Laporan Praktikum Kromatografi Cair Tingkat Tinggi

Laporan Praktikum Kromatografi Cair Tingkat Tinggi Tanggal Praktikum :10 April 2011 Tanggal Pengumpulan : 17 April 2011 Assisten : 1.

Disusun oeh : Salma Ilmiati (10509063) Kelompok 6

Laboratorium Kimia Analitik Program Studi Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Teknologi Bandung 2011

Kromatografi Cair Tingkat Tinggi I. Tujuan Percobaan •

Menentukan waktu retensi dari kafein

•

Menghitung kandungan kafein pada minuman sampel

I. Teori Dasar Kafein adalah senyawa polar yang larut dalam metanol. Apabila kadar kafein ingin ditentukan dengan kromatografi, kafein harus diekstrak ke pelarut lain yang lebih non polar. Tapi apabila fasa dalam kromatografinya diubah dimana fasa diamnya non polar dan fasa geraknya polar (HPLC fasa terbalik), ekstraksi tersebut tidak perlu dilakukan. Eluen dari kolom monitor dalam bentuk absoban yang sebanding

dengan

konsentrasi

kafein,

sehingga

konsentrasi

kafein

dapat

ditentukan. HPLC (High Performance Liquid Chromatography) menggunakan fasa terbalik dimana sample dialirkan pada fasa diamnya dan dielusi, kemudian dibawa ke detector oleh fasa geraknya. Fasa diam HPLC berupa partikel silica yang ditutup silena. Eluennya bersifat polar seperti methanol dan air. Fasa geraknya tidak diperlukan dalam jumlah yang besar, sehingga komposisi suatu sample dapat diketahui tanpa harus mengekstraknya terlebih dahulu. Pada HPLC, waktu retensi akan meningkat dengan meningkatnya sifat non polar dari suatu senyawa. II. Cara Kerja Mula-mula, kita membuat fasa geraknya (eluen) terlebih dahulu, yaitu 140 ml aquabidest, 1.4 ml H3PO4 5%, dan 60 ml methanol dicampurkan gelas ukur. Lalu dimasukkan ke dalam penangas ultrasonic (ultrasonic bath) untuk dihilangkan gas terlarutnya. Setelah itu, larutan standar 500 ppm kafein diambil sebanyak 5 ml, dimasukkan ke dalam 5 buah labu takar 10 ml kemudian diencerkan dengan eluen yang telah dibuat dengan konsentrasi masing-masing 20, 40, 60, 80, dan 100 ppm. Selanjutnya larutan dengan konsentrasi masing-masing tersebut diinjeksikan ke dalam HPLC untuk dihasilkan kromatogramnya. Untuk larutan sampel, teh yang telah disaring dengan penyaringan biasa, diencerkan sebanyak 2x dan 5x sebagai acuan.

III. Data Pengamatan •

20 ppm [mV]

3.683

std 20 ppm (kel 6 senin)

3.220

1.4

Voltage

1.2

1.0

0.8

0.6

0

5

10

15

20 [min.]

Time

Reten.Time [min] 3.22 3.683 Total

1 2

•

Area [mV.s] 14.351 10.282 24.634

Height [mV] 0.931 0.807 1.738

Area [%] 58.3 41.7 100

Heigh t [%] 53.6 46.4 100

W05 [min] 0.23 0.19

40 ppm [mV]

Voltage

3.187

2.0

3.687

std 40 ppm (kel 6 senin)

1.5

1.0

0.5

0

5

10 Time

15

20 [min.]

Reten. Time [min] 3.187 3.687 Total

1 2

•

Area [mV.s] 28.303 18.438 46.74

Height [mV] 1.785 1.324 3.108

Area [%] 60.6 39.4 100

Heigh t [%] 57.4 42.6 100

W05 [min] 0.22 0.2

60 ppm [mV] 3.0

3.203

2.5

3.703

s td 60 ppm (ke l 6 s e nin)

Voltage

2.0

1.5

1.0

0.5

0

5

10

15

Time

1 2

•

Reten. Time [min] 3.203 3.703 Total 80 ppm

Area [mV.s] 37.462 24.335 61.797

Heigh t [mV] 2.352 1.678 4.03

Are a [%] 60.6 39.4 100

Heigh t [%] 58.4 41.6 100

W05 [min ] 0.23 0.21

20 [min.]

