laporan HPLC KA_dewi.docx

LAPORAN PRAKTIKUM KIMIA ANALISIS Hight Performance Liquid Chromatograph !HPLC"

A#i#ten

$ %u &mi

'o(ongan)Ke(ompo*

$S)&

Nama *e(ompo*

$

A(+ertu# Kri#tian Si#,anto !-../01/0.2" 3,i Augu#nita !-../01/044" 5ran#i#ca 6unita 6unita 3,i 7u(andari !-../01//0." Maria Krien#ia !-../01/18."

LA%ORATORIUM KIMIA ANALISIS 5AKULTAS 5ARMASI UNI9&RSITAS KATOLIK 7I36A MAN3ALA SURA%A6A -018

I:

3ASAR T&ORI Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair - cair yang dapat digunakan

 baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas atau area larutan standar (hopkar, !""#$. Prinsip dasar dari HPLC, dan semua metode kromatografi adalah memisahkan setiap komponen dalam sampel untuk selan%utnya diidentifikasi (kualitatif$ dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif$. Analisa kualitatif bertu%uan untuk mengetahui informasi tentang identitas kimia dari analit dalam suatu sampel. &edangkan analisa kuantitatif untuk mengetahui %umlah dan konsentrasi analit tersebut dalam sampel (hopkar, !""#$. HPLC menggunakan fasa gerak untuk memisahkan komponen dari sebuah campuran komponen (analit$. Prinsip ke%a HPLC adalah pemisahan setiap komponen dalam sampel  berdasarkan kepolarannya. 'ang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Contoh fasa diam yang digunakan (pada kolom$ HPLC %enis fasa terbalik adalah P!), dimana  adalah rantai alkana C-!) atau C-). &ementara fasa geraknya berupa larutan yang diatur komposisinya (gradien elusi$, hal ini bergantung pada kepolaran analit yang akan dipisahkan. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan *aktu retensinya akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah (hopkar, !""#$. omponen utama HPLC adalah + •

eseroir pelarut + at pelarut yang dipakai polaritasnya dapat berariasi tergantung dari senya*a yang dianalisis, yang perlu diperhatikan adalah bah*a tempat pelarut tersebut harus memungkinkan untuk proses menghilangkan gas atau udara yang ada

•

dalam pelarut. Pompa + digunakan untuk mengalirkan pelarut sebagai fase gerak dengan kecepatan

•

dan tekanan yang tetap. n%ektor + saat sampel diin%eksikan ke dalam kolom, diharapkan agar pelarut tidak  mengganggu masuknya keseluruhan sampel ke dalam kolom. n%eksi dapat menggunakan syringe.

•

olom kromatografi + kolom yang dipakai memiliki pan%ang !# / 01 cm dan diameter  2,1 / 1 mm yang diisi dengan fase stasioner berukuran 1-!# mikrometer dan terbuat

•

dari logam atau stainless steel. 3etektor + digunakan untuk mendeteksi sampel. 3etektor dibutuhkan untuk  mempunyai sensitiitas yang tinggi, linear untuk %angka konsentrasi tertentu dan dapat mendekati eluen tanpa mempengaruhi resolusi kromatografi (Adnan,!""4$.

egunaan umum HPLC adalah untuk pemisahan se%umlah senya*a organik, anorganik, maupun senya*a biologis, penentuan molekul - molekul netral, ionic, maupun *itter ion, isolasi dan pemurnian senya*a, pemisahan senya*a-senya*a yang strukturnya hampir sama, HPLC merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif  maupun kuantitatif (Adnan,!""4$. 5at dengan kepolaran berbeda dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi caircair. Prinsip HPLC menggunakan prinsip kromatografi adsorbsi dan banyak digunakan dalam industi farmasi dan pestisida. HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar  senya*a aktif pada obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk - produk degradasi dalam sediaan farmasi. eterbatasan metode HPLC ini adalah untuk identifikasi senya*a, kecuali %ika HPLC dihubungkan dengan spektrometer massa (6&$. eterbatasan lainnya adalah sampel sangat kompleks maka resolusi yang baik sulit diperoleh (Adnan,!""4$. Si#tem Pera(atan HPLC nstrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas+ *adah fase gerak, p ompa, alat untuk

memasukkan sampel (tempat in%eksi$, kolom, detektor, *adah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. 3iagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini +

!. 7adah 8ase gerak dan 8ase gerak  7adah fase gerak harus bersih dan lembam (inert$. 7adah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai *adah fase gerak. 7adah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara ! sampai 0 liter pelarut. 8ase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. 3aya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. 9ntuk  fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak$, kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. &ementara untuk fase terbalik (fase diam kurang  polar daripada fase gerak$, kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas  pelarut. 8ase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari  partikel-partikel kecil ini. &elain itu, adanya ga s dalam fase gerak %uga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor  sehingga akan mengacaukan analisis. :lusi dapat dilakukan dengan cara isokratik  (komposisi fase gerak tetap selama elusi$ atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi$ yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. :lusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama %ika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas. 8ase gerak  yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. 9ntuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut  %enis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik. 0. Pompa Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat *adah pelarut yakni+ pompa harus inert terhadap fase gerak. ;ahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, ba%a tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 1### psi dan

mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir < mL=menit. 9ntuk tu%uan  preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 0# mL=menit. Tu%uan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak  adalah untuk men%amin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 0 %enis pompa dalam HPLC yaitu+  pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe  pompa dengan aliran fase gerak yang konstan se%auh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan. atau lebih kecil dibanding dengan kolom konensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase

•

gerak lebih lambat (!# -!## ?l=menit$. Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal

•

 %ika digabung dengan spektrometer massa. &ensitiitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya  %enis kolom ini sangat bermanfaat %ika %umlah sampel terbatas misal sampel klinis. 6eskipun demikian dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom

konensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin. ebanyakan fase diam  pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimia*i, silika yang tidak  dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan diinil benen. Permukaan silika adalah  polar

dan

sedikit

asam

karena

adanya

residu

gugus

silanol

(&i-@H$.

&ilika dapat dimodifikasi secara kimia*i dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. eagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain. @ktadesil silika (@3& atau C!)$ merupakan fase diam yang paling banyak  digunakan karena mampu memisahkan senya*a-senya*a dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. @ktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk  solut yang polar. &ilika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril$ lebih cocok sebagai  pengganti silika yang tidak dimodifikasi. &ilika yang tidak dimodifikasi akan memberikan *aktu retensi yang berariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.

1. 3etektor HPLC 3etektor pada HPLC dikelompokkan men%adi 0 golongan yaitu+ detektor  uniersal (yang mampu mendeteksi at secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak   bersifat selektif$ seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif,

seperti

detektor

9B-Bis,

detektor

fluoresensi,

dan

dealnya, suatu detektor harus mempunyai karak teristik sebagai berikut+

elektrokimia.

6empunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel. 6empunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar 

• •

•

yang sangat kecil. &tabil dalam pengopersiannya. 6empunyai sel olume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran

•

 pita. &ignal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran

•

yang luas (kisaran dinamis linier$. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

•

;eberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan karakteristik detektor seperti berikut + 3etektor

&ensitifitas (g=ml$

isaran linier 

arakteristik 

1  !#-!# 1  !#-!# D 0  !#-!#

!#2 !#1 !#1

8luoresensi

!#-!0

!#2

ndeks bias

1  !#-4

!#2

&ensitiitas bagus, paling sering digunakan, selektif  terhadap gugus-gugus dan struktur-struktur yang tidak   %enuh. &ensitifitas sangat bagus, selektif, Tidak peka terhadap  perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak. Hampir bersifat uniersal akan tetapi sensitiitasnya sedang. &angat sensitif terhadap suhu, dan tidak dapat digunakan  pada elusi bergradien

!#-) !#-!0

!#2 !#1

 Absorbansi Uv-vis

8otometer filter  &pektrofotometer  spektrometer photodiode array

 Elektrokimia

onduktimetri Amperometri

;&NIS HPLC

Peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak, tidak dapat digunakan pada elusi bergradien. Hanya mendeteksi solut-solut ionik. &ensitifitas sangat bagus, selektif tetapi timbul masalah dengan adanya kontaminasi elektroda.

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (%ika fase diamnya lebih  polar dibanding dengan fase geraknya$ atau fase terbalik (%ika fase diamnya kurang non polar  dibanding dengan fase geraknya$. ;erdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan men%adi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. &elain klasifikasi di atas, HPLC %uga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan %enis-%enis HPLC sebagai berikut+ !. romatografi Adsorbsi Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar "#> kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Eugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor. 0. romatografi fase terikat ebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimia*i atau fase terikat. &e%auh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. 8ase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (@3& atau C!)$ dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik. &ebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. 9ntuk solut yang  bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam men%adi lebih lemah dibanding %ika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.