Laporan Isolasi DNA Dan Elektroforesis

LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA (BI-2105) ISOLASI DNA DAN ELEKTROFORESIS DNA TANAMAN BAYAM (Amaranthus Sp.)

Tanggal Praktikum : 4 November 2013 dan 11 November 2013 Tanggal Pengumpulan : 18 November 2013

Disusun Oleh: Annisa Amalia 10612007 Kelompok 1

Asisten : Nofella Mahardika 10611063

PROGRAM STUDI BIOLOGI SEKOLAH ILMU DAN TEKNOLOGI HAYATI INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG BANDUNG 2013

BAB I PENDAHULUAN

1.1.Latar Belakang Isolasi DNA adalah proses pemisahan molekul DNA dari molekul-molekul lain di inti sel. Prosedur ini memiliki beberapa tujuan analisis yaitu visualisasi DNA, peninjauan pola fragmentasi DNA, pembuatan pustaka genomik, rekayasa gen, dan amplifikasi DNA. Terdapat tiga tahapan dasar dan dua tahapan tambahan dalam prosedur isolasi DNA ini, yaitu preparasi ekstrak DNA (perusakan dinding sel dan lisis membran sel), purifikasi DNA, dan presipitasi DNA, serta pemisahan terhadap protein (dengan protease) dan RNA (dengan RNAse). Dewasa ini telah banyak dilakukan isolasi DNA yang bertujuan untuk mengembangkan ilmu pengetahuan terutama dalam ilmu genetika. Dalam praktikum kali ini, dilakukan isolasi DNA pada tanaman bayam (Lee, 2013). Elektroforesis

dilakukan

untuk

memisahkan,

mengidentifikasi

mengkarekterisasi dan purifikasi dari molekul DNA. Elektroforesis merupakan cara pengamatan DNA dengan bantuan sinar ultraviolet. Cara pemisahan dengan elektroforesis ini merupakan alat pendukung yang sangat pokok dalam teknologi DNA rekombinan, dengan aplikasi yang begitu luas baik untuk pemisahan untai tunggal atau untai ganda molekul DNA. Elektroforesis digunakan untuk pengamatan DNA dalam penampakan flouresensinya. Dalam praktikum kali ini, tujuan dilakukannya elektroforesis yaitu untuk menentukan kemurnian dan ukuran DNA tanaman bayam (Cheng and Zhang, 2008).

1.2.Tujuan Tujuan dari praktikum kali ini adalah :  Menentukan kemurnian DNA berdasarkan hasil elektroforesis  Menentukan ukuran DNA tanaman bayam berdasarkan hasil elektroforesis

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Prinsip Isolasi DNA Pada Tanaman Isolasi atau ekstraksi DNA merupakan proses pemindahan DNA dari sel atau virus. Isolasi DNA merupakan langkah awal dalam melakukan analisa DNA menggunakan metode elektroforesis atau PCR, dapat pula dijadikan langkah awal untuk dapat mendiagnosa penyakit apapun, termasuk bawaan genetik, sejak dini. Isolasi DNA banyak metodenya sesuai dengan sampel apa yang akan kita isolasi. Misalnya untuk isolasi tumbuhan,tumbuhan diketahui memiliki dinding sel untuk mengambil bagian dalam khususnya DNA sebelumnya kita harus menghancurkan dinding sel nya terlebih dahulu yaitu menggunakan nitrogen cair dan digerus untuk memudahkan hancurnya dinding sel tersebut. Berbeda dengan tumbuhan untuk isolasi sel hewan tidak perlu menggunakan nitrogen cair,karena tidak mempunyai dinding sel yang keras sel hewan cukup memakai buffer lisis,untuk melisiskan selnya (Rice, 2010). Proses pengambilan DNA dari organisme yang akan diuji dapat melalui berbagai macam cara, mengambil sampel darah, atau rambut pada manusia, contohnya, atau langsung mencampurkannya dengan larutan SDS seperti pada Drosophila. Perlunya dilakukan dengan mencampurkan dengan SDS terlebih dahulu, untuk melisiskan sel, dan mengeluarkan DNA yang terdapat di dalamnya, serta menjaga DNA untuk tetap utuh, walau sel telah lisis. Untuk memisahkan DNA dengan organel-organel lain di dalam sel, campuran disentrifugasi. Sentrifuga memiliki prinsip perbedaan berat jenis saat dilakukan pemutaran dengan kecepatan tertentu, sehingga akan diperoleh hasil dengan larutan yang memiliki berat jenis yang lebih ringan akan berada paling atas (biasanya akan terbentuk 2-3 fasa) (Rice, 2010). Setelah sel lisis dan dipisahkan, DNA harus segera dijaga keadaan fisiologisnya

