clamidia=7.0%) y en 9.0% de las adolescentes (gonorrea=1.7% y clamidia=6.8%). El diagnóstico clínico de cervicitis no es posible en muchos casos pues además de que los síntomas no son siempre característicos, los signos pueden confundirse con otras condiciones. Por esta razón es importante hacer énfasis en los aspectos objetivos que correlacionan mejor con el diagnóstico de cervicitis. Entre ellos se encuentra la observación de muco-pus procedente del canal endocervical. Esto se efectúa por medio de la prueba del hisopo endocervical, la cual se basa en que al retirarlo del canal muestra coloración amarilla, verde o roja que indica muco-pus o friabilidad de la mucosa, y la presencia de más de 10 leucocitos polimorfonucleares por campo de 40X. El diagnóstico etiológico debe buscar la presencia de N. gonorrhoeae y C. trachomatis. El diagnóstico microbiológico de clamidia se basa en la detección de antígenos del microorganismo mediante técnicas de ELISA o pruebas rápidas. Las técnicas citológicas que utilizan Papanicolaou o Giemsa para identificar células con inclusiones, han demostrado muy baja sensibilidad aunque una especificidad aceptable, por lo que no deben utilizarse para diagnóstico.

OTROS AGENTES ETIOLÓGICOS Mycobacterium tuberculosis

endometritis, salpingitis

Actinomyces spp. y Arachnia sp.

colonización uterina en pacientes

Entamoeba gingivalis (protozoo)

con dispositivos intrauterinos

Entamoeba histolytica (protozoo)

vaginitis, cervicitis

Enterebius vermicularis (helminto)

vaginitis en niñas

161

CAPÍTULO 14 LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO Y FLUIDOS CORPORALES PROPÓSITO: Demostrar por medio de bacterioscopía con Gram y cultivo, la presencia de bacterias en estas muestras, que normalmente deben ser estériles. Las bacterias que tienen mayor importancia en el líquido cefalorraquídeo son: Gram negativo: Neisseria meningitidis (causa meningitis meningocócica severa) Haemophilus influenzae (especialmente en niños de 6 meses a 4 años de edad) Escherichia coli y otras enterobacterias (en pacientes debilitados, neonatos y post-craneotomía) Pseudomonas aeruginosa Gram-positivo: Streptococcus pneumoniae (muy importante) Staphylococcus aureus Streptococcus sp. (grupos B y D en neonatos) Streptococcus pyogenes Listeria monocytogenes (raro) Otros microorganismos importantes: Mycobacterium tuberculosis, Leptospira interrogans y Treponema pallidum (bacterias). Cryptococcus neoformans y Candida albicans (hongos levaduriformes) V arios virus (enterovirus, paperas y otros). MUESTRA: Las muestras incluidas en los fluidos corporales son: Líquido cefalorraquídeo (conocido también como fluido espinal o LCR) 163

Líquido ventricular (líquido cisternal, líquido craneal) Fluido abdominal (líquido peritoneal o aseíbico, líquido de parasentesis, líquido de diálisis, bilis) Líquido pleural, torasentesis y empiema (obtenido del tórax) Líquido pericárdico Líquido sinovial Médula ósea, sangre (ver capítulo de hemocultivo y mielocultivo) Por lo general estas muestras son obtenidas por el médico que solicita su análisis. Deben obtenerse antes de iniciar tratamiento con antibióticos y las debe colectar en recipientes estériles proporcionados por el laboratorio. Las muestras deben transportarse inmediatamente al laboratorio y ser procesadas inmediatamente no después de 30 minutos de recolectadas. Rotular con el nombre del paciente, número de registro, fecha y naturaleza de la muestra. Si el médico sospecha que la muestra puede contener bacilos alcohol-ácido resistentes debe hacerlo saber en su solicitud al laboratorio. Los síntomas de irritación de las meninges (membranas que cubren el cerebro y la médula espinal), que puede ser causada por microorganismos son: fiebre, dolor de cabeza, vómitos, rigidez y dolor de nuca, reflejos aumentados, estupor a coma y petequias en la piel. En los niños estos síntomas son vagos e inespecíficos, por esta razón sólo los resultados del laboratorio pueden establecer el diagnóstico. En caso de meningitis bacteriana, el líquido cefalorraquídeo (LCR) generalmente es purulento (turbio), con abundantes leucocitos (generalmente más de 1,000 por milímetro cúbico), con predominio de neutrófilos polimorfonucleares y glucosa disminuida (consumida por las bacterias). En la meningitis tuberculosa, generalmente el LCR es límpido y su glucosa normal. ETIOLOGÍA Y SINTOMATOLOGÍA DE INFECCIÓN ÓSEA Y ARTICULACIONES SIGNOS Y SÍNTOMAS

BACTERIA POTENCIALMENTE ASOCIADA

Edema articular

Staphylococcus aureus

Eritema y calor

Haemophilus influenzae

Dolor al movimiento

Streptococcus pyogenes

Dolor a la palpación

Neisseria gonorrhoeae

Rayos X: sinovitis u osteomielitis

Streptococcus pneumoniae Enterobacterias Micobacterias

164

PROCEDIMIENTO: 1.

El médico debe obtener la muestra (LCR o cualquier otro fluido corporal del cual desee examen completo) en dos tubos estériles 13 x 100 con tapón de rosca o frasquitos estériles que cierren bien. Enviarlos inmediatamente al laboratorio. Mantener la muestra dentro de la incubadora a 36°C mientras se procesa. En caso de recibirse un solo frasquito separar asépticamente en dos porciones.

2.

Uno de los tubos no se centrifuga, enviarlo a donde corresponda para citología (recuento total de células), recuento diferencial (fórmula) y análisis químico. El otro tubo sirve para el análisis microbiológico.

3.

Centrifugar la muestra 15 minutos a alta velocidad (2500-3000 rpm). Decantar asépticamente, tapar agitar y procesar sólo el sedimento.

4.

Sembrar una asada del sedimiento en cada uno de estos medios: Agar sangre de carnero al 5% Agar chocolate MacConkey Sabouraud (hongos), no Micosel Tioglicolato Lowenstein-Jensen (sólo si se solicita)

5.

Diseminar por estrías en toda la superficie de los medios sólidos. Introducir el agar sangre de carnero y el agar chocolate en jarro húmedo con candela encendida. Incubar todos los medios a 36°C, excepto el Sabouraud que se incuba a 27°C (o a temperatura ambiente para aislamiento de hongos patógenos especialmente Cryptococcus neoformans).

6.

En porta-objetos nuevos o bien limpios con alcohol, hacer dos frotes pequeños (de aproximadamente un centímetro de diámetro) en el centro de la lámina. Si el material es muy escaso poner una gota del sedimiento, dejar secar, luego colocar otra gota encima y dejar secar de nuevo.

7.

Colorear un frote con Gram y otro con Ziehl-Neelsen.

165

Fig. 11 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO (LCR)

Muestra: LCR obtenido siempre por el médico, en dos recipientes estériles, ya sea tubos o frasquitos preparados por el laboratorio. 1. Enviar un recipiente sin centrifugar a Citología y Química 2. Centrifugar 15 minutos, decantar asépticamente y procesar sedimento GRAM

ZIEHL-NEELSEN sedimento

3. RUTINARIAMENTE SEMBRAR EN

agar sangre agar MacConkey de carnero chocolate Sabouraud 4. Incubar en jarro con candela

OPCIONAL

Tioglicolato Lowenstein-Jensen NO INCLINAR

5. Incubar aeróbicamente a 36o C, Sabouraud a 27o C

6. Aislamiento e identificación de bacterias, micobacterias u hongos 166

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: Lo más pronto posible, observar los frotes de sedimento de LCR con lente de inmersión. En vista que del resultado de los frotes depende el tratamiento inmediato de pacientes con infección grave de las meninges, su observación debe hacerse con todo cuidado. Poner especial cuidado en observar las siguientes morfologías: 1.

Diplococos gram-negativo (rojos), arriñonados, dispuestos en parejas como granos de café, idénticos a N. gonorrhoeae de pus uretral: morfología compatible con N. meningitidis. Dar alerta al médico inmediatamente.

2.

Cocobacilos gram-negativo (rojo pálido) pleomórficos, con escasas formas bacilares: morfología compatible con H. influenzae, agente de meningitis en niños de 6 meses a 4 años; raro en adultos.

3.

Cocos gram-positivo (morados), lanceolados, ovalados, dispuestos en parejas o cadenas cortas, la cápsula se insinúa como un halo claro alrededor de las bacterias: En LCR morfología compatible con S. pneumoniae. En otros fluidos puede ser S. pyogenes con mayor frecuencia.

4.

Bacilos gram-negativo (rojos) de coloración sólida, no pleomórficos, bacilos alargados: morfología compatible con enterobacterias o pseudomonas (E. coli, Salmonella sp., Pseudomonas aeruginosa, etc.)

5.

Levaduras redondeadas, algunas con gemaciones laterales, gram-positivo, se insinúa cápsula, hacer “tinta china” para demostrar la presencia de la levadura capsulada C. neoformans.

6.

En el Ziehl-Neelsen: bacilos alcohol-ácido resistente (rojos), cortos, algunos con coloración dispareja en forma de gránulos: morfología compatible con M. tuberculosis.

Si hay bacterias en los frotes, el laboratorio está en la obligación de alertar al médico de inmediato. Reportar el Gram según se indicó. Es muy importante señalar la cantidad y clase de leucocitos presentes. Si la morfología es típica, informar con que bacteria es compatible según las explicaciones anteriores. Si no hay seguridad, reportar sólo el tipo y cantidad de bacterias observadas.

167

Los cultivos deben observarse a las 24 horas de incubación a 36°C. Si no se observa crecimiento, reincubar todas las cajas. Si a las 48 horas de incubación tampoco hay crecimiento, apuntar en el libro de control: N-48, y reportar “Negativo a las 48 horas de incubación a 36°C en aero-anaerobiosis”. Si se observa algún crecimiento a las 24 ó 48 horas, comparar con la siguiente tabla: Crecimiento en BACTERIA Agar Sangre

Agar Chocolate

MacConkey

Tioglicolato

Sabouraud

-/+

+

-

-

-

H. influenzae

-

+

-

-

-

S. pneumoniae

+

+

-

+/-

+

Enterobacterias y pseudomonas

+

+

+

+

+

Cryptococcus neoformans

-

-

-

-

+

Anaerobios

-

-

-

+

-

N. meningitidis

Hacer frote Gram de las colonias para confirmar morfología e identificar según los capítulos anteriores, así: BACTERIA

* **

COLONIAS

PRUEBAS DE CONFIRMACIÓN

N. meningitidis

Pequeñas (1 mm de diámetro o menos) brillantes, bordes enteros, no hemolíticas)

Oxidasa*, azúcares en CTA (ver tabla en capítulo 13)

H. influenzae

Muy pequeñas (puntiformes) brillantes, bordes enteros, no hemolíticas)

Prueba de satelitismo con Staphylococcus aureus**

S. pneumoniae

Pequeñas (1 mm de diámetro o más) aplanadas, alfa hemolíticas

Inhibición por disco de optoquina (ver capítulo 8)

Enterobacterias

Grandes, brillantes, bordes lisos crecen en todos los medios. Notar en MacConkey si son lactosa positivo (rojas) o negativo (incoloras)

TSI/LIA/MIO/urea/citrato; o API. Aglutina-ción con antisueros

Aglutinar con antisueros específicos, los grupos más frecuentes son A, B y C. Hacer antibiograma en agar Mueller-Hinton con 5% de sangre, achocolatdo. Prueba de “satelitismo” para H. influenzae (de LCR, secreciones) y H. aegyptis (de ojos).

