Livro Genomica - Luis Mir - 2005 Cap 04

 

 

D I N Â M I C A D O S G E N E S E M E D I C I N A G E N Ô M I C A 

DINÂMICA DOS GENES E MEDICINA  GENÔMICA

C APÍTU  APÍTULO LO  4

Clarice Sampaio Alho

• Ap Apre rese sent ntaç ação ão • Conj Conjunto unto de de genes genes na espéc espécie ie humana humana • Conj Conjunto unto de genes genes nos indi indivídu víduos os • Refe Referên rências cias bib biblio liográf gráficas icas • Súm Súmul ula a cur curri ricul cular ar

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D I N Â M I C A D O S G E N E S E M E D I C I N A G E N Ô M I C A 

APRESENTAÇÃO “Não fosse pela enorme variação individual, a medicina poderia ser considerada uma ciência e não uma arte”, Sir William Osler (1892). “Talvez a doença só apareça naqueles em que a herança seja dupla [do pai e da mãe], pois vejo que algo está faltando”, Sir Archibald Garrod (1902).

Estas duas afirmações evidenciam que há muito tempo se tem a percepção do quanto as características herdadas afetam individualmente a saúde humana. Há mais de 50 anos, aplica-se efetivamente o conhecimento genético às doenças do homem e, aos poucos, foram sendo elucidados os mecanismos de herança bem como os mecanismos moleculares através dos quais os genes causam as doenças. Durante este período, foi possível associar características de causas monogênicas, de herança mendeliana simples, a alterações pontuais na saúde. No entanto, a identificação dos genótipos nem sempre foi capaz de predizer um fenótipo final, dado que as doenças complexas, ou as adquiridas por processos infecto-contagiosos são

CONJUNTO DE GENES NA ESPÉCIE HUMANA DIVERSIDADE GENÉTICA DAS POPULAÇÕES HUMANAS Os primeiros homens indistinguíveis anatomicamente anatomicamente do homem atual e que apresentavam traços de organizaçã organizaçãoo cultural e social viviam já há cerca de 40 mil anos. Esses homens fabricavam ferramentas elaboradas com fino acabamento, expressavam-se artisticamente esculpindo e pintando suas cavernas com figuras de animais e pessoas, bem como desenvolviam rituais e cerimônias, como os funerais no enterro dos mortos. Destes homens e de seus genes, somos hoje todos descendentes. Ainda que se conclua que a origem do homem moderno teve uma linha evolutiva única, há ampla diversidade genética entre as populações humanas atuais, condicionada, ao longo dos anos, pelas interações genético-ambientais que ajustaram, a cada geração, os grupos de indivíduos às pressões do meio. As mais particulares características características no reservatório de genes, obtidas em decorrência do processo evolutivo,

sempre reguladas pela ação conjuntaambientais. de suscetibilidades genéticas individuais e de influências Em abril de 2003, foi anunciada, definitivamente, definitivamente, a conclusão do seqüenciamento do genoma humano após 13 anos de trabalhos ininterruptos, atingindo a meta, fixada em 1990, de cobrir, com precisão, 99,99% da seqüência de bases que compõem nossos cromossomos. Seis bilhões de seres humanos habitam hoje o planeta, distribuídos em subgrupos geneticamente distinguíveis e com particulares fragilidades fisiológicas. O objetivo agora da nova ciência genômica é ser aplicável à prática médica. Os atuais estudos genômicos da medicina intencionam identificar identificar quais são os genes ou con juntos gênicos que, quando herdados, deixam um indivíduo mais suscetível a desenvolver algum perfil patológico. Tudo isso para que, futuramente, seja possível curar ou atenuar as

fazem com que varie amplamente toda associação entre manifestações fenotípicas e marcadores genéticos, dependendo da população humana em questão.

mais diferentes doenças. O objetivo deste capítulo é apresentar alguns conteúdos que possam ser úteis à interpretação da investigação genômica para a medicina. Para tanto, são enfocados dois aspectos: um, que sustenta que as associações entre manifestações fenotípicas e marcadores genéticos dependem do reservatório de genes obtido em decorrência do processo evolutivo de cada população humana em estudo: seção “Conjunto de genes na espécie humana”. E outro, que revela que a manifestação das variantes polimórficas está, em um único indivíduo, sob influência do restante de seu próprio genoma, bem como do meio ao qual ele está exposto: seção “Conjunto de genes nos indivíduos”. Assim, na análise de um único paciente, a relação genótipo-fenótipo irá sofrer influências e interferências genéticas e ambientais que lhe são extremamente particula-

do cruzamento os indivíduosafricana das diferentes populações. A outra hipóteseentre da substituição ou Vindos da África (Out of Africa) postula, no entanto, que o homem moderno surgiu entre 200 mil e 100 mil anos atrás, a partir de uma única população africana que ocupou e se dispersou pelo Velho Mundo (Fig. 4.1). A estratégia mais atual, utilizada como ferramenta na tentativa de esclarecer a maneira como houve a dispersão das populações ancestrais e a ocupação do planeta pela espécie humana, vem sendo a análise dos segmentos marcadores do DNA humano, como os dos loci polimórficos para as endonucleases de restrição, seqüências  Alu e, principalmente, os do DNA mitocondrial (mtDNA)5-7. O mtDNA, herdado pela via materna, é particularmente adequado aos estudos evolutivos, quando se avaliam as diferentes etnias humanas atuais. Análises de sítios de restrição do mtDNA, realizadas em indivíduos de diferentes etnias,

res. Apenas uma correta interpretação são dos resultados desviantes, comopermitirá quando aocompreengenótipo alterado inclui um fenótipo normal.

Homo sapiens:

origem e dispersão

A tentativa de explicar a origem do homem moderno tem sido apoiada pelos estudos moleculares das variações no genoma humano, os quais permitem sustentar duas hipóteses plausíveis1-4. A primeira delas, hipótese multirregional ou multifocal, postula que o Homo sapiens sapiens moderno evoluiu de distintas populações arcaicas do Velho Mundo no curso de aproximadamente um milhão de anos, e atingiu um grau de homogeneidadee posterior devido ao fluxo gênico decorrente homogeneidad

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40 mil anos Entre 35 e 15 mil anos

150 mil anos

13 mil anos

Fig. 4.1 — Origem africana da espécie humana há cerca de 150 mil anos e dispersão para os outros continentes ao longo do tempo. Análises

de mtDNA suportam que os ancestrais das populações americanas tenham vindo da Ásia.

revelam que o mtDNA africano tem maior variação que os demais, que existem dois ramos de mtDNA em africanos, sendo apenas um deles compartilhado com o restante da humanidade, e que as linhagens de mtDNA encontradas nas diferentes populações atuais podem estar ligadas a uma única mulher ancestral africana que viveu há cerca de 200 mil anos (chamada “Eva mitocondrial” ou “Eva africana”)1,3,5. Ainda que tais resultados moleculares pareçam determinantes para apoiar a segunda hipótese, falta muito para que se conclua concretamente sobre a linha evolutiva da qual nos originamos. A teoria evolutiva prevê, de fato, que uma população-fonte, mais antiga, tipicamente terá maior diversidade do que uma população mais recente. Também é plausível que todo o mtDNA humano possa ter vindo de uma única mulher. No entanto, essas constatações apenas melhoram a compreensão sobre a evolução do homem moderno. A identificação de características no mtDNA não difere da realizada nos demais cromossomos humanos, assim, cada característica especial, de cada um de nossos segmentos de DNA, pode ser correlacionada a um único ancestral. Por exemplo, a fusão telomérica que originou o cromossomo 2 humano pode ter sido um evento mutacional ocorrido em um único indivíduo ancestral, assim seríamos todos descendentes dele. Ou ainda, substituições únicas de bases nos códons, as quais podem gerar diferentes seqüências aminoacídicas aminoacídicas nas proteínas, podem ter sido também decorrentes de eventos mutacionais ocorridos em distintos indivíduos únicos que transmitiram seu DNA às gerações presentes. Por motivos como estes, a constatação da 74

existência da Eva africana, assim como de outras evidências isoladas, não é suficiente para dar por encerrada a busca da filogenia humana. Contudo, há o consenso de que ancestrais humanos, residentes na África há cerca de 150 mil anos, dispersaram-se para os demais continentes. Os indivíduos da espécie  Homo sapiens dispersaram-se geograficamentee pelo planeta, de forma que grandes populageograficament ções passaram a ficar espacialmente isoladas umas das outras. O isolamento geográfico provocou, evidentemente, o isolamento reprodutivo, o qual impediu o fluxo gênico completo entre as grandes populações, gerando-se grupos de indivíduos uma proporçãodistinta significativa seus genes em comum e,com conseqüentemente, da dosde demais. Três grupos que apresentam reservatórios gênicos marcantes e próprios na espécie humana podem ser identificados, de maneira generalizada, pela origem geográfica: os africanos, os asiáticos e os europeus. Tal Tal diferenciação étnica foi condicionada pelo acúmulo de mutações aleatórias mantidas nas populações em resposta às pressões seletivas s eletivas ambientais ou, em outras palavras, pela capacidade de adaptação diferencial dos grupos ancestrais de sobreviver às condições às quais estiveram expostos.

