Laporan Tetap KAI (HPLC)

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY ( HPLC )

LAPORAN TETAP PRAKTIKUM KIMIA ANALITIK INSTRUMEN DISUSUN OLEH : Kelompok: III ( 3.KC ) Guhartini Liza Novriani Ralli Artindah Samapta Probowisnu Siti Rahayu Dwi Indah Mayasari INSTRUKTUR

(NIM 061430401224) (NIM 061430401227) (NIM 061430401233) (NIM 061430401236) (NIM 061430401241) (NIM 061430401989)

: Ir. Erwana Dewi, M.Eng

JURUSAN TEKNIK KIMIA POLITEKNIK NEGERI SRIWIJAYA 2015

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY ( HPLC ) A. Tujuan - Dapat menjelaskan teori kromatografi cair kinerja tinggi. - Dapat mengoperasikan alat kromatografi cair kinerja tinggi dengan baik -

dan benar. Dapat menganalisa suatu senyawa kimia baik secara kualitatif maupun kuantitatif menggunakan alat kromatografi cair kinerja tinggi.

B. Alat dan bahan yang Digunakan Alat yang Digunakan : - Serangkat alat HPLC yang dilengkapi dengan injector dan pencetak -

kromatografi. Kolom Linchosphere. Syringe Penyaring milipone.

Bahan yang Digunakan : -

Cairan blanko yang mengandung caffeine.

C. Gambar Alat (Terlampir) D. Dasar Teori Kromatografi adalah metode suatu proses fisik yang digunakan untuk memisahkan komponen-komponen dari suatu campuran senyawa kimia. Dalam kromatografi, campuran tersebut dibuat sebagi zona yang sempit (kecil) pada salah satu ujung media porus seperti adsorben, yang disebut alas atau landasan kromatografi. Zona campuran kemudian digerakan dengan larutan suatu cairan atau gas yang bergerak sebagai pembawa, melaui media porus tersebut, yang berupa partikel-partikel yang ”diam“ (tidak bergerak, statisiones). Sehingga akibatnya masing-masing komponen dari campuran tersebut akan terbagi (terdistribusi) secara tidak merata antara alas yang “diam” dan cairan atau gas yang membawanya. Akibat selanjutnya, masing-masing komponen akan bergerak (bermigrasi) pada kecepatan yang berbeda (differential migration) dan dengan demikian, akan sampai pada ujung lain dari alas tersebut pada waktu yang

berlainan, dan dengan demikian terjadilah pemisahan diantara komponenkomponen yang ada. (Bahti, Husein H. 2011: 4). Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponenkomponen campuran yang berdasarkan distribusi diferensial dari komponenkomponen sampel diantara dua fasa, yaitu fasa gerak dan fasa diam. Salah satu teknik kromatografi yang dimana fasa gerak dan fasa diamnya menggunakan zat cair adalah HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau didalam bahasa Indonesia disebut KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi). Teknik HPLC merupakan suatu metode kromatografi cair-cair, yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kualitatif dengan teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas area standar. Pada prakteknya, metode pembandingan area standar dan sampel kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan suatu konsentrasi standar. Oleh karena itu, dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi. (Wiji, dkk. 2010 : 17). HPLC yang modern telah mucul akibat pertemuan dari kebutuhan, keinginan manusia untuk meminimalis pekerjaan, kemampuan teknologi, dan teori untuk memandu pengembangan pada jalur yang rasional. Jelas sebelum era peralatan yang modern bahwa LC (Liquid Chromatography) memiliki kekuatan pemisahan yang sangat ampuh, bahkan untuk komponen-komponen yang berhubungan sangat erat. LC harus ditingkatkan kecepatannya, diotomasasi, dan harus disesuaikan dengan sampel-sampel yang lebih kecil, waktu elusi yang beberapa jam (Underwood, Day. 2002 : 553). HPLC berbeda dari kromatografi kolom cairan konvensional dalam hal digunakan bahan pengisi kolom berupa partikel yang sangat kecil berukuran sampai 3-5 μm (1μm = 10-6 m). Sehingga mengharuskan digunakannya tekanan tinggi sampai 20.000 Kpa (

