Lucrare Lab.3-Metode de Recoltare a Embrionilor

TEHNICI DE RECOLTARE A EMBRIONILOR Succesul embrio-transferului depinde de abilitatea de a realiza o serie de etape şi în acelaşi timp de a minimaliza simultan o serie de factori cunoscuţi a avea efecte negative asupra reuşitei transferului. Pentru acest deziderat momentul recoltării embrionilor trebuie ales în conformitate cu timpul scurs de la însămânţare, ţinând cont de migraţia acestuia din oviduct spre coarnele uterine. Din oviduct, la toate speciile domestice ovulele şi embrionii se pot preleva la câteva ore după fecundaţie, ei ajungând în coarnele uterine la 5 zile la vacă (Newcomb R,. 1983), 2-4 zile la scroafă. În funcţie de stadiul embrionar dorit, prelevarea embrionilor din tractul genital al femelelor donatoare se efectuează la intervale variabile, prin tehnici chirurgicale la oaie şi scroafă sau prin tehnici chirurgicale sau nechirurgicale la vacă. Dezvoltată iniţial ca o tehnică chirurgicală, embrio-transferul a devenit datorită perfecţionării metodelor de recoltare şi transfer o metodă nechirurgicală care vizează: îmbunătăţirea performanţelor reproductive a femelelor prin îmbunătăţirea calităţilor productive şi abilităţilor genetice. 1.1. Recoltarea embrionilor prin tehnici chirurgicale Practicarea tehnicilor chirurgicale de recoltare a embrionilor reprezintă singura alternativă atunci când dorim ovule nefecundate, ovule în diferite stadii de fecundabilitate sau embrioni în primele stadii de dezvoltare (2-4-8 blastomere). Prelevarea prin tehnici chirurgicale este de preferat dacă femelele sunt destinate sacrificării datorită ratei mari de recuperare comparativ cu tehnicile nechirurgicale.

1

1.1.1. Recoltarea de la animalele vii 1.1.1.1. Prelevarea embrionilor prin laparotomie pe linia albă Pentru realizarea prelevării, femela donatoare, supusă anterior unei diete de 24 ore, este contenţionată pe masa de operaţie în decubit dorsal făcându-i-se anestezie generală şi regională. După pregătirea câmpului operator şi efectuarea laparotomiei, prin tracţiuni uşoare efectuate asupra ligamentului larg se aduce în plagă ovarul şi cornul uterin congener, se înregistrează răspunsul la tratamentul poliovulator prin numărarea corpilor galbeni de pe ovar, după care se trece la perfuzia oviductelor şi coarnelor uterine (fig. 1).

Fig. 1 - Recoltarea embrionilor de la nivelul oviductului de oaie, prin metode chirurgicale Tehnica mai des utilizată constă în perfuzia postero-anterioară a oviductului împreună cu jumătatea anterioară a cornului uterin. Aceasta este ţinută etanş prin presiune digitală sau prin ligaturare, în lumenul uterin introducându-se mediu de prelevare cu ajutorul unui ac ataşat la o seringă de 50 ml. Cornul uterin este presat cu ajutorul degetelor sau cu o pensă intestinală în vederea refulării mediului sper cervix. Se introduc câte 20-30 ml mediu în 2-4 reprize, iar prin presiuni uşoare, embrionii din cornul uterin şi cei din oviduct sunt antrenaţi împreună cu mediul de perfuzie şi recoltaţi în vase cu pereţi dubli. Operaţia se repetă la cornul uterin opus. 2

Recoltare embrionilor poate fi efectuată şi prin perfuzia antero-posterioară, când mediul de perfuzie este introdus în oviduct, cu o canulă sau direct în lumenul uterin, cu ajutorul unui ac bont ce puncţionează peretele uterin la nivelul joncţiunii utero-tubare. Baza cornului uterin este obturată prin presiunea exercitată cu degetul mare şi arătător sau cu ajutorul unei pense intestinale, după care se introduce mediul de perfuzie până ce cornul uterin capătă o anumită turgescenţă. Puncţia cornului uterin cu un ac bont, cu lumen mare fixat la un tub din plastic permite recoltarea lichidului în recipientele pregătite. Se mai poate recurge la introducerea în lumenul uterin a unui cateter Rush prevăzut cu bastonaş în vederea evitării refulării mediului. După recoltare embrionilor şi scoaterea cateterului, zona puncţionată se suturează cu catgut. Metoda chirurgicală de recoltare prezintă avantajul obţinerii unei rate de recuperare superioară tehnicilor nechirurgicale, procentul ajungând la 80-100%. Metoda prezintă şi dezavantaje datorită: •

manoperelor laborioase;

