Macromoléculas de La Levadura (1)

MACROMOLÉCULAS DE LA LEVADURA

Isabella García Oliveros1, Jennifer Lorena Gómez2, Valentina Herrera Arbeláez3 Resumen En esta práctica se separó por medio de la centrifugación las principales macromoléculas de la levadura, se identificó cualitativamente dichas macromoléculas como, proteínas, ácidos nucleicos y glucógeno. Se pudo reconocer la presencia de ARN en levadura y también la carga de proteínas de la misma, con ayuda de la solución salina al 0.15M.Esta práctica también permitió aplicar la prueba de Biuret. Palabras clave: prueba de Biuret, macromoléculas, levadura, ARN, ácidos nucleicos, centrifuga. Introducción Las macromoléculas son moléculas de gran dimensión, constituidas por varias moléculas que pueden ser similares entre sí o no y que están formadas por miles de átomos. Generalmente se pueden describir como la repetición de una o unas pocas unidades mínimas o monómeras, formando los polímeros. En los cuales se relacionan las proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos y lípidos. La presencia de proteínas en una mezcla se puede determinar mediante la reacción del Biuret. El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina (de NaOH o KOH). La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos presentando un máximo de absorción a 540 nm. 1

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Procedimiento En un mortero se colocó el equivalente a una cucharadita de levadura de panadería, lavada y seca.se agrego una cucharadita de arena lavada y seca y se trituro cuidadosamente por 5 minutos. Se agregó 15 ml de ácido tricloroacético al 5 % y se macero cuidadosamente por tres minutos más. Se dejó que la arena se asentara y decantara la suspensión lechosa vertiéndola a un tubo de centrífuga. Se Centrifugó a 3000 revoluciones durante 5 minutos. Se obtuvo un precipitado que contenía ácidos nucleicos y un sobrenadante que contenía glucógeno. Se pasó el sobrenadante a un tubo de ensayo y el tubo de centrífuga con el precipitado se colocó en un baño de hielo.se precipitó el glucógeno añadiendo 2 volúmenes de alcohol etílico, agitando y enfriando en el baño de hielo. Se pasó este medio a un tubo de centrífuga y se centrifugo a 3000 r.p.m. se descartó el sobrenadante y se disolvió el precipitado en 1 ml de agua destilada. Se utilizó como control otro tubo de ensayo 1 ml de agua destilada y a ambos se agregó 1 ml del reactivo de yodo, el cual tiño el glucógeno de pardo rojizo. Se tomó el precipitado de ácidos nucleicos y proteínas y se agrego 15 ml de cloruro de sodio al 10 %, agitando cuidadosamente. Cómo tenía este medio con el tubo de centrífuga, se pasó a un tubo de ensayo y se colocó en un baño de agua hirviendo por 10 minutos. Luego se enfrió cuidadosamente y se pasó el medio a un tubo de centrífuga, centrifugando a 3000 r.p.m., durante 3 minutos. Él sobrenadante contenía ácidos nucleicos, se pasó a un tubo de ensayo, y se dejó el precipitado proteico en un baño de hielo.se tomo el tubo que contiene los ácidos nucleicos y se precipitó añadiendo 2 volúmenes de etanol frío, lentamente y agitando sobre un baño de hielo y dejándolo por unos 3 minutos. Se vertió el contenido a un tubo de centrífuga y se centrifugo durante 3 minutos a 3000 r.p.m. se Descartó el sobrenadante y se disolvió el precipitado en 2 ml de amortiguador salino. Se Colocó en otro tubo como control 2 ml de amortiguador salino, y a ambos se agregó 3 ml del reactivo de orcinol; se colocó los tubos en un baño de agua hirviendo durante algunos minutos. Una coloración verde indico la presencia de ARN. Se tomó el precipitado de proteínas coaguladas y se disolvió con 2 ml de solución salina 0.15M.En otro tubo de ensayo, como control se colocó 2 ml de la solución salina.se añadió a cada tubo 1 ml de la solución de sulfato de cobre, luego 2 ml de hidróxido de sodio 10 M. La aparición de un color violeta indico la positividad de la prueba (Prueba del Biuret).

Resultados Luego de haber macerado la arena junto con la levadura y al haber agregado 15 ml de ácido tricloracetico la arena se asienta y el líquido queda cremoso con un color gris parecido al cemento (Figura 1), este fue llevado a la centrifuga, y luego se observó que el sobrenadante quedo muy líquido y de un color amarillo oscuro en la parte de arriba, el precitado quedo como una masa similar al color

