Lezione 5 (Immunochimica)

 

TECNICHE IMMUNOCHIMICHE

 

ALCUNE DEFINIZIONI……

ANTIGENE:   molec molecola ola ch che, e, intr introd odott otta a in un or orga gani nismo smo,, è in gr grad ado o di atti attivar vare e la risposta anticorpale. anticorpale. Gli antigeni antigeni sono tipicamente tipicamente macromolecole macromolecole solubili in acqua e che poss ssie ied dono ono un alto lto gra rad do di comp omple lesssi sittà chimi imica. Maggio iore re il peso molec mo lecola olare re,, magg maggior iorii le pr prob obab abili ilità tà che che funz funzion ionin ino o come come anti antige geni. ni. Le pr prot otei eine ne eterologhe (cioè, provenienti da organismi diversi dall’animale trattato) di massa molecolare >10000 Da sono generalmente degli ottimi antigeni, mentre i piccoli peptidi non sono di solito antigenici. Due sono essenzialmente le proprietà di un antigene :    IMMUNOGENICITÀ:  capacità    ANTIGENICITÀ:

di indurre una risposta immunitaria

  capaci capacità tà di reagir reagire e in maniera maniera specific specifica a con i prodott prodottii fina finalili

delle risposte immuni (anticorpi (anticorpi e/o recettori di membrana)

 

ALCUNE DEFINIZIONI…… Da che cosa dipende l’immunogenicità di una sostanza?    Estraneità:  il

sistema immunitario è in grado di discriminare il “self” dal “non self”, di conseguenza,

le molecole estranee ad un determinato organismo hanno capacità immunogenica;    Specie Specie

animale: animale:   le prop propri riet età à immu immuno noge gene ne di un an anti tige gene ne varia variano no a seco second nda a de della lla spec specie ie

animale utilizzata per la produzione di anticorpi;    Peso

molecolare:  più è elevato il peso molecolare della molecola in esame e maggiore sarà la

possibilità di avere un una a risposta immunogenica;    Degradabilità:   macromolecole

insolubili sono più immunogene di quelle più piccole e solubili,

poiché vengono più facilmente fagocitate ed elaborate dal sistema macrofagico;    Comp omplessità

chimica

immunogenicit icità à.

Ad

e

struttura urale

esempio

delle

molec eco ole:   l’et l’eter erog ogen enei eità tà

omopolime imeri

anche

ch chim imica ica

adeguatamente

grandi

ap appo port rta a hanno

immunogenicità bassa se confrontata con polimeri, contenenti aminoacidi diversi, dello stesso peso molecolare. D’altra parte, gli antigeni proteici risultano tanto più immunogeni quanto più sono complessi complessi i loro l oro livelli di organizzazione molecolare (struttura (struttura terziari terziaria a e quaternaria).

 

ALCUNE DEFINIZIONI……

Tutte le sostanze sono immunogeniche? No,, infatti esistono piccole sostanze organiche, dette  apteni, monovalenti (con un No unico uni co determ determinan inante te antige antigenico nico), ), antige antigenic niche, he, ma non immunog immunogeni eniche che.. Possono Possono nome di carrier  di carrier  (BSA,  (BSA, KLH) e funzionare come epitopi naturali, scatenando la risposta anticorpale.

 

ALCUNE DEFINIZIONI…… ANTICORPI Gli anticorpi, prodotti dalle plasmacellule, appartengono al gruppo di proteine note come  immunoglobuli  immunoglobuline ne (Ig), classificabili in cinque diverse classi: classi: IgG,  IgG, IgA, IgM, IgE, e IgD.. Gli anticorpi IgD anticorpi strutturalmente strutturalmente più semplici sono le  IgG, costituite da quattro catene polilipe po pept ptid idic iche he:: due due ca cate tene ne legg legger ere e id iden enti tich che e tr tra a di lo loro ro e due due cate catene ne pesa pesant ntii anch'esse identiche tra loro; rappresentano circa l’80% delle Ig del siero. Fab Ponti disolfuro

Zona variabile Zona costante

Catene leggere 25 kDa, 220 aa

Catena leggera

Zona variabile

Catene pesanti

Fc

Catena pesante

50 kDa, 440 aa

Zona costante

Fab : Fragment antigen binding Fc : Fragment crystallizable

 

ALCUNE DEFINIZIONI……

 