200 atmosfir) untuk mengalirkan fasa gerak

melalui kolom tersebut. Ternyata, penggunaan bahan pengisi kolom yang lebih kecil ini bukan saja telah memperbaiki kecepatan analisis, tapi (dari ini yang lebih penting) ialah telah

menghasilkan suatu teknik dengan daya pisah yang tinggi. HPLC mempunyai kelemahan- kelemahan yang diantaranya, peralatannya lebih rumit, tidak murah, dan perlu pengalaman. Untuk beberapa jenis zat, metode ini kurang sensitif. Selain itu sampel disyaratkan harus stabil dalam larutan. Berdasarkan kepolaran fasa geraknya, HPLC dibagi menjadi 2 macam yaitu : a) Fase Normal HPLC HPLC jenis ini secara esensial sama dengan kromatografi kolom. Meskipun disebut normal, ini bukan bentuk biasa dari HPLC. Kolom ini diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut nonpolar seperti heksan sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4,6 mm (dan kemungkinan kurang dari nilai ini) dengan panjang 120 nm250 nm. Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding dengan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom. Apabila pasangan fasa diam lebih polar daripada fasa geraknya maka sistem ini disebut HPLC fase normal. b) Fase Balik HPLC Pada HPLC jenis ini, ukuran kolomnya sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan hidrokarbon dengna rantai panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Dalam kasus ini, akan terdapat interaksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Interaksi yang terjadi tidak sekuat interaksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fasa diam) dan molekulmolekul polar dalam larutan. Oleh karena itu molekul-molekul polar akan lebih cepat bergerak melalui kolom. Sedangkan molekulmolekul non polar akan bergerak lambat karena interaksi dengan gugus hidrokarbon.

Komponen instrumentasi penyusun Kromatografi Cair Kinerja Tinggi : a) Reservoir Pelarut Jumlah reservoir pelarut : (1) bisa salah satu atau lebih; berisi pelarut organik seperti heksana, atau air, atau campuran air dan pelarut organik seperti metanol,tergantung kepada apakah kita bekerja menggunakan fasa normal atau fasa terbalik atau metode kromatografilainnya. Bila sistem KCKT dilengkapi dengan alat pencampuran (2) (atau mempunyai lebih dari satu pompa) yang memungkinkan membuat campurancampuran pelarut dengan komposisi yang diatur dengan bantuan suatu programener, maka diperlukan lebih dari satu reservoir, sistem ini diperlukan untuk melakukan elusi bergradien dimana komposisi pelarut diubah-ubah selama pengelusian. Pelarut fasa gerak dipompa dari reservoir oleh sistem pompa, demikian sehingga campuran pelarut dengan komposisi tertentu dapat mengalir tanpa denyutan (pulseless). Kecepatan aliran dapat diatur antara 0,1 – 10 mL/menit. Gas yang terlarut dalam pelarut fasa gerak yang digunakan harus dibuang terlebih dahulu (de-gassing), selain itu, pelarut harus di saring dahulu agar bebas dari partikel-partikel kecil yang tidak larut. Pada saluran-saluran pelarut biasanya dipasang saringan (berukuran 2-10 mμ) untuk mencegah partikel-partikel kecil yang tidak larut tadi, masuk kedalam kolom. Saringan ini harus diganti atau dibersihkan bila terjadi penyumbatan. Diantara jenis-jenis pompa yang paling umum digunakan untuk sistem HPLC adalah jenis pompa “isap dan tekan ” (reciprocating). Pompa “isap dan tekan” yang sederhana mempunyai kecepatan isap yang tetap. Artinya, waktu yang diperlukan untuk langkah mengisis sama dengan waktu untuk langkah memompa. Pompa seperti ini memerlukan perendam denyutan yang baik. Oleh karena itu, pompa jenis ini umumnya menggunakan dua pengisap yang masing-masing bekerja kebalikan satu dari yang lainnya. Setiap pengisap memppunyai dua katup pengendali. Pelarut diisap ke dalam ruang pengisap melalui katup pemasukkan dan kemudian ditekan ke luar melalui katup pengeluaran. Untuk melakukan elusi bergradien diperlukan dua sistem pompa yang masing-masing mempunyai satu atau dua penghisap. Ada dua macam rancangan utama pompa gradien yaitu