Raças e etnias: mutação, seleção, deriva e migração Os períodos glaciais, bem como outros fatores ambientais, separaram geograficamente áreas de ocupação distinguindo o espaço habitado pelo homem e criandohumana condições para a evolução diferencial entre as populações. Ao lon-

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go das gerações, os habitantes de cada uma das áreas isoladas evidenciaram distintos fenótipos: negros ao sul, brancos ao oeste, mongóis ao leste. Posteriormente, graças às migrações, as áreas habitacionais destas três raças originais sobrepuseram-se geograficame geograficamente. nte. Os mais variados e possíveis mecanismos seletivos ambientais podem ser apresentados para caracterizar as diferenças raciais manifestadas nos fenótipos, mas a visão clássica que indica a seleção natural como força motriz principal da evolução das raças pode não ser tão definitiva quando se consideram os também possíveis processos aleatórios e destaca-se o significativo efeito da deriva (Fig. 4.2A). A deriva gênica é o fator evolutivo pelo qual a flutuação das freqüências gênicas é devida ao acaso, uma vez que indivíduos que se separam da população de origem estão sujeitos a apresentarem uma oscilação gênica distinta da observada na população original 8-13. Este fator neutro na evolução dos genótipos humanos pode ser também entendido pelo “efeito do fundador”, o qual explica a ocorrência de uma freqüência relativamente alta de

um conjunto de genes em uma população fundada por um pequeno grupo ancestral (Fig. 4.2B). Outro fator aleatório, ou “efeito de tamanho”, provoca em populações pequenas também oscilações casuais capazes de alterarem profundamente as freqüências gênicas nos indivíduos. Na história de nossos antepassados, há cerca de 70 mil anos, quando seres humanos se aventuraram para fora da África, rumo ao norte, em busca de novos territórios, os períodos de glaciações foram determinantes, ao provocarem mortandades que reduziram grupos numerosos a poucos indivíduos sobreviventes. Cada uma das populações remanescentes, com tamanhos efetivos diminuídos e reduzidas variações genéticas, foi responsável por determinar o rumo da evolução num modelo gargalo de garrafa, o qual explica a existência de proporções alélicas características em populações derivadas de sucessivas gerações descendentes de um grupo reduzido de ancestrais (Fig. 4.2C). Assim, tanto a seleção natural quanto a deriva aleatória interagiram para moldar a constituição genética particular das presentes populações humanas.

População Original

População Derivada

 Área 1 0,25 0,15 0,25 0,35

 Área 2

Emigrantes fundadores

0,10 0,30 0,30 0,30

Mutação

Seleção Natural adaptabilidade reduzida de

(B)

0,25 0,25 0,25 0,25

Deriva

Genótipos: 0,36 0,60  Alelos:

0,16 0,48 Genótipos: 0,40  Alelos:

0,04 0,20

0,64 0,32 0,80

População Derivada Tempo 2

População Original Tempo 1 Migração Sobreviventes 2 3

0,30 0,30 0,20 0,20

(A)

0,28 0,20 0,20 0,32

Genótipos: 0,36 0,60  Alelos: (C)

0,16 0,48 Genótipos: 0,04 0,40  Alelos: 0,20

0,64 0,32 0,80

freqüências gênicas ao longo das gerações. As formas coloridas representam Fig. 4.2  4.2 — Fatores evolutivos que afetam as populações, alterando as freqüências indivíduos com diferentes genótipos. (A) Perdaoriginal do equilíbrio de Hardy-Weinberg a quatro fatores seleção natural, deriva e migração) que afetam uma população (baseado em Lewis R, 1999devido  ); (B) exemplificação exempl ificação daevolutivos ocorrência(mutação, ocorrência do efeito do fundador; (C) exemplificação da ocorrência do efeito gargalo de garrafa. 3

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Na evolução do  Homo sapiens, independentemente da razão ou origem pela qual se observa diferenciação genética entre as populações existentes na atualidade, importa considerar, para o estudo médico, que unidos aos genes que conferem o fenótipo característico de cada uma das etnias podem estar outros genes que determinam suscetibilidades ou fragilidades fisiológicas14. Ainda dentro do enfoque evolutivo, devido ao atual elevado crescimento populacional humano, os estudos moleculares evidenciam que há ampla variação genética dentro das raças, capaz de superar a variação observada entre elas. Embora os cromossomos humanos e os loci que todos contêm sejam os mesmos dentro da espécie, variam a natureza e as freqüências dos diferentes alelos entre os subgrupos populacionais. Algumas variações são praticamente restritas a um grupo, ainda que não estejam necessariamente presentes em todos os membros do grupo. Admitindo que somos todos descendentes, supostamente, dos primeiros 50 mil homens que povoaram o planeta, com grande probabilidade, os mesmos alelos variantes seriam encontrados em muitas amostras populacionais, contudo, seria de se esperar freqüências diferentes entre as populações. Deentre fato,os existem acentuadas de freqüências alélicas gruposdiferenças populacionais, tanto para os alelos que causam doenças genéticas quanto para os marcadores genéticos aparentemente neutros em termos seletivos7,14–16. São cada vez melhor conhecidas as particularidade particularidadess genéticas que caracterizam cada grupo populacional, dependendo de sua origem étnica. É sabido que há uma distribuição diferencial das doenças entre os variados grupos, e que a prevalência de uma certa patologia mudará de acordo com as propriedades evolutivas da população em questão. Ainda assim, pouco se sabe sobre as vantagens ou desvantagens seletivas que evidenciaram os fenótipos em cada grupo populacional. É razoável propor, por exemplo, que a baixa estatura dos esquimós e sua relativamente espessa gordura subcutânea sejam características vantajosas para que suportar clima frio, ou o tórax largo e profundo dos índios vivemo nas elevadas altitudes dos Andes, na América do Sul, seja importante para seu melhor desempenho respiratório 17. Por motivos como estes, no estudo da genética que associa manifestações fenotípicas e marcadores de DNA, as características que conferem risco de doença ou de saúde a um indivíduo são o reflexo do conjunto de genes que ele possui com base na população à qual pertence e no grupo étnico do qual é originário18.

 Variabilidade  Var iabilidade dentro do genoma humano Se não fosse pela existência dos segmentos alterados do genoma,existe seríamos todos clones. Ainerente infinitaque variedade indivíduos graças à tendência o DNAde tem de sofrer alterações em sua seqüência s eqüência nucleotídica. nucleotídica. 76

A seqüência de bases do DNA humano é sujeita às mais variadas mudanças hereditárias (mutações), rearranjos e/ou reorganizações reorganizaç ões gênicos, responsáveis pelas particularidade particularidadess individuais. Embora a base das diferenças fenotípicas receba influência do ambiente, são as pequenas mudanças genéticas codificadas no DNA as responsáveis pela variabilidade individual. A seqüência do DNA nuclear é mais de 99,9% idêntica entre quaisquer dois seres humanos, porém é exatamente na fração restante das seqüências dos nucleotídeos entre os genomas, e nas diferentes combinações entre elas, que se determinam as características próprias de cada pessoa. Algumas diferenças das seqüências do DNA têm pouco ou nenhum efeito sobre o fenótipo (neutras ou silenciosas), no entanto, as outras são aquelas que dão as variações anatômicas, fisiológicas e/ou bioquímicas, as quais fazem com que se observem as mais marcadas diferenças quanto à suscetibilidade a doenças, intolerâncias dietéticas, respostas terapêuticas, predisposição às fragilidades, resistências orgânicas, características comportamentais, alterações da personalidade, aptidões atléticas, talentos artísticos, etc. As mutações, rearranjos e reordenamento dos genes são, portanto, os responsáveis por toda esta gama de variações individuais geneticamente determinadas. Como interessa aqui lidar com a variabilidade interpessoal, dar-se-á ênfase apenas a dois aspectos aspectos no estudo das mutações e variações dentro do genoma humano: (I) quando a alteração gerar somente variabilidade e não aberrações incompatíveis com a sobrevivência, e (II) quando a característica alterada for transmissível à descendência, desconsiderando, portanto, as mutações em células somáticas isoladas adquiridas após o nascimento.

Organização geral do genoma humano O termo (doeminglês ) foi primeiramente proposto por “genoma” H. Winckler 1920,genome para designar a totalidade do material genético contido no complemento cromossômico de uma espécie. Em 1986, Roderick propôs o termo “genômica”, para descrever os estudos do mapeamento, seqüenciamento e análise dos genomas. Genoma humano é o termo usado para descrever a informação genética total (conteúdo de DNA) nas células humanas. Uma célula humana, no seu conteúdo haplóide, apresenta cerca de 3,3 bilhões de pares de bases compondo as moléculas de DNA. Assim, o genoma humano une a informação herdada pelo genoma nuclear (99,9995%) e pelo genoma mitocondrial (0,0005%). Entre as características importantes da estrutura do genoma humano estão a de ser constituído por uma considerável porção de DNA repetitivo (DNA não-codificador, cópias gênicas e de fragmentos gênicos) e a de que a porcentagem de DNA nãocodificador é superior a 95% (Fig. 4.3) 19–21.

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~75% DNA extragênico ~40% único ou baixo número de cópias

~60% moderado a altamente repetitivo Repetido em também

Repetido disperso

Genoma nuclear 3.300Mb ~30 mil genes

Genoma mitocondrial 1,6kb 37 genes

Fragmentos de genes, pseudogenes

Íntrons, UTRs etc.