ALCUNE DEFINIZIONI…… Interazione antigene-ant antigene-anticorpo icorpo

  Sistema

chiave-serratura :

  L’unione

che si instaura tra un antigene ed il corrispondente anticorpo porta alla

form formaz azio ione ne di que quello llo che vien viene e defi defini nitto   IMMUNOCOMPLESSO. Tale unione è altamente specifica ed è regolata da forze di tipo chimico-fisico (legami di natura covalen lente te)) che che agisc agiscono ono tr tra a i dete determi rmina nant ntii dell’ dell’an anti tige gene ne e dell’ dell’an antic ticorp orpo o non cova (Forze di Coulomb, Forze di Van der Waals, legami H);   La

formazione degli immunocomplessi determina una serie di eventi finalizzati alla

dell’antigene. definitiva distruzione o neutralizzazione dell’antigene.

 

ALCUNE DEFINIZIONI…… 

  L’equilibrio fra antigene e l’anticorpo viene espresso dalla legge di massa:

Ka

Ab + Ag   ⇔ AbAg 

=

  [AbAg ] = 1 [Ab]⋅ [Ag]   K d

  Quando, per una determinata concentrazione concentrazione di Ag, si ha:

[AgAb ]  = [Ab] cioè i siti antigenici dell’anticorpo sono saturati  per metà  con l’antigene, allora il valore del reciproco della concentrazione dell’antigene libero sarà uguale alla

costante di affinità:

Ka

=  

1

[Ag]

1

=  

Kd

La costante Ka   (anche   costante di associazione) associazione) è definita dalla concentrazione di anti an tige gene ne lilibe bero ro nece necess ssar ario io perc perché hé veng venga a ra ragg ggiu iunt nto o il 50 50% % di sa satu tura razi zion one e dei dei si siti ti anticorpali ed una ed una misura dell’affinità misura dell’affinità intrinseca o della o della stabilità del legame Ag-Ab. Ag-Ab.

 

ALCUNE DEFINIZIONI……

  Il

affinità  di un anticorpo per un dato antigene  determina, valore della costante di affinità di

neglili esperi neg esperiment mentii immuno immunochim chimici, ici,   sia sia il lilimi mite te di ri rile leva vabi bililità tà   (che (che migl miglio iora ra con con l’aumentare l’aume ntare dell’affinità dell’affinità), ),   sia sia la spec specifific icitità à   (che (che cr cres esce ce al all’ l’au aume ment ntar are e della della differenza tra il valore della costante di affinità di un Ab verso l’Ag specifico e quello relativo ad un Ag meno specifico);    Le

Kaff possono variare da 109 ÷ 1010 M-1 nel caso di anticorpi con elevata affinità per 

l’antigene, a 104 ÷ 105 M-1 nel caso, invece, di immunoglobuline con bassa affinità.

 

ALCUNE DEFINIZIONI…… 

  Affinità:   forza forza dell’inter dell’interazion azione e anti antigene gene-ant -anticorp icorpo, o, misurata misurata dalla cost costante ante di equ equilibr ilibrio io della reazione di associazione;



  Reazione antigene-anticorpo:  reazione dinamica e reversibile tra un anticorpo e un antigene perr dare pe dare orig origin ine e al comp comple less sso o an antig tigen enee-an anti tico corp rpo. o. E’ ca cara ratt tter eriz izza zata ta da un una a cost costan ante te di equilibrio definita;



  Immunogeno: sostanza antigenica (antigene, coniugato aptene-proteina) che, in contatto con un ospite immunocompetente, immunocompetente, è capace di stimolare la produzione di anticorpi specifici;



  Sito legante anticorpale (paratopo):  regione della molecola anticorpale capace di combinarsi con il corrispondente c orrispondente dete determinante rminante antigenico;



  Determinante antigenico (epitopo): elemento strutturale della moleco molecola la antigenica riconosciuto dall’anticorpo e capace di combinarsi con il corrispondente corri spondente sito sito legante anticorpale;



  Marcatore:  sostanza (radioisotopo, enzima, fluoroforo ecc) che introdotta nella struttura di un reagente (antigene, aptene, anticorpo) ne consente la rivelazione. ri velazione.

 

TECNICHE IMMUNOCHIMICHE La specificità delle reazioni reazioni antigene-antico antigene-anticorpo rpo e la sensibilità sensibilità di “marcator “marcatori” i” (enzimi, imi, iso isotopi, sos osttanze flu luo oresce cent nti, i, radic ica ali lib ibe eri) posson ono o “

esser sere ”,

quantificare con precisione una sostanza antigenica, presente, nel nostro caso, nei fluidi biologici.