168

Efectuar la prueba de satelitismo así: 1. 2. 3.

4. 5.

Obtener un cultivo puro en agar chocolate en jarro húmedo con candela, a 36° C. Tomar una asada y estriar en la superficie de una caja de agar sangre, sólo en una dirección. Tomar una asada de un cultivo de Staphylococcus aureus (de otro cultivo cualquiera o de preferencia una cepa pura mantenida en refrigeración). Hacer con el asa en argolla una sola estría recta, perpendicular a las estrías del Haemophilus. Incubar en jarro con candela 24 horas a 36° C y luego examinar con lupa y buena luz. Una reacción positiva se manifiesta por el crecimiento de pequeñas colonias puntiformes y translúcidas que crecen sólo muy cerca de la estría de S. aureus.

INFORME: El informe del frote Gram de LCR debe haberse enviado previamente, el día en que se recibió la muestra. Después informar lo más pronto posible el resultado del cultivo con el nombre correcto de la bacteria, y la cantidad de colonias observadas (escaso, regular, abundante cantidad) en las cajas originales, por ejemplo: Primer informe, entregar el mismo día de obtención de la muestra: Frote Gram: Se observan escasos diplococos gram-positivo, lanceolados y capsulados, de morfología compatible con S. pneumoniae. Leucocitos polimorfonucleares: regular cantidad. Cultivo: Pendiente Segundo informe, entregar el día que termina la identificación: Cultivo: Se aisló S. pneumoniae. Antibiograma.

169

CAPÍTULO 15 TEJIDOS Y BIOPSIAS PROPÓSITO: Demostrar por frote y cultivo la presencia de bacterias en piezas de tejidos de sala de operaciones, o piezas aún más pequeñas obtenidas por biopsia. Las bacterias que pueden estar presentes son muy variadas. Anteriormente sólo se efectuaba histopatología de estas muestras, en la actualidad el examen microbiológico es también de gran ayuda diagnóstica. Además, la microbiología post-mortem contribuye a elucidar las infecciones mortales. MUESTRA: Este tipo de muestras son exclusivamente obtenidas por el médico en condiciones asépticas, y depositadas en recipientes estériles de boca ancha con un poco de solución salina estéril, proporcionados por el laboratorio. Debe obtenerse suficiente cantidad y no debe adicionarse ninguna sustancia fijadora como formol. Después de procesarse, la muestra debe almacenarse en refrigeración o congelación, en solución salina estéril para que no se deseque, con el propósito de preservarla para nuevos estudios, ya que generalmente hay riesgo para el paciente al tomar nueva muestra. De úlcera o tractos fistulosos debe efectuarse curetaje profundo tomando parte del tejido de la pared del tracto fistuloso. Debe desinfectarse la piel circundante e introducir un catéter venoso de plástico estéril, y luego aspirar con jeringa estéril. De las úlceras obtener material de la base. Si se justifica, el material de estas muestras debe obtenerse en algún medio de transporte anaeróbico adecuado (ver capítulo 17). En el caso de material de fístulas, debe hacerse una preparación en fresco para buscar gránulos de Actinomyces, Nocardia u hongos. Para obtener cultivos de material de autopsia, la piel debe ser desinfectada aplicando una espátula caliente para quemar la piel. Si se trata de un órgano, debe sumergirse en agua hirviendo por 5 a 10 segundos, y luego debe disecarse con instrumentos estériles y tomar para cultivo material del centro. La mitad de la

171

muestra debe fijarse en formol, y la otra enviarse en recipiente estéril con un poco de solución salina estéril al laboratorio de microbiología. PROCEDIMIENTO: No es adecuado inocular los medios sólo tocando o frotando la pieza con una asa. Debe hacerse de la siguiente manera: 1-

Colocar la pieza con pinzas estériles en una caja de Petri estéril. Con tijeras estériles, picarla finamente y luego pasarla a un macerador de tejido estéril o, si no lo hay, a un pequeño mortero estéril.

2-

Usar arena esteril para triturar bien la muestra. Si se hace en un mortero, adicionar una pequeña cantidad de solución salina estéril. Dejar sedimentar para cultivar el sobrenadante. Si se sospecha la presencia de hongos, no triturar, sólo picar finamente con tijeras estériles.

3-

Con aguja y jeringa estériles, aspirar asépticamente una porción del sobrenadante. Inyectar aproximadamente un mililitro en un frasco de caldo para hemocultivo.

4-

Seleccionar los otros medios de cultivo a inocularse con base en el o los microorganismos sospechados, u observados en una coloración de Gram. Si se desconoce la historia del paciente inocular con una gota del resto de la muestra en la jeringa los siguientes medios: agar sangre de carnero al 5%, agar chocolate, MacConkey, manitol-sal, tioglicolato, Sabouraud, mycosel y Lowenstein-Jensen.

5-

Incubar a 36°C el agar sangre y el agar chocolate en jarro húmedo con candela; MacConkey, manitol-sal, tioglicolato y Lowenstein-Jensen, aeróbicamente a 36°C, y los tubos de Sabouraud y mycosel a 27°C o a temperatura ambiente.

6-

Preparar dos frotes, colorear uno con Gram y el otro con Ziehl-Neelsen.

7-

Las muestras de sangre de autopsia deben procesarse como hemocultivo, sin importar la presencia de coágulos.

172

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS E INFORME Si se observa crecimiento en los medios después de 24 a 48 horas de incubación, hacer las coloraciones y sub-cultivos adecuados para efectuar la identificación según el caso. Pueden encontrarse los siguientes microorganismos con interés clínico: anaerobios como Actinomyces sp., bacterias aerobias comunes, Nocardia sp., hongos sistémicos y Mycobacterium sp. Descartar cultivos para bacterias a las 48 horas de incubación, cultivos para hongos después de dos semanas y el LowensteinJensen después de 6 semanas de incubación. Reportar según las normas de los capítulos anteriores.

173

ANUNCIO ZITHROMAX

175

DOCUMENTO ZITHROMAX

176

CAPÍTULO 16 PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD (ANTIBIOGRAMA) PROPÓSITO La prueba de susceptibilidad sirve para determinar in vitro a qué antibióticos es susceptible o resistente una determinada cepa bacteriana aislada del paciente. Este método permite al médico escoger el antibiótico más adecuado con base científica proporcionada por el laboratorio, y evita dar tratamientos útiles. Susceptible: Cuando los microorganismos responsables de una infección son inhibidos por concentraciones de antibiótico obtenidas con un régimen usual de dosificación. Moderadamente susceptible: Cuando los microorganismos son inhibidos por concentraciones altas de antibiótico. Resistente: Si los microorganismos que causan la infección, toleran concentraciones de antibiótico superiores a las que pueden obtenerse en la sangre por medio de un régimen usual de dosificación. Intermedio (Indeterminado): Hoy en día se considera como prueba errática que por lo tanto debe repetirse, ya que realmente se trata de una población bacteriana resistente. El nombre “Antibiograma” es adecuado para designar esta prueba, pero no lo es “Prueba de sensibilidad”, pues las bacterias no “sienten” la acción de los antibióticos, son susceptibles a estos medicamentos. La técnica que debe usarse es la de Bauer-Kirby, ligeramente modificada por el Comité Nacional de Estándares para Laboratorios Clínicos de Estados Unidos (NCCLS). MEDIO DE CULTIVO Por medio de la técnica de Bauer-Kirby modificada se obtienen resultados confiables, reproducibles y de gran utilidad clínica siempre y cuando se sigan al pie de la letra las instrucciones de este capítulo. Es una técnica relativamente sen177

cilla que siempre debe efectuarse con el agar de Mueller-Hinton; el grosor de la caja, concentración del inóculo, humedad, temperatura y otros factores deben estar perfectamente estandarizados para que los resultados puedan ser comparables entre los diversos laboratorios. Es muy importante tomar en cuenta que esta técnica sólo sirve para efectuar el antibiograma de las siguientes bacterias aeróbicas o facultativas de crecimiento rápido: -

Staphylococcus aureus Enterobacterias Pseudomonas

El antibiograma para Haemophilus spp. y Neisseria spp. debe hacerse en MuellerHinton con 5% de sangre, “achocolatado”. Preparar el agar Mueller-Hinton según las indicaciones del productor y con las siguientes características: 1-

Las cajas de Petri de tamaño estándar (100 mm de diámetro), deben llenarse con aproximadamente 25 ml del agar líquido ya autoclaveado, a manera de dar un medio de 4 mm de grueso. Idealmente deben usarse cajas de Petri descartables de plástico, de 150 mm de diámetro con la misma profundidad, para poder colocar los discos más separados

2-

Deben guardarse en la refrigeradora dentro de bolsas plásticas selladas, (de 2 a 8° C), por no más de 7 días.

3-

El pH del medio debe ser de 7.2 a 7.4. Medir el pH del medio con potenciómetro. Dejar solidificar un poco del medio dentro de un pequeño beaker alrededor del electrodo del aparato. Ajustar si es necesario, antes de autoclavear, con NaOH 1N, o HCl 1N.

4-

De cada lote de medio, incubar dos cajas por 24 horas a 36° C para comprobar su esterilidad. Descartar estas cajas ya que no son adecuadas para efectuar antibiograma después de ser incubadas.

5-

Inmediatamente antes de usar el medio Mueller-Hinton, secarlo a 36° C. Colocar las cajas en la incubadora por 20 minutos con el medio arriba y la tapadera ligeramente abierta. 178

Almacenaje de discos con antibióticos Para que el procedimiento proporcione datos con verdadera correlación clínica, en primer lugar debe tomarse la siguiente precaución para el almacenaje de los discos de papel impregnados con los diferentes antibióticos, que se obtienen comercialmente. Almacenar los discos de acuerdo con las siguientes instrucciones, para que no pierdan su potencia: 1-

Congelar (idealmente a -20° C) los discos de penicilina, ampicilina, carbenicilina y cefalosporinas. Descongelar periódicamente sólo los discos que serán usados durante la semana. Descongelarlos por lo menos dos horas antes de usarse.

2-

Los discos del resto de antibióticos pueden almacenarse refrigerados sin congelación. De preferencia con una pastilla desecante.

3-

Si se usan los cartuchos de discos montados en dispensador, introducir dos pastillas desecantes de las que vienen con los discos y cerrar bien después de usar.

PROCEDIMIENTO: Efectuar el antibiograma así: 1-

Con el asa flameada y fría tomar 4 a 5 colonias bien aisladas y de igual morfología del cultivo original en cualquier medio sólido. Debe trasladarse siempre un cultivo puro.

2-

Inocular un tubo con 4 ml de caldo tripticasa soya o caldo infusión de cerebro y corazón (BHI).

3-

Incubar el caldo de 2 a 5 horas a 36° C, hasta que aparezca una ligera tubidez.

4-

Ajustar la turbidez del caldo a la turbidez del estándar de MacFarland 0.5. Si el caldo es más turbio que el estándar agregarle más caldo o solución salina estéril. Comparar ambos tubos (muestra y estándar) con buena luz y frente a un fondo blanco con una línea negra para evaluar visualmente la turbidez.