pecampuran tekana tinggi yang mempunyai hantaran dua pompa dan pencampuran tekana rendah dengan hantaran satu pompa. Rancangan pompa gradien yang pertama, yakni sistem pencampuran tekanan tinggi, mempunyai dua pompa dan satu pengendali, masing-masing pompa menghantarkan satu sistem pelarut. Fungsi pengendali adalah mengatur kecepatan aliran masing-masing pelarut sesuai dengan komposisi yang diinginkan dan juga berfungsi untuk menjamin terjadinya pengadukan yang baik oleh suatu pengaduk dinamik. Setiap pompa mempunyai dua penghisap dan setiap penghisap mempunyai dua katup. Jenis yang kedua, pompa pembagi bertekanan rendah hanya mempunyai satu penghisap. Untuk melakukan elusi gradien hanya diperlukan satu pompa. Pompa ini mempunyai katup pembagi, tidak mempunyai pengendali gradien. Dengan katup-katup pembagi dimungkinkan untuk membuat suatu campuran terner (tiga jenis pelarut) dengan perbandingan yang diinginkan. Jadi untuk melakukan gradien gradien tidak diperlukan lebih dari satu pompa. Katupkatup pembagi ini dikendalikan oleh suatu microprocessor dan terbuka selama langkah pemasukan pelarut. (Bahti, Husein. H . 2011 : 34-40) b) Kolom Kolom HPLC biasanya terbuat dari stailess steel, akan tetapi ada juga yang terbuat dari gelas berdinding tebal. Kolom utama berisi fasa diam, tepat terjadinya pemisahan campuran menjadi komponen-komponen. Bergantung keperluannya kolom utama dapat digunakan untuk analisis atau preparatif setiap komponen yang keluar kolom ditampung pada tabung yang berbeda dan keluaran HPLC dihubungkan dengan fraction colector selain kolom utama dikenal pula kolom pengaman. Kolom utama berisi fasa dian dan jenisnya bervariasi bergantung pada keperluan, misalnya dikenal kolom C8, C-18, cyanopropyl, dan penukar ion. Kolom utama untuk HPLC biasanya berukuran panjang berkisar antara 5-30 cm dan diameter dalam berkisar 4,5–10 mm. Kolom pengaman (guard coloumn) disebut juga pra-kolom karena letaknya sebelum sistem pemasukan cuplikan. Kolom ini berukuran pendek 5 cm dengan diameter 4,6 mm biasanya dipaking dengan partikel silika berukuran besar

dari ukuran partikel kolom utama. Kolom pengaman mempunyai dua fungsi yaitu: menyaring kotoran yang terbawa oleh fasa gerak dan untuk menjenuhkan fasa gerak dalam rangka menghindarkan terjadinya erosi fasa diam oleh aliran pelarut. Kolom merupakan jantung kromatograf, keberhasilan atau kegagalan analisis bergantung pada pilhan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok : -

Kolom analitik Garis tengah dalam 2-6 mm, panjang bergantung pada jenis kemasan, untuk kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50-100 cm, untuk kemasan

mikropartikel berpori biasanya 10-30 cm. Kolom preparative Umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar, dan panjang 25-100 cm. c) Pompa -

Pada HPLC, pompa ini berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus. Digunakan pompa bertekanan tinggi dalam metode ini sebagai akibat penggunaan fasa gerak yang berupa zat cair yang akan sukar mengalir dalam kolom yang dipadatkan dengan serbuk halus. Oleh karena itu, agar zat cair dapat melewati kolom secara tepat maka dibutuhkan bantuan pompa yang bertekana tinggi. Pompa yang digunakan dalam HPLC harus memenuhi persyaratan sebagai berikut :    

Menghasilkan tekanan sampai 5000 psi Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit Bahan tahan korosi Keluaran bebas pulse

d) Injector Sample Sampel-sampel cair dan larutan disuntikan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir dibawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal. Salah satu jenis penyuntik untuk memasukan sampel ke dalam sistem (kolom) kromatografi adalah penyuntik loop. Dalam prakteknya, loop tidak perlu diisi penuh, tapi bila tidak diisi penuh akan mengakibatkan lebih jeleknya presisi

hasil eksperimen dan ketergantungan presisi tersebut kepada bagaimana sioperator menggunakan penyuntik. Perlu diingat, bahwa penyuntik tidak boleh dicabut sebelum pegangan (handle) penyuntik diputar dari posisi load (“pengisap”) ke posisi inject (“suntik”). Karena sampel akan mengalir ke saluran pembuangan. Hal yang terakhir ini tentunya tidak diinginkan, pegangan penyuntik harus diputar cepat agar pemutusan aliran ke dalam diinginkan. Pegangan penyuntik harus diputar cepat agar pemutusan aliran ke dalam kolom, antara posisi pengisian (load) dan posisi penyuntikan (inject) berlangsung cepat. Yang menjadi faktor ketidak tepatan pengukuran HPLC salah satunya terletak pada keterulangan pemasukan cuplikan kedalam paking kolom. Masalahnya

kebanyakan

memasukan

cuplikan

kedalam

kolom

dapat

menyebabkan band broadening. Oleh karen itu cuplikan yang dimasukkan harus sekecil beberapa puluh mikroliter. Beberapa teknik pemasukan cuplikan kedalam sistem dapat diuraikan sebagai berikut : 