 

IMMUNODOSAGGI

Metodi marcati

Metodi non marcati

traccianti radioisotopici, radioi sotopici, enzimatici, fluorimetrici, bioluminesc bi oluminescenti, enti, chemiluminescenti

Agglutinazione

Precipitazione

Se avviene in soluzione

Se avviene in matrice solida

acquosa

Diretta

Indiretta

se l’antigene è corpuscolato

se l’antigene, solubile, si fa

(cellule, batteri)

adsorbire o legare covalentemente a carrier insolubili (sfere di lattice, globuli rossi)

 

Reazioni di agglutinazio agglutinazione/precipita ne/precipitazione zione In adat adatte te condizioni condizioni sperime sperimentali ntali (p (pH, H, temp temperatu eratura, ra, forza ionica), ionica), e con adatti rapporti ottenere re la precip precipita itazio zione ne del comple complesso sso ant antigen igene-a e-anti nticor corpo, po, stechiometrici, si può ottene anche di peso molecolare molto elevato.

 

REAZIONI DI AGGLUTINAZIONE/PRECIPITAZIONE

 

REAZIONI DI AGGLUTINAZIONE/PRECIPITAZIONE Test di precipitazione ad anello , Ring Test 

 

REAZIONI DI AGGLUTINAZIONE/PRECIPITAZIONE

Ricerca di IgM o IgG per verificare la infezione in corso o già avvenuta!!!

 

REAZIONI DI AGGLUTINAZIONE/PRECIPITAZIONE

 

REAZIONI DI AGGLUTINAZIONE/PRECIPITAZIONE

 

REAZIONI DI AGGLUTINAZIONE/PRECIPITAZIONE

 

REAZIONI DI AGGLUTINAZIONE/PRECIPITAZIONE

 

REAZIONI DI PRECIPITAZIONE

Se l’immunoprecipitazione avviene in un gel, si parla più propriamente di Immunodiffusione

Metodi di immunodiffusione più comuni per il dosaggio di antigeni: 

Immunodiffusione radiale semplice



Immunodiffusione doppia



Immunoelettroforesi

 

REAZIONI DI PRECIPITAZIONE Immunodiffusione radiale semplice

Il diametro dell’anello sarà funzione della concentrazione dell’antigene

 

REAZIONI DI PRECIPITAZIONE Immunodiffusione radiale semplice

Il diametro dell’anello sarà funzione della concentrazione dell’antigene

Costruzione retta di taratura:

 

REAZIONI DI PRECIPITAZIONE Immunodiffusione doppia (metodo di Ouchterlony)

a e b : epitopi sugli antigeni

La posizione della banda dà una stima

semiquantitativa

concentrazione di antigene

della

 

REAZIONI DI PRECIPITAZIONE

 

REAZIONI DI PRECIPITAZIONE Immunoelettroforesi

Si unisce la separazione di proteine (antigeni) mediante elettroforesi con la specificità della reazione di immunoprecipitazione:

Usata per indagini qualitative:    nell’alterato 

anabolismo delle IgG (gammapatie mono- e policlonali)

  nello studio delle anomalie della sintesi proteica ((analbuminemia, analbuminemia, aga agammaglobulinem mmaglobulinemia, ia, ecc)

 

REAZIONI DI PRECIPITAZIONE

 

REAZIONI DI PRECIPITAZIONE Quando un clone di plasmacellule produce una proteina M, si

ha

una

modifica

dell'elettroforesi.

Una

proteina

monocl mono clon onal ale e pu può ò migr migrar are e ov ovun unqu que e ne nella lla re regi gion one e de delle lle gamma globuline. Le IgM e le IgA tendono a migrare più velocemente

rispetto

alle

IgG

(figure

b

e

c).

