Lezione 2 Il Sistema AB0

Il sistema eritrocitario AB0

Il sistema eritrocitario AB0 • Biochimica • Genetica • Espressione • Gruppi principali e loro varianti: nomenclatura • Anticorpi diretti verso gli antigeni AB0

• Metodiche • Significato clinico

• Biochimica

La storia: Karl Landsteiner • 1901: Mescolando sangue e siero di pazienti diverso identificò i gruppi AB0.

http://www.nobelpreis.org/castellano/medizin/images/landsteiner.jpg

Daniels 2002

- gli antigeni ABH e Lewis sono composti da carboidrati - l’espressione e la distinzione degli antigeni H, A, B e Lewis dipende dalla natura del monosaccaride terminale immunodominante - La presenza di uno specifico zucchero è determinata dall’azione di uno specifico enzima (transferasi) codificato a livello genico - le catene di oligosaccaridi possono legarsi a polipeptidi per formare glicoproteine, a ceramidi per formare glicosfingolipidi e a lipidi per formare glicolipidi

- i complessi oligosaccaridici sono parte integrante della membrana eritrocitaria, delle cellule epiteliali ed endoteliali e possono essere riscontrati in vari tipi di secrezioni umane

La molecola di base su cui vengono “costruiti” gli antigeni A, B e H è detta “Precursore” Precursore = catena oligosaccaridica legata sia a glicosfingolipidi (GR) o a glicoproteine (secrezioni).

Globulo Rosso

Glucosio

Sostanza Precursore

Galattosio N-acetilglucosammina Galattosio

Mediante l’aggiunta di uno zucchero alla sostanza precursore viene ottenuto l’antigene H. Questa è la base su cui si costruiscono gli antigeni A e B. I geni A e B codificano per enzimi che aggiungono uno zucchero immunodominante all’antigene H.

Formazione dell’antigene H Il gene H codifica per un enzima che aggiunge uno zucchero (Fucosio) allo zucchero terminale della sostanza precursore. La struttura biochimica costituisce l’ Antigene H. (l’allele h è amorfo.)

Globulo Rosso

Glucosio

Antigene H

Galattosio

N-acetilglucosammina Galattosio Fucosio

Formazione dell’antigene A Globulo

Il gene A codifica per un enzima che aggiunge GalNAc (N-Acetil-D galattosammina) allo zucchero terminale dell’ Antigene H

Rosso

Glucosio Galattosio N-acetilglucosammina Galattosio

Fucosio

N-acetylgalattosammina

Formazione dell’antigene B Globulo Rosso

Il gene B codifica per un enzima che aggiunge D-Galattoso allo zucchero terminale dell’ Antigene H.

Glucosio Galattosio N-acetiglucosammina Galattosio

Fucosio

Galattosio

L’ antigene H si trova solo sui GR in presenza del genotipo HH e Hh ma NON nel genotipo hh (rarissimo).

L’ antigene A si trova nei GR in presenza dei genotipi Hh, HH, e A/A, A/0 o A/B.

L’ antigene B si trova nei GR in presenza dei genotipi Hh, HH, e B/B, B/0 o A/B.

Tratto da: F. Morelati. Il sistema eritrocitario AB0. OCD news 2006

Tratto da: AABB Technical Manual. 15th Edition 2005

• Genetica

Localizzazione cromosomica dei gruppi sanguigni

Tratto da: AABB Technical Manual. 15th Edition 2005

Genetica degli antigeni ABO 1. H gene – H e h alleli (h è amorfo). Si trova sul cromosoma 19. 2. AB0 geni – alleli A, B e 0. Si trovano sul cromosoma 9. 1. Se gene – Se e se alleli (se è amorfo); l’allele Se è presente nell’80 % della popolazione. Si trova sul cromosoma 19.

