Laporan Praktikum III Dasar Genetika Ternak

L apor an Pra Pr aktikum kti kum I I I D asar sar G enetik netika a Ter Ter nak nak GEL ELEKTROFORESIS

Oleh NAMA

: NUR FIANTI

KELAS

:A

KELOMPOK : IV ASISTEN

: UCI MALINDA

JURUSAN PETERNAKAN FAKULTAS PETERNAKAN UNIVERSITAS HALU OLEO KENDARI 2016

I.

PENDAHULUAN

1.1. Latar belakang

Genetika adalah ilmu yang mempelajari sifat keturunan. Keturunan adalah  proses biologis dimana orangtua/induk mewariskan gen kepada anaknya atau keturunannya. Gen adalah bagian kromosom atau salah satu kesatuan kimia (DNA) dalam kromosom, yaitu dalam lokus yang mengendalikan cirri genetis suatu makhluk hidup. DNA merupakan senyawa kimia yang paling penting pada makhluk hidup, yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk dalam keseluharannya dari satu generasi kegenerasi berikutnya. Elekroferesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan  berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Elektroforesis dapat digunakan untuk makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Teknik

elektroforesis

digunakan

untuk

memisahkan

makromolekul.

Makromolekul yang disajikan elektroforesis adalah protein dan asam nukleat yang memiliki perbedaan ukuran, kadar ion, dan molekul-molekul penyusunnya. Molekul protein dan asam nukleat yang bermuatan negatif akan bergerak dari kutub negatif menuju kutub positif dari gel elektroforesis. Elektroforesis gel agarosa adalah metode pemisahan molekul DNA dan RNA menurut muatan, ukuran, dan bentuk. Berdasarkan uraian tersebut maka  perlu dilakukan praktikum gel elektroforesis.

1.2. Tujuan

Tujuan dilakukannya praktikum elektroforesis DNA adalah sebagai berikut: 1.

Untuk mengetahui prinsip kerja elekroforesis,

2.

Untuk mengetahui materi dan metode elektroforesis,

3.

Untuk mengetahui alat dan bahan elektroforesis.

1.3. Manfaat

Manfaat dilakukannya prktikum elektroforesis DNA adalah sebagai berikut: 1.

Dapat mengetahui prinsip kerja elekroforesis,

2.

Dapat mengetahui materi dan metode elektroforesis,

3.

Dapat mengetahui alat dan bahan elektroforesis.

II. METODE PRAKTIKUM

2.1. Waktu dan Tempat

Praktikum gel elektroforesis dilaksanakan pada Hari Kamis, Tanggal 8 Desember 2016, di laboratorium Genetika dan Pemuliaan Ternak, Fakultas Peternakan, Universitas Halu Oleo, Kendari. 2.2. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada praktikum gel elektroforesis dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1. Alat dan Kegunaan  No. Alat 1 Alat Tulis 2 UV illuminator 3 Elektroforesis 4 Sisir 5  Nampan

Kegunaan Untuk menulis hasil praktikum Untuk melihat warna Untuk menghantarkan panas Untuk membuat lubang penyimpnan sampel Meletakan gel

Bahan yang digunakan pada praktikum gel elektroforesis dapat dilihat  pada Tabel 2. Tabel 2. Bahan dan Kegunaan

 No. Bahan 1 Gel agarose 2 Buffer 3 Epidium bromida

Kegunaan Bahan pengamtan Sebagai media penghantar listrik Sebagai bahan pewarna

2.3. Prosedur Praktikum

Prosedur kerja pada praktikum gel elektroforesis adalah sebagai berikut : 1.

Menyiapkan alat dan bahan,

2.

Menjelaskan prinsip kerja elektroforesis,

3.

Mengamati dan mencatat bagian dan fungsi elktroforesis,

4.

Membuat laporan.

III. PEMBAHASAN

3.1. Prinsip Kerja Elektroforesis

Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ekstraksi atau pemisahan DNA dari bahan padar seperti selulosa dan protein, serta  pemurnian DNA. Prinsip elektroforesis agaros adalah teknik pemisahan asam nukleat/protein berdasarkan perbedaan medan listrik, molekul dan partikel  bermuatan akan bergerak kea rah elekrode yang memiliki muatan berlawanan di  bawah pengaruh medan istrik. Prinsip elektroforesis SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrilamide Gel Reaction)  pemisahan protein darah dengan migrasi komponen acrilamida berdasarkan perbedaan berat molekul (Lubis dkk., 2013). Sifat partikel bergerak ke kutub yang berlawanan dengan muatannya (partikel/ion positif bergerak ke katoda dan sebaliknya). Perbedaan muatan dan ukuran partikel mengakibatkan laju bergerak berbeda yaitu terjadi pemisahan (Mayangsari, 2012). 3.2. Materi dan Metode Elektroforesis

Sputum dicampur dengan larutan NaOH 1N dengan perbandingan 1:1. didiamkan selama 30 menit. Dari campuran tersebut diambil 1,5 mL, masukkan ke dalam tabung eppendorf dicentrifuge selama 5 menit pada kecepatan 11.000xg lalu pellet diambil kemudian ditambahkan 250

µl

buffer lisis dan 5

µl

 proteinase K diinkubasi pada suhu 55ºC selama 1jam kemudian diinkubasi kembali pada suhu ruang selama 5 menit, lalu ditambahkan 300

µl

fenol.

