Laporan Klt Densitometer

BAB I PENDAHULUAN 1.1

TUJUAN a. Tujuan Umum Mahasiswa mampu melakukan uji konfirmasi senyawa golongan narkotika atau psikotropika pada urin pecandu narkoba dengan metode KLT-spektrofotodensitometer.

b. Tujuan Khusus 1. Untuk dapat melakukan penyiapan sampel untuk ekstraksi cair-cair dan ekstraksi fase padat. 2. Untuk dapat memisahkan obat-obat golongan amfetamin dan opiat dari sampel urine dengan ekstraksi cair-cair dan ekstraksi fase padat. 3. Mampu melakukan penyiapan plat KLT-spektrofotodensitometer. 4. Mampu menggunakan alat spektrodensitometri. 5. Mampu melakukan analisis senyawa-senyawa golongan narkotika atau psikotropika berdasarkan hasil uji konfirmasi.

1.2

LATAR BELAKANG Masalah penyalahgunaan Narkotika, Psikotropika dan Zat Adiktif lainya (NAPZA) atau istilah yang populer dikenal masyarakat sebagai NARKOBA (Narkotika dan Bahan/ Obat berbahanya) merupakan masalah yang sangat kompleks, yang memerlukan upaya penanggulangan secara komprehensif dengan melibatkan kerja sama multidispliner, multisektor, dan peran

serta

masyarakat

secara

aktif

berkesinambungan, konsekuen dan konsisten.

yang

dilaksanakan

secara

Meskipun dalam Kedokteran, sebagian besar golongan Narkotika, Psikotropika dan Zat Adiktif lainnya (NAPZA) masih bermanfaat bagi pengobatan, namun bila disalahgunakan atau digunakan tidak menurut indikasi medis atau standar pengobatan terlebih lagi bila disertai peredaran dijalur ilegal, akan berakibat sangat merugikan bagi individu maupun masyarakat luas khususnya generasi muda. Dari data yang ada, penyalahgunaan NAPZA paling banyak berumur antara 15–24 tahun. Tampaknya generasi muda adalah sasaran strategis perdagangan gelap NAPZA. Pemeriksaan konfirmasi adalah suatu pemeriksaan lanjutan yang lebih akurat karena hasil yang dikeluarkan sudah definitive menunjukkan jenis zat narkotika/psikotropika yang terkandung dalam sampel. Uji konfirmasi senyawa golongan narkotika atau psikotropika pada urin pecandu narkoba dapat dilakukan dengan metode KLT-spektrodensitometer. Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan salah satu teknik yang sering digunakan dalam mengidentifikasi suatu senyawa dalam analisis toksikologi dan digunakan secara luas dalam pemisahan dan identifikasi obat karena teknik ini cepat, menghasilkan hasil dengan sensitivitas yang tinggi serta memerlukan sedikit biaya. Dalam uji konfirmasi ini, noda yang dihasilkan pada plat dari proses pemisahan yang terjadi pada KLT nantinya akan dibuatkan spektrumnya dari panjang gelombang 190-400 nm menggunakan spektrodensitometer. Nah untuk dapat melakukan uji konfirmasi ini dengan baik dan benar sehingga nantinya dapat diperoleh hasil uji konfirmasi terhadap senyawa golongan narkotika atau psikotropika pada urin pecandu yang valid, maka praktikan diharapkan mampu melakukan penyiapan plat KLT-spektrodensitometer serta mampu menggunakan alat spektrodensitometer itu sendiri.

BAB II DASAR TEORI

2.1

Ekstraksi Ekstraksi adalah proses penarikan suatu zat dengan pelarut. Ekstraksi menyangkut distribusi suatu zat terlarut (solut) diantara dua fasa cair yang tidak saling bercampur. Teknik ekstraksi sangat berguna untuk pemisahan secara cepat dan bersih, baik untuk zat organik atau anorganik, untuk analisis makro maupun mikro (Rahayu, 2011). a. Ekstraksi Cair-Cair Ekstraksi cair-cair (liquid extraction, solvent extraction): yaitu pemisahan solute dari cairan pembawa (diluen) menggunakan solven cair. Campuran diluen dan solven tersebut bersifat heterogen (immiscible, tidak saling campur), dan jika dipisahkan terdapat 2 fase, yaitu fase diluen (rafinat) dan fase solven (ekstrak). Pada ekstraksi cair-cair, satu komponen bahan atau lebih dari suatu campuran dipisahkan dengan bantuan pelarut. Proses ini digunakan secara teknis dalam skala besar misalnya untuk memperoleh vitamin, antibiotika, bahan-bahan penyedap, produk-produk minyak bumi dan garam-garam. logam. Proses inipun digunakan untuk membersihkan air limbah dan larutan ekstrak hasil ekstraksi padat cair. b. Solid Phase Ekstraction (SPE) Ekstraksi fase padat (Solid Phase Ekstraction) merupakan suatu teknik preparasi sampel yang sangat bermanfaat. SPE mengacu pada peristiwa pelepasan senyawa kimia dari sampel cairan yang mengalir karena adanya

retensi pada suatu padatan penyerap, yang kemudian diikuti dengan perolehan kembali analit yang diinginkan melalui proses elusi.

2.2

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan salah satu analisis kualitatif dari

suatu sampel yang ingin dideteksi dengan memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan perbedaan kepolaran. Adapun prinsip kerjanya yaitu memisahkan sampel berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel dengan pelarut yang digunakan. Teknik ini biasanya menggunakan fase diam dari bentuk plat silika dan fase geraknya disesuaikan dengan jenis sampel yang ingin dipisahkan. Larutan atau campuran larutan yang digunakan dinamakan eluen. Semakin dekat kepolaran antara sampel dengan eluen maka sampel akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut. Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda. campuran pelarut pengembang dan fasa diamnya dapat berupa serbuk halus yang berfungsi sebagai permukaan penyerap (kromatografi cair-padat) atau berfungsi sebagai penyangga untuk lapisan zat cair (kromatografi cair-cair). Fasa diam pada KLT sering disebut penyerap walaupun berfungsi sebagai penyangga untuk zat cair di dalam sistem kromatografi cair-cair. Hampir segala macam serbuk dapat dipakai sebagai penyerap pada KLT, contohnya silika gel (asam silikat), alumina (aluminium oksida), kiselgur (tanah diatomae) dan selulosa. Silika gel merupakan penyerap paling banyak dipakai dalam KLT.

2.3

Instrumen Spektrofotodensitometri Thin Layer Chromatography Scanner yang lebih dikenal dengan nama

spektrofotodensitometer semakin banyak dan luas digunakan dalam analisis kualitatif dan kuantitatif (Hahn-Deinstrop, 2007). Instrumen spektrofotodensitometer terdiridari

sumber cahaya dalam rentang panjang gelombang 200-800 nm yaitu lampu deuterium (rentang spektra 200-400 nm), lampu tungsten (rentang spektra 400-800 nm), slit (celah), monokromator untuk memilih panjang gelombang yang sesuai, sistem untuk memfokuskan sinar pada plat, filter fluoresensi, pengganda foton (photomultiplier) dan rekorder (Ganjar dan Rohman, 2007 ; Schmutz, 1980). Analisis KLT dengan menggunakan spektrofotodensitometri dapat dilakukan dengan menggunakan mode absorbsi atau flouresensi. Pada umumnya yang paling sering digunakan adalah mode absorbsi dengan menggunakan sinar UV pada λ 190300 nm. Oleh karena kebanyakan plat KLT menggunakan silika gel yang bersifat opaque (tidak tembus cahaya), maka pengukuran dengan mode transmitan tidak cocok digunakan. Penentuan absorpsi analit pada plat KLT opaque didasarkan pada rasio intensitas antara radiasi elektromagnetik yang datang dengan intensitas radiasi elektromagnetik yang dipantulkan/direfleksikan. Pengukuran flouresensi merupakan metode pengukuran langsung yang peka untuk senyawa dalam daerah ultraviolet dapat ditentukan melalui emisi penyinaran sekunder. Intensitas cahaya flouresensi setelah dipancarkan melalui suatu monokromator, diukur secara selektif dalam kondisi yang sesuai, berbanding lurus dengan berat senyawa yang ada dalam noda (Sherma and Fried, 1994).