de la arena en la parte de abajo del tubo; al haber agregado los volúmenes de etanol frio al sobrenadante, el color amarillo de este cambio a un color verde limón, pero siguió siendo muy liquida. Después de centrifugar el precipitado por segunda vez su apariencia cambio observándose de color gris y espeso, como una masa; a este se agregó el reactivo de yodo (lugol) y se observó que el glucógeno se tornó a un color rojo pardo y comparado con el tubo de prueba que contenía agua destilada con yodo su resultado queda de color cobre (Figura 2), esta reacción se dio entre los ácidos nucleicos de la levadura y la solución de yodo. Se Calentó el tubo que contenía ácidos nucleicos y proteínas, este se dividió en dos fases en la cual la levadura es más densa y se posiciono en la parte de abajo del tubo. Del precipitado y el sobrenadante producto de la tercera centrifugación se obtuvieron 11 ml en partes iguales, el resultado de la cuarta centrifugación de este se observó una división de colores, un color beige en la parte de arriba, y un color gris abajo. Cuando se agregó el reactivo de orcinol a estas, y al haber expuesto al aumento de temperatura se observó como este fue cambiando de color parcialmente. Al haber agregado a la solución de proteínas solución salina 0.15M se observó un color verde que represento el ARN de la levadura (Figura 3).Se observó al realizar el ensayo con NaOH y CuSO4 la Aparición de un color violeta que es lo que represento la positividad de la prueba de Biuret (Figura 4).

Figura1 Macerado de levadura con arena

Figura 2 Glucógeno de color pardo rojizo

Figura 3 Presencia ARN de la levadura

Figura 4 Prueba de Biuret Discusión Al utilizar “el glucógeno que es una estructura muy ramificada, y está formada por varias cadenas que contienen de 12 a 18 unidades de α-glucosa y uno de los extremos de esta cadena se une a la siguiente cadena mediante un enlace α-1,6-glucosídico, la importancia de que el glucógeno sea una molécula tan ramificada es que aumenta su solubilidad en disolventes de baja polaridad “2.Con el glucógeno obtenido de la decantación en la centrifuga más 1 ml de agua destilada como solvente y 1ml del reactivo de yodo, se comprobó la presencia de este ya que tiñe el glucógeno de color pardo rojizo y así saber que la prueba fue positiva para la presencia de glucógeno.

Al exponer la solución de proteínas y ácidos nucleicos obtenidos en la práctica con solución salina al 0.15M, y una temperatura elevada en baño maría que era necesario para que el soluto y el solvente se ayudaran en el intercambio molecular con los ácidos nucleicos y proteínas, se pudo comprobar la presencia de ARN y la carga proteica de la levadura al obtener un color verde en esta solución. Haciendo uso de la levadura de panadería se realizaron procesos con el fin de conocer y comprobar de la ley de Biuret. “El método comprende un ensayo colorimétrico de un paso donde se cuantifica la formación de un complejo estable entre proteínas y cobre. El complejo presenta un color violeta característico, el cual se da por la coordinación de un átomo de cobre con cuatro átomos de nitrógeno. El complejo se basa en la desprotonación de los grupos amida para formar el enlace con el cobre o por el establecimiento de un enlace coordinado entre el metal y los pares de electrones libres de los átomos de oxígeno y de nitrógeno del péptido. Después de la adición del reactivo se

requiere de tiempo para desarrollar una coloración de Biuret” 1, donde su resultado fue positivo en la prueba realizada en el laboratorio, su coloración fue de color violeta, a pesar de que no fue completo el proceso puesto que no se añadió el amortiguador (citrato de sodio al 0.15M). Conclusiones Los resultados obtenidos en la práctica de cada una de las pruebas realizadas muestran que hay presencia de proteínas y ARN, pero también una alta concentración de glucógeno lo que nos indica que esta es la principal fuente de energía de la levadura. Para que la extracción y decantación de estas macromoléculas fuera exitosa se acudió a medios como la centrifugación y cambios de temperatura extremas que permitieran afectar las solubilidades y así permitir con mayor facilidad obtención de estas. Anexos Preguntas 1. Cuáles son los fundamentos de las técnicas de extracción (cuál es la utilidad de cada uno de los pasos que se sigue y de cada uno de los reactivos que se utiliza para purificar las macromoléculas y de las pruebas de identificación empleadas en esta práctica) Centrifugación: La centrifugación es un método por el cual se pueden separar solidos de líquidos, de diferente densidad median una centrifugadora, la cual imprime a la mezcla un movimiento rotatorio con una fuerza de mayor intensidad que la gravedad, provocando la sedimentación del solido o de las partículas de mayor densidad. Ley de Biuret: El nombre de la reacción procede del compuesto coloreado formado por la condensación de dos moléculas de urea con eliminación de amoníaco. Si una solución fuertemente alcalina de sulfato cúprico (CuSO4) se añade a una solución de proteína se forma una complejo entre el ion cúprico y los enlaces peptídicos, con aparición de una coloración violeta-púrpura. 3

2. Escriba las reacciones químicas correspondientes de las diferentes pruebas de identificación utilizadas. H2N- CO- NH2 H2N – CO – NH2 Urea FICHAS TECNICAS

H2N – CO – NH2 Biuret

 Ácido tricloracetico al 5%

 Reactivo de yodo (lugol)

 Cloruro de sodio al 10%

 Reactivo de orcinol

 Sulfato de cobre

 Hidróxido de sodio

 Citrato de sodio

Referencias 1 2

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k. Bachmann, Biología para Médicos https://nadiazg.files.wordpress.com/2012/04/practica-2.pdf

Prácticas de Química Aplicada V1.7, Grado en Nutrición humana y dietética, 2011