LAPORAN RESMI PRAKTIKUM 2

LAPORAN RESMI PRAKTIKUM FARMAKOLOGI EKSPERIMENTAL I ANALISIS OBAT DALAM CAIRAN HAYATI

 Nama Asisten: 1. Christine 2. Yolanda Disusun oleh: Golongan IV Kelompok V Kelas C  Nama

NIM

1. Viviane Annisa

FA/09287

2. Anita Kurniawati

FA/09317

3. Annisafia Rizky Damaskha

FA/09320

4. Pridiyanto

FA/09323

5. Mercy Arizona

FA/09326

LABORATORIUM FARMAKOLOGI DAN TOKSIKOLOGI YOGYAKARTA 2013

ANALISIS OBAT DALAM CAIRAN HAYATI

I.

TUJUAN

Agar mahasiswa dapat memahami langkah-langkah analisis obat dalam cairan hayati

II.

DASAR TEORI

Obat merupakan zat kimia, baik alami maupun sintetik yang mempunyai pengaruh atau dapat menimbulkan efek pada organisme hidup, baik efek psikologis, fisiologis maupun  biokimiawi. Kerja suatu obat merupakan hasil dari banyak proses yang didasari oleh suatu rangkaian reaksi. Rangkaian reaksi inilah yang dialami oleh obat dari mulai dikonsumsi hingga sampai ke reseptor dan akhirnya obat dalam bentuk aktifnya akan berinteraksi dengan reseptor  atau tempat aksi atau sel target

yang nantinya akan bisa memberikan efek biologis yang

diinginkan. Rangkaian reaksi ini dibagi menjadi tiga fase, yaiktu fase biofarmasetik, farmakodinamik, dan farmakokinetik. ( Mutschler, 1991) Fase biofarmasetik meliputi proses fabrikasi, pengaturan dosis, formulasi bentuk sediaan, hancurnya bentuk sediaan obat dan melarutnya bahan obat yang ditentukan oleh sifat-sifat galenik obat. Farmakodinamik merupakan ilmu yang mempelajari tentang cara kerja obat, efek  obat terhadap berbagai fungsi dalam organ, pengaruh obat terhadap reaksi kimia dan struktur  obat. Sedangkan farmakodinamik dapat diartikan sebagai pengaruh obat terhadap sel hidup. Fase ini berperan dalam menentukan seberapa besar efek obat dalam tubuh. Dan farmakokinetik  adalah ilmu yang mempelajari tentang absorpsi, distribusi, metabolisme, dan ekskresi obat atau dapat diartikan sebagai pengaruh tubuh terhadap obat. Pada fase ini obat mengalami proses absorpsi, distribusi, metabolisme, dan ekskresi yang berjalan secara langsung maupun tidak  langsung mengikuti perjalanan obat melintasi suatu membran sel. Farmakokinetik menentukan kecepatan mulai kerja obat, lama kerja dan intensitas efek obat. Di dalam permasalahan farmakokinetik dikenal juga dengan istilah parameter farmakokinetik, yaitu besaran yang diturunkan secara matematis dari hasil pengukuran kadar obat atau metabolitnya di dalam cairan hayati (darah, urin, saliva dan lainnya). Cairan hayati yang biasa digunakan untuk dianalisis kadar obat atau metabolitnya adalah cairan hayati yang berupa darah. Dipilih darah karena darah merupakan tumpuan proses absorbsi, distribusi,dan eliminasi. Artinya tanpa darah, obat tidak dapat menyebar ke lingkungan  badan dan dikeluarkan dari badan. Karena itu, logis bila adanya proses absorbsi dapat ditunjukkan dengan peningkatan kadar obat dalam darah dan adanya proses distribusi serta

eliminasi ditunjukkan dengan pengurangan kadar obat dalam darah. Dengan kata lain, besarnya obat yang ada dalam darah mencerminkan besarnya kadar obat di tempat absorbsi, distribusi, dan tempat eliminasi. Darah merupakan tempat dominan yang dilalui obat dan juga menjadi tempat yang paling cepat dicapai oleh obat. Berbeda dengan urin yang merupakan cairan hayati yang  biasanya digunakan dalam uji fase farmakokinetik untuk mempelajari disposisi suatu obat dan menentukan kadar suatu obat untuk obat-obatan yang dieksresikan lewat urin, minimal 10% nya terdapat dalam urin dalam bentuk utuh yang belum dimetabolisme. Untuk menilai farmakokinetik obat di dalam tubuh, pendekatan langsung yang paling baik  adalah dengan mengukur obat di dalam darah, serum atau plasma. Biasanya serum atau plasma diambil dari supernatan darah yang disentrifugasi dengan ditambahkan antikoagulan. Ada 3 jenis parameter farmakokinetik, yaitu parameter primer, sekunder, dan turunan. Parameter farmakokinetik primer meliputi kecepatan absorbsi, volume distribusi, dan klirens. Parameter farmakokinetik sekunder di antaranya waktu paro eliminasi dan kecepatan konstanta eliminasi, sedangkan parameter farmakokinetik turunan harganya tergantung dari dosis dan kecepatan pemberian obat. ( Donatus, 2008 ). Adapun penjelasan ketiga parameter tersebut adalah : 1. Parameter pokok  

Tetapan kecepatan absorbsi (Ka) Menggambarkan kecepatan absorbsi, yaitumasuknya obat ke dalam sirkulasi sistemik dari absorbsinya (saluran cerna padapemberian oral, jaringan otot  pada pemberian intramuskular).



Cl (Klirens) Klirens adalah volume darah yang dibersihkan dari kandungan obat persatuan waktu (Neal, 2006).



Volume distribusi (Vd) Volume distribusi adalah volume yang menunjukkan distribusi obat (Neal, 2006).

2. Parameter Sekunder  

1

Waktu paro eliminasi (t /2) Merupakan waktu yang dibutuhkan untuk mengubah jumlah obat di dalam tubuh menjadi seperdua selama eliminasi (atau selama infus yang konstan) (Katzung, 2001).



Tetapan kecepatan eliminasi ( Kel ) Kecepatan eliminasi adalah fraksi obat yang ada pada suatu waktu yang

akan tereliminasi dalam satu satuan waktu. Tetapan kecepatan eliminasi menunjukkan laju penurunan kadar obat setelah proses kinetik mencapai keseimbangan (Neal, 2006). 3. Parameter Turunan 

Waktu mencapai kadar puncak ( tmak )  Nilai ini menunjukkan kapan kadar obat dalam sirkulasi sistemik mencapai  puncak.



Kadar puncak (Cp mak) Kadar puncak adalah kadar tertinggi yang terukur dalam darah atau serum atau plasma.Nilai ini merupakan hasil dari proses absorbsi, distribusi dan eliminasi dengan pengertian bahwa pada saat kadar mencapai puncak proses proses tersebutberada dalam keadaan seimbang.



Luas daerah di bawah kurva kadar obat dalam sirkulasi sistemik vs waktu (AUC)  Nilai ini menggambarkan derajad absorbsi, yakni berapa banyak obat diabsorbsi dari sejumlah dosis yang diberikan. Area dibawah kurva konsentrasiobat-waktu (AUC) berguna sebagai ukuran dari jumlah total obat yang

utuh

tidak

berubah

yang

mencapai

sirkulasi

sistemik.