Stato di secretore • Il gene Se codifica per la presenza dell’antigene H nelle secrezioni biologiche, quindi la eventuale presenza dell’antigene A e/o B nelle secrezioni oltre alla presenza dei rispettivi geni (A e B), dipende dalla presenza del gene Se e dell’antigene H antigene A Gene Se (SeSe o Sese)

Gene se (sese)

Antigene H nelle secrezioni

e/o

antigene B

Nessun antigene A, B o H presente nelle secrezioni

Tratto da: F. Morelati. Il sistema eritrocitario AB0. OCD news 2006

Tratto da: F. Morelati. Il sistema eritrocitario AB0. OCD news 2006

Genotipo

Fenotipo

00

0

A0 AA B0 BB AB

A B AB

Generazione parentale: omozigoti 1° Generazione: eterozigoti

Accoppiamento con eterozigoti A0 / B0

2° Generazione: eterozigoti

Tratto da: AABB Technical Manual. 15th Edition 2005

Esempio 1

P1:

F1:

Padre fenotipo A

Madre Fenotipo A

Figlio 1 fenotipo 0

Genotipi?

Figlio 2 Fenotipo A

Esempio 1

P1:

F1:

Padre fenotipo A

Madre fenotipo A

genotipo A0

genotipo A0

Figlio 1 fenotipo 0

Figlio 2 fenotipo A

genotipo 00

genotipo AA o A0

Genotipi?

Esempio 2

P1:

F1:

Padre fenotipo AB

Madre fenotipo A

Figlio 1 fenotipo 0

Genotipi?

Figlio 2 fenotipo A

• Espressione

La grande maggioranza (ma non tutti) degli antigeni H nel gruppo A e B vengono trasformati in antigeni A o B A

A

A

A Gruppo O

Molti Antigeni H

Maggiori quantità di H

Gruppo A

Pochi Antigeni H

O > A2 > B > A2B > A1 > A1B

A

Minori quantità di H

Fenotipo Bombay (Oh) • Dipende da un genotipo hh – I globuli rossi sono privi di antigeni H e quindi anche degli antigeni A e B… c’è solo la sostanza precursore – Descritto per la prima volta a Bombay, India – I GR NON sono agglutinati da anti-A, Anti-B o Anti-H (Ulex europaeus - lectina) – Il Siero ha attività anti-A, anti-B e anti-H; agglutina quindi tutti i gruppi ABO.

• Che gruppo ABO usereste per trasfondere questi pazienti ?

Antigeni A e B :Una funzione ? • Sconosciuta ! • Soggetti AB più resistenti al colera • Lo stato di secretore conferisce ulteriore protezione • Soggetti 0 più resistenti alla malaria • Forse rimasti per pressione selettiva positiva

Espressione antigeni AB0 • Membrana eritrocitaria • Tessuti – endotelio vasi sanguigni – epitelio degli organi di secrezione ed escrezione

• Secrezioni (quando presente Se) – saliva – succhi gastrici – liquido seminale – fluidi di cisti ovariche – Latte – Urine

• Gruppi principali e loro varianti

Tratto da: F. Morelati. Il sistema eritrocitario AB0. OCD news 2006

Sottogruppi ABO • I sottogruppi ABO differiscono nella quantità di antigene presente sulla membrana dei GR: hanno meno antigene • Sono il risultato della presenza di trasferasi meno efficienti nell’aggiungere gli zuccheri

immunodominanti alla sostanza H • I sottogruppi di A sono più frequenti di quelli di B

Sottogruppi di A: A1 e A2 • I due principali sottogruppi di A sono: A1 e A2 – Entrambi reagiscono “fortemente” con anti-A – Per distinguere A1 da A2 si può utilizzare la lectina Dolichos biflorus (anti-A1) – La Lectina anti-H reagisce fortemente con le emazie A2 (meno antigeni A sul GR) – 80% degli individui di gruppo A o AB sono di suttogruppo A1, 20% are A2 and A2B – Circa 1/10 dei soggetti A2 hanno anticorpi anti A1 che generano una discrepanza nella prova indiretta con A1 – Risoluzione: La prova indiretta con emazie A2 è negativa, la reazione con la lectina anti- A1 è negativa.