Per 

l'l'id iden enti tifi fica cazi zion one e ce cert rta a de delllla a pr prot otei eina na M si può può util utiliz izza zare re l'immunoelettroforesi. L'immunoelettroforesi  si avvale dell'applicazione di  anticorpi

contro le proteine sieriche già elettroforeticamente separate : si generano archi di precipitazione dovuti alla reazione tra an antitigen gene e e anti anticor corpo po. Se è pres presen ente te una ga gam mmopa pattia mon ono oclonale, le,

si

produrrà

una

modif ific ica a

dell' ll'arco

di

precipitazione sulla banda delle IgA o delle IgG o delle IgM, che permette di riconoscere a quale immunoglobuline immunoglobu line appartiene la proteina M.

classe

di

 

Immunoistochimica Immunoistochimic a (IHC)   Tecnica

usata per mostrare la presenza di antigeni (per lo più proteine) nella loro

esat esatta ta locali localizz zzaz azion ione e in sezi sezioni oni istolo istologi gich che e di tessu tessuti ti,, pr prese eserva rvand ndon one e strut struttu tura ra ed integrità, usando una specifica reazione antigene-anticorpo, ed in cui  l’anticorpo è

marcato da molte e differenti specie chimiche  (essenzialmente enzimi, come HRP o , capac

ca a zzare una reaz one c m ca o a uoro or

   L’immunois isttochim himica

pre reve ved de

la

combin ina azio ion ne

;

dell dell’’immunolo log gia

e

delllla a

micros mic rosco copi pia, a, in quan quanto to il comp comples lesso so anti antige genene-an antic ticorp orpo o deve deve es esse sere re visib visibile ile al microscopio;   Usati

anticorpi policlonali e monoclonali.

 

IMMUNOISTOCHIMICA

IHC di ti IHC tiro rosi sinn-idr idrol olas asii (TH) TH) in verde, negli assoni dei neuroni

Colorazione IHC di una sezione di rene con il marcatore CD10

 

IMMUNOISTOCHIMICA

 

IMMUNOISTOCHIMICA

USO di IHC    Antigeni   Markers    Ti

tissutali o di superficie cellulare per la diagnosi di patologie autoimmuni

tumorali

izzazione izzazione tumorale tumorale

  Marcatori

di differenziamento

   Marcatori

agenti infettivi infettivi (virus, batteri)

 

Immunofluorescenza Immunofluoresce nza (IF)

 

Gli Ab sono marcati con molecole fluorescenti

 

IMMUNOFLUORESCENZA



  Le molecole fluorescenti fluorescenti assorbono assorbono luce a una determinata determinata lunghezz lunghezza a d’onda (eccitazione) (ecc itazione) e la emettono ad un’altra lunghezza d’onda (emissione);



  Se gl glii Ab sono sono marc marcat atii co con n i fluor fluorocr ocrom omi, i, poss possono ono es esser sere e ril rilev evat atii attr attrave averso rso la valuttazio valu azion ne dell della a luc luce col olor orat ata a emess messa a in seg seguit ito o allll’e ’ecc ccit itaz azio ion ne a una una e erm na a un ung ezza on a;



  La luce emessa può essere rivelata con un microscopio a fluorescenza; fluorescenza;



  I co colo lora rant ntii po poss sson ono o esse essere re co coni niug ugat atii alla alla re regi gion one e Fc di una una mole moleco cola la se senz nza a modificarne la specificità;



  Coloranti: fluoresceina, rodamina, ficoeritrina ecc.

 

Citofluorimetria (CFM)

  E’

una tecnica che permette la misurazione e la caratterizzazione di cellule sospese

in un mezzo fluido;    Rende

possibile la misurazione di proprietà multiple di singole cellule cellule ad una velocità

molto rapida, permettendo una dettagliata analisi qualitativa qual itativa e quantitativa;    Si

basa sull’impiego di Ab monoclonali fluorescenti;

   Consente

l’analisi (e  sorting) delle diverse popolazioni di cellule del sangue, che

esprimono esprim ono sulla propria superficie superficie markers specifici che le discriminano le une dalle altre.

 

CITOFLUORIMETRIA APPLICAZIONI    Permette

di analizzare un un elevato numero di cellule in breve ttempo empo (50.000 cellule in

pochi secondi), quantificando numerosi parametri per ogni singola cellula. cellul a.    Perm Permet ette te

ad es. es. di de dete term rmin inar are e il cont conten enut uto o di DN DNA, A, di RNA, RNA, i di dive vers rsii so sott ttot otip ipii

cellulari, gli organelli intracellulari, l’attività di alcuni enzimi.    Studio

della ploidia e della proliferazione cellulare;

   Analisi

del ciclo cellulare;

   Analisi

immunofenotipica immunofenotipica multiparametrica multiparametrica;;   Risposta del sistema immunitario alla somministrazione di vaccini (cellule antigene specifiche, produzione di citochine, ci tochine, ecc);    Livelli

di apoptos apoptosii in patologie asso associate ciate a deplezione cellulare (es AIDS) o accumulo cellulare

(tumori);   ecc.

ecc. !!!!!