2.4

Uji Konfirmasi terhadap Narkotika dan Psikotropika Pemeriksaan konfirmasi adalah suatu pemeriksaan lanjutan yang lebih akurat

karena hasil yang dikeluarkan sudah definitif menunjukkan jenis zat narkotika psikotropika yang terkandung di dalam sampel tersebut. Pemeriksaan dilakukan apabila hasil pemeriksaan pendahuluan (Screening Test) memberi hasil positif (Anonim, 2008). Pada uji konfirmasi dengan KLT, setiap senyawa yang terlarut dalam fase gerak memiliki hambatan yang berbeda saat bergerak pada fase diam. Besar hambatan ini dapat dinyatakan dengan nilai Rf atau hRf (hRf = 100 Rf) (Sherma and Fried, 1996). Harga Rf dapat dihitung dengan persamaan berikut :

Rf 

Jarak yang ditempuh masing - masing senyawa jarak yang ditempuh fase gerak ..........……………(1)

Uji konfirmasi dilakukan dengan membandingkan nilai hRf analit dengan data senyawa standar dan pustaka. Pada prakteknya, nilai hRf bervariasi karena pengaruh faktor lingkungan seperti kejenuhan bejana kromatografi (chamber), pH medium, suhu penguapan fase gerak pada plat, kadar analit yang ditotolkan (Sherma and Fried, 1996 ; Flanagan et al., 2007). Terdapat metode yang digunakan untuk mengurangi

variasi hRf tersebut,

Deutshe Forschungsgemeinschaft (DFG) dan The International Association of Forensic Toxicologist (TIAFT) menggunakan harga

hRf terkoreksi (hRfc) yang

relatif konstan untuk masing-masing senyawa pada tiap sistem TLC tertentu (Zeeuw et al, 1992). Harga hRfc suatu analit dapat dihitung dengan menggunakan metode korelasi poligonal. Metode ini membutuhkan minimal empat senyawa standar pembanding yang harga hRfc tersebar di antara harga hRfc sampel. Perhitungan poligonal untuk menentukan harga hRfc analit dapat dilihat seperti pada gambar 1.

Gambar 1. Grafik penghitungan hRfc secara Poligonal (Zeeuw et al., 1992) Keterangan: Sumbu x = Harga hRf analit; sumbu y = harga hRfc senyawa 4 pembanding A, B, C, dan D adalah senyawa standar.

Berdasarkan gambar 2.1 di atas, hRf

senyawa X berada di antara hRfc

senyawa-senyawa standar dimana harga hRfc analit dapat diperoleh dengan memplot ke sumbu X. Disamping menggunakan kurva diatas, harga hRfc analit langsung dapat dihitung menggunakan rumus berikut (Zeeuw et al., 1992). hRf c (X)  hRf c (C) 

Δc hRf(X)  hRf(C), dimana...............................................(2) Δ

 c  hRf c ( D) - hRf c (C ) .........................................................................................(2a)   hRf (D) - hRf (C ) .............................................................................................(2b) Bila harga hRfc analit yang didapat dapat dibandingkan dengan database harga hRfc di pustaka, maka akan diperoleh beberapa kemungkinan senyawa yang sesuai, hal ini akan memunculkan banyak senyawa yang dicurigai sebagai analit. Untuk lebih

meyakinkan hasil analisis, maka digunakan kombinasi harga hRfc

dengan spektrum analit. Dari kombinasi 2 variabel ini akan diperoleh deretan senyawa-senyawa yang berurutan, dimana senyawa yang korelasinya paling sesuai dengan analit disebut dengan senyawa hit factor.

BAB III PROSEDUR KERJA

3.1 Medium Analit Sampel: Urin Target 

Derivat Amfetamin : Amfetamin (AM), Metamfetamin (MA), dan Metilendioksimetanfetamin (MDMA)



Golongan Opiat : Morfin dan Codein

3.2 ALAT DAN BAHAN a.

ALAT 1. Pipet tetes 2. Botol vial

11. Eppendorf 12. Oven

3. Aluminium foil

13. Erlenmeyer

4. Kulkas/freezer

14. Linomart

5. Pipet ukur

15. Spektrodensitometer

6. Gelas beaker

16. Pemanas dari Caorning PC-420D.

7. Tabung reaksi

17. Catridge SPE ACCUBOND dan CHROMABOND

8. Benjana kromatografi vertical (Camag-MuttenzSwitzerland) 10x10

b. BAHAN 1. Bahan Kimia dan Pelarut Bahan kimia dan pelarut yang digunakan mempunyai derajat kemurnian pro analisis dari Merck-Germany yaitu methanol,kloroform, sitoheksan, toluene, dietilamin, HCl, dan NaOH , amoniak 25%, aseton, dan etanol. 2. Fase Diam Fase diam yang digunakan adalah plat Al-TLC Si 60 GF254 dari Merk-Germany. 3. Senyawa Standar Senyawa standar pembanding digunakan larutan papavaerin, bromheksin, teofilin, dan dekstrometorpan. 4. Buffer pospat pH 10,5 5. Buffer phospat pH 9,3 6. Metanol 7. Kloroform 8. Isopropanol 9. Aquadest

3.3 SKEMA KERJA 

Ekstraksi sampel dengan menggunakan ekstraksi cair-cair 1 ml sampel urine + 1 ml buffer fosfat pH 9,3 + 2 ml campuran kloroform : isopropanol = 3 : 1 (7,8 mL : 2,2 mL)

Tabung divortex

Emulsi

kecepatan 2500 rpm selama 30

sempurna

Fase Air dalam tabung + 1 mL buffer fosfat pH 10,5 + 2 mL campuran kloroform : isopropanol = 3 : 1 (7,8 mL :2,2 mL)

Fase kloroform diambil ditampung pada tabung ( Fraksi A mengandung morfin)

menit Tabung dicentrifuge dgn kecepatan 2500 rpm selama 10 menit Terbentuk dua fase pada tabung yaitu fase kloroform dan fase air

Tabung divortex Dgn kecepatan 2500 rpm selama 30 menit Larutan homogen dalam tabung centrifuge

Tabung dicentrifuge dgn kecepatan 2500 rpm selama 10 menit

Terbentuk dua fase pada tabung yaitu fase kloroform dan fase air

Fase kloroform sebagai Fraksi B diambil dan ditampung pada fraksi A Residu + dilarutkan dalam 25 µl metanol

Diuapkan pada suhu 60-700C

Larutan fraksi A dan B yang telah digabung



Ekstraksi sampel dengan menggunakan SPE (Solid Phase Extraction) Menggunakan fase diam Kolom SPE Accubond II Evidex Catridge

a. Preparasi Sampel Amfetamin 5 mL sampel urine + 3 mL K2HPO4 0,1 M pH 6

dihomogenkan

Sampel siap digunakan

Opiat 5 mL sampel urine + 0,5 mL HCl

Dipanaskan 1200C selama

Larutan sampel

20 menit dan dinginkan

urine

Ditambahkan 0,75 mL 10 N NaOH pH 6,5-7,5 dgn 2,5 mL 0,5 M asam fosfat

Sampel siap digunakan

b.