~90% DNA não-codificad não-codificador or

~10% DNA  codificador

~25% genes e seqüências gene-relacionadas

Fig. 4.3  4.3 — Organização do genoma humano (baseado em Strachan & Read, 1999 5 ).

O genoma nuclear está distribuído nos 22 cromossomos autossômicos e nos dois cromossomos sexuais com ampla variação na composição das bases, bem como na densidade e dispersão dos genes. O número total de genes no genoma nuclear é estimado em torno de 30 mil com enorme variabilidade entre eles no que diz respeito ao tamanho, organização organiz ação interna (conteúdo e extensão dos éxons e íntrons) e expressão. Entre os casos mais extremos, podem ser citados os genes muito pequenos, com menos de 1.000 pares de bases (1.000 pb = 1 kb) e que não contêm íntrons, como, por exemplo, os que codificam para a histona H4, tRNA-Tir ou α-interferon, e genes que ocupam grandes extensões cromossômicas, como o gene que codifica para a distrofina, o qual ocupa 2,4 milhões de pares de bases (Mb), tendo apenas 0,6% de seu conteúdo em éxons 20–23. Uma grande fração dos genes humanos é membro de famílias gênicas, em que os genes individuais são intimamente relacionados, mas não necessariamente idênticos idênticos em sua seqüência de bases. Os genes agrupados em tandem (segmentos cromossômicos repetidos adjacentes), como o grupamento de genes α-globina, surgiram por duplicação gênica e assim se mantêm no genoma. Outros genes de famílias que codificam produtos polipeptídicos idênticos ou funcionalmente re-

O grau de agrupamento gênico no genoma nuclear é altamente variado e dependente da região cromossômica cromoss ômica em questão, havendo regiões de alta densidade onde podem ser encontrados, até mesmo, genes sobrepostos. Nestas regiões, a sobreposição de genes se dá pela transcrição a partir de ambas as fitas de DNA ou, ainda, pela presença de genes dentro de outros genes (em geral, dentro de seqüenciais intrônicas). Por exemplo, o gene da susceptibilidade ao retinoblastoma (RB1; 13q14-2) possui no seu íntron 17, o qual ocupa 72 kb, o gene do receptor acoplado à proteína G, U16, transcrito a partir da fita oposta5. Além das seqüências gênicas de DNA de cópia única que constituem nosso conjunto gênico, o DNA do genoma humano é classificado em duas outras categorias seqüenciais: DNA moderadamente repetitivo e DNA altamente repetitivo. As famílias de seqüências de DNA altamente repetitivo são, predominantemente, dominantemen te, não-codificadoras e podem estar organizadas em tandem ou de forma dispersa. disper sa. Dependendo do tamanho médio dos arranjos das unidades repetitivas (medido em número de pares de bases) e a extensão destes no cromossomo, o DNA não-codificador altamente repetitivo em tandem é agrupado em uma das quatro subclasses: DNA-megassatélite DNA-megassatélite (blocos com unidades repetitivas de vários kb), DNA-satélite

lacionados estar cromossomos, como, por podem exemplo, osdispersos membrosem dasdiferentes subfamílias dos genes 23,24 das histonas .

(blocos unidades de dezenas de pb que ocupam 100 kb adevários Mb repetitivas de comprimento), minissatélite (blocos de poucos pb repetidos num espaço de 100 pb a 20 kb do

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cromossomo) e microssatélite (blocos de 1 a 4 pb repetidos centenas de vezes). As famílias de DNA repetitivo disperso, as quais contêm elementos de DNA que se transpõem ativamente, fazem parte de duas classes discriminadas pelo comprimento da unidade de repetição: SINE (short interspersed  nuclear elements) e LINE (long interspersed nuclear elements). O SINE humano mais importante é a família  Alu, a qual ocorre cerca de uma vez a cada 3 kb do genoma humano, contém uma seqüência promotora interna para a RNApolimerase III e parece ter sido originada a partir do gene RNA 7SL por retrotransposição, ou seja, seu RNA transcrito é convertido dentro da célula novamente em DNA e se reinsere no genoma1,5,6,20,25.

 Variabilidade  Var iabilidade e hereditariedade A diversidade dos organismos organismos vivos e o seu sucesso em colonizar todas as partes da superfície da Terra dependeram das mudanças genéticas, acumuladas acumuladas ao longo de milhões de anos, que conferiram alternativas para as adaptações necessárias às condições dos novos hábitats. O aumento da variabilidade dentro da espécie é condicionado pela ocorrência das mutações que darão origem a novos alelos e, em conseqüência, a evolução das populações está intimamente ligada à fixação destes alelos entre os indivíduos, através das gerações. Assim, a evolução combina o poder da inovação (mutabilidade) com o aparecimento de novos fenótipos decorrentes dos novos alelos mutantes, e a necessidade de conservação (fidelidade) daqueles genes cuja ocorrência de alterações poria em risco a sua funcionalidade e, conseqüentemente, a viabilidade do indivíduo. Apesar de o DNA ser uma molécula extremamente estável, pode apresentar sua composição alterada após um ciclo replicativo em que não haja correção de um nucleotídeo incorporado erroneamente (alteração espontânea), ou por sofrer uma lesão(alteração não-reparada, provocada porlesões, agentes físico-químicos induzida). As diferentes não reparadas e não corrigidas antes do término da replicação, serão fixadas, constituindo-se mudanças hereditárias. Além disso, os rearranjos cromossômicos devido a pareamentos desiguais podem alterar de forma drástica a seqüência original do DNA. Todas essas alterações terão relevância populacional evolutiva ao serem passadas para a descendência descendência.. Mutação e recombinação são forças evolutivas que originam novas variações (alelos) para um mesmo gene ou segmento de DNA. Os novos alelos irão constituir, então, o substrato da evolução por adaptação, ao estarem sujeitos à seleção natural. O alelo que conferir maior vantagem adaptativa ao indivíduo que o portar será selecionado positivamente. longo das gerações, os indivíduos paraAosua descendência o alelo vantajoso, adaptados o qual terápassarão sua freqüência aumentada na população população com o passar do tempo. A 78

mudança na freqüência de um alelo pode ocorrer também devido a efeitos aleatórios, mesmo que haja reduzida diferença adaptativa entre os alelos de um gene. A maioria dos genes humanos tem taxas de mutação muito baixas, na ordem de uma mutação por locus por 100.000 a 1.000.000 de gametas em cada geração, sendo exceções os genes com extensas seqüências no genoma humano, como o gene que codifica para a distrofina26,27, o qual tem uma taxa de mutação mais elevada. As mutações gênicas são alterações acidentais que podem aumentar a carga genética (conjunto de genes deletérios) do genoma da espécie. Tendo em vista que a penetrância (capacidade de expressão do alelo no fenótipo) de um alelo surgido por mutação depende da ação seletiva exercida pelo ambiente sobre ele, parece claro que a ocorrência de alelos mutados freqüentes em uma população indica, no mínimo, que eles foram inócuos, pois, de outra forma, não teriam como haver permanecido no genoma após milênios de seleção natural. Por esse motivo, é compreensível que seja raro identificar algum efeito deletério incisivo sobre um alelo mutante com freqüência elevada numa população humana. Sempre que um alelo, surgido por mutação, condicionar um forte efeito fenotípico deletério em seus portadores, terá prejudicada sua transmissão às gerações seguintes, impedindo, assim, o aumento de sua freqüência. O valor adaptativo de um alelo ( f de  fitness) pode ser definido como a razão entre a fecundidade média dos portadores de uma mutação e a dos portadores dos demais alelos. Assim, não apenas a viabilidade do portador do alelo mutado é importante mas também sua s ua fertilidade. A recíproca do valor adaptativo é o coeficiente seletivo ( s), o qual mede a intensidade da seleção sobre o fenótipo do portador do alelo mutado. Pode-se considerar que f  +  + s = 1. Portanto, alelos que conferem letalidade (alelo letal com f  =  = 0) e alelos mutantes com baixo valor adaptativo são marcadamente selecionados negativamente e encontrados em pequenas proporções nas populações. Tais Tais genes que determinam fortes efeitos deletérios ocorrem na população com freqüências inferiores a 1% (chamados idiomorfos). Se o valor adaptativo for pouco reduzido ou neutro, o gene mutado poderá ser transmitido através dos indivíduos e, ao longo das gerações, fixar-se na população com freqüências entre 1% e 99%, ou seja, gene polimórfico 4.