 

CITOFLUORIMETRIA Principio di funzionamento del citometro a flusso (FACS, fluorescence-activated cell sorter) 1.

Le cellule, marcate, di una popolazione eterogenea vengono aspirate dalla provetta e immesse in una camera di flusso dove vengono separate le une dalla altre.

2.

Ogni Ogni sin singola gola cellu cellula la v viene iene poi attraversa attraversata ta d da a un fascio di luce che eccita i fluorocromi (anticorpi flu luor ores esce cent nti) i) e de dete term rmin ina a l’e l’emiss issio ione ne di un segnale fluorescente

3.

Il segnale segnale pass passando ando attra attraverso verso un ssistem istema a di ffiltri iltri e specchi raggiunge un rivelatore; viene quindi proces pro cessa sato to ele elettr ttroni onica came mente nte,, tras trasfor forma mato to da analog ana logico ico a digita digitale le e inv inviat iato o all all’an ’analiz alizzat zatore ore,, ch che e elab elabor ora a il da dato to e lo vis visua ualiz lizza za tr tram amite ite un grafico

4.

Att Attrave verrso pias iastre di defle lesssio ion ne le cellule lule analizzate possono essere raccolte sepa separa rata tame ment nte e tram tramite ite un proc proces esso so defi defini nito to

“sorting”.  

CITOFLUORIMETRIA LA CITOFLUORIMETRIA NELLA DIAGNOSTICA DELLE MALATTIE EMATOLOGICHE Campioni: 

  Sangue periferico



  Sangue midollare



  Liquido pleurico pleurico,, ascitico, pericardico



  Sospensione cellulare da tessuto

Marcatori: la nomenclatura CD Si considera membro di un Cluster of Differentiation un marcatore di superficie che:    identifica    ha  è

un part particolare icolare tipo cellulare o un certo stadio differenziativo differenziativo

una struttura biochim biochimica ica definita

riconosciuto da un gruppo di Ab m monoclonali onoclonali diversi

CD13 e CD33 → leucemia linfoblastica l infoblastica acuta CD34 → marker ‘staminale’ in AML (prognosi infausta, terapia più aggressiva)

CD34

marker staminale in AML (prognosi infausta, terapia più aggressiva)

 

CITOFLUORIMETRIA

 

CITOFLUORIMETRIA

 

Metodi radioimmunologici RIA: Radio-Immuno-Assay (1977 premio Nobel per la medicina a Rosalyn Yalow)

Met etod odo, o, per per la misu misura ra di pr prot otei eine ne,,   ormoni   ecc ecc.. in fl flui uidi di bi biol olog ogic ici, i, basa basato to su sulla lla

competizione, tra un ant antige igene non non marc marcat ato o ed una una quan quanttit ità à not nota dell dello o ste stesso sso antigene marcato, per il legame con un numero limitato e costante di siti anticorpali

Antigene non marcato, Ag Antigene marcato (125I), Ag*

Anticorpo, Ab

 

RIA 1)

(F)= antigene free (B)= antigene bounded concentrazione nota

concentrazione nota

g   + (F)

 

g (B)

All’equilibrio, dopo aver separato l’immunocomplesso marcato dall’antigene marcato libero, si procede alla misura della radioattività radioattiv ità (dosaggio dei raggi  γ)  delle due soluzioni:

radioattiv ità legata (B)   all' equilibrio radioattiv ità libera (F)

 

RIA 2) Costruzione retta di taratura: Supponiamo di aggiungere lo stesso tipo di antigene, ma  non marcato, in quantità di volta in volta NOTE

(standard necessari per la costruzione della retta)

C1

 

C2

C1 < C2 < C3

C3 Aume Au ment ntan ando do la co conc ncen entr traz azion ione e dell’ dell’an anti tige gene ne no non n marc marcat ato, o, fa favo vori risc sco o la CO COMP MPET ETIZI IZION ONE E co con n

l antigene marcato per i siti di legame sull anticorpo

 