Injeksi Syringe Syringe disuntikan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe yang tahan tekanan sampai 1500 psi. Akan tetapi keterulangan



injeksi stringe ini sedikit lebih baik dari 2-3 % dan sering lebih jelek. Injeksi Stop Flow Aliran pelarut dihentikan sementara, sambungan pada ujung kolom dibuka dan cuplikan disuntikan langsung kedalam ujung kolom. Setelah menyambung kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali. Untuk memasukkan cuplikan kedalam fasa gerak perlu dua langkah : sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dan posisi ‘load’. Cuplikan masih berada dalam loop ; kran diputar untuk mengubah posisi ‘load’ menjadi posisi ‘injeksi’ dan fasa gerak membawa cuplikan kedalam kolom



(kran cuplikan) Kran Cuplikan Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak digunakan. Untuk memasukan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu 2 langkah, yaitu: sejumlah volume cuplikan disuntikan ke dalam loop dalam posisi load, cuplikan masih berada dalam loop; kran diputar untuk

mengubah posisi load menjadi posisi injeksi dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom. e) Detektor Ada dua jenis detektor yaitu detektor selektif, adalah detektor yang peka terhadap golongan senyawa tertentu saja. Dan detektor universal, yaitu detektor yang peka terhadap golongan senyawa apapun kecuali pelarutnya. Diantara detektor yang digunakan dalam KCKT adalah : Detektor Ultra Violet – Visible (Sinar Tampak) Detektor UV terutama digunakan untuk pendeteksian senyawasenyawa organik. Detektor UV dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang, sehingga panjang gelombang UV yang digunakan dapat dipilih sesuai dengan jenis cuplikan yang diukur. Detektor UV-Visible (uv-sinar tampak) paling banyak digunakan, karena sensitivitasnya yang baik mudah menggunakannya, tidak merusak senyawa yang di analisis, dan memungkinkan untuk melakukan elusi bergradien. Ada yang dipasang pada panjang gelombang tetap yaitu pada panjang gelombang 254 nm, dan ada yang panjang gelombangnya dapat dipilih sesuai dengan diinginkan antara 190-600 nm. Detektor dengan panjang gelombang variabel ini ada yang dilengkapi alat untuk memilih panjang gelombang secara otomatis dan dapat me-nol-kan sendiri (allto zero). Detektor jenis ini juga ada yang menggunakan drode erray (sebagai pengganti photo tube), sehingga dapat melakukan pembacaan absorban yang kontinyu pada berbagai panjang gelombang. Detektor Indeks Bias Detektor indeks bias memberi respons terhadap senyawa yang dianalisis apapun, termasuk pelarutnya sendiri. Prinsip dasar kerja detektor ini adalah perubahan indeks bias karena adanya komponen sampel dalam pelarut. Detektor ini bersifat tidak merusak (non-destruktif), sensitivitasnya cukup tinggi (minimum 10-6 g) dan umumnya digunakan dalam pekerjaan preparatif. Dengan detektor ini tidak dapat dilakukan elusi bergradien. Detektor ini digunakan dalam kromatografi eklusi dan dalam analisis karbohidrat.

Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam menggunakan detektor indeks bias : 1. Bila digunakan lebih dari satu pelarut, maka campuran dahulu hingga homogen dan bebaskan dari gas terlarutnya. 2. Setelah detektor dihidupkan, tunggu beberapa lama sebelum digunakan sampai detektor stabil. 3. Bila digunakan lebih dari satu detektor yang dipasang berurutan, maka tempatkanlah detektor indeks bias pada urutan terakhir. 4. Untuk saluran pembuangan, gunakanlah selang teflon berdiameter dalam (inner diameter) yang besar tapi pendek. 5. Tempatkan detektor pada kondisi suhu yang dipelihara tetap. 6. Jaga agar sel indeks bias selalu bersih. 6.

Rekorder Rekorder adalah alat untuk mencetak hasil percobaan pada lembar berupa kumpulan puncak (kromatogram) kromatogram HPLC yang didapat berguna untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran dan jumlah peak menyatakan jumlah komponen. Analisis kualitatif dapat dilakukan dengan cara membandingkan waktu retensi (rt) analit atau sampel dengan waktu retensi standar. Sedangkan analisis kuantitatif depat dilakukan dengan didasarkan pada luas peak atau tinggi peak dengan metode standar kalibrasi. Prinsip kerja instumentasi HPLC HPLC menggunakan fasa gerak untuk memisahkan komponen dari sebuah campuran komponen (analit). Prinsip keja HPLC adalah pemisahan setiaap komponen dalam sampel berdasarkan kepolarannya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Fasa diam yang biasa digunakan (pada kolom) HPLC jenis fasa terbalik adalah RMe 2SiCl, dimana R adalah rantai alkana C-18 atau C8. Sementara fasa geraknya berupa larutan yang diatur komposisinya (gradien elusi), misalnya : air:asetonitril (80:20), hal ini bergantung pada kepolaran analit yang akan dipisahkan. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan waktu retensinya akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang punsak-puncaknya terpisah.

Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan komponen-komponen terjadi karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Keunggulan menggunakan HPLC dibandingkan kromatografi gas yaitu terletak pada kemampuannya untuk menganalisis cuplikan yang tidak menguap dan labil pada suhu tinggi. HPLC tidak terbatas pada senyawa organik tapi mampu menganalisis senyawa anorganik, mampu menganalisis cuplikan yang mempunyai molekul tinggi (beratnya), mampu menganalisis cuplik yang mempunyai titik didih yang sangat tinggi seperti polimer. Cara kerja instumentasi HPLC Prinsip kerja alat HPLC adalah pertama fasa gerak dialirkan melalui kolom kedetektor dengan bantuan pompa. Kemudian cuplikan dimasukan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Didalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran karena perbedan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu. Sebaliknya solut-solut yang interaksinya kuat dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen yang campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.

Gambar Skema Instrumentasi HPLC

E. Analisis Percobaan Praktikum kali ini yang dilakukan adalah menganalisa sample caffeine menggunkana

alat

penyerap

yang

bernama

High

Performance

Liquid

Chromatography (HPLC) atau yang lebih dikenal dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analitanalit berdasarkan kepolarannya, alat yang terdiri dari kolom (sebagai fase diam) dan larutan tertentu sebagai fase geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fase geraknya. Campuran analit akan terpisah berdasarkan teramati pada spectrum yang puncak-puncaknya terpisah. Untuk skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa terhelogenasi < golongan eter ~ golongan ester < golongan keton ~ golongan aldehida < golongan alkohol < golongan asam. HPLC dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada proses kualitatif cara yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah melihat Retention Time (RT). Peak yang mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya adalah sebagai peak milik analit. Selain melihat RT hal lain yang perlu dilihat adalah spectrum 3D dari signal kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai spectrum 3D yang juga sama. Sehingga jika spectrum 3D antara dua zat berbed, maka kedua zat tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan meskipun memiliki RT yang sama. Kemudian melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar komponen yang dianalisis didalam sample. Yang berperan dalam proses separasi pada systm HPLC adalah kolom. Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis amalisa, misalnya kolom C18 yang dapat digunakan untuk analisa carotenoid, protein, lavastatin, dan sebagainya. Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu missal kolom zorbax carbohidrat (agilent) untuk analisa karbohidrat (mono- , di-, polisakarida)

Setelah komponen dalam sampel berhasil dipisahkan, tahap selanjutnya adalah identifikasi. Hasil analisa HPLC brupa kromatogram. Dalam kromatogram akaan terdapat peak-peak yang mengambarkan banyak jenis komponen dalam sample. Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan meyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentreasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample dilakukan tahapan reperasi yang rumit. Saat ini HPLC atau KCKT merupakan cara pemisahan yang secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sample apada sejumlah bidang diantaranya : farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer, dan industri-industri makanan. F. Kesimpulan  HPLC atau High Performance Liquid Chromatography merupakan teknik pemisahan yang dilakukan berdasarkan sifat kepolaran masing-masing 

komponen dalam analit terhadap fase geraknya. Kegunaan umum HPLC untuk pemisahan sejumlah senyawa organic, anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidakmakmuran, analisis senyawa-senyawa mudah menguap, penentuan molekul-molekul netral,



amupun zwitter ion, dan lainnya. Analisa caffeine yang dilakukan harus terhindar dari adanya gelembunggelembung atau gas udara dalam penganalisaan dari awal hingga akhir



agar pembacaan detector tidak terganggu dan hasilnya tidak kacau. Read time caffeine dalam analisa ialah 4,57 menit dengan tinggi 141,514 mAu dan area 18,534 mAu*min

G. Daftar Pustaka Kasie Laboratorium Kimia Analitik Instrumen. Penuntun Praktikum KAI : High Performance Liquid Chromatography (HPLC). 2015. Palembang : Politeknik Negeri Sriwijaya. Ir. Muhammad Taufik, M.Si, dkk. Modul Kimia Analitik Instrumen. 2015. Palembang: Politeknik Negeri Sriwijaya