(Shargel dkk, 2005) Untuk mendapatkan nilai  –  nilai parameter farmakokinetik obat yang dapat dipercaya, metode penetapan kadar harus memenuhi berbagai kriteria, yaitu meliputi recovery (perolehan kembali), presisi, dan akurasi. Harga dari perolehan kembali didapat dari perhitungan:

        Perolehan kembali ini merupakan tolok ukur efisiensi analisis. Sedangkan inpresisi  penetapan kadar obat dapat dilihat dari kesalahan acak ( random analytical error ). Kesalahan acak atau disebut juga kesalahan tidak tergantung merupakan kesalahan yang nilainya tidak  dapat diramalkan dan tidak ada aturan yang mengaturnya serta nilainya berfluktuasi. (Gholib, I.G., dan Rohman, A., 2012). Nilai dari kesalahan acak dapat dicari dengan menggunakan rumus :

    ()   

Presisi menyatakan seberapa dekat nilai hasil dua kali atau lebih pengulangan pengukuran.

‐

Semakin dekat nilai nilai hasil pengulangan pengukuran maka semakin presisi pengukuran tersebut. Sedangkan inakurasi penetapan kadar dapat dilihat dari kesalahan sistematiknya yang dapat dihitung menggunakan rumus:

            

.

Kesalahan ini bisa berupa kesalahan konstan atau proporsional karena mempunyai nilai definitif ( nilai tertentu ) yang mana dapat menyebabkan hasil dari analisis tersebut mengarah ke arah yang lebih kecil atau ke arah yang lebih besar dari rata-rata. (Gholib, I.G., dan Rohman, A., 2012).

Akurasi atau bisa disebut dengan ketelitian sendiri dapat diartikan sebagai nilai

kedekatan hasil pengukuran dengan true value (nilai sesungguhnya). Dari hasil analisis diharapkan mendapat hasil perolehan kembali/recovery yang tinggi (75-90 % atau lebih), kesalahan acak dan kesalahan sistematiknya kurang dari 10 % ( Pachla dkk. , 1986). Maka dari itu, metode analisis kadar obat merupakan kunci utama kesahihan data farmakokinetik yang diperoleh. Sehingga sebelum melakukan studi, langkah awal yang harus dilakukan adalah menguji suatu metode analisis. Ada 4 parameter yang digunakan untuk menilai validitas

metode

analisis,

yaitu

selektivitas,

sensitivitas,

akurasi

dan

presisi.

(Ritschel,1992). Akan tetapi ada yang menyebutkan bahwa parameter yang digunakan untuk  menguji validitas suatu metode ada 6, yaitu selektivitas, sensitivitas, akurasi, presisi, kekasaran dan efisiensitas (praktis). (Gholib, I.G., dan Rohman, A., 2012) 1. Selektivitas Selektivitas suatu metode merupakan kemampuan suatu metode untuk membedakan suatu obat dari metabolitnya, obat lahir (dalam kasus tertentu yang berkaitan) dan kandungan endogen cuplikan hayati Artinya dalam penetapan kadar, metode tersebut tidak banyak  terpengaruh oleh adanya senyawa lain. (Gholib, I.G., dan Rohman, A., 2012). Selektivitas metode menempati prioritas utama karena bentuk obat yang akan ditetapkan dalam cuplikan hayati adalah dalam bentuk tak berubah atau metabolitnya. Metode analisis yang digunakan harus memiliki spesifitas yang tinggi terhadap salah satu obat yang akan ditetapkan tersebut. (Shargel, 1988). Apabila suatu metode tidak selektif berarti yang diukur adalah obat utuh dengan metabolitnya sehingga data kadar obat dalam spesimen hayati terjadap waktu tidak  menggambarkan keadaan yang sebenarnya tentang farmakokinetik kadar obat utuh pada tiap-tiap

waktu. Hal ini menyebabkan kesalahan pada nilai parameter farmakokinetik obat tersebut. ( Hakim, 2008)

2. Sensitivitas Sensitivitas suatu metode adalah kepekaan metode dalam menganalisis kadar terendah yang dapat dianalisis. Artinya metode harus dapat digunakan untuk menetapkan kadar senyawa dalam kensentrasi yang kecil misalnya pada penetapan kadar zat-zat racun, metabolit obat dalam  jaringan dan lain sebagainya. (Gholib, I.G., dan Rohman, A., 2012). Apabila suatu metode yang digunakan tidak sensitif, ada kemungkinan tidak terpantaunya kadar obat yang rendah selama  proses absorbsi dan eliminasi. Hal ini dapat menimbulkan kesalahan dalam penetapan model dan harga parameter farmakokinetik. ( Hakim, 2008). Perlu diperhatikan bahwa terdapat keterkaitan antara kespesifikan dan kepekaan suatu metode analisis. Dalam berbagai kasus,kespesifikan suatu metode dapat ditingkatkan dengan menurunkan kepekaan, karena dengan cara gangguan komponen lain dalam sampel dapat ditekan. Akan tetapi, penurunan kepekaan kadang-kadang mengakibatkan kekeliruan negative yang merugikan dalam analissi kualitatif. Oleh karena itu, sebelum memilih suatu metode, perlu dipertimbangkan dengan seksama manakah yang lebih dibutuhkan,kepekaan yang maksimum atau kespesifikan yang tinggi.

3. Ketelitian / akurasi Ketelitian / akurasi merupakan nilai kedekatan hasil pengukuran dengan true value (nilai sesungguhnya). Artinya metode sebisa mungkin harus dapat menghasilkan nilai rata  –  rata (mean) yang sangat dekat dengan nilai sebenarnya. (Gholib, I.G., dan Rohman, A., 2012). Ketelitian suatu metode dapat dilihat dari perbedaan antara harga penetapan kadar rata-rata dengan harga sebenarnya atau konsentrasi yang diketahui. Jika tidak ada data nilai sebenarnya atau nilai yang dianggap benar tersebut maka tidak mungkin untuk menentukan berapa akurasi  pengukuran tersebut. Nilai akurasi yang tinggi diperlukan dalam farmakokinetik agar kadar obat yang didapat benar-benar mampu menerangkan kadar yang sesungguhnya in vivo. ( Hakim, 2008)

4. Ketepatan / presisi Ketepatan / presisi menyatakan seberapa dekat nilai hasil dua kali atau lebih pengulangan  pengukuran. Artinya metode sedapat mungkin menghasilkan suatu hasil analisis yang sama atau hampir sama dalam satu seri pengukuran. (Gholib, I.G., dan Rohman, A., 2012). Ukuran presisi yang lazim digunakan adalah ketidaktelitian (impecision) yang biasanya dinyatakan sebagai koefisien variasi pengukuran. Di dalam kimia analisis, koefisien variasi ini sering disebut sebagai

kesalahan acak. ( Hakim, 2008). Dalam hal ketepatan ini ada 2 istilah yang sering digunakan, yaitu : a. Keterulangan (repeatibility), yaitu ketepatan pada kondisi percobaan yang sama (berulang), baik orangnya maupun alat, tempat dan waktunya.  b. Ketertiruan (reproducibility), yaitu ketepatan pada kondisi percobaan yang berbeda pada orangnya maupun waktu, tempat dan alatnya. (Mursyidi, Achmad dan Rohman, Abdul , Editor. 2006)

5. Kekasaran /rugged dan efisiensitas /praktis Artinya adanya perubahan komposisi pelarut atau variasi lingkungan tidak menyebabkan  perubahan hasil analisis. Sedangkan praktis berarti metode tersebut mudah dikerjakan, tidak  memerlukan banyak waktu dan biaya. Syarat ini diperlukan karena banyak senyawa yang tidak  stabil apabila waktu penetapan terlalu lama. (Gholib, I.G., dan Rohman, A., 2012)

III.