RIA Sempre separando l’immunocomplesso dall’antigene libero, si misura la radioattività delle due soluzioni, monitorando lo l o spiazzamento dell’antigene marcato:

ogni volta che si aggiunge una quantità nota di

radioattiv ità legata (B) radioattiv ità libera (F)

antigene non marcato, TALE RAPPORTO CAMBIA (diminuisce all’aumentare della quantità di

antigene non marcato)

Si può costruire una retta di taratura, che riporta in grafico tale rapporto in funzione delle concentrazioni note di antigene non marcato usate libero

 

RIA

3) Adesso si può analizzare un sistema in cui l’antigene non marcato si trova in un fluido biologico   e ne bisogna determinare la concentrazione (si risale alla concentrazione incognita dell’antigene per semplice  interpolazione sulla retta di taratura ); ad essere

note   sono la concentrazione di  anticorpo,  in difetto  rispetto alla quantità necessaria per legare tutto l’antigene presente, e di antigene marcato

La tecnica del dosaggio radioimmunologico è comune in vari ambiti clinici: diagnosi del diabete (dosaggio insulina), dell’ipertensione, di patologie correlate a  disfunzioni

tiroidee  e dell'ormone della crescita, dosaggio nel sangue di  sostanze stupefacenti  o applicazioni forensi (antidoping ).

Anch An che: e: Vita Vitami mina na B-12, B-12, Vi Vita tami mina na D3, D3, Tireo Tireogl glob obul ulin ina, a, Te Test stos oste tero rone ne,, Re Renin nina, a, Os Oste teoc ocal alci cina na,, Glucagone, Fosfatasi prostatica, Calcitonina, Aldosterone urinario, Aldosterone Al dosterone

 

RIA

 

RIA Vantaggi del RIA:    Si

dosa qualsiasi composto, composto, disponibile, però, anche in forma marcata

   Elevata

sensibilità (pg/ml)

   Elevata

specificità



  Elevata precisione ,

Svantaggi del RIA:    Costo

elevato di apparecchiature apparecchiature e reagenti

   Durata

dei reagenti reagenti

   Peri Perico colili

radi radiol olog ogic icii

le leg gati

controllati 

Tempi di risposta lunghi

all’u ll’uso so del del

radi radioa oattti tivo vo::

oper operat ator orii

fr fre eque quentem ntemen entte

  Tempi

di risposta lunghi

 

Metodi Immunoenzima Immunoenzimatici tici ELISA: Enzyme-Lynked Immunosorbent Assay

  L'ELISA

è una tecnica molto utilizzata, basata sulla coniugazione chimica di enzimi

(quali ad es. la fosfatasi alcalina o la perossidasi) con anticorpi o antigeni. L’attività di questi enzimi imi è facilme lmente monitorabile e consente di quantificare la concentrazione di complesso coniugato (‘marcato’) con facilità e precisione. A seconda del particolare metodo utilizzato, l’ELISA può servire per il   dosaggio di

antigeni o anticorpi.   Antigene    Analita

riconosciuto dall’anticorpo specifico (Immuno)

 sorbent) (antigene (antigene o anticorpo) adsorbito sulla superficie del sistema ( sorbent

   Antig Antigen ene/ e/ant antic icorp orpo o

ricon riconosc osciut iuto o da un (s (sec econd ondo) o) an antic ticorp orpo o ma marc rcat ato o con con un

enzima (Enzyme linked), capace di dare una reazione il cui prodotto sia  colorato

 

ELISA

 

ELISA TIPI ELISA:    DIRETTO

(Anticorpo primario marcato)

   INDIRETTO

(Anticorpo secondario marcato) (Anticorpo

   COMPETITIVO

DIRETTO

   COMPETITIVO

INDIRETTO

   DAS-ELISA  (Double    DAS-ELISA

Antibody Sandwich) DIRETTO

(Double Antibody Sandwich) INDIRETTO

 

ELISA

 

ELISA   METODO

ELISA DIRETTO:  In questo metodo, che consente di titolare un antigene, è un

anticorpo primario che deve essere coniugato con un enzima indicatore.    Si

fa reagire una soluzione di un anticorpo spe specifico cifico marcato con un enzima enzima con un antigene

ancorato ad una fase solida    Dopo

aver lavato, si aggiunge il substrato dell'enzima. In questa tecnica, l'attività enzimatica .

 

ELISA   METODO

ELISA INDIRETTO:  serve per  titolare   titolare un anticorpo, anzi anzich ché é un anti antige gene ne.. E’

l’anticorpo secondario ad essere coniugato all’enzima. all ’enzima. 

