LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI ACARA VIII UJI CEMARAN MIKROBA: ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT) DAN ANGKA KAPANG KHAMIR (AKK)

Disusun oleh : Nama

: Vivo Puspitasari Ana Maria

NIM

: 118114030

Kelompok

:B1

Tanggal

: 3 Mei 2012

PJ Laporan

:

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2012

ACARA VIII UJI CEMARAN MIKROBA: ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT) DAN ANGKA KAPANG KHAMIR (AKK)

A. TUJUAN

1. Menghitung jumlah mikroba aerob mesofil yang terdapat dalam produk makanan. 2. Menguji bahwa produk makanan yang diuji tidak boleh mengandung mikroba melebihi batas yang ditetapkan karena berbahaya (toksik) bagi kesehatan.

B. DASAR TEORI

Khamir yang lebih besar daripada kebanyakan bakteri timbul apabila organism hidup sebagai parasit atau pathogen dalam jaringan, sedangkan dalam bentuk kapang apabila organism tersebut merupakan saprofit dalam tanah atau dalam medium laboratorium (Tortora, 2010). Khamir itu bersifat fakultatif; artinya, mereka dapat hidup baik dalam keadaan aerobik maupun keadaan anaerobik.Kapang adalah mikroorganisme aerobic sejati. Cendawan dapat hidup dalam kisaran suhu yang luas, dengan suhu optimum kebanyakan spesies saprofitik dari 22 sampai 30°C; spesies patogenik mempunyai suhu optimum lebih tinggi, biasanya 30-37°C. Beberapa cendawan akan tumbuh pada atau mendekati 0°C dan dengan demikian dapat menyebabkan kerusakan pada daging atau sayur-sayuran dalam penyimpanan dingin. Cendawan mampu memanfaatkan berbagai bahan untuk gizinya.Sekalipun demikian, mereka itu heterotrof (Pelczar, 2008). Pertumbuhan bakteri dapat diukur dengan beberapa cara, yaitu dengan menghitung jumah sel dan dengan mngukur massa total populasi, yang

biasanya sebanding dengan jumlah sel. Jumlah populasi biasanya dihitung sebagai jumlah sel dalam 1 ml cairan per 1 mg materi padat. Dengan membuat seri pengenceran, kita dapat memperkirakan jumlah bakteri dalam sampel (Radji, 2010). Untuk pengujian dilakukan dengan cara : 1. Uji Angka Kapang/ Khamir Total (AKK)

Pada pengujian ini akan diketahui seberapa besar cemaran kapang/  khamir pada sediaan. Caranya dengan menghitung koloni kapang/ khamir pada serial pengenceran sampel sediaan. Hasil pengujian akan dibandingkan dengan standar uji cemaran mikroba SNI 19-2897-1992 (Soediono, 2007). 2. Uji Angka Lempeng Total (ALT)

Pada pengujian ini akan diketahui seberapa besar cemaran bakteri pada sediaan. Caranya dengan menghitung koloni bakteri pada serial pengenceran sampel sediaan. Setiap sediaan menyaratkan batas angka bakteri dan kapang/  khamir tertentu yang masih dianggap aman untuk dikonsumsi, yaitu < 10

4

koloni per ml untuk kapang/ khamir dan 106 koloni per ml untuk bakteri. Hasil pengujian ini akan dibandingkan dengan standar uji cemaran mikroba SNI 19-2897-1992 (Soediono, 2007). Dalam perhitungan jumlah mikroba, sel-sel hidup dan mati juga dipergitungkan. Suatu sel yang hidup dapat diartikan sebagai satu sel yang mampu membelah diri dan dapat menghasilkan individu yang baru. Cara yang digunakan untuk menghitung sel-sel yang hidup adalah dengan menentukan  jumlah sel-sel dalam sampel yang mampu membentuk koloni pada media agar yang sesuai. Oleh karena itu, perhitungan jumlah koloni sel-sel hidup ini sering dinamakan “Plate Count” atau perhitungan k oloni (colony count). Ada 2 cara melakukan suatu plate count, yaitu : 

Metode Sebaran



Metode Taburan (Brooks,2004).