CARA PERCOBAAN

A. Alat dan Bahan Alat :

1. Labu takar 5 mL 2. Pipet volume 0,5 dan 1 mL 3. Tabung reaksi / flakon 4. Ependorf  5. Pipet ukur 5 mL 6. Pipet biasa 7. Mikropipet 8. Blue tip dan yellow tip 9. Skalpet / silet 10. Pipa kapiler  11. Sentrifuge dan stopwatch 12. Spektrofotometer UV dan kuvet 13. Vortex 14. Propipet 15. Injeksi 16. Stakeholder  17. Timbangan

Bahan :

1. Darah tikus 2. Heparin 3.  Natrium nitrit 0,1 % 4. Amonium sulfamat 0,5 % 5. Asam trikloroasetat (TCA) 5 % 6.  N(1-Naftil) etilendiamin 0,1 % 7. Sulfametoksasol 1 mg / mL

B. Cara Kerja 1. Pembuatan kurva baku internal Dimasukkan zat antikoagulan heparin pada setiap ependorf 

Dimasukkan darah tikus ke dalam ependorf tersebut ±2 ml

Dimasukkan darah tikus ke dalam 6 tabung reaksi @ 250 µL

Dimasukkan sulfadiazin dengan kadar 0 µg/mL ,25 µg/mL,50 µg/mL,100 µg/mL,200 µg/mL dan 400 µg/mL ke dalam 6 tabung reaksi berisi darah tersebut

Ditambahkan ke dalam tiap tabung reaksi 2 mL TCA 5%, vortex selama 10 detik 

Sentrifugasi selama 5 menit (2500 rpm)

Diambil 1,5 mL supernatan, diencerkan dengan 2 mL aquadest

Ditambahkan 0,1 mL larutan NaNO2 0,1 %, didiamkan 3 menit,dan divortexing

Ditambahkan 0,2 mL larutan Ammonium sulfamat 0,5 %, didiamkan selama 2 menit, dan divortexing

Ditambahkan 0,2 mL larutan N(1-naftil) etilendiamin 0,1 %, dicampur baik-baik, didiamkan 5menit di tempat gelap

Diukur absorbansi dengan panjang gelombang 545 nm

Dihitung kadar sulfadiazin terukur dengan persamaan kurva baku yang telah ditentukan

2. Pembuatan validasi Dimasukkan zat antikoagulan heparin pada setiap ependorf 

Dimasukkan darah tikus ke dalam ependorf tersebut ±2 ml

Dimasukkan darah tikus ke dalam 6 tabung reaksi @ 250 µL

Dimasukkan sulfadiazin dengan kadar 50 dan 300 µg/mL ke dalam 6 tabung reaksi berisi darah tersebut, 3 tabung reaksi untuk tiap konsentrasi sulfadiazin

Ditambahkan ke dalam tiap tabung reaksi 2 mL TCA 5%, vortex selama 10 detik 

Sentrifugasi selama 5 menit (2500 rpm)

Diambil 1,5 mL supernatan, diencerkan dengan 2 mL aquadest

Ditambahkan 0,1 mL larutan NaNO2 0,1 %, didiamkan 3 menit,dan divortexing

Ditambahkan 0,2 mL larutan Ammonium sulfamat 0,5 %, didiamkan selama 2 menit, dan divortexing

Ditambahkan 0,2 mL larutan N(1-naftil) etilendiamin 0,1 %, dicampur baik-baik, didiamkan 5menit di tempat gelap

Diukur absorbansi dengan panjang gelombang 545 nm

Dihitung kadar sulfadiazin terukur dengan persamaan kurva baku yang telah ditentukan

3. Pemrosesan sampel darah invivo (Penetapan Kadar) Ditimbang tikus

Dihitung volume pemberian sulfametoktasol

Ditunggu selama ± 1 jam

Sambil menunggu, diteteskan heparin ke dalam ependorf secukupnya

Jika sudah sejam, tikus dimasukkan ke dalam kurungan tikus

Diambil darah tikus melalui vena ekor dengan cara disayat memakai skalpel/silet yang sebelumnya bulu-bulu tikus sudah dibersihkan terlebih dahulu

Darah ditampung dalam ependorf hingga volumenya ± 1,5 ml yang kemudian dibagi ke dalam 35 tabung reaksi @ 250 μL dan diberi perlakuan yang sama pada tiap tabung

Ke dalam 250 μL darah yang mengandung antikoagulan (heparin) ditambah 250 μL aquades

dicampur homogen

ditambah 2,0 mL TCA 5% dengan mikropipet dan divortexing

dipusingkan selama 5 menit (2500 rpm) dengan sentrifugasi

diambil beningan (1,50 mL) dan diencerkan dengan aquades 2,0 mL

ke dalam tiap tabung ditambahkan larutan NaNO2 (0,1 mL; 0,1%), didiamkan selama 3 menit

ditambahkan larutan ammonium sulfamat (0.2 mL ; 0,5 %), diamkan selama 2 menit

ditambahkan larutan N(1-naftil) etilendiain (0,2 mL; 0,1 %), dicampur baik-baik, didiamkan 5 menit ditempat gelap

dipindahkan larutan ke dalam kuvet dan dibaca intensitas warna pada spektrofotometer (545 nm) terhadap blanko darah (sebagai kontrol) yang telah diproses dengan cara yang sama

IV.

DATA PERCOBAAN DAN PERHITUNGAN



Data Absorbansi Sampel Darah (Kurva Baku)

Data Sampel

Kadar Obat (g/ml)

Darah Tikus

Absorbansi

Kurva Baku (y=bx+a)

25

0,006

50

0,000*

a = -0,0120

100

0,036

b =5,5850.10-

200

0,104

r =0,9980

400

0,211

y =5,5850.10- x - 0,0120

Keterangan : λ = 545 nm * data direject 

Data Absorbansi Sampel Darah (Validasi)

Data Sampel

Absorbansi

Kadar (μg/ml) Replikasi I

Darah Tikus

Replikasi II Replikasi III

50

0,104

0,104

0,100

300

0,182

0,200

0,198



Data Absorbansi Sampel Darah (Penetapan Kadar)

Absorbansi Replikasi III

Kelompok 

Replikasi I

Replikasi II

I

0,218

0,199

0,231

0,188

II

0,136

0,134

0,147

0,144

0,130

III

0,183

0,217

0,226

IV

0,118

0,102

0,107

0,122

0,132

Replikasi IV

Keterangan : warna oranye menunjukkan data kelompok praktikan 

Berat Sampel Bobot wadah + tikus = 369,50 gram Bobot wadah kosong = 249,00 gram Bobot tikus = 120,50 gram