  Il materiale materiale da dosare (ad es., un siero umano contenent contenente e IgG) viene fatto reagire con l’apposito l’apposito antigene legato ad una fase solida.



  Dopo Dopo reazione del siero con l’antigene l’antigene immobilizza immobilizzato, to, il materiale materiale che non si è legato legato viene rimosso mediante lavaggio.



  Si aggiunge aggiunge poi un anticorpo anticorpo anti-IgG anti-IgG (ad es., se il siero era umano, si può agg aggiunger iungere e un antic anticorpo orpo estratto da un animale di laboratorio immunizzato contro le porzioni costanti di IgG umane) coniugato misurata a sarà con con un enzi enzima ma.. Si la lav va di nu nuov ovo o e si aggi aggiun unge ge su subs bstr trat ato o de dellll’e ’enz nzim ima: a: l’attività l’attività   misurat direttamente proporzionale direttamente proporzionale alla  alla quantità di anticorpo di anticorpo specifico  specifico presente nel siero originale.

 

ELISA   METODO

ELISA COMPETITIVO DIRETTO: a) Uso coniugato Antigene-Enzima

   Una

qua quantit ntità à fissa fissa di antige antigene ne ma marca rcato to e diluizi diluizion onii de decre cresce scenti nti di ant antige igene ne libero libero (co (come me

standard o nel campione) vengono messe a reagire insieme nei confronti di un anticorpo in antigene marcato e quello libero libero si  si troveranno a competere a  competere per  per un difetto. In questo modo, l’ l’antigene numero limitato di siti di  siti anticorpali. anticorpali. Dopo aver lavato il complesso, si aggiunge il substrato per  ’

’

,

mediante chemiluminescenza. La concentrazione del prodotto enzimatico misurata risulterà inversamente proporzionale proporzionale alla  alla concentrazione dell’analita dell’analita (antigene  (antigene non marcato).

X noto

noto

 

ELISA   METODO

ELISA COMPETITIVO DIRETTO: b) Uso coniugato Anticorpo-Enzima

   Ques Questo to

tip tipo o di sa sagg ggio io co comp mpet etitiv itivo o coinv coinvolg olge e l’u l’uso so de dell con coniug iugato ato ant antico icorp rpo-e o-enz nzim ima, a, con

l’antigene immobilizzato sulla fase solida. La reazione di competizione avviene fra l’antigene immobilizzato e quello libero in soluzione (come standard o proveniente dal campione), nei confronti dell’anticorpo marcato presente in concentrazione fissa e in difetto. La misura del prodotto della reazione enzimatica sarà inversamente sarà  inversamente proporzionale  alla concentrazione di antigene presente  presente nel campione. antigene

noto

 

X

noto

 

ELISA   METODO

  La

ELISA COMPETITIVO INDIRETTO:

procedura implica l’uso di un  anticorpo secondario marcato, in grado di riconoscere la

regione costante dell’anticorpo primario, precedentemente precedentemente incubato i ncubato su fase sol solida. ida.   La

reazione di competizione avviene fra l’antigene immobilizzato e quello libero in soluzione

come co me st stan anda dard rd o prov proven enie ient nte e da dall ca camp mpio ione ne,, nei nei co conf nfro ront ntii de dell’ ll’an anti tico corp rpo o pres presen ente te in conc co ncen en ra razz on one e ss ssa. a.   La

misura del prodotto enzimatico sarà direttamente sarà  direttamente proporzionale nel proporzionale  nel caso della misura del

titolo dell’anticorpo dell’anticorpo da  da determinare, mentre i mentre inversamente nversamente proporzionale proporzionale per  per l’analita l’analita..

X

noto

X/noto

 

ELISA 

  METODO DAS-ELISA DIRETTO:   Questa metodica può essere utilizzata esclusivamente esclusivamente quando l’analita possiede almeno due epitopi. 

  Un eccesso di anticorpo verso il primo sito antigenico viene imm immobilizzato obilizzato sulla fase solida e incuba inc ubato to con dil diluiz uizion ionii su succe ccess ssive ive di ant antige igene ne prese presente nte nel cam campio pione ne (in (inco cogni gnito) to) o in soluzioni standard (per costruire la retta di taratura). Dopo il lavaggio, il complesso Ag-Ab immobilizzato immobilizza to viene incubato con una concentrazione fissa di anticorpo marcato che andrà a legarsi al secondo sito antigenico dell’immunocomplesso. La misura del prodotto della reazione enzimatica risulterà risulterà direttamente  direttamente proporzionale proporzionale alla  alla concentrazione dell’antigene dell’antigene (analita) da stimare.

noto

 

X

noto

 

ELISA 

  METODO DAS-ELISA INDIRETTO: INDIRETTO:   In questo metodo, metodo, è un anticorpo secondario secondario che deve essere coniugato con un enzima indicatore. 