C. SKEMA KERJA 1. UJI ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT) Alat dan Bahan

a. Media Plate Count Agar (PCA) b. Buffered Pepton Water (BPW) c. Sampel uji makanan (jajan pasar dan makanan dalam kemasan pabrik) d. Pipet volume e. Colony counter (alat hitung koloni) f. Cawan mortir steril g. Gelas arloji steril h. Sendok steril

Cara Kerja a. Persiapan dan Homogenasi Sampel Makanan (lihat lampiran 2) b. Pembuatan media PCA ( Plate Count Agar) (hitung dan lihat cara  pembuatan media pada kemasan) c. Penyiapan Sampel Uji

Disiapkan sampel uji berupa makanan dalam kemasan maupun yang tidak dalam kemasan, yang bisa dihancurkan dengan menggunakan mortir steril ↓ Ditimbang @ 5 gram menggunakan gelas arloji steril secara aseptis ↓ Penanganan wadah/kemasan : Wadah/kemasan makanan dibersihkan dicuci/dilap dengan alkohol 70 %, bagian tutup/bagian yang dibuka dilewatkan di atas api dan kemudian dibuka secara aseptis

d. Homogenisasi dan Pengenceran Sampel

Ditimbang 5 gram atau 10 gram masing-masing sampel makanan yang telah dihaluskan dengan mortir secara aseptik, larutkan ke dalam 45 ml BPW atau 90 ml BPW ↓ Dikocok dengan baik dan homogen. Didapat suspensi dengan pengenceran 10-1(Berat sampel/bahan bisa disesuaikan dengan kebutuhan) ↓ Disiapkan 3 tabung reaksi masing-masing diisi dengan 9 ml BPW ↓ Pipet 1 ml bahan yang telah dihomogenkan dalam tabung I, dikocok  sampai homogen ↓ Pipet 1 ml cairan dalam tabung I ke dalam tabung II, dikocok sampai homogen ↓ Pipet 1 ml cairan dari tabung II dan dimasukkan ke dalam tabung III, dikocok sampai homogen. Dengan demikian pengenceran yang -2 -3 -4 diperoleh adalah 10 , 10 , 10

e. Uji ALT

Dari masing-masing hasil pengenceran bahan tersebut, dipipet 1 ml dan dituangkan ke dalam 15 ml PCA yang telah dicairkan (suhu 4555°C) ↓ Dituangkan ke dalam cawan petri steril, digoyang sampai homogen dengan cara memutar petri sedemikian rupa hingga suspensi tersebar merata (metode  pour plate). Percobaan dibuat duplo ↓ Untuk mengetahui sterilitas media dan pengencer dibuat uji kontrol.Uji sterilitas media dilakukan dengan pembuatan kontrol kontaminasi media.Caranya : ke dalam satu cawan petri dituangkan media dan biarkan memadat. Uji kontrol pengencer dilakukan menginokulasikan larutan BPW ke dalam media PCA, biarkan memadat ↓ Dibiarkan sampai memadat dan inkubasikan pada suhu kamar selama 24 jam ↓ Diamati hasil dan dihitung jumlah koloni kuman yang tumbuh.Dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni antara 25-250 koloni.Jumlah koloni rata-rata dari kedua cawan dihitung lalu dikalikan dengan faktor pengencerannya. Hasil dinyatakan sebagai Angka Lempeng Total (ALT) dalam tiap gram contoh bahan(jumlah bakteri per ml sampel : CFU/ml sampel). ↓ Cara menghitung dan menyatakan hasil ALT terlampir dalam lampiran 3 ↓

Dibandingkan hasil angka ALT yang diperoleh dengan literatur tentang persyaratan ALT pada makanan yang ditetapkan berdasarkan SNI ↓ Contoh perhitungan ALT:Pengenceran Jumlah Koloni Bakteri Pengenceran