Volume pemberian, dosis sulfametoksazol= 10/200 gram BB

               

Volume Pemberian=



Perhitungan Larutan Stok 

V1.M1 = V2.M2 Keterangan: V1 = Volume sulfametoksazol yang diambil (ml) V2 = Volume labu takar (ml) M1 = Konsentrasi/kadar sulfametoksazol stok (g/ml) M2 = Konsentrasi/kadar yang diinginkan (g/ml) Kadar stok sulfametoksasol= 1 mg/ml = 1000 g/ml

Replikasi V

a. Kadar 25 g/ml V1.M1

= V2.M2

V1. 1000 g/ml

= 10 ml. 25 g/ml

V1

= 0,25 ml = 250 l

 b. Kadar 50 g/ml V1.M1

= V2.M2

V1. 1000 g/ml

= 10 ml. 50 g/ml

V1

= 0,5 ml = 500 l

c. Kadar 100 g/ml V1.M1

= V2.M2

V1. 1000 g/ml

= 10 ml. 100 g/ml

V1

= 1 ml = 1000 l

d. Kadar 200 g/ml V1.M1

= V2.M2

V1. 1000 g/ml

= 10 ml. 200 g/ml

V1

= 2 ml = 2000 l

e. Kadar 400 g/ml



V1.M1

= V2.M2

V1. 1000 g/ml

= 10 ml. 400 g/ml

V1

= 4 ml = 4000 l

Pengenceran validasi

a. Kadar 50 g/ml V1.M1

= V2.M2

V1. 1000 g/ml

= 5 ml. 50 g/ml

V1

= 0,25 ml = 250 l

 b. Kadar 300 g/ml



V1.M1

= V2.M2

V1. 1000 g/ml

= 5 ml. 300 g/ml

V1

= 1,5 ml = 1500 l

Perhitungan kadar sufametoksazol dalam sampel darah tikus (validasi metode) -4

Kurva Baku : y = 5,5850.10 x - 0,0120

A.

Kadar 50 g/ml

Replikasi 1 :

y = 0,104

0,104 = 5,5850.10-4x - 0,0120 = 5,5850.10-4x

0,116 x Replikasi 2 :

= 207,699 g/ml y = 0,104 -4

0,104 = 5,5850.10 x - 0,0120 0,116 = 5,5850.10-4x x Replikasi 3 :

= 207,699 g/ml y = 0,100 = 5,5850.10 x - 0,0120

0,112

= 5,5850.10-4x

x



 



 

-4

0,100

= 200,537 g/ml

() = 205,311 g/ml  () = 4,13498 SD = √    Kesalahan Acak =   X 100 %  x 100 % = 2,014 % =    X 100 % Perolehan Kembali =    x 100 % = 415,398 % Replikasi 1 =   x 100 % = 415,398 % Replikasi 2 =   x 100 % = 401,074 % Replikasi 3 =  (4153 4153 40104 ) = 410,623 % Rata-rata recovery =  Rata-rata kadar =

Kesalahan sistemik = 100% - Recorvery

Replikasi 1 = 100% - 415,398 % = - 315,398 % Replikasi 2 = 100% - 415,398 % = - 315,398 % Replikasi 3 = 100% - 401,074 % = - 301,074 % 

Rata-rata kesalahan sistemik =

( 3153  3153  30104 ) 

= - 310,623 %

B. Kadar 300 g/ml Replikasi 1 : y = 0,182 0,182 = 5,5850.10-4x - 0,0120 0,194 = 5,5850.10-4x x = 347,359 g/ml Replikasi 2 : y = 0,200 -4

0,200 = 5,5850.10 x - 0,0120 0,212 = 5,5850.10-4x x

= 379,588 g/ml

Replikasi 3 : y = 0,198 -4

0,198 = 5,5850.10 x - 0,0120 0,21 x

= 5,5850.10-4x = 376,007 g/ml

() = 367,651 g/ml  () = 17,6647  SD = √     Kesalahan Acak =   X 100 %  x 100 % = 4,8047 % =    X 100 %  Perolehan Kembali =    x 100 % = 115,786 % Replikasi 1 =   x 100 % = 126,529 % Replikasi 2 =   x 100 % = 125,335 % Replikasi 3 =  ( ) = 122,55 %  Rata-rata recorvery =  



Rata-rata kadar =

Kesalahan sistemik = 100% - Recorvery

Replikasi 1 = 100% - 115,786 % = - 15,786 % Replikasi 2 = 100% - 126,529 % = - 26,529 % Replikasi 3 = 100% - 125,335 % = - 25,335 % 

Rata-rata kesalahan sistemik =

(     ) 

= -22,55 %



Perhitungan Kadar Sampel Darah Tikus (Penetapan Kadar) -4

Kurva baku : y = 5,5850.10 x – 0,0120 Digunakan kadar sulfametoksazol= 1000 µg/ml

Replikasi 1  y = 0,183 0,183 = 5,5850.10-4x – 0,0120 0,1465 = 5,5850.10-4x x = 349,15 g/ml Replikasi 2  y = 0,217 0,217 = 5,5850.10-4x – 0,0120 -4

0,229 = 5,5850.10 x x = 410,027 g/ml Replikasi 3  y = 0,226 0,226 = 5,5850.10-4x – 0,0120 -4

0,238 = 5,5850.10 x x = 426,141 g/ml Kadar Rata-Rata = (349,15 + 410,027 + 426,141) g/ml

3 = 395,106 g/ml SD = 40,606 Kesalahan Acak  =

 x 100% = 10,277% 

Perolehan Kembali (Recovery) = kadar terukur x 100%

kadar diketahui Replikasi 1 = 349,15 x 100% = 34,915 % 1000 Replikasi 2 = 410,027 x 100% = 41,0027% 1000 Replikasi 3 = 426,141 x 100% = 42,6141% 1000 Rata-Rata Recovery = (34,915 %+ 41,0027%+ 42,6141%) = 39,5106 %

3

Kesalahan Sistemik  = 100% - recovery

Replikasi 1 = 100% - 34,915% = 65,085% Replikasi 2 = 100% - 41,0027% = 58,9973% Replikasi 3 = 100% - 42,6141%= 57,3859% Rata-rata kesalahan sistemik  = 65,085% + 58,9973% + 57,3859%

3 = 60,4894%

Kurva Baku Sulfametoksazol dalam Darah Tikus 0.25 y = 0.0006x - 0.0120 R² = 0.996

0.2    i    s 0.15    n    a     b    r    o    s     b    A 0.1

0.211

Y-Values

0.104

Linear (Y-Values)

0.05 0.036 0.006

0 0

100

200

300

400

500

Kadar (µg/ml)

IV.

