Lapres Dna

I.

JUDUL PERCOBAAN

: Isolasi DNA Epithelial Mulut

II.

TANGGAL PERCOBAAN

: Kamis, 2 November 2017 ; pukul 09.30 WIB

III. SELESAI PERCOBAAN

: Kamis, 2 November 2017 ; pukul 13.00 WIB

IV. TUJUAN

:

Mampu mengerjakan isolasi DNA sesuai prosedur, dengan sampel DNA diambil dari sel ephitelial mulut V.

DASAR TEORI

:

DNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk hidup, yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Molekul DNA terdapat pada nukleus, mitokondria, plastida dan sentriol. Molekul DNA pada nucleus memiliki bentuk sebagai benang lurus dan tidak bercabang, sedangkan DNA yang terletak pada mitokondria dan plastida berbentuk lingkaran (Suryo, 2012 : 59). DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. DNA terdiri dari tiga macam molekul, yaitu yaitu gula deoksiribosa, gugus gugus fosfat dan basa basa nitrogen.

Gula pentosa

memiliki 5 atom C, dan pada DNA atom C nomor 2 berikatan dengan atom H. Gugus fosfat pada DNA berikatan dengan atom C nomor 5 melalui ikatan fosfoester. Gugus fosfat tersebut yang yang menyebabkan menyebabkan asam nukleat bermuatan negatif. Basa nitrogen yang menyusun asam nukleat ada dua macam, yaitu basa purin yang terdiri dari adenin dan guanin dan basa pirimidin yang terdiri dari timin dan sitosin. Ikatan tersebut menghasilkan menghasilkan molekul yang disebut nukleosida. Nukleosida akan bergabung dengan fosfat dan membentuk molekul yang disebut nukleotida. Nukleotida adalah Satu komponen pembangun DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu gugus fosfat dan satu pasang basa (Asris, 2010). Untai ganda DNA tersusun oleh dua rantai polinukleotida yang terpilin. Kedua rantai tersebut berikatan dengan adanya ikatan hidrogen antara basa adenin dengan timin sebanyak dua ikatan dan antara guanin dan sitosin sebanyak tiga ikatan. Spesifisitas pasangan basa tersebut disebut sebagai komplementaritas Replikasi merupakan proses pelipatgandaan DNA. Proses replikasi ini diperlukan ketika sel akan membelah diri. Pada setiap sel, kecuali sel gamet, pembelahan diri harus disertai dengan replikasi DNA supaya semua sel turunan memiliki informasi genetik yang sama. Pada dasarnya, proses replikasi memanfaatkan fakta bahwa DNA terdiri dari

dua rantai dan rantai yang satu merupakan konjugat dari rantai pasangannya. Dengan kata lain, dengan mengetahui susunan satu rantai, maka susunan rantai pasangan dapat dengan mudah dibentuk. Salah satu teori yang paling populer menyatakan  bahwa pada masing-masing DNA baru yang diperoleh pada akhir proses replikasi, satu rantai tunggal merupakan rantai DNA dari rantai DNA sebelumnya, sedangkan rantai pasangannya merupakan rantai yang baru disintesis. Rantai tunggal yang diperoleh dari DNA sebelumnya tersebut bertindak sebagai cetakan untuk membuat rantai pasangannya (Campbell, dkk., 2010). Setelah cukup ruang terbentuk akibat pembukaan untaian ganda ini, DNA  polimerase masuk dan mengikat diri pada kedua rantai DNA yang sudah terbuka secara lokal tersebut. Proses pembukaan rantai ganda tersebut berlangsung disertai dengan pergeseran DNA polimerase mengikuti arah membukanya rantai ganda. Monomer DNA ditambahkan di kedua sisi rantai yang membuka setiap kali DNA  polimerase bergeser. Hal ini berlanjut sampai seluruh rantai telah benar-benar terpisah.Sel eukariot memiliki DNA di dalam kromosom, yaitu di inti sel dan ada  beberapa sel eukariot memiliki DNA di luar kromosom, yaitu DNA pada mitokondria dan kloroplas. DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan dengan  protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular, replikasinya berlangsung secara independen dan tidak bergantung pada replikasi kromosom, serta tidak berasosiasi dengan protein histon. Organisasi gen mitokondria lebih mirip organisasi gen pada bakteri. Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orang tua (Suryo, 2004) DNA dari sel prokariot maupun sel eukariot dapat diperoleh dengan cara mengisolasi DNA yang terdapat di dalam sel. Iso lasi DNA adalah teknik yang dilakukan untuk memisahkan DNA dari zat yang lain di dalam sel. Fungsi dari  pengisolasian DNA adalah mendapatkan DNA murni dari dalam sel yang akan digunakan untuk penganalisisan genotip suatu organisme (Asris, 2010). Beberapa sifat penting DNA adalah : 1. Mengabsorpsi sinar ultraviolet pada panjang gelombang 260 nm 2. Menunjukan roatsi optis yang kuat 3. Dalam larutan menunjukan viskositas yang tingi katena struktur heliksnya yang kokoh

