Laporan Kromatografi Lapis Tipis

I.

NOMOR PERCOBAAN

: VI

II.

TANGGAL PRAKTIKUM

: 06 oktober 2014.

III. JUDUL PRAKTIKUM IV. TUJUAN PRAKTIKUM

: Kromatografi Lapis Tipis : Untuk Mengetahui Cara Pemisahan AsamAmino Dengan KLT Dan Mengetahui HargaRf Asam Amino

V.

ALAT DAN BAHAN Alat :

Bahan :



Plat Kromatografi

- Silika Gel



Selembar Kaca

- Pelarut Etanol



Penggiling

- Larutan Ninhidrin



Beker Gelas

- Larutan Kuprinitrat



Pengaduk Magnetik

- Larutan glutamat



Gelas Ukur

- Larutan Alanin



Pipet Tetes

- Larutan Glysin



Penyemprot

- Larutan Arginin



Penggaris

- Aquades



Pensil dan Oven

VI. DASAR TEORI Pada umumnya asam amino diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, Dengan cara ini diperoleh campuran bermacam-macam asam amino dan untuk menentukan jenis asam amino maupun kuantitas masing-masing asam amino perlu diadakan pemisahan antara asam-asam amino tersebut. Banyak metode yang dapat dilakukan dalam pemisahan dan identifikasi asam amino,

seperti

metode

gravimetri,

kalorimetri,

mikrobiologi,

kromatografi

dan

elektroforesis. Salah satu meteode yang paling banyak digunakan dalam pemisahan asamasam amino adalah metode romatografi. Asam amino mempunyai sifat yaitu dapat dipisahkan. Pada umumnya, asam amino diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, baik menggunakan enzim maupun asam. Dengan cara ini diperoleh dengan campuran bermacam-macam asam amino dan untuk menentukan jenis asam amino maupun kuantitas masing-masing asam amino perlu diadakan pemisahan antara asam-asam amino tersebut. Ada beberapa metode analisis asam amino, misalnya metode gravimetri, mikrobiologi, kromatografi, dan elektroforesis. Salah satu metode yang banyak memperoleh pengembangan adalah metode kromatografi. Macam-macam kromatografi adalah kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis dan kromatografi penukar ion. Pada umumnya asam amino diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, baik menggunakan enzim maupun asam. Dengan cara ini diperoleh campuran bermacam-macam asam amino dan untuk menentukan jenis asam amino maupun kuantitas masing-masing asam amino perlu diadakan pemisahan antara asam-asam amino tersebut Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah salah satu metode pemisahan komponen menggunakan fasa diam berupa plat dengan lapisan bahan adsorben inert. KLT merupakan salah satu jenis kromatografi analitik. KLT sering digunakan untuk identifikasi awal, karena banyak keuntungan menggunakan KLT, di antaranya adalah sederhana dan murah. KLT termasuk dalam kategori kromatografi planar, selain kromatografi kertas. KLT dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dipakai selayaknya sebagai metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif atau preparatif. Kedua, dipakai untuk menjajaki

sistem pelarut dan sistem penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi kolom atau kromatografi cair kinerja tinggi. KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa – senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida – lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi dan isolasi senyawa murni skala kecil. Pelarut yang dipilih untuk pengembang disesuaikan dengan sifat kelarutan senyawa yang dianalisis. Bahan lapisan tipis seperti silika gel adalah senyawa yang tidak bereaksi dengan pereaksi – pereaksi yang lebih reaktif seperti asam sulfat. Data yang diperoleh dari KLT adalah nilai Rf yang berguna untuk identifikasi senyawa. Nilai Rf untuk senyawa murni dapat dibandingkan dengan nilai Rf dari senyawa standar. Nilai Rf dapat didefinisikan sebagai jarak yang ditempuh oleh senyawa dari titik asal dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut dari titik asal. Oleh karena itu bilangan Rf selalu lebih kecil dari 1,0. Pelaksanaan KLT 1.