PEMBAHASAN

Percobaan ini bertujuan agar mahasiswa dapat memahami langkah-langkah analisis obat dalam cairan hayati. Obat yang dianalisis dalam praktikum kali ini adalah sulfametoksazol dengan menggunakan metode Bratton-Marshall. Metode Bratton-marshall merupakan cara umum untuk penetapan kadar senyawa yang mempunyai amina aromatis primer. Analisis dalam percobaan ini bertujuan untuk menguji seberapa besar ketepatan dan ketelitian metode yang digunakan. Beberapa parameter farmakokinetik yang digunakan adalah recovery,kesalahan sistematik sebagai parameter ketelitian (presisi) serta perhitungan standar  deviasi (SD), dan kesalahan acak (CV) sebagai parameter ketepatan (akurasi). Parameter  farmakokinetik ini merupakan besaran yang diturunkan secara metematis dari hasil pengukuran kadar obat atau metabolitnya dalam darah atau urin. Analisis ini dilakukan dengan membuat seri

kadar obat tertentu dalam darah dan urin yang kemudian diproses lebih lanjut sehingga dapat dibaca absorbansinya dan dibuat kurva bakunya. Cairan hayati yang digunakan dapat berupa sampel urin,darah, atau saliva, akan tetatpi dalam percobaan ini menggunakan darah sebagai sampel. Digunakan darah karena darah merupakan tempat yang paling cepat dicapai dan dominan dilalui obat dalam proses absorpsi dan distribusi baik ke jaringan target maupun ke organ eliminasi, sehingga kadar obat di dalam sirkulasi sistemik ini paling mencerminkan kadar obat sebenarnya di dalam tubuh diantara cairan hayati yang lain. Proses absorbsi ditunjukkan dengan adanya peningkatan kadar obat dalam darah, sedangkan proses distribusi dan eliminasi ditunjukkan dengan adanya penurunan kadar  obat dalam darah pada waktu tertentu. Urin merupakan cairan hayati yang sering digunakan dalam analisis farmakokinetik untuk mempelajari disosiasi obat dan untuk menentukan kadar  obat. Digunakan data urin apabila tidak mungkin menganalisis dengan data darah dan jika level darah pada pemberian dosis normal sangat rendah dan tidak ada metode penetapan kadar obat dalam darah yang tersedia. Obat

yang

dianalisis

dalam

praktikum

ini

ialah

sulfametoksazol.

Struktur 

sulfametoksazol :

RM

: C10H11 N3O3S

BM

: 253,28

 Nama lain

: N1-(5-metil-3-isoksazolil)sulfanilamida

Khasiat

: Antibakteri

Kegunaan

: Sebagai sampel dalam percobaan

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik  Pemerian

: Serbuk hablur, putih sampai hampir putih; praktis tidak berbau.

Kelarutan

:Praktis tidak larut dalam air, dalam eter dan dalam kloroform; mudah larut dalam

aseton dan dalam larutan natrium hidroksida encer; agak sukar larut dalam etanol (Anonim, 1995) Mekanisme Kerja Sulfonamida yang analog struktural dan antagonis kompetitif dari para aminobenzoic acid  (PABA). Mereka menghambat pemanfaatan bakteri normal PABA untuk  sintesis asam folat , suatu metabolit penting dalam sintesis DNA. Para efek terlihat biasanya  bakteriostatik di alam. Asam folat tidak disintesis pada manusia, tetapi bukan merupakan

 persyaratan diet. Hal ini memungkinkan untuk toksisitas selektif untuk sel-sel bakteri (atau setiap sel tergantung pada sintesis asam folat) atas sel-sel manusia. Resistensi bakteri terhadap sulfametoksazol disebabkan oleh mutasi pada enzim asam folat yang menghambat PABA dari sintesis asam folat mengikat dan blok. (Anonim, 2011) Yang paling umum efek samping dari sulfametoksazol / trimetoprim adalah gangguan  pencernaan. Alergi terhadap sulfa berbasis obat biasanya menyebabkan ruam kulit, gatal-gatal, atau kesulitan bernapas atau menelan dan penghentian surat perintah langsung dari pengobatan dan kontak dengan dokter segera. Sulfametoksazol / trimetoprim juga dikenal untuk  meningkatkan konsentrasi darah obat warfarin (US nama merek: Coumadin). dan dapat menyebabkan peningkatan tak terduga dalam waktu pembekuan dan perdarahan yang tidak  terkontrol Neutropenia dan trombositopenia juga efek samping jarang terjadi akan dimonitor jika  pasien ditempatkan pada terapi jangka panjang. Sulfametoksazol juga merupakan sindrom Stevens-Johnson (SJS) menginduksi substansi. Sulfametoksazol juga dapat menyebabkan mual,  perut yang parah,

atau

nyeri perut. Sakit

kepala

umumnya

terjadi saat mengambil

sulfametoksazol. Nyeri otot kadang-kadang terjadi saat mengambil obat ini. Jika gejalanya menetap, salah satu harus menghubungi nya / dokternya. Jika kesulitan bernapas atau  pembengkakan pada wajah, mulut, atau lidah terjadi, orang harus menghentikan obat dan mendapatkan bantuan medis darurat. Ini sering gejala-gejala reaksi alergi yang parah. Sulfametoksazol/trimethoprim dapat menyebabkan anemia megaloblastik pada beberapa pasien karena merupakan antagonis folat. (Anonim, 2011) Sulfametoksazol merupakan derivat dari Sulfisoxasol yang mempunyai absorbsi dan ekskresi yang lebih lambat. Bersifat tidak larut dalam air, tetapi larut dalam NaOH encer. Dari sifat-sifat itu, larutan obat ini dibuat dengan melarutkan terlebih dahulu SMZ dalam NaOH kemudian diencerkan dengan menggunakan aquadest hingga konsentrasi yang dikehendaki. Obat ini biasa digunakan dalam bentuk sediaan tablet, injeksi, suspensi, tetes mata, dan salep mata. Waktu paruh plasma Sulfametoksazol adalah 11 jam. Sulfametoksazol: absorbsi dalam saluran cerna cepat dan sempurna dan ± 20 G terikat oleh  protein plasma. Dalam darah, 10-20 obat terdapat dalam bentuk terasetilasi. Kadar plasma tertinggi dicapai dalam 4 jam setelah pemberian secara oral, dengan waktu paro 10-12 jam. Dosis oral awal 2 g diikuti lagi 2-3 dd sampai infeksi terjadi. Metode yang digunakan dalam praktikum kali ini ialah metode Bratton-Marshall. Metode ini didasarkan pada prinsip kolorimetri yaitu terbentuknya senyawa berwarna yang intensitasnya dapat ditentukan secara spektrofotometri visibel. Metode ini melalui 3 tahap yaitu : 1. Pembentukan Senyawa Diazo

Salah satu syarat reaksi diazotasi adalah senyawa harus memiliki gugus amina aromatik   primer. Sulfametoksazol memiliki struktur standar amina aromatik primer, sehingga reaksi diazotasi dapat berlangsung. Dengan reaksi sebagai berikut: +

 NaNO2 TCA

 N +

+ H2O

(garam diazonum dari sulfametoksazol) 2. Penghilangan sisa asam nitrit dengan penambahan asam sulfamat Pada proses terbentuknya garam diazonium yang dihasilkan dari reaksi antara amina aromatik primer dengan asam Nitrit (HNO2) yang berasal dari natrium nitrit, pada tahap ini terjadi kelebihan asam nitrit yang harus di hilangkan dengan penambahan asam sulfamat, karena kalau tidak dihilangkan, senyawa yang sudah berwarna akan dirusak (dioksidasi) oleh asam nitrit sehingga kembali lagi menjadi tidak berwarna. Reaksi penghilangan sisa asam nitrit sebagai  berikut: HNO2 + HSO3 NH2