4. Mengalami denaturasi akibat adanya pemanasan atau agitasi akibat pemecahan ikatan hidrogen, pendinginan memperbaki ikatan hidrogen antara pasangan pasangan basa. 5. Ikatan hidrogen dapat dipecah dalam pH asam atau basa. Struktur asam nukleat dapat diketahui lebih terinci lagi. Gugus hidroksi 3’ dari ribose terikat pada hidroksil 5’ dan ribose  berikutnya melalui ikatan fosfodiester. Tentu saja basa heterosiklik dihubungkan dengan unit deoksiribosa oleh ikatan Nglikosida. Perlu dicatat bahwa pada DNA tidak ada lagi gugus hidroksil unit eoksiribosa yang tersisa. Pada setiap fosfat masih mempunyai satu proton bersifat asam yang biasanya mengion pada pH 7. Jika proton ada, zat tersebut adalah suatu asam, karena itulah bernama asam nukleat. Adapun strukturnya adalah sebagai  berikut:

Gambar 1. Struktur DNA

Gambar 2. Struktur DNA rantai ganda

Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak (Yuwono, 2008). Pada sel eukariotik termasuk tanaman dan hewan bagian terbesar dari DNA berada pada nukleus yaitu organel yang dipisahkan dari sitoplasma dengan membran. Nukleus terdiri dari 90 % keseluruhan DNA seluler. Sisa DNA adalah organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Karena DNA terdapat pada nukleus, maka perlu adanya metode pelisisan sel sampai pemanenan sel. Dimana metode tersebut merupakan bagian dari metode isolasi DNA (Elrod, 2007). Pemisahan DNA dari materi seluler lainnya merupakan hal yang signifikan dan mengharuskan penyalinan DNA menjadi RNA dan translasi RNA menjadi protein  berlangsung dalam kompartemen( ruang ) yang berbeda yaitu secara berturut-turut dalam nucleus dan sitoplasma ( Elrod, 2007 ). Terdapat organel-organel bermembran ganda di dalam sitoplasma, termasuk mitokondria baik pada tumbuhan maupun hewan. Oleh karena itu perlu dilakukan isolasi DNA pada tanaman dan hewan untuk mengetahui dan mempelajari DNA dari tanaman dan hewan tersebut. Sel eukariotik memiliki DNA lebih banyak, lengkap dengan komponen-komponen lain. DNA tanaman dan hewan tersimpan dalam nucleusyang terbungkus oleh membran. Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di  bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan  pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah. Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran (Albert, 1994). DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran  plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa  protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian detergen.

Penambahan sabun cair dan garam dapur adalah untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA (Rachmat, 2012). Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa  polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat  pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air  pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit (Kirsman, 2010). Penambahan

deterjen

atau

garam

dapur

dalam

isolasi

DNA

dapat

menyebabkan rusaknya membrane sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membrane membentuk senyawa “lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia (Kirsman, 2010). Prinsip –  prinsip dalam mengisolasi DNA (Tohib, 2012) : 1.