Ekstraksi Sampel Amfetamin SPE Condition

Kolom SPE

+ 6 ml methanol + 6 mL K2HPO4 0,1 M pH 6

Kolom SPE yang telah dikondisikan + Sampel yang

Rinse

telah dipreparasi + 3 mL air + 3 mL 0,1 M asam asetat + 3 mL metanol

Kolom SPE yang bebas

Eluat + 3 mL isopropil (60/40/1)

kloroform- pengotor (analit berada alcohol-HCl dalam padatan penyerap)

Diuapkan pada suhu 650C Elution Fraksi-fraksi yang telah diuapkan

Analit hasil Direkonstitusi dengan methanol sebanyak 25 µl

ekstraksi

Opiat SPE Condition

Kolom SPE

+ 6 ml methanol + 6 mL K2HPO4 0,1 M pH 6

Kolom SPE yang telah dikondisikan + 3 mL K2HPO4 0,1 M + masukkan sampel yang telah dipreparasi

Rinse

+ 3 mL air + 3 mL sodium asetat 0,1 M pH 4,5 + 3 mL metanol

Kolom SPE yang bebas Eluat + 3 mL kloroformisopropil alcohol-NH4OH (78/20/2)

pengotor (analit berada dalam padatan penyerap)

Diuapkan pada suhu 650C

Elution

Fraksi-fraksi yang telah diuapkan



Analit hasil Direkonstitusi dengan methanol sebanyak 25 µl

ekstraksi

Sistem Kromatografi a. Penyiapan Fase Diam Plat Al-TLC Si 60 GF254

Plat siap digunakan

Dipotong sesuai ukuran yang diperlukan

Diaktivasi pada suhu 1200 C selama 30 menit dalam oven

Plat yang sudah dipotong Dicuci/dielusi dengan metanol

Plat yang sudah dielusi

b. Penyiapan Larutan Pengembang TB Sikloheksana: Toluen:Dietilamin (75:15:10)

Larutan pengembang siap digunakan Dimasukkan ke dalam labu ukur & dihomogenkan

c. Penjenuhan Bejana Kromatografi Pelarut pengembang

Dimasukkan ke dalam bejana kromatografi yang dilapisi kertas saring

Pelarut pengembang TB dalam bejana Dibiarkan ± 30 menit Bejana siap digunakan

d. Larutan Standar Amfetamin dan Morfin

0,25 m standar amfetamin + 0,25 ml standar opiat

Larutan Standar Dimasukkan kedalam labu ukur dan add dengan methanol

e. Larutan Standar Pembanding Fase Gerak Sistem TB

0,5 ml Larutan Teofilin+0,5 ml papaverin+ 0,5 ml dekstrometorfan+ 0,5 ml bromheksin (masing-masing konsentrasi 1mg/ml)

Larutan Dicampur dan dihomogenkan

standar

pembanding TB



Pemisahan Hasil Ekstraksi Sampel dengan KLT

2 PLAT Al-TLC Si 60 GF254

yang sudah diprewashing dan diaktivasi

2 PLAT Al-TLC Si 60 Ditotolkan standar pembanding serta 25 µl larutan ekstrak yang direkontitusi dengan metanol

GF254 siap dielusi Dimasukkan kedalam bejana kromatografi yang sudah jenuh

Dielusi dengan sistem gerak TB sampi 90 mm dari tepi atas plat

Hasil elusi KLT pada plat



Plat diangkat dan dikeringkan 0 dalam oven suhu 60 C selama 10 menit

Plat yang sudah dielusi dengan KLT

Deteksi dengan Spektrofotodensitometeri dan Penetapan Hasil Ekstraksi Sampel

Hasil elusi KLT pada plat

Dipindai dengan TLC scanner (Camag-MuttenzSwitzerland pada λ tertentu

Hasil kromatogram sebagai hRfc

Jenis Dicocokkan kedua hasil

Setiap noda dibuat spektrumnya dari λ 190-400nm

Hasil spectrum masing-masing λ

Senyawa

BAB IV PEMBAHASAN 4.1 1.

Hasil Pengamatan Preparasi Sampel Urine dengan Ekstraksi Cair-Cair  Kode Sampel : x  Target analit : Morfin dan MDMA No

Gambar

Keterangan

1

Sampel urine X

 Ekstraksi LLE dilakuakn terhadap sampel urine x  Target analit : Morfin

2

Sampel Urine + Buffer Fosfat pH 9,3 +

 Bagian atas : buffer fosfat

campuran kloform:isopropanol (3:1)

 Bagian Bawah : campuran kloroform isopropanol

Bagian atas

Bagian bawah

3

 Proses

Proses homogenisasi

homogenisasi

dilakukan

menggunakan

vortex dengan kecepatan 3000

rpm

selama

10

menit.

4

Setelah

proses

homogenisasi

vortex

dengan Setelah

divortex,

tampak

emulsi

campuran

pelarut

organic (kloroform:isopropanol) dan dengan sampel.

5

Campuran sampel dan pelarut organic Setelah disentrifuse larutan akan terpisah menjadi 2

setelah disentrifuse

bagian:  Bagian atas : Fase air (terdapat pengotor serta sebagaian Fase Air

Kloroform (fraksi A)

masih

terdapat dalam fase air)  Bagian

Fase

analit

bawah:

Fase

kloroform/Fraksi A (analit yang diinginkan terdapat dalam fase kloroform)

6

Campuran Fraksi A dan Fraksi B

Merupakan

fraksi

yang

mengandung analit dan siap untuk

diuapkan

untuk

menghilangkan pelarut yang digunakan pada ekstraksi.

2.

Pengenceran Standar Amfetamin dan Opiat Dik : Konsentrasi standar sebagai N1 = 1000 ng/µl = 1 mg/ml N2 = 50 ng/ml = 0,05 mg/ml V2 = 5 mL Dit : V1 = ……? Dari konsentrasi 50 ng/µl Jawab : V1 x N1

3.

=

V2 x N2

V1 x 1 mg/ml =

5 ml x 0,05 mg/ml

V1

0,25 ml

=

Pengenceran Dekstrometorfan Dik : Konsentrasi dekstrometorfan sebagai N1 = 2 mg/ml N2 = 1 mg/ml V2 = 5 mL Dit : V1 = ……? Dari konsentrasi 2 mg/ml Jawab : V1 x N1

=

V2 x N2

V1 x 2 mg/ml =

5 ml x 1 mg/ml

V1

2,5 ml

=

4.

5.

Penotolan Sampel dan Standar Pada Plat 10 x 10 cm

200 ng

400 ng

600 ng

800 ng

1000 ng

1

2

3

4

5

6

7

Larutan Baku Standar 



Konsentrasi larutan Standar 

Konsentrasi Standar 1 (C1) = 200 ng



Konsentrasi Standar 2 (C2) = 400 ng



Konsentrasi Standar 3 (C3) = 600 ng



Konsentrasi Standar 4 (C4) = 800 ng



Konsentrasi Standar 5 (C5) = 1000 ng

AUC Larutan Standar Jenis Senyawa Morphine a.

AUC Standar 1 (AUC 1m) = 928,0

b.

AUC Standar 2 (AUC 2m) = 917,5

c.

AUC Standar 3 (AUC 3m) = 1288,2

d.

AUC Standar 4 (AUC 4m) = 1586,2

e.

AUC Standar 5 (AUC 5m) = 674,1

8

9



6.

AUC Larutan Standar Jenis Senyawa MDMA a.

AUC Standar 1 (AUC 1md) = 1010,2

b.

AUC Standar 2 (AUC 2md) = 1225,0

c.

AUC Standar 3 (AUC 3md) = 1331,5

d.

AUC Standar 4 (AUC 4md) = 946,2

e.

AUC Standar 5 (AUC 5md) = 238,2

Kurva Hubungan Konsentrasi Terhadap Absorbansi Senyawa Morphine

a.

Konsentrasi (X) 400

Absorbansi(Y)

X2

Y2

XY

917,5

160000

841806,25

367000

600

1288,2

360000

1659459,24

772920

800

1586,2

640000

2516030,44

1268960

∑X = 1800

∑Y = 3791.9

∑X2 =

∑Y2 =

∑XY=

1160000

5017295.93

2408880

Penentuan Koefisien Korelasi

√*

(

) +*

(

) +

( √*(

√( √ √

) )

(

) +*(

)(

(

) )

(

) +

)

R = 0,998 R2 = 0,9961 b.

Penentuan Koefisien Regresi (B) dan Konstanta (A) ( ( (

) ) ( ) (

) )

A = 260,92 B = 1,6718 c.

Persamaan Garis Regresi Linier Dik :

A = 260,92 B = 1,6728 Dit : Y = ………? Jawab : Y = A + BX Y = 1,6728 x + 260,92

Kurva Konsentrasi Terhadap Absorbansi Morphine 1800 y = 1.6718x + 260.92 R² = 0.9961

1600

Absorbansi

1400 1200 1000 800 600 400 200 0 0

200

400

600

800

1000

Konsentrasi

7.