Genes mutados: origem A história evolutiva e as alterações que resultaram, finalmente, no genoma humano, assim como as de qualquer outro genoma, são tão antigas quanto a vida, e a variabilidade dentro do genoma humano acompanha, de forma paralela, toda a evolução da nossa espécie. As mutações que originaram e originam variabilidade no genoma humano são decorrentes de alterações cromossômicas numéricas ou estruturais ou de alterações na seqüência nucleotídica do DNA. Estas últimas têm sua fonte em três mecanismos básicos26–29: (I) mutações mutações decorrentes de erros err os na replicação repl icação do

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DNA, (II) mutações decorrentes de danos físico-químicos à seqüência de DNA e (III) mutações decorrentes de pareamento desigual entre seqüências de DNA. Conhecer tais mecanismos moleculares é útil à compreensão da origem evolutiva das variantes hoje existentes. A replicação do DNA é um processo extremamente preciso: a enzima DNA polimerase, por meio do pareamento de bases, a cada ciclo celular celular,, replica fielmente a dupla hélice do DNA, usando como molde uma cadeia original. No entanto, devido às falhas químicas naturais, esta enzima introduz, em média, um nucleotídeo incorreto em um dos filamentos filhos em crescimento a cada 10 milhões de bases incorporadas à nova cadeia. Uma verificação adicional posterior, realizada pelo próprio complexo DNA polimerase, identifica

↓ Fita

nova

os erros de replicação e corrige mais de 99,9% deles. Assim, a taxa geral de mutação espontânea, como resultado de erros na replicação, é de 10–10 por par de bases por divisão celular, ou seja, menos de uma mutação de par de bases por duplicação celular, considerando uma célula humana diplóide com um genoma com sete bilhões de pares de bases. Um erro de incorporação nucleotídica será responsável por uma substituição única de base na próxima divisão celular (mutação de ponto) (Fig. 4.4A, B). Danos causados pela exposição do DNA a agentes mutagênicos físico-químicos, como a luz ultravioleta ou espécies ativas de oxigênio, podem alterar a seqüência dos nucleotídeos das mais variadas formas e com as mais abrangentes conseqüências. Ainda que os danos no DNA e os erros de

Seqüência mutada

↓ Erro

Seqüência original

Fita molde ↑ (A)

(B)

Transição

(purina → purina ou pirimidina →  pirimidina)

Transversão (purina → pirimidina ou pirimidina →  purina)

Inserção

Deleção

(adição de uma ou mais bases)

(remoção de uma ou mais bases)

Inversão

Translocação

Duplicação

Duplicação

(reinserção na orientação oposta)

(realocação de um segmento de DNA)

(de uma ou mais bases em tandem)

(de uma ou mais bases dispersa)

(C)

DN A, alterando um único ou múltiplos nucleotídeos. Fig. 4.4  4.4 — Diferentes classes de mutações que afetam a seqüência de bases da molécula de DNA, (A) Uma fita de DNA original é usada como molde para a formação da fita complementar durante a replicação semiconservativa; (B) erro de incorporação de um nucleotídeo, causando pareamento incorreto das bases do DNA: DNA : se não corrigido, o erro levará a uma mutação permanente em uma das moléculas de DNA produzidas no próximo turno de replicação; (C) nomenclatura das diferentes mutações com base no tipo de alteração ocorrida.

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incorporação nucleotídica nucleotídica possam ser reparados e corrigidos por apropriados mecanismos celulares, mantém-se em nossas células alguma taxa de tais alterações devido ao benefício evolutivo que elas conferem à espécie. Outro mecanismo natural de geração de variabilidade, vantajoso para a espécie, é o crossing-over , no qual duas moléculas homólogas, após alinharem-se e trocarem entre si seus segmentos de DNA, originam segmentos s egmentos híbridos completamente novos. E, nesse mesmo sentido, a geração de variabilidade pode ser ainda incrementada, caso a recombinação entre cromossomos homólogos (durante a meiose) ou cromátides irmãs (na mitose, após a replicação) seja decorrente de pareamento entre seqüências não alinhadas perfeitamente. Por mecanismos de reconhecimento e pareamento, genes ou segmentos de DNA, similares ou idênticos, em tandem ou dispersos, podem desencadear um alinhamento cromossômico desigual. Em conseqüência, a recombinação ocorrida entre porções de moléculas malpareadas, ou crossing-over desigual, adicionará ou removerá conjuntos polinucleotídicos do segmento cromossômico original. Este mecanismo é, portanto, tido como o responsável pela origem das deleções, inversões, duplicações ou expansões de componentes do genoma (Fig. 4.4C)26-30. Um pareamento desigual entre membros da família  Alu   de DNA repetitivo intercalar pode desencadear uma recombinação dentro do gene que codifica para o receptor de lipoproteínas de baixa densidade (LDL-colesterol), duplicando vários de seus éxons e desencadeando um fenótipo hipercolesterolêmico. Outro exemplo, é a recombinação mediada pelo pareamento entre duas seqüências homólogas invertidas situadas, uma à 5´do gene do fator VIII de coagulação sangüínea e outra no íntron 22 deste gene, que resulta resulta na inversão dos éxons 1 a 22, impedindo a correta síntese do fator VIII, o que desencadeia a hemofilia A27. A transposição, um outro tipo de recombinação, envolve o movimento de segmentos de DNA através do genoma, sem requerer homologia entre as seqüências. Os elementos, ou segmentos de inserção, que se movem através de transposição, chamados elementos transponíveis ou transpósons, como os segmentos da família Alu, característicos da espécie humana, produzem seqüências variantes, ao se inserirem por meio de retrotransposição em segmentos aleatórios do genoma.

Genes mutados: efeito A Fig. 4.5 apresenta, de forma esquematizada, um segmento gênico humano hipotético com seu promotor e seu mecanismo de expressão em funcionamento pleno. As representações esquemáticas, esquemáticas, apresentadas a seguir (Fig. 4.6), ilustram o efeito que uma mutação pode acarretar na expressão deste mesmo gene hipotético original3,26,27,31. De acordo com o ilustrado na Fig. 4.6, o gene selvagem no quadro A se expressa transcrevendo e traduzindo uma 80

proteína com 13 resíduos em sua seqüência aminoacídica aminoacídica primária. No quadro B, observa-se uma mutação do ponto de substituição de base do tipo “transição”, a qual substitui o nucleotídeo +18, a partir do sítio de início da transcrição, de uma pirimidina citosina (C) para uma purina adenina (A). Tal mutação (C+18 → A) acarreta a troca da terceira base, do terceiro códon a ser traduzido, de CUC para CUA. Esse tipo de mutação, chamado “mutação silenciosa”, não afeta a informação do RNA mensageiro (mRNA), de modo que o aminoácido a ser incorporado no terceiro códon permanecerá o mesmo: o RNA transportador (tRNA) incorporará uma leucina (Leu) na terceira posição, ao ler qualquer um dos dois códons (CUC ou CUA). Em C ocorre uma substituição de base do mesmo tipo que em B, porém no nucleotídeo +16 (C+16 → A). Neste caso, a mutação acarreta a troca da primeira base, do terceiro códon a ser traduzido, de CUC para AUC, alterando, conseqüentemente, a informação na seqüência do mRNA e na proteína final, que conterá um aminoácido isoleucina (Ile) no lugar da leucina original (Leu 3 → Ile). Mutações como esta, na qual há substituição substit uição de aminoácido, são chamadas “mutações com troca de sentido” (ou missense), mas, quando preservam a característica química conservativas”, essencial do aminoácido original, são denominadas “mutações pois afetam levemente a expressão fenotípica do gene mutado. No quadro D, verifica-se uma substituição pontual da base +49 (A+49 → C) presente no éxon dois. Neste exemplo, a mutação de ponto no DNA gerou a substituição da primeira base do oitavo códon, que passou do original ACU para CCU, provocando uma alteração na proteína sintetizada (de treonina para prolina pr olina ou Thr8 → Pro) com efeito mais severo, denominada “mutação com troca de sentido não-conservativa”. não-conservativa”. Os quadros E, F e G ilustram mutações de repercussões mais drásticas, pois geram produtos protéicos marcadamente alterados. Em E, a proteína final resulta truncada, com apenas nove aminoácidos, devido à mutação sofrida na seqüên→ +54 cia do DNA, na códon, qual a que substituição   A provoca alteração do nono passa a serTum códon de paradaa de síntese protéica (de UGU para UGA ou Cys9 → stop). Alterações como esta, chamadas de “mutações sem sentido” (ou nonsense), resultam de substituições de bases, ou de qualquer outra mudança na seqüência do DNA que acabe por incorporar precocemente um códon finalizador que encurte a cadeia polipeptídica ou, ainda, que elimine ou destrua o códon de parada original, provocando a continuação da tradução e o alongamento alonga mento da cadeia polipeptídica, até que surja um novo códon finalizador. A proteína resultante das mutações sem sentido raramente apresenta alguma funcionalidade funcionalidade.. No quadro F, houve uma deleção de dois nucleotídeos nas posições +56 e +57 a partir do sítio de início da transcri-

ção, no éxon que, dois,aque quebrou a matriz de os leitura dos códons. Nota-se partir do décimo resíduo, aminoácidos incorporados passaram a ter uma seqüência diferente da es-

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D I N Â M I C A D O S G E N E S E M E D I C I N A G E N Ô M I C A 

Promotor

RNA-polimerase ↑

↑ s  síítio

Éxon 1

UTR 

Éxon 2

Íntron 2

de ínicio da transcrição

adição cap ↓

↓ 3’

Íntron 1

Éxon 3

sítio de poliadenilação ↑

splicing

↑ sítio de terminação

↓ adição de cauda poli-A 

Ribossomo ↓ 5’ UTR ↓   ↓ início da tradução

 

↓ 3’