Melisis sel secara fisik, dengan cara penggerusan.

2.

Pemecahan dinding sel.

3.

Pemecahan membran sel.

4.

Pemisahan DNA dari bahan yang lain. Dalam isolasi DNA, bahan yang digunakan biasanya berupa jaringan

tumbuhan, jaringan hewan, atau manusia, untuk itu langkah pertama yang harus kita lakukan adalah memecahkan jaringan menjadi sel-sel yang mandiri. Proses dilakukan secara mekanik atau fisik dengan menumbuk atau menggerus bahan yang akan kita gunakan dengan mortar atau blender. Kedua adalah memecahkan dinding sel dan membran sel lapisan pembungkus DNA. Struktur utama pembentuk membran dan dinding sel adalah lemak, untuk itu kita gunakan deterjen dan garam dapur. Kedua  bahan ini digunakan untuk melubangi dan merusak sel sehingga isi inti sel (DNA)  bisa keluar (Tohib, 2012). Adapun manfaat dari isolasi DNA antara lain (Asris, 2010):

1. Mendapatkan DNA murni yang akan digunakan dalam percobaan laboratorium tertentu. 2. Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel 3. Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan secara enzimatik melalui teknik Hibridisasi Southern. 4. Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan pustaka genomik. 5. Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin peminakan DNA.

VI.

ALAT DAN BAHAN

:

Alat  –  alat :

-

tabung ikrosentrifus

-  beaker glass

1 buah 3 buah

-

tabung reaksi

3 buah

-

vortex

1 buah

-

mikrosentrifus

1 buah

-  pipet mohr

1 buah

-  pipet tetes

secukupnya

Bahan-Bahan :

-

Aquades

4,5 mL

-

Air mineral

4,5 mL

-

Minuman isotonic

4,5 mL

-

Buffer Tris-EDTA

3 mL

-  NaCl 2,5 M -

Etanol dingin

300 µL 3 mL

VII.

ALUR PERCOBAAN

1. Pengumpulan Sel-sel ±10 mL minuman isotonic, air mineral, dan aquades

- Digunakan untuk berkumur selama 1 menit - Hasil berkumur ditampung dalam beaker glass Larutan sel epitel

2. Pemecahan sel (lisis) dan pencernaan protein 1,5 mL larutan sel epitel

- Dimasukkan kedalam tabung mikrosentrifus - Disentrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit

filtrat

Residu

- Ditambah larutan sel hingga 2 kali - Ditambah 1 mL larutan buffer TrisEDTA - Divortex selama 1 menit sampai endapan hancur Larutan epitel yang sudah di vortex

3. Pengendapan DNA Larutan epitel yang sudah divortex

- Ditambahkan 100 µL NaCl - Diaduk dengan cara membolak-balikkan tabung - Dipindahkan semua isi tabung mikrosentrifus ke tabung lain yang bersih dan kering - Ditambahkan 1 mL etanol dingin secara  pelan-pelan - Dibiarkan selama 5 menit Gumpalan putih seperti  benang yang melayanglayang

VIII. HASIL PENGAMATAN No

Rancangan percobaan

Hasil pengamatan Sebelum

1

Pengumpulan Sel-Sel

- Aquades :tidak  berwarna - Air mineral: tidak  berwarna - Isotonic: berwarna  putih

- Aquades setelah

layang

larutan bergel

- Air mineral setelah

- Larutan epitel isotonic: berwarna  putih

isotonic: berwarna  putih

Aquades

- Disentrifus: muncul endapan putih didasar (residu), filtrate larutan tak berwarna

- Diulang 2 kali: endapan semakin  banyak

- + larutan buffer TrisEDTA: endapan larut sebagian

- Divortex selama 1 menit: endapan larut semua (larutan tak  bewarna)

dari

aquades, sedangkan air mineral

dan

isotonic

DNA.