179

Preparar el estándar 0.5 de MacFarland así: mezclar 0.5 ml de cloruro de bario 0.048 M (1.175 g BaCl2. 2H2O en balón de 100 ml, aforar con agua destilada), más 99.5 ml de ácido sulfúrico 0.36 N (1 ml de H2SO4 en balón de 100 ml, aforar con agua destilada). Llenar tubos que cierren bien, sellarlos, guardarlos en la oscuridad con fecha. Hacer nuevo estándar cada 6 meses. 5-

Antes de quince minutos de diluídos los caldos, inocular la caja presecada de agar Mueller-Hinton así: introducir un hisopo estéril en el caldo de turbidez igual al estándar; exprimir bien el hisopo presionándolo firmemente contra las paredes del tubo, arriba del nivel del caldo.

6-

Con el hisopo exprimido sembrar la caja en tres direcciones opuestas sobre toda la superficie, cerca del mechero encendido. En caso de urgencia puede sembrarse la prueba con la muestra directa, sólo si el frote Gram revela una sola clase de bacteria (LCR o secreciones varias), pero esto debe evitarse y considerarse preliminar.

7-

Dejar secar la caja de 3 a 5 minutos, pero no más de 15 minutos, con la tapadera cerrada.

8-

Con pinzas estériles o dispersador especial, colocar los discos impregnados de antibióticos a manera de que queden lo más separados entre sí que sea posible. Con las pinzas flameadas y frías presionar los discos ya colocados para adherirlos bien al medio de cultivo. Escoger los antibióticos a colocar dependiendo de la bacteria estudiada, según el listado básico actualizado de cada laboratorio y de acuerdo con los listados oficiales del NCCLS (1995), que aparecen en las páginas 182 y 183 de este manual. Es preferible usar discos comerciales y no los obsequiados por el productor del antibiótico. Al recibir discos obsequiados por el productor del antibiótico, debe verificarse que éstos sean elaborados por una compañía especializada (por ejemplo: DIFCO o BBL), y no por la misma compañía productora del antibiótico.

9-

Invertir las cajas e incubarlas por 16 a 18 horas a 36° C, nunca usar jarro con candela (excepto para Haemophilus spp. y Neisseria spp.)

180

Fig. 12 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA ANTIBIOGRAMA

1. Tomar 4 ó 5 colonias de igual morfología del cultivo original 2. Inocular un tubo con 4 ml de caldo

Cualquier medio sólido

o

3. Incubar por 2 a 5 hrs a 36 C hasta alcanzar la turbidez del estándar 0.5 de MacFarland Agar Mueller-Hinton 5. Sembrar caja pre-secada en tres direcciones opuestas

4. Empapar hisopo estéril, exprimir bien contra las paredes del tubo

6. Dejar secar de 3 a 5 minutos (no más de 15) y colocar discos de antibióticos para gram-positivo o gram-negativo

7. Incubar por 16 a 18 hrs a o 36 C y medir diámetros de halos de inhibición; interpretar según tablas 181

ANTIBIÓTICOS APROBADOS (FDA-USA) QUE DEBEN USARSE RUTINARIAMENTE PARA PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD EN VARIOS GRUPOS BACTERIANOS Según: NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards), M7-A3 (M100-56), 1995. Enterobacterias: Grupo A, prueba inicial, reportar siempre: 11. Ampicilina* 12. Cefazolina* 13. Cefalotina* 14. Gentamicina* Grupo B, prueba inicial, reportar selectivamente: 15. Mezlocilina o piperacilina 16. Ticarcilina 17. Ampicilina-sulbactam* o amoxicilina-ácido clavulánico 18. Piperacilina-tazobactam 19. Ticarcilina-ácido clavulánico 10. Cefmetazol 11. Cefoperazona 12. Cefotetan 13. Cefoxitina* 14. Cefamandol/cefonicida/cefuroxima 15. Cefotaxima*/ceftizoxima/ceftriaxona 16. Imipenem 17. Amikacina 18. Ciprofloxacina* 19. Trimetoprim-sulfametoxazol* *

De utilidad en infección urinaria, además de carbenicilina, cinoxacina, lamefloxacina/norfloxacina/ofloxacina, loracarbef y nitrofurantoína.

182

Pseudomonas aeruginosa y otros bacilos gram-negativo facultativos no de la familia Enterobacteriaceae: Grupo A, prueba inicial, reportar siempre: 11. Mezlocilina o ticarcilina 12. Piperacilina 13. Gentamicina 14. Ceftazidima Grupo B, prueba inicial, reportar selectivamente: 15. Ticarcilina-ácido clavulánico 16. Cefoperazona 17. Aztreonam 18. Imipenem 19. Amikacina 10. Tobramicina 11. Ciprofloxacina 12. Trimetoprim-sulfametoxazol Staphylococcus spp.: Grupo A, prueba inicial, reportar siempre: 11. Penicilina 12. Oxacilina o meticilina Grupo B, prueba inicial, reportar selectivamente: 13. Azitromicina 14. Vancomicina 15. Clindamicina 16. Claritromicina 17. Eritromicina 18. Trimetoprim-sulfametoxazol

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: 1-

Después de 16 a 18 horas de incubación, examinar con buena luz las cajas ya crecidas.

2-

Medir en milímetros el diámetro de los halos de inhibición completa 183

con una regla por detrás de la caja de Petri, o con patrones especiales. No tomar en cuenta escasas colonias separadas dentro del halo de inhibición o crecimiento muy débil (80% de inhibición). Sin embargo, si se observan múltiples colonias dentro del halo de inhibición, éstas deben sub-cultivarse para descartar contaminación. En caso de tratarse de la misma bacteria que se analiza, repetir el antibiograma de las colonias que crecen dentro del halo. El “velo” de crecimiento de Proteus sp. dentro del halo, tampoco debe tomarse en cuenta. Medir siempre hasta el márgen donde se inicia el crecimiento grueso. 3-

En el caso de sulfonamidas, puede ocurrir crecimiento dentro del halo, el cual no debe tomarse en cuenta.

4-

En caso de urgencia puede efectuarse una lectura preliminar después de 5 ó 6 horas de incubación, siempre y cuando la caja se reincube y posteriormente se envíe el informe definitivo.

5-

Transformar las medidas de los diámetros de los halos de inhibición en milímetros, a: resistente, intermedio, moderadamente susceptible o susceptible por medio del uso de tablas actualizadas. Se deben utilizar las tablas de interpretación que son oficiales en Estados Unidos: National Comittee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Para este propósito, utilice las tablas de las páginas 185, 186 y 187 de este manual.

184

INTERPRETACIÓN DE LOS DIÁMETROS DE LAS ZONAS DE INHIBICIÓN (mm) PARA MIEMBROS DE LA FAMILIA Enterobacteriaceae Agente antimicrobiano Amikacina Amoxicilinaácido clavulánico

Moderadamente Contenido Resistente Intermedio Susceptible susceptible del disco (mcg) ≥17

130

≤14

20/10

≤13

14-17

≥18

15-16

110

≤13

14-16

≥17

10/10

≤11

12-14

≥15

130

≤15

16-21

≥22

Cefamandol

130

≤14

15-17

≥18

Cefazolina

130

≤14

15-17

≥18

Cefmetazol

130

≤12

13-15

≥16

Cefonicida

130

≤14

15-17

≥18

Cefoperazona

175

≤15

16-20

≥21

Cefotaxima

130

≤14

15-22

≥23

Cefotetan

130

≤12

13-15

≥16

Cefoxitina

130

≤14

15-17

≥18

Ceftazidima

130

≤14

15-17

≥18

Ceftizoxima

130

≤14

15-19

≥20

Ceftriaxona

130

≤13

14-20

≥21

Cefuroxima (oral)

130

≤14

15-22

≥23

Cefuroxima (parenteral)

130

≤14

15-17

≥18

Cefalotina

130

≤14

15-17

≥18

Cloranfenicol

130

≤12

Ciprofloxacina

135

≤15

Gentamicina

110

≤12

Imipenem

110

≤13

Kanamicina

130

≤13

Mezlocilina

175

≤17

Netilmicina

130

≤12

Piperacilina

100

≤17

Tetraciclina

130

≤14

Ticarcilina

175

≤14

Ampicilina Ampicilina-sulbactam Aztreonam

185

≥18

13-17 16-20

≥21 ≥15

13-14 14-15

≥16 ≥18

14-17 18-20

≥21 ≥15

13-14 18-20

≥21 ≥19

15-18 15-19

≥20

(Continuación) Agente Antimicrobiano Ticarcilina-ácido clavulánico

Moderadamente Contenido Resistente Intermedio Susceptible del disco (mcg) susceptible ≥20

75/10

≤14

310

≤12

1.25/23.75

≤10

11-15

≥16

Carbenicilina

100

≤19

20-22

≥23

Cinoxacina

100

≤14

15-18

≥19

Nitrofurantoína

300

≤14

15-16

≥17

Norfloxacina

310

≤12

13-16

≥17

Ofloxacina

315

≤12

13-15

≥16

Sulfisoxazol

250 ó 300

≤12

13-16

≥17

315

≤10

11-15

>16

Tobramicina Trimetoprimsulfametoxazol

15-19

≥15

13-14

Reportar sólo en urocultivos:

Trimetoprim

INTERPRETACIÓN DE LOS DIÁMETROS DE LAS ZONAS DE INHIBICIÓN (mm) PARA Staphylococcus spp. Agente antimicrobiano

Contenido del disco

Resistente Intermedio

Moderadamente Susceptible susceptible

Amoxicilina- ácido clavulánico

120/10 mcg

≤19

≥20

Ampicilina

10 mcg/ml

≤28

≥29

Ampicilina-sulbactam

≥15

10/10 mcg

≤11

15-17

Cefazolina

30 mcg

≤14

15-17

Cefotaxima

30 mcg

≤14

15-22

≥23

Ceftriaxona

30 mcg

≤13

14-20

≥21

Cefalotina

30 mcg

≤14

15-17

≥18

Cloranfenicol

30 mcg

≤12

Ciprofloxacina

35 mcg

≤15

Clindamicina

32 mcg

≤14

15-20

≥21

Eritromicina

15 mcg

≤13

14-22

≥23

Gentamicina

10 mcg

≤12

13-14

≥15

Imipenem

10 mcg

≤13

186

12-14

≥18

≥18

13-17 16-20

14-15

≥21

≥16

(Continuación) Agente antimicrobiano

Contenido del disco

Resistente Intermedio

Moderadamente Susceptible susceptible

Meticilina

135 mcg

≤9

10-13

≤9

≥14

Ofloxacina

315 mcg

≤12

≤12

13-15

≥16

Oxacilina

311 mcg

≤10

11-12

≤10

≥13

Penicilina G

10 U

≤28

≤28

≤28

≥29

Rifampicina

315 mcg

≤16

17-19

≤16

≥20

Tetraciclina

330 mcg

≤14

15-18

3≤14

≥19

1.25/23.75 mcg

≤10

≤10

11-15

≥16

330 mcg

3≤9

10-11

3≤9

3≥12

Trimetoprimsulfametoxazol Vancomicina

Reportar sólo sólo en uro: Reportar en urocultivos: Nitrofurantoína

300 mcg

≤14

15-16

≤14

≥17

Norfloxacina

310 mcg

≤12

13-16

≥17

Sulfisoxazol

250 ó 300 mcg

≤12

≤12 13-16

Trimetoprim

315 mcg

≤10

11-15

≥16

≥17

Tomado de: Munro, S. 1992. Disk Diffusion Susceptibility Testing. In: Isenberg, H.D. (Editor in Chief). CLINICAL MICROBIOLOGY PROCEDURES HANDBOOK. Two volumes. American Society for Microbiology. Washington, D.C., U.S.A. Basado en: NCCLS. 1991. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. Third informational supplement. M100-S3. NCCLS, Villanova, Pennsylvania, U.S.A.

