LAPRES H P L C

HPLC (HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY) 1. Tujuan − Mempelajari cara kerja alat HPLC − Menganalisa sampel secara kualitatif dan kuantitatif dengan alat HPLC 2.Dasar Teori Kromatografi (Chromatography) adalah pemisahan komponen-komponen campuran berdasarkan daya adsorpsi antara fase diam dengan fase gerak. . Kolom yang digunakan memiliki spesifikasi sebagai berikut. − Diameter kolom antara 1 hingga 5 cm. − Panjang kolom antara 50 hingga 500 cm. − Laju alir cairan sekitar 0,1 ml permenit. − Ukuran butiran padatan pengisi (packing) antara 150-200 mikro.

Gambar 1. Sistem kerja HPLC Melalui kolom tersebut, campuran yang dipisahkan mengalami elusi (elution) yaitu proses pelarutan dan pemisahan zat terlarut (sampel) dengan penambahan pelarut segar (fresh solvent). Dengan terjadinya hal tersebut, maka komponen penyusun campuran akan terpisah satu persatu tergantung gaya interaksinya dengan pelarut segar dan permukaan butiran padatan pengisi. Komponen yang mudah larut dalam pelarut segar dan memiliki kepolaran yang sangat berbeda dengan permukaan butiran padatan pengisi akan terpisah terlebih dahulu. Sebaliknya, komponen yang sukar larut dalam pelarut segar dan memiliki kepolaran yang sama dengan permukaan butiran padatan pengisi akan terpisah paling akhir. Pada dasarnya, sebuah alat HPLC terdiri atas : _ Botol Penampung Botol penampung biasanya berjumlah empat buah. Masing-masing berisi pelarut murni sebagai cairan pembawa (fasa gerak). Dari masing-masing botol, cairan mengalir ke suatu penampung sebelum membawa analit yang telah disuntikkan ke dalam kolom. Penampung tersebut berfungsi sebagai wadah pencampuran jika memang diperlukan. _ Pompa Pompa yang sering digunakan pada HPLC harus memenuhi kriteria sebagai berikut : − Tekanan dapat mencapai 400 bar. − Laju alir yang dihasilkan konstan dan tidak berfluktuasi. − Dapat menghasilkan laju alir hingga 10 ml/menit. − Dapat mereproduksi laju alir secara tepat. − Tidak bersifat korosif. _ Katup Katup berfungsi untu mengatur komposisi pelarut yang diperlukan. Selain itu juga berfungsi untuk mengatur laju alir pelarut. _ Kolom Kolom HPLC pada umumnya terbuat dari pipa baja tahan karat dengan permukaan dalam sangat halus dan berdinding tebal. Kolom yang sering digunakan biasanya berdiameter dalam 4,6 mm dan panjang 25 cm. Kolom ini diisi packing berukuran 5 mikron dan memiliki 50.000