 berwarna

dapat

berasal

 berwarna, larutan

mineral: tidak

- Larutan epitel

yang

menunjukkan

- Larutan epitel air

 berwarna

percobaanini

 berkumur: tidak

 berwarna

mineral: tidak

Dalam

gelembung dan

aquades :tidak

- Larutan epitel air

akan

seperti benang yang melayang- diisolasi

- Larutan epitel

 berwarna

terisolasi

 berwarna, muncul

larutan bergel

aquades :tidak

yang

menunjukkan gumpalan putih DNA

 berkumur: putih,

- Larutan epitel

DNA

 berkumur: tidak

- Isotonic setelah

Pemecahan sel (lisis) dan pencernaan protein

Kesimpulan

Sesudah

 bergel

2

Dugaan/reaksi

minuman tidak adanya

- Larutan epitel air mineral: tidak  berwarna - Larutan epitel isotonic: berwarna  putih 2

Pemecahan sel (lisis) dan pencernaan protein

- Larutan epitel aquades :tidak  berwarna - Larutan epitel air mineral: tidak  berwarna

- Larutan epitel isotonic: berwarna  putih

Aquades

- Disentrifus: muncul endapan putih didasar (residu), filtrate larutan tak berwarna

- Diulang 2 kali: endapan semakin  banyak

- + larutan buffer TrisEDTA: endapan larut sebagian

- Divortex selama 1 menit: endapan larut semua (larutan tak  bewarna)

Air mineral:

- Disentrifus: muncul endapan putih didasar (residu), filtrate larutan tak berwarna

- Diulang 2 kali: endapan semakin  banyak

- + larutan buffer TrisEDTA: endapan larut sebagian Divortex selama 1 menit: endapan larut semua (larutan tak  bewarna)

Isotonik:

- Disentrifus: muncul sedikit endapan putih didasar (residu)

Air mineral:

- Disentrifus: muncul endapan putih didasar (residu), filtrate larutan tak berwarna

- Diulang 2 kali: endapan semakin  banyak

- + larutan buffer TrisEDTA: endapan larut sebagian Divortex selama 1 menit: endapan larut semua (larutan tak  bewarna)

Isotonik:

- Disentrifus: muncul sedikit endapan putih didasar (residu)

hampir tidak terlihat, filtrate larutan tak  berwarna

- Diulang 2 kali: sedikit endapan putih

- + larutan buffer TrisEDTA: endapan larut sebagian

- Divortex selama 1 menit: endapan larut semua (larutan tak  bewarna)

hampir tidak terlihat, filtrate larutan tak  berwarna

- Diulang 2 kali: sedikit endapan putih

- + larutan buffer TrisEDTA: endapan larut sebagian

- Divortex selama 1 menit: endapan larut semua (larutan tak  bewarna)

3

Pengendapan DNA

- Larutan epitel

Aquades

aquades yang sudah - + 100 µL NaCl: divortex: endapan

larutan epitel tidak

larut

 berwarna

- Larutan epitel air mineral yang sudah

- Diaduk: homogeny - + etanol dingin 1 mL:

divortex: endapan

larutan epitel tidak

larut

 berwarna

- Larutan epitel

- Didiamkan 5 menit:

isotonik yang sudah

terdapat gumpalan

divortex: endapan

 putih seperti

larut

 benangyang melayang-layang (DNA)

Air mineral:

- + 100 µL NaCl: larutan epitel tidak  berwarna

- Diaduk: homogeny - + etanol dingin 1 mL:

3

Pengendapan DNA

- Larutan epitel

Aquades

aquades yang sudah - + 100 µL NaCl: divortex: endapan

larutan epitel tidak

larut

 berwarna

- Larutan epitel air mineral yang sudah

- Diaduk: homogeny - + etanol dingin 1 mL:

divortex: endapan

larutan epitel tidak

larut

 berwarna

- Larutan epitel

- Didiamkan 5 menit:

isotonik yang sudah

terdapat gumpalan

divortex: endapan

 putih seperti

larut

 benangyang melayang-layang (DNA)

Air mineral:

- + 100 µL NaCl: larutan epitel tidak  berwarna

- Diaduk: homogeny - + etanol dingin 1 mL:

larutan epitel tidak  berwarna

- Didiamkan 5 menit: tidak muncul gumpalan putih seperti benang yang melayang-layang (DNA)