N. siti antigenici sulla superficie degli eritrociti

Gruppo A1

Gruppo A1B

8 - 12 x 105

5-9x

105

Gruppo A2

1 - 4 x 105

Gruppo A2B

1 x 105

Gestione trasfusionale dei soggetti A2 • Gli anticorpi anti A1 prodotti da un soggetto A2 sono nella stragrande maggioranza dei casi NON clinicamente significativi (anticorpi freddi) • Ad un soggetto A2 si possono quindi trasfondere emazie A1

Altri sottogruppi A • Vi sono altri sottogruppi anche se molto più rari: – Aint (intermediate), A3, Ax, Am, Aend, Ael, Abantu

• Le emazie A3 danno una reazione a campi misti quando cimentati con anti-A policlonali, possono contenere anti-A1 • I gruppi Ax, Am, Ael danno una reazione diretta perfettamente negativa, la presenza dell’antigene è sospettata dalla completa assenza di reazione sierica con le emazie A. – Non è noto come queste emazie vengano tollerate in caso di trasfusione a soggetto 0.

Sottogruppi B • I sottogruppi B sono ancora più rari degli A • Si differenziano per il tipo di reazione con i rispettivi sieri anti-B, anti-A,B, antiH • Quelli noti sono: B3, Bx, Bm, and Bel

Tratto da: AABB Technical Manual. 15th Edition 2005

Tratto da: F. Morelati. Il sistema eritrocitario AB0. OCD news 2006

Qualche problema con la nomenclatura…

AB0 e Lewis: uno stretto legame • Sistema Lewsi: Ag Lea e Leb • Risultano dalla azione di una glicosiltrasferasi codificata da un allele Le che aggiunge uno zucchero ad una catena precursore • Lea è prodotto quando Le è ereditato con alleli sese (soggetti non secretori) • Leb quando Le è ereditato con almeno un allele Se (secretori) • Se si eredita l’allele amorfo le, non si produrrà alcun antigene Lewis Le(a-b-) • Lea e Leb non sono antigeni antitetici ma risultano dalla interazione di alleli ereditati indipendentemente • Gli antigeni Lewis non sono intrinseci alla membrana dei globuli rossi ma sono espressisu glicosfingolipidi adsorbiti dal plasma sulla membrana

Tratto da: AABB Technical Manual. 15th Edition 2005

• Anticorpi diretti verso gli antigeni AB0

Gli Anticorpi “Regolari”: la regola di Landsteiner • Soggetti normali e sani possiedono NATURALMENTE gli anticorpi anti-A o anti-B diretti contro gli antigeni A o B che è assente sui loro Globuli Rossi

• In altre parole NON richiedono una esposizione (trasfusione o gravidanza) ad emazie estranee • NON sono presenti alla nascità, e perciò si pensa siano stimolati da antigeni ambientali (probabilmente batterici) a cui siamo tutti esposti

Anticorpi anti-A / anti-B • Le IgM sono predominanti negli individui di Gruppo A e di gruppo B – Anti-A – Anti-B

• IgG (con una minoranza di IgM) è l’anticorpo predominante negli individui di gruppo 0 – Anti-A,B ( con alcuni anti-A e anti-B)

• Reagiscono a Temperatura Ambiente • Attivano facilmente il complemento ( sopratutto le IgM) • Sono ad alto titolo (grado di reazione 4+)

Anticorpi AB0: evoluzione con l’età • Di solito compaiono dopo 3-6 mesi di vita – Ma i neonati possono acquisire passivamente le IgG materne: NON SI DEVE FARE la PROVA INDIRETTA (sierica) nel sangue dei neonati • Titolo stabile a 5-6 anni • Declinano nell’anziano

Anti-A1 • Individui di gruppo O e B presentano anti-A nel loro siero • Tuttavia gli anti-A possono essere divisi in due categorie distinte: anti-A e anti-A1 • Infatti l’antigene A è presente in due forme A1 e A2 • Anti-A1 agglutina solo l’antigene A1 non l’ A2 • L’anti-A agglutina entrambi; non esiste un anti-A2. • Una piccola parte dei soggetti A2 può sviluppare anti-A1 • In questo caso si è di fronte ad una “discrepanza” alla tipizzazione • Gli Anti-A1 sviluppati dagli A2 non danno pressochè mai luogo a conseguenze cliniche in caso di trasfusione con sangue A