UTR 

Modificações pós-traducionais

 3’ de DNA de um gene humano hipotético com três Fig. 4.5 — Resumo das etapas que vão do gene até a proteína: é mostrado um segmento 5’→  3’ éxons e dois íntrons, bem como sua seqüência promotora upstream upstream.. Na seqüência de DNA, a base adenina (A), indicada como início da transcrição, é considerada o nucleotídeo +1 da seqüência gênica. O sítio de poliadenilação, indicado à 3’, equivale à seqüência AATAAA. A  plena transcrição do gene, realizada pela RNA polimerase, produz uma molécula de fita simples de RNA precursora (hnRNA ou heterogêneo nuclear ou transcrito primário) que permanece dentro do núcleo, até que se finalizem os eventos de processamento (excisão de íntrons ou splicing , adição de CAP à 5’ e poliadenilação à 3’). O RNA processado (mRNA ou RNA mensageiro) é exportado através dos poros da carioteca para o citoplasma, onde se incorpora ao complexo de ribossomo + tRNA + aminoácidos. A tradução será realizada na direção 5’ →  3’,  3’, tendo início no  primeiro triplet triplet AUG  AUG encontrado. A região a 5’ deste códon não será traduzida (5’ UTR ou 5’5’-untranslated untranslated region ). A partir da metionina (Met) inicial incorporada, os nucleotídeos da molécula do mRNA serão codificados de três em três, até que se encontre um códon de parada da tradução, isto é, um triplet triplet para  para o qual não há há incorporação de aminoácido aminoácido (UGA, UAG UAG ou UAA). A região à 3’ do códon de terminação terminação não será traduzida (3’ UTR ou 3’-untranslated 3’-untranslated region ). A ilustração esquematiza a síntese de uma proteína composta de 13 resíduos na sua seqüência  primária, a qual será modificada posteriormente, até a formação da proteína final funcional.

perada originalmente. A quebra no marco de leitura para a

Genes mutados: persistência

incorporação dos aminoácidos na seqüência protéica, ou mutação  frame-shift , pode ocorrer devido a deleções, inserções ou duplicações, e gera proteínas com aminoácidos alterados na sua seqüência polipeptídica, truncadas e/ou alongadas, em geral sem função fenotípica. Finalmente, o exemplo apresentado em G ilustra uma alteração na seqüência promotora do gene que impossibilitou o estabelecimento do complexo de transcrição, impedindo que o gene se expressasse. Outros exemplos de mutações poderiam ser ainda citados neste capítulo, como as alterações que afetam as regiões 5’ e 3’ não-traduzidas (5’ UTR e 3’ UTR, ou untranslated regions), regiões intrônicas, os sítios de início e finalização da transcrição ou da tradução, as seqüências de poliadenilação ou os sítios de

A persistência de um alelo mutante como provedor de variabilidade dentro do genoma de uma espécie está sujeita à resposta deste às pressões seletivas. Assim, variantes alélicas polimórficas serão mantidas na população de forma diferencial dependente da repercussão que ela venha a ter no fenótipo. No homem, indivíduo diplóide, tal repercussão no fenótipo estará associada diretamente à herança genotípica; assim, a seleção irá ocorrer de forma diferencial, dependendo do tipo da manifestação do alelo no genótipo. Três situações clássicas podem ser observadas: (i) se a mutação anular completamente a expressão do gene (como no exemplo apresentado na Fig. 4.6G), o alelo mutado passará a ter caráter

excisão de íntrons (splicing Em qualquer um destes do casos, repercussão da mutação na ).capacidade de expressão genea poderia ter conotações desde leves até extremamente graves.

“recessivo” relação ao alelo original selvagem. forma, o caráterem fenotípico decorrente da ausência do Desta funcionamento deste gene será percebido apenas quando herdado em

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F U N D A M E N T O S D A G E N Ô M I C A 

homozigose, ou seja, quando o indivíduo tiver em seu genótipo ambos loci gênicos mutados; (ii) se a mutação apenas alterar a expressão do gene original, qualitativa ou quantitativamente, a repercussão no fenótipo será percebida em três

níveis dependentes do genótipo herdado: os homozigotos apresentarão fenótipos distintos e extremos, e o heterozigoto apresentará um fenótipo intermediário. Neste caso, ambos genes se expressarão, sendo, portanto, considerados “co-dominan-

Verr próxima página. Fig. 4.6 — Ve

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D I N Â M I C A D O S G E N E S E M E D I C I N A G E N Ô M I C A 

Fig. 4.6 — Exemplos do efeito que uma mutação na seqüência de DNA pode acarretar na expressão de um gene. (A) Reprodução resumida do

gene humano hipotético original, considerado tipo selvagem, apresentado na Fig. 4.5; (B a G) seis exemplos de alterações na seqüência de DNA e suas repercussões na expressão do gene. Os detalhes explicativos são apresentados no texto.

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tes”; (iii) se a mutação ativar a expressão de um gene que estava desligado ou com ativação bloqueada, o alelo mutado passará a ter caráter “dominante” sobre o seu alelo original selvagem, manifestando-se no fenótipo tanto em homozigose como em heterozigose. A manutenção do alelo mutante entre os indivíduos de uma população vai depender, portanto, da sua capacidade de expressividade e de penetrância, observadas pelo valor adaptativo que ele confere ao indivíduo que o porta. Assim, alelos polimórficos,, que permaneceram no genoma ao longo da evopolimórficos lução da espécie, são existentes entre populações atuais, por não haverem apresentado valores adaptativos extremamente baixos no passado2–4. No entanto, uma característica polimórfica, mantida ao longo das gerações devido a um efeito inicialmente neutro, poderá passar a apresentar efeito deletério, se os indivíduos da espécie se expuserem a importantes mudanças ambientais. Nos últimos séculos, ocorreram mudanças no comportamento sociocultural do homem cujas conseqüência conseqüênciass afetaram diretamente a prevalência de algumas doenças, as causas de morte e a longevidade das populações humanas. Evidentemente, a evolução biológica não acompanhou a evolução cultural na mesma velocidade; assim, alelos que no passado poderiam significar atributos genômicos hoje podem conferir prejuízos. Por exemplo, no passado, quando o homem era um ser caçador-coletor e os períodos de inanição eram comuns, alguns mecanismos seletivos agiriam, mantendo os alelos que garantissem um excelente aproveitamento dos substratos energéticos. Hoje em dia, podem ser justamente os alelos que permitem mobilização mais eficiente dos carboidratos os que dão ao indivíduo a suscetibilidade ao diabetes. Ou ainda, os genes que hoje favorecem e provocam a aterosclerose podem ter sido mantidos ao longo da evolução sob a explicação de que permitiram mobilização acelerada de gordura. Tais Tais suposições são apoiadas pela evidência, por exemplo, de que os

ou impedido a manifestação dos sintomas prejudiciais no portador de um gene deletério, permitindo sua boa adaptabilidade (capacidade de o indivíduo sobreviver e deixar descendentes). Uma vez que não sofrem pressão seletiva, os genes que conferem defeitos de visão, como a miopia, ou problemas respiratórios, como a asma brônquica, têm sido mantidos nas populações que fazem uso de recursos, como óculos

3,12,15. camundongos genesde para diabetes obesidade sobrevivem melhor às com condições jejum que oseoutros outr os animais Os avanços tecnológicos médico-sanitários reduziram a prevalência das doenças infecto-contagiosas que antes representavam a causa primária da mortalidade humana e da reduzida expectativa de vida da população. A atual longevidade humana está, portanto, conferindo o tempo necessário para que o fenótipo decorrente de alguns genes seja manifestado. A expressividade de tais genes, que teria sido inócua há dezenas de anos, agora passa a ser relevante, por associar-se às morbidades e disfunções fisiológicas crônico-degenerativas presentes no envelhecimento. A fragilidade diferencial na saúde do idoso humano estará relacionada à manifestação dos genes que conferem efeitos deletérios.

P; contudo, também valores uma terço dos genesafetada ligadospelos ao sexo comde f  f    =, s0 eserá  = eliminado cada geração. A pressão seletiva sobre os alelos recessivos poligênicos com segregação independente é inferior à das condições monogênicas, sendo quase nula, quando se tratam de múltiplos loci com efeito cumulativo, dadas a rara freqüência do homozigoto puro recessivo e a alta freqüência de heterozigotos portadores dos alelos. Mesmo nos casos em que a letalidade conjunta dos alelos seja completa ( f  de  de todos alelos = 0), será remota a possibilidade de reduzir a persistência de tais alelos na população devido à alta proporção de portadores. A seleção sobre os alelos autossômicos monogênicos com co-dominância se dará em graus de intensidade diferentes dependentes do número de alelos com baixo  f  herdados   herdados no genótipo. Algumas vantagens e desvantagens dos indivíduos heterozigotos, portadores de fenótipos intermediários, dese-

fator decorrente das alterações ambientedehumano é Outro o mascaramento do efeito fenotípico no prejudicial muitos genes: a revolução na tecnologia para a saúde tem revertido reverti do 84

ou drogas bronquiodilatad bronquiodilatadoras, oras, respectivamente. impedir a manifestação de alelos que seriam causadores deAotais fragilidades fisiológicas a seu portador, eles permanecem na população e são passados para as gerações seguintes, aumentando sua freqüência. Os avanços da medicina têm, portanto, promovido um relaxamento de seleção permitindo que muitos alelos com baixo valor adaptativo ( f   f ) aumentem suas freqüên32–37 cias na população humana . Alelos polimórficos, ou seja, que apresentaram até hoje um valor adaptativo maior que zero ( f  >  > 0) e um coeficiente seletivo menor que um (s < 1), persistem nas populações humanas por diferentes motivos. Em geral, quanto maiores forem o coeficiente seletivo, o grau de penetrância ( P) e a precocidade da manifestação fenotípica do alelo, mais baixa será sua manutenção na população. Se o alelo, no entanto, for recessivo autossômico monogênico, mesmo que apresente baixo f , apenas homozigotos hom ozigotos recessivos terão sua persistência afetada na população. Por este motivo, há pouca eficiência de seleção sobre esta condição, ainda mais se a penetrância do alelo for incompleta (P < 1). Pode-se medir o número de gerações (n) necessárias para alterar a freqüência do alelo recessivo (q) de q1 para q2 pela equação q2 = q1 /1 + (n • q1). O uso do diagnóstico pré-natal para selecionar bebês contra a presença de alelos recessivos condicionantes de fragilidades fisiológicas poderá aumentar a freqüência de tais alelos na população, pois, uma vez que a probabilidade do nascimento do homozigoto recessivo for nula, a freqüência do nascimento de heterozigotos subirá de 0,50 (um meio) para 0,67 (dois terços). A manutenção de um alelo ligado ao cromossomo X será