Kurva Hubungan Konsentrasi Terhadap Absorbansi Senyawa MDMA Konsentrasi (X) 200

Absorbansi(Y)

X2

Y2

1010,2

40000

1020504.04

400

1225

160000

1500625

600

1331,5

360000

1772892.25

∑X = 1200

∑Y = 3566.7

∑X2 =

∑Y2 =

798900 ∑XY=

560000

4294021.29

1490940

XY

490000

a. Penentuan Koefisien Korelasi

√*

(

) +*

(

( √*(

) +

) )

(

) +*(

(

) )

(

202040

) +

)(

√(

)

√ √

R = 0,981 R2 = 0,9635 b.

Penentuan Koefisien Regresi (B) dan Konstanta (A) ( ( (

) ) ( ) (

) )

A = 867,6 B = 0,8033 c.

Persamaan Garis Regresi Linier Dik :

A = 867,6 B = 0,8033 Dit : Y = ………? Jawab : Y = A + BX Y = 0,8033 x + 867,6

Kurva Konsentrasi Terhadap Absorbansi MDMA 1600 y = 0.8033x + 867.6 R² = 0.9635

1400 Absorbansi

1200 1000 800 600 400 200 0 0

100

200

300

400

500

600

700

Konsentrasi

8.

Larutan Sampel LLE  AUC Sampel LLE Track 8 1. AUC Sampel Jenis Senyawa Morphine (AUC S1) = 5009,9 2. AUC Sampel Jenis Senyawa MDMA(AUC S2) = 15534,4 

Rf Sampel LLE Track 8 1. Rf Sampel Jenis Senyawa Morphine (Rf1) = 0,04 2. Rf Sampel Jenis Senyawa MDMA(Rf2) = 0,42

9.

Analisa Kualitatif Senyawa Morphine dan MDMA dalam Sampel LLE a. Analisa Kualitatif Senyawa Morphine Dik : hRf Morphine track 8 = 0,04 x 100 = 4, berada diantara hRfc Teofilin dan Papaverin = 1 dan 8. ( )=1 hRfc (B) = 8 hRf (B) = 17

hRf (A) = 2 Dit : = ……..? Jawab : ( )

( )

,

( )

( ) -

= 1 + 7/15 x 2 = 1 + 14/15 = 1 + 0,933 = 1,933 Keterangan : hRfc (X)

= nilai hRfc Morphine sampel

hRfc (A)

= nilai hRfc Teofilin pustaka

∆c

= hRfc (B) - hRfc (A) (selisih pustaka nilai hRfc Papaverin dengan Teofilin)

∆

= hRf (B) - hRf (A) (selisih nilai hRf Papaverin dengan Teofilin di track 9)

hRf (X)

= nilai Rf max Morphine di track 8 dikali 100

hRf (A)

= nilai Rf max Teofilin di track 9 dikali 100

Jadi, hRFc Morphine yang diperoleh adalah sebesar 1,933 bila dibandingkan dengan hRFc pustaka hasil ini sangat jauh dari hRfc senyawa Morphine dalam larutan pengembang TB yaitu sebesar 00.

b. Analisa Kualitatif Senyawa Morphine Dik : hRf MDMA track 8 = 0,42 x 100 = 42, berada diantara hRfc Teofilin dan Papaverin = 8 dan 42. ( ) = 42 ( )=8 ( ) = 0,67x100 = 67 ( ) = 0,17x100 = 17

Dit :

= ……..?

Jawab : ( )

( )

+

(

( )

( 42 – 17)

= 8 + 17 = 25 Jadi, hRFc MDMA yang diperoleh adalah sebesar 25, hasil ini sudah mendekati hRfc

dalam pustaka untuk MDMA dalam larutan

pengembang TB yaitu sebesar 24.

10.

Kadar Morphine dan MDMA pada LLE Dik : Persamaan Garis Regresi a. Morphine : y = 1,6728 x + 260,92 b. MDMA

: y = 0,8033 x + 867,6

AUC S1 (y1) = 5009,9 AUC S2 (y2) = 15534,4 Dit :

a.

Kadar Morphine dalam sampel = ……?

b.

Kadar MDMA dalam sampel = …..?

Jawab : a. Kadar Morphine y

= 1,6728 x + 260,92

5009,9

= 1,6728 x + 260,92

5009,9-260,92

= 1,6728 x

1,6278 x

= 4748,98

x

= 2917,42 ng Jadi kadar morphine yang terkandung dalam sampel LLE adalah

2917,42 ng/ml = 0,002917 mg/ml. b. Kadar MDMA y

= 0,8033 x + 867,6

15534,4

= 0,8033 x + 867,6

15534,4-867,6

= 0,8033 x

0,8033 x

= 14666,8

x

= 18258,18 ng Jadi kadar morphine yang terkandung dalam sampel LLE adalah

18258,18 ng/ml = 0,0183 mg/ml.

4.2

PEMBAHASAN Pemeriksaan konfirmasi adalah suatu pemeriksaan lanjutan yang lebih

akurat karena hasil yang dikeluarkan sudah definitif menunjukkan jenis zat narkotika psikotropika yang terkandung di dalam sampel tersebut. Pemeriksaan dilakukan apabila hasil pemeriksaan pendahuluan (screening test) memberi hasil positif. Pemeriksaan konfirmatif bertujuan untuk memastikan identitas atau golongan analit dan menetapkan kadarnya. Pada praktikum, dilakukan pemeriksaan konfirmatif pada sampel urine yang sudah positif menunjukkan adanya narkotika golongan opiate pada hasil uji skrining. Opioid atau opiat berasal dari kata opium, jus dari bunga opium, Papaver somniverum, yang mengandung kira-kira 20 alkaloid opium, termasuk morfin. Nama Opioid juga digunakan untuk opiat, yaitu suatu preparat atau derivat dari opium dan narkotik sintetik yang kerjanya menyerupai opiat tetapi tidak didapatkan dari opium. opiat alami lain atau opiat yang disintesis dari opiat alami adalah

heroin

(diacethylmorphine),

kodein

(3-methoxymorphine),

dan

hydromorphone (Dilaudid). Ada beberapa cara atau metode yang dapat digunakan dalam melakukan uji konfirmasi narkotika/psikotropika, seperti: kromatografi gas- spektrofotometri massa (GC-MS), kromatografi cair kenerja tinggi (HPLC) dengan diode-array detektor,

kromatografi

cair

-

spektrofotometri

massa

(LC-MS),

KLT-

Spektrofotodensitometri, dan teknik lainnya. Dan pada praktikum ini, metode yang

digunakan

adalah

metode

KLT-Spektrofotodensitometri.

Dalam

pemeriksaan konfirmasi ini, ada beberapa tahapan yang harus dilakukan untuk dapat melakukan pemeriksaan dan memastikan jenis senyawa yang terdapat di dalam sampel, antara lain preparasi sampel, ekstraksi sampel, uji konfirmasi narkotika /psikotropika pada sampel urine dengan KLT-spektrofotodensitometri, dan perhitungan kadar senyawa narkotika / psikotropika yang terdapat di dalam sampel. 1.

Preparasi Sampel Urine dengan Ekstraksi Urine sangat berguna dalam skrining racun karena obat, racun, dan

metabolit terdapat dengan konsentrasi yang ebih besar pada urine dibandingkan

dalam darah. Urine tidak seperti plasma, bebas dari protein dan lipida. Karena itu, umumnya dapat langsung diekstraksi dengan pelarut organic. Keuntungan analisis obat menggunakan sampel urine adalah bahwa jenis senyawa yang umum terdapat dalam urine adalah larut air. Sedangkan, sebagian besar obat adalah larut lemak sehingga dapat diekstraksi dengan pelarut yang sesuai. Untuk melakukan pemeriksaan konfirmasi narkotika/psikotropika pada urine, diperlukan preparasi sampel sebelum dilakukan sebelum melakukan analisis. Tingkat kerumitan prosedur preparasi sampel sangat ditentukan oleh sifat alami sampel, sifat alami senyawa yang akan dianalisis, dan metode deteksi yang dipilih. Tujuan dilakukannya preparasi sampel yaitu untuk memecah ikatan obatprotein, derivatisasi analit untuk meningkatkan efisiensi ekstraksi, kromatografik maupun deteksi. Selain itu, untuk memisahkan residu tak larut maupun senyawa pengganggu dan menyesuaikan kadar sampel dengan sensitivitas alat. Untuk memisahkan analit dengan matrik sampel, pada praktikum ini dilakukan preparasi sampel dengan metode ekstraksi cair-cair/liquid-liquid ekstraction (LLE). Ekstraksi adalah pemisahan satu atau beberapa bahan dari suatu padatan atau cairan dengan bantuan pelarut sebagai separating agen. Pemisahan terjadi atas dasar kemampuan larut yang berbeda dari komponenkomponen dalam campuran. Biasanya, pada ekstraksi pelarut yang digunakan adalah pelarut organic, karena sebagian besar senyawa golongan obat larut dalam pelarut organic. Terdapat beberapa persyaratan pelarut organic yang digunakan untuk mengekstraksi analit, antara lain: 

Memiliki kemampuan mengekstraksi yang baik



Kelarutannya rendah dalam air.