Isotonik:

- + 100 µL NaCl: larutan epitel tidak  berwarna

- Diaduk: homogeny - + etanol dingin 1 mL: larutan epitel tidak  berwarna

- Didiamkan 5 menit: tidak muncul gumpalan putih seperti benang yang

larutan epitel tidak  berwarna

- Didiamkan 5 menit: tidak muncul gumpalan putih seperti benang yang melayang-layang (DNA)

Isotonik:

- + 100 µL NaCl: larutan epitel tidak  berwarna

- Diaduk: homogeny - + etanol dingin 1 mL: larutan epitel tidak  berwarna

- Didiamkan 5 menit: tidak muncul gumpalan putih seperti benang yang

melayang-layang (DNA)

melayang-layang (DNA)

IX.

ANALISIS DATA DAN PEMBAHASAN

Isolasi DNA merupakan tahap terpenting dalam analisis biologi molekuler. Teknik-teknik isolasi DNA yang telah dikembangkan sangat mahal dan memerlukan waktu yang lama. DNA dapat diisolasi dari berbagai sel atau jaringan baik hewan, tumbuhan maupun manusia. DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam  jaringan. Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan  pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian detergen. Penambahan sabun cair dan garam dapur adalah untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA (Rachmat, 2012). Modifikasi teknik isolasi DNA telah dilakukan pada beberapa laboratorium, misalnya pada takaran bahan-bahan yang digunakan atau penguraian/ penggantian  jenis bahan yang digunakan sesuai denga sel/

jaringan sumber DNA. Teknik/

IX.

ANALISIS DATA DAN PEMBAHASAN

Isolasi DNA merupakan tahap terpenting dalam analisis biologi molekuler. Teknik-teknik isolasi DNA yang telah dikembangkan sangat mahal dan memerlukan waktu yang lama. DNA dapat diisolasi dari berbagai sel atau jaringan baik hewan, tumbuhan maupun manusia. DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam  jaringan. Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan  pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian detergen. Penambahan sabun cair dan garam dapur adalah untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA (Rachmat, 2012). Modifikasi teknik isolasi DNA telah dilakukan pada beberapa laboratorium, misalnya pada takaran bahan-bahan yang digunakan atau penguraian/ penggantian  jenis bahan yang digunakan sesuai denga sel/

jaringan sumber DNA. Teknik/

metode isolasi DNA yang sangat sederhana adalah metode Kitchen Preparation. Metode isolasi ini memanfaatkan bahan- bahan yang biasanya digunakan ibu rumah tangga yaitu sabun cuci (cair, bubuk atau krim) untuk menggantikan bahan utama yang berfungsi untuk melisis sel, ekstrak buah nanas sebagai sumber enzim protease serta garam dapur (Rachmat, 2012). Praktikum isolasi DNA dilakukan bertujuan untuk mengetahui pengaruh aquades, air mineral, dan minuman isotonik terhadap kualitas DNA yang dihasilkan dalam proses isolasi. Pelarut yang digunakan adalah aquades, air mineral, dan minuman isotonik. Prinsip dari percobaan ini adalah perusakan sel epitel secara kimiawi agar terjadi pemecahan sel, penambahan NaCl sehingga DNA dapat dikeluarkan dari dalam sel. NaCl yang digunakan pada percobaan ini sebesar 2,5 M. Pertama, yang harus dilakukan adalah menyiapkan alat dan bahan yang diperlukan untuk percobaan ini, terutama disiapkan akuades (tidak berwarna), air mineral (tidak berwarna), dan minuman isotonic (berwarna putih). Langkah pertama yaitu, masing-masing dari akuades, air mineral, minuman isotonic digunakan untuk  berkumur selama 1 menit, kemudian hasil berkumurnya (larutan sel epitel) ditampung didalam beaker glass. Didapatkan hasil bahwa, aquades setelah