Selanjutnya divortex selama 5 menit, disentrifuge 5 menit pada kecepatan 14.000xg. Selanjutnya dipindahkan fase atas A

µl

(sesuai banyaknya fase atas

yang terbentuk, minimal 200 µl

µl).

Fase atas(A) + (0,1xA)

µl

NaOAC +(1,4xA)

etanol absolut lalu dibolak-balik perlahan lalu campuran tersebut disimpan

 pada suhu -20ºC selama 30 menit. Campuran kemudian disentrifuge selama 15 menit pada kecepatan 14.000xg sehingga terbentuk supernatan dan filtrat. Selanjutnya dekantasi supernatan tambahkan 200

µl

etanol 70%, sentrifuge 5

menit dengan kecepatan 10.000xg. Supernatan dibuang keringkan dengan menggunakan alat  speed vac. DNA dilarutkan dengan menambahkan 25

µl

H2O

free RNAse. DNA diukur konsentrasinya menggunakan alat spektrofotometer. Agar didapatkan hasil elektroforesis yang baik, diperlukan proses isolasi DNA yang benar. Konsentrasi DNA yang layak diamplifikasi 1,8-2,0. Hasil isolasi DNA tersebut kemudian diamplifikasi menggunakan metode PCR ( Polymerase Chain Reaction) dan divisualisasikan dengan metode elektroforesis menggunakan dua konsentrasi gel agarosa yang berbeda yaitu konsentrasi gel agarosa 1% dan 1,2%. Pembuatan

gel agarosa;

agarosa

serbuk ditimbang

sesuai

dengan

konsentrasi yang akan dibuat (1,0% dan 1,2%) dilarutkan dalam buffer TAE 1x dipanaskan pada hotplate hingga mendidih dan berwarna jernih. Setelah mendidih, gel didinginkan hingga suhu ±55ºC lalu ditambahkan Cybr green sebanyak 1,5

µl

dan dihomogenkan. Gel selanjutnya dimasukkan kedalam

cetakan yang telah disisipkan sisir elektroforesis dibagian sisi-sisinya.

Gel

dibiarkan membeku (± selama 30 menit). Lakukan elektroforesis hasil PCR. Hasil PCR dilihat menggunakan alat UV translluminator /gel dokumen. Lihat fragmen DNA yang terbentuk dan dibandingkan dengan kontrol positif dan marker Hind III 281-310 pb. Hasil : Positif : terbentuk pita/band yang sejajar dengan kontrol positif dan ada diantara 281-310 pb.

Negatif : tidak terbentuk

 pita /band. Luas area ketebalan pita/band DNA yang terbentuk dari hasil elektroforesis kemudian diolah menggunakan software image J  (Efrida, 2015). Gel agarosa (1%) dibuat dengan melarutkan 0.3 gram agarosa ke dalam larutan TAE 1X hingga volume 30 mL. Larutan a garosa dididihkan sehingga larut sempurna. Suhu larutan diperiksa 50-60   C, ditambahkan 1 µL EtBr. Larutan   ̊

agarosa dituang kedalam baki gel agarosa, dibiarkan hingga larutan berubah menjadi gel yang padat. Baki yang telah berisi gel agarosa dimasukkan kedalam tangki elektroforesis dan tambahkan buffer TAE hingga gel terendam seluruhnya. Sejumlah 10 µL unit DNA hasil isolasi yang telah dicampur dengan loading dye (0.25 % bromphenol blue, 40 % sukrosa) dimasukan ke dalam sumur gel. Waktu rinning 45-60 menit dengan volttase 100 V. gel hasil elektroforesis diamati di  bawah sinar UV  menggunakan UV Transiluminator (Aini dkk., 2011 ). 3.3. Alat dan Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun muda dari 10 tanaman bitti yang berasal dari provenansi Kabupaten Enrekang dan Bone yang

telah

ditetapkan

sebagai

menggunakan eppendorf (e-cup),

lokasi

penelitian.

Analisis

molekuler

mikrotip, nitrogen cair, buffer lysis,

isopropanol, ddH2O Mikrozone Megamix Blue, Agarose, PCR tube, loading dye, TAE dan TBE. Alat yang digunakan selama pengambilan sampel etanol, cutter, plastic, label dll. Analisis molekuler menggunakan mortar, mikropipet ( Eppendorf Research), Inkubator (Juliabo Paratherm III), Mesin sentrifugasi ( Ependorf Centrifuge 5415 D), thermal cycler ( Applied Biosystem), mesin Elektrolisis (Bio Rad) (Fajarwati dkk., 2012).