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quilibram as freqüências genotípicas e/ou alélicas ao longo das gerações, permitindo a persistência de alelos contra o que seria matematicamente esperado. Nas populações humanas, são reconhecidos dois exemplos clássicos quanto à vantagem ou não do heterozigoto: (I) vantagem do heterozigoto para o gene que codifica a hemoglobina (Hb A /Hbs) em áreas endêmicas do Plasmodium falciparum causador da malária, uma vez que o alelo normal para a hemoglobina (Hb A) protege o indivíduo em relação aos efeitos da anemia e o alelo mutante (Hbs) protege-o contra os efeitos da malária, alterando e destruindo a hemácia infectada pelo protozoário; e (II) desvantagem dos heterozigotos para o sistema Rh em decorrência, supostamente, da eritroblastose fetal1,4,34. As populações humanas têm sido pressionadas seletivamente, ao longo dos anos, por diferentes epidemias causadas por microrganismos. A infecção pelo vírus HIV-1 (AIDS ou síndrome da imunodeficiência humana adquirida) vem causando vítimas fatais em todas as populações mundiais. Contudo, dado que HIV-1 penetra nas células que expressam ambos receptores da quimiocina, CD4 e CCR5, estão sobrevivendo à AIDS indivíduos homozigotos para uma mutação

dual. Se tais interferências forem desconsideradas, haverá risco de equívoco na interpretação particularizada da investigação. Os estudos genômicos na medicina prevêem que a relação entre a herança do marcador genético e a manifestação fenotípica não é integralmente determinística devido às influências e interferências dos demais genes presentes em cada indivíduo14-18,31-36. “Um estudo multicêntrico, perfeitamente delineado, publicado em uma revista científica de elevado impacto, avaliou 5.000 sujeitos de uma mesma população e detectou a existência de associação estatisticamente significativa entre a herança do alelo D do polimorfismo I/D do gene que codi fica para a enzima conversora da angiotensina (ECA) e a manifestação de hipertensão essencial (HE) antes dos 50 anos de idade. Em decorrência do estudo, os autores concluíram que a análise da variação polimórfica em questão poderia  predizer  predi zer,, com 87% de precisão, o risco de um indivíduo daquela população vir a desenvolver HE.”

nerativos. Mesmo a estrutura do genoma a identificação dasconhecendo suas variações polimórficas estáhumano, apenas no início, e as pesquisas ainda buscam detectar quais são os genes, os marcadores e/ou os polimorfismos genéticos envolvidos nos quadros patológicos complexos. Os estudos populacionais em larga escala, que prevêem a descoberta de genes predisponentes a efeitos deletérios na saúde dos indivíduos, sustentam-se nas diretrizes epidemiológicas, usando associações e correlações estatísticas que unem o gene candidato à ocorrência da disfunção. Mesmo que tais estudos evidenciem uma associação direta significativa entre a presença de um alelo e a manifestação de uma doença complexa, deve-se levar em consideração o conjunto genético herdado por um indivíduo, antes de concluir se os fatores genéticos

O exemplo hipotético do uso da informação genética como prognóstico na prática médica, descrito acima, pode servir como base na tentativa de esclarecer as razões da existência dos casos desviantes, como quando o genótipo marcador da HE for encontrado em indivíduos com fenótipo saudável, ou quando o fenótipo patológico não estiver associado ao genótipo esperado. Assim, a conclusão sobre a suscetibilidade de um sujeito a desenvolver qualquer doença deve passar por uma avaliação que vai muito além da determinação do genótipo. No caso do exemplo, dever-se-ia considerar, pelo menos, dois grandes enfoques: 1 — a HE é uma doença multifatorial, ou seja, causada pelo resultado conjunto da capacidade de expressão das centenas de genes que controlam a função vascular modulados pelos fatores vindos do meio externo. Um indivíduo além de apresentar em seu genoma o genótipo marcador para suscetibilidade à HE deverá, portanto, apresentar um conjunto genético que não interfira negativamente na expressão do alelo marcador, bem como, estar exposto a um ambiente favorável à manifestação do mesmo. No caso da HE, sabe-se que a dieta hipercalórica, o sedentarismo e o tabagismo são exemplos de fatores de risco externos que potencializam potencializam o estado fisiológico que promove a diminuição do calibre dos vasos; 2 — o polimorfismo I/D (inserção/deleção) é uma variação representada pela presença ou ausência respectiva de uma seqüência repetida Alu de 287 bp dentro do intron 16 37. Por se tratar de um polimorfismo intrônico, pode-se supor que a variante em questão ou venha a interferir no processamento do mRNA-ECA, ou apenas seja uma mutação silenciosa ligada a uma segunda mutação localizada em outra porção genômica que realmente interfira na atividade vasoconstritora da ECA. Esta segunda mutação poderia ser dentro do próprio gene ECA, na sua porção

vão, de fato,não afetá-lo fenotipicamente. A etiologia complexas será decifrada sem que se conheçamdas as doenças influências e as interferências gênicas dentro de cada genoma indivi-

promotora, numa seqüência reguladora ) ou numàgene regulador, por exemplo. Nestes casos,(aenhancer  suscetibilidade elevação da pressão vascular associado ao polimorfismo I/D

no gene3,15,31,35 que codifica o CCR5, são resistentes à infecção . Como apara AIDS, outraspois epidemias infectocontagiosas, e mais recentemente a SARS (síndrome respiratória aguda)38, também de origem viral, vêm selecionando positivamente apenas os indivíduos resistentes.

CONJUNTO DE GENES NOS INDIVÍDUOS INFLUÊNCIAS E INTERFERÊNCIAS GÊNICAS Avaliações populacionais epidemiológicas para a medicina genômica preventiva (descartando os vieses de amostragem)37 estão indicando a relação entre a herança de certos alelos, ou marcadores genéticos, e a suscetibilidade ao desenvolvimento de quadros biológicos mais ou menos dege-

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(I) Marcador genético em estudo

Fig. 4.7  4.7  —  Alvo da medicina genômica: possíveis atitudes médicas  preventivas e terapêuticas mais personalizadas a partir dos estudos genômicos.

Ao longo do processo evolutivo, pequenas mutações foram alterando a seqüência final de segmentos de DNA, gerando variações polimórficas. As mutações que foram compatíveis com a sobrevivência do indivíduo podem ter alterado a qualidade ou a quantidade de algum produto gênico, ou haverem sido neutras ou silenciosas; em qualquer dos casos tais variantes polimórficas poderão ser utilizadas como marcadores informativos de algum fenótipo. Caso se esteja investigando inv estigando marcadores neutros ou silenciosos, eles poderão ser informativos quando estiverem ligados a características genéticas, de fato, determinantes. Ou seja, serão informativos quando houver desequilíbrio de ligação (associação preferencial) entre o marcador e a característica genética desencadeadora do fenótipo. A distância entre as características polimórficas ligadas, obtida em unidades-mapa (uma unidade-mapa equivale a 1 centimorgan ou a 1% de recombinação entre duas alterações alélicas), oferece a medida quantitativa do relacionamento genético entre elas, as quais serão consideradas ligadas, quando estiverem suficientemente próximas para que não segreguem independentemente, ten-

 Análises moleculares/Estudos moleculares/Estudos populacio populacionais nais Respostas a drogas (farmacogenética)

Suscetibilidades genéticas (diagnóstico/prognóstico) Segmentos de DNA alterados que causam doenças simples raras

Segmentos de DNA  envolvidos na suscetibilidade a doenças complexas freqüentes ou infectocontagiosas

Segmentos de DNA  envolvidos no metabolismo das drogas

Otimização do diagnóstico e dos tratamentos e novas descobertas Medicina genômica suscetibilidades idades Fig. 4.8 — Estudos moleculares genéticos e genômicos em populações humanas na busca da identificação de perfis relacionados às suscetibil às doenças e ao metabolismo das drogas. O resultado destes estudos levará à compreensão dos mecanismos de herança e dos mecanismos moleculares através dos quais os genes causam as doenças, a fim de que possam ser alvos para novas drogas e tratamentos.

