Laporan Praktikum Elisa

LAPORAN PRAKTIKUM INSTRUMEN DAN TEKNOLOGI ANALISIS ELISA METODE SANDWICH PEMERIKSAAN KUANTITATIF TNF α

Oleh : Yulia Dwi Setia NIM 156070100111002

KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI DAN PENDIDIKAN TINGGI

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA 2015

PENDAHULUAN a. Dasar Teori Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Umumnya ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu competitive assay yang menggunakan konjugat antigen – enzim atau konjugat antibodi – enzim, dan noncompetitive assay yang menggunakan dua antibodi. Pada ELISA non-competitive assay, antibodi kedua akan dikonjugasikan dengan enzim sebagai indikator. Teknik kedua ini seringkali disebut sebagai "Sandwich" ELISA. Tumor Necrosis factor alpha (TNF α) merupakan molekul yang memiliki peran penting dalam inflamasi, perkembangan sistem imun, apoptosis, dan metabolisme lemak. TNF α juga memiliki peran dalam berbagai macam penyakit seperti asthma, Crohn’s disease, rheumatoid arthritis, nyeri neuropatik, obesitas, diabetes tipe 2, syok septic, autoimunitas dan kanker. b. Tujuan kegiatan 1. Memahami prinsip kerja teknik ELISA 2. Mampu melakukan pemeriksaan kuantitatif TNF α dengan teknik Elisa 3. Mampu membuat grafik dari pengenceran standar dan memperoleh rumus persamaan perhitungan konsentrasi sampel dengan regresi linier 4. Mampu menentukan kadar TNFα pada sample. c. Pelaksanaan Kegiatan Praktikum dilaksanakan di Laboratorium Biomedik FKUB pada tanggal 21 September 2015 pukul 09.40 – 14.30 d. Alat dan Bahan : a) Human TNF α Immunoassay kit b) Vortex c) Micropipette d) Aquades e) ELISA reader e. Prosedur kerja a)

Menyiapkan reagen sample dan standart

b)

Menambahkan 50 µL Assay Diluent RD1F di masing – masing well

c)

Menambahkan 200 µL dari Standart dan sample di masing – masing well, inkubasi pada suhu ruangan selama 2 jam

d)

Mencuci dengan menggunakan wash buffer sebanyak 400 µL selama 4 kali pencucian.

e)

Menambahkan 200 µL TNF α conjugate di masing – masing well, tutup dengan adhesive strip. Inkubasi selama 1 jam pada suhu ruangan.

f)

Mencuci menggunakan wash buffer sebanyak 400 µL selama 4 kali pencucian.

g)

Menambahkan 200 µL substrate solution, inkubasi 20 menit pada suhu ruang dan jauhkan dari cahaya

h)

Menambahkan 50 µL stop solution di masing – masing well. Warna dari well harus berubah dari biru ke kuning

i)

Membaca hasil ELISA menggunakan microplate reader pada gelombang 450 nm

j)

Membuat grafik standar, memasukkan absorbansi sample ke rumus kurva standard dan menentukan kadarnya.

HASIL a. Hasil pengukuran standar No 1 2 3 4 5 6 7

Konsentrasi 1000 pg/mL 500 pg/mL 250 pg/mL 125 pg/mL 62,5 pg/mL 31,2 pg/mL 15,6 pg/mL

Absorbansi 1,658 0,982 0,387 0,250 0,182 0,096 0,062

b. Grafik standar menggunakan regresi linier

c.

Nilai absorbansi dan kadar sampel No 1 2 3 4

Sampel 1 Sampel 1 Sampel 2 Sampel 2

Absorbansi 2,199* 2,125* 1,990* 2,017*

kadar 2149 pg/mL* 2075 pg/mL* 1940 pg/mL* 1967 pg/mL*

Rata – rata 2112 pg/mL*

Standar deviasi 52,3259*

1953,5 pg/mL*

19,09*

Keterangan : * absorbansi sampel lebih tinggi dari absorbansi standar yang terbesar

d.

Well di dalam mikroplate yang akan dibaca di ELISA reader

Keterangan : kolom 1 berisi standar, sedangkan kolom 2 berisi sampel. Well A1 tidak diisi standar karena akan mengacaukan pembacaan. Well A2 dan B2 berisi sampel 1, sedangkan well C2 dan D2 berisi sampel 2 (duplo)

PEMBAHASAN Dari tabel hasil pengukuran standar dapat dibuat grafik dimana sumbu x adalah konsentrasi (pg/ml) dan y adalah nilai absorbansi. Dari grafik standar dapat diketahui persamaan regresi linier dari standar yaitu y=0,001x + 0,050. Persamaan tersebut akan digunakan untuk menghitung konsentrasi sampel. Contohnya pada sampel 1 diketahui bahwa absorbansi sebesar 2,199, maka cara menghitung kadarnya adalah (2,199 – 0,050) / 0,001 dan didapatkan hasil 2149pg/mL. Pada tabel nilai absorbansi dan kadar sampel ditunjukkan nilai absorbansi, kadar sampel yang diketahui dari memasukkan persamaan pada kurva standar, rata – rata kadar serta standar deviasi. Dari hasil pengukuran absorbansi sampel, diketahui bahwa besarnya absorbansi sampel berada di atas dari nilai absorbansi standar yang tertinggi (ditandai dengan tanda *). Hal tersebut mengakibatkan absorbansi sampel tidak terletak di dalam grafik standar. Apabila hal tersebut terjadi, maka diperlukan pengenceran sampel terlebih dahulu agar absorbansi sampel bisa berada di dalam grafik standar, sehingga bisa dihitung menggunakan persamaan dari standar.

KESIMPULAN DAN SARAN a) Kesimpulan -

prinsip kerja pemeriksaan ELISA pada praktikum ini adalah reaksi antigen-antibodi dengan teknik kuantitatif baerdasarkan jumlah ikatan antigen-antibodi yang spesifik yang ditentukan dengan nilai absorbansi

-

Dari grafik standar diperoleh persamaan regresi linier y=0,001x + 0,050 dengan R =0,990. 2

-

Nilai absorbansi dari sampel 1 dan sampel 2 lebih tinggi dari nilai absobansi tertinggi standar. Hal tersebut menunjukkan bahwa sebelum dilakukan pemeriksaan ELISA maka sampel perlu diencerkan terlebih dahulu supaya absorbansi sampel terletak di dalam grafik standar sehingga dapat dihitung kadarnya menggunakan persamaan regresi linier pada grafik standar.

b) Saran -

Pemeriksaan dengan metode ELISA memerlukan ketelitian yang tinggi terutama dalam hal pengenceran standar (proses pemipetan) karena apabila ada kesalahan pada konsentrasi standar akan berdampak pada perhitungan konsentrasi sampel selanjutnya

-

Diperlukan pengenceran sampel terlebih dahulu supaya absorbansi sampel tidak lebih tinggi dari absorbansi standar yang terbesar