Bahan yang digunakan antara lain adalah jaringan otak sapi, buffer ekstrak GAD (dengan kandungan : 100 mM pindaksol 5-phosphat (PLP)), 1 mM 2aminoetilisotiouronium

bromide

(AET),

4

mM

fenilmetilsulfonilfluorida

(PMSF), 0.0025 M entilendiamin tetraasetat (EDTA), 1 M sucrose, sephadex G75, ammonium sulfat, selofan, buffer phosphate 0.2 M pH 7, HCL 0.01 M, sodium dodecyl sulfat (SDS), commasive brilliant blue, acrylamide, TEMED, dan BaCl2 0.1 M. alat yang digunakan adalah elektroforesis apparatus merk BioRad, Sentrifuge dingin, kromatografi, stirrer dan beacker glass (Arjita, 2009). Bahan yang digunakan pada pemeriksaan PCR yaitu cairan efusi pleura, isopropanol, proteinase K, etanol buffer lisis, H 2O free DNA, KIT PCR (terdiri atas enzim DNA polymerase, dNTPs, buffer 10 x), sepasang primer, agarose,  buffer TAE, loading dye parafilm, kontrol positif, dan kontrol negatif. Sdangkan alat-alat yang digunakan adalah tabung eppendrof (1.5 ml dan 0.2 ml), tip  berbagai ukuran, pipet mikro, alat sentrifuge, waterbath, alat elekroforesis, dan illuminator UV (Jayasaputra dkk., 2007).

IV. PENUTUP

4.1. Kesimpulan

Berdasarkan tujuan dari praktikum gel elektroforesis dapat disimpulkan  bahwa: 1. Prinsip kerja gel elektroforesis agaros adalah teknik pemisahan asam nukleat/protein berdasarkan perbedaan medan listrik, molekul dan partikel  bermuatan akan bergerak kea rah elekrode yang memiliki muatan berlawanan di bawah pengaruh medan istrik. 2. Materi dan metode elektroforesis salah satunya adalah Gel agarosa (1%) dibuat dengan melarutkan 0.3 gram agarosa ke dalam larutan TAE 1X hingga volume 30 mL. Larutan agarosa dididihkan sehingga larut sempurna. Suhu larutan diperiksa 50-60  C, ditambahkan 1 µL EtBr.   ̊

3. Alat dan bahan yang digunakan diantaranya yaitu cairan efusi pleura, isopropanol, proteinase K, etanol buffer lisis, H 2O free DNA, KIT PCR agarose, dan lian-lain. Sedangkan alat-alat yang digunakan adalah tabung eppendrof (1.5 ml dan 0.2 ml), tip berbagai ukuran dan lain-lain. 4.2.Saran

Saran saya pada praktikum ini, sebaiknya alat dalam laboratorium dilengkapi agar dalam praktikum selanjutnya bisa dilaksanakan dengan efisien.

DAFTAR PUSTAKA

Aini, A.N., A.Ria., L.N. Aminin, 2011.  Pemurnian DNA Plasmid Puc19  Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea. Jurnal Sains dan Matematika Vol. 19 No. 2 Arjita, I.P.D., 2009.  Analisis Protein Jaringan Otak Sapi dengan Metode Isolasi,  Purifikasi dan Visualisasi. Gane Swara Vol. 3 No. 2 Efrida, A. 2015.  Pengujian Konsentrasi Gel Agarosa 1 % dan 1.2 % pada  Elektroforesis DNA Mycobacterium Tuberculosis. Jurnal Ilmu-Ilmu Kesehatan Fajarwati, L., M. Restu, T. Kuswinati. 2012. Optimalisasi Suhu dan Lama  Ingkubasi dalam Ekstraksi DNA Tanaman Bitti (Vitex cofassus Reinw) serta  Analisis Keragaman Genetik dengan Teknik RAPD-PCR. Jurnal Sains dan Teknologi Vol. 12 No. 3 Jayasaputra, D.k., J.T. Widjaja, T.L., Wargasetia, 2007.  Deteksi Mycobacterium Tuberculosis dengan Teknik PCR pada Cairan Efusi Pleura Penderita Tuberkulosis Paru. JKM Vol. 7 No. 1 Lubis, N.A., dan F.G. Prawira. 2013.  Isolasi DNA Manusia (Epitelial Mulut dan  Darah) dan Teknik PCR Isolasi Protein dari Darah, Elektroforesis Agarose dan SDS-PAGE. Laporan Praktikum Mayangsari, Y., 2012.  Electrophoresis. Department of Food and Agricultural Products Processing Technology. Faculty of Agrikultural Technologi Gadjah Mada University