Petri I

Petri II

Rata-rata

-1

147

149

148

-2

17

19

18

10 10

↓ Dari data di atas maka dapat disimpulkan bahwa Angka Lempeng Total (ALT) : 1,48 x 103 (menggunakan aturan jumlah koloni 30300 koloni)

2. UJI ANGKA KAPANG KHAMIR (AKK) Alat dan Bahan

a. Media Malt Extract Agar (MEA) b. Buffered Pepton Water (BPW) c. Sampel uji makanan (jajan pasar dan makanan dalam kemasan pabrik) d. Kloramfenikol 100 mg/ l media Pembuatan larutan kloramfenikol: 1 gram kloramfenikol dalam 100 ml air suling steril e. Pipet volume f. Colony Counter (alat hitung koloni) g. Cawan mortir steril h. Cawan arloji steril i. Sendok steril

Cara Kerja a. Penyiapan Sampel Uji

Sama dengan uji ALT b. Pembuatan media MEA ( Malt Extract Agar) (dihitung dan dilihat  cara pembuatan media pada kemasan) c. Homogenisasi dan Pegenceran Sampel

Sama dengan uji ALT, media pertumbuhan yang digunakan adalah MEA. d. Uji AKK

Sebelum dicampur dengan sampel makanan, MEA ditambah dengan antibiotik kloramfenikol (MEA 100 ml ditambah 0,5 ml larutan antibiotik kloramfenikol (1 gram antibiotik dalam 100 ml air suling steril) ↓ Metode pour plate : diambil 15 ml MEA suhu 45-50°C dalam tabung reaksi (yang telah diinokulasi kloramfenikol) dan ditambahkan 1 ml dari masing-masing hasil pengenceran sampel makanan ↓ Dituangkan ke dalam cawan petri steril, digoyang sampai homogen dengan cara memutar petri sedemikian rupa hingga suspensi tersebar merata (metode pour plate) ↓ Percobaan dibuat duplo. Seluruh cawan petri diinkubasi pada suhu 20o

25 C dan diinkubasi 24-48 jam ↓

Saat pengamatan, dicatat jumlah koloni jamur yang tumbuh.Koloni khamir dibedakan dari kapang karena bentuknya bulat kecil-kecil putih hampir menyerupai bakteri.Koloni kapang biasanya buram dan berbulu, koloni khamir berwarna putih dan licin (berbau asam). Lempeng agar yang diamati adalah lempeng di mana terdapat 10-150 koloni kapang/khamir ↓ Jumlah total koloni dari kedua cawan dihitung lalu dikalikan dengan faktor pengencerannya. Hasil dinyatakan sebagai Angka Kapang Khamir (AKK) dalam tiap gram atau ml contoh bahan ↓ Cara menghitung dan menyatakan hasil AKK terlampir dalam lampiran 3. ↓ Dibandingkan hasil angka AKK yang diperoleh dengan literatur tentang persyaratan AKK pada makanan yang ditetapkan berdasarkan SNI

Lampiran 3 (Anonim, 1992; Anonim, 2000)

PERSIAPAN DAN HOMOGENISASI SAMPEL MAKANAN (SNI 01-2897-1992); (PPOMN : 94/MIK/00; 96/MIK/00)

Definisi :

Homogenisasi sampel adalah cara persiapan sampel makanan untuk  memperoleh distribusi bakteri secara merata di dalam sampel makanan yang diuji. Dasar Persiapan :

Membebaskan sel-sel bakteri yang masih terlindung oleh partikel makanan dan untuk menggiatkan kembali sel-sel bakteri yang mungkin viabilitasnya berkurang karena kondisi yang kurang menguntungkan di dalam makanan. Alat dan Bahan :