[mV] std 80 ppm (kel 6 senin)

3.183

3.690

4

Voltage

3

2

1

0

5

10

15

Time

Reten. Time [min] 1

3.183

2

3.69

Area [mV.s]

Are a [%]

Heigh t [%]

W05 [min ]

3.703

64.3

60.3

0.22

2.443

35.7

39.7

0.22

6.147

100

100

65.89 6 36.51 2 102.4 07

Total •

Height [mV]

20 [min.]

100 ppm

[mV] std 100 ppm (kel 6 senin)

7

3.190

6

Voltage

3.707

5

4

3

2

1

0 0

5

10

15

Time

1

Reten. Time [min]

Area [mV.s]

3.19

105.64

Heigh t [mV] 6.221

Area [%]

Heigh t [%]

W05 [min]

64.6

62.3

0.22

20 [min.]

2 2 3.707 57.95 163.59 Total 2 • Sampel nescafe 10x

3.765

35.4

37.7

9.986

100

100

0.22

[mV] sampel nescafe 10x (kel 6 senin)

Voltage

3.727

2.153

2.5

3.200

2.450

3.0

2.0

1.767

1.5

1.0

0.5 0

5

10

15

20 [min.]

Time

Reten. Time [min] 1 2 3 4 5

1.767 2.153 2.45 3.2 3.727

Area [mV.s]

4.285 25.509 37.914 54.873 22.852 145.43 Total 4 I. Pengolahan Data Penentuan

Heigh t [mV] 0.364 1.486 1.94 2.386 1.246 7.421

Konsentrasi

80 100 Grafik

Heigh t [%]

W05 [min]

2.9 17.5 26.1 37.7 15.7

4.9 20 26.1 32.1 16.8

0.16 0.28 0.36 0.25 0.33

100

100

Kafein

Perbandingan Grafik Standar Kafein [ppm] 20 40 60

Area [%]

Area Height [mV.s] [mV] 24.634 1.738 46.74 3.108 61.797 4.03 102.40 7 6.147 163.59 2 9.986

Pada

Sampel

Nescafe

dengan

Bila data 60 ppm tidak dimasukkan:

Dari grafik tanpa data 60ppm bisa ditentukan konsentrasi sampel : Luas puncak : 1.667x - 15.73 Konsentrasi ( C ) :

luaspuncak− 15.73 1.667 karena sampel diencerkan 10 kali, maka : (C):

luaspuncak− 15.73 x10 1.667 Konsentrasi kafein dalam sampel C:

luaspuncak− 15.73 x10 1.667 Larutan sampel menggunakan jumlah luas kurva dan jumlah tinggi kurva dengan waktu retensi yang mendekati waktu retensi dari larutan standar. :

77.725− 15.73 x10 1.667 : 371.897 Berat kafein dalam teh (diambil 1 L larutan) mg = ppm x 1L

= 371.897 x 1 = 371.897mg

Berdasarkan grafik konsentrasi dengan tinggi

Jika data 60 ppm ditiadakan

Dari grafik bisa ditentukan konsentrasi sampel : Luas puncak : 0.097x - 0.615 Konsentrasi ( C ) :

tinggipuncak − 0.615 0.097 karena sampel diencerkan 10 kali, maka :

(C):

tinggipuncak − 0.615 x10 0.097 Konsentrasi kafein dalam teh C:

tinggipuncak − 0.615 x10 0.097 Larutan sampel menggunakan jumlah luas kurva dan jumlah tinggi kurva dengan waktu retensi yang mendekati waktu retensi dari larutan standar. :

3.632 − 0.615 x10 0.097 : 311.031 Berat kafein dalam teh (diambil 1 L larutan) mg = ppm x 1L = 311.031 x 1 = 311.031 mg

II. Pembahasan High-performance pemurnian dipisahkan

dan

liquid

chromatography

pengasingan

berdasarkan

campuran.