Memiliki densitas atau kerapatan lebih rendah daripada air.



Memiliki volatilitas moderat agar mudah diuapkan, tetapi tidak terlalu volatile agar tidak menguap saat dilakukan preparasi sampel.



Stabil atau inert, serta tidak mudah terbakar.



Murah.



Tidak mengabsorpsi sinar uv atau tidak memiliki aktivitas elektrokimia.

Pemilihan pelarut yang digunakan untuk ekstraksi ini tergantung dari sifat analit yang akan dianalisis. Morfin memiliki sifat kelarutan 1 bagian larut dalam 5000 bagian air, dalam 210 bagian etanol, dalam 1220 bagian kloroform, dalam 125 bagian gliserol, sangat mudah larut dalam campuran kloroform-isopropanol dan praktis tidak larut dalam eter. 2.

Ekstraksi Sampel dengan menggunakan Ekstraksi Cair-Cair Ekstraksi cair-cair (liquid extraction, solvent extraction): yaitu pemisahan

solute dari cairan pembawa (diluen) menggunakan solven cair. Campuran diluen dan solven tersebut bersifat heterogen (immiscible, tidak saling campur). Pemisahan dengan metode ekstraksi cair-cair didasarkan pada distribusi zat terlarut dengan perbandingan tertentu antara dua pelarut yang tidak saling bercampur. Umumnya digunakan pelarut nonpolar yang secara efektif akan mengekstraksi analit. Jika dipisahkan terdapat 2 fase, yaitu fase diluen (rafinat) yang berisi diluen dan sisa solut dan fase solven (ekstrak) yang berisi solut dan solven. Ekstraksi cair-cair ini dilakukan pada sampel urine yang diduga mengandung morfin (golongan opiate). Ekstraksi ini dilakukan dengan cara menambahkan 1 ml buffer fosfat pH 9,3 ke dalam 1 ml sampel urin pada tabung sentrifuse kemudian ditambahkan 2 ml campuran kloroform:isopropanol (3:1). Penambahan buffer fosfat ini dilakukan karena ekstraksi akan berjalan optimal pada pH tertentu, dan berdasarkan pustaka variasi pH pada ekstraksi cair-cair yang menghasilkan perolehan kembali analit yang tertinggi adalah pH 9-10 dengan presentasi perolehan kembali analit sebesar 83,9%-97,2%. Sedangkan campuran isopropanol-kloroform digunakan karena berdasarkan pustaka yang ada, menyatakan bahwa pengekstraksi kloroform dengan pengendap protein isopropanol memberikan hasil perolehan kembali morfin yang memuaskan. Setelah itu, tabung divortek dengan kecepatan 2500 rpm selama 30 menit hingga terbentuk emulsi sempurna. Kemudian tabung disentrifuse dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Pencampuran dengan vortek merupakan metode yang

paling cepat, efisien, dan hanya untuk pelarut dalam jumlah kecil. Dan setelah disentrifuse larutan akan tampak terpisah menjadi 2 fase yaitu fase kloroform di bagian bawah (fraksi A yang mengandung morfin) dan fase air di bagian atas. Hal ini karena masa jenis pelarut organic (fase kloroform) lebih besar daripada fase airnya. Setelah disentrifuse, fraksi A kemudian dipisahkan dengan fase airnya. Proses ekstraksi kemudian diulang kembali pada fase air menggunakan buffer fosfat dengan pH 10,5. Pengulangan ini dilakukan untuk menarik analit yang kemungkinan masih tersisa pada fase air. Semakin besar jumlah pengulangan yang dilakukan, semakin besar jumlah analit yang dapat diperoleh. Selanjutnya fraksi B (fraksi yang mengandung morfin) yang diperoleh dari pengulangan ini digabungkan dengan fraksi A dan kemudian diuapkan dalam penangas pada suhu 60-700 C untuk menguapkan pelarut sehingga hanya tersisa analitnya. Kemudian hasil penguapan ini di rekonstitusi dengan 25 µl methanol. Setelah analit yang didapat diuapkan dan direkonstitusi dengan methanol, analit tampak tidak berwarna (bening). 3.

Uji Konfirmasi dengan metode KLT-Spektrodensitometer Metode KLT-Spektrodensitometer merupakan salah satu teknik yang

sering digunakan untuk mengidentifikasi suatu senyawa dalam analisis toksikologi baik secara kualitatif dan kuantitatif. Suatu campuran zat dapat dipisahkan dengan teknik KLT berdasarkan afinitas masing-masing komponen terhadap fase gerak dan fase diamnya. Komponen yang telah terpisah, besar serapannya dapat diukur dengan spektrofotodensitometer. Kadar dari sampel dapat ditentukan dari perbandingan antara serapan sampel dan bakunya. Secara garis besar, ada dua hal yang dilakukan dalam praktikum ini yaitu memisahkan senyawa-senyawa pengotor dari senyawa yang ingin dideteksi, yaitu amfetamin dan opiat dengan menggunakan metode KLT dan pengukuran absorbansi senyawa MDMA dan opiat dengan alat spektrofotodensitometer. Pembacaan hasil pemisahan dengan metode KLT dilakukan melalui proses scanning menggunakan CAMAG TLC-SCANNER. Dari proses pengukuran absorbansi dari senyawa amfetamin dan opiat menghasikan data kualitatif berupa suatu kromatogram dan spektrum dari MDMA dan opiat, dimana kadar dari

MDMA dan opiat dapat dihitung dengan AUC (Area Under Curve) yang didapat. Jika absorbansi suatu seri larutan diukur pada panjang gelombang, suhu, kondisi pelarut yang sama, dan absorbansi masing-masing larutan diplotkan terhadap konsentrasinya maka suatu garis lurus akan teramati sesuai dengan persamaan A= εbc. Kromatografi lapis tipis (TLC) adalah suatu pemisahan campuran analit berdasarkan afinitas masing-masing komponen terhadap fase gerak dan fase diam dengan cara elusi melalui fase diam yang datar pada plat penyangga. Fase gerak yang digunakan dalam praktikum ini berupa larutan pengembang TB. Pemillihan fase gerak ini didasarkan dari pemilihan pustaka dimana secara pustaka larutan pengembang TB dapat memberikan hasil elusi yang lebih baik daripada larutan pengembang TAEA. Prosedur pemisahan/elusi dengan KLT dilakukan terlebih dahulu dengan melakukan beberapa persiapan kerja diantaranya penyiapan fase diam, penyiapan larutan pengembang TB, penjenuhan benjana kromatografi dan pembuatan larutan pembanding. Prosedur yang pertama dilakukan yaitu penyiapan fase diam yaitu plat Al-TLC Si 60 GF254. Penyiapan plat ini dilakukan dengan tujuan agar plat siap untuk digunakan dalam proses elusi, dimana proses penyiapan yang pertama adalah melakukan pemotongan terhadap plat tersebut sesuai dengan ukuran yang diperlukan. Pada praktikum ini, ukuran plat yang digunakan adalah 10 x 10 cm dimana

dipotong dari plat yang sebenarnya berukuran 20 x 20 cm. Proses

pemotongan plat dilakukan dengan beberapa persyaratan, antara lain: 1.

Alas yang digunakan untuk memotong plat harus dalam keadaan bersih dan halus dan biasanya terbuat dari keramik atau kaca.

2.

Alat pemotong yang digunakan harus tajam dan tidak boleh berkarat

3.

Dalam pemotongan plat, dilakukan secara berulang dan tidak boleh terlalu dilakukan penekan hingga plat benarbenar terputus dengan sempurna.