1. Alat cincang yang sesuai 2. Alat homogenasi (blender, cawan mortir) 3. Wadah pencampur dari gelas atau logam yang tahan suhu autoklaf  4. Timbangan 5. Pisau, garpu, sendok, gunting, spatula, pembuka kaleng dll 6. Beker, erlenmeyer, tabung reaksi dan botol pengencer steril 7. Larutan pengencer : Alkaline Peptone Water (APW), Buffered Peptone Water (BPW), Peptone Dillution Fluid (PDF), Peptone Water (PW), Buffered Distilled Water (BDW), Phosphate Buffered Distilled Water (PBDW)

A. Persiapan Sampel :

1. Penanganan Wadah atau Kemasan :

Disiapkan peralatan untuk penyiapan sampel yang sudah steril atau dapat disterilkan menggunakan api bunsen ↓ Dibersihkan dengan alkohol 70% sesaat sebelum pengujian berlangsung. Wadah terbuat dari kertas atau plastik :

Pada bagian wadah yang akan dibuka dibersihkan dengan alkohol 70% ↓ Dibuka secara aseptik.

Wadah botol 

Sumbat atau tutup botol dibersihkan dengan alkohol 70% ↓ Dibuka secara aseptik di dekat nyala api bunsen.

Wadah kaleng

Permukaan kaleng dicuci dan dibersihkan dengan alkohol 70% ↓ Dibuka secara aseptik di dekat nyala api bunsen.

2. Homogenisasi Sampel

 Makanan bentuk cairan

Sampel dikocok sebanyak 25 kali ↓ Dengan cara aseptik dipipet 25 ml cuplikan sampel ke dalam wadah steril yang sesuai ↓ Kemudian ditambahkan 225 ml larutan pengencer dikocok homogen -1 sehingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 1 : 10 (10 )  Makanan bentuk serbuk

Dengan cara aseptik ditimbang 25 g cuplikan ke dalam erlenmeyer atau wadah lain steril yang sesuai ↓ Kemudian ditambahkan 225 ml larutan pengencer dikocok homogen -1 sehingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 1 : 10 (10 )  Makanan bentuk kental 

Dengan cara aseptik dipipet 25 ml atau ditimbang 25 g cuplikan ke dalam erlenmeyer atau wadah lain steril yang sesuai ↓ Kemudian ditambahkan 225 ml larutan pengencer, dikocok homogen hingga -1

diperoleh suspensi dengan pengenceran 1 : 10 (10 ).

 Makanan bentuk padat

Dengan cara aseptik ditimbang 25 g cuplikan ke dalam blender

↓ Ditambahkan 225 ml larutan pengencer ↓ Kemudian dihomogenkan sehingga diperoleh suspensi dengan -1 pengenceran 1 : 10 (10 ). Catatan :

ogenkan dalam blender yang dihangatkan dan larutan pengencer yang dihangatkan

suhu 40oC selama tidak lebih dari 15 menit hingga bisa dipipet. Cuplikan dipipet 25 ml secara aseptik dengan pipet yang dihangatkan, ke dalam wadah yang berisi 225 ml larutan pengencer hangat dan kemudian dikocok homogen sehingga diperoleh suspensi dengan -1 pengenceran 1 : 10 (10 ).

 Makanan beku

Sampel yang masih beku harus dipecah menjadi bagian-bagian yang lebih kecil dengan menggunakan peralatan tumpul. Bila sampel dalam bentuk blok besar, misal ikan atau daging, cuplikan dapat diambil dengan bantuan gergaji, pisau atau bor. Cara lain sampel beku dapat disimpan terlebih dahulu pada suhu refrigerator selama tidak lebih dari 12 jam untuk memudahkan pengambilan cuplikan. Untuk sampel yang tidak terlalu beku seperti es krim, dapat dibiarkan terlebih dahulu pada suhu ruangan selama tidak lebih dari 15 menit. Setelah cukup leleh sampel dalam kemasan diaduk homogen dengan hati-hati, kemudian secara aseptik ditimbang 25 g cuplikan ke dalam wadah steril yang sesuai atau blender, selanjutnya dihomogenkan hingga diperoleh -1 suspensi dengan pengenceran 1 : 10 (10 )