•

posibilităţii apariţiei de aderenţe datorită intervenţiei în zona periovariană;

•

costurilor ridicate;

•

necesitatea unor dotări specifice şi a unei echipe de intervenţie bine pregătite;

•

este mai dificil de aplicat la vacile în lactaţie datorită dezvoltării glandei mamare. 1.1.1.2. Recoltarea embrionilor prin laparotomie în flanc Metoda presupune aceeaşi timpi operatori şi de pregătire respectaţi în cazul

laparatomiei pe linia albă diferenţa constând în contenţia femelei şi abordarea aparatului genital care se realizează la nivelul flancului drept sau stâng. Incizia se face vertical, în zona flancului, cât mai posterior posibil după care muşchii abdominali sunt dilaceraţi, peritoneul puncţionat şi incizat vertical. Exteriorizarea aparatului genital permite examinarea ovarului, contorizarea corpilor galbeni şi desfăşurarea manoperei propriu-zise de spălare (fig. 2).

3

Fig. 2 - Recoltarea embrionilor de la animalul viu prin metoda chirurgicală Metoda are avantajul a fi: •

mai expeditivă decât metoda laparatomiei pe linia albă;

•

este mai ieftină;

•

complicaţiile postoperatorii neînsemnate;

•

oferă posibilitatea reutilizării flancului opus la scurt interval. În general tehnicile chirurgicale de prelevare a embrionilor presupun spălarea

oviductului pe la nivelul fimbriei, spălarea oviductului pe la nivelul joncţiunii uterotubare sau spălarea uterului la baza cornului uterin. 1.1.2. Prelevarea embrionilor pe cale chirurgicală de la animale sacrificate Procedeul a fost utilizat în special pentru studii de fecunditate „in vitro” dar şi pentru transferul de embrioni în stadii diferite de dezvoltare. La timpul stabilit, animalul donator este sacrificat şi în timpul cel mai scurt se procedează la recoltarea embrionilor. Colectarea eventuală a ovulelor nefecundate poate servi la elucidarea proceselor de maturare, fecundare şi cultivare „in vitro” a acestora în scop ştiinţific sau de creare a unor bănci de ovule sau de embrioni. Prin intermediul acestei tehnici este deci posibil să recoltăm: •

ovule, direct din foliculi prin recoltarea lichidului folicular din foliculi având diametrul de 3-5 mm şi identificarea la stereolupă. Metoda este utilizată pentru studiul morfologic al ovulelor, studiul condiţiilor de maturare şi fecundare „in vitro”;

4

•

ovule şi embrioni, de la nivelul oviductului (fig. 3).

Fig. 3 - Recoltarea embrionilor de la animalele sacrificate Metoda este utilizată atât pentru studiul fecundaţiei „in vitro” când se recoltează ovulele nefecundate, cât şi pentru studiul morfologic şi al condiţiilor de cultivare a embrionilor aflaţi în stadii timpurii de clivaj. Intervenţia constă în ligaturarea extremităţii oviductelor urmată de rezecţia lor, recoltarea făcându-se prin simpla spălare a acestora. Embrioni de la nivelul coarnelor uterine sunt recoltaţi după acelaşi protocol, doar că ei sunt într-un stadiu mai avansat de dezvoltare, oferind posibilitatea studiului morfologic sau a cultivării pe termen scurt sau mediu. Recoltarea ovulelor sau embrionilor de la donatoarele sacrificate prezintă dezavantajul imposibilităţii reutilizării acestora aducând deci mari prejudicii economice. Pe de altă parte, executarea manoperelor impuse la recoltare, trebuie desfăşurate foarte rapid pentru a nu se produce deprecierea materialului biologic. 1.2. Tehnici nechirurgicale utilizate pentru recoltarea embrionilor La baza rapidei evoluţii a biotehnicii transferului embrionar a stat dezvoltarea puternică, în ultimele două decenii, a tehnicilor de prelevare nechirurgicală a embrionilor bovini. Acestea au căpătat un suport ştiinţific şi practic începând cu lucrările lui Dracy şi Petersen (1950) – citaţi de Hafez E.S.E. (1987), care au reuşit să recupereze 26,5% din embrionii vacilor poliovulate, folosind o canulă de plastic. Ulterior, au fost elaborate o serie de tehnici de recoltare care utilizează diferite dispozitive rigide sau flexibile, din cauciuc, plastic sau metal, cu 2 sau 3 căi de 5