Hal tersebut diatas harus dilakukan agar hasil pemotongan plat tidak bergerigi atau halus karena apabila plat yang dipotong itu bergerigi dapat mempengaruhi pada proses elusi dimana dapat menyebabkan arah elusi menjadi miring dan menimbulkan tailing (ekor). Setelah plat dipotong dengan baik kemudian dilakukan pemberian batas pada plat/tepi atas plat serta identitas arah elusi pada plat dengan menggunakan pensil. Pemilihan penggunaan pensil untuk identitas adalah tidak mengandung bahan kimia yang dapat ikut bermigrasi bersama analit sehingga tidak mengotori sisi aktif plat atau dengan kata lain bahan kimia yang terdapat dalam pensil masih dapat ditoleransi oleh plat. Pemberian batas tepi atas plat yaitu berukuran 1 cm dari atas plat yang dapat ditandai dengan garis kecil pada bagian kanan dan kiri. Sedangkan pemberian identitas yang dilakukan yaitu pemberian tanda panah atas pada bagian atas plat dan pemberian kode untuk menandai plat yang digunakan. Dimana kedua proses tersebut mempunyai fungsi diantaranya yaitu

pemberian batas/tepi atas pada plat

berfungsi sebagai batas perhentian proses elusi/titik akhir proses elusi dimana diatas batas tersebut biasanya telah terkumpul pengotor hasil dari proses pencucian. Sementara fungsi pemberian identitas arah elusi dengan tanda panah atas yaitu agar proses pencucian plat dan proses elusi berjalan kearah yang sama, sebab apabila tidak diberikan berupa kode arah elusi maka ditakutkan terjadinya arah proses elusi dan pencucian yang berlawanan dimana akan menyebabkan kotoran plat yang telah dibawa ke bagian atas plat saat pencucian plat dengan methanol akan turun kembali ke daerah uji saat proses elusi yang menyebabkan analit yang dielusikan akan terelusi bersama pengotor – pengotor tersebut sehingga mengganggu proses analisis analit. Sebelum plat benar-benar siap untuk digunakan, plat harus dicuci dan diaktivasi terlebih dahulu. Proses pencucian plat dilakukan dengan menggunakan methanol yang bertujuan menghilangkan pengotor dari sisi aktif plat. Pemilihan penggunaan methanol ini didasarkan pada sifat pelarut methanol yang dapat melarutkan senyawa polar dan non polar atau sering disebut sebagai pelarut umum sehingga pengotor yang terdapat pada plat semuanya dapat terlarut dan tidak mengganggu sisi aktif plat. Selain itu methanol juga digunakan karena didasarkan pada harga methanol yang murah dan mudah

untuk didapat. Proses pencucian plat dilakukan dengan menaruh plat pada chamber yang telah diisi dengan 10 ml methanol dan dibiarkan hingga methanol bermigrasi sampai ke atas. Namun perlu diperhatikan agar peletakkan plat pada chamber sesuai dengan kode arah elusinya. Tahap selanjutnya yaitu dilakukan proses aktivasi plat, yang bertujuan untuk menghilangkan air dan pengotor yang menempel pada sisi aktif plat agar dapat memberikan respon baseline yang lebih baik serta mengurangi rasio gangguan (noise ratio). Proses aktivasi plat dilakukan dengan plat yang sudah dicuci sebelumnya kemudian dipanaskan pada oven pada suhu 600C selama 10 menit. Kemudian plat siap untuk digunakan. Setelah proses penyiapan plat kemudian dilakukan proses penyiapan larutan pengembang TB. Larutan pengembang TB dibuat dengan mencampurkan sikloheksana : toluene : dietilamin pada perbandingan (75 : 15 : 10). Dalam praktikum ini larutan pengembang TB yang dibuat dengan mencampurkan 7,5 mL sikloheksana : 1,5 ml toluene : 1 ml dietilamin kemudian dihomogenkan dan larutan pengembang TB siap untuk digunakan. Tahap selanjutnya pada proses persiapan kerja ini yaitu pembuatan lsenyawa standar dan larutan standar pembanding TB. Terlebih dahulu dibuat senyawa standar, dimana senyawa standar ini dibuat dengan tujuan sebagai suatu standar yang digunakan dalam pembuatan kurva standar dimana akan diperoleh persamaan garis regresinya untuk penentuan dari kadar senyawa yang terdapat pada sampel. Senyawa standar yang digunakan adalah senyawa dari jenis amfetamin dan senyawa opiat, kedua jenis senyawa ini digunakan karena merupakan target analit yang ingin ditentukan dalam praktikum ini. Senyawa standar yang diperlukan masing-masing konsentrasinya adalah 50 ng/µl yang dibuat dari konsentrasi senyawa standar yang tersedia adalah 1000 ng/µl, maka larutan standar dengan konsentrasi 1000 ng/l tersebut diencerkan terlebih dahulu menjadi konsentrasi 50 ng/l dengan cara 0,25 ml larutan standar 1000 ng/l diencerkan dalam labu ukur 5 ml dengan menggunakan methanol hingga tanda

batas labu ukur, sehingga diperoleh larutan standar pembanding 50 ng/l yang diinginkan. Kemudian dibuat larutan standar pembanding TB, dimana senyawa pembanding dibuat dengan tujuan untuk memastikan jenis senyawa yang terdapat dalam sampel dengan membandingkan nilai hRFnya standar pembanding pada pustaka. Larutan standar pembanding untuk sistem TB dibuat dari larutan teofilin, papaverin, dekstrometorfan, dan bromheksin yang masing – masing larutan tersebut berkonsentrasi 1 mg / ml kecuali larutan dektrometorfan yang memiliki konsentrasi 2 mg/ml. Oleh karenanya sebelum keempat larutan tersebut dicampurkan, larutan dekstrometorfan harus diencerkan terlebih dahulu hingga diperoleh larutan standar pembanding dekstrometorfan 1 ml /ml. Pengenceran larutan dekstrometorfan 2 mg / ml dilakukan dengan memipet 2,5 ml larutan dektrometorfan 2 mg / ml dan dimasukkan ke dalam labu ukur 5 ml kemudian ditepatkan hingga tanda batas dengan methanol da dihomogenkan hingga diperoleh larutan Dektrometorfan 1 mg / ml. Pembuatan larutan standar pembanding untuk sistem TB dilakukan dengan mencampurkan masing – masing 0,5 ml larutan teofilin 1 mg / ml, papaverin 1 mg / ml, dektrometorfan 1 mg / ml, serta bromheksin 1 mg /ml dalam sebuah botol vial dan kemudian dihomogenkan. Proses

tahapan

terakhir

persiapan

kerja

adalah

penjenuhan

chamber/benjana kromatografi. Proses penjenuhan chamber sebaiknya dilakukan hampir bersamaan dengan proses penotolan dimana untuk mencegah terjadinya kejenuhan chamber terlebih dahulu namun proses penotolan belum diselesaikan. Proses penjenuhan dilakukan hingga mencapai jarak rambat 10 cm. Hal ini bertujuan untuk menyamakan tekanan dalam chamber sehingga proses pengembangan fase gerak dapat berlangsung dengan efektif. Penjenuhan chamber dilakukan dengan menambahkan 10 ml larutan metanol ke dalam chamber dan menempatkan kertas tissue di ujung atas chamber sebagai indicator kejenuhannya. Penambahan kertas tissue/kertas saring berfungsi agar penguapan yang terjadi dalam chamber dapat diketahui merata sehingga udara di dalam chamber tetap jenuh pelarut. Namun indicator kejenuhan dengan kertas tissue relative akan menghasilkan kejenuhan yang sama disetiap prosesnya maka sebaiknya