  Si fa reagire una soluzione ignota di antigene con un ant anticorpo icorpo spec specifico ifico legato ad una fase solida, si lava e si aggiunge un secondo anticorpo (che dovrà essere policlonale oppure dovrà do vrà es esse sere re un an anti tico corp rpo o mono monocl clon onal ale e dive divers rso o da qu quel ello lo immo immobi biliz lizza zato to,, ca capa pace ce di riconoscere un diverso epitopo dell'antigene). dell 'antigene). ,



contenente l’enzima; dopo lavaggi opportuni, viene aggiunto il substrato dell'enzima. In  direttamente proporzionale alla questa tecnica, l'attività enzimatica misurata sarà sarà direttamente proporzionale  alla quantità di antigene di antigene presente.  presente.

 

ELISA

•   Gli enzimi  HR P, o la fosfatasi enzimi più comunement comunemente e usati sono la perossidasi perossidasi di rafa rafano, no, HRP

alcalina, AP. •   I subs substr trat atii enzi enzima mati tici ci dovre dovrebb bber ero o es esser sere e idealm idealmen ente te stab stabili ili,, non non toss tossic icii e poco poco

costosi: substrati non colorati sono convertiti in prodotti colorati (OPD,arancio e TMB, blu . •

  ELISA ELISA IN CHIMICA CHIMICA CLINI CLINICA: CA:  ricerca di proteine nel plasma, a concentrazioni così basse da non poter essere rilevate ad es. con metodi nefelometrici (basati sulla torbidità) (proteina C, proteina S, ecc.); dosaggio del ferro nel siero; ricerca di anticorpi

(anti-HIV IV));

ricerca

di

ormoni

come

l’insulilin na ,

di

estrogeni,

gonadotropina corionica umana, di antigeni di superficie delle epatiti, ecc ecc.

di

 

ELISA MOVIMENTO PER CAPILLARITÀ

hCG, Antigene α-hCG, anticorpo primario libero

Enzima

α-hCG, anticorpo primario immobilizzato

Substrato dell’enzima Enzima

α-IgG, anticorpo secondario immobilizzato

Substrato dell’enzima

Enzima  

WESTERN BLOTTING 

  Questa Questa tecnic tecnica a combin combina a la risoluz risoluzione ione dell’e dell’elet lettrof trofores oresii con la sensib sensibilit ilità à della della rivelazione immunochimica.



  Permet Permette te di rivelare rivelare e quanti quantific ficare are proteine proteine che reag reagisco iscono no con un anticor anticorpo po specifico.



  Le prot protei eine ne,, dopo dopo esse esserr stat state e fr fraz azio iona nate te in SDSSDS-PA PAGE GE,, veng vengon ono o tras trasfe feri rite te su membrana (nitrocellulosa, PVDF), grazie ad un campo elettrico trasversale che le forza a migrare dal gel sulla membrana membrana a cui aderiscono. aderiscono. Dopo il trasferiment trasferimento, o, si proc proced ede e in mani manier era a id iden enti tica ca a que quella lla de delllle e te tecn cnic iche he EL ELIS ISA A o RI RIA A (la lava vagg ggio io,, saturazione dei siti, incubazione con anticorpo primario, incubazione anticorpo secondario, rivelazione).

 

WESTERN BLOTTING

 

WESTERN BLOTTING

 

WESTERN BLOTTING

 

WESTERN BLOTTING

Luminol

 

WESTERN BLOTTING

 

Luminescenza Chemiluminescenza Diverse reazioni biologiche (che si avvalgono di   ossidasi) ossidasi) comportano la produzione di acqua LUMINOL, in condizioni alcaline ossigenata (H2O2); quest’ultima, reagendo con composti come ilil   LUMINOL, ed in presenza di catalizzatori a base di ferro, dà luogo alla emissione di fotoni :

anche catalizzata da

Sostanze come il luminol possono essere usate nella sintesi di coniugati da usare poi   come