acces. Printre cele mai cunoscute cităm tehnicile: Sugie, Cassou, Newcomb, Elsden, Rasbech şi Neustadt Aish. Toate aceste tehnici sunt utilizate pentru recoltarea embrionilor din coarnele uterine, adică în zilele 6 – 9 după fecundaţie. Pregătirea femelelor donatoare în vederea prelevării embrionilor prin cateterism cervical, constă în instituirea dietei timp de 24 de ore, contenţia într-un stand special prevăzut cu posibilitatea ridicării trenului anterior cu circa 20 – 30 cm. În condiţii de fermă, recoltarea embrionilor se efectuează pe locul obişnuit de contenţie a femelelor. După realizarea contenţiei, se trece la igienizarea regiunii ano-vulvare şi dezinfecţia cu produse neiritante. La fel se procedează cu instrumentarul necesar, care în prealabil este degresat, spălat şi sterilizat, iar sticlăria şi instrumentarul din plastic sunt siliconate impunându-se sterilizarea cu etilen – oxid. Operaţia de prelevare a embrionilor se efectuează pe femela supusă anesteziei epidurale, cu 4 – 6 ml procaină 2 %. La vacile cu uter aton, anestezia regională se completează cu 0,5 – 1 ml Rompun, în vederea stimulării tonicităţii uterine. Cateterismul cervical poate fi realizat cu ajutorul mai multor tipuri de sonde care au dat şi denumirea metodei de recoltare. 1.2.1. Tehnici de prelevare a embrionilor 1.2.1.1. Tehnicile de prelevare a embrionilor utilizatoare de catetere tip Folley – Elsden Aceste tehnici utilizează catetere de tip Folley cu 2 şi 3 căi de acces care sunt introduse sub control transrectal în cornul uterin (fig. 4) Catetere de tip Folley.

6

Introducerea la nivel cervical este facilitată de rigidizarea sondei prin intermediul unui manşon metalic. Cateterele sunt poziţionate la circa 5 – 8 cm de bifurcaţia coarnelor uterine, fixarea realizându-se prin umflarea balonaşului cu circa 8 – 15 ml de aer. În acest mod se evită şi refularea mediului de prelevare introdus în uter în vederea spălării (fig. 5).

Fig. 5 - Modalităţi de fixare a balonaşului sondelor de recoltare 1.2.1.2. Tehnica Robertson (Robertson E.,1999) poziţionează balonaşul cateterului Folley imediat după pasajul cervixului, recoltarea făcându-se pe ambele coarne în acelaşi timp. În cazul sondei Folley cu 2 căi de acces irigarea uterină se face individual pentru fiecare corn prin introducerea şi evacuarea liberă a mediului cu ajutorul unei seringi. În cazul sondei cu 3 căi de acces irigarea uterină se efectuează în flux continuu prin conectarea căii de admisie la un vas de sticlă ce conţine mediu şi care este suspendat la 1 – 1,5 m deasupra solului. Cantitatea de mediu utilizată pentru fiecare corn uterin este de 300 – 500 ml, o bună recoltare însemnând recuperarea integrală a mediului introdus. 1.2.1.3. Tehnica Newcomb de recoltare a embrionilor descrisă de Newcomb şi col. în 1977 utilizează cateterul cu trei căi tip Franklin. Sonda se introduce intrauterin cu ajutori unei canule tubulare metalice de 52 cm lungime şi 7 cm diametru. Plasarea se face la 3 – 5 cm după bifurcaţia coarnelor uterine. Această canulă este dotată cu un mandren care îi obturează lumenul în timpul tunelizării cervixului. După introducerea canulei sub control transrectal, se extrage mandrenul şi se introduce cateterul în lumenul cornului uterin la 5 – 7 cm ce vârful acestuia.