digunakan indicator waktu untuk penjenuhan yang sudah dibuktikan melalui suatu penelitian yaitu selama 30 menit. Kondisi jenuh dalam chamber dengan uap pelarut mencegah penguapan pelarut (Clark, 2007). Waktu penjenuhan chamber harus diperhatikan agar chamber tidak lewat jenuh yang dapat memperlambat proses elusi dan menghasilkan pemisahan yang kurang baik. Kemudian Chamber ditutup dengan baik dan dijaga agar tidak mengalami pergeseran sehingga larutan pengembang TB di dalamnya tidak menguap dan tidak mengganggu jalannya proses penjenuhan chamber. Proses penotolan sampel pada plat KLT dilakukan menggunakan penotol linomart yang bersifat semi otomatis, dimana penotolan dilakukan terhadap larutan standar, analit sampel yang sebelumnya telah direkonstitusi dengan methanol, serta larutan standar pembanding sistem TB pada plat yang telah dicuci dan diaktivasi. Dikatakan sebagai alat penotolan yang semi otomatis, karena pada proses aspirasi bahan uji ke dalam syringe linomart masih dilakukan secara manual oleh petugas tetapi untuk proses penotolah bahan uji dilakukan secara otomatis oleh linomart itu sendiri melalui proses setting komputerisasi yang sebelumnya telah dilakukan sehingga petugas hanya perlu penempatan plat pada meja linomart. Karena plat yang digunakan berukuran 10 X 10 cm dan jarak penotolan satu senyawa dengan senyawa lainnya adalah 1 cm, maka pada plat tersebut akan terdapat 9 titik penotolan. Titik penotolan 1 sampai 5 diisi dengan larutan standar, titik penotolan 6 sampai 8 diisi dengan analit dari sampel, dan titik penotolan 9 diisi dengan larutan standar pembanding untuk sistem TB. Pada titik penotolan 1 sampai 5, ditotolkan larutan standar dengan konsentrasi yang berbeda – beda, yaitu 200 ng/l, 400 ng/l, 600 ng/l, 800 ng/l, dan 1000 ng/l. Sedangkan pada titik penotolan ke 6 diisi oleh analit yang diperoleh melalui proses ekstraksi SPE dengan target sasaran analisis Amfetamin, pada titik penotolan 7 diisi oleh analit yang diperoleh melalui proses ekstraksi SPE dengan target sasaran analisis Opiat dan titik penotolan 8 diisi oleh analit yang diperoleh melalui proses ekstraksi LLE dengan target sasaran analisis Amfetamin dan Opiat. Masing – masing analit dari sampel tersebut ditotolkan sebanyak 50 l. Dan pada titik penotolan 9 ditotolkan 2 l larutan standar pembanding TB. Pada proses

penotolan dilakukan perlu diperhatikan bahwa penotolan sampel yang tidak tepat akan menyebabkan bercak yang menyebar ke puncak ganda. Pelebaran bercak dapat mengganggu proses scanning dengan alat spektrodensitometer karena memungkinkan terjadinya himpitan puncak. Plat yang telah ditotolkan kemudian dielusi pada chamber yang telah dijenuhkan. Chamber ditutup rapat dan volume fase gerak dibuat sedikit mungkin namun dapat mengelusi lempeng sampai pada batas jarak pengembangan. Hal ini bertujuan agar tidak terjadi kontaminasi dari kontaminan selama proses elusi. Plat yang telah melalui proses elusi selanjutnya melalui proses pengeringan dengan oven pada suhu 600C selama 10 menit yang bertujuan untuk menguapkan sisa pelarut yang masih terdapat pada plat KLT sehingga tidak mengganggu proses scanning dengan spektrofotodensitometer. Dalam proses pengeringan harus diperhatikan titik uap pelarut dan titik uap senyawa agar senyawa yang akan dideteksi tidak rusak serta agar pelarut dapat dipisahkan dari senyawa dengan baik. Terdapat beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses pengelusian ini,diantaranya: a. Chamber diletakkan pada tempat yang datar dan bebas dari getaran agar kejenuhan chamber stabil. b. Proses pemasukan plat ke dalam chamber dilakukan secara cepat karena untuk mempertahankan kejenuhan chamber. c. Dipastikan posisi plat pada saat didalam chmaber dalam keadaan datar dan sedikit dimiringkan sehingga hanya ujungnya yang tersandar pada dinding chamber hal ini dilakukan dengan tujuan agar memudahkan dalam proses pengambilan plat setelah proses elusi selesai dan agar meminimalkan plat jatuh saat proses elusi. Analit yang telah dielusikan pada plat KLT dapat secara langsung dilakukan uji konfirmasi untuk memastikan jenis senyawa yang terkandung dalam analit dengan menggunakan TLC Scanner (Spektrofotodensitometer). Setelah plat dielusi dengan pengembang TB, kemudian hasil elusi ini dipindai dengan TLC scanner (Spektrofotodensitometer).

Spektrofotodensitometer

merupakan

suatu

instrumen

yang

dapat

mengukur intensitas radiasi yang direfleksikan dari permukaan lempeng ketika disinari dengan lampu UV atau lampu sinar tampak. Solut-solut yang mampu menyerap sinar akan dicatat sebagai puncak (peak) oleh pencatat (recorder). Instrument spektrofotodensitometer terdiri dari sumber cahaya pada rentang panjang gelombang 200-800 nm yaitu lampu deuterium (rentang spectra 200-400 nm), lampu tungsten (rentang spectra 400-800nm), slit atau celah, monokromator unutk memilih panjang gelombang yang sesuai, system untuk memfokoskan sinar pada plat, filter flourosensi, pengganda foton, dan rekorder. Spektrofotodensitometer dapat bekerja secara absorpsi atau flouresensi. Dan yang sering digunakan adalah metode absorpsi dengan menggunakan sinar uv pada panjang gelomabang 190-300 nm karena kebanyakan plat KLT menggunakan silica gell yang bersifat opaque (tidak tembus cahaya). Prinsip kerja spektrofotodensitometri berdasarkan interaksi antara radiasi elektromagnetik sinar uv- vis dengan analit yang merupakan noda pada plat. Radiasi elektomagnetik yang dating pada plat diabsorpsi oleh analit. Radiasi elektromagnetik yang diabsorpsi oleh analit atau indicator plat dapat diemisikan berupa flourosensi dan fosforesensi. Deteksi menggunakan spektrofotodensitometri ini dilakukan terhadap 9 titik penotolan yang terdiri dari 5 titik standar amfetamin opiate, 1 titik penotolan sampel, dan 1 titik penotolan satndar pembanding TB. Spektrofotodensitometer akan mendeteksi masing-masing track penotolan dan masing-masing track ini akan

ditampilkan

dalam

bentuk

kromatogram.

Semakin

tinggi

bentuk

kromatogram ini, maka konsentrasi analit dalam sampel semakin. Dari kromatogram ini, akan dapat diketahui nilai Area Under Curve (AUC) dan nilai Rf dari tiap senyawa yang terkandung dalam noda, dimana Rf ini sangat khas untuk masing-masing senyawa. Dan dari sinilah akan diketahui secara pasti jenis senyawa yang terdapat pada analit dengan membandingkannya dengan nilai Rf dan bentuk peak pada pustaka untuk berbagai jenis senyawa. berdasarkan

kromatogram yang ditunjukkan pada spektrofotodensitometer, didapatkan hasil pada masing-masing track sebagai berikut: 1. Track 1, Track 2, Tack 3, Track4, dan Track 5 (noda standar) : terdapat adanya kandungan morfin. Hasil ini didapatkan dari nilai Rf yang ditunjukkan pada kromatogram yaitu nilai Rf max 0,02 yang spesifik untuk morfin dan nilai Rf max 0,40 yang spesifik untuk MDMA. Selain itu, terdapat juga bromheksin dan papaverin, yang kemungkinan adalah zat pengotor yang memiliki Rf yang mirip dengan zat-zat tersebut. 2. Track 6 (noda sampel LLE) : dari hasil pendeteksian sampel, menunjukkan adanya kandungan morfin dan MDMA berdasarkan nilai Rf max yang didapat yaitu 0,02 yang spesifik untuk Morfin dan 0,038 dimana Rf ini mirip dengan MDMA. Selain itu, ditemukan juga adanya zat yang diduga papaverin karena nilai Rf 0,17 yang mirip dengan papaverin dan zat yang diduga bromheksin karena nilai Rfnya 0,88 yang mirip dengan broheksin. 3. Track 9 (noda standar pembanding TB)