karakter

(HPLC)

Pada

HPLC

hidrofobiknya.

mengacu RP,

pada

proses

senyawa-senyawa

Pelarut-pelarut

harus

dihawagaskan (dihilangkan komponen gasnya) untuk menghalangi pembentukan gelembung-gelembung.Prinsip kerja HPLC adalah dengan bantuan pompa fasa gerak cair yang dialirkan melalui kolom ke detector. Sampel yang digunakan pada percobaan ialah kafein pada Nescafe yang mempunyai struktur molekul O

N

N

N N O

caf f ein

Sampel dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam

kolom

terjadi

pemisahan

komponen-komponen

campuran.

Karena

perbedaan kekuatan interaksi antara solute-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solute-solut tersebut akan keluar kolom dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk

kromatogram

kromatografi

gas.

Computer

dapat

digunakan

untuk

mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC. Instrumentasi HPLC yaitu: •

Fasa gerak

Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelariut. HPLC mempunyai lebih banyak pilihan fasa gerak. Fasa gerak selain berfungsi membawa komponen-komponen campuran menuju detector, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solute-solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan. Dalam percobaan ini yang berfungsi sebagai fasa gerak ialah metanol. Fasa gerak Persyaratan fasa gerak dalam HPLC ialah: 1. zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan di analisis. 2. zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat menganggu interpretasi kromatogram

3. zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom 4. zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun. 5. zat cair tidak kental 6. sesuai dengan detector Jenis fasa gerak untuk kromatografi partisi, adsorpsi, dan penukar ion bersifat interaktif dalam arti fasa gerak berinteraksi dengan komponen-komponen cuplikan. Akibatnya, waktu retensi sangat dipengaruhi oleh jenis pelarut. Sebaliknya fasa gerak untuk kromatografi eksklusi bersifat non interaktif. Oleh karena itu, waktu retensi dengan kromatografi ini tidak bergantung pada komposisi fasa gerak. •

Pompa

Pompa memberikan tekanan tinggi yang tetap tanpa berpulsasi, dan bisa diprogramkan untuk memvariasikan komposisi pelarut selama berlangsungnya pemisahan. Pompa dalam HPLC berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus. Pompa yang dapat digunakan dalam HPLC harus memenuhi persyaratan, yaitu: 1. Menghasilkan tekanan sampai 600 psi (pons/in2) 2. Keluaran bebas pulsa 3. Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit 4. Bahan tahan korosi •

Unit Sistem Penyuntikan atau Penginjeksian Sampel

Kadang keterulangan

kala,

faktor

pemasukan

ketidaktepatan cuplikan

ke

pengukuran dalam

peking

HPLC

terletak

kolom.

pada

Masalahnya,

kebanyakan memasukan cuplikan ke dalam kolom dapat menyebabkan band broadening. Oleh karena itu, cuplikan yang dimasukkan harus sekecil mungkin, beberapa puluh mikroliter. Selain itu, perlu diusahakan tekanan tidak menurun ketika memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak. Berikut beberapa teknik pemasukan cuplikan ke dalam sistem HPLC : 1. Injeksi Syringe Alat yang paling dulu dan paling mudah untuk memasukkan cuplikan adalah syringe. Syringe disuntikkan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe yang tahan tekanan sampai 1500 psi. akan tetapi keterulangan injeksi syringe ini sedikit lebih baik dari 2-3 % dan sering lebih jelek

2. Injeksi ‘stop-flow’ Injeksi stop-floe adalah jenis injeksi syringe kedua tapi di sini aliran pelarut dihentikan sementara, sambungan pada ujung kolom dibuka dan cuplikan disuntikan langsung ke dalam ujung kolom. Setelah menyambungkan kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali 3. Kran Cuplikan Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak digunakan. Untuk memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu dua langkah: (a) sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi ‘load’, cuplikan masih berada dalam loop, (b) kran diputar untuk mengubah posisi ‘load’ menjadi posisi ‘injeksi’ dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom. Loop dapat diganti-ganti dan tersedia berbagai ukuran volume dari 5 hingga

500μL.