Fase Diam Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan

diameter partikel antara 10-30 μm. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja KLT dalam hal efisiensi dan resolusinya. Penjerap yang paling sering digunakan adalah silika dan serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi yang utama pada KLT adalah adsorpsi dan partisi (Gandjar & Rohman, 2007). 2.

Fase Gerak Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan mencoba-

coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling sederhana ialah campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak :

1. Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan teknik yang sensitif. 2. Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan. 3. Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzene akan meningkatkan harga Rf secara signifikan (Gandjar & Rohman, 2007). 3.

Penotolan Sampel Untuk memperoleh roprodusibilitas, volume sampel yang ditotolkan paling sedikit

0,5 μl. Jika volume sampel yang ditotolkan lebih besar dari 2-10 μl, maka penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar totolan. 4.

Pengembangan Bila sampel telah ditotolkan maka tahap selanjutnya adalah mengembangkan sampel

dalam bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhi dengan uap fase gerak. Tepi bagian bawah lempeng tipis yang telah ditotoli sampel dicelupkan kedalam fase gerak kurang lebih 0,5-1 cm. Tinggi fase gerak dalam bejana harus dibawah lempeng yang telah berisi totolan sampel. Bejana kromatografi harus tertutup rapat dan sedapat mungkin volume fase gerak sedikit mungkin, akan tetapi harus mampu mengelusi lempeng sampai ketinggian lempeng yang telah ditentukan. Untuk melakukan penjenuhan fase gerak, biasanya bejana dilapisi dengan kertas saring. Jika fase gerak telah mencapai ujung dari kertas saring, maka dapat dikatakan bahwa fase gerak telah jenuh (Gandjar & Rohman, 2007).

5.

Deteksi Bercak Deteksi bercak pada KLT dapat dilakukan secara kimia dan fisika. Cara kimia yang

biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui cara penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas. Cara fisika yang dapat digunakan untuk menampakkan bercak adalah dengan cara pencacahan radioaktif dan fluorosensi sinar

ultraviolet. Fluorosensi sinar ultraviolet terutama untuk senyawa yang dapat berfluorosensi, membuat bercak akan terlihat jelas. Deteksi senyawa dilakukan dengan menggunakan detektor UV di bawah sinar UV 254 nm, indikator pada plat KLT akan memancarkan warna hijau dan pada UV 366 nm akan memancarkan warna ungu. Komponen yang menyerap cahaya pada 254 atau 366 nm akan tampak sebagai bercak gelap pada plat yang bercahaya. Metode deteksi lain adalah dengan menggunakan pereaksi semprot.

VII. PROSEDUR PERCOBAAN Pembuatan lapis tipis Plat gelas yang dipakai harus bersih, terutama bebas dari lemak. Timbag 25 gram Silica gel G dan aduk ini dengan 50 ml air dengan pengaduk magnetik sampai homogen. Suspensi ini dimasukkan ke alat pembuatan lapis tipis (alat Stahl atau alat buatan dalam negeri). Tebal lapis tipis adalah sekitar 250 mu. Biarkan lapis tipis ini ditempatnya kira-kira 10 menit. Sesudah ini boleh dipindah tempatnya dan dibiarkan kering diudara selama semalam. Meneteskan larutan zat yang akan diperiksa Zat asam amino yang diperiksa, paling banyak 0,5 – 2,0 ug dalam 0,5 ul, diteteskan pada plat silica gel kira-kira 1 cm dari tepi bawah. Jika banyak macam zat yang akan diselidiki maka ini dapat diteteskan sejajar dengan jarak kira-kira 1 cm antara dua zat dan kira-kira 1,5 cm dari tepi sisi. Penetesan harus dilakukan dengan hati-hati seklai supaya permukaan lapis tidak rusak. Tempat-tempat pada plat yang akan ditaruh (ditetesi) dengan alrutan-larutan zat tersebut, sebelum diberi titik dengan ujung pensil yang runcing, guna mengetahui kelak titik-titik permulaan. Lubanglubang yang kecil ini tidak akan banyak mempengaruhi bentuk noda. Sebelum eluaen dijalankan maka tetesan-tetesan tersebut harus dibiarkan dulu sampai kering. Ruang Kromatografi Ruang kromatografi harus dapat ditutup dengan rapat. Ruang ini diisi dengan eluaen sedemikian sehingga apabila plat dimasukkan bagian bawahnya terendam