7

Lungimea cateterului este de 115 cm, este confecţionat din plastic şi are 3 orificii de acces : una este destinată pentru gonflarea balonaşului plasat la 15 cm de vârful cateterului, o cale este pentru introducerea mediului de spălare şi este plasat la 25 cm de vârful cateterului iar a treia cale este pentru evacuarea mediului şi începe cu 2 orificii plasate imediat anterior balonaşului. După gonflarea balonaşului se realizează introducerea mediului cu ajutorul unei seringi de 50 – 60 ml, folosinduse în general circa 250 ml pentru fiecare corn uterin. Prin presarea cu degetul mare şi arătător a joncţiunii utero – tubare şi prin masajul uterin în direcţia antero – posterioară se realizează o bună recoltare a mediului introdus în vasele de recoltare care sunt prevăzute cu pereţi dubli şi sunt siliconate (fig. 6).

Fig. 6 - Modalităţi de manevrare a cornului uterin în timpul recoltării embrionilor prin tehnica Newcomb Operaţia se reia la cornul uterin opus, finalul operaţiunii constând în dezumflarea balonaşului, extragerea cateterului, spălarea şi dezinfecţia lui în vederea unei noi utilizări. 1.2.1.4. Tehnica de prelevare a embrionilor utilizând cateterele tip Worllein Rush Metoda poartă denumirea de tehnica Neustadt Aish şi utilizează un cateter de cauciuc cu o lungime de 70 cm având 2 căi de admisie. Sonda se introduce în cornul uterin sub control transrectal după asigurarea rigidităţii cu ajutorul unui mandren metalic. Această sondă este mai lungă şi are pereţii mai rigizi ceea ce îi permite introducerea mai în profunzimea cornului uterin.

8

Astfel, după introducerea cateterului rigidizat la 5 – 6 cm de bifurcaţia uterină, mandrenul se retrage 7 – 15 cm, înaintarea continuând în lumenul cornului uterin cu ajutorul vârfului extensibil a cateterului care urmează curbura lumenului uterin făcând posibilă avansarea fără probleme. Umflarea balonaşului şi spălarea propriu – zisă se face ca şi în tehnica Folley – Elsden. Tehnica Nestadt Aish de recoltare nechirurgicală este reprezentată în fig. 7.

Fig. 7 - Tehnica Nestadt Aish de recoltare nechirurgicală a embrionilor 1.2.1.5. Tehnica Cassou (IMV - INRA) de prelevare a embrionilor Metoda utilizează instrumentar produs de firma Cassou, compus dintr-un cateter metalic de 75 cm lungime şi 6 mm diametru, la vârful căreia există un balonaş din latex (fig. 8).

Fig. 8 - Tehnica IMV – INRA de recoltare nechirurgicală a embrionilor

9

În interiorul cateterului rigid se introduce un cateter extensibil prevăzut cu două orificii şi confecţionat din plastic. După introducerea cateterului rigid la baza cornului uterin şi fixarea acestuia prin umflarea balonaşului, cateterul flexibil se plasează adânc în lumenul cornului uterin, flexibilitatea oferindu-i posibilitatea plasării spre vârful cornului uterin. Aparatul de colectare a embrionilor, format din cele două catetere este prevăzut cu trei căi de acces : •

una pentru introducerea mediului ;

•

alta pentru umflarea balonaşului ;

•

a treia pentru recuperarea mediului fiind formată din cateterul flexibil. Rata embrionilor recoltaţi prin tehnicile nechirurgicale de prelevare a

embrionilor se remarcă prin procentele mari de reuşită (55 – 95 %), performanţă condiţionată foarte mult de tehnicitatea operatorului şi mai puţin de instrumentarul de prelevare utilizat. Avantajele tehnicilor nechirurgicale constau în : •

costul scăzut al manoperei ;

•

expeditatea metodelor ;

•

posibilitatea realizării în condiţii de fermă ;

•

netraumatizante pentru cervix şi uter ;

•

posibilitatea de repetare pe aceeaşi donatoare la intervale scurte de timp. Inconvenientele metodelor nechirurgicale de recoltare a embrionilor constau

în: •

rate mai scăzute de recuperare comparativ cu cele chirurgicale ;

•

restricţii impuse momentului recoltării (5 zile de la ovulaţie) ;

•

necesitatea executării de către personal specializat (Koos R.D. şi col., 1984).

10