Dengan

sistem

pemasukan

cuplikan

ini

memungkinkan

memasukkan cuplikan pada tekanan 7000 psi dengan ketelitian tinggi. Juga loop mikro tersedia dengan volume 0,5 hingga 5 μL. •

Kolom

Kolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel walaupun ada juga yang terbuat dari gelas berdinding tebal. Kolom utama berisi fas diam, tempat terjadinya pemisahan campuran menjadi komponen-komponennya. •

Detector

Detektor-detektor bergantung pada perubahan indeks refraktif, serapan UVtampak, atau fluoresensi setelah eksitasi dengan panjang gelombang yang sesuai.Berbagai detector untuk HPLC telah tersedia, walaupun demikian detector harus memenuhi persyaratan berikut: 1. cukup sensitive; 2. stabilitas dan keterulangan tinggi; 3. respon linear terhadap solute; 4. waktu respon pendek sehinggatidak bergantung kecepatan alir ; 5. realibilitas tinggi dan mudah digunakan; 6.

tidak merusak cuplikan.

Detector HPLC dikelompokan ke dalam tiga jenis, yaitu: detector umum memberi respon terhadap fasa gerak yang dimodulasi dengan adanaya solute. Sebaliknya, detector sepesifik memberi respon terhadap beberapa sifat solute yang tidak

dimiliki oleh fasa gerak. Terakhir, detectoe yang bersifat umum terhadap solute setelah fasa gerak dihilangkan dengan penguapan. Detector berdasarkan absorpsi UV merupakan detector HPLC yang paling banyak di pakai. Detector elektrokimia paling banyak dipakai terutama dalam HPLC penukar ion. Cara Kerja HPLC, mula-mula solven diambil melalui pompa.

Solven ini

dikemudian masuk ke dalam katup injeksi berbutar, yang dipasang tepat pada sampel loop. Dengan pertolongan mikrosiring, sampel dimasukan ke dalam sampel loop yang kemudian bersama-sama dengan solven masuk ke dalam kolom. Hasil pemisahan dideteksi oleh detector, yang penampakannya ditunjukan oleh perekam (pencatat = recorder). Tekanan solven di atur dengan pengatur dan pengukur tekanan. Pompa pemasuk solven pada tekanan konstan hingga tekanan kurang lebih 4500 psi dengan laju alir rendah, yakni beberapa milliliter per menit. Rekorder menghasilkan kromatogram zat-zat yang dipisahkan dari suatu sampel Kelebihan HPLC Dibandingkan dengan kromatografi gas, kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT atau HPLC = High Performance Liquid Chromatography) mempunyai beberapa kelebihan. Beberapa kelebihan KCKT diantaranya ialah: 1. Percobaan dapat dilaksanakan dalam suhu kamar 2. cepat dan mudah melaksanakannya 3. peka, detektor HPLC dapat divariasi dan unik. 4. pelarut pengembang bisa dipakai berulang kali demikian juga dengan kolomnya. 5.

ideal untuk molekul besar dan ion.

6.

mudah memperoleh cuplikan.

7.

daya pisahnya baik.

8.

dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang di analisis.

9.

HPLC juga dapat menganalisis senyawa yang tidak mudah menguap dan termolabil.

I. Kesimpulan Kadar kafein dalam nescafe:

•

Dengan kurva kalibrasi luas kromatogram

•

Dengan kurva kalibrasi tinggi kromatogram 1: 311.031 mg

: 371.897mg

I. Daftar Pustaka • • • • •

Harvey, David. ”Modern Analytical Chemistry.” International edition. Mc Graw Hill Publisher. Sydney. 2000. pg 578-588. Braithwaite, A. and Smith, F. J. “Chromatographic Methods”. 5th ed. Kluwer Academic Publisher. London. 1999. pg 23-26, 258-266, 379-383. Drs. Soebagio dkk, 2002, KIMIA ANALITIK II, Malang: JICA FMIPA UNM Sumar Hendrayana, 2006, KIMIA PEMISAHAN, Bandung : Rosdakarya Hostettmann, K dkk, 1995, Cara Kromatografi Preparatif, Bandung: ITB

I. Lampiran