CONTROL DE CALIDAD Para controlar la efectividad y reproducibilidad de la prueba, cada laboratorio debe mantener refrigeradas en agar inclinado y sub-cultivar semanalmente las siguientes dos cepas bacterianas estándar, que producen patrones de suscepti-bilidad conocidos: a) b)

Escherichia coli ATCC 25922 (gram-negativo) Staphylococcus aureus ATCC 25923 (gram-positivo)

La susceptibilidad de las dos cepas patrón debe probarse con cada lote nuevo 187

de medio Mueller-Hinton, o una vez a la semana. Nunca hacerlo de los cultivos refrigerados, hacerlo de colonias previamente sub-cultivadas en agar sangre. Las zonas de inhibición de los patrones conocidos sirven para evaluar la precisión de la prueba. Los halos de inhibición de las dos cepas control deben estar entre los rangos de la siguiente tabla: LÍMITES ACEPTABLES DE LOS HALOS DE INHIBICIÓN (mm) QUE DEBEN OBTENERSE CON LAS CEPAS CONTROL Y ALGUNOS ANTIBIÓTICOS Antibiótico

S. aureus ATCC 25923

E. coli ATCC 25922

Amikacina

--------

19 - 26

Ampicilina

27 - 35

16 - 22

Ampicilina-sulbactam

29 - 37

20 - 24

Aztreonam

--------

28 - 36

Ceftazidima

--------

25 - 32

Clindamicina

24 - 30

--------

Cloranfenicol

19 - 26

21 - 27

Eritromicina

22 - 30

--------

Gentamicina

19 - 27

19 - 26

Penicilina-G

26 - 37

--------

Tetraciclina

19 - 28

18 - 25

Tobramicina

--------

18 - 26

Trimetoprim-sulfametoxazol

24 - 32

24 - 32

FUENTES COMUNES DE ERROR: 12345-

Usar otro medio que no sea Mueller-Hinton. Mala estandarización de la turbidez del inóculo. Mala preparación del medio, no ajustar el pH entre 7.2 y 7.4. Usar medio vencido o cajas mal almacenadas. Mal almacenaje de los discos con antibióticos. 188

161718191011121314151617-

Mala preparación o almacenaje del estándar 0.5 de MacFarland. No exprimir el hisopo en las paredes del tubo. Retraso entre la preparación del inóculo y la siembra (aumenta la concentración bacteriana). Retraso en la aplicación de los discos en las cajas ya inoculadas. Exceso de incubación de las cajas. Uso de jarro con candela o incubación a otra temperatura que no sea 36° C. Lectura prematura antes de 16 a 18 horas de incubación. Mala medición de los halos de inhibición. Cultivos mixto, no puros. Aplicación de la técnica a anaerobios o bacterias de crecimiento lento. No usar las cepas control. Errores de transcripción de resultados.

La prueba de susceptibilidad antimicrobiana de difusión sobre agar, propuesta desde 1966 por Bauer, Kirby, Sherris y Truck, continúa siendo aceptable y práctica. Es indispensable hacer notar el enorme avance que se ha logrado recientemente en la miniaturización y automatización del antibiograma. Si el laboratorio tiene posibilidades económicas y técnicas, debe utilizar alguno de los procedimientos modernos de antibiograma por dilución, miniaturizado e idealmente automatizado. El autor tiene conocimiento de dos métodos de este tipo, disponibles en nuestro medio que dan buenos resultados: ATB/VITEK de Bio Merièux y SENSIDENT de Merck. ESPECIFICACIONES PARA PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD* DE DOS ANTIBIÓTICOS DE PFIZER (Para bacilos gram-negativo facultativos y Staphylococcus spp.) Nombre genérico

Nombre comercial

Azitromicina (macrólido, azálido)

Zithromax

Ampicilinasulbactam Unasyn (Sultamicilina)

Contenido del disco

Interpretación del diámetro del halo (mm) Intermedio Susceptible Resistente

15 mcg

≤ 13

14-17

≥ 18

10 mcg de ampicilina + 10 mcg sulbactam

≤ 11

12-14**

≥ 15

** Método de difusión en disco sobre agar según Bauer-Kirby. ** Moderadamente susceptible.

189

ANUNCIO UNASYN (blanco y negro, cara de niño)

191

DOCUMENTO UNASYN (blanco y negro columna vertical, debe decir UNASYN al principio) 192

CAPÍTULO 17 ANAEROBIOS PROPÓSITO: Demostrar por medio de cultivo con procedimientos especiales, la presencia de bacterias anaerobias, es decir aquellas que no crecen en presencia de oxígeno del aire. Estas bacterias son normales y predominan en las microbiotas de las mucosas (boca, intestino, heces, vagina, etc.) En determinadas circunstancias llegan a sitios anatómicos diferentes y causan infección, generalmente en asociación con bacterias aerobias tales como enterobacterias, pseudomonas o cocos gram-positivo. Por esta razón, siempre debe hacerse frote Gram del material clínico y cultivo aerobio, además del cultivo en anaerobiosis (ausencia de oxígeno). MUESTRA: Si en algún tipo de análisis bacteriológico es de vital importancia la toma de la muestra y su transporte al laboratorio, es en el caso de los anaerobios. Esto se debe principalmente a dos factores: -

La muestra debe tomarse con mucho cuidado a manera de no contaminarla con bacterias de los sitios colonizados normalmente por anaerobios. Por esta razón, el médico a veces debe tomar muestras de secreciones del pulmón por punción trans-traqueal (para evitar los anaerobios de la orofaringe), o punción suprapúbica de la vejiga (para evitar los anaerobios de la uretra).

-

Las bacterias anaerobias son muy susceptibles al oxígeno del aire. Si los anaerobios en la muestra entran brevemente en contacto con aire, pierden muy rápidamente su viabilidad (capacidad de reproducirse en cultivo). Por esta razón deben seguirse al pie de la letra instrucciones, tanto para toma de la muestra como para su transporte al laboratorio.

Hallazgos clínicos que sugieren infección causada por anaerobios: 12-

Pus con mal olor. Infección cerca de membranas mucosas. 193

131415161718191011121314-

Tejido necrótico, gangrena o formación de pseudo-membranas. Gas en tejido o secreción. Endocarditis con hemocultivos rutinarios negativos. Infección asociada con cáncer u otros procesos que causan destrucción de tejidos. Infección relacionada con uso de antibióticos aminoglucósidos. Tromboflebitis séptica. Bacteremia con ictericia. Infección causada por mordidas humanas o de animales (investigar Pasteurella multocida, cocobacilo gram-negativo aerobio). Pus sanguinolento y negruzco que puede fluorecer de color rojo bajo luz ultravioleta (Bacteroides melaninogenicus). Presencia de “gránulos de azufre” en pus de lesiones en mandíbula u otro sitio (actinomicosis, buscar Actinomyces israelii). Signos y síntomas de gangrena gaseosa. Entidades clínicas que generalmente implican anaerobios como aborto séptico, o cirugía gastrointestinal infectada.

TOMA DE MUESTRA PARA CULTIVO DE ANAEROBIOS: Si se sospechan anaerobios en la muestra, ésta debe manejarse de manera especial. Los sitios anatómicos de donde se requiere tomar muestra son muy variados, generalmente las muestras aceptables para cultivo de anaerobios son: 1234567-

Pus aspirado. Tejidos varios (biopsia, cirugía, autopsia). Fluidos corporales (LCR, líquido pleural, paracentésis, pericárdico, sinovial). Aspirado por punción trans-traqueal. Aspirado por punción pulmonar directa. Orina aspirada por punción supra-púbica. “Gránulos de azufre” de pacientes con sospecha de actinomicosis.

Las muestras no aceptables para cultivo de anaerobios, pues contienen normalmente estas bacterias y siempre deben ser rechazadas si se solicita este tipo de cultivo, son: 123-

Hisopos de garganta o boca. Esputo espectorado. Material de broncoscopía no colectado con catéter de doble lumen. 194

45678-

Heces, contenido intestinal, hisopo rectal. Hisopo de lesiones superficiales (úlceras de decúbito, etc.) Material contiguo a mucosas. Orina colectada al vuelo. Hisopos vaginales o cervicales.

En todo caso, evitar contaminaciones con microbiota anaerobia normal. No deben pasar más de 10 minutos para transportar este tipo de muestras al laboratorio. Si no es posible transportarla con esta rapidez la muestra debe inocularse en un frasco o dispositivo especial que la mantenga en anaerobiosis. El laboratorio de microbiología debe ser alertado que se tomará una muestra para anaerobios, para que tenga listo el material necesario y la muestra se siembre cuanto antes. El personal del laboratorio debe conocer bien los procedimientos especiales para toma de muestra y aislamiento de anaerobios. Tomar las muestras con hisopo es menos satisfactorio que aspirar. Esto se debe a que el hisopo puede exponer a los anaerobios al oxígeno del ambiente, tiende a secarse rápidamente y permite colectar una muestra muy pequeña. En resumen para lograr el cultivo de las bacterias anaerobias deben tomarse las siguientes precauciones. 1234-

Cultivar el material clínico inmediatamente después de obtenido. Emplear medios frescos. Obtener condiciones anaerobias adecuadas. Efectuar el sub-cultivo de colonias inmediatamente después de sacarlas del medio anaerobio.

TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS AL LABORATORIO: Si la muestra no va a ser inoculada antes de 10 minutos de obtenida, debe colocarse en ambiente anaerobio para su transporte. Para este propósito, usar recipientes especiales obtenidos comercialmente (de preferencia “culturettes”, para transporte de anaerobios). En caso de no contarse con este material, por lo menos colocar la muestra lo más pronto posible en caldo tioglicolato. Este medio líquido contiene tioglicolato de sodio que reduce el medio y lo hace anaerobio en el fondo. Siempre debe usarse medio fresco, calentar el tubo por 10 minutos (tapón de rosca flojo) en baño de agua hirviendo, y luego enfriar en agua fría. El caldo debe quedar amarillo con una capa rosada delgada en la superficie.

195

Si la muestra se aspiró con una jeringa, debe sacarse todo el aire (que no queden burbujas), y sellar la punta de la aguja insertando un tapón de hule. PROCEDIMIENTO: La muestra recién tomada, o adecuadamente transportada al laboratorio, debe procesarse así: En primer lugar, siempre hacer un frote y colorearlo con Gram.

2-

Sembrar la muestra por estrías en una caja de agar sangre de carnero al 5% fresca y en el fondo de un tubo de caldo tioglicolato (hervido y enfriado).

3-

Introducir rápidamente la caja con el medio hacia arriba y el tioglicolato en un jarro Gas-Pak limpio y seco. Abrir un sobrecito indicador de anaerobiosis Jarro Gas-Pak y colocarlo dentro del jarro a manera de que la almohadilla con azul de metileno se vea claramente. Inmediatamente cortar con tijera la esquina indicada del sobre generador de hidrógeno y CO2 (sin apacharlo), y con pipeta de vidrio (no insertarla), agregarle 10 ml de agua destilada. Colocar el sobre con la abertura hacia arriba y cerrar fuertemente el jarro con la tapadera especial y la pinza de tornillo. La tapadera tiene por dentro una canastilla metálica que puede desenroscarse. Adentro debe colocarse un sobrecito de trocitos de paladio iridiado que actúa como catalítico para combinar el oxígeno dentro del jarro con el hidrógeno producido por el sobre generador y formar agua. Con el uso, el catalítico se inactiva, por lo que una vez a la semana deben calentarse los trocitos a 100° C por treinta minutos (en cápsula de porcelana, dentro del horno de secar material), para reactivarlo y secarlo periódicamente.