digunakan berkumur: larutan sel epitel tidak berwarna, muncul gelembung dan larutan berlendir; air mineral setelah digunakan berkumur: larutan sel epitel tidak  berwarna, muncul gelembung dan larutan berlendir; minuman isotonik setelah digunakan berkumur: larutan sel epitel berwarna putih, muncul gelembung dan larutan berlendir. Untuk percobaan ini, yang akan digunakan sebagai sampel adalah  bagian yang encer (bukan yang berlendir atau yang bergelembung). Kedua, masing-masing larutan sel epitel akuades, air mineral, dan minuman isotonic diambil 1,5 mL menggunakan pipet mohr dan dimasukkan kedalam tabung mikrosentrifus,

setelah

itu

disentrifus.

Proses

sentrifus

digunakan

untuk

mengendapkan protein yang ada didalam larutan sel epitel akuades, air mineral, dan minuman isotonic yang didalam protein tersebut terdapat DNA. Perlakuan diatas dilakukan sebanyak 3 kali untuk menambah endapan protein, endapan protein yang semakin banyak akan menunjukkan hasil positif terhadap kualitas DNA yang dihasilkan. Setelah disentrifus dihasilkan filtrat dan residu, dimana residu ini adalah  protein yang mengandung DNA didalamnya, kemudian filtrate dan residu dipisahkan. Urutan banyaknya residu pada larutan sel epitel, akuades > isotonic > air mineral. Residu yang masih didalam tabung mikrosentrifus ditambahkan 1 mL larutan buffer Tris-EDTA yang tidak berwarna. Penambahan larutan buffer TrisEDTA bertujuan untuk menjaga pH larutan, karena DNA dapat bertahan pada pH tertentu yaitu pada pH 5-12, pH dari bufer yang digunakan harus berada dalam rentang pH 5-12, larutan buffer dengan pH rendah akan mengkibatkan depurifikasi dan mengakibatkan DNA terdistribusi ke fase fenol selama proses deproteinisasi, sedangkan pH larutan yang tinggi di atas 12 akan mengakibatkan pemisahan untai ganda DNA, fungsi larutan buffer adalah untuk menjaga struktur DNA selama  proses penghancuran dan purifikasi sehingga memudahkan dalam menghilangkan  protein dan RNA serta mencegah aktivitas enzim pendegradasi DNA dan mencegah  perubahan pada molekul DNA, larutan buffer Tris-EDTA yang digunakan adalah pH 8, selain itu ada pula senyawa EDTA (etilendiamintetraasetat) yang berfungsi untuk menghilangkan ion Mg 2+ yang penting untuk mempertahankan struktur selubung sel serta menghambat enzim yang dapat merusak DNA. Hasil yang didapatkan pada ketiga tabung mikrosentrifus yang berisi masing-masing residu (protein) larutan sel epitel akuades, air mineral, dan minuman isotonic adalah endapan /residu yang dihasilkan berkurang (endapan sedikit larut) setelah ditambahkan larutan buffer TrisEDTA. Kemudian ketiga tabung tersebut divortex selama 1 menit dengan kecepatan

1500 rpm. Vortex bertujuan untuk merusak dinding sel epitel, sehingga DNA dapat keluar dari sel epitel. Hasil yang didapatkan pada ketiga tabung mikrosentrifus yang  berisi masing-masing residu (protein) larutan sel epitel akuades, air mineral, dan minuman isotonic setelah divortex adalah endapan/residu larut semua (larutan tak  berwarna). Ketiga, Pada percobaan lainnya, pemecahan sel (lisis) dilakukan dengan  penambahan detergen dan garam dapur untuk membantu proses pemecahan sel. sering digunakan sodium dodecyl sulphate (SDS) sebagai tahap pelisisan membran sel. Detergen tersebut selain berperan dalam melisiskan membran sel juga dapat  berperan dalam mengurangi aktivitas enzim nuklease yang merupakan enzim  pendegradasi DNA. Namun, pada percobaan kali ini digunakan NaCl 2,5 M, NaCl  berfungsi untuk menghilangkan polisakarida seperti lemak, karbohidrat, protein, dll,  NaCl juga berfugsi untuk memekatkan DNA, hal ini dapat terjadi karena ion Na+ yang dikandung oleh garam mampu membentuk ikatan dengan kutub negative pada ikatan fosfat DNA, saat ion Na +  garam berikatan dengan gugus fosfat pada DNA,  pada saat itulah DNA akan berkumpul, selain itu penambahan NaCl juga bertujuan untuk memudahkan pemisahan benang-benang DNA dari larutan dan untuk mengendapkan kotoran-kotorannya sehingga benang-benang DNA tersebut akan mudah diamati. Hasil yang didapatkan pada ketiga tabung mikrosentrifus (akuades, air mineral, dan minuman isotonik) yang berisi masing-masing larutan yang sudah divortex setelah ditambah 100 µL NaCl adalah larutan tak berwarna. Kemudian ketiga