N2 + H2SO4 + H2O

3. Pengkoplingan garam diazonium-NED Pada proses ini, garam diazonium yang sudah terbentuk segera direaksikan dengan reagen kopling membentuk senyawa kopling yang memiliki gugus kromofor yang lebih panjang sehingga dapat dideteksi oleh spektrofotometri UV-Vis. Reagen kopling yang khas dalam metode Bratton-Marshall adalah N-(1-Naftil) etilen diamin (NED).Dengan demikian pergeseran  bathokromik sehingga λ lebih panjang, sementara intensitas warnanya lebih tajam. Hasilnya senyawa menjadi lebih mudah dideteksi oleh spektrofotometri UV-Vis. Pada praktikum kali ini dilakukan pembagian tugas , yaitu satu mahasiswa sebagai  perwakilan pembuatan kurva baku sulfometoksazol, tiga mahasiswa untuk penetapan kadar, dan satu mahasiswa melakukan validasi. Untuk validasi dan pembuatan kurva baku,pengambilan darah hewan uji melalui mata tikus dilakukan oleh kakak laboran. Pengambilan darah dari vena ocularis pada mata tikus menggunakan pipa kapiler yang dimasukkan kedalam bagian bawah kelopak mata dengan sedikit

 pemutaran untuk melancarkan aliran darah. Kemudian darah ditampung pada eppendorf  yang sudah diberi heparin. Heparin (dari bahasa Yunani Kuno ηπαρ (hepar), hati), juga dikenal sebagai heparin tak  terpecah, yang

sangat-sulfat glikosaminoglikan,

secara

luas

digunakan

sebagai

injeksi antikoagulan, dan memiliki tertinggi negatif densitas muatan dari setiap dikenal molekul  biologis. Ini juga dapat digunakan untuk membentuk permukaan antikoagulan dalam pada  peralatan eksperimen dan berbagai medis seperti tabung tes dan dialisis ginjal mesin. Heparin mempunyai struktur sebagai berikut :

Gambar 1. Struktur Heparin Meskipun digunakan terutama dalam pengobatan untuk antikoagulasi, peran fisiologis yang benar di dalam tubuh masih belum jelas, karena darah anti-koagulasi dicapai kebanyakan oleh heparan sulfat proteoglikan yang berasal dari endotel sel. Heparin biasanya disimpan dalam  butiran yang keluar dari sel mast dan dirilis hanya ke dalam pembuluh darahdi situs dari cedera  jaringan. Telah diusulkan bahwa, daripada antikoagulasi, tujuan utama dari heparin adalah  pertahanan di situs tersebut terhadap bakteri dan benda asing lainnya. Selain itu, dilestarikan di sejumlah spesies yang sangat berbeda, termasuk beberapa invertebrata yang tidak memiliki sistem pembekuan darah yang sama. (Anonim, 2011) Heparin merupakan anti koagulansia langsung yang mengandung gugus karboksil dan sisa sulfat, sehingga heparin merupakan salah satu asam terkuat dalam tubuh. Heparin bekerja dengan menghambat pembekuan darah yang kerjanya tergantung adanya anti-trombin III (suatu 2-globulin dan kofaktor dari heparin dan memperkuat kerja heparin) sehingga membentuk  kompleks heparin-antitrombin yang mampu mengaktifkan faktor-faktor IXa, Xa, Xia, XIIa sehingga menghambat pembentukan trombin. Pada konsentrasi tinggi heparin menghambat juga agregrasi trombosit. Secara ringkasnya, heparin mempunyai sifat antikoagulan dengan menghambat pengubahan protrombin menjadi trombin dengan proses penggumpalan darah. Heparin + Antitrombin III + Faktor Penggumpalan

kompleks(I)

kompleks Protrombin

x

Trombin

2+

Ca

Apabila sampel darah mengalami koagulasi, maka ketika dilakukan proses sentrifuge yang akan keluar adalah serum bukan plasma darah. Padahal yang dimaksudkan untuk  digunakan sebagai sampel hayati dalam percobaan ini adalah plasma darah, karena sulfadiazin akan berikatan dengan protein plasma membentuk kompleks obat makromolekul yang disebut kompleks obat-protein. Heparin dapat mencegah koagulasi darah selama 3-4 jam. Heparin  bereaksi dengan mengikat antitrombin III membentuk kompleks, yang berafinitas lebih besar  terhadap beberapa faktor pembekuan darah, darpada antitrombin itu sendiri. Heparin juga menginktivasi faktor IIIa (AHg) dan mencegah terbentuknya fibrin yang stabil, sehingga heparin dapat mempecepat inaktivasi faktor pembekuan darah. Pembuatan seri kadar larutan baku (stok) sulfametoksazol dengan cara mengencerkan stok larutan sulfametoksazol 1,0 mg/ml menggunakan pelarut aquadest dengan labu takar 5,0 ml. Sehingga didapatkan konsentrasi sulfametoksazol: 25; 50; 100; 200; 400 µg/ml. Untuk blanko digunakan aquadest. Penggunaan blanko bertujuan untuk mengoreksi aborbansi senyawa yang terbentuk. Pembuatan kurva baku bertujuan untuk menghitung persamaan regresi linier hubungan kadar sulfametoksazol pada sampel darah tikus. Pembuatan validasi kurva baku membutuhkan 6 sampel darah yang telah dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Lima dari sampel darah tersebut ditambahkan sulfametoksazol sebanyak 250 µl dengan kadar yang berbeda untuk tiap tabung reaksi. Satu sampel darah yang tersisa ditambahkan 250 µl aquadest sebagai blanko dalam  perhitungan absorbansi. Ke dalam tiap tabung reaksi ditambahkan 2 ml TCA 5 % dan kemudian divortex selama 30 detik agar terbentuk cmpuran yang homogen. TCA merupakan asam organik yang sangat kuat, dimana di dalam 0,1 M larutan ini mempunyai pH sebesar 1,2. TCA dapat dibuat dengan oksidasi kloralhidrat dan asam nitrit. TCA mempunyai fungsi sebagai pemberi suasana asam, sehingga dapat menghentikan kerja enzim  pemetabolisme obat sekaligus menyebabkan denaturasi protein plasma tanpa memecah protein menjadi asam amino penyusunnya. Dengan demikian, protein yang terdapat dalam darah akan mengedap dan memisah dengan plasma darah. Adanya suasana asam pada larutan juga akan mendukung terjadinya proses diazotasi sehingga nantinya akan didapatkan gambaran konsentrasi sulfametoksazol sebenarnya. Campuran darah dan larutan sulfametoksazol disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Sentrifugasi ini bertujuan untuk memisahkan endapan protein dengan supernatan yang mengandung sejumlah sulfametoksazol yang tidak ikut mengendap bersama

 protein. Supernatan yang dihasilkan diambil sebanyak 1,5 ml dan dipindahkan ke tabung reaksi yang lain untuk selanjutnya diencerkan dengan 2 ml aquades dan divortex selama 30 detik. Selanjutnya dilakukan penambahan 0,1 ml NaNO2 0,1 %, divortex, dan didiamkan selama 3 menit untuk menyempurnakan reaksi diazotasi, yaitu pembentukan garam diazonium yang sangat reaktif. NaNO2 bersifat sebagai oksidator , maka asam nitrit yang terbentuk tidak   boleh berlebih. Setelah ditambah NaNO2, dilanjutkan dengan penambahan Ammonium Sulfamat 0,5 % sebanyak 0,2 ml. Kemudian larutan divortex dan didiamkan selama 2 menit. Penambahan ammonium sulfamat bertujuan untuk menghilangkan kelebihan asam nitrit yang terbentuk. Pada  penambahannya