4-

Adicionalmente, toda la muestra que llega al laboratorio para cultivo de anaerobios debe sembrarse por estrías en otro agar sangre de carnero, MacConkey y manitol-sal, los cuales se incuban aeróbicamente.

196

H2+CO2

1-

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: Hallazgos bacteriológicos que sugieren la presencia de anaerobios: 1-

Morfología sugestiva en el Gram directo de la muestra.

2-

Ausencia de crecimiento aerobio de las bacterias observadas en el Gram directo.

3-

Crecimiento en el fondo del tioglicolato hace sospechar anaerobios. Ausencia de crecimiento en tioglicolato no descarta definitivamente la presencia de anaerobios.

4-

Gas o mal olor en la muestra o el cultivo.

5-

Colonias características en el agar sangre incubado en Gas-Pak.

6-

Colonias negras después de incubación prolongada indican Bacteriodes melaninogenicus; las colonias jóvenes pueden dar fluorescencia roja bajo luz ultravioleta.

La identificación hasta especie de todas las bacterias anaerobias de interés clínico es una tarea compleja y altamente especializada. Se recomienda seguir las siguientes claves para efectuar la identificación presuntiva. En primer lugar, una interpretación correcta y acuciosa del frote de la muestra original coloreado con Gram, permite sospechar qué bacterias anaerobias se deben aislar, y en algunos casos permite la detección de anaerobios cuyo aislamiento no se logra por alguna causa. Observar y reportar el frote Gram según lo indicado y luego correlacionar con las bacterias anaerobias y aerobias aisladas. Observar y registrar en el frote Gram del material clínico, lo siguiente: 1-

La reacción al Gram, el tamaño, la forma y la cantidad relativa de las bacterias presentes.

2-

La presencia de esporas, su forma y posición en la célula.

3-

Cualquier característica morfológica especial como ramificación pseudoramificación, formación de cadenas, filamentos, cuerpos esféricos o diminutas formas granulares. 197

4-

Comparar con la siguiente tabla como guía, y correlacionar con el cultivo anaerobio.

CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE ALGUNOS BACILOS ANAEROBIOS GRAM-NEGATIVO DE IMPORTANCIA MÉDICA ESPECIE

*

MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA

COLONIA

Bacteroides fragilis

Bacilos regulares con extremos redondeados*, pueden ser pleomórficos (agar sangre); comúnmente vacuolados (tioglicolato); pueden presentar cuerpos esféricos en su interior.

En motas, circular, entera y brillante.

Bacteroides melaninogenicus

Cocobacilos* (agar sangre); pleomórficos, vacuolados, bacilos degenerados (tioglicolato).

Colonias negras en agar sangre después de 4-5 días de incubación.

Bacteroides variabilis

Bacilos pequeños con extremos redondeados*; vacuolados.

Colonias circulares, enteras, brillantes u opacas con bordes translúcidos.

Fusobacterium necrophorum (Sphaerophorus necrophorus)

Bacilos pleomórficos con extremos redondeados*; esférulas y cuerpos redondeados.

Umbonada (con centro más alto que el resto de la colonia), opaca, con borde translúcido circular.

Fusobacterium fusiforme

Bacilos delgados con extremos adelgazados terminados en punta; algunos o la mayoría filamentosos (agar sangre y tioglicolato).

Circular, entera.

Ver figura 12: Diversas Morfologías Bacterianas

INTERPRETACIÓN DEL CULTIVO 1-

Después de no menos de 48 horas de incubación, destapar el jarro: Antes de abrirlo notar que el indicador debe estar blanco y la superficie interior del jarro con gotas de agua. Si el indicador está celeste y no hay agua de condensación, significa que no se produjo anaerobiosis y deben revisarse los procedimientos. Notar un fuerte olor pútrido característi198

co de los anaerobios. Descartar el indicador y el sobre generador de hidrógeno y CO2. 2-

Examinar simultáneamente la caja de agar sangre y el tubo de tioglicolato. Debe tenerse a mano el resultado de los crecimientos aerobios, ya que muchas bacterias facultativas crecen tanto en aerobiosis como en anaerobiosis. Es de esperarse que enterobacterias, pseudomonas, estafilococos y estreptococos también crezcan en el agar sangre anaerobio, pues son facultativos. Examinar las cajas con buena luz, con lupa y microscopio estereoscópico.

3-

Hacer inmediatamente frote Gram y sub-cultivo en agar sangre de carnero al 5% y en tioglicolato (hervido y enfriado) de cada tipo de colonias que no corresponda a aerobios ya previamente identificados. También sembrar un sub-cultivo en agar sangre aerobio donde los anaerobios verdaderos no crecen. Es muy frecuente que se encuentran en la misma muestra dos o más anaerobios además de varios aerobios.

4-

Incubar aeróbicamente el agar sangre de carnero donde se efectuó el sub-cultivo y el tioglicolato original. Si no se observa crecimiento en el agar sangre aerobio a las 24 a 48 horas, se trata verdaderamente de un anaerobio. Hacer frote Gram del crecimiento en tioglicolato y referirse a la tabla para confirmar la identificación presuntiva de los anaerobios.

5-

La presencia de colonias con doble zona de beta hemólisis. Y que microscópicamente son bacilos gram-positivo gruesos, generalmente poco o no esporulados, indican la presencia de Clostridium perfringens. Esta bacteria se aisla de lesiones gangrenosas y heridas contaminadas con tierra (gangrena gaseosa). Debe reportarse inmediatamente.

6-

La mayoría de anaerobios que causan infección verdadera en humanos son gram-negativo, en especial Bacteroides fragilis. Identificar presuntivamente a los anaerobios gram-negativo según la tabla que aparece en la página siguiente.

199

IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA DE VARIOS ANAEROBIOS DE IMPORTANCIA MÉDiCA MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA Bacilos gram-negativo, pleomóficos; se colorean pálidamente algunos presentan cuerpos esféricos o predo minio de cocobacilos*.

Bacteroides sp.

Bacilos pálidamente gram-negativo, finos con los extremos en punta*.

Fusobacterium sp.

Pequeños diplococos* gram-negativo, semejantes a Neisseria pero mucho más pequeños.

Veillonella sp.

Bacilos gram-positivo gruesos o finos que presentan esporas las cuales no se tiñen con Gram.

Clostridium sp.

Cocos gram-positivo ovalados o lanceolados* con tendencia a agruparse en cadenas; semejantes a Streptococcus sp., pero anaerobios.

*

REPORTAR

Peptostreptococcus sp.

Cocos gram-positivo redondos con tendencia a agruparse en racimos*; semejantes a Staphylococcus sp., pero anaerobios

Peptococcus sp.

Bacilos gram-positivo no esporulados.

Se aisló un bacilo anaerobio gram-negativo no esporulado.

Bacilos gram-positivo no esporulados, ligeramente ramificados; colonias en forma de “muelas”.

Actinomyces sp.

Ver figura 13: Diversas Morfologías Bacterianas

200

Fig. 13 DIVERSAS MORFOLOGÍAS BACTERIANAS

Cocos sueltos

Cocos en parejas (diplococos)

Cocos en cadenas (estreptococos)

Cocos en racimos (estafilococos)

Cocos en tétradas

Cocobacilos

Bacilos en forma de maza (difteroides)

Bacilos con bordes redondeados

Bacilos con bordes cuadrados

Fusobacterium sp.

Vibrio sp.

Spirillum sp.

Borrelia sp.

Treponema sp.

201

Leptospira sp.

7-

En el caso de bacilos anaerobios gram-negativo, hacer un sub-cultivo en agar sangre de carnero y colocar en las primeras estrías los siguientes discos: -

Kanamicina Vancomicina Colistina

(1,000 mcg) (5 mcg) (10 mcg)

La presencia de halo de inhibición indica susceptible (S), no hay halo es resistente (R), V = variable. Interpretar los resultados junto con otras pruebas confirmatorias, así: Bacteria

Kanamicina

Vancomicina

Colistin

Bacteroides fragilis

R

R

R

Otros Bacteroides sp.

R

R

V

B. melaninogenicus

R

R

V

B. ureolyticus

S

R

S

Fusobacterium nucleolatum

S

R

S

F. necrophorum

S

R

S

F. mortiferum

S

R

S

F. varium

S

R

S

Fusobacterium sp.

S

R

S

Se sugiere que en los laboratorios clínicos, sea el profesional microbiólogo quien efectúe la identificación definitiva o presuntiva de los anaerobios. INFORME: Según los criterios anteriores y otros que pueden obtenerse en literatura especializada, informar las bacterias anaerobias aisladas. No se efectúa prueba de susceptibilidad para anaerobios mientras no se cuente con una técnica sencilla que pueda implementarse en los diversos laboratorios de nuestro medio. 202

CAPÍTULO 18 MICOBACTERIAS PROPÓSITO: Demostrar por medio de coloraciones y cultivos especiales la presencia de bacterias pertenecientes al género Mycobacterium especialmente Mycobacterium tuberculosis, llamado comúnmente “BK” (Bacilo de Koch). Este grupo de bacterias en forma de bacilo, se tiñen con dificultad por el alto contenido de grasas en su pared celular. Para lograr teñirlas deben usarse colorantes con fenol y/o calor. Una vez teñidas con fuchsina carbólica (fenolada) no se decoloran con alcohol acidificado. Por esta característica muy particular se les llama “bacilos alcohol-ácido resistentes” (abreviado BAAR). No usar el término “ácido-alcohol resistentes”. Las micobacterias son aerobios estrictos, no móviles, no poseen cápsula ni producen esporas. Su crecimiento es sumamente lento; la mayoría de las especies patógenas crecen después de 2 a 6 semanas de incubación a 36° C en el medio de Lowenstein-Jensen. Aproximadamente 12 especies de Mycobacterium se asocian a infección humana. En nuestro medio, sin lugar a duda, M. tuberculosis es la especie más importante. Las micobacterias en general producen granulomas destructivos de crecimiento lento, que pueden sufrir necrosis o cavitación. La detección de micobacterias es una gran responsabilidad para el laboratorio de microbiología, ya que un resultado positivo de frote o cultivo implica serias consecuencias para el paciente y afecta su vida con un tratamiento específico por varios meses, o incluso años. MUESTRAS 1.

Esputo: La tuberculosis es en nuestro medio la infección humana más importante causada por micobacterias. Esta infección crónica generalmente ocurre en los pulmones por la inhalación del agente causal, el cual por lo general es M. tuberculosis (muy rara vez M. bovis o M. kansasii). Por esta razón, el esputo es la muestra que con mayor frecuencia se remite al laboratorio para la investigación de tuberculosis.

