laporan pengujian gram

LAPORAN PRAKTIKUM PENGANTAR BAKTERIOLOGI TUMBUHAN “Pewarnaan Gram, Uji KOH dan Pewarnaan Spora”

OLEH:

FITRAH AULIA NIM: D1 B1 12 031

PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI JURUSAN AGROTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS HALU OLEO 2014

I.PENDAHULUAN A. Latar Belakang Bakteri memiliki beberapa macam bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, dan spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung. Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarnaan. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna

asam dan pewarna basa. Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku. Setiap sel terdiri dari berbagai bahan kimia. Setiap sel akan menunjukkan susunan kimiawi yang spesifik. Sebagai contoh, bakteri Gram negatif memiliki lipopolisakarida dalam dinding selnya, Sedangkan bakteri Gram positif tidak. Sebaliknya pada banyak bakteri Gram positif terdapat asam teikoat. Bahan kimia ini tidak ditemukan pada gram negatif. Karakteristik utamanya adalah tebalnya lapisan peptidoglikan pada dinding sel. Akibatnya, pada saat prosedur pewarnaan Gram, meninggalkan

warna

biru.

Dinding

sel

Gram

positif

biasa

ditemukan

padaActinobacteria dan Firmicutes. Tidak seperti dinding sel Gram positif, dinding sel Gram negatif memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis. Hal ini menyebabkan lunturnya warna biru/merah muda saat disiram etanol. Melihat dari berbagai devinisi yang telah disebutkan diatas maka kami sangat tertarik untuk melakukan pengujian guna untuk mengidentifikasi dan mengetahui morfologi dari bakteri utamanya pada bakteri yang ber gram positif dan gram negatif serta dapat mengetahui morfologi bakteri aerob dan anaerob dengan cara pewarnaan gram, uji KOH dan pewarnaan spora bakteri.

A. Tujuan dan kegunaan Tujuan dari praktikum ini yaitu untuk mengetahui cara pewarnaan gram dengan uji KOH dan untuk mengidentifikasi bakteri Gram positif dan Gram negatif. Kegunaan dari praktikum ini yaitu agar dapat mengetahui cara pewarnaan gram dengan uji KOH dan agar dapat mengidentifikasi bakteri Gram positif dan Gram negatif.

II.

TINJAUAN PUSTAKA

Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan gram negative, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode tersebut diberi nama berdasarka penemunya ilmuwan Denmark, Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik tersebut pada tahun 1884 untuk membedakan antara Pneumococcus dan bakteri Klebsiella pneumonia (Karmana 2008). Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada zat warna basa bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut disebut kromofor dan memiliki muatan positif. Sebaliknya, pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna mempunyai muatan negatif zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan di dinding sel, membran sel dan sitoplasma, sewaktu proses pewarnaan muatan positif pada zat warna basa akan berkaitan dengan muatan negatif dalam sel, sehingga mikroorganisme lebih jelas terlihat (Dwidjoseputro, 2012). Bakteri garam positif adalah bakteri yang mempertahanka zat warna metil ungu atau Kristal ungu sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri jenis tersebut akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda atau merah. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri tersebut terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Sudjadi, 2006).

Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu atau kristal ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak. Pada uji pewarnaan gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metal ungu atau Kristal ungu, yang membuat semua bakteri gram negative menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian tersebut berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri tersebut berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka (Firmansyah, 2009). Metode pewarnaan spora berfungsi untuk mempermudah pengamatan agar peneliti atau pengamat mampu melihat spora, membedakan dengan sel vegetatif ataupun mengamati bentuknya. Endospora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya. Hal tersebut yang menjadi dasar dari metode pengecatan endospora dengan larutan hijau malasit. Metode Shaeffor, foton endospora diwarnai pertama dengan larutan hijau malasit. Pengecatan tersebut sifatnya kuat karena dapat berpenetrasi ke dalam endospora dengan perlakuan larutan hijau malasit. Teknik tersebut akan menghasilkan warna hijau pada endospora dan merah pada sel vegetatif (James, 2004).

III.

METODE PRAKTIKUM

A. Tempat dan Waktu Praktikum Bakteriologi ini dilaksanakan di Laboratorium Ilmu Hama dan Penyakit Tanaman Jurusan Agroteknologi Fakultas Pertanian Universitas Halu Oleo (UHO). Pada hari Kamis tanggal 23 Oktober 2014 pukul 10.00 WITA sampai selesai. B. Alat dan Bahan Alat yang digunakan pada praktikum ini yaitu kaca objek, jarum ose, pipet mikro, gelas kimia, mikroskop dan lampu bunsen. Bahan yang digunakan yaitu Isolat Xanthomonas, Ralstonia, ST21E, P11, PLKKS, tissue, alkohol 70 %, aquades, larutan safranin, dan malachite green C. Prosedur Kerja Praktikum Prosedur kegiatan dari praktikum ini yaitu sebagai berikut: A. Uji Larutan KOH 1.

Mengambil satu ose biakan bakteri uji dan mencampurkan 2 tetes larutan KOH 3% di atas gelas objek.

2.

Mengaduk secara merata dengan jarum ose, tarik jarum ose ke atas kaca objek dan amati pembentukan lendir. Jika terbentuk lendir mengidintifikasikan bakteri Gram-negatif, jika tidak berlendir mengindikasikan bakteri Gram positif.

3.

Melakukan hal yang sama untuk isolat-isolat bakteri lainnya.