: pendeteksian standar pembanding

TB ini dilakukan untuk mengetahui nilai hRf dari standar pembanding yang digunakan, dan nantinya akan dibandingkan dengan nilai hRfc yang ada pada pustaka sehingga dapat diketahui secara pasti jenis senyawa pada analit. dari hasil pendeteksian ini didapatkan zat-zat yang terkandung pada standar pembanding TB antara lain papaverin, theophiline, dextrometorpan, dan bromheksin dengan nilai Rf yang spesifik untuk masing-masing zat tersebut. Uji konfirmasi dilakukan dengan nilai hRf analit senyawa standar dan pustaka. Pada prakteknya nilai hRf bervariasi karena pengaruh factor lingkungan seperti kejenuhan chamber, pH medium, suhu penguapan fase gerak dan plat, serta kadar analit yang ditotolkan. Terdapat metode untuk mengurangi variasi hRf tersebut. Yaitu menggunakan harga hRf terkoreksi (hRfc) yang relative konstan untuk masing-masing senyawa pada tiap system TLC tertentu. Harga hRfc suatu analit dapat dihitung dengan menggunakan metode korelasi polygonal. Metode ini membutuhkan minimal 4 senyawa standar pembanding yang harga hRfc tersebar

di antara harga hRfc sampel. Penetuan harga hRfc pada sampel dilakukan dengan rumus berikut ini: hRfc (X) = hRfc (C) +

[Rf(X)-hRf(C) ,dimana

c = hRfc (D)-hRfc (C) = hRf(D)-hRf(C) Kemudian, harga hRfc analit yang didapat dapat dibandingkan dengan database harga hRfc dengan pelarut pengembang TB di pustaka sehingga diperoleh kemungkinan senyawa yang sesuai. Dari hasil perhitungan yang dilakukan,diperoleh hRfc senyawa morphine = 1,933 dan hRfc senyawa MDMA = 25 bila kedua hasil ini dibandingkan dengan pustaka yang telah ada, hRfc senyawa morphine sangat jauh dari pustaka sedangkan hRfc senyawa MDMA mendekati dari pustaka.Namun untuk analysis kualitatif ini juga dilakukan dengan mencocokan peak senyawa dimana peak analit morphine pada sampel sama dengan pustaka sehingga dapat dikatakan analit tersebut adalah morphine. Dengan menggunakan spektrofotodensitometer ini juga dapat dilakukan penentuan kadar senyawa yang ada pada sampel. Analisis kuantitatif dari suatu senyawa yang telah dipisahkan dengan KLT biasanya dilakukan dengan densitometer langsung pada lempeng KLT (atau secara in situ). Kadar dari sampel dapat ditentukan dari perbandingan antara serapan sampel dan bakunya. Kadar dari sampel dapat ditentukan dari perbandingan antara serapan sampel dan Standarnya. Penetuan kadar sampel ini dilakukan dengan terlebih dahulu membuat kurva standar dengan meihat nilai AUC yang diperoleh pada kromatogram sebagai nilai Y. Dari kromatogram ini dapat dilihat nilai AUC untuk masing-masing konsentrasi standar antara lain: 1. AUC Senyawa Morphine a. AUC Standar 1 (AUC 1m) = 928,0 b. AUC Standar 2 (AUC 2m) = 917,5 c. AUC Standar 3 (AUC 3m) = 1288,2 d. AUC Standar 4 (AUC 4m) = 1586,2 e. AUC Standar 5 (AUC 5m) = 674,1

2. AUC Senyawa MDMA a. AUC Standar 1 (AUC 1md) = 1010,2 b. AUC Standar 2 (AUC 2md) = 1225,0 c. AUC Standar 3 (AUC 3md) = 1331,5 d. AUC Standar 4 (AUC 4md) = 946,2 e. AUC Standar 5 (AUC 5md) = 238,2 Dari nilai AUC ini kemudian dapat ditentukan masing-masing koefisien korelasi dan persamaan garis regresinya. Namun pada saat pembuatan kurva konsentrasi terhadap absorbansi terdapat penghilangan 2 titik yang mengganggu kelinieritasn dari kurva sehingga hanya digunakan 3 titik konsentrasi untuk menentukan kurva konsentrasi terhadap absorbansi masing-masing jenis senyawa korelasi. Penghilangan konsentrasi ini juga dilakukan karena ada dugaan bahwa terdapat beberapa kesalahan dari proses penotolan dan proses elusi sehingga tidak sesuai dengan teori yang ada. Adapun koefien korelari yang diperoleh pada masing-masing kurva adalah r senyawa morphine =0,9961 dan r senyawa MDMA=0.9655, dari koedisien korelasi yang diperoleh ini dapat dikatahui bahwa kurva mendekati kelinieran sangat bagus sehingga dapat digunakan dalam penentuan kadar dari masing-masing senyawa. Selain itu juga digunakan persamaan regresi linier untuk penentuan kadarnya yaitu senyawa morphine sebesar y = 1,6728 x + 260,92 dan senyawa MDMA persamaan regresi liniernya sebesar y = 0,8033 x + 867,6. Bila persamaan regresi linier telah diketahui, maka kadar morfin dalam sampel dapat diketahui dengan memasukkan nilai AUC sampel pada persamaan regresi linier. Dari perhitungan yang dilakukan, kemudian didapatkan kadar morfin dalam sampel adalah sebesar 0,002917 mg/ml dan kadar MDMA dalam sampel adalah sebesar 0,0183 mg/ml.

BAB V PENUTUP 5.1 SIMPULAN 1. Preparasi sampel untuk uji konfirmasi dan pemisahan obat-obatan golongan amfetamin dan opiate dalam sampel urine dapat dilakukan dengan metode ekstraksi cair-cair dan SPE. 2. Proses persiapan kerja dalam proses elusi yaitu penyiapan fase diam, penyiapan larutan pengembang TB, penjenuhan benjana kromatografi dan pembuatan larutan pembanding 3. Prinsip pemisahan KLT adalah Suatu campuran zat dapat dipisahkan dengan teknik KLT berdasarkan afinitas masing-masing komponen terhadap fase gerak dan fase diamnya. 4. Prinsip kerja spektrofotodensitometri berdasarkan interaksi antara radiasi elektromagnetik sinar uv- vis dengan analit yang merupakan noda pada plat. Radiasi elektomagnetik yang dating pada plat diabsorpsi oleh analit. Radiasi elektromagnetik yang diabsorpsi oleh analit atau indicator plat dapat diemisikan berupa flourosensi dan fosforesensi. 5. Dari hasil uji konfirmasi dengan metode KLT-Spektrofotodensitometri terhadap sampel urine yang diperiksa dapat ditentukan bahwa jenis senyawa yang ada dalam sampel urine adalah Morfin (golongan opiate) dengan kadar sebesar 0,002917 mg/ml dan kadar MDMA dalam sampel adalah sebesar 0,0183 mg/ml.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2011. Pemeriksaan Laboratorium Narkotika dan Psikotropika. http://ndiel2.wordpress.com/2011/11/08/pemeriksaan-lab-napzanarkotika-psikotropika-dan-zat-adiktif-lain/. Diakses tanggal 13 Mei 2013 Anonim.

2012.

Opioid

dan

Ketergantungan.

http://indoanesthesia.wordpress.com/2012/07/04/opioid-danketergantungan/ Diakses tanggal: 16 Mei 2013 BNN. 2008. Pedoman Pemeriksaan Laboratorium Narkotika, Psikotropik, dan Obat Berbahaya. Jakarta : BNN. Rahayu. 2011. Ekstraksi. http://alchemistviolet.blogspot.com/2011/02/ekstraksi.html.

diakses

tanggal: 13 Mei 2013 Sora. 2010. Amfetamin http://rillsora.blogspot.com/2010/03/amfetamin.html Diakses : 14 Mei 2013 Wirasuta. 2008. Analisis Toksikologi Forensik Dan Interpretasi Temuan Analisis. Jakarta: Indonesian Journal of Legal and Forensic Sciences Wirasuta.

2012.

Tugas

Dugaan

Pemerkosaan

Menggunakan

Obat.

http://gelgel-wirasuta.blogspot.com/2012/06/dugaan-perkosaanmenggunakan-obat-tugas.html. diakses tanggal: 13 Mei 2013 Wirasuta,dkk. 2013. Penuntun Praktikum Toksikologi D3 Analis Kesehatan Tahun Ajaran 2012/2013. Badung:

Jurusan Farmasi

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana

Fakulras