203

El esputo debe colectarse temprano en la mañana, inmediatamente al despertar. De preferencia tres a cuatro muestras (seriadas) en días alternos. El primer esputo de la mañana es la muestra más adecuada para el análisis, pues es concentrada y menos contaminada, ya que el paciente no ha comido o bebido durante la noche. Un sólo esputo es más adecuado que un “pool” o mezcla de varias muestras. Colectar la muestra de esputo así: el esputo, al igual que cualquier otra muestra para micobacterias, debe colectarse antes de iniciar tratamiento, que puede inhibir el crecimiento. Indicar al paciente que al despertar se enjuague la boca dos veces con agua corriente; no usar pasta dental o cualquier otro antiséptico. Acostado boca abajo en su cama, el paciente debe desgarrar esputo lo más profundamente posible; así como estar consciente de que descargas nasofaríngeas o saliva no son esputo. El esputo se produce después de un acceso de tos que expulsa material exudativo de los pulmones; 5 a 10 ml de esputo es la cantidad adecuada para análisis, pero cualquier volumen debe procesarse. El paciente debe depositar la muestra en un recipiente estéril de boca ancha proporcionado por el laboratorio. De preferencia deberán usarse recipientes especiales de plástico descartables, del tipo que incluye adentro un tubo grueso para efectuar el proceso. El buen esputo para análisis de micobacterias es caseoso (apariencia de queso), puede ser verdoso o amarillento. Si no se remite o procesa rápidamente, adicionar aproximadamente 0.5 g de carbonato de sodio (Na2CO3), para disminuir el crecimiento de contaminantes y luego debe refrigerarse o congelarse. Se debe identificar bien la muestra con una etiqueta que tenga el nombre y número de registro del paciente, la fecha y tipo de muestra. Debido a que el exterior del recipiente puede contaminarse durante la obtención de la muestra, debe colocarse en una bolsa plástica y luego llevarse al laboratorio. Si el paciente produce muy poca cantidad de esputo, puede examinarse un “pool” de 24 a 48 horas de colección continua, aunque no es lo deseable. 204

En pacientes que tienen dificultad para producir esputo puede usarse varios métodos:

2.

a)

Nebulización de solución salina hipertónica (cloruro de sodio al 10%, sin propilenglicol), es excelente para inducir la producción de esputo, generalmente diluído.

b)

Los hisopos faríngeos pueden ser usados en estos pacientes para extraer el esputo. Especialmente este procedimiento es aconsejable para niños pequeños a los cuales no se les puede pedir una muestra adecuada.

c)

Broncoscopía: puede ser usada para obtener las muestras directamente del sitio infectado. Se obtienen muy buenas muestras.

Lavado gástrico: Frecuentemente se solicita lavado gástrico para análisis de micobacterias. No se usa para detectar tuberculosis del estómago, sirve para demostrar micobacterias del esputo que el paciente involuntariamente se ha tragado. Este procedimiento está indicado en los siguientes pacientes: a)

Con evidencia radiológica de tuberculosis pulmonar y en quienes los exámenes de esputo son negativos.

b)

En pacientes que no cooperan, diciendo que no producen esputo o se lo tragan.

c)

Los que no pueden expectorar porque padecen de otros trastornos: estados de coma, enfermedad neurológica, etc.

d)

En los niños en los que normalmente se hace difícil obtener la muestra de esputo.

La investigación microscópica de BAAR en lavado gástrico no es recomendable como un procedimiento diagnóstico único y definitivo, pues BAAR como M. gastri forman parte de la microbiota gástrica y no se pueden diferenciar de M. tuberculosis. Sin embargo, múltiples BAAR en contenido gástrico generalmente se correlacionan con cultivos positivos de M. tuberculosis y constituye información valiosa inmediata con utilidad clínica. 205

El lavado gástrico debe ser efectuado en la mañana, cuando el estómago está vacío (por lo menos 8 horas después que el paciente ha comido o tomado medicamentos orales), es mejor que el paciente se levante de su cama y que la muestra se obtenga 30 minutos después de inducir esputo por nebulización. Deben usarse sondas de Levin, jeringas estériles de 50 ml y 20 a 30 ml de agua destilada estéril. Introducir la sonda al estómago por la nariz, inyectar el agua, succionar e inyectar de nuevo varias veces. La muestra obtenida debe colocarse en recipiente estéril de boca ancha. Debido a que las micobacterias pueden destruirse rápidamente en los lavados gástricos por la acción del ácido clorhídrico del estómago, la muestra debe ser procesada en un período de tiempo que no exceda de 20 minutos. Si por cualquier circunstancia no es posible procesarla rápidamente, es necesario neutralizarla, agregando carbonato de sodio al 10%, solución de fosfato trisódico anhidro al 10%, solución de fosfato trisódico con 12 moléculas de agua al 23% o bien cristales de fosfato disódico. En todos los casos es aconsejable usar rojo fenol como indicador para saber si el pH está entre 7 y 8. No neutralizar las muestras que son procesadas antes de 4 horas después de obtenidas y mantenidas en refrigeración. 3.

Orina: Se debe examinar un mínimo de tres muestras de la primera orina de la mañana colectada “al vuelo” en recipiente estéril de boca ancha (ver capítulo 7), o muestras obtenidas por catéter. Se debe colectar toda la orina posible cada vez, algunas veces se utiliza orina colectada durante 12 a 24 horas, la cual es menos adecuada porque generalmente está muy contaminada y contiene menos micobacterias viables que la primera orina de la mañana. Las muestras deben mantenerse refrigeradas mientras se procesan lo antes posible; no utilizar recipientes con preservativos.

4.

Otro tipo de muestras: La tuberculosis es una infección que puede localizarse en casi cualquier parte del cuerpo, por esta razón pueden analizarse las siguientes muestras de líquidos, exudados o tejidos: Lavado bronquial Fragmentos de pulmón Hisopo faríngeo Líquido cefalorraquídeo Líquido pleural Líquido articular Pus 206

-

Raspado endometrial/sangre menstrual Médula ósea Líquido pericárdico Trozos de varios tejidos obtenidos en autopsia Heces (en ocasiones muy especiales)

Por lo general este tipo de muestras son obtenidas por el médico en recipientes estériles proporcionados por el laboratorio. Si es necesario se puede adicionar heparina o citrato de sodio como anticoagulantes; no usar preservativos o fijadores. Es conveniente obtener un volumen grande de muestra; si la cantidad es pequeña adicionar solución salina para evitar desecación. Si la muestra no se examina inmediatamente debe refrigerarse. PROCEDIMIENTO: Baciloscopía: El diagnóstico de micobacteriosis se basa en la observación de los bacilos alcohol-ácido resistente en la muestra y su cultivo in vitro. Los bacilos alcohol-ácido resistentes deben teñirse con las coloraciones de Ziehl-Neelsen o Kinyoun; ambas tinciones dan buenos resultados. La diferencia fundamental consiste en lo siguiente: Ziehl-Neelsen sí utiliza calentamiento de la lámina y Kinyoun no, además la fuchsina de Kinyoun es más concentrada. Coloración de Ziehl-Neelsen: Preparar frotes delgados de la muestra a examinar. Si se trata de esputo trasladar la muestra a una caja de Petri estéril y examinarla con buena luz sobre fondo oscuro. Con aplicadores de madera quebrados, seleccionar los fragmentos anormales (con pus verdoso, blanquesino o amarillento; sangre rojiza o herrumbrosa). Colocar un pequeño fragmento entre dos portaobjetos de vidrio, aplastar varias veces el esputo y luego deslizar una lámina sobre otra para obtener dos frotes parejos y delgados. Escoger el mejor, dejar secar y luego fijar moderadamente con calor sobre la llama del mechero (igual que para la coloración de Gram). Puede colorearse sedimento del esputo digerido/ descontaminado, u otras muestras clínicas. Procedimiento de la coloración de Ziehl-Neelsen: 1-

Poner el frote ya fijado y frío en el soporte de coloración cerca del lavatrastos, colocarle encima un trozo de papel filtro para que mantenga el colorante sobre el frote. 207

12-

Cubrir el papel filtro con fuchsina carbónica de Ziehl-Neelsen; debe quedar bien empapado.

13-

Calentar cuidadosamente la lámina por debajo, ya sea con un mechero de alcohol o con un hisopo grande empapado en alcohol. Calentar suavemente hasta el aparecimiento de humos blancos. No debe hervir. Dejar colorear el frote por 5 minutos sin calentar más. Si la lámina se seca agregar más fuchsina sin volver a calentar.

14-

Remover el papel filtro y lavar con agua corriente (usar poca presión).

15-

Decolorar el frote con alcohol-ácido hasta que ya no salga más colorante rojo (aproximadamente 2 minutos). Debe insistirse en la decoloración ya que es el paso diferencial. Los frotes gruesos requieren mayor tiempo de decoloración, pero tampoco se debe decolorar excesivamente.

16-

Lavar brevemente con agua corriente.

17-

Cubrir el frote con azul de metileno por 1 ó 2 minutos.

18-

Lavar con agua corriente.

19-

Dejar secar al aire o flamear muy brevemente, pero no secar con papel absorbente.

10-

Examinar el frote con el lente de inmersión, con cuidado de limpiar el aceite del lente entre cada frote para no acarrear micobacterias de una muestra a otra.

11-

No efectuar coloraciones simultáneas de varias muestras en recipientes de Coplin, porque también puede haber transferencia de micobacterias entre las muestras.

REACTIVOS PARA ZIEHL-NEELSEN 1-

Fuchsina carbólica de Ziehl-Neelsen (colorante principal) Solución saturada de fuchsina básica .............................. 10 ml Preparar solución saturada de fuchsina básica así: Disolver 3 gramos de fuchsina básica en 100 ml de alcohol etílico al 95%.

208

Solución acuosa de fenol al 5% ........................................ 90 ml Preparar solución de fenol al 5%, así: (Fundir los cristales de fenol en baño de María, medir 5 ml con probeta, (no con pipeta), y luego llevar a volumen de 100 ml con agua destilada estéril. 2-

Alcohol-ácido (decolorante): Acido clorhídrico concentrado ......................................... 93 ml Alcohol etílico al 95% ........................................................ 95 ml

3-

Azul de metileno (colorante de contraste): Cloruro de azul de metileno ........................................... 0.3 gramos Agua destilada .................................................................. 100 ml Según F. Ziehl (1882), y Neelsen (1885), Alemania.

COLORACIÓN DE KINYOUN: Esta coloración da buenos resultados, comparables al Ziehl-Neelsen, si se efectúa según la técnica exacta. Tiene la ventaja que no necesita calentamiento. Proceder así: 1-

Preparar el frote igual que para Ziehl-Neelsen y fijarlo con calor.

2-

Colocar la lámina en la gradilla de coloración y dejar que enfríe. Cubrir el frote con fuchsina de Kinyoun y dejar que se coloree por 4 minutos. No es necesario calentar.

3-

Lavar con agua corriente.

4-

Decolorar el frote con alcohol-ácido hasta que ya no salga más colorante rojo. Insistir en este paso pues es el que diferencia a las bacterias.

5-

Lavar con agua corriente.

6-

Cubrir el frote con azul de metileno por 1 ó 2 minutos.

7-

Lavar con agua corriente.

8-

Dejar secar y examinar con el lente de inmersión. En general tomar las mínimas precauciones que para la coloración de Ziehl-Neelsen. 209

REACTIVOS PARA KINYOUN 1-

Fuchsina carbólica de Kinyoun: Fuchsina básica .................................................................... 4 gramos Fenol fundido ................................................................... 128 ml Alcohol etílico al 95% ...................................................... 120 ml Agua destilada .................................................................. 100 ml Disolver la fuchsina en el alcohol y luego adicionar el agua lentamente con agitación. Fundir cristales de fenol en baño de agua caliente a 56° C, medir con pipeta 8 ml y adicionar a la fuchsina.

2-

Alcohol ácido: igual al de Ziehl-Neelsen (ácido clorhírico concentrado: 3 ml, más alcohol etílico al 95%: 97 ml)

3-

Azul de metileno: igual al de Ziehl-Neelsen (0.3 gramos de cloruro de azul de metileno, disolver en 100 ml de agua destilada). Según Kinyoun: Am. J. Pub. Health, 5: 867, 1915.