B. Pewarnaan Gram 1. Membersihkan kaca objek dengan alcohol 70 % hingga bebas lemak, kemudian dilewatkan di atas api bunsen. 2. Mengambil secara aseptik satu ose biakan bakteri dari isolat yang telah disediakan dan letakkan pada kaca objek. Kemudian kering-anginkan, setelah kering, di lewatkan di atas api bunsen untuk memfiksasi bakteri tersebut. 3. Memberikan cat warna malachite green sebanyak 1-2 tetes dan diamkan selama satu menit. 4. Membilas kaca objek dengan air mengalir, kemudian kering-anginkan dengan menggunakan tissue atau ditekan-tekan. 5. Memberikan larutan peluntur ( alkohol) dan diamkan selama 1 menit, kemudian cuci dengan air mengalir dan kering-anginkan. 6. Memberikan larutan cat penutup ( safranin) dan diamkan selama 2 menit, lalu cuci dengan air mengalir dan kering-anginkan. 7. Mengamati kaca preparat pada mikroskop.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Hasil pengamatan praktikum ini dapat dilihat pada table berikut: Tabel : Pengujiian KOH pada bakteri No

Kode isolat

Hasil Pengamatan Uji KOH Reaksi Gram

Bentuk sel

1

Xanthomonas

Positif

Negatif

2

Ralstonia

Negatif

Positif

3

ST21E

Negatif

Positif

4

P11

Positif

Negatif

5

PLKK5

Negatif

Positif

B. Pembahasan Pada praktikum kali ini yaitu pewarnaan Gram dengan uji KOH, dimana pada identifikasi Gram bakteri ini menggunakan 5 isolat bakteri diantaranya yaitu isolat Xanthomonas, Ralstonia, ST21E, P11, dan PLKK5. Dari 5 isolat bakteri tersebut terdapat tiga isolat yang mengidentifikasi Gram positif yaitu Ralstonia, ST21E, PLKK5, serta ada dua isolat Gram negatif Xanthomonas dan P11. Pada pewarnaan Gram tidak terjadi perubahan warna yang telah di amati pada mikroskop, warnawarna tersebut tidak jelas apakah Gram negatif atau Gram posistif.

Berdasarkan hasil pengamatan dibawah mikroskop, untuk bakteri yang termasuk gram positif akan terlihat berwarna ungu, dimana warna ungu ini sendiri merupaka warna dari kristal violet yang sebelumnya diteteskan, warna ini melekat dengan kuat karena peptidoglikan dari bakteri gram positif tebal. Sedangkan untuk bakteri gram negatif akan terlihat warna merah, dimana warna merah ini merupakan warna dari pewarna safranin yang diteteskan terakhir kali, warna ini melekat dan warna ungu sama sekali tidak terlihat karena peptidoglikan dari bakteri gram negatif relatif tipis sehingga ia tidak mampu mempertahankan warna ungu layaknya bakteri gram positif. Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan Gram dibagi menjadi dua yaitu Gram positif dan Gram negatif. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan bakteri Gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Manurung, 2010). Secara teoritis Gram (+) memiliki dinding sel yang tebal dan lemak yang tipis sedangkan Gram (-) berlemak tebal dan berdinding sel tipis yang berada di ruang periplasma. KOH akan menyerang lemak (bilayer lipid) ini dan membuat sel Gram (-) pecah. Pecahnya sel melepaskan materi genetik (DNA) yang merupakan substansi melimpah di dalam sel bakteri. Molekul DNA sangat panjang bersifat sticky strings

(menyerupai lendir, getah atau dapat berarti lengket) yang memberikan hasil seperti lendir saat diangkat dengan jarum inokulum.

A. Kesimpulan Kesimpulan dari praktikum ini yaitu pada praktikum ini adalah pewarnaan Gram dengan uji KOH, hasil identifikasi Gram bakteri ini menggunakan 5 isolat bakteri diantaranya yaitu isolat Xanthomonas, Ralstonia, ST21E, P11, dan PLKK5. Dari 5 isolat bakteri tersebut terdapat tiga isolat yang mengidentifikasi Gram positif yaitu Ralstonia, ST21E, PLKK5, serta ada dua isolat Gram negatif Xanthomonas dan P11. Pada pewarnaan Gram tidak terjadi perubahan warna yang telah di amati pada mikroskop, warna-warna tersebut tidak jelas apakah Gram negatif atau Gram posistif. B. Saran Saran saya yaitu sebaiknya bahan-bahan untuk praktikum selanjutnya bisa terpenuhi agar praktikan dapat melakukan proses praktikum dengan baik lagi.

DAFTAR PUSTAKA Dwidjoseputro, D. 2012. Dasar-dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta. Firmansyah Ricky. 2009. Mudah dan Aktif Belajar Biologi. Jakarta : Grafindo Media Pratama (halaman : 109) James Joyce. 2002. Prinsip-Prinsip Sains Untuk Keperawatan. Retno Indah, penerjemah. Jakarta : Erlangga. Terjemahan dari : Principles of Science for Nurses (halaman : 115) Karmana Oman. 2008. Biologi. Jakarta : PT Grafindo Media Pratama (halaman : 56) Pearce Evelyn. 2009. Anatomi dan Fisiologi untuk Paramedis. Yuliani Sri, penerjemah. Jakarta : PT Gramedia Pustaka Utama. Terjemahan dari : Anatomy and Physiology for Nurses (halaman : 200) Sudjadi Bagod. 2006. Biologi Sains Dalam Kehidupan. Jakarta : Yudhistira Ghalia Indonesia (Halaman : 16)