sampai bawah tempat tetesan zat-zat yang diselidiki. Dinding ruang harus dilapisi dengan kertas saring yang dibasahi dengan eluen. Ini supaya ruang kromatografi mudah dan cepat dijenuhi dengan uap eluen. Cara melakukan elusi Plat-plat yang telah ditetesi asam amino dan yang telah kering, dimasukkan ke dalam ruang kromatografi. Disini yang dipakai adalah kromatografi mendaki. Hendaknya suhu dibuat tetap. Kromatografi diberhentikan setelah berjalan sekitar 10 cm. Pada batas ini semulad diberi tanda garis dengan ujung pensil yag runcing. Plat diambil dan dikeringkan pada suhu kamar. Cara perwarnaan a) Dengan hati-hati disemprot dengan larutan ninhidrin. Asam asetat yang ditambahkan dimasukkan untuk menjaga pH sekitar 5, juga apababila fase gerakj yang dipakai bersifat alkali. Kemudian plat dikeringkan pada 60oC selama 30 menit atau 110oC selama 1`0 menit. Kalau dipanasi lebih lama, maka nantinya plat akan berwarna sedikit rose. b) untuk menstabilkan noda-noda setelah diwarnakan dengan ninhidrin, maka plat kemudian disemprotkan dengan larutan penyemprot kuprinitrat (lihat bab metrial). Maka akan terjadi ikatan komplek Cu-ninhidrin yang berwarna. Warna ini hanya stabil apabila tidak ada asam bebas. Maka sesudah disemprot, plat harus dikenakan uap amonia. Juga plat tidak boleh terdisoasiasi dalam suasana basa antara pH 7-9. walau disosiasi ini reversibel. Di atas pH 9 disosiasi tersebut bersifta irreversibel. VIII. HASIL PENGAMATAN Asam amino

Jarak eluen (cm)

Jarak noda (cm)

Rf (cm)