plates/meter. Akhir-akhir ini, terdapat kolom jenis baru yang dikenal dengan kolom mikro. Kolom ini berdiameter dalam sekitar 1 mm dengan panjang 3 hingga 7,5 mm. Meskipun ukuran kolom relatif kecil, akan tetapi dengan packing berukuran 3 mikron maka kolom mikro memiliki 100.000 plates/meter. _ Gerbang suntik − Gerbang suntik pada HPLC didisain sedemikian rupa sehingga mampu membatasi jumlah analit yang masuk kolom pada volum tertentu misalnya 20 mikroliter Selain itu, gerbang suntik dirancang dengan dua jalur yang dapat diubah-ubah arahnya dengan memutar tuas. Kedua jalur tesebut adalah Jalur penyuntikkan dan Jalur memasukkan analit ke kolom _ Detektor Detektor merupakan alat yang dapat mengidentifikasi senyawa yang keluar dari kolom. _ Data Prosesor Alat ini berfungsi untuk mengubah sinyal dari detektor menjadi data berupa angka-angka yang diperlukan misalnya data tentang waktu retensi (Rt), luas kurva, persentase luas kurva dan sebagainya. _ Fase Gerak (Mobile Fase) Fase gerak yang berfugsi untuk membawa analit melalui kolom dan mencapai detektor . _Interaksi Fase Gerak dengan Fase Diam Analisis kromatografi dengan HPLC amat tergantung pada interaksi pelarut dengan dua unsur lainnya yaitu fase diam dan analit. Gaya interaksi ketiga hal tersebut dapat dijelaskan melalui Teori Polaritas Relatif. Urutan polaritas setiap gugus fungsional mulai dari yang paling tinggi hingga paling rendah adalah Hidrokarbon, Eter, Ester, Keton, Aldehida, Amida, Amina, Alkohol _Polaritas air lebih tinggi dari semua gugus fungsional tersebut. Sebagai acuan, analisis kromatografi akan berhasil jika polaritas analit hampir sama dengan polaritas fase diam tetapi sangat berbeda dengan polaritas fase gerak.Hal itu lebih baik jika dibandingkan dengan polaritas analit yang hampir sama dengan polaritas fase gerak namun amat berbeda dengan polaritas fase diam karena hal ini menyebabkan waktu retensi (Rt) sangat pendek. Apabila polaritas analit dan fase diam terlalu mirip dan berlawanan sekali dengan fase geraknya, maka Rt akan sangat panjang. Berdasarkan polaritas fase diam dan fase gerak yang digunakan, HPLC digolongkan menjadi dua, yaitu :Kromatografi Normal dan Kromatografi Fase Terbalik Kromatografi Normal. Pada metode ini, fase diam yang digunakan bersifat sangat polar, misalnya silika, alumina dan trietilin glikol. Sebaliknya, pelarut yang digunakan bersifat nonpolar misalnya heksana dan propil eter. Akan tetapi, dengan mempertimbangkan jenis pelarut non-polar yang amat sedikit dibanding yang polar, maka saat ini metode di atas dibalik dengan cara menggunakan fase diam yang non-polar seperti lapisan heksana sedangkan fase geraknya menggunakan pelarut polar misalnya air, alkohol, hidokarbon, eter dan sebagainya. Metode ini lazim disebut Kromatografi Fase Terbalik (Reversed Fased Chromatography) 3. Alat − HPLC - UV-VIS Detektor − Personal Komputer - Printer − Alat suntik 4. Bahan − Methanol -Quercetin

– Rutin -Air

5. Skema Kerja A. Persiapan Botol penampung A

Pelarut campuran A

Botol penampung B

Pelarut campuran B

tekan ke bawah tombol on/off Hidupkan alat

Tekan tombol on/off Panjang gelombang :254 nm RANGE(AUFS) : 0,0005 RISE TIME : 0,1 detik

Hidupkan detector

Pilih menu Chromatography, click HPLC , click OK, ketik “lab” pada User Name, ketik “1” pada password, lalu click OK, click HPLC.

Hidupkan Komputer

B. Analisis Purging

Buka tutup depan HPLC putar ke kiri kran purging tekan tombol “PURGE” “D”. gelembung dan fasa pembawa lain keluar

Tekan “PUMP/STOP”. Tutup kran purging.

gelembung dan fasa pembawa lain keluar

A : Methanol : Air (15 :

85) B : Methanol : Air (85 : 95) sebagai fasa pembawa (gerak).

tekan “FLOW” “A” “100” “ENTER”. Tekan kembali “FLOW” “1” “ENTER” Mengatur laju alir fasa pembawa 3 ml/menit Suntikkan min 20 mikro pada tuas INJECT

Sampel rutin

Atur menu

gerakkan tuas dari INJECT ke LOAD tekan PUMP dan ENTER (pada PC) secara serentak Sinyal tergambar di monitor

Suntik sampel quercetin dan campuran

analisis jenis dan kadar sampel