INTERPRETACIÓN E INFORME DE BACILOSCOPIAS: La característica de “alcohol-ácido resistencia” típica de las micobacterias hace que la baciloscopía tenga una importancia fundamental. Se usa para seguir el curso del tratamiento y para dar de alta al paciente en el hospital, para continuar su tratamiento ambulatorio. Tomar muy en cuenta las siguientes consideraciones: 1-

Sin excepción alguna, utilice la siguiente clave para reportar todos los frotes para micobacterias. Esta forma de reportar ha sido estandarizada por la Asociación Nacional de Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias de Estados Unidos, con el objeto de poder comparar resultados de distintos laboratorios y orientar adecuadamente al médico.

210

REPORTE DE FROTES PARA MICOBACTERIAS NÚMERO DE BACILOS ALCOHOL-ÁCIDO RESISTENTE 0

REPORTE No se observan bacilos alcohol-ácido resistentes

1 a 2 en todo el frote

Informar el número de BAAR encontrados y pedir nueva muestra

3 a 9 en todo el frote

+ o escasos

10 ó más en todo el frote

++ o regular cantidad

1 ó más por campo

+++ o abundantes

2-

Un frote para diagnóstico de tuberculosis o cualquiera otra micobacteriosis debe examinarse de 10 a 15 minutos antes de darse por negativo. Si se trata de L.C.R. debe observarse aún por más tiempo.

3-

La especie del microorganismo alcohol-ácido resistente no puede determinarse sólo por la morfología microscópica, debe hacerce por cultivo. Sin embargo, algunas características pueden orientar, por ejemplo: Nocardia spp. frecuentemente produce ramificaciones y Mycobacterium kansasii puede formar células largas y anchas, con coloración en bandas.

4-

La característica alcohol-ácido resistente de un microorganismo puede variar con la edad del cultivo o exposición a drogas.

5-

Con el lente de inmersión, Mycobacterium tuberculosis aparece típicamente como bacilos bien definidos, ligeramente curvos, de color rojo brillante (se aprecia mejor con luz intensa). Pueden aparecer con coloración discontinua en forma de varios gránulos de color rojo más intenso, observar con atención gránulos rojos en la preparación ya que pueden ser parte de un BAAR.

6-

En el frote pueden aparecer artefactos alcohol-ácido resistentes, especialmente si el frote es grueso o no fue suficientemente decolorado. Sólo bacilos bien definidos deben considerarse BAAR.

7-

En caso que se observen muy escasos BAAR debe repetirse el frote. Si el frote 211

es muy grueso es probable que se desprenda de la lámina durante la coloración, por esto debe evitarse la transferencia de BAAR de una preparación a otra por medio de aceite de inmersión, lentes sucios o colorantes. 18-

Ocasionalmente, la buena selección de las partes anormales de la muestra para preparar el frote puede dar resultados mucho mejores que el uso de concentraciones.

19-

Puede ocurrir que la misma muestra sea negativa por frote, pero positiva por cultivo, ya que la baciloscopía es menos sensible para detectar micobacterias que el cultivo.

10-

Nunca dejar el azul de metileno por más tiempo del indicado: 1 ó 2 minutos.

11-

A veces es difícil distinguir los artefactos acidófilos (rojos) de verdaderos bacilos alcohol-ácido resistentes. La observación de “cuerpos esféricos alcoholácido resistentes” debe mencionarse como “sospechosa”. Los “gránulos de Much” son micobacterias, sin pared celular (esferoplastos), son gram-positivo y no alcohol-ácido resistentes.

12-

La liberación irregular de micobacterias de los focos endotraquiales puede dar frotes positivos y negativos en el mismo paciente.

13-

Los BAAR observados no presentes originalmente en la muestra, pueden provenir del agua del chorro, colorantes contaminados, recipientes o de portaobjetos sucios.

CULTIVO PARA MICOBACTERIAS Los procedimientos para obtener el crecimiento in vitro de las microbacterias son especializados; deben seguirse estrictamente las instrucciones para tener éxito en su recuperación. Por lo general, las muestras para cultivo de micobacterias contienen muchas bacterias de las microbiotas, especialmente el esputo que siempre se contamina con microbiota de la boca. Además el esputo es una muestra difícil de manipular por su mucosidad, tenacidad y adherencia. Por estas razones para su cultivo, el esputo debe digerirse para hacerlo líquido y descontaminarse; es decir, darle algún tratamiento químico para destruir las bacterias contaminantes que crecen rápido, pero sin destruir a las micobacterias.

212

DIGESTIÓN Y DESCONTAMINACIÓN DE ESPUTOS Para efectuar la digestión/descontaminación de esputos pueden usarse dos métodos: aMétodo convencional de hidróxido de sodio bMétodo de N-acetil-levo-cisteína (NALC) El método de hidróxido de sodio es muy fuerte y destruye un porcentaje considerable de micobacterias. Por esa razón, debe hacerse todo lo posible para implementar la técnica de NALC. El método de la acetil-cisteína proporciona mayor porcentaje de aislamiento de micobacterias pero su desventaja consiste en la dificultad de conseguir esta sustancia química en nuestro medio. La N-acetil levocistenía (NALC), puede obtenerse de las siguientes compañías: aBBL, Cockeysville, Maryland, USA. bMead Johnson Research Center, Evansville, Indiana, USA. cSigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA. La NALC digiere el moco del esputo por ruptura de las uniones disalfuro de la mucina y además destruye las bacterias comunes sin dañar a las micobacterias. Al procesar esputos u otras muestras para cultivo, debe hacerse con sumo cuidado y dentro de una campana bacteriológica. Descartar todo el material contaminado en recipientes con fenol al 5 por ciento. Evitar los aerosoles que se producen al flamear las asas; introducirlas antes de flamear dentro de un recipiente con alcohol y arena en el fondo (el alcohol debe quedar 2.5 cms por encima de la arena). Método de digestión/descontaminación con N-acetil-levo-cisteína (NALC). (Según Kubica et al. Am. Rev. Respir. Dis. 89:284, 1964) 1-

El reactivo para digerir/descontaminar es inestable pues es inactivado por oxígeno, iones de metales pesados y hemoglobina. Por esta razón, el reactivo debe prepararse diariamente y sólo dura un día. Si sobra solución NALC, puede guardarse en frasco bien cerrado y usarse al día siguiente, pero nunca al tercer día después de preparada. El polvo de NALC debe mantenerse refrigerado. Debe prepararse sólo la cantidad de solución que se usará en un día mezclando los tres componentes así:

213

Cantidad a preparar

NaOH al 4% estéril

Citrato de sodio al 2.9% estéril

Polvo de NALC (refrigerado)

125 ml

12.4 ml

12.5 ml

0.125 g

150 ml

25 ml

25 ml

0.25 g

100 ml

50 ml

50 ml

0.5

g

Las soluciones individuales deben prepararse así: -

Hidróxido de sodio Na0H al 4% (1N): Disolver 40 g de hidróxido de sodio para análisis en 1 litro de agua destilada. Autoclavear y guardar a temperatura ambiente. Si precipita descartar.

-

Citrato de sodio al 2.9% (0.1M): Disolver 29.4 g de citrato de sodio anhidro en 1 litro de agua destilada. Autoclavear y guardar a temperatura ambiente. Si precipita descartar.

2-

Colectar la muestra de esputo según lo indicado. Transferir aproximadamente 10 ml a un tubo plástico, descartable de 50 ml. Esto debe hacerse bajo una campana bacteriológica. Limpiar la superficie de trabajo periódicamente, con desinfectante.

3-

Agregar un volumen igual del reactivo de acetil-cisteína, pero no más que el volumen de esputo. Si el esputo es muy escaso o mucoso agregar el NALC directamente al recipiente de colección y luego pasar al tubo.

4-

Tapar bien el tubo, y agitar bien en agitador “vortex” de 5 a 20 segundos o hasta que el esputo se digiera. La agitación demasiado violenta puede desnaturalizar el reactivo NALC.

5-

Dejar en reposo exactamente 15 minutos a temperatura ambiente, para que la muestra se descontamine.

6-

Llenar el tubo con agua destilada estéril, hasta que el nivel del líquido quede 12 mm por debajo del borde. Tapar el tubo y agitar por inclinación para mezclar bien.

7-

Centrifugar a 3,000 rpm (1800 a 2400 g) por 15 minutos. 214

18-

Decantar el tubo a manera de guardar el sedimento (sobre un recipiente con desinfectante, formol al 10%). Flamear la boca de los tubos para evitar contaminación.

19-

Con una pipeta serológica estéril, adicionar al sedimento 1.0 ml de albúmina bovina al 0.2% (aproximadamente 20 gotas), mezclar bien a mano. Efectuar asépticamente un frote si este no se ha hecho de esputo original, colorear con Ziehl-Neelsen o Kinyoun.

10-

Con pipeta capilar estéril, inocular dos gotas del sedimento con albúmina en la superficie de un tubo (dos de preferencia según disponibilidad), de medio de cultivo Lowenstein-Jensen.

11-

Colocar los tubos dentro de la incubadora a 36° C, inclinados de manera que la superficie del medio quede totalmente horizontal por 1 a 2 días para distribuir bien el inóculo; luego incubar verticalmente en gradilla.

12-

De preferencia colocar a cada tubo un capuchón de cartulina negra para evitar que al cultivo le de la luz. Dejar el tapón de rosca ligeramente flojo.

DIGESTIÓN/DESCONTAMINACIÓN DE ESPUTOS POR EL MÉTODO CONVENCIONAL DE HIDRÓXIDO DE SODIO Este procedimiento es muy utilizado, pero el porcentaje de recuperación de micobacterias es menor que el que se obtiene con el método de la acetil-cisteína. Utilizar este método sólo si no se consigue el polvo de NALC. 1-

Trasladar asépticamente el esputo a una caja de Petri, sobre fondo oscuro. Con dos aplicadores con las puntas quebradas, seleccionar las porciones anormales del esputo (pus, sangre, etc.).

2-

En un tubo de centrífuga grande, colocar una fracción anormal del esputo. Adicionar igual volumen de hidróxido de sodio al 3.5% con 0.004% de rojo fenol. Agitar vigorosamente por 10 minutos, de preferencia en máquina homogenizadora.

3-

Centrifugar el tubo a 3,000 rpm por 20 minutos.

4-

Decantar cuidadosamente el sobrenadante sobre un recipiente con desinfectante. 215

5-

Con pipeta Pasteur estéril, adicionar lentamente ácido clorhídrico 2N, hasta obtener un color amarillo definitivo.

6-

Neutralizar el sedimento con unas pocas gotas de hidróxido de sodio al 3.5% hasta un punto final con un color rosado débil.

7-

Inocular un tubo del medio de Lowenstein-Jensen con dos asadas del sedimento.

8-

Incubar a 36° C según lo indicado.

Reactivos para la técnica de digestión/descontaminación con Na0H: 1-

Hidróxido de sodio al 3.5% con 0.004% rojo fenol: Pesar 35 gramos de hidróxido de sodio para análisis, colocar las lentejas ya pesadas dentro de un balón aforado de 1 litro. Poner el balón en baño de agua fría, y adicionar lentamente agua destilada con agitación constante hasta casi llegar a la marca. Dejar enfriar y luego aforar exactamente a la marca de un litro. Pesar 0.04 g (40 mg) de rojo fenol en polvo. Adicionarlo al hidróxido y mezclar bien hasta obtener una solución rosado fuerte.