 Makanan yang dikalengkan

Keadaan wadah diamati.Dilihat adanya kebocoran dan kerusakan kaleng.Terhadap kaleng yang utuh dilanjutkan pengujian.Setelah wadah dibuka, diambil sejumlah 25 g cuplikan dan dimasukkan ke dalam blender. Ditambahkan 225 ml larutan pengencer hingga -1 diperoleh suspensi dengan pengenceran 1 : 10 (10 )

B. Cara Perhitungan dan Menyatakan Hasil ALT (Anonim, 1992; Anonim, 2000)

1. Pilih cawan petri (simplo atau duplo) dari suatu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni antara 25-250 setiap cawan. Hitung semua koloni dalam cawan petri dengan menggunakan colony counter . Hitung rata-rata jumlah koloni dan kalikan dengan faktor

pengenceran. Hasil dinyatakan sebagai Angka Lempeng Total dalam tiap gram atau ml sampel. 2. Jika salah satu dari 2 cawan petri terdapat jumlah koloni lebih kecil dari 25 atau lebih besar dari 250, hitung rata-rata jumlah koloni, kalikan dengan faktor pengenceran. Hasil dinyatakan sebagai ALT dalam tiap gram atau ml sampel. 3. Jika hasil dari 2 tingkat pegenceran yang berurutan menunjukkan  jumah koloni berturut-turut antara 25-250 koloni, hitung jumah koloni dari masing-masing pengenceran seperti yang disebut pada butir a dan butir b di atas, dan hitung rata-rata jumah koloni dari kedua pengenceran tersebut. Apabila hasil perhitungan pada tingkat yang lebih tinggi diperoleh jumlah koloni rata-rata > 2 kali jumlah koloni rata-rata pengenceran di bawahnya, maka ALT dipilih dari tingkat pengenceran yang lebih rendah (missal: pada pengenceran 10 2

jumlah koloni rata-rata140, padapengenceran 10 -2

rata-rata 32, maka dipilih jumlah koloni 140x10 ).

-3

-

jumlah koloni

4. Bila hasil perhitungan pada tingkat pengenceran lebih tinggi diperoleh jumlah koloni rata-rata kurang dari 2 kali jumlah rata-rata pada pengenceran di bawahnya maka ALT dihitung dari rata-rata  jumlah koloni kedua tingkat pengenceran tersebut (missal: pada 10

-2

3

 jumlah koloni rata-rata 240, pada pengenceran 10  jumlah koloni ratarata 41), maka ALT adalah:    



     



5. Jika rata-rata jumlah koloni masing-masing cawan petri tidak terletak  antara 25 dan 250 koloni, hitung jumlah koloni seperti pada butir a dan b di atas, dan nyatakan sebagai jumlah bakteri perkiraan per milliliter atau gram. 6. Jika jumlah koloni dari semua pengenceran lebih dari 250 koloni, maka setiap 2 cawan petri dengan pengenceran tertinggi dibagi ke dalam 2, 4 atau 8 sektor. Hitung jumlah koloni dalam 1 bagian atau lebih. Untuk mendapatkan jumlah koloni dalam satu cawan petri, hitung rata-rata jumlah koloni dan kalikan dengan faktor pembagi dan pengenceran. Nyatakan hasilnya sebagai jumlah bakteri perkiraan per milliliter atau gram. 7. Jika dalam 1/8 bagian cawan petri terdapat lebih dari 200 koloni, maka jumlah koloni yang didapat sama dengan 8x200 (1600), dikalikan dengan faktor pengenceran dan nyatakan hasilnya sebagai  jumlah bakteri perkiraan per milliliter atau gram lebih besar dari  jumlah yang didapat (> 1600 x faktor pengenceran). 8. Jika tidak ada koloni yang tumbuh dalam cawan petri, nyatakan  jumlah bakteri perkiraan < 1 dikalikan pengenceran yang terendah (