Anti-A,B • Presenti nel siero dei soggetti di gruppo 0 • Reagisce con emazie A, B, ed AB • Sono prevalentemente IgG (con una piccola quota di IgM) • Anti-A,B è un singolo anticorpo, non una miscela di anti-A and anti-B

• Metodiche

Tipizzazione AB0 La determinazione del gruppo AB0 deve necessariamente includere: •una prova diretta sugli eritrociti con utilizzo di antisieri specifici con anticorpi monoclonali anti-A, anti-B , antiA,B •un indagine indiretta sul siero/plasma dello stesso soggetto utilizzando emazie di gruppo noto (A1, A2 e B) Ciascuna delle due indagini rappresenta il controllo dell’altro. Basta un campione anticoagulato con EDTA

Tipizzazione AB0 risultati attesi Rezione delle emazie da tipizzare con:

anti-A anti-B

Reazione del siero del sangue da tipizzare con: Emazie

Emazie

B

gruppo AB0

%

%

A1 e A2

Caucasici

Africani.

1

0

0

+

+

0

45

49

2

+

0

0

+

A

40

27

3

0

+

+

0

B

11

20

4

+

+

0

0

AB

4

4

Anti-B Anti-A Anti A,B

GR-A1 GR-A2 GR-B

Discrepanze AB0: Una discrepanza si ha quando la prova diretta (globulare) non è confermata da una prova indiretta (sierica) Paziente

Anti-A

Anti-B

GR A1

GR B

1

4+

1+

0

4+

2

0

4+

1+

0

3

4+

4+

1+

0

4

0

3+

0

0

Discrepanze AB0: dovute a 2 situazioni: • Problemi con i Globuli Rossi – Antigeni con debole/assente reattività – Extra antigeni – Reazioni a campo misto – Trasfusioni recenti con GR non-omogruppo

• Problemi con il Siero – Anticorpi con debole/assente reattività – Extra anticorpi

Che fare? • Identificare la causa • Escludere innanzitutto un problema tecnico – Provetta sbagliata/ mal etichettata – Reagente non dispensato

• Primi passi: ripetere il test sullo stesso camione ; richiedere un ulteriore campione; lavare le emazie • In alcuni casi ci sono delle vere discrepanze legate a fattori globulari (GR) o sierici

Cosa fare con una discrepanza irrisolta e/o in emergenza? • Escludere un fenotipo Bombay • Escludere la presenza di un alloanticorpo freddo potenzialmente significativo (cross match negativo) • In urgenza trasfondere gruppo 0

Saprò farlo funzionare?

Determinazione Gruppo

Possibili cause delle discrepanze di gruppo ABO Diretto

Indiretto (sierico)

(cellulare) Ag Mancanti / Deboli

Extra Ag

Campo misto

Mancanti Deboli

Extra

Sottogruppi A/B

B Acquisito (A1 malattia intestinale)

Trasfusione di gruppo 0

Malattia

Fenotipo B(A)

Trapianto di midollo

Alloanticorpi Freddi

Rouleaux (impilamento)

Fenotipo A3

Rouleaux (impilamento)

(leucemia)

Autoanticorpi Freddi Gelatina Wharton (cordone) Esposizione antigene T (sepsi)

Neonati / anzianii / immunocomp romessi

Possono causare tutte reazioni positive (panagglutinazione)

Anti-A1

Autoanticorpi Freddi

Discrepanze nella tipizzazione ABO diretta: risoluzione problemi FALSI NEGATIVI

FALSI POSITIVI

Aggiunti i reattivi ??