harus dilakukan dengan berhati-hati untuk menghindari pembentukan

gelembung gas yang sangat banyak. Ammonium sulfamat merupakan reduktor sehingga akan  bereaksi redoks dengan asam nitrit. Hilangnya kelebihan nitrit ditandai dengan tidak a danya gas nitrogen lagi, yaitu dapat diamati dengan hilangnya gelembung gas dalam larutan. Selanjutnya ditambah NED 0,1 % sebanyak 0,2 ml. Vortex dan diamkan selama 5 menit di tempat gelap. Penambahan NED membuat garam diazonium kembali terionkan sehingga terjadi reaksi pengkoplingan antara garam diazonium dengan NED sehingga terbentuk  sulfametoksazol (semula tidak berwarna menjadi senyawa berwarna) dan serapannya bisa dibaca  pada λ 545 nm. Dari data berupa kadar sulfametoksazol yang digunakan dan nilai absorbansi yang dihasilkan yaitu absorbansi 0,006 untuk kadar 25 µg/ml;0,000 untuk kadar 50 µg/ml(direject) ; 0,036 untuk kadar 100; 0,104 untuk kadar 200 µg/ml ; dan 0,211 untuk kadar 400 µg/ml. dari hasil tersebut dapat ditentukan persamaan kurva baku yang digunakan dalam langkah selanjutnya,

yaitu

perhitungan

validasi.

Dari

perhitungan

regresi

linier

konsentrasi

sulfametoksazol vs absorbansi, didapatkan persamaan kurva baku: Untuk sampel darah tikus y =5,5850.10-4x - 0,0120 Perhitungan validasi sulfometoksazol dilakukan dengan langkah kerja yang hampir  sama dengan langkah kerja dalam penentuan kurva baku. Yang membedakan keduanya adalah konsentrasi sulfametoksazol yang digunakan, yaitu 50 µg/ml; dan 300 µg/ml. Pada validasi, dilakukan replikasi sebanyak dua kali untuk masing masing konsentrasi sulfametoksazol sehingga diperoleh data akhir sebanyak enam data, yaitu untuk kadar 50µg/ml di dapat absorbansi 0,104; 0,104; 0,100, sedangkan untuk kadar 300 µg/ml didapat data absorbansi 0,182; 0,200 ; 0,198. Pada penetapan kadar , sampel darah diambil secara invivo. Invivo yaitu ujian secara  biologis menggunakan hewan coba untuk membantu menjalakan penelitian-penalitian yang tidak   bisa secara langsung dilakukan dalam tubuh manusia dengan asumsi semua jaringan, sel-sel

 penyusun tubuh, serta enzim-enzim ada dalam tubuh hewan coba tersebut memiliki kesamaan dengan manusia. ( Anonim, 2011) Hal yang pertama dilakukan adalah melakukan penimbangan terhadap hewan uji, dalam hal ini adalah tikus,dimana mendapatkan berat tikus 120,5 gram. Selanjutnya dilakukan  penghitungan volume dosis obat ,didapatkan hasil 0,6025 ml dan dilakuakan pemberian obat secara peroral sesuai dosis kepada hewan uji. Hewan uji kemudian didiamkan selama satu jam supaya terjadi absorbsi obat sehingga sulfametoksazol dalam darah dapat diukur. Pengambilan darah hewan uji seharusnya dilakukan melalui ekor dengan cara meletakkan hewan uji ke dalam holder, akan tetapi karena darah dari ekor tikus tidak mau menetes, maka dilakukan pengambilan sampel darah melalui mata tikus. Darah diamabil dari vena ocularis pada mata tikus (Rattus Novergicus/mus muculus bacterianus) Pengambilan darah melalui mata tikus dilakukan oleh kakak laboran dikarnakan mahasiswa belum berpengalaman untuk mengambil sediaan hayati. Pengambilan darah dari vena ocularis pada mata tikus menggunakan pipa kapiler yang dimasukkan kedalam bagian bawah kelopak mata dengan sedikit  pemutaran untuk melancarkan aliran darah. Kemudian darah ditampung pada eppendorf  yang sudah diberi heparin. Dikarenakan sampel darah hanya sedikit, darah tikus dibagi ke dalam tiga tabung reaksi saja dengan masing masing tabung reaksi berisi 250 μL sampel darah. Sampel tersebut masing masing kemudian ditambah 250 μL akuades kemudian dihomogenkan dengan fortex. Langkah selanjutnya hingga pembacaan absorbansi adalah sama dengan penetapan kurva baku dan validasi. Dalam penetapan kadar didapatkan hasil absorbansi 0,183 ; 0,217; dan 0,226 Data berupa absorbansi dapat digunakan untuk perhitungan kadar sulfametoksazol yang terlarut dalam supernatan, dengan menggunakan persamaan kurva baku yang telah ditetapkan. Pada penetapan kadar sulfometoksazol didapatkan kadar 395,106 g/mlpada percobaan pertama, 410,027 g/mlpada replikasi pertama dan 349,15 g/ml pada replikasi kedua. Kemudian nilai absorbansi pada validasi diplotkan ke dalam kurva baku tersebut, sehingga di dapat kadar. Selanjutnya dapat dihitung beberapa parameter statistika yaitu recovery, kesalahan sistematik, dan kesalahan acaknya. Nilai Perolehan Kembali / Recovery 

Semakin tinggi nilai recovery maka semakin tinggi akurasi dan efisiensi analisis.  Recovery yang baik berada dalam rentang kadar 75 –  90%. Harga recovery tiap sampel hayati sebagai berikut: Sampel darah tikus Replikasi 1 = 349,15 x 100% = 34,915 % 1000

Replikasi 2 = 410,027 x 100% = 41,0027% 1000 Replikasi 3 = 426,141 x 100% = 42,6141% 1000 Rata-Rata Recovery = (34,915 %+ 41,0027%+ 42,6141%) = 39,5106 %

3 Dari hasil tersebut tidak ada satupun hasil recovery yang memenuhi syarat. Untuk harga recovery yang kurang dari 100 % dapat disebabkan : 

senyawa endogen atau metabolit yang ikut terukur. Kemungkinan disebabkan karena terdapat molekul-molekul pengganggu atau protein dalam darah yang dapat menurunkan nilai absorbansi

 

ketidaktelitian praktikan dalam penambahan analit ataupun larutan pereaksi  perbedaan dalam penentuan operating time sehingga pembacaan absorbansi pada pembuatan kurva baku dan pembacaan pada percobaan tidak sama selang waktunya.



Pengambilan supernatan yang tidak tepat



Kondisi diazotasi yang belum sempurna, karena kondisi keasaman ataupun suhu yang terlalu tinggi.

Untuk menghindari kesalahan dalam parameter nilai perolehan kembali / recovery dapat dilakukan : 

Sentrifugasi yang dilakukan harus mampu mengendapkan protein plasma dan tidak  menyebabkan hemolisis, untuk sampel darah, yaitu pecahnya sel darah merah sehingga komponen-komponen intrasel keluar tercampur dalam plasma sehingga tidak menggangu proses absorbansi sampel.