1

Glutamat

10

3.3

0.33

Rf (cm) teori 0.36

2

Arginin

10

2.2

0.22

0.20

3

Glysin

10

2.6

0.26

0.26

4

Alanin

10

2.5

0.25

0.28

No

IX. REAKSI REAKSI ASAM AMINO DENGAN ETANO L O

O H3N

+

C CH

O

+

H3N

CH 3CH 2OH

+

C CH

OCH 2CH 3

R

R Asam Amino

Etanol

REAKSI ASAM AMINO DENGAN NINHIDRIN O

H

C

OH

+

C OH

C

R

COOH

NH2

O

Ninhidrin

C

Asam Amino H

NH 3

+

CO 2

R

O

O C

C

OH C H

C

O

O C

OH C OH

C O

Ninhidrin O

O

C

C C

N

C

C O

C O

Berwarna merah muda

+

3H 2OO

+

H

+

+

H2O

REAKSI ASAM AMINO DENGAN KUPRINITRIT O H2N

C CH R

O

O OH

+

Cu(NO 3)2 kuprinitrit

O

O C Cu R

C

++

R NH 2

NH 2

asam amino senyaw a kompleks ungu

+

2NO 3-

X. PEMBAHASAN Pada percobaan kali ini berjudul Kromatografi Lapis Tipis pada asam amino yang bertujuan untuk mengetahui cara pemisahan asam amino dengan cara kromatografi lapis tipis dan menghitung harga Rf dari asam-asam amino yang diselidiki. Reaksi antara ninhidrin dengan asam amino membentuk produk berwarna ungu. Pada percobaan kali ini media pemisahan yang digunakan adalah silica gel G pada lempeng kaca. Sebagai pengikat silica gel digunakan plester, yang juga disebut sebagai fase diam hidrofilik. Kemudian plat silica gel dibiarkan kering dengan bantuan cahaya matahari dan udara. pembuatan lapisan tipis dengan menambahkan 10 gr silika gel dengan 25 ml air yang dituangkan kedalam plat kaca. Kemudian silikanya diratakan pada permukaan plat kaca yang telah diukur pinggir kanan-kirinya 1 cm dan diselotip. Pada saat meratakan hanya dapat diratakan dengan satu perataan tidak boleh berulang-ulang agar didapatkan permukaan yang tidak bergelombang. asam amino yang diperiksa diantaranya Alanin, Glutamat, Glysin,dan Arginin. Diteteskan pada plat kaca 1.5 cm dari tepi bawah plat yang diteteskan berjajar dengan jarak 2 cm. Lalu asam amino dimasukkan ke dalam ruang kromatografi yang telah diisi dengan eluen. Eluen yang digunakan adalah 100:39 etanol dan air.etanol bergerak naik hingga jarak 10cm kemudian di keringkan di udara. Setelah kering, Untuk melihat bercak zat asam amino digunakan larutan penyemprot ninhidrin. Setelah disemprot, pada silica gel muncul bercak – bercak atau noda. Noda yang dihasilkan oleh setiap larutan asam amino (Alanin, glutamate,arginin,glysin.) berwarna merah keunguan. Uji ninhidrin positif untuk semua asam amino yang memiliki gugus amino bebas. Bercak-bercak warna

yang terbentuk diukur.Berdasarkan hasil

percobaan yang dilakukan, diperoleh nilai Rf untuk asam amino glutamat adalah 0.33 asam amino Arginin adalah 0.22 asam amino Glysin adalah 0.26 dan asam amino Alanin adalah 0,25. Hasil nilai Rf dari larutan sampel ini tidak ada yang sesuai dengan asam amino tersebut namun, nilainya yang sama adalah dengan nilai asam amino Glysin.

Adanya kesalahan dari hasil percobaan yang dilakukan, yaitu perbedaan nilai Rf asam amino yang diperoleh dengan nilai Rf asam amino berdasarkan teori, hal ini mungkin disebabkan karena saat melakukan penyemprotan yang mendorong asam amino sehingga panjang warna yang terbentuk tidak sesuai dengan teori.

XI. KESIMPULAN a)

Pada Pembuatan lapis tipis, plat kacanya yag digunakan harus benar-benar terbebas dari lemak, karena bila ada dapat mengganggu jalannya kromatografi.

b)

Pada kromatografi fase geraknya adalah etanol dan fasa diamnya adalah silica gel.

c)

Digunakan larutan cuprinitrat pada saat pewarnaan adalah untuk menstabilkan noda – noda yang timbul karena terjadi ikatan kompleks ninhidrin yang berwarna.

d)

Nilai Rf asam amino glutamate adalah 0.33, arginin adalah 0.22,glysin 0.26 dan alanin 0.28.

e)

Setiap asam amino memiliki koefisien partisi tertentu untuk pasangan pelarut tertentu. Asam amino yang memiliki afinitas terhadap fasa gerak (pelarut) yang lebih besar akan tertahan lebih lama pada fasa gerak, sedangkan zat terlarut yang afinitasnya terhadap fasa gerak lebih kecil akan tertahan lebih lama pada fasa diam.

f)

Semakin besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak bergeraknya senyawa tersebut pada plat kromatografi lapis tipis

XII. DAFTAR PUSTAKA Adorana,erlinda.2013. Kromatografi Lapis Tipis. http://erlindaadonara.blogspot.com/2013 /09/kromatografi-lapis-tipis.html.diakses pada 9 oktober 2014. Anonim.2013. Kromatografi lapis tipis. http://www.ilmukimia.org/2013/05/kromatografilapis-tipis-klt.html.diakses pada 9 oktober 2014.