Eccessiva centrifugazione

L’emolisi è una reazione Reagenti/campioni positiva !! (Ac freddi anti A-B- contaminati da batteri H-Lea) Errato rapporto antisiero/cellule Insufficiente centrifugazione

Incubazione a T > 20-24 °C

Sbagliata interpretazione o registrazione

Discrepanze nella prova indiretta ABO: risoluzione problemi • Coaguli di fibrina • Conc. Anomala di proteine, HMW plasma expanders: formano rouleaux visibili al microscopio; diluire il siero con salina • Agglutinine a freddo nell’antisiero: reazioni più deboli; preriscaldare l’antisiero • Immunodeficit (età, patologia, terapia): verificare la diagnosi o l’età

Biologia molecolare e immunoematologia • Nel 1986 è stato clonato il gene del sistema MN (gene GYPA) • Le basi molecolari di 28 su 29 sistemi di gruppo sanguigno sono state definite • Partendo da tests su DNA genomico, è possibile predire con un buon grado di accuratezza i fenotipi dei principali gruppi sanguigni

Genotipo=AelB1 Fenotipo=AelB

• Significato clinico

Perché il sistema AB0 è importante?

• In assenza dell’antigene, sono attesi gli anticorpi corrispondenti • Gli anticorpi sono spesso presenti ad elevato titolo ed avidità, anche se il soggetto non è stato stimolato immunologicamente • Gli anticorpi sono reattivi a basse temperature ma a differenza di molti altri anticorpi freddi sono in grado di legarsi al corrispondente Ag anche a 37°C • Gli antigeni A e B sono presenti in grandi quantità sui globuli rossi • Sia che siano IgG o IgM , gli anticorpi ABO attivano con efficienza il complemento – Questo significa che la trasfusione di emazie AB0

Schema di compatibilità ABO per la trasfusione di emazie “concentrate”

Schema di compatibilità ABO per la trasfusione di plasma

E le piastrine? • Trasfondere preferenzialmente omogruppo • Le piastrine esprimono gli Antigeni A e B e questo può associarsi ad una ridotta sopravvivenza in caso di trasfusione “incompatibile” • I concentrati piastrinici sono un prodotto con una quantità variabile di plasma (molto in caso di aferesi poco in caso di assemblati da buffy risospesi in soluzione conservant) • il rischio di emolisi da incompatibilità da plasma 0 pericoloso non va sottovalutato

Gli Zero Pericolosi…… • Alcuni rari soggetti di gruppo 0 presentano degli anticorpi (in genere anti-A) ad alte concentrazioni • La trasfusione anche di pochi millilitri di sangue di questi soggetto sono capaci di causare una emolisi massiva delle emazie del ricevente • Questo rischio non è “negligible” in caso di trasfusione di piastrine sospese in plasma O • Per questo per un utilizzo universale è consigliabile“screenare” la presenza ed il titolo delle emolisine in donatori 0 di piastrine in aferesi: le piastrine di donatori con presenza di anticorpi antiA o B ad alto titolo e/o con spiccata azione emolitica sono riservate a pazienti di gruppo 0

Sistema AB0 e trapianti • Anticorpi del sistema AB0 possono: – essere causa di rigetto di organi solidi (rene, cuore, fegato) – influenzare negativamente l’attecchimento del midollo osseo trapiantato

Conclusioni • Il sistema AB0 è una base fondamentale della immunoematologia e della medicina trasfusionale • Ha una rilevanza anche nel trapianto di organi solidi • “In immunoematologia poche regole e molte eccezioni…a cominciare dall’ABO” • Fortunatamente l’utilizzo di antisieri monoclonali e di metodi automatizzati e standardizzati hanno ridotto discrepanze AB0 dovute a fattori interferenti ed alla aspecificità dei sieri policlonali umani usati in passato

Per saperne di più - Fernanda Morelati. Il sistema eritrocitario AB0. OCD news n. 22 2006 - M. Murphy, D. Pamphilon eds. Practical Transfusion Medicine. Blackwell 2001. - G. L. Daniels. Human Blood Groups. Blackwell 2002. - AABB Technical Manual. 15th edition 2005. - Massimo La Raja. http://immunoematologia.blogspot.com/2009/03/proce sso-trasfusionale-prova.html