Saat pengambilan supernatan hasil sentrifugasi, jangan sampai endapan ikut terambil.



Pengukuran sampel ataupun larutan harus tepat.

Nilai Kesalahan Sistematik 

Kesalahan sistematik pada percobaan seharusnya kurang dari 10 % agar metode yang digunakan mencapai akurasi yang tinggi. Kesalahan ini bersifat konstan dan mengakibatkan  penyimpangan tertentu dari rata-rata. Pada percobaan diperoleh nilai kesalahan sistematik  sebagai berikut. Kesalahan Sistemik  = 100% - recovery

Replikasi 1 = 100% - 34,915% = 65,685% Replikasi 2 = 100% - 41,0027% = 58,9973% Replikasi 3 = 100% - 42,4161%= 57,5839%

Rata-rata kesalahan sistemik  =

65,685% + 58,9973% +57,5839% 3

= 60,7554%

 Nilai kesalahan sistemik yang diperoleh hampir semuanya lebih dari 10 %, artinya hasil  percobaan memiliki akurasi kurang yang baik. Ada beberapa faktor yang mempengaruhi kesalahan sistemik antara lain: 

Kesalahan personel dan operasi. Dalam percobaan ini kemunkinan kesalahan pada ketidaktelitian  praktikan dalam pengukuran volume sampel maupun reagen. Dapat diminimalisir dengan  peningkatan ketrampilan analisis. Makin terampil, makin kecil kesalah an personel.



Kesalahan alat dan pereaksi, dapat disebabkan oleh pereaksi yang kurang valid atau telah terkontaminasi atau pemakaian alat yang kurang tepat walaupun alatnya baik.



Kesalahan metode, dapat disebabkan kesalahan pengambilan sampel dan kesalahan reaksi kimia yang tidak sempurna. Kemungkinan dalam percobaan ini reaksi diazotasi belum sempurna, yaitu masih adanya gelembung udara saat pengukuran absorbansi sehingga mempengaruhi serapan. Sedangkan data yang memiliki kesalahan sistemik bernilai negatif dapat disebabkan oleh:



Sensitifitas peralatan yang digunakan kurang (spektrofotometer maupun pipet volume) dalam  pembacaan absorbansi atau pengukuran



Sampel mengandung banyak pengotor 

Nilai Kesalahan Acak / Coefi sien Vari an (CV)

Kesalahan acak pada percobaan seharusnya kurang dari 10 % agar metode yang digunakan mencapai ketepatan yang tinggi. Pada percobaan diperoleh nilai kesalahan acak / CV sebagai berikut. Kesalahan Acak  =

 x 100% = 10,277% 

Kesalahan acak umumnya disebabkan masalah-masalah pengukuran berulang termasuk  alat yang digunakan kurang sensitif. Beberapa nilai CV yang diperoleh melebihi 10 %, artinya metode tersebut tidak memiliki presisi yang baik. Kemungkinan faktor-faktor penyebabnya variasi pengukuran setiap praktikan yang berbeda seperti pembacaan meniskus labu takar dan  pipet, kurang tepatnya alat yang digunakan. Untuk mengatasinya, alat yang digunakan harus dikalibrasi terlebih dahulu. Sebelum penggunaan alat dibersihkan dan dikeringkan terlebih dahulu agar kontaminasi alat dapat diminimalisir. Dan adapun ada beberapa nilai CV yang diperoleh tidak terdefinisi yang berarti metode tersebut tidak memiliki presisi yang baik.

Melihat keseluruhan nilai parameter yang didapat, percobaan yang dilakukan sensitivitas, akurasi maupun presisinya rendah. Banyak kemungkinan faktor penyebabnya baik dari  praktikan, cara pengerjaan, alat maupun metode yang digunakan.

V.

KESIMPULAN

1. Metode  Bratton-Marshal  dapat digunakan untuk menganalisis obat-obat yang memiliki gugus amina aromatik primer dengan pembentukan senyawa coupling berwarna dari garam diazonium. 2. Metode pengukuran harus memenuhi beberapa kriteria, diantaranya efiesiensi (perolehan kembali atau recovery), presisi dan akurasi. 3. Berdasarkan teori, metode  Bratton-Marshal  dapat digunakan untuk menetapkan kadar  sulfametoksazol, karena sulfametoksazol memiliki gugus amina aromatis primer. 4. Pada sampel darah tikus: Percobaan 1, berdasarkan analisis hasil percobaan memiliki kadar rata-rata = 349,15 µg/ml, recovery = 34,315% dan kesalahan sistemik 65,685% Replikasi 1, berdasarkan analisis hasil percobaan memiliki kadar rata-rata = 410,027 µg/ml, recovery = 41,0027% dan kesalahan sistemik 58,9973%. 

Replikasi 2, berdasarkan analisis hasil percobaan memiliki kadar rata-rata = 426,141 µg/ml, recovery = 42,6141% dan kesalahan sistemik 57,5839%.



Kesalahan acak rata rata pada percobaan 1 hingga repliasi 2 adalah 10,277%

5. Berdasarkan hasil percobaan, metode Bratton-Marshal tidak memenuhi syarat (tidak spesifik dan

selektif) karena tidak memenuhi parameter, yaitu tidak efisien, akurat dan presisi dalam  penetapan kadar sulfametoksazol dalam darah tikus.

VI.

DAFTAR PUSTAKA

Donatus, I.A., 2008, Strategi Penelitian Farmakokinetika, Cermin Dunia Kedokteran No. 37, Jakarta. Gholib, I.G., dan Rohman, A., 2012, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta. Hakim, Lukman, 2008, Farmakokinetik , Bursa Ilmu, Yogyakarta. Katzung, Bertram, 1992, Farmakologi Dasar dan Klinik , EGC, Jakarta. Mursyidi, Achmad dan Rohman, Abdul , Editor, 2006, Volumetri dan Gravimetri, Yayasan Farmasi Indonesia, Yogyakarta. Mutschler, Ernst, 1991, Dinamika Obat, ITB-Press, Bandung.  Neal, M.J., 2006, At a Glance Farmakologi Medis, Edisi V, Erlangga, Jakarta.

Ritschel, W.A., 1992,  Handbook of Basic Pharmacokinetics,



ed, Drug Intelligence

Publications, Inc., Hamilton. Riski,2011, Pengujian in vivo (Uji biologi), http://lordbroken.wordpress.com/2011/05/08/  pengujian-in-vivo-uji-biologi/, diakses 7 Mei 2013, pukul 14.00 WIB. Shargel, Leon, 1988, Biofarmasetika dan Farmakokinetika Terapan, Airlangga University Press, Surabaya. Shargel, Leon, 2005, Applied Biopharmaceutics & Pharmacheutics, Appleton & Lange, USA.

Yogyakarta, 9 Mei 2013 Asisten,

Praktikan, Viviane Annisa

FA/09287

(

)

Anita Kurniawati

FA/09317

(

)

Annisafia Rizky D.

FA/09320

(

)

Pridiyanto

FA/09323

(

)

Mercy Arizona

FA/09326

(

)