dependeria da extensão do desequilíbrio de ligação entre as duas mutações polimórficas. No sentido de oferecer ferramentas para a análise do uso da informação genética como prognóstico na prática médica são citadas a seguir dez situações, nas quais a inter-

dendo a serem transmitidas juntas. A genética das populações é capaz de medir o número de substituições alélicas por locus que ocorreram durante a separação evolutiva das populações humanas. Assim, é razoável supor que, se a aquisição da mutação marcadora neutra ou silenciosa ocorreu em um

pretação genótipo-fenótipo pode estar mascarada devido influências e/ou interferências genômicas, particulares a cadaa indivíduo1-5,26-27 .

período evolutivo particular,apenas particular, ela pode ligadapopulações à característica genética informativa emestar algumas de indivíduos. A associação entre fenótipo e mutação marca-

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(II) Efeito epistático

ticas quantitativas (ou poligênicas, ou contínuas) são determinadas por vários pares de genes localizados em loci diversos, com diferentes graus de identificação da predisposição ao fenótipo. Ainda pode ocorrer que a manifestação de um caráter dependa, além dos pequenos efeitos aditivos dependentes dos alelos herdados, dos efeitos intensificadores ou bloqueadores que o ambiente ao qual o indivíduo está expos-

Uma variante alélica informativa pode ter seu fenótipo final mascarado pela ação de um outro gene não-alélico sobre ela, ou seja, alteração na expressão fenotípica de um gene por interferência de outro pertencente a um locus diferente. Nestes casos, a suscetibilidade do indivíduo a manifestar o fenótipo dependerá da combinação do conjunto de alelos de ambos os loci herdados.

to exerce. A interpretação donoestudo dosestá alelos polimórficos com contribuição quantitativa fenótipo sujeita, portanto, à determinação do limiar genotípico, o qual mede a quantidade necessária de genes presentes no genótipo, para que uma característica de herança multifatorial se manifeste num dado ambiente. Assim, existindo um limiar genotípico, podem-se identificar as categorias fenotípicas descontínuas ou semicontínuas que facilitam a interpretação da contribuição genética.

(III) Efeito pleiotrópico

(VI) Reflexo genotípico diferencial do alelo polimórfico

dora, portanto, pode ser observada apenas em alguns grupos típicos. Além disso, devido a recombinações cromossômicas aleatórias, a configuração em CIS  entre  entre mutação marcadora e característica informativa pode vir a ser perdida.

Ocorre quando uma variante polimórfica gera efeitos fenotípicos múltiplos seqüenciais e em cadeia. Uma variante alélica informativa pode estar associada a um fenótipo final não de forma direta, mas devido a um desencadeamento de efeitos Ela serádireta a responsável pelo fenótipo, mesmo queanteriores. não haja relação evidente entre o seu produto gênico e as características fisiológicas, bioquímicas ou moleculares observadas no fenótipo. Considera-se este fator, ao estudar genes reguladores ou seqüências promotoras de genes estruturais devido aos efeitos fenotípicos múltiplos por eles gerados. Desta forma, ainda que não haja relação fisiológica ou bioquímica direta esperada ou conhecida entre a herança de um alelo e a manifestação fenotípica de uma característica, se forem encontradas associações ou correlações estatisticamente significativas entre ambas, estas deverão ser consideradas, uma vez que o alelo pode estar agindo pleiotropicamente pleiotropicamen te sobre a característica.

(IV) Penetrância variada A penetrância diferencial de um alelo ou de um genótipo pode ser a responsável pela ausência de associação entre a herança e a expressão fenotípica observada. Genes sujeitos a interações com outros genes (epistasia (epistasi a ou pleiotropia), ou alvo de modificações epigenéticas (por exemplo, como metilação), podem apresentar penetrância incompleta ou reduzida, medida quando a freqüência de associação entre a expressão fenotípica e a herança do genótipo é inferior a um ( P < 1). Nestes casos, ocorre que o alelo em questão está sob influência do restante do genoma ou do meio externo.

A conseqüência de uma mutação alélica poderá ter reflexo diferencial no genótipo se o alelo mutado tiver expressão dominante, for recessivo ou co-dominante. Por este motivo, antes de propor agrupamentos entre homozigotos e heterozigotos na busca de associações com os fenótipos, é relevante que se considere a forma como a mutação se manifesta no genótipo. Mutações que não anulem completamente, mas apenas interfiram no nível de expressão do alelo (qualitativa ou quantitativamente), serão co-dominantes com o alelo original, pois ambos estarão se expressando, expressan do, e o heterozigoto apresentará um fenótipo intermediário aos homozigotos. Por outro lado, mutações polimórficas que impeçam a síntese ou a total funcionalidade protéica apresentarão apenas dois fenótipos a partir dos três genótipos possíveis, uma vez que o heterozigoto não terá expressão própria. Neste caso, o alelo mutado será recessivo. Terá caráter dominante aquela variante polimórfica que ativar a expressão de um gene originalmente desligado.

(VII) Efeitos estruturais

A manifestação de um caráter encontra-se sob efeito quan-

A interpretação da herança de certo alelo polimórfico pode ser comprometida ainda, se este estiver recebendo interferências estruturais dentro do genoma. Dado que as genotipagens são realizadas através de técnicas de visualização de segmentos ou seqüências de DNA, deve-se considerar que a detecção da presença de um alelo não significa que o mesmo esteja posicionado no genoma conforme o esperado do ponto de vista estrutural. Assim, antes de fixar ou descartar qualquer associação entre fenótipo e a herança de genes detectada por genotipagem molecular, molecular, deve ser s er considerada a existência de alguns aspectos estruturais complicadores, como: (a) o efeito de posição: ocorre quando a troca espacial da posição de um gene com relação aos demais no genoma acarreta uma mudança no seu efeito fenotípico. Tal Tal troca pode haver sido de-

titativo, quando é determinada pelae que herança de váriosdegenes que segregam independentemente influenciam, maneira cumulativa, o aparecimento do fenótipo. As caracterís-

corrente cromossômicas como inversõesdeourecombinações translocações.estruturais Nestes casos, a análise pura do DNA será capaz de detector a presença do gene são permitin-

(V) Efeito quantitativo

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F U N D A M E N T O S D A G E N Ô M I C A 

do, no entanto, a constatação da ausência de sua expressão devido a sua nova posição no genoma; (b) pseudogenes: são seqüências de DNA homólogas a genes conhecidos não-alélicas e não-funcionais (com alterações que impedem a transcrição e/ou tradução). Alguns genes de interesse podem apresentar cópias inativas no genoma que se tornam complicadoras, quando se está estudando a herança pela análise apenas da presença das seqüências de DNA, desconsiderando capacidade de expressão; (c) pseudodominância: ocorre quan-a do há a expressão fenotípica do alelo recessivo no heterozigoto em conseqüência de alteração estrutural mutante não-polimórfica do alelo homólogo dominante.

(VIII) Modificações epigenéticas São modificações no padrão de expressão gênica que não se devem a alterações na seqüência nucleotídica do DNA. Ou seja, sem que haja alteração visível na molécula do DNA, a modulação de um gene pelo meio gera diferentes formas de expressividade, resultando em fenótipos distintos. A metilação é um dos tipos de mecanismo epigenético no qual um gene tem sua expressão mudada, mesmo mantendo-se inalterada a sua seqüência de bases, pela incorporação de um radical metila (CH3) em seus nucleotídeos. Uma vez mais, as genotipagens moleculares podem ser limitadas se forem capazes apenas de identificar a presença do segmento de DNA, e não sua expressão. Além da metilação, a epigenia abrange outros mecanismos que podem eliminar funções gênicas, reduzir, silenciar ou supra-regular temporariamente a expressão de um gene ou as propriedades de seu produto mesmo sem uma mudança na seqüência do DNA. Mudanças na conformação da cromatina, mudanças pós-traducionais e o imprinting (ver item IX) estão entre os já detectados mecanismos epigênicos39. Mais recentemente, por decorrência do conhecimento mais abrangente da configuração dos genomas, vêm sendo identificadas camadas de informação que afetam o fenótipo e que não estão diretamente associadas a modificações na seqüência do DNA de genes codificadores43-46. Cerca de 80% dos segmentos de DNA altamente conservados nos genomas de organismos superiores (genoma humano e outros mamíferos) não pertencem a regiões codificadoras de proteínas. A manutenção de ditos segmentos é um forte indicativo de sua importância evolutiva. Assim, regiões não-codificadoras do genoma têm se mantido quase que intactas durante milhões de anos devido à relevância do papel por elas desempenhado. Essas informações, definitivas no que se refere às variações fenotípicas, são epigenéticas e moduladas independentemente da seqüência do DNA. Os segmentos codificadores de proteínas, que correspondem a apenas 2,5% do genoma humano, estão separados pelas extensas regiões não-codificadoras, as quais contêm uma coleção de outras unidades de transcrição RNAs podem estar interferindo de maneira paralela na cujos química ce43,44 lular . Um tipo de silenciamento individual de genes é efe88

tuado por moléculas RNAs anti-senso, transcritas por genes não-codificadores não-codificado res que, ao combinarem-se com a molécula de mRNA complementar, formarão estruturas fita-dupla não-traduzíveis45. A sincronia da transcrição do RNA anti-senso e seu mRNA complementar poderia ser ainda uma forma de controle temporal da síntese protéica. Outros genes, ou porções gênicas, não-codificadores (íntrons, por exemplo) transcrevem para microRNAs, os quais são segmentos que formam estruturas RNA fita-dupla em grampos após transcritos e que, através do mecanismo de RNA de interferência (iRNA), serão utilizados também no silenciamento de genes ou na redução da taxa de tradução de alguns mRNAs 46. As porções genômicas não-codificadoras não-codificadoras (até então pouco exploradas) e a atuação de moléculas de RNAs ativos como um sistema regulador pós-transcricional (uma novidade entre os mecanismos epigênicos) poderão interferir, portanto, drasticamente na transmissão da informação informação e, em conseqüência, no no fenótipo final.