tabung

tersebut

diaduk

dengan

cara

membolak-balikkan

tabung

mikrosentrifus. Selanjutnya larutan yang ada didalam tabung mikrosentrifus dipindahkan kedalam tabung reaksi yang bersih dan kering, kemudian ditambahkan 1 mL etanol dingin pada masing-masing tabung. Etanol berfungsi untuk untuk melakukan presipitasi sehingga DNA yang telah terkumpul tadi mampu memisah dari larutan dan terbentuklah lapisan-lapisan yang dapat diidentifikasi unsur  penyusunnya. Disini, yang digunakan adalah etanol dingin, karena apabila etanol yang digunakan dalam keadaan panas akan menyebabkan DNA mudah rusak, semakin dingin ethanol, DNA yang terpresipitasi semakin pekat. Hasil yang didapatkan pada ketiga tabung (akuades, air mineral, dan minuman isotonik) setelah ditambah etanol dingin adalah larutan tak berwarna. Kemudian, didiamkan selama 5 menit. Langkah terakhir yaitu mengamati DNA yang terbentuk, didapatkan hasil  bahwa hanya larutan sel epitel akuades yang menunjukkan adanya DNA yang dapat

dilihat dengan adanya gumpalan putih seperti benang yang melayang-layang didalam larutan, sedangkan untuk larutan sel epitel air mineral dan minuman isotonic tidak menunjukkan adanya DNA, karena tidak menunjukkan adanya gumpalan putih seperti benang yang melayang-layang didalam larutan. Pada dasarnya akuades, air mineral, dan minuman isotonic dapat mengikat DNA, namun yang paling banyak dapat mengikat DNA adalah minuman isotonic karena didalam minuman isotonic terkandung ion Na +, dimana ketika ion Na + garam  berikatan dengan gugus fosfat pada DNA, pada saat itulah DNA akan berkumpul,  banyaknya DNA yang terkumpul ditandai dengan endapan yang banyak, banyaknya endapan dapat memperlihatkan DNA dengan jelas. Berdasarkan pengamatan organoleptik, endapan yang dihasilkan paling banyak terdapat ada larutan sel epitel aquades. Namun, berdasarkan teori seharusnya yang mempunyai endapan paling  banyak adalah larutan sel epitel isotonic. Hal tersebut dikarenakan karena, 1. Kurang maksimalnya pada saat proses berkumur, sehingga menyebabkan tidak  banyak protein yang ada didalam sel epitel tidak terikat oleh pelarut akudes, air mineral, dan minuman isotonic. DNA terdapat didalam protein, sehingga semakin sedikit protein yang terikat oleh pelarut akudes, air mineral, dan minuman isotonic maka akan sedikit atau tidak ada DNA yang teridentifikasi. 2. Keterbatasan mata praktikan dalam mengamati adanya DNA atau tidak pada larutan sel epitel akuades, air mineral, dan minuman isotonic, karena DNA yang dihasilkan terlalu tipis (hanya satu helai). 3. Masih adanya ion ion Mg 2+ dan enzim tertentu , dimana ion Mg 2+ dan enzim tertentu dapat menyebabkan rusaknya struktur selubung sel dan merusak DNA. 4. Masih adanya senyawa polisakarida seperti lemak, karbohidrat, protein yang terkandung didalam larutan. Hal tersebut dikarenakan tidak ditambahkan larutan Proteinase K yang berfungsi untuk mencerna protein, sehingga DNA yang ada didalam protein belum lisis semuanya.