2-

Acido clorhídrico 2N: Medir 16 ml de ácido clorhídrico concentrado en el fondo de un balón aforado de 1 litro. Adicionar lentamente agua destilada hasta aforar a la marca de 1 litro.

Procedimiento de digestión/descontaminación para esputos de pacientes cuyas muestras están constantemente contaminadas con Pseudomonas sp. o Proteus sp: 1-

Agregar al esputo un volumen igual de ácido oxálico al 5% (si no se cuenta con este reactivo usar ácido sulfúrico al 4%).

2-

Mezclar en agitador vortex y dejar en reposo 30 minutos a temperatura ambiente, con agitación ocasional.

3-

Agregar solución salina estéril para bajar el peso específico y diluir el ácido.

4-

Centrifugar a 3,000 rpm (1800 a 2400 g) por 15 minutos. 216

5-

Decantar el líquido sobrenadante y neutralizar el sedimento con NaOH al 3.5% con 0.004% de rojo fenol.

6-

Inocular dos asadas del sedimento en Lowenstein-Jensen.

Procedimiento para lavados gástricos Si el material es mucoide: 1-

Agregar una pizca (50 a 100 mg) de polvo NALC a 20-50 ml del lavado gástrico.

2-

Mezclar manualmente en agitador vortex.

3-

Centrifugar a 3,000 rpm por 30 minutos.

4-

Decantar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 2 a 5 ml de agua destilada estéril.

5-

Agregar un volumen igual de la solución NALC-NaOH y proceder igual que esputo.

Si el material es fluido: 1-

Centrifugar toda la muestra por 30 minutos a 3,000 rpm.

2-

Decantar el líquido sobrenadante y resuspender el sedimento en 2 a 5 ml de agua destilada estéril. Unir todos los sedimentos si se centrifugan varios tubos.

3-

Agregar igual volumen de la solución NALC-NaOH y proceder igual que esputo.

Procedimiento para orina: 1-

Centrifugar toda la muestra de la primera orina de la mañana por 30 minutos a 3,000 rpm. Puede ser necesario utilizar varios tubos estériles.

2-

Decantar los sobrenadantes, y unir los sedimentos.

3-

Agregar al sedimento igual volumen de ácido sulfúrico al 4%. 217

4-

Mezclar y dejar en reposo por exactamente 15 minutos.

5-

Llenar el tubo con agua destilada estéril.

6-

Centrifugar a 3,000 rpm por 15 minutos.

7-

Decantar el sobrenadante y agregar al sedimento unas gotas de albúmina bovina al 0.2%.

Procedimiento para hisopo faríngeo: 1-

Trasladar el hisopo con pinzas flameadas a un tubo de centrífuga estéril (sólo la punta).

2-

Agregar 2 ml de agua destilada estéril o solución salina estéril.

3-

Agregar 2 ml de la solución digestora NALC-NaOH.

4-

Agitar en agitador vortex.

5-

Dejar en reposo 15 minutos.

6-

Remover el hisopo del tubo con pinzas flameadas.

7-

Llenar el tubo con agua destilada estéril hasta 12 mm del borde.

8-

Centrifugar 15 minutos a 3,000 rpm y continuar el procedimiento como esputo.

Procedimiento para tejido o piel: 1-

Utilizar macerador de tejidos o mortero estéril para triturar la muestra asépticamente en solución salina estéril. Si el tejido es mucoso (por ejemplo pulmón), adicionar una pizca de polvo NALC. Si se desea investigar hongos patógenos es mejor no triturar, mejor cortar en pedazos finos con tijeras estériles.

2-

Si la muestra fue colectada asépticamente, inocular directamente un pequeño trozo en Lowenstein-Jensen.

3-

Si el tejido no ha sido colectado asépticamente, colocar el macerado en un tubo estéril y procesar como esputo. 218

Procedimiento para otros fluidos corporales: Si el material es muco-purulento: 1-

Procesar igual que esputo si el volumen es de 10 ml o menos.

2-

Si el volumen es mayor de 10 ml, proceder como lavado gástrico mucoso.

Si el material es fluido: 1-

Si el material se obtuvo asépticamente, centrifugar o inocular el sedimento directamente en Lowenstein-Jensen.

2-

Si el material no se obtuvo asépticamente, proceder como esputo si el volumen es menor de 10 ml, si es mayor procesar como lavado gástrico fluido.

3-

Efectuar procedimientos especiales para aislamiento de micobacterias de sangre o heces fecales, debe justificarse plenamente y por lo general no se efectúa. Médula ósea: sembrar directamente en Lowenstein-Jensen.

INTERPRETACIÓN DEL CULTIVO Examinar los tubos con lupa o microscopio estereoscópico y buena luz, a los 5 días después de inoculados, y luego una vez por semana, los días lunes, para observar crecimiento. Los tubos negativos deben incubarse hasta 6 a 8 semanas, a 36° C, antes de ser descartados como negativos. Debe reportarse como negativo a las 6 semanas; si hay crecimiento posterior debe modificarse el reporte. Las micobacterias pueden producir en el medio de Lowenstein-Jensen dos tipos de colonias: -

Eugónicas: Colonias secas, superficie rugosa, bordes irregulares color crema amarillento. Son típicas de la mayoría de micobacterias especialmente M. tuberculosis. M. kansasii es menos rugoso.

-

Disgónicas: Colonias brillantes de superficie lisa y bordes enteros típicas de Mycobacterium bovis y Mycobacterium avium-intracelulare. Al observarse estos tipos de crecimiento en el tubo de Lowenstein-Jensen de preferencia observados con microscopio estereoscópico, hacer frote en una gota de solución salina o colorear con Ziehl-Neelsen. 219

Si se observan colonias eugónicas de color crema formadas por bacilos alcohol-ácido resistentes (las cepas más virulentas con “factor cordón”: forman cordones sinuosos de bacilos agrupados paralelamente), y no produce pigmento, presuntivamente se trata de Mycobacterium tuberculosis. Reportar el crecimiento observado cuantitativamente según esta tabla: Número de colonias

Reporte de cantidad

No se observan colonias

Negativo para Mycobacterium tuberculosis

Menos de 50 colonias

Mencionar el número de colonias

50-100 colonias

+(1+)

100-200 colonias

++ ( 2 + )

Casi confluente (200-500)

+++ ( 3 + )

Confluente (más de 500)

++++ ( 4 + )

Por ejemplo si el tubo de Lowenstein-Jensen presenta el crecimiento de 70 colonias eugónicas de BAAR, identificadas como M. tuberculosis por niacina, e informar: Se aisló Mycobacterium tuberculosis +. Identificar M. tuberculosis por las siguientes características: 1-

Crecimiento lento de colonias eugónicas no pigmentadas en LowensteinJensen que crecen entre 4 y 7 semanas.

2-

El Ziehl-Neelsen de estas colonias revela BAAR cortos, ligeramente curvos de coloración sólida, a veces agrupados en cordones.

3-

Confirmar con la reacción de producción de niacina positiva.

Prueba de niacina: La producción de la vitamina niacina (ácido nicotínico) en el medio Lowenstein-Jensen es típica de M. tuberculosis. Las otras micobacterias son niacina negativo, por lo que con esta única prueba se logra una diferenciación adecuada. Esta diferenciación se conoce desde 1955 según Konno et al. (Science, 124: 985, 1956 y Am. Rev. Resp. Dis. 75: 529, 1957). 220

Las colonias eugónicas no pigmentadas sobre el medio, producen niacina la cual se difunde hacia el medio. La niacina se produce lentamente al igual que se desarrollan las colonias. Por esta razón, la prueba sólo puede hacerse en cultivos puros que tengan de 50 a 100 colonias (1 +), y de 3 a 4 semanas de incubación. Se utiliza un procedimiento sencillo de extracción de la niacina que se encuentra en el medio (no en las colonias), la cual luego se identifica por la producción de un color amarillo en las tiras que contienen los reactivos químicos adecuados. Proceder así si el cultivo llena los requisitos mencionados: 1-

Al tubo de Lowenstein-Jensen, con un cultivo puro de colonias eugónicas (50 a 100) no pigmentadas y 3 a 4 semanas de incubación, agregar 1.5 ml de agua destilada estéril o solución salina estéril. No usar cultivos contaminados que presentan coloración azul en el Lowenstein-Jensen.

2-

Con el asa espatulada o pipeta capilar, cortar profundamente varias veces el medio de cultivo dentro del tubo, para que el agua o solución salina penetre y extraiga la niacina.

3-

Inclinar el tubo sobre algún soporte, de manera que la superficie del medio quede horizontal y cubierta de líquido.

4-

Dejar el tubo en reposo en esta posición por 30 minutos.

5-

Colocar el tubo verticalmente en una gradilla con mucho cuidado, succionar aproximadamente 0.6 ml de extracto con pipeta Pasteur y bulbo. Pasarlo al fondo de un tubo 13 X 75 mm con tapón de rosca. Marcar el tubo con el número de muestra.

6-

Como control negativo, pipetear 0.6 ml del agua o solución salina utilizada para hacer el extracto en otro tubo 13 X 75 mm. Marcar el tubo “control negativo”.

7-

Con pinzas flameadas, dejar caer en ambos tubos una tira reactiva de niacina (DIFCO 3182-30-8, Bacto-TB Niacina Test Strips), de manera que la flecha indicadora quede apuntando al fondo del tubo; tapar los tubos inmediatamente. Mantener las tiras en refrigeración.

8-

Agitar los tubos suavemente; repetir esta agitación suave de 5 a 10 minutos. 221

9-

Después de 12 a 15 minutos, pero no después de 30 minutos, comparar el color de los extractos.

10-

Interpretación: la prueba de niacina es positiva si aparece color amarillo en el extracto de la muestra, y el control negativo no presenta color. Autoclavear los tubos con extractos de muestras.

Si el cultivo en Lowenstein-Jensen presenta crecimiento de colonias pigmentadas (amarillo-anaranjado), o de crecimiento rápido (antes de 5 días), o niacina negativo, se debe sospechar de otras especies “atípicas” del género Mycobacterium o más correctamente de los grupos de Runyon. En Guatemala son mucho menos frecuentes que Mycobacterium tuberculosis. En este caso el personal técnico deberá entregar el cultivo al microbiólogo a cargo del laboratorio, quien clasificará el BAAR aislado en alguno de los cuatro grupos de Runyon por medio de pruebas especiales. Grupos de Runyon (micobacterias “atípicas”): Grupo I: Fotocromógenos: producen pigmento sólo cuando el cultivo se expone a la luz. En la obscuridad producen colonias sin pigmentación, son de crecimiento lento. Ejemplos: Mycobacterium kansasii y Mycobacterium marinum (crece a 30°C). Grupo II: Escotocromógenos: producen pigmento tanto en la oscuridad como en la luz y son de crecimiento lento. Ejemplo: Mycobacterium scrofulacem, que causa adenopatía cervical en niños. Grupo III: No fotocromógenos: no producen pigmento y son de crecimiento lento. Ejemplo: Mycobacterium avium-intracelulare. Grupo IV: Crecedores rápidos: se caracterizan por crecer antes de 7 días de incubación. Ejemplo: Mycobacterium fortuitum, puede causar tuberculosis resistente a varias drogas.

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Esta publicación fue impresa en los talleres gráficos de Editorial Serviprensa C.A. de Guatemala, C.A. en el mes de septiembre de 1996. Esta edición consta de 1,000 ejemplares en papel bond 80 gramos.