(IX)

Imprinting

mecanismo de “impressão genômica” resulta emdeterfenótiposOdiferentes, dependendo de qual genitor se origina minado alelo autossômico. Este processo, um tipo particular de mecanismo epigenético, pode ser causado por diferentes graus de metilação do DNA de genes durante a gametogênese (ovogênese e espermatogênese), ou seja, antes de serem herdados. O fato de o gene ter sido herdado do pai ou da mãe interfere na capacidade de expressão dele na descendência, independentemente independentem ente se for feminina ou masculina.

(X) Variância fenotípica decorrente do meio ambiente Quando não se encontra a associação esperada entre a herança umocorrendo genótipo einterferência uma única manifestação fenotípica, podede estar também do meio externo. Nestes casos, a expressão de um gene é completa ou parcialmente modulada pela exposição ao meio, ou o ambiente exerce uma ação capaz de introduzir alterações fenotípicas independentes dos componentes do genoma. Ao interpretar a relação entre fenótipo e genes herdados, deve-se considerar para esse quesito: (a) a fenocópia: designa um fenótipo, ou seja, um conjunto de características físicas, fisiológicas e/ou bioquímicas, induzido por fatores adquiridos do ambiente, que se assemelha a um outro produzido pela herança de um gene específico. Assim, a pura verificação da existência do fenótipo não indica herança; (b) o reduzido grau de herdabilidade do caráter: a medida da herdabilidade indica o grau de determinação genética de uma característica, isto é, a medida estatística quantoSe o caráter foi determinado pela influência do genética. o valorfenotípico da herdabilidade de um caráter for inferior a um, isso significa que se espera variação fenotípi-

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D I N Â M I C A D O S G E N E S E M E D I C I N A G E N Ô M I C A 

ca de decorrência ambiental. Um caráter com herdabilidade igual a zero é completamente adquirido pelo meio; (c) a norma de reação: mede o quanto da variância fenotípica é decorrente de variação ambiental e não de variação genética. Ou seja, um mesmo gene, ou genótipo, pode se expressar das mais variadas formas, havendo ampla distribuição fenotípica, em resposta apenas às diferentes condições ambientais.

MEDICINA GENÔMICA A capacidade de decifrar o genoma humano, aliada ao estudo das populações humanas, possibilita a compreensão, em detalhes cada vez mais precisos, de como a informação genética define os demais aspectos do organismo humano. O conhecimento do genoma humano habilita os pesquisadores a mapear e identificar os marcadores genéticos responsáveis pelo aumento da suscetibilidade de um indivíduo a apresentar características biológicas típicas ou a desenvolver quadros patológicos. Com isso, passa-se a aplicar os conhecimentos genômicos à prática da clínica médica na busca da identificação dos mecanismos da herança e os mecanismos moleculares através dos quais os genes causam as doenças. Os atuais estudos genômicos da medicina têm por objetivo identificar os genes, marcadores genéticos ou conjuntos de genes que, quando herdados, deixam um indivíduo mais suscetível a desenvolver algum perfil patológico. No entanto, a identificação de um genótipo nem sempre pode predizer o fenótipo final, mas apenas detectar a predisposição do indivíduo a determinado fenótipo, uma vez que os processos multifatoriais são regulados pela ação conjunta de centenas

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de genes e interferências ambientais. Mesmo nesta situação, a identificação diferencial da herança genética é muito funcional como fator diagnóstico a ser introduzido na prática clínica. Em outras palavras, conhecendo os genes herdados por uma pessoa, será possível conhecer em que grau há predisposição de ela desenvolver determinadas doenças, o quão suscetível ela é às doenças infectocontagiosas e como ela poderá 14,16,18,31-35,40-42

responder a um tratamento farmacológico . A identificação da herança de certos genes e de sua associação ao desenvolvimento de doenças servirá como mais um fator de risco para uma avaliação prognóstica que direcione atitudes médicas preventivas e estratégias terapêuticas mais personalizadas na busca de curar ou atenuar o fenótipo patológico. Além disso, será possível indicar à indústria farmacológica a melhor direção para a produção de drogas mais precisas e eficazes (Fig. 4.7). Nos cerca de 30 mil genes do genoma humano, codificadores de mais de 100 mil proteínas, já foram detectadas mais de 50 mil variações polimórficas de alteração de um único nucleotídeo (SNP ou single-nucleotide polymorphism), as quais podem provocar alterações estruturais ou regulatórias nas diversas funções metabólicas do organismo, envolvendo, portanto, modificações fenotípicas16. Desta forma, é fundamental conceber que somente após estudos populacionais em larga escala, com grande número de indivíduos de diferentes populações avaliados, será possível concluir se, de fato, há associação entre a herança de certos genes ou marcadores genéticos e um fenótipo, e, ainda que uma associação significativa seja evidenciada, dever-se-ão considerar as variabilidades individuais de cada paciente, antes de submetê-lo a intervenções 18,33,42 (Fig. 4.8).

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S Ú MU L A C U RR I CU L AR

CLARICE SAMPAIO ALHO Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Faculdade de Biociências/  Laboratório de Genética e Biologia Molecular — PUC-RS Av. 6.681 ——Prédio 12 — CEP: 90610-000 — Porto Alegre-RS Tel.:Ipiranga, (51) 3320-3500 E-mail: [email protected]

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• 1999-Atua 1999Atual: l: Profess Professora ora de genétic genéticaa e pesquisad pesquisadora ora na FaculFaculdade de Biociências - PUCRS. • 2001 2001-At -Atual: ual: Pesquis Pesquisador adoraa Responsáve Responsávell pelo Laboratór Laboratório io de Genética e Biologia Molecular da Faculdade de Biociências - Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul PUCRS. • 20 2002 02-A -Atu tual al:: Co Cons nsul ulto torr ad-hoc permanente do Comitê de Ética em Pesquisa - PUCRS. • 2003-A 2003-Atual: tual: Coorden Coordenadora adora do Programa Programa de Pós-Gr Pós-Graduação aduação Mestrado e Doutorado em Biologia Celular e Molecular PUCRS. • 20032003-2003: 2003: Colabo Colaborador radoraa do Curso Curso de Pós-Gra Pós-Graduaçã duaçãoo EspeEspecialização em Engenharia Clínica do CEPEX - UCSal, Salvador, Bahia. • 20022002-2003: 2003: Colabo Colaborador radoraa do Curso Curso de Pós-Gra Pós-Graduaçã duaçãoo EspeEspecialização em Análises Clínicas do CEPEX - UCSal, Salva-

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dor, Bahia. • 2000-200 2000-2002: 2: Membro Membro Secretá Secretário rio da Diret Diretoria oria da da Sociedade Sociedade Brasileira de Genética Regional do Rio Grande do Sul - SBG/  RS, Porto Alegre, RS. • 19991999-2001: 2001: Pesqui Pesquisado sadora ra Associada Associada ao Instit Instituto uto de Geriatr Geriatria ia e Gerontologia - PUCRS. • 19911991-1993: 1993: Diret Diretor-Pr or-Presid esidente ente da Associa Associação ção Gaúcha Gaúcha de DisDistrofias Musculares - AGADIM, Porto Alegre, RS.

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Prêmios e Títulos

Resumo da Produção Acadêmica e Científica  Artigos publicados em periódicos, 4 Trabalhos em eventos, 46  Livros e capítulos, 9 Orientações concluídas, 8 Orientações em Andamento, 8

Formação Acadêmica/Titulação

• 1994-1998 1994-1998:: Doutorado Doutorado em em Fisiopato Fisiopatologi logiaa e Patologia Patologia MoleMolecular. Universidade de Barcelona, U.B., Espanha. • 1990-1 1990-1994: 994: Mestrad Mestradoo em Genética Genética e Biologia Biologia Molecular Molecular.. Departamentoo de Genética, Universidade Departament Universidade Federal do Rio Grande do Sul, UFRGS, Porto Alegre/RS. • 19871987-1990: 1990: Licenc Licenciatur iaturaa Em Ciências Ciências Biológ Biológicas icas e Bachare Bachare-lado em Genética. Universidade Federal do Rio Grande do Sul, UFRGS, Porto Alegre/RS.

• 2001: 2001: Distinção Distinção no no Prêmio Prêmio Jovem Geneti Geneticista cista 2001, 2001, Socieda Socieda-de Brasileira de Genética / Amershan Pharmacia Biotech. Artigos Publicados

• Alho CS. CS. Esclare Esclarecendo cendo algumas algumas questõ questões es sobre sobre Seres Seres HumaHumanos Clonados. In: Kipper Kipper DJ et al. Ética em Pesquisa: RefleReflexões. EDIPUCRS. Porto Alegre, RS, 2003, p. 61-70.

Participação Examinadora, Participação em em Banca Comissões Julgadoras,1220

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