X.

KESIMPULAN

Dalam percobaan ini DNA yang dapat diisolasi berasal dari aquades, sedangkan air mineral dan minuman isotonic tidak menunjukkan adanya DNA.

XI.

DAFTAR PUSTAKA

Albert, B., 1994. Biologi Molekuler Sel Edisi Kedua. PT. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta. Asris.,

2010. Definisi

Isolasi

DNA

dan

Manfaat

Isolasi

 DNA.http://asris07.  Student.ipb.ac.id. Diakses pada tanggal 8 November 2017,  pukul 04.00 WIB Campbell, N. A., dan Jane B. R., 2010, Biologi Jilid I Edisi Kedelapan, Erlangga, Jakarta. Elrod, S., 2007. Genetika Edisi Keempat . Erlangga. Jakarta. Kirsman, 2010. Isolasi DNA Buah. http://kirsman83.weebl.com. Diakses pada tanggal 8 November 2017, pukul 04.00 WIB Rachmat, 2012. Isolasi

DNA. http://rachmatyusuf.blogspot.com.  Diakses

pada

tanggal 8 November 2017, pukul 04.00 WIB Suryo, 2004. Genetika Strata 1. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta. Tohib, 2012. Macam Metode Isolasi DNA. http://www.tohib.web.id.  Diakses pada tanggal 8 November 2017, pukul 04.00 WIB Yuwono, T., 2008. Biologi Molekuler . Erlangga. Jakarta.

XII.

JAWABAN PERTANYAAN

1. Gambarkan struktur DNA 2. Bagaimanakan cara menentukan jumlah DNA hasil isolasi tersebut menggunakan spektrofotometer! Jawaban : 1. Gambar struktur DNA:

2. Cara menetukan DNA hasil isolasi menggunakan spektrofotometer: - Ditentukan panjang gelombang Jumlah DNA dicerminkan berat molekul bukan oleh volume. Untuk mengetahui jumlah DNA, maka DNA hasil isolasi harus dianalisis dengan spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 260 nm. Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm. Rasio OD260 / OD280 antara 1,8 2,0 mencerminkan DNA yang relatif murni dan terbebas dari kontaminan  protein. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dapat dikonversikan menjadi konsentrasi, yaitu nilai 1 pada OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml. DNA dan RNA menyerap pada panjang gelombang maksimal 260 nm, sementara kebanyakan protein menyerap kuat pada 180 nm. Namun, asam nukleat juga menyerap secara signifikan pada 280 nm (50%-55% dari absorbansi poada 260 nm), dan sebagian protein dapat menyerap kuat pada 260 nm (absrobansi bervariasi, tergantung pada protein). Dengan demikian, untuk mengukur secara akurat konsentrasi DNA, RNA dan protein dalam campuran yang kompleks bisa menjadi sulit. Namun, mengukur absorbansi  pada 260 nm dan pada 280 nm dapat memberikan validasi kemurnian sampel asam nukleat: rasio A260/A280 di atas 1,8 untuk DNA atau 2,0 untuk RNA mengindikasikan sampel yang murni, nilai rasio yang rendah menunjukkan adanya protein atau kontaminan lainnya.

-

Preparasi sampel dan pengujian dengan spektrofotometer

Untuk preparasi sampel Dipipet 5 µl sampel DNA hasil isolasi, ditambahkan aquadest secukupnya sehingga volume akhir 1 ml dicampur, kemudian

pindahkan

kedalam

kuvet

spektrofotometer,

Blanko

spektrofotometer dengan kuvet berisi 1 ml aquadest dibaca absorbansi sampel dengan spektorfotometer pada λ   260 nm dan dilakukan pembacaan yang ke-2 pada λ  280 nm.