dalam

lingkungan

yang

memungkinkan,

yaitu

dengan

mencampurkannya dengan sejenis buffer yang mengandung fenol dan kloroform. Sehingga DNA dalam keadaan utuh dan terjaga fisiologisnya. Kemudian larutan

dihomogenisasi atau di vortex, setelah itu larutan kembali disentrifuga, yang nantinya akan diperoleh DNA berada di atas dan fasa organik dengan fenol dan kloroform berada di bawah. DNA yang telah dipisahkan setelah disentrifugasi diendapkan menggunakan etanol atau isopropanol, karena DNA tidak dapat larut dalam etanol maupun isopropanol, sehingga DNA akan mengendap. Kemudian setelah dilakukan pemurnian DNA, DNA dikeringkan, lalu dilarutkan dalam TE untuk presipitasi agar dapat disimpan untuk analisis DNA selanjutnya. Secara keseluruhan, tahapan isolasi DNA adalah pemecahan sel, pemisahan protein, pengendapan DNA, dan pemurnian DNA (Rice, 2010). Pada jaringan tanaman, yang harus diperhatikan adalah jaringan tanaman diperlakukan terlebih dahulu dalam Nitrogen cair (NO2) dan segera dilakukan penggerusan agar diperoleh ekstrak sel yang halus. Kemudian ekstrak sel diperlakukan dengan ekstrak

2.2 Fungsi Larutan-Larutan yang Digunakan Dalam Isolasi DNA Pada percobaan digunakan berbagai macam larutan dan reagen. Larutanlarutan dan reagen tersebut memiliki fungsi tersendiri. Pada isolasi DNA bayam, digunakan nitrogen cair pada saat penggerusan daun bayam. Nitrogen cair ini memiliki fungsi menghancurkan dinding sel sehingga DNA lebih mudah diakses. Kemudian pada saat gerusan telah didapat, terdapat penambahan extraction buffer atau disebut juga buffer eksteaksi. Buffer ekstraksi mengandungTris-HClSDS yang masing-masing bahan tersebut memiliki fungsi masing masing. TrisHCl berperan penting dalam kestabilan pH. Kestabilan pH menjadi hal yang krusial karena pH yang pas akan membuat DNA tidak ikut terdenaturasi. Menurut Rice, SDS merupakan deterjen yang memiliki fungsi membuang lipid dan protein pada proses purifikasi DNA. Pada isolasi DNA bayam juga terdapat penambahan Kloroform Isoamil atau disebut juga dengan CI yang memiliki fungsi untuk menghilangkan kontaminan protein. Protein yang telah dipisahkan nantinya akan terendapkan oleh etanol. Layaknya percobaan-percobaan lain yang membutuhkan beberapa reagen kimia untuk mendukung dan mempermudah proses percobaan, pada percobaan

kali inipun digunakan beberapa jenis reagen untuk isolasi DNA tanaman bayam, diantaranya ethanol 75%, buffer ekstraksi yang mengandung Tris-HCl, EDTA, NaCl, dan 2-merkaptoetanol (SDS), isopropanol, nitrogen cair, larutan fenol : kloroform : Isoamil alkohol (25:24:1), potassium asetat, serta sodium asetat. Masing-masing buffer memiliki fungsinya tersendiri, misalnya saja salah satu reagen yang penting yakni buffer ekstraksi yang digunakan mengandung Tris HCl, EDTA, dan SDS. Tris HCl berperan sebagai buffer yang mengatur pH larutan ekstraksi. Ethylenediamine tetraacetic acid atau EDTA berperan sebagai chelating agent yang mengikat ion metal dalam larutan ekstraksi (Henry, 2001). EDTA melemahkan sel dengan mengikat ion bivalen (Mg+2 dan Ca+2) yang diperlukan untuk kestabilan membran sel. EDTA juga digunakan agar enzim nuklease yang dapat mendegradasi DNA tidak aktif. Sementara itu SDS (sodium dodecyl sulfate) merupakan detergen biologis yang menyebabkan membran sel hancur serta mengemulsikan lipid dan protein sel dengan mengganggu interaksi polar yang mengikat membran sel (Brooks, 2013). Selain buffer ekstraksi, digunakan pula larutan fenol:kloroform:isoamil alcohol (25:24:1) yang berperan sebagai pelarut organik yang dapat melarutkan protein dan polisakarida, namun tidak dapat melarutkan DNA. Oleh karena itu pelarut ini dapat digunakan untuk mengisolasi DNAdari komponen-komponen organik lainnya (Henry, 2001). Nitrogen cair digunakan untuk melisiskan dindng sel sehingga semua isi sel dapat dikeluarkan dan kemudian dapat ditampung dalam larutan buffer. Dinding sel yang dikenai nitrogen cair akan menjadi getas dan mudah dihancurkan ketika dilakukan proses penggerusn. Selain menggunakan nitrogen cair, dinding sel juga dapat dipecahkan dengan penggerusan menggunakan buffer ekstraksi diikuti penghangatan pada suhu 650C (Subandiyah, 2006).

2.3 Prinsip Kerja Elektroforesis Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang dipisahkan. Teknik ini dapat

digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif (Yuwono, 2005). Prinsip kerjanya adalah jika molekul yang bermuatan negatif (DNA) dilewatkan melalui suatu medium, misalnya gel agarose, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya (positif), maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif (Elektroforesis) melalui membran matriks gel agarose tersebut (Yuwono, 2005). Elektroforesis adalah suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau pergerakan partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan listrik. Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode). Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi

dari

DNA.

Hasil

elektroforesis

yang

terlihat

adalah

terbentuknya band yang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasangan basanya (Klug & Cummings 1994: 397). Teknik

elektroforesis

mempergunakan

medium

yang

terbuat

dari

gel. Perpindahan partikel pada medium gel tersebut dipengaruhi oleh faktorfaktor seperti ukuran partikel, komposisi dan konsentrasi gel, densitas muatan, kuat medan listrik dan sebagainya. Semakin kecil partikel tesebut, maka pergerakan atau migrasinya akan semakin cepat, karena matriks gel mengandung jaringan kompleks berupa pori-pori sehingga partikel-partikel tersebut dapat bergerak melalui matriks tersebut (Brown 1992: 19). Di dalam elektroforesis digunakan sumber arus listrik searah (DC), ruang untuk elektroforesis (Comb, Well, platform dan cetakan wadah gel), larutan buffer (buffer ionik danloading buffer), matriks elektroforesis, marker dan gel (Klug & Cummings 1994: A-6). Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju pergerakan dari molekul DNA, yaitu: 1.

Ukuran Molekul DNA

Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar. 2.

Konsentrasi gel Semakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar untuk dilewati molekul-molekul DNA. Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar.

3.

Bentuk molekul Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak dibandingkan dengan yang berbentuk bulat.

4.

Densitas muatan Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul. Molekul dengan densitas muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang rendah.

5.

Pori-pori gel Semakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan molekul DNA.

6.

Voltase Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul DNA.

7.

Larutan buffer elektroforesis Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga mempercepat migrasi DNA (Wolfe, 1993). 2.4 Fungsi Reagen dalam Elektroforesis Seperti yang sempat dalam paragraf sebelumnya bahwa dalam setiap percobaan biasanya memerlukan reagen guna mendukung dan memudahkan proses percobaan, hal itu pula yang terjadi pada percobaan elektroforesis. Beberapa reagen yang digunakan dalam percobaan elektroforesis misalnya sajaagarosa, TAE, loading buffer, dan Etidium Bromida. Masing-masing reagen memiliki peran dan fungsi tersendiri yang amat mendukung dan menentukan hasil akhir dari percobaan.

Reagen loading dye misalnya. Pada percobaan, sampel DNA yang akan dielektroforesis ditambahkan loading dye terlebih dahulu. Hal ini dikarenakan larutan loading dye memiliki peran penting dalam menghasilkan ban DNA yang tajam. Tiga fungsi utama dari larutan tersebut adalah untuk menterminasi reaksi enzimatik sebelum elektroforesis, menyediakan kerapatan agar sampel dapat bergerak dalam sumur gel, dan menyediakan cara untuk melihat pergerakan molekul DNA saat elektroforesis (Surzycki, 2003). Loading dye mengandung bromofenol biru, xylene cyanol, dan orange G yang digunakan untuk memvisualisasi sampel DNA. Pada agarosa 1 %, xylene cyanol bergerak dengan kecepatan setara dengan 4000 bp DNA, bromofenol biru bergerak dengan kecepatan setara dengan 200 bp DNA, dan orange G bergerak dengan kecepatan setara dengan 200-400 bp DNA. Biasanya loading dye juga mengandung gliserol atau sukrosa untuk meningkatkan kerapatan DNA sehingga dapat masuk dan bergerak dalam sumur gel (Elkins, 2013). Buffer TAE (Tris-Asetat-EDTA) berperan dalam pemberian sensitivitas dan kemampuan pemisahan yang tinggi. Buffer TAE memberikan ion untuk konduktivitas listrik sehingga molekul-molekul DNA dapat bererak dengan baik di dalam gel (Mitchelson and Cheng, 2001) selain itu larutan TAE juga berperan sebagai penghantar arus pada media (Yuwono, 2005). Setelah dielektroforesis, DNA divisualisasi menggunakan pewarna etidium bromida. Etidium bromida dapat berikatan dengan kuat pada DNA dan menghasilkan pendar sinar orange ketika dilihat dibawah sinar ultraviolet (Cheng and Zhang, 2008). Karenanya, larutan etidium bromide dapat dikatakan memiliki fungsi sebagai reagen pembantu visualisasi dalam proses elektroforesis DNA (Marks et al, 2000)

2.5 Ukuran Genom Tanaman Bayam Secara keseluruhan kumpulan gen-gen yang terdapat di dalam setiap sel-sel individu organisme disebut sebagai genom. Ukuran genom adalah jumah total DNA yang terkandung dalam satu salinan genom tunggal. Panjang molekul DNA yang beruntai tunggal diukur dalam satuan basa. Karena secara kebanyakan DNA

merupakan pasangan komplementer dari untaian polimer yang disatukan dengan ikatan hidrogen, panjang dari DNA beruntai ganda diukur dalam pasangan basa atau base pairs (bp). Seribu pasangan dianggap sebagai 1 Kb , dan satu juta pasangan basa sebagai 1 Mb (Bruzel, 1998). Kompleksitas suatu organisme tidak berbanding lurus degan ukuran genom, beberapa organisme sel tunggal memiliki DNA lebih besar dibandingkan dengan manusia (Stewart, 2009). Amaranthus sp. merupakan salah satu organisme dengan model terbaik dalam penelitian ukuran genom. Secara evolusi, spesies Amaranthus sp. sangat kaya akan sumber daya genom. Berikut merupakan beberapa ukuran genom haploid pada Amaranthus sp. (Stewart, 2009). Adapun bayam, organisme yang menjadi objek percobaan kali ini, diikutip dari Brooks (2010), Spinacia oleracea atau bayam yang merupakan kelompok tumbuhan Amaranthus memiliki genome 989 Mb.

Tabel 3.1 Ukuran Genom Haploid dari Amaranthus sp. (Stewart, 2009)

2.6 Gambar Susunan Ladder 1kb Ladder DNA merupakan larutan yang terdiri dari berbagai ukuran molekul DNA yang digunakan pada gel elektroforesis sebagai pembanding untuk menentukan ukuran suatu DNA. Ladder memiliki ukuran yang berbeda-beda, disesuaikan dengan perkiraan panjang DNA (Mobile Reference, 2007). Masingmasing pabrik yang memproduksi ladder memiliki jangkauan base pair yang berbeda-beda walaupun memiliki ukuran yang sama. Gambar 2.2 di bawah ini

merupakan ladder 1 Kb yang diproduksi oleh Geneaid, terdiri dari 13 garis linear fragmen DNA yang dapat digunakan untuk mengukur DNA yang memiliki 250 bp hingga 10000 bp.

Gambar 2.2 Ladder 1 kb (Geneaid, 2013)

2.7 Faktor-Faktor yang Memengaruhi Hasil Elektroforesis Terkadang hasil elektroforesis yang didapatkan tidak sesuai dengan yang diharapkan, baik berupa ban fragmen yang tidak terlihat, muncul smear, ataupun terdapat anomali migrasi DNA. Berikut ini hal-hal yang menyeabkan ban yang muncul pucat atau bahkan tidak muncul ban (Dube, 2010): 1) Kurangnya jumlah atau konsentrasi DNA, dapat diatasi dengan menambahkan jumlah DNA asalkan tidak melebihi 50 ng/ban. 2) DNA terdegradasi akibat kontaminasi nuklease. 3) Voltase yang digunakan terlalu rendah. 4) Panjang gelombang sinar ultraviolet yang tidak tepat untuk visualisasi menggunakan pewarna etidium bromida. Untuk hasil yang baik gunakan panjang geombang 254 nm. Hasil lain yang seringkali muncul pada percobaan elektroforesis yang gagal adalah smear. Masih menurut Dube (2010), penyebab munculnya smear pada percobaan elektroforesis DNA diantaranya adalah:

1) DNA terdegradasi akibat kontaminasi nuklease. 2) Terlalu banyak DNA yang dielektoforesis 3) Kondisi elektroforesis yang tidak tepat. 4) Terlalu banyak garam pada DNA 5) DNA terkontaminasi protein 6) Ban DNA kecil berdifusi ketika pewarnaan Sedangkan pada hasil elektroforesis yang menunjukkan anomali migrasi DNA, Dube (2010) menambahkan,

terdapat beberapa faktor mendasar yang

menyebabkan hal tersebut terjadi, diantaranya adalah: 1) Kondisi elektroforesis yang tidak tepat. Jangan menggunakan voltase lebih dari 20 V/cm dan jaga agar temperatur di bawah 300 C selama elektroforesis. Harus dicek pula apakah konsentrasi buffer yang digunakan sudah tepat. 2) DNA terdenaturasi. Jangan pernah memanaskan DNA ketika akan dilakukan elektroforesis. Senada dengan Dube, Sambrook (1989) juga mengidentifikasi beberapa faktor utama yang menyebabkan hasil elektroforesis tak sesuai dengan yang diharapkan. Hasil elektroforesis yang buruk seringkali disebabkan oleh banyaknya zat-zat pengotor dalam DNA atau dengan kata lain DNA yang didapat tidak murni. Beberapa faktor yang memengaruhi kemurnian DNA yakni tingkat kontaminasi protein dalam larutan, faktor pengencer, serta daya absorbansi. Pada elektroforesis, konsentrasi DNA diukur secara Sprektrofotometri dengan menggunakan GeneQuant DNA calculator. Dasar teknik ini adalah DNA yang dapat menyerap sinar ultraviolet dengan kuat pada panjang gelombang 260 nm, sedangkan 280 nm merupakan daerah serapan protein. Panjang gelombang dengan nilai serapan 1,0 (A260=1,0 ) setara dengan 50 mg DNA utas ganda per milliliter larutan. Oleh karena itu, didapatkan bahwa konsentrasi DNA (µg/ml) diperoleh dari perkalian antara faktor pengencer, faktor konversi (50 µg/ml) dan Absorbansi (A260). Kemurnian DNA ditentukan oleh tingkat kontaminasi protein dalam larutan. Rasio optical density (OD) menurut Montgomery and Sise (1990), apabila 260 nm dan 280 nm berada di antara 1.8-2.0 menunjukkan bahwa proses

deproteinasi pada metode tersebut baik. Jika nilai rasio lebih kecil dari 1,8 maka masih ada kontaminasi protein atau fenol di dalam larutan (Sulandari dan Zein, 2003)

BAB III METODE KERJA

3.1. Alat dan Bahan Alat dan bahan yang digunakan pada praktikum kali ini adalah : Tabel 3.1. Alat dan Bahan Alat Alat sentrifuga Vortex Freezer Waterbath Mikropipet Pestel dan mortar Cetakan gel Alat pencetak sumur Sumber arus

Bahan Tabung eppendorf Tips TAE 50x Loading buffer 6x Etidium bromide Jaringan tanaman (Bayam) Ethanol 75% Buffer ekstraksi Isopropanol

Alat pemanas

Nitrogen cair Fenol:Kloroform:Isoamil alkohol (25:24:1) Potassium asetat 5M SDS 20% Buffer Tris EDTA : 10 mM Tris-HCl pH 8,1 mM EDTA

3.2. Metode Kerja 3.2.1. Isolasi DNA Sebanyak 0,2 gram daun bayam digerus dengan nitrogen cair hingga halus. Setelah itu, dimasukkan ke dalam microtube. Kemudian, kedalam microtube ditambahkan 500 µL extraction buffer. Microtube di vortex selama 5 detik dan diinkubasi waterbath 60ºC selama 30 menit dalam apung-apung. Microtube hasil inkubasi ditambahkan 500 µL Chloroform:Isoamilalkohol (CI) dan dikocok hingga tercampur. Kemudian, micortube disentrifuga 14000 g selama 5 menit. Setelah disentrifuga, supernatant diambil sebanyak 400 µL. Kemudian, ke dalam microtube ditambahkan isopropanol 400 µL dan diinkubasi selama 30 menit di suhu -80ºC.Microtube hasil inkubasi disentrifuga 14000 g selama 5 menit. Kemudian, supernatan dibuang dan pellet dikeringkan sampai agak bening (sekitar 10-15 menit). Lalu, ke dalam microtube ditambahan buffer TE 50 µL. Setelah itu, microtube ditempatkan pada es selama 5 menit dan disentrifuga 14000 g selama 2 menit. Setelah sentrifuga, supernatan yang terbentuk diambil dan disimpan di suhu -20ºC. Kemudian, hasil isolasi DNA.

3.2.2. Elektroforesis DNA Mula-mula, pencetak sumur diletakkan pada cetakan gel. Kemudian agarosa dicampurkan dengan buter TAE 1x (konsentrasi akhir agarosa 0,3%) dan didihkan.

Setelah agak dingin, campuran agarosa dan TAE 1x ditambahkan

dengan 1 µL etidium bromide. Lalu, campuran gel tersebut dimasukkan kedalam cetakan gel dan didiamkan sampai gel mengeras. Kemudian, cetakan gel diletakkan pada alat elektroforesis. Setelah itu, buffer TAE 1x juga dituangkan pada alat elektroforesis hingga mencapai tinggi 1mm diatas gel. Setelah gel

berada dalam larutan buffer TAE, pencetak sumur dilepaskan dari gel. Kemudian 10 µL DNA yang telah diisolasi dicampurkan dengan 2 µL loading buffer dan campuran tersebut dimasukkan ke dalam sumur gel. Setelah itu, alat elektroforesis dihubungkan dengan sumber arus dan sumber arus dinyalakan pada 70 Volt sampai bromofenol biru mencapai ujung gel. Setelah bromofenol biru mencapai ujung gel, sumber arus dimatikan. Gel dikeluarkan dari tangki gel dan diamati. Gel dicelupkan ke dalam 0,2-0,5 µg/ml etidium bromide dan buter TAE 1x selama 10-60 menit, kemudian etidium bromide dihilangkan dari dalam gel dengan memindahkan gel ke dalam buffer TAE 1 x selama 10-60 menit. Setelah itu, gel disinari ultraviolet agar band-band DNA dapat dilihat dan diamati.

BAB IV HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Pengamatan

KEL. 16

KEL. 15

KEL.14

KEL.13

KEL.12

KEL.11

KEL.10

KEL. 9

KEL. 8

KEL. 7

KEL. 6

KEL. 5

KEL.4

KEL. 3

KEL. 2

KEL. 1

4.1.1. Foto Hasil Pengamatan

Gambar 4.1 Hasil Elektroforesis (Dokumentasi Pribadi, 2013)

4.1.2. Proses dan Hasil Perhitungan Band Melalui Metode Regresi Tidak dapat dilakukan perhitungan band dikarenakan hasil elektroforesis seluruhnya dalam bentuk smear.

4.2.Pembahasan Hasil elektroforesis yang didapat pada percobaan kali ini berbentuk smear sehingga ukuran DNA tidak dapat dihitung. Menurut Dube (2010), penyebab munculnya smear pada percobaan elektroforesis DNA diantaranya adalah: A. Terlalu banyak DNA yang dielektoforesis. Hal ini dapat diatasi dengan mengurangi jumlah DNA yang digunakan. Dengan membatasi jumlah komponen DNA yang diteliti, hasil elektroforesis yang didapat tentu akan lebih akurat. B. Terlalu banyak garam pada DNA. Seharusnya garam digunakan pada takaran yang memang dianjurkan dan sesuai literature selama proses elektroforesis DNA. Kelebihan garam malah akan mengganggu proses

elektroforesis dan memengaruhi hasil yang akan didapat. Kondisi ini dapat diatasi dengan teknik presipitasi garam berlebih menggunakan etanol. C. DNA terdegradasi akibat kontaminasi nuklease. D. Ban DNA kecil berdifusi ketika pewarnaan. Kondisi ini dapat diatasi dengan cara menambahkan etidium bromida saat elektroforesis. E. Kondisi elektroforesis yang tidak tepat. Penggunaan voltase listrik yang lebih dari 20 V/cm selama proses elektroforesis dapat memengaruhi hasil yang didapat di akhir percobaan. Oleh sebab itu, selalu gunakan voltase listrik dalam rentang di bawah 20V/cm serta selalu ingat untuk menjaga temperature lingkungan tetap di bawah 300 C selama elektroforesis berlangsung, tujuannya adalah agar DNA tidak terdenaturasi akibat suhu yang terlalu tinggi. F. DNA terkontaminasi protein.Protein dan zat organik lainnya (bahkan fenol sekalipun) akan menyebabkan hasil elektroforesis yang didapat menjadi smear karena kesemua bahan tersebut akhirnya menjadi kontaminan bagi DNA. Kontaminan tersebut yang menyebabkan hasil elektroforesis yang didapat tidak jelas dan buruk akibat DNA yang dielektroforesis tidak sepenuhnya DNA murni. Hal ini dapat diatasi dengan cara

ekstraksi

protein menggunakan fenol. Pita genom yang tidak smear atau bahkan tanpa latar pembayang di bagian belakangnya mengindikasikan tingkat kemurnian DNA yang baik. DNA disebut tidak terdegradasi atau terkontaminasi dan dapat diisolasi dengan baik. Kontaminasi fenol dan bahan organik lainnya dapat dilihat dengan munculnya latar pembayang atau smear di sepanjang jalur pergerakkan pita genom DNA (Tenriulo et al.,2001). Ada 3 hal yang menjadi faktor penentu dalam metode ekstraksi dan purifikasi DNA secara optimal, yakni penghomogenan jaringan tanaman, komposisi larutan buffer, dan penghilangan enzim penghambat polisakarida (Syarifudin dan Santoso, 2011). BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan Setelah melakukan percobaan, didapat kesimpulan :  DNA yang didapat dari hasil isolasi tidak murni, banyak faktor pengotor lain yang pada akhirnya memengaruhi hasil elektroforesis DNA pada percobaan kali ini.  Ukuran DNA bayam tidak dapat dihitung karena hasil elektroforesis yang didapat dari percobaan kali ini berbentuk smear.

5.2. Saran Pada saat praktikum, sebaiknya langkah-langkah kegiatan praktikum dilakukan dengan sesuai dan sangat hati-hati karena kesalahan yang terjadi dapat mengakibatkan pengaruh yang kurang baik terhadap hasil. Hal ini terutama dalam penggunaan bahan harus sesuai dengan aturan yang telah ditentukan dalam petunjuk kegiatan praktikum.

Daftar Pustaka Cheng, Liang and David Y. Zhang. 2008. Molecular Genetic Pathology. New Jersey : Humana Press Henry, Robert J. 2001. Plant Genotyping : The DNA Fingerprinting of Plants. New York : CABI Publishing Lee, Steven. 2013. DNA Extraction Methods. www.sjsu.edu/ people/ steven.lee/ courses/c3/s0/ DNA%2520ExtractiEx